DE69918128T2

DE69918128T2 - Mutierte gewebefaktor-inhibitor (tfpi), dna sequenz davon und verwendung zur erkennung von thrombotischen erkrankungen

Info

Publication number: DE69918128T2
Application number: DE69918128T
Authority: DE
Inventors: Knut Kleesiek; Thomas Brinkmann; Wolfgang Prohaska; Christian Goetting; Michael Schmidt
Original assignee: KLEESIEK KNUT PROF DR
Current assignee: KLEESIEK KNUT PROF DR
Priority date: 1998-08-25
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2019-08-19
Also published as: US6521410B1; CA2340460A1; ATE269356T1; EP1105423B1; EP1105423A1; AU5736899A; WO2000011034A1; DE69918128D1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Mutante des Gewebefaktor-Inhibitorproteins ("Tissue Factor Pathway Inhibitor", TFPI) und ihre entsprechenden DNA Sequenz. Die Mutante kann in Menschen aufgefunden werden, welche ein erhöhtes Risiko für Thrombosekrankheiten zeigen oder zeigen können. Die DNA Sequenz gemäß der Erfindung unterscheidet sich vom der bekannten TFPI kodierenden DNA durch einen singulären Nukleotidpolymorphismus, der in der Änderung einer Aminosäureposition innerhalb des TFPI-Proteins resultiert. Durch Selektieren nach besagter DNA oder Fragmenten davon in menschlichen Blutproben ist es möglich eine Veranlagung für thrombotische Funktionsstörungen vorauszusagen, durch welche prophylaktische Anwendungen oder Maßnahmen initiiert werden können.
Gewebefaktor-Inhibitor ("Tissue Factor Pathway Inhibitor", TFPI) ist ein wichtiger Regulator des extrinsischen Blutgerinnungsweges. Obwohl die regulative biochemische Rolle von TFPI offensichtlich ist, bleibt die klinische Signifikanz dieses Proteinase-Inhibitors aufzuklären. Die Definition eines klinischen TFPI Mangels scheint komplexer zu sein als die bei anderen Gerinnungshemmstoffen, da die Aktivität und Konzentration von zirkulierendem TFPI nicht als echtes Maß von in vivo Zuständen betrachtet werden kann. Es ist gezeigt worden, dass seine Bestimmung in Plasmaproben mittels immunologischer Methoden oder funktioneller Untersuchungen unzulänglich für das Auffinden eines klinischen Mangels ist.
TFPI ist ein einkettiges Glykoprotein, welches im Plasma in Spuren vorkommt. Es wurde kürzlich bekannt als Hemmstoff des extrinsischen Weges oder als Lipoprotein assoziierter Gerinnungshemmstoff TFPI gehört der Klasse der Kunitz-Typ Proteinase-Hemmstoffe an, und das reife Protein enthält ein saures amino-terminales Ende gefolgt von drei Kunitz-Typ inhibitorischen Domänen und einem basischen carboxyl-terminalen Ende. Die für TFPI kodierende cDNA wurde geklont und charakterisiert von Wun et al. (J. Biol. Chem. 1988, 263). Das reife Molekül besteht aus 276 Aminosäureresten einschließlich 18 Cysteinen (siehe SEQ ID Nr. 1, 2), welche alle in Disulfidbindungen involviert sind, und enthält drei potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen. Das Molekulargewicht des Polypeptid-Hauptstrangs ist ungefähr 32 kDA groß, das im Plasma vorkommende Protein weist jedoch auf SDS-PAGE ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 42 kDA auf, was vermutlich auf Glycosylierung zurückzuführen ist.
Der multivalente Protease-Hemmstoff ist ein wichtiger Regulator des extrinsischen Blutgerinnungsweges bedingt durch seine Fähigkeit mit dem Blutgerinnungsfaktor VIIa/Gewebefaktorkomplex und dem aktivierten Faktor X über dessen Kunitz-Typ Domänen δ1 und δ2 zu interagieren (siehe: Girard, T.J. et al., Nature 338, 518-520 (1989); Broze, G.J.Jr. et al.; Blood 71, 335 (1984); Rapaport, S.I. & Rao, L.V.M., Thrombosis and Haemostasis 74, 7-17 (1995); Broze, G.J.Jr., Haemostaseologie 17 73-77 (1997)). Es gibt auch Hinweise, dass die Infusion von rekombinantem TFPI gegen durch TF oder E.coli induzierte verstreute intravaskuläre Gerinnung schützen kann, um wiederum gegenüber venöser Thrombose zu schützen und eine erneute Thrombose nach erfolgreicher Thrombolyse bei arterieller Thrombose zu verhindern. Die intravaskuläre Verteilung von TFPI ist komplex. Das reife humane Gewebefaktor-Inhibitorprotein wird hauptsächlich durch das vaskuläre Endothelium synthetisiert (Bajaj, M.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8869, (1990)). Es ist ferner in wenigstens vier intravaskulären Pools aufgefunden worden: gebunden an die Endothelzelloberfläche, assoziiert mit Lipoproteinen, trägerfrei innerhalb des Plasmas, und abgesondert in Blutblättchen (Sandset, P.M. & Abildgaard, U., Haemostasis 21, 219 (1991). Eine Übersicht der Regulation und Rolle von TFPI innerhalb des extrinsischen Wegsystems wird geliefert von Peterson et al. (Thrombosis Research, 79, 1-47 (1995)).
TFPI spielt eine so wichtige Rolle bei der Hemmung des extrinsischen Weges, dass TFPI Mangel, der auf Mutationen im TFPI Gen zurückzuführen ist, die Aktivität des Prothrombinase-Komplexes erhöhen sollte. Dies steigert die Thrombin Bildung und folgerichtig das Risiko von venöser Thrombose. Solch eine verringerte Hemmung der Thrombin Bildung ist bereits bekannt bei vererbten Gerinnungshemmungsdefekten, welche für Thrombose prädisponieren, einschließlich eines Mangels an Antithrombin III, Protein C und Protein S (Dahlbäck, B. Blood 85, 607-614 (1995)). Die geläufigste vererbte Abnormalität, welche bekannt ist, zu venöser Thrombose zu führen, ist die Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C, welche durch eine singuläre Punktmutation im Faktor V – Gen verursacht wird (Bertina, R.M. et al., Nature 369, 64-67 (1994)).
Somit ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, genomische DNA Proben von humanen normalen Blutspendern und thrombotischen Patienten nach Veränderungen im TFPI Gen zu durchsuchen, um den Einfluss eines modifizierten TFPI bei venösen thrombotischen Erkrankungen zu bewerten.
Überraschenderweise konnte eine singuläre Nukleotidsubstitution (C → T) im Exon 7 des TFPI-Gens gefunden werden, welche zu einem Prolin nach Leucin Austausch an Position 151 des reifen Proteins führt (siehe SEQ ID Nr. 3, 4). Untersucht man die statistische Signifikanz dieser TFPI-Modifikation, stellt man fest, dass diese Modifikation mit einem relativen Risiko zu allgemeinen thrombotischen Funktionsstörungen verknüpft ist. Es sollte jedoch betont werden, dass die besagte Modifikation auch bei einzelnen Personen aufzutreten scheint, welche, vergleicht man ihre familiäre Gesundheitsvorgeschichte, offensichtlich kein erhöhtes Risiko gegenüber thrombotischen Ereignissen zeigen. Nichtsdestoweniger kann das Auffinden von modifiziertem TFPI Protein / DNA in Blutproben von einzelnen Personen einen wichtigen Hinweis auf eine mögliche Disposition dieser Person für thrombotische Erkrankungen liefern. Daher können prophylaktische Maßnahmen ergriffen werden, um besagte Krankheiten zu verhindern.
Der Ausdruck "thrombotische Funktionsstörungen", der oben und unten verwendet wird, schließt gemäß der Erfindung alle bekannten Krankheiten oder Störungen ein, die direkt oder indirekt in Beziehung stehen mit einer ständigen oder zeitweiligen abnormalen oder pathologischen Blutgerinnung, zum Beispiel, venöse Thrombose.
Das modifizierte TFPI oder die entsprechende DNA können als diagnostischer Marker Verwendung finden, um ein solches mögliches Risiko für thrombotische Störungen in einem Patienten zu detektieren.
Somit ist es Gegenstand der Erfindung, eine DNA Sequenz zur Verfügung zu stellen, welche für einen Mutante von Gewebefaktor-Inhibitor ("Tissue Factor Pathway Inhibitor", TFPI) Protein kodiert, worin ein Prolin-Rest an Position 151 des reifen Peptides (berechnet vom N-terminalen Ende) durch einen Leucin-Rest ersetzt ist.
Es ist ferner Gegenstand der Erfindung, eine DNA Sequenz zur Verfügung zu stellen, die einen DNA Sequenz (a) umfasst, welche für eine Signalsequenz kodiert, gefolgt von einer DNA Sequenz (b), welche für eine Mutante des TFPI-Proteins kodiert, worin ein Cytosin an Position 536, berechnet vom Startkodon der Sequenz (a), durch ein Tyrosin ersetzt wird, um innnerhalb der kodierenden Region der Sequenz (b) ein CTG Kodon anstelle eines CCG Kodons zu bilden.
Es ist weiterhin Gegenstand der Erfindung ein Verfahren bereit zu stellen, um eine Veranlagung für thromboembolische Krankheiten in Menschen festzustellen, in dem man genomische Proben aus menschlichem Blut nach DNA Sequenzen, wie sie oben oder in den Ansprüchen definiert sind, absucht.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Methode, welche Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Restriktionsanalyse einsetzt, in dem man die gesamte DNA aus menschlichen Blutproben extrahiert, Exon 7 des TFPI-Gens (von Position 536 bis 628) und seine ehemalige flankierende Intron-Region mittels geeigneter Primer amplifiziert, die PCR-Produkte mit einem Restriktionsenzym, welches die Erkennungsstelle ACTGG oder CAGTG aufweist, behandelt, und die Länge des Fragments nach Restriktionsanalyse oder Isolierung und Detektierung der oben und unten definierten DNA feststellt.
Geeignete Primer gemäß der Erfindung sind Primer oder DNA Fragmente, welche mit den entsprechenden Regionen von Exon 7 des TFPI Gens hybridisieren können, intronische Flankenregionen eingeschlossen. Daher ist es in einer bevorzugten Ausführungsform Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren, wie oben und in den Ansprüchen definiert, bereit zu stellen, welches die folgenden Primer (SEQ ID Nr. 6, 8) verwendet:
5' – TCTATTTTAATTGGCTGTAT – 3' und
5' – GCATGATAATAGTTTCCTGG – 3'.
Die durch den singulären Nukleotidpolymorphismus bedingte Modifikation (C → T, CCG → CTG) im TFPI Gen an Position 536 generiert innerhalb dieser Region des Gens eine neue Spaltungsstelle, welche im ursprünglichen Gen nicht vorhanden ist. Dies ist sehr vorteilhaft und kann vorzugsweise als Kurznachweis von derartig modifizierter DNA in Blutproben, und folgerichtig der oben erwähnen Veranlagung für thrombotische Funktionsstörungen verwendet werden. Die durch besagten Nukleotidaustausch geschaffene Erkennungsstelle ist ACTGG oder CAGTG (SEQ ID. Nr. 5, 7). Daher sind alle Restriktionsenzyme, die diese Spaltungsstelle erkennen können, geeignet, um das diagnostische Verfahren der Erfindung durchzuführen.
Bekannte und geeignete Restriktionsenzyme sind beispielsweise Bse1I, BseNI, BsrI, BsrSI, BscH1, Bst11I, BsoHI, Tsp1I, and TspRI. Das gemäß der Erfindung bevorzugte Enzym ist BseNI.
Letztlich ist es Gegenstand der Erfindung, eine neue Mutante von Gewebefaktor-Inhibitor ("Tissue Factor Pathway Inhibitor", TFPI) Protein zur Verfügung zu stellen, worin ein Prolin-Rest an Position 151 des reifen Peptids (berechnet vom N-Terminus ohne Signalpeptidsequenz) durch einen Leucin-Rest ersetzt ist.
Gemäß der Erfindung wurde die These untermauert, dass genetische Variationen im TFPI Gen zum Auftreten von bislang ungeklärten Fällen von Thrombophilie in ungefähr der Hälfte der betroffenen Patienten beitragen. In einem ersten Screening-Experiment wurden 50 nicht miteinander verwandte Personen mit einer thrombotischen Vorgeschichte untersucht, die ausselektiert waren, um die genetische Grundlage ihrer Thrombose zu bestimmen (27 von ihnen erwiesen sich als Träger der Faktor V Leiden Mutation). Durch Absuchen aller kodierender Exons des TFPI Gens und der benachbarten intronischen 5'- und 3'- Regionen mittels PCR-SSCP Analyse wurde ein abnormales Muster in einem PCR-Fragment von Exon 7 beobachtet (1a), welches die Anwesenheit einer genetischen Variation vermuten ließ. DNA Sequenzierung des Fragmentes, welches das abnormale SSCP Bandenmuster zeigte, offenbarte eine singuläre heterozygote C- nach T- Mutation an Nukleotidposition 1 von Exon 7, was zu einer Änderung von Kodon CCG¹⁵¹ zu CTG¹⁵¹ führt und in einem Pro¹⁵¹ zu Leu¹⁵¹ Austausch in der Aminosäuresequenz des reifen Proteins resultiert (1b, c; 2) (siehe auch: van der Logt et al., Biochemistry 30, 1571-1577 (1991); Girard, T.J. et al.; J. Biol. Chem. 266, 5036-501 (1991)).
Der 536C → T Übergang geht einher mit der Bildung einer neuen Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BseNI und liefert ein schnelles Hilfsmittel, um weitere Individuen nach dieser Mutation mittels PCR und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse (PCR-RFLP) abzusuchen. Die für die Amplifizierung von Exon 7 und der 5'- und 3'- flankierenden intronischen Regionen entworfenen Primer wurden verwendet, um ein 170 by großes PCR-Fragment zu generieren. Wenn das Nukleotid C an Position 536 vorhanden ist, ist das 170 by große DNA Fragment nicht mit BseNI verdaubar. Wenn jedoch das Nukleotid T an dieser Position zugegen ist, wird ein 27 by und ein 143 by großes Restriktionsfragment generiert. Unter Verwendung dieser Methode wurde ein zweiter Satz von Patienten mit venöser Thrombose (n=234), von denen 30.2 % die Faktor V Leiden Mutation trugen, einem entsprechenden Screening unterworfen. Ein weiteres Individuum, das für die TFPI-Mutation heterozygot ist, wurde detektiert. Homozygote Träger dieser Mutation wurden nicht gefunden.
Um die Verbreitung des 536C → T Austausches in der allgemeinen Bevölkerung abzuschätzen, wurden 2480 zufällig ausgewählte, nicht verwandte Blutspender (Alter 18 – 60 Jahre) mittels PCR-RFLP untersucht.
Um eine größere Anzahl von Personen mit dem Merkmal aufzufinden – was eine präzisere Abschätzung des relativen Risikos dieser Individuen, eine venöse Thrombose zu entwickeln, zulassen würde – wurden Familienmitglieder der heterozygoten Blutspender und Patienten untersucht. Insgesamt wurden 13 heterozygote Individuen in sechs verschiedenen Familien gefunden. Zwei von ihnen litten an starker Venenthrombose.
Alle Personen, die die TFPI Mutation in sich trugen, wurden auf die Anwesenheit von anderen genetischen Defekten der Blut gerinnenden Proteine (Faktor V Leiden, Prothrombin 20210G → A Mutation, Mangel an Protein C, Protein S und Antithrombin III) untersucht, um den Beitrag dieser Störungen an den thromboembolischen Befunden auszuschließen. Die zwei Individuen, die das TFPI-Merkmal aufwiesen und an venöser Thrombose litten, hatten keine der zusätzlich untersuchten genetischen Funktionsstörungen. Obwohl die TFPI Mutation zusammen mit entweder der Faktor V Leiden Mutation oder der Prothrombin Mutation (20210G → A) in 4 Mitgliedern einer Familie beobachtet wurde, hatte keines von ihnen eine thromboembolische Krankheitsvorgeschichte.
Es ist allgemein anerkannt, dass für den Beweis, dass ein hemmendes Blutgerinnungsprotein eine wichtige regulative Rolle spielt, das Auffinden von geringen Mengen von zirkulierendem, mit venöser Thrombose assoziiertem Hemmstoff erforderlich ist. Daher wurden die TFPI Aktivität durch einen funktionellen und die Proteinkonzentration durch einen immunologischen Untersuchungsansatz im Plasma aller TFPI Mutation aufweisenden Individuen gemessen. Verglichen mit der Kontrollgruppe (Blutspender ohne TFPI Mutation) wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt. Jedoch könnten geringfügige Unterschiede aufgrund der geringen Anzahl von bislang untersuchten Fällen nicht erkannt worden sein.
Ferner muss im Zusammenhang mit der Interpretation der TFPI Mengen berücksichtigt werden, dass, verglichen mit anderen Blutgerinnungshemmstoffen wie Antithrombin III und Protein C, die hauptsächlich als freie Moleküle zirkulieren, zirkulierendes TFPI nicht das wahre Ausmaß der gesamten in vivo TFPI Menge wiedergibt. Daher hat sich gezeigt, dass die Bestimmung von TFPI Aktivität und Proteinkonzentration in Plasmaproben ein ungeeigneter Ansatz ist, klinischen TFPI Mangel festzustellen. Die intravaskuläre Verteilung ist mehr komplex. Eine größere Menge von TFPI (ungefähr 50 – 80% des gesamten intravaskulären Vorkommens) ist normalerweise am Endothelium gebunden, kann jedoch in die Zirkulation nach erfolgter Injektion von Heparin freigegeben werden. Es ist auch bekannt, dass mehr als 80% des zirkulierenden TFPI in einer komplexen Form mit Lipoprotein, vorzugsweise mit Lipoprotein geringer Dichte vorliegt. Ob jedoch diese Fraktion von Lipoprotein-assoziiertem TFPI als Blutgerinnungshemmstoff aktiv bleibt, ist noch unbekannt. Das Vorkommen von Plasma-TFPI ist mit der Lipoprotein-Konzentration korreliert, und es ist gezeigt worden, dass Patienten mit einer vererbten Abetalipoprotein-Ämie erniedrigte TFPI Plasmakonzentrationen aufweisen aber nicht an venöser Thrombose leiden. Daher stellt sich die Frage, ob ein Mangel an gesamtem intravaskulärem TFPI durch irgend einen der bislang verwendeten Tests festgestellt werden kann (Sandset, P.M. & Bendz, B. Thrombosis and Haemostasis 78, 467-470 (1997)). Eine genetische Abnormalität von TFPI, welche die Entwicklung von venöser Thrombose fördert, kann verschiedene Funktionen des Proteins betreffen, so die Sekretion durch Endothelzellen, die Bindung an Endothelmembranen, die Proteolyse im vaskulären Raum und die Assoziierung mit Lipoproteinen.
Bislang wurden 13 Individuen mit der TFPI Mutation identifiziert. Zwei von ihnen hatten eine venöse Thrombose als Krankheitsvorgeschichte. Obwohl die Anzahl der Personen ziemlich klein ist, um das Risiko zu Thrombophilie abzuschätzen, wurde die Verbreitung von venöser Thrombose in dieser Gruppe mit der Verbreitung in 466 Blutspendern, welche sehr sorgfältig über eine mögliche Vorgeschichte venöser Thrombose befragt wurden, verglichen. 10 Fälle wurden in dieser Gruppe gefunden. Die statistische Auswertung ergab eine Wahrscheinlichkeit von 94.5% für die Hypothese, dass das Auftreten des TFPI-Merkmals mit Thrombophilie verknüpft ist (p= 0.055, ungleiches Verhältnis: 5.9; 95% Konfidenzintervall: 1.0 – 36.5).
Somit bleibt diese Frage offen and kann nur beantwortet werden, wenn mehr Personen mit der TFPI Mutation für die statistische Bewertung verfügbar sind.
Beschreibung der Abbildungen:
1: PCR-SSCP und Sequenzänderung für die Prolin zu Leucin Substitution in einer TFPI Variante.

(a) Einzelstrangkonformationspolymorphismus in Exon 7 des TFPI-Gens in einem thrombotischen Patienten (Bande C) und nicht thrombotischen Kontrollen (Banden A, B, D). Der Pfeil in Bande C gibt eine zusätzliche Bande an, die nur in heterozygoten Varianten beobachtet wurde.
(b) Sequenzierungsprofil des Richtungsstranges der PCR-Produkte, die aus der Gesamt-DNA aus der heterozygoten Person, identifiziert durch SSCP, erhalten wurde. Der C → T Übergang in der Nukleotidsequenz, angegeben durch zwei Scheitelpunkte an der selben Position in der heterozygoten Probe, ist durch einen Pfeil markiert.
(c) Der C → T Übergang an Nukleotidposition 1 des Exons 7 resultiert in einer CCG → CTG Änderung in dem Richtungsstrang und führt zu einer Substitution an Position 151 des TFPI Proteins von Prolin zu Leucin.

2: Vorgeschlagene Sekundärstruktur des Gewebefaktor-Inhibitors ("Tissue Factor Pathway Inhibitor") und die Position des Aminosäureaustausches. Das reife Protein besteht aus 276 Aminosäuren, welche drei Tandem Kunitz-Typ Proteinaseinhibitor-Domänen, zwei verbundene Ketten, ein saures N-terminale Ende mit negativ geladenen Aminosäuren (-) und ein basisches carboxyl-terminales Ende, welches eine Anhäufung von positiv geladenen Aminosäuren (+) enthält, bilden. Kunitz-Domäne δ1 ist als Bindungsstelle für Faktor VIIa/Gewebefaktorkomplex identifiziert worden, während Domäne δ2 aktivierten Faktor Xa bindet (Wesselschmidt, R. et al., Blood 79, 2004-2010 (1992)). Ob Kunitz-Typ Domäne δ3 bindet und eine spezifische Protease inhibiert, ist unbekannt. Das basische carboxyl-terminale Ende ist die vorausgesagte Bindungsstelle zu Glycosylaminoglycanen auf der Endothelzelloberfläche und trägt zur Heparinbindung bei (Enjyoji, K.-I. et al., Biochemistry 34, 5725-5735 (1995)). Verkürzte Formen von TFPI sind fest an Lipoproteine mit geringer Dichte gebunden, und es fehlt ihnen der distale Teil des vollständigen Moleküls, einschließlich der Kunitz-Typ Domäne δ3 (Broze. G.J.Jr. et al., Blood Coag. Fibrinol. 5, 551-559 (1994)). Asn¹¹⁷ and Asn¹⁶⁷ sind N-glycosyliert, Ser¹⁷⁴ und Thr¹⁷⁵ sind O-glycosyliert (Nakahara, T.M. et al. Biochemistry 35, 6450-6459 (1996)). Der Pro¹⁵¹ nach Leucin Austausch ist nahe der Kunitz-Typ Inhibitordomäne δ2 innerhalb der zweiten verbindenden Kette lokalisiert (Vergrößerung).
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung in Einzelheiten ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1:
Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
374 nicht verwandte Patienten mit einer eindeutigen Vorgeschichte einer tiefen Venenthrombose und 2480 Blutspender als Kontrollgruppe wurde in dieser Studie untersucht. Die Gesamt-DNA aller Personen wurde aus dem ganzen Blut unter Verwendung von des QI Aamp Blood Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) extrahiert. TFPI-Exon 7 und seine 5'- und 3'- flankierenden intronischen Regionen wurden speziell aus genomischer DNA mittels PCR amplifiziert (Saiki, R. K. et al., Science 239, 487-491 (1988)). Die Primer für die Amplifizierungsreaktion (TFPI Ex7F 5'-TCTATTTTAATTGGCTGTAT-3', TFPI Ex7R 5'-GCATGATAATAGTTTCCTGG-3') stammten von der genomischen Sequenz des TFPI-Gens (van der Logt et al., Biochemistry 30, 1571-1577 (1991)). Die Standard-PCR umfasste 0.1 – 1 μg genomische DNA, 300 nM von jedem Primer, 200 μM von jedem Desoxynukleotidtriphosphat, GeneAmp 10× PCR Puffer und 2.5 Einheiten von AmpliTaq DNA Polymerase (Perkin-Eimer Corporation, Foster City, CA) in einem Endvolumen von 50μl. Nach dem Vermischen wurde zu jedem Röhrchen 1 Tropfen Mineralöl hinzugefügt, um Verdampfen zu verhindern. Die thermischen Zyklisierungsbedingungen umfassten anfängliche Denaturierung bei 94°C 3 Minuten lang, gefolgt von 40 Zyklen der Denaturierung bei 94°C 30 Sekunden lang, Abkühlen bei 48°C 45 Sekunden lang und Verlängern bei 72°C 45 Sekunden lang. Die PCR-Produkte wurden auf einem neutralen 0.8%-igem Agarose-Gel der Elektrophorese unterworfen und zur Untersuchung mit Ethidiumbromid angefärbt.
Beispiel 2:
Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP).
Sequenzvariationen innerhalb der amplifizierten DNA wurden im Anschluss an die PCR durch Einzelstrang-Konformationspolymorphismus detektiert. Zur SSCP-Analyse wurden die amplifizierten DNA-Fragmente, welche die Kodierungsregion von Exon 7 enthielten, unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) gereinigt. An dieses Verfahren anschließend, wurden die Fragmente 1 : 6 in destilliertem Wasser verdünnt, 10 Minuten lang bei 98°C erhitzt und dann auf Eis abgeschreckt, um eine fast vollständige Denaturierung zu erreichen. Elektrophorese wurde unter Verwendung der PhastSystem Elektrophoreseeinheit von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) durchgeführt.
Strangtrennung wurde mit einem 12.5%-igem "Homogeneous PhastGel" bei einer Temperatur von 12°C erhalten. Die Laufbedingungen waren: (i) Vorlauf: 400 V, 5.0 mA, 1.0 W, 12°C, 60 Vh; (ii) Proben-Auftragung: 25 V, 5.0 mA, 1.0 W, 12°C; 2 Vh; (iii) Hauptlauf: 200 V, 5.0 mA, 1.0 W; 12°C, 220 Vh. Die Gele wurde in der Färbeeinheit der Vorrichtung entsprechend der von Bassam et al. beschriebenen Methode (Bassam, B.J. et al, Analyt. Biochem. 196, 80-83 (1991)) der Silberfärbung unterzogen.
Beispiel 3:
DNA-Sequenzanalyse der SSCP-Varianten.
Die gereinigten PCR-Fragmente, die Unterschiede in dem SSCP-Bandenmuster zeigten, wurden als Vorlage für die Vorwärts- und Rückwärtszyklisierungssequenzierungs-Reaktionen mit den oben beschriebenen Primern verwendet. Die Fragmente wurden unter Verwendung des Protokolls von Applied Biosystems Incorporated (ABI) für die TAQ-Zyklisierungssequenzierung mittels Farbstoff-Terminatoren und einem automatischem ABI PRISM 377 DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) sequenziert.
Beispiel 4:
PCR-Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse zur Bestimmung der TFPI 536C → T Mutation.
PCR wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde auf einem 0.8%-igem Agarose-Gel überwacht. 6μl des PCR-Produktes wurden dann 1.5 Stunden lang mit 5U BseNI (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) bei 65°C in einem Endvolumen von 20 μl ohne weitere Aufreinigung inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf ein 2.5%-iges Agarose-Gel aufgetragen, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht analysiert.
Beispiel 5:
PCR-RFLP Analyse zur Bestimmung der Faktor V 1691 G → A Mutation.
Die PCR-RFLP Analyse der Faktor V Leiden Mutation wurde, wie früher durch Beauchamp et al. beschrieben, unter Verwendung der Primer Fv3 und Fv6 durchgeführt (Beauchamp, N.J. et al., Brit. J. Haematol. 88, 219-222 (1990).
Beispiel 6:
PCR vermittelte zielgerichtete Mutagenese zur Bestimmung des 20210G → A Übergangs im Prothrombin-Gen.
Der G nach A Übergang an Position 20210 im Prothrombin-Gen wurde nach Amplifizierung mit den Primern
PTHF 5'-CGCCTGAAGAAGTGGATACAGA-3' und
PTHR 5'-ATAGCACTGGGAGCATTGAA GC-3'
bestimmt. Der letztere wurde durch eine C- nach A- Substitution an Position 20214 umgestaltet, um eine Restriktionsstelle für HindIII (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) zu generieren, sofern der G- nach A- Übergang an Position 20210 im Prothrombin-Gen vorhanden ist (Poort, R.S. et al., Blood 88, 3968-3703 (1996)). Restriktionsanalyse und Gel-Elektrophorese wurden, wie oben beschrieben, unter HindIII empfohlenen Reaktionsbedingungen durchgeführt.
Beispiel 7:
Messung der TFPI-Konzentration und Aktivität in Plasma-Proben.
Das gesamte TFPI und vollständige Formen davon, Komplexe mit Gewebefaktor (TF) und Faktor VIIa, ebenso wie binäre Komplexe mit Faktor Xa und quaternäre Komplexe mit TF, Faktor VIIa und Faktor Xa wurden in Plasmaproben, die aus Individuen mit heterozygoter TFPI-Mutation, aus unbetroffenen Familienmitgliedern und aus Blutspendern gewonnen wurden, unter Verwendung des "IMUBIND Total and Truncated TFPI ELISA" Kits (American Diagnostica Inc., Greenwich, CT) gemäß der Herstelleranweisungen quantitativ bestimmt. Die gleichen Plasmaproben wurden verwendet, um die Aktivität von hauptsächlich freiem TFPI mit dem "ACTICHROME TFPI Activity Assay" von American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT) zu bestimmen.
Beispiel 8:
Bestimmung der Konzentration von Protein C und Antithrombin III in Plasmaproben.
Die Konzentration von Protein C und AT III in Plasmaproben wurde unter Verwendung des "DADE BEHRING Protein C" (Liederbach, Germany) und des "Antithrombin III Chromogenic Assays" entsprechend der Herstellerangaben gemessen.
Beispiel 9:
Bestimmung der Protein S Aktivität in Plasmaproben.
Die Aktivität von Protein C- Cofaktor wurde mit dem "Protein S Clotting Test" von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) bestimmt. Die Blutgerinnungszeit wurde mit einem Ball-Koagulationsmeter (Amelung, Lemgo, Deutschland) gemessen.
Beispiel 10
Bestimmung von Lipoprotein hoher und niedriger Dichte.
Um Plasmaproben von Patienten mit abnormaler Lipoproteinkonzentration, die auf Assoziation von TFPI mit Lipoprotein niedriger Dichte zurückzuführen ist, auszuschließen, bestimmten wir die Konzentration von Hoch-Dichte und Niedrig-Dichte Lipoprotein mittels eines kommerziell erhältlichen Trübungsmessungsansatzes (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland).
Beispiel 11
Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung des Chisquare Tests und linearer logistischer Regressionsanalyse nach geschlechts- und altersabhängigen Berechnungen mit dem "Statistcal Analysis System (SAS)"-Programm, Version 6.12 und "Student's t-Test". Zur statistischen Analyse wurden die Patienten mit thrombotischer Vorgeschichte an die Kontrollgruppe entsprechend Alter und Geschlecht angepasst.
SEQUENCE PROTOKOLL

Claims

DNA – Sequenz, kodierend für eine Mutante des humanen "Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)" – Proteins, in welchem ein Prolin – Rest an Position 151 des reifen Peptides (berechnet vom N-Terminus ohne Signalpeptid) durch einen Leucin – Rest ersetzt ist.
DNA – Sequenz, welche eine DNA – Sequenz (a), die für ein Signalpeptid kodiert, gefolgt von einer DNA – Sequenz (b), die für eine Mutante des humanen "Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)" – Proteins kodiert, enthält, worin ein Cytosin an Position 536, berechnet vom Startkodon der Sequenz (a), durch ein Tyrosin ersetzt ist und ein CTG – Kodon an Stelle eines CCG – Kodons innerhalb des kodierenden Bereiches der Sequenz (b) bildet.
DNA – Sequenz, enthaltend die DNA – Sequenz gemäß SEQ ID No. 3.
Verwendung einer DNA – Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die in vitro Diagnose von thrombotischen Fehlstörungen.
Verwendung nach Anspruch 4 für die in vitro Diagnose einer Veranlagung für venöse, thromboembolische Krankheiten im Menschen.
Verfahren zum Aufspüren einer Veranlagung für thromboembolische Krankheiten im Menschen mittels Prüfen von genomischen DNA – Proben menschlichen Blutes auf eine DNA – Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren nach Anspruch 6 mittels Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Restriktionsanalyse durch Extraktion der gesamten DNA aus menschlichen Blutproben, Amplifizieren des Exon 7 des TFPI – Gens und seiner vorausgehenden flankierenden intronischen Region mittels geeigneter Primer, Behandeln des PCR-Produktes mit einem Restriktionsenzym, welches die Erkennungsstelle ACTGG oder CAGTG aufweist, und Detektieren der Länge des Fragmentes nach Restriktionsanalyse oder Isolieren und Detektieren der DNA – Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die folgenden Primer eingesetzt werden: (a) 5' – TCTATTTTAATTGGCTGTAT – 3' und (b) 5' – GCATGATAATAGTTTCCTGG – 3'.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Restriktionsenzym BseNI ist.
Mutante des humanen "Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)" – Proteins, in welchem ein Prolin – Rest an Position 151 des reifen Peptides (berechnet vom N-Terminus ohne Signalpeptid) durch einen Leucin – Rest ersetzt ist.