DE60218162T2

DE60218162T2 - Verfahren und Zusammensetzungen zur Beurteilung der Lungenfunktion und von Lungenerkrankungen

Info

Publication number: DE60218162T2
Application number: DE60218162T
Authority: DE
Inventors: Peter Robert YOUNG
Original assignee: Auckland Uniservices Ltd
Current assignee: Auckland Uniservices Ltd
Priority date: 2001-06-05
Filing date: 2002-06-05
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2022-06-06
Also published as: EP1402073A4; WO2002099134B1; CA2449647A1; PT1402073E; EP1402073B1; DK1402073T3; US20120142000A1; EP1801240A1; US20040219548A1; WO2002099134A1; HK1065336A1; DE60218162D1; CY1107625T1; SG143977A1; NZ545283A; JP2004532640A; ES2282444T3; AU2002323841B2; EP1402073A1; ATE353976T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der Pulmonarfunktion und/oder -erkrankungen und insbesondere zur Diagnose einer Prädisposition auf und/oder der Schwere einer chronisch obstruktiven Pulmonarerkrankung bei Rauchern und Nichtrauchern unter Verwendung der Analyse des genetischen Polymorphismus und geänderter Genexpression. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Diagnose einer beeinträchtigten Lungenfunktion und insbesondere zur Diagnose der Prädisposition von und/oder der Schwere einer beeinträchtigten Lungenfunktion und des damit verbundenen Morbiditäts-/Mortalitätsrisikos anderer Erkrankungen. Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen für die Verwendung in diesen Verfahren.
Stand der Technik
Chronisch obstruktive Pulmonarerkrankung (COPD) ist die viert häufigste Todesursache in Industrieländern und ein Hauptgrund für die Wiedereinweisung ins Krankenhaus weltweit. Sie wird durch eine heimtückische Entzündung und progressive Lungenzerstörung charakterisiert. Es wird klinisch evident, nachdem bei betroffenen Rauchern stressbedingte Atemnot festgestellt wird, wenn 50% oder mehr der Lungenfunktion unwiderruflich verloren gegangen sind. Dieser Verlust der Lungenfunktion wird klinisch durch verringerte exspiratorische Flussgeschwindigkeiten bestimmt (spezifisches Einsekundenausatemkapazität in einer Sekunde oder FEVI). Über 95% der COPD werden dem Zigarettenrauchen zugeordnet, wobei bis jetzt nur 20% oder so der Raucher COPD entwickeln (anfällige Raucher). Studien zeigen überraschend, dass die Rauchdosis nur ungefähr 16% der beeinträchtigten Lungenfunktion ausmachen. Eine Anzahl von Familienstudien, die die Übereinstimmung bei Geschwistern (Zwillinge und Nichtzwillinge) vergleichen, zeigen durchwegs eine starke familiäre Tendenz und die Suche nach Genen für die Suszeptibilität der COPD-Erkrankung (oder die Modifikation der Erkrankung) ist fließend. Genetische Risikofaktoren für chronische Pulmonarerkrankungen werden bei Sandford et al, besprochen (Eur. Respir. J. 1997, 10: 1380–1391).
Trotz der Fortschritte bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen verändern die gegenwärtigen Therapien die natürliche Geschichte von COPD mit progressivem Verlust der Lungenfunktion, was Atemaussetzer und Tot verursacht, nicht signifikant. Obwohl sich gezeigt hat, dass das Einstellen des Rauchens diesen Abfall der Lungenfunktion verringert, ist der Verlust beträchtlich und die Symptome der Verschlechterung der Atemnot können nicht umgedreht werden, wenn dies nicht innerhalb der ersten 20 Jahre oder so des Rauchens für anfällige Raucher erreicht wird. Studien über das Einstellen des Rauchens zeigen, dass Techniken, um den Rauchern beim Aufhören zu helfen, eingeschränkten Erfolg haben. Analog zur Entdeckung des Cholesterinserums und dessen Verbindung zu Koronararterienerkrankung, gibt es einen Bedarf, die Faktoren, die zu COPD beitragen, besser zu verstehen, so dass Tests, die Risikoraucher identifizieren, entwickelt werden können und das neue Behandlungen zur Verringerung der Nebenwirkungen des Rauchens entdeckt werden können.
Eine Anzahl epidemiologischer Studien haben einheitlich gezeigt, dass bei der Einwirkung von Dosen von 20 oder mehr Packungen pro Jahr die Verteilung in der Lungenfunktion zu Trimodalität tendiert, wobei ein Teil der Raucher sogar nach 60+ Packungen pro Jahr normale Lungenfunktion behält (resistente Raucher), wobei ein Teil, der niemals Symptome entwickeln wird, bescheidende Verringerungen der Lungenfunktion zeigt und wobei ein Teil, der ausnahmslos COPD entwickelt, einen beschleunigten Verlust der Lungenfunktion zeigt. Dies deutet daraufhin, dass unter Rauchern 3 Populationen existieren, jene die resistent gegenüber einer Entwicklung von COPD sind, jene mit geringem Risiko und jene mit hohem Risiko (anfällig Raucher genannt).
Die zugrunde liegende Pathophysiologie von COPD wird bis jetzt nicht verstanden. Die Einwirkung von Zigarettenrauch auf die Lunge resultiert sowohl in einer Entzündungsantwort als auch in einer oxidativen Belastung, die mindestens 4 Prozesse starten. Eine Anzahl von Cytokinen wird lokal freigesetzt und sowohl Neutrophile als auch Makrophagen werden in die Lunge rekrutiert.
COPD ist eine heterogene Erkrankung, die in unterschiedlichem Ausmaß Emphysem und chronische Bronchitis umfasst, welche sich als Teil eines remodulierenden Verfahrens im Anschluss an den Entzündungsinsult durch chronische Einwirkung von Tabakrauch und anderen Luftverunreinigungen entwickeln. Es ist wahrscheinlich, dass viele Gene bei der Entwicklung von COPD involviert sind.
Weitere epidemiologische Studien haben gezeigt, dass die beeinträchtigte Lungenfunktion, die durch spirometrische Verfahren gemessen wird, ein direktes Verfahren zur Diagnose des Vorhandensein von und/oder der Tendenz zu obstruktiven Lungenerkrankungen (z.B. chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Asthma, Bronchiektase und Bronchiolitis) (Subramanian D, et al. 1994) und ein indirektes Verfahren zum Festsetzen des Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko von anderen Erkrankungen, wie z.B. Koronararterienerkrankung, Schlaganfall und Lungenkrebs bereitstellt (Hole DJ, et al. 1996, Knuiman MW, et al. 1999, Sorlie PD, et al. 1989, Bang KM, et al. 1993, Rodriguez BL, et al. 1994 and Weiss ST, et al. 1995).
Es ist seit langem erkannt worden, dass beeinträchtigte Lungenfunktion wie gegenwärtig durch spirometrische Verfahren gemessen, die klinische Basis für das Bestimmen des Vorhandenseins und der Schwere von obstruktiven Lungenerkrankungen, wie z.B. chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Asthma, Bronchiektase und Bronchiolitis, ist. In Gegenwart von chronischen Rauchern können diese Erkrankungen durch minimale reversible Atemwegsobstruktionen charakterisiert werden, wie durch niedrige Einsekundenausatemkapazität (FEV1), prognostizierter geringer Prozentsatz an Einsekundenausatemkapazität und verringertes Verhältnis der Einsekundenausatemkapazität gegenüber der forcierten Vitalkapazität wiedergegeben (allgemeine Referenz).
In den letzten 20 Jahren haben epidemiologische Studien die Beziehung zwischen beeinträchtigter Lungenfunktion (oftmals FEV1) mit dem Mortalitätsrisiko von nicht-COPD Todesursachen, insbesondere Koronararterienerkrankung (CAD), Schlaganfall und Lungenkrebs untersucht. Obwohl dies allgemein anerkannte Konsequenzen der chronischen Einwirkung von Zigarettenrauch sind, ist aus diesem epidemiologischen Studien klar, dass nur ein Teil der Raucher durch diese Störungen sterben. Das Gegenteil zeigt jedoch, dass über 90% von COPD und Lungenkrebs der chronischen Einwirkung von Zigarettenrauch zuzuordnen sind. Rauchen wird als der wichtigste Risikofaktor der Lebensführung angesehen, der zur Mortalität durch Koronararterienerkrankungen beiträgt. Obwohl die epidemiologischen Studien eine verschiedenartige Gruppe von Lebewesen herangezogen haben, haben sie durchwegs verringertes FEV1 (oder eine verbundene Messung) als einen signifikanten und unabhängigen Risikofaktor für den Tod nicht nur durch COPD, sondern auch durch CAD, Schlaganfall und Lungenkrebs identifiziert (Hole DJ, et al. 1996, Knuiman MW, et al. 1999, Sorlie PD, et al. 1989, Athonisen NR, 1989, Bang KM, et al. 1993, Rodriguez BL, et al. 1994 and Weiss ST, et al. 1995). In der größten dieser Studien war das Todesrisiko durch CAD, das beeinträchtigter Lungenfunktion zuzuordnen ist, so groß wie das für Cholesterinserum (Hole DJ, et al. 1996). Das Mortalitätsrisiko, das mit verringertem FEV1 für CAD verbunden ist, wird sowohl bei Rauchern als auch Nichtrauchern gesehen, aber ist ungefähr zweimal stärker bei den Erstgenannten (Hole DJ, et al. 1996).
Es ist seit langem anerkannt, dass chronisch obstruktive Lungenerkrankungen, Lungenkrebs, Schlaganfall und Koronararterienerkrankung alle in Familien laufen, und dass die chronische Einwirkung von Zigarettenrauch ein wichtiger Umweltbeitrag zur Entwicklung dieser Erkrankungen ist. Obwohl prospektive Studien gezeigt haben, dass verringertes FEV1 ein verlässlicher Prädiktor von gesteigertem Risiko gegenüber all diesen Erkrankungen ist, kann es dreißig oder mehr Jahre chronischen Rauchens dauern, bevor es einen ausreichend Schaden an den Lungen gibt, damit diese Suszeptibilität klinisch nachweisbar ist (durch verringertes Lungenfunktionstesten).
Es wäre wünschenswert und vorteilhaft Verfahren zu haben, welche verwendet werden könnten, um die Prädisposition eines Lebewesens zu bestimmen, pulmonare Erkrankungen, wie z.B. chronisch obstruktive Pulmonarerkrankung (COPD) zu entwickeln, oder einer Prädisposition, um beeinträchtigte Lungenfunktion und das damit verbundene Risiko von obstruktiver Lungenerkrankung und das Risiko für verbundene Krankheiten, wie z.B. CAS, Schlaganfall und Lungenkrebs, zu entwickeln, insbesondere wenn das Lebewesen ein Raucher ist und/oder eine gesteigerte Suszeptibilität gegenüber oxidativer Belastung hat.
Bisherige Verfahren beinhalten die Untersuchung von Expressionsmustern von TGF-β₁, TGFβ Rezeptortyp I und II (de Boer et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158; 1951–1957) und das Analysieren einzelner Nukleotidpolymorphismen des TGF-β₁ Promoters (WO 02/08468). Wert et al (PNAS 2000:97, Nr. 11: 5972 bis 5977) studierten das Tensidprotein D und Matrixmetalloproteinasen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basierte teilweise auf der überraschenden Feststellung, das Polymorphismen bestimmter Gene und Gruppen von Genen insbesondere diejenigen, die in Matrixremodulierung, Antioxidantienverteidigung, Entzündungsantworten und ihren Inhibitoren involviert sind, häufiger bei Patienten mit COPD als in Kontrolllebewesen gefunden werden. In einem anderen Teil basiert die vorliegende Erfindung auf einer weiteren überraschenden Feststellung, dass die Polymorphismen bei diesen Genen und/oder ihren regulatorischen Bereichen mit der Schwere einer beeinträchtigten Lungenfunktion bei Rauchern verbunden ist.
Bis heute ist es nicht möglich gewesen, die Gesamtwirkungen (additiv, schützend oder multiplikativ) verschiedener genetischer "Suszeptibilitäts"-Varianten, die zu COPD/Emphysemie oder beeinträchtigter Lungenfunktion beitragen, zu bewerten. Somit scheint das Vorhandensein verschiedener Varianten (Mutationen und/oder Polymorphismen) der COPD/Emphysem Suszeptibilitätsgene ein größeres Risiko zu verleihen, COPD/Emphysemie und/oder beeinträchtigte Lungenfunktion in einem einfachen Additivmodul zu haben.
Somit wird gemäß einem Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen einer Prädisposition eines Lebewesens einen Zustand zu entwickeln, zum Bestimmen eines potentiellen Risikos eines Lebewesens den Zustand zu entwickeln oder zum Diagnostizieren eines potentiellen Beginns des Zustands in einem Lebewesen bereitgestellt, wobei das Verfahren wenigstens die Analyse von wenigstens einem Polymorphismus aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
A-82G in dem Promoter des MMP12 (menschliche makrophage Elasthase) kodierenden Gens;
T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ (transformierender Wachstumsfaktor Beta) kodierenden Gens;
C+760G des SOD3 (Superoxiddismutase 3) kodierenden Gens;
T-1296C in Promoter des TIMP3 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinase 3) kodierenden Gens; und
Polymorphismen im Bindungsgleichgewicht mit diesen Polymorphismen;
wobei der Genotyp des Lebewesens indikativ für die Prädisposition zur Entwicklung des Zustands, für das potentielle Risiko zur Entwicklung des Zustands oder für den potentiellen Beginn des Zustands ist, und wobei der Zustand eine chronisch obstruktive Pulmonarerkrankung (COPD) oder eine beeinträchtigte Lungenfunktion ist.
Gemäß einen zweiten Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Bestimmen einer Prädisposition eines Lebewesens und/oder des potentiellen Risikos für die Entwicklung eines Morbiditäts-/Mortalitätsrisikos einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist, bereitgestellt, dass mindestens die Analyse von mindestens einem Polymorphismes, der aus der Gruppe, die aus
T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ (transformierender Wachstumsfaktor Beta) kodierenden Gens;
C+760G des SOD3 (Superoxiddismutase 3) kodierenden Gens;
T-1296C im Promoter des TIMP3 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinase 3) kodierenden Gens; und
Polymorphismen im Bindungsungleichgewicht mit diesen Polymorphismen besteht, ausgewählt wird, wobei der Genotyp des Lebewesens indikativ für die Prädisposition für und/oder ein potentielles Risiko zur Entwicklung eines Morbiditäts-/Mortalitätsrisikos der Erkrankung ist.
Der Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass die Bestimmung von Polymorphismen auf einem oder einer Kombination von Genen durchgeführt werden kann. Die Bestimmung der Prädisposition eines Lebewesens eine COPD zu entwickeln, kann zum Beispiel somit z.B. nur auf der Analyse des Promoterbereichs der interstitiellen Kollagenase oder dem von Gelatinase B oder dem von Makrophagenelastasen basieren. Es ist jedoch bevorzugt, dass regulatorische und/oder Promoterpolymorphismen einer Kombination der hier beschriebenen Gene, von zwei oder allen zusammen, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird verständlich sein, dass der Begriff „Polymorphismen" verwendet wird, um jede Varianten und Mutationen, einschließlich der vollständigen oder Teilabwesenheit von Genen (z.B. Nullmutationen), zu beschreiben.
Bevorzugt wird eine „Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist", wie hier verwendet, aus der Gruppe, die aus chronisch obstruktiver Pulmonarerkrankung, Koronararterienerkrankung, Schlaganfall und Lungenkrebs besteht, ausgewählt.
Ein Satz von Nukleotidsonden und/oder -primern für die Verwendung in den Verfahren von irgendeinem der zuvor genannten Aspekte kann bereitgestellt werden. Die bevorzugten Primer und/oder Sonden sind die, welche die polymorphen Bereiche der Gene, die für Matrixremodelierungsproteine (einschließlich Proteasen und/oder ihre Inhibitoren), Entzündungsproteine und auf oxidativen Stress reagierende Proteine, und von anderen Genen, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kodieren, überspannen oder verwendet werden können, um zu überspannen.
Der Genotyp des Lebewesens ist indikativ für die Prädisposition und/oder das potentielle Risiko zur Entwicklung eines Morbiditäts-/Mortalitätsrisikos der Erkrankung.
Bevorzugt wird die Erkrankung aus der Gruppe, die aus chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Koronararterienerkrankung, Schlaganfall und Lungenkrebs besteht, ausgewählt. Bevorzugt ist die chronisch obstruktive Lungenerkrankung eine chronisch obstruktive Pulmonarerkrankung.
Bevorzugt umfasst ein Verfahren einer bevorzugten Form der Erfindung des Weiteren die Analyse eines Polymorphismus bei mindestens einem Gen, das für ein Protein kodiert, das beim Matrixremodulieren, der antioxidativen Verteidigung oder der Entzündungsantwort involviert ist, einschließlich von Genen, die für Matrixmetalloproteinasen, Entzündungs- und entzündungshemmende Cytokine, Inhibitoren von Matrixmetalloproteinasen und -enzymen, die bei metabolisierenden Oxidantien involviert sind, kodiert. Bevorzugt wird das mindestens eine Gen aus der Gruppe, die aus
MMP1 (interstitielle Collagenasen);
MMP9 (Gelatinase B);
MMP12 (menschliche Makrophagenelasthase);
α1-Antitypsin; und
GST1 (Glutathion S Transferase 1).
TGFβ (transformierender Wachstumsfaktor β);
SOD3 (Superoxiddismutase 3); oder
TIMP3 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinase 3). besteht, ausgewählt.
Bevorzugt ist die Polymorphismenanalyse 1G/2G bei Position -1607 innerhalb des Promoters MMP1, C-1562T in dem Promoter des MMP9 kodierenden Gens, G1237A in der 3'Region des α 1-Antitrypsin kodierenden Gens, das M1 Null Polymorphismus in dem GSTM1 kodierenden Gen, A-82G in dem Promoter des MMP12 kodierenden Gens.
Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung umfasst das Analysieren des Polymorphismus:
1G/2G bei Position -1607 innerhalb des Promoters für MMP1;
C-1562T in dem Promoter des MMP9 kodierenden Gens; und
A-82G in dem Promoter des MMP12 kodierenden Gens.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren der Erfindung umfasst das Analysieren des Polymorphismus:
1G/2G bei Position -1607 innerhalb des Promoters MMP1;
T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens;
C+760G des SOD3 kodierenden Gens; und
T-1296C im Promoter des TIMP3 kodierenden Gens.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren der Erfindung umfasst das Analysieren des Polymorphismus:
A-82G in dem Promoter des MMP12 kodierenden Gens;
G1237A in der 3'Region des α1-Antitrypsin kodierenden Gens; und
M1 Null Polymorphismus des GST1 kodierenden Gens.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus A-82G in dem Promoter des MMP12 kodierenden Gens analysiert wird, ist der Genotyp -82AA in dem Promoter des MMP12 kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) eine Prädisposition zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; b) potentielles Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und c) potentieller Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus C+760G in dem SOD3 kodierenden Gen analysiert wird, sind die Genotypen +76000 oder +760CG innerhalb des SOD3 kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) Schutz gegenüber der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) verringertes Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus T-1296C in dem Promoter des TIMP3 kodierenden Gens analysiert wird, ist der Genotyp-1296TT in dem Promoter des TIMP3 kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) Schutz gegenüber der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) verringertem Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus T→C in dem Kodon 10 des TGFβ kodierenden Gens analysiert wird, ist der Genotyp CC (homozygotisches P Allel) in dem Kodon 10 des TGFβ kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) Schutz gegenüber der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) verringertem Risiko der Entwicklung COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus 1G12G an Position -1607 in dem Promoter von MMP1 analysiert wird, ist der Genotyp 2G2G in dem Promoter des MMP1 kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) Schutz gegenüber der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) verringertem Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus C-1562T in dem Promoter des MMP9 kodierenden Gens analysiert wird, sind die Genotypen -1562CT und -1562TT in dem Promoter des MMP9 kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) Prädisposition der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; b) das potentielle Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und c) dem potentiellen Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
In Übereinstimmung mit einem Verfahren der Erfindung, bei dem der Polymorphismus G1237A in der 3'Region des α1-Antitrypsin kodierenden Gens analysiert wird, sind die Genotypen 1237AG und 1237AA (Tt oder tt Allel Genotypen) in der 3'Region des α1-Antitrypsin kodierenden Gens indikativ für eine oder mehrere von: a) Prädisposition der Entwicklung von COPD, beeinträchtigte Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; b) potentielles Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und c) dem potentiellen Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
In einer bevorzugten Form der Erfindung ist das Vorhandensein von zwei oder mehreren schützenden Genotypen indikativ für ein verringertes Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion. und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In einer weiter bevorzugten Form der Erfindung ist das Vorhandensein von zwei oder mehreren. Suszeptibilitäts-Genotypen indikativ für ein gesteigertes Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist das Lebewesen ein Raucher oder jemand, der hohen Niveaus an Luftschadstoffen, wie z.B. umgebungsbedingter Tabakrauch, ausgesetzt ist.
In einem Aspekt der Erfindung, bei dem der Polymorphismus T→C in dem Kodon 10 des TGFβ kodierenden Gens und/oder des Polymorphismus C+760G des SOD3 kodierenden Gens analysiert wird, wird die Analyse unter Verwendung von TGFβ oder SOD3 kodierendem RNA oder CDNA durchgeführt.
Ein Satz von Nukleotidsonden und/oder -Primern kann für die Verwendung in den hier zuvor beschriebenen bevorzugten Verfahren der Erfindung bereitgestellt werden. Bevorzugt sind die Nukleotidsonden und/oder -primer die, die die polymorphen Bereiche der Gene überspannen oder zum Überspannen verwendet werden können.
In einem weiteren bevorzugten Aspekt umfasst die Erfindung mindestens den Schritt in dem Lebewesen die Aminosäure, die an einer Position, die Kodon 10 des TGFβ kodierenden Gens zuzuordnen ist, zu analysieren.
Das Vorhandensein von Leucin an der Position ist ein Anzeichen einer Prädisposition und/oder eines potentiellen Risikos der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist, und/oder dem potentiellen Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion. Das Vorhandensein Prolin an dieser Position ist ein Anzeichen für ein verringertes Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
In einem anderen bevorzugten Aspekt umfasst die Erfindung mindestens den Schritt in einem Lebewesen die Aminosäure, die an Position 213 von SOD3 vorhanden ist, zu analysieren.
Das Vorhandensein von Glycin an Position 213 ist ein Anzeichen auf ein potentielles Risiko zur Entwicklung und/oder Prädisposition zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist, und/oder dem potentiellen Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
Das Vorhandensein von Arginin an der Position ist ein Anzeichen für ein verringertes Risiko COPD, beeinträchtigte Lungenfunktion und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Erkrankung, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist, zu entwickeln.
Wenn hier auf „Raucher" Bezug genommen wird, soll der Begriff ebenfalls Ex-Raucher umfassen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Der Prozentsatz am Menschen mit COPD, der gegenüber der Anzahl an genetischen Suszeptibilitätsvarianten geplottet ist zeigt eine lineare Beziehung mit einer abgeschätzten Wahrscheinlichkeit COPD in einer Höhe von 80% bei diesen vier oder mehr Suszeptibilitätsvarianten zu haben.
2: Graphische Darstellung der Daten in Tabelle 10. Die Risikoabschätzung, wie durch das standardisierte Verhältnis quantifiziert, zeigt, dass das Vorhandensein von 0 Schutzgenotypen in dieser Studie signifikant das Risiko eines Rauchers COPD zu haben um 167 erhöht ist. Umgekehrt zeigt die Analyse, dass das Risiko eines Rauchers mit 2 oder mehr Schutzgenotypen COPD zu haben, um 67% verringert ist. In Anbetracht, dass das Hintergrundrisiko von COPD bei Rauchern vor den genetischen Tests ungefähr 20% ist, erhöht das Vorhandensein von 0 Schutzgenotypen signifikant dieses Risiko.
3: Graphische Darstellung der Daten in Tabelle 11. Die Risikoabschätzungsanalysen zeigten keine signifikanten Unterschiede im Risiko, obwohl die Trends, die ein größeres Risiko eines Rauchers mit COPD in Anwesenheit von zwei oder mehr Suszeptibilitätsgenotypen zeigten, evident waren.
4–6: Die 4–6 zeigen einen Trend in Richtung einer größeren Lungenfunktion bei Rauchern mit steigender Anzahl von Schutzgenotypen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Unter Verwendung von Fallkontrollstudien haben wird die Frequenzen verschiedener genetischer Varianten (Polymorphismen) von Kandidatgenen bei Rauchern und Blutspendern verglichen. Die Mehrheit dieser Kandidatgenen haben bestätigte (oder wahrscheinlich) funktionale Wirkungen auf die Genexpression oder Proteinfunktion. Im Speziellen haben wird die Frequenzen von Polymorphismen zwischen Blutspenderkontrollen, resistenten Rauchern und denen mit COPD (unterteilt in die mit frühem Beginn und die mit normalem Beginn) verglichen. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass es sowohl Schutz- als auch Suszeptibilitätsgenotypen gibt, die sich von ausgewählten Kandidatgenpolymorphismen ableiten. In Anbetracht, dass COPD eine polygene Erkrankung ist und wahrscheinlich viele Genotypen bei der Entwicklung von COPD bei jedem der suszeptiblen Raucher involviert sind, können nur einfache genetische Modelle untersucht werden (d.h. der Netzeffekt der Suszeptibilität und der schützenden Genotypen ist nicht bekannt). In einer hier beschriebenen Ausführungsform werden drei genetische Suszeptibilitätspolymorphismen und 4 genetische Schutzpolymorphismen identifiziert. Statistische Analysen der kombinierten Wirkungen dieser Polymorphismen zeigen, dass die genetischen Assays der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um Raucher mit einem größeren Risiko der Entwicklung von COPD zu identifizieren.
Somit ist es möglich, durch die systematische Analyse der Frequenz dieser Polymorphismen in gut definierten Gruppen von Rauchern und Nichtrauchern bestimmte Proteine mit der Entwicklung von COPD in Zusammenhang zu bringen und unser Fähigkeit zu verbessern, zum Zwecke der Prognose zu identifizieren, welche Raucher ein erhöhtes Risiko der Entwicklung einer beeinträchtigen Lungenfunktion und COPD haben.
Da nur die Minderheit von Rauchern an einer oder einer Kombination dieser Erkrankungen leiden, können „suszeptible Raucher" existieren, die durch die kombinierten Wirkungen der genetischen Mechanismen und einer hohen Einwirkung von Oxidantien ein größeres Risiko für eine rauchbedingten Lungenerkrankung (COPD und Lungenkrebs) haben. In Anbetracht der heutigen epidemiologischen Feststellungen ist es wahrscheinlich, dass diese genetische Suszeptibilität sich ebenfalls auf eine Prädisposition auf andere rauchbedingte Erkrankungen, wie zum Beispiel CAD und Schlaganfall, erstreckt.
Des Weiteren glauben wir, dass verringerte FEV1 ein Biomaker einer allgemeinen Suszeptibilität bezüglich Nebenwirkungen des chronischen Rauchens und oxidativen Stresses ist. D.h., dass es unter Bedingungen eines chronisch oxidativen Stresses (wie bei chronischer Einwirkung von Zigarettenrauch zu sehen) eine Änderung in der Aktivität der Proteine, die in Matrixremodulierung, Entzündung und/oder oxidativem Stress involviert sind, gibt. Die geänderten Aktivitäten dieser Proteine (typischerweise Enzyme) über längere Zeiträume führen zu der Promotion von Lungenentzündung, Fibrose und parenchymaler Schädigung, was chronische obstruktive Lungenerkrankungen verursachen kann, und tragen zu Lungenkrebs bei. Die gleichen Prozesse treten in der Arterienwand auf, wobei dabei die Progression und/oder die Instabilität der atheromatösen Plaque gefördert werden, was in dem Fortschreiten der atheromatösen Plaque zur Thrombosebildung resultiert, wenn nicht in der Entwicklung von Koronararterienerkrankung und Schlaganfall (Waltenberger J. 2001). Die Thrombosebildung führt wiederum zu Krankheitsbildern einer instabilen Angina, akutem Myokardinfakt und Schlaganfall, welche alle eine hohe Mortalität mitbringen. Es ist vorgeschlagen worden, dass die Prozesse der Entzündung, der Matrixremodulierung und/oder der Antwort auf oxidativen Stress zur Plaqueinstabilität, die diese Krankheitsbilder charakterisieren, beitragen. In diesem Zusammenhang ist verringertes FEV1 ein indirekter Biomaker von denen mit einer Suszeptibilität zu ungünstiger Matrixremodulierung, Entzündung und gesteigertem Schaden durch oxidativen Stress. Somit können durch diese Mechanismen verringertes FEV1 und Mortalitätsrisiko für diese Erkrankungen durch die Aktivität der Matrixremodulierungsproteine, Entzündungsproteine und einer individuellen inhärenten Antwort auf oxidativen Stress verbunden werden. Obwohl verringerte FEV1 eine zuverlässige Vorhersage des erhöhten Risikos für all diese Erkrankungen ist, kann es dreißig oder mehr Jahre chronischen Rauchens benötigen, bevor es einen hinlänglichen Schaden an den Lungen gibt, damit diese Suszeptibilität klinisch nachweisbar ist (durch einen Test auf eine verringerte Lungenfunktion). Die Verfahren der vorliegenden Erfindung überwinden diesen Nachteil.
Beispiele
Die Erfindung wird nun detaillierter unter Bezugnahme auf nicht beschränkende Beispiele beschrieben werden.
Beispiel 1: Vorstudien
1.1 Auswahl der Lebewesen
Die Patienten von europäischer Abstammung, die mit einer Verschlimmerung ihres COPDs in ein Krankenhaus eingewiesen wurden, wurden nacheinander ausgewählt. COPD wurde in den Lebewesen definiert, die ein Minimum von 20 Packungen im Jahr geraucht hatten und ein FEV1/FVC¹ Verhältnis (Einsekundenausatemkapazität/forcierte Vitalkapazität) von < 70% und eine FEV1 als ein Prozentsatz von prognostizierten < 70% hatten (gemessen unter Verwendung der American Thoracic Society Kriterien). Patienten mit den oben genannten Lungenfunktionstests, bei denen COPD durch spezialisierte Ärzte diagnostiziert wurde, wurden ausgewählt, wenn sie über 50 Jahre alt waren und nach 40 Lebensjahren Symptome von Atemnot entwickelt hatten. Die mit einer Geschichte von Asthma, Bronchiektasie oder Lungenoperation waren ausgeschlossen. Vierundachtzig Patienten wurden ausgewählt, von den 56% männlich waren, wobei das durchschnittliche FEV1/FVC (± Standardabweichung) 0.44 (0.12) war, wobei die durchschnittliche FEV1 als ein prognostizierter Prozentsatz 33 (13) war. Das durchschnittliche Alter und die durchschnittliche Packungsanzahl pro Jahr waren 73 (9) Jahre und 45 (29) Packungen im Jahr. Unter Verwendung eines auf PCR basierenden Verfahrens (Sandfort et al., 1999) genotypisierten wir die COPD Gruppe für die α1-Antitrypsinmutationen (S und Z Varianten) und keine hatte das Z Allel (MZ, SZ, ZZ Genotyp). Wir studierten ebenfalls 178 europäische Blutspender (Rauchstatus unbekannt), die nacheinander über den örtlichen Blutspendeservice ausgewählt wurden. Fünfundfünfzig Prozent waren männlich und ihr durchschnittliches Alter war 45 Jahre.
1.2. MMP1 Promoterpolymorphismusgenotypisierung
Die genomische DNA wurde aus Gesamtblutproben (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J.; Molecular Cloning Manual. 1989) extrahiert. Der MMP1 Promoterpolymorphismus wurde durch geringe Modifikationen eines zuvor veröffentlichen Verfahrens (Dunleavey et al., 2000) bestimmt.
Die PCR Oligonukleotidprimer waren 5'-TCG-TGA-GAA-TGT-CTT-CCC-ATT-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-TCT-TGG-ATT-GAT-TTG-AGA-TAA-GTG-AAA-TC-3' (Rückwärtsprimer). Die PCR Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt und enthielt 50 ng genomische DNA, 10 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 100 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ und 1 Einheit Taq Polymerase. Die Zyklisierungszeiten waren Inkubationen für 2 min bei 95°C gefolgt von 35 Zyklen von 45s bei 92°C, 50s bei 60°C und 50s bei 72°C. 4 μl PCR Produkte (118 bp) wurden durch ultraviolette Transillumination eines 3% Agarosegels, das mit Ethidiumbromid versetzt war, visualisiert. Der Rest wurde für 4 Stunden mit 10 Einheiten Asp 700 (Roche Diagenostics, Neuseeland) bei 37°C verdaut. Die verdauten Produkte wurden an einem 3% Agarosegelrun für 2.5 Stunden bei 80 V mit TBE Puffer getrennt. Das PCR Produkt blieb unbeschnitten (d.h. 118 bp) in der Gegenwart des 2G Allels oder wurde in Streifen von 100 bp und 17 bp in Gegenwart des 1G Allels geschnitten. Das direkte Sequenzieren wurde bei 3 Lebewesen durchgeführt, die den Genotypen 1G1G, 1G2G oder 2G2G durch das oben genannte Verfahren zugewiesen wurden und bestätigten, dass das Letztgenannte korrekt die Abwesenheit oder Gegenwart des 1G oder 2G Allels identifizierte.
1.3. MMP9 Promoterpolymorphismusgenotypisierung
Genomische DNA wurde aus Gesamtblut durch dieselben in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren extrahiert. Das Genotypisieren der Gelatinase B (MMP9) C-1562T Promoterpolymorphismus wurde durch PCR (Modifiziert durch das von Zhang B., et al. 1999 veröffentlichte Verfahren) unter Verwendung des Primers gelb1 (5'-GCC-TGG-CAC-ATA-GTA-GGC-CC-3') und gelb2 (5-CTT-CCT-AGC-CAG-CCG-GCA-TC-3') durchgeführt. Die PCR Amplifikation wurde in einem PTC-100 Thermozykler (MJ Research, Inc.) in 25 μl Reaktionsmischung durchgeführt. Die Reaktionsmischung war 50 ng genomische DNA, 50 ng jedes Primers, 20 μM dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und 0.001 Gelatine. Die PCR Zyklusbedingungen waren: ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 95°C für 3 Minuten, 35 Zyklen PCR (Denaturierung bei 92°C für 50 Sekunden, Anlagerung bei 66°C für 48 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 58 Sekunden) gefolgt von einem Zyklusverlängerung bei 72°C für 5 Minuten. Vier Mikroliter Aliquots der PCR Produkte wurden mit 10 U Restriktionsenzym SphI (LifeTech) in dem empfohlenen Puffersystem bei 37°C für fünf Stunden verdaut. Alle Verdauungsprodukte wurden auf einem 3% Agarosegel analysiert. Das direkte Sequenzieren wurde bei drei Lebewesen, die den Genotypen CC, CT oder TT zuzurechnen waren, durch das oben genannte Verfahren durchgeführt und bestätigten, dass das Letztgenannte korrekt die C und T Allele identifizierte.
1.4. MMP12 Promoterpolymorphismusgenotypisierung
Die genomische DNA wurde aus Gesamtblut durch dieselben in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren extrahiert. Das Genotypisierung des menschlichen Makrophagenelasthase (MMP12) A-82G Promoterpolymorphismus wurde durch PCR (modifiziert durch die von Jormsjo S. et al. 2000 publizierten Verfahren) unter Verwendung der Primer hmepl (5'-AGA-TAG-TCA-AGG-GAT-GAT-ATC-AGC-T-3') und hmep2 (5-GGC-TTG-TAG-AGC-TGT-TCA-GGG-3'). Die PCR Amplifikation wurde in einem PTC-100 Thermozykler (MJ Research, Inc.) in 25 μl Reaktionsmischung durchgeführt. Die Reaktionsmischung war 50 ng genomische DNA, 50 ng jedes Primers, 20 μM dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und 0,001% Gelatine. Die PCR Zyklusbedinungen waren: Ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 Minuten, 35 Zyklen PCR (Denaturierung bei 92°C für 50 Sekunden, Anlagerung bei 66°C für 48 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 58 Sekunden), gefolgt von einem Zyklusverlängerung bei 72°C für 5 Minuten. Vier Mikroliter Aliquots der PCR Produkte wurden mit 10 U Restriktionsenzym PvuII (Live Tech) in dem empfohlen Puffersystem bei 37°C für fünf Stunden verdaut. Alle Abbauprodukte wurden an 3% Agarosegel analysiert. Direktes Sequenzieren wurde bei drei Lebewesen, die den Genotypen AA, AG oder GG zuzuordnen sind, durch das oben beschriebenen Verfahren durchgeführt und bestätigten, dass das Letztgenannte korrekt die A und G Allele identifizierte.
Die Genotypen wurden durch zwei Prüfer unabhängig und blind gegenüber dem Phenotyp (COPD und Kontrolle) Status zugeordnet. Die Unterschiede in den Allel- und Genotypfrequenzen wurden durch Odd's Ratio unter Verwendung von Cornfield 95% Konfidenzgrenzen, Yates korrigierter χ2-Quadratetest mit Signifikanz bei p ≤ 0.05 verglichen.
1.5. MMP1/MMP9/MMP12 Promoterallel und Genotypfrequenzen
Die Analyse unserer Genotypisierungsdaten zeigte, dass das Hardy Weinberg Gleichgewicht bei beiden Haufen erreicht und das signifikante Unterschiede gefunden wurden (zusammengefasst in den Tabellen 1, 2 und 3). Tabelle 1. MMP1 1G/2G Promoterpolymorphismusallel und Genotypfrequenz bei den COPD Patienten und Blutspenderkontrollen

*Anzahl der Chromosome (2n)
1. Allel: 2G vs 1G für COPD vs Kontrollen, Odds Ratio (OR) = 1.89, 95% Konfidenzgrenzen 1.3–2.7,
χ2 (Yates korrigiert) = 10.67, P = 0.001
Genotyp: 2G2G vs 1G1G + 1G2G für COPD vs Kontrollen, OR = 2.47, 95% Konfidenzgrenzen 1.3–4.5, χ2 (Yates korrigiert) = 9.05, p = 0.003

* Anzahl der Chromosome (2n)1. Allel T vs C für COPD vs Kontrollen, Odds Ratio (OR) = 1.94, 95% Konfidenzgrenzen 1.2-3.1,
χ2 (Yates korrigiert) = 7.91, p = 0.004
2. Genotyp: CT/TT vs CC für COPD vs Kontrollen, OR = 2.1, 95% Konfidenzgrenzen 2.2–3.7,
χ2 (Yates korrigiert) = 6.7, p = 0.009.

*Anzahl der Chromosome (2n)
3. Allel: A vs G für COPD vs Kontrollen, Odds Ratio (OR) _ 2.17, 95% Konfidenzgrenzen 1.8–2.8,
χ2 (Yates korrigiert) = 6.83, p = 0.009
2. Genotyp: AA vs AG/GG für COPD vs Kontrollen, OR = 2.21, 95% Konfidenzgrenzen 1.2–4.3,
χ2 (Yates korrigiert) = 5.89, p = 0.02.

Die oben genannten Daten zeigen, dass die MMP1 1G/2G, das MMP9 C-1562T und das MMP12 A-82G Promoterpolymorphismen unabhängige Kandidatorte für die Suszeptibilität zur Entwicklung von COPD sind. Im Falle von MMP1 waren sowohl die 2G Allelfrequenz als auch die 2G2G Genotypfrequenz signifikant vorherrschender bei den COPD Patienten als bei der gesunden Kontrollpopulation (60% vs 45% bzw. 39% vs 21%). Gleichzeitig waren im Falle von MMP9 sowohl die T Allelfrequenz als auch die CT/TT Genotypfrequenz signifikant bei den COPD Patienten vorherrschender, als bei der gesunden Kontrollpopulation (26% vs 15% bzw. 47% vs 29%). Letztlich waren im Falle von MMP12 sowohl die A Allelfrequenz als auch die AA Genotypfrequenz signifikant vorherrschender bei den COPD Patienten als bei der gesunden Kontrollpopulation (90% vs 80% bzw. 80% vs 64%).
1.6. Genotypisieren des alpha 1-Antitrypsin 3'Taq 1 Polymorphismus
Die genomische DNA wurde aus Gesamtblut wie für die vorhergehenden Beispiele extrahiert. Der alpha 1-Antitrypsin 3'Taq 1 Polymorphismus wurde durch die folgenden Verfahren unter Verwendung zuvor veröffentlichter Primer (Sandford AJ, et al. 1997b) bestimmt. Die PCR Oligonukleotidprimer waren 5'-CTA-CCA-GGA-ATG-GCC-TTG-TCC-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-CTC-TCA-GGT-CTG-TGT-TCA-TCC-3' (Rückwärtsprimer). Die PCR Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt und enthielt 50 ng genomische DNA, 10 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 100 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ und 1 Einheit Taq Polymerase. Die Zyklusierungszeiten waren Inkubationen für 2 min bei 95°C, gefolgt von 35 Zyklen von 45s bei 94°C, 40s bei 62°C und 45s bei 72°C mit einem Endzyklus von 5 min bei 72°C. 4 μl der PCR Produkte (205 bp) wurden durch ultraviolette Transillumination eines 1.5% Agarosegels, das mit Ethidiumbromid versetzt ist, visualisiert. Der Rest des PCR Produkts wurde für 4 Stunden mit 10 Einheiten Taq 1 Restriktionsenzym (Roche Diagnostics, Neuseeland) bei 65°C verdaut. Die verdauten Produkte wurden auf einem 2% Agarosegelrun für 2.5 Stunden bei 80 V mit TBE Puffer getrennt. Das PCR Produkt verblieb ungeschnitten (d.h. 205 bp) in Gegenwart des t (Mutant) Allels oder wurde in Streifen von 130 bp und 75 bp in Gegenwart des T (Wildtyp) Allels geschnitten.
1.7. Genotypisierung des Glutathion S-Transferase (GST) M1 Null Polymorphismus
Die genomische DNA wurde aus Gesamtblut wie für die vorherigen Beispiele extrahiert. Der Glutathion S-Transferase (GST) M1 null Löschungspolymorphismus wurde durch die folgenden Verfahren unter Verwendung zuvor veröffentlichter Primer bestimmt (Cantlay AM, et al. 1994). Die PCR Oligonukleotidprimer waren (5'-CTG-CCC-TAC-TTG-ATT-GAT-GG-3'; 5'-ATC-TTC-TCC-TCT-TCT-GTC-TC-3' und 5'-TTC-TGG-ATT-GTA-GCA-GAT-CA-3'). Die PCR Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt und enthielt 50 ng genomische DNA, 50 ng jedes Primers, 20 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ und 0.5 Einheiten Taq Polymerase. Die Zyklisierungszeiten waren Inkubationen für 3 min bei 95°C, gefolgt von 35 Zyklen von 45s bei 94°C, 48s bei 56°C und 48s bei 72°C mit einer Endverlängerung für 3 min bei 72°C. 6 μl der PCR Produkte wurden durch ultraviollete Transillumination eines 2% Agarosegels, das mit Ethidiumbromid versetzt ist, visualisiert. Die PCR Produkte waren eine 202 bp Bande (GSTM4 interne Kontrolle für die Amplifikation) und entweder eine 275 bp Bande für ein normales GSTM1 (Homozygot oder Heterozygot) oder eine 275 bp Bande, was auf Homozygosität für die GSTM1 Nulllöschung hindeutete. Tabelle 4. Alpha 1-Antitrypsin 3' Prime Taq 1 Polymorphismusallel und Genotypfrequenz bei COPD Patienten und Blutspenderkontrollen.

* Anzahl der Chromosome (2n)
4. Allel: t vs T für COPD vs Kontrollen, Odds Ratio (OR) _ 3.76, 95% Konfidenzgrenzen 1.6–8.8,
χ2 (Yates korrigiert) = 11.27, p = 0.0008
2. Genotyp: Tt/tt vs TT für COPD vs Kontrolle, OR = 11,98 Konfidenzgrenzen 1.7–10.0,
χ2 (Yates korrigiert) = 11.98, p = 0.0005.

n vs N in COPD verglichen mit den Kontrollen OR = 2.6, 95% 1.5–4.6,
χ2 (Yates korrigiert) = 11.52, p = 0.0007.

Obwohl sich dieser Polymorphismus in einem Bereich, der regulatorische Elemente enthält, befindet, konnten in vitro-Studien keinen wichtigen funktionalen Effekt aus dieser genetischen Variante zeigen (Sandford et al. 1997). Für die GSTM1 Mutation haben wir eine Frequenz von 42% bei den Kontrollen und 65% bei unseren COPD Patienten gefunden.
Wenn die kombinierte Wirkung dieser genetischen Varianten bei einer logistischen Gleichung (Odds Ratio Abschätzungen), welche ähnliche Frequenzen bei gesunden Rauchern wie unsere Kontrollen annimmt, beurteilt wurden, stellte sich heraus, dass ungefähr 42% (95% Cl = 31–56%) der Tendenz zu COPD unabhängig durch jede der fünf genetischen Varianten erklärt werden könnte. Wenn graphisch untersucht, wobei der Prozentsatz an Leuten mit COPD gegenüber der Anzahl an genetischen Suszeptibilitätsvarianten geplotted wurde, zeigten sie bei denen mit vier oder mehr Suszeptibilitätsvarianten eine lineare Beziehung mit einer geschätzten Wahrscheinlichkeit COPD zu haben so hoch wie 80% (siehe 1).
Unser COPD Haufen ist wahrscheinlich eine heterogene Gruppe von Patienten mit variierendem Grad an Emphysemie, Bronchitis und reversibler Atemwegsobstruktion (die asmathische Komponente von COPD).
Die vorliegende Studie stellt Beweis bereit, dass MMP1, MMP9 und/oder MMP12 Überexpression der Entwicklung von COPD bei einigen Rauchern zu Grunde liegt und ist die erste, die direkt den 2G Allel (in MMP1), den T Allel (in MMP9) und den G Allel (in MMP12) Promoterpolymorphismus als die genetische Basis dieses Verfahrens impliziert.
Wie oben dargelegt, ist der in den vorliegenden Studien verwendete COPD Haufen wahrscheinlich eine heterogene Gruppe von Patienten mit variierender Schwere an Emphysemie als Teil ihrer COPD. Wir schlagen vor, dass eine und/oder eine Kombination des MMP1 2G Allels und/oder MMP9 T Allels und/oder MMP12 A Allels ihre Wirkung bei der Entwicklung von COPD durch Überexprimierung der relevanten Matrixmetalloproteinase und anschließender Entwicklung von Emphysem zeigt. Es ist jedoch nicht klar, wie der Entzündungsreiz der chronischen Einwirkung einer Zigarette in MMP Überexprimierung resultiert. Im Hinblick darauf ist es von Interesse, dass der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), ein Entzündungscytokin, das als Antwort auf Zigarettenrauch freigesetzt wird (und in der COPD Remodulierung impliziert ist) gezeigt hat, dass der an die Kernsequenz der Ets Transkriptionsfaktorbindungsseite (von der Ahe et al., 1993) bindet. Ohne an einen bestimmten Mechanismus gebunden zu werden, sei angemerkt, dass die oben genannten Polymorphismen mit Ets Transkriptionsbindungsseiten verbunden sind, die die Antwort auf Entzündungsreize, wie z.B. TNF-α, die die Risikoraucher zur Entwicklung von Emphysemie bringen, steigern.
Beispiel 2: Erweiterte Studie
Die vorgehende Festlegung von MMP1, 9 und 12 Promoterpolymorphismen als Kandidatorte für die Suszeptibilität der Entwicklung von COPD wurde von einer zweiten, breiteren Studie gefolgt, die das Genotypisieren der Kandidatenpolymorphismen der TGFβ, SOD3 und TIMP3 Gene beinhaltete. Diese Studie wurde entworfen, um zu Untersuchen ob sich sowohl Schutz- als auch Suszeptibilitätsgenotypen von dieser Unterart der Gene ableiten können.
2.1. Auswahl der Lebewesen
Lebewesen mit europäischer Abstammung, die ein Minimum von 15 Packungen pro Jahr geraucht hatten und bei denen ein Arzt chronische obstruktive Pulmonarerkrankung (COPD) festgestellt hat, wurden aus zwei Quellen ausgewählt. Die erste Gruppe waren Patienten, mit einer Verschlimmerung ihres COPDs und die die folgenden Kriterien erfüllten: sie waren über 50 Jahre alt und hatten in einem Alter von 40 Jahren Symptome von Atemnot entwickelt, hatten eine Einsekundenausatemkapazität (FEV1) als ein prognostizierter Prozentsatz < 70% und ein FEV1/FVC² Verhältnis (Einsekundenausatemkapazität/forcierte Vitalkapazität) von < 70% (gemessen unter Verwendung des American Thoracic Society Kriteriums). Einhundertundelf Lebewesenwesen wurden ausgewählt, von denen 58% männlich waren, das durchschnittliche FEV1/FVC (± interquartialer Bereich (IRQ)) war 44% (37–50), die durchschnittliche FEV1 als ein prognostizierter Prozentsatz war 32 (24–47). Das Durchschnittsalter und die Historie der Packungen pro Jahr waren 73 (66–77) Jahre und 43 (30–57) Packungen pro Jahr. Die zweite ausgewählte Gruppe waren Patienten, die mit Atemnot in eine Brustambulanz gebracht wurden, bei denen nach klinischer und spirometrischer Beurteilung COPD (durch einen Brustarzt) diagnostiziert wurden, und die die folgenden Kriterien erfüllten: sie waren jünger als 65 Jahre alt und hatten nach einem Alter von 40 Jahren Symptome von Atemnot entwickelt, hatten eine Einsekundenausatemkapazität (FEV1) als ein prognostizierter Prozentsatz < 70% und ein FEV1/FVC³ Verhältnis (Einsekundenausatemkapazität/forcierte Vitalkapazität) von < 70% (gemessen unter Verwendung des American Thoracic Society Kriteriums). Einundsechzig Lebewesen wurden ausgewählt von denen 43% männlich waren, wobei der Durchschnitt von FEV1/FVC (± interquartialer Bereich (IRQ)) 44% (38–55) war, wobei die durchschnittliche FEV1 als ein prognostizierter Prozentsatz 37 (24–47) war. Das Durchschnittsalter und -geschichte der Packung pro Jahr war 58 (53–62) Jahre und 41 (31–52) Packungen pro Jahr. Unter Verwendung eines auf PCR basierenden Verfahrens (Sandford et al., 1999) genotypisierten wir beide COPD Gruppen für die α1-Antitrypsinmutationen (S und Z Varianten) und hatten die mit dem Z Allel (MZ, SZ, ZZ Genotyp) eingeschlossen. Wir untersuchten ebenfalls 85 europäische Lebewesen, die ein Minimum von 20 Packungen pro Jahr geraucht hatten und die niemals an Atemnot litten und bei denen keine obstruktive Lungenerkrankung, insbesondere Asthma oder chronische obstruktive Lungenerkrankung, in der Vergangenheit diagnostiziert worden ist. Dies Kontrollgruppe wurde durch Klubs für Ältere ausgewählt und bestanden aus 58% Männern, der durchschnittliche FEV1/FVC (± IQR) war 82% (76–88), die durchschnittliche FEV1 als ein prognostizierter Prozentsatz war 94 (87–101). Das durchschnittliche Alter und die durchschnittliche Packungsgeschichte pro Jahr war 52 (46–61) Jahre und 38 (25–59) Packungen pro Jahr. Es wurden ebenfalls 178 europäische Blutspender (Rauchstatus unbekannt) nacheinander durch örtliche Blutspendedienste ausgewählt. 55% waren Männer und ihr durchschnittliches Alter war 45 Jahre.
Diese Studie zeigt, dass Polymorphismus, der verglichen mit den Kontrollen in größerer Frequenz bei COPD Patienten gefunden wurde, eine gesteigerte Suszeptibilität gegenüber der Entwicklung von beeinträchtigter Lungenfunktion und COPD reflektieren kann. Gleichzeitig kann Polymorphismus, der mit einer größeren Frequenz bei resistenten Rauchern verglichen zu suszeptiblen Rauchern (COPD Patienten) gefunden wurde, eine Schutzrolle reflektieren. Zusammenfassung der Charakteristika für die COPD (Hosp), COPD (Klinik) und resistenten Rauchern.
2.2. Transformationswachstumsfaktor β (TGFβ) Kodon 10 Polymorphismusgenotypisierung
Genomische DNA wurde aus Gesamtblutproben extrahiert (Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). Der (TGFβ) Kodon 10 Polymorphismus wurde durch geringe Modifikationen eines zuvor veröffentlichten Verfahrens bestimmt (Syrris et al., 1998, hier in Gänze unter Bezugnahme aufgenommen). Die PCR Oligonukleotidprimer waren 5'-ACC ACA CCA GAA ATG TTG GC-3' (Vorwärtsprimer) und 5'-AGT AGC CAC AGC GGT AGC AGC TGC-3' (Rückwärtsprimer). Die PCR Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt und enthielt 20 ng genomische DNA, 500 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 0.2 mM dNTPs, 10 mM, Tris-HCl (pH 8.4), 150 mM KCl, 1.0 mM MgCl₂ und 1 Einheit Taq Polymerase (Life Technologies). Die Zykluszeiten waren Inkubationen für 3 min bei 95°C, gefolgt von 33 Zyklen von 50s bei 94°C, 60s bei 66°C und 60s bei 72°C. Eine Endverlängerung von 10 min bei 72°C folgte dann. 4 μl der PCR Produkte wurden durch ultraviolette Transillumination eines 3% Agarosegels, das mit Ethidiumbromid versetzt war, visualisiert. Ein Teil von 3 μl des Amplifikationsproduktes wurde für eine Stunde mit 4 Einheiten PstI (Roche Diagnostics, Neuseeland) bei 37°C verdaut. Die verdauten Produkte wurden auf einem 2.5% Agarosegelrun für 2.0 Stunden bei 80 mV mit TBE Puffer getrennt. Es wurde ultraviolette Transillumination nach dem Versetzen mit Ethidiumbromid verwendet. Die Produkte wurden gegenüber einer 123 bp Leiter visualisiert. In Gegenwart des Leucin (L) Allels wurde die Produktgröße von 110 pb auf 86 bp und 24 bp Produkte geschnitten, während das amplifizierte Produkt in Gegenwart des Prolin (P) Allels ungeschnitten blieb. Direktes Sequenzieren wurde bei 3 Lebewesen durchgeführt, die den Genotypen LL, LB und PP durch das oben genannte Verfahren zugeordnet wurden, und bestätigten, dass das Letztgenannte korrekt die Abwesenheit oder die Anwesenheit der L oder P Allele identifizierte.
2.3. Superoxiddismutase 3 (SOD3) C+760G (Arg213Gly) Polymorphismusgenotypisierung
Genomische DNA wurde aus Gesamtblutproben extrahiert (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). Der SOD3 C+760G Polymorphismus wurde durch geringe Modifikationen eines zuvor veröffentlichten Verfahrens bestimmt (Ukkola et al., 2001, hier in Gänze unter Bezugnahme aufgenommen). Die PCR Oligonukleotidprimer waren 5'-GCA ACC AGG CCA GCG TGG AGA ACG GGA A-3'.(Vorwärtsprimer) und 5'-CCA GAG GAG AAG CTC AAA GGC AGA-3' (Rückwärtsprimer). Die PCR Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt und enthielt 175 ng genomische DNA, 1 nmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 0.1 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 150 mM KCl, 1.0 mM MgCl₂ und 0.5 Einheit Taq Polymerase (Life Technologies). Zykluszeiten waren Inkubationen für 3 min bei 95°C, gefolgt von 33 Zyklen von 50s bei 94°C, 60s bei 66°C und 60s bei 72°C. Eine Endverlängerung von 10 min bei 72°C folgte dann. 4 μl der PCR Produkte wurden durch ultraviolette Transillumination eines 3% Agarosegels, das mit Ethidiumbromid versetzt war, visualisiert. Ein Teil von 3 μl des Amplifikationsproduktes wurde für 1 Std. mit 10 Einheiten Mwol (Roche Diagnostics, Neuseeland) bei 60°C verdaut. Die verdauten Produkte (221 bp) wurden auf einem 3.5% Agarosegelrun für 1.0 Std. bei 80 V mit TBE Puffer getrennt. Unter Verwendung einer ultravioletten Transillumination nach dem Versetzen mit Ethidiumbromid wurden die Produkte gegenüber einer 123 bp Leiter visualisiert. In Gegenwart des Gly-213 (oder G) Allels wurde die Produktgröße von 221 bp nicht geschnitten, aber in Gegenwart des Wildtyps Arg 213 (oder C) Allels wurde das Produkt in zwei Banden geschnitten. Das direkte Sequenzieren wurde bei drei Lebewesen durchgeführt, die den Genotypen CC und CG durch das oben genannte Verfahren zugeordnet wurden, und bestätigten, dass das Letztgenannte korrekt die Anwesenheit oder Abwesenheit der C oder G Allele identifizierte.
2.4. Gewebeinhibitor von Metalloproteinase 3 (TIMP 3) T-1296C Promoterpolymorphismusgenotypisierung
Genomische DNA wurde aus Gesamtblutproben extrahiert (Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). Der TIMP 3 T-1296C Promoterpolymorphismus wurde durch geringe Modifikationen eines zuvor veröffentlichten Verfahrens bestimmt (Beranek., 2000, hier in Gänze unter Bezugnahme aufgenommen). Die PCR Oligonukleotidprimer waren 5'-CAA AGC AGA ATC AAG ATG TCA AT- 3' (Vorwärtsprimer) und 5'-CTG GGT TAA GCA ACA CAA AGC-3' (Rückwärtsprimer). Die PCR Reaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt und enthielt 1 μg genomische DNA, 10 pmol Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 0.2 mM dNTPs, 10 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ und 0.7 Einheit Taq Polymerase (Life Technologies). Die Zyklisierungszeiten waren Inkubationen für 5 min bei 95°C, gefolgt von 30 Zyklen von 30s bei 95°C, 60s bei 61°C und 30s bis 72°C. Eine Endverlängerung von 10 min bei 72°C folgt dann. 4 μl der PCR Produkte wurden durch ultraviolette Transillumination eines 3% Agarosegels, das mit Ethidiumbromid versetzt war, visualisiert. Ein Teil von 10 μl des Amplifikationsprodukts wurde über Nacht mit 5 Einheiten AluI (Roche Diagnostics, Neuseeland) bei 37°C verdaut. Die verdauten Produkte (221 bp) wurden auf einem 3.5% Agarosegelrun für 1.0 Std. bei 80V mit TBE Puffer getrennt. Unter Verwendung von ultravioletter Transillumination nach versetzen mit Ethidiumbromid wurden die Produkte gegenüber einer 123 bp Leiter visualisiert. In Gegenwart des T Allels war die verdauten Banden 201, 128, 69, 53 und 32, während in Gegenwart des C Allels die verdauten Banden 201, 160, 69 und 55 Banden waren. Das direkte Sequenzieren wurde bei 3 Lebewesen durchgeführt, die den Genotypen TT, TC und CC durch das oben genannte Verfahren zuzuordnen waren, und bestätigten, dass das Letztgenannte korrekt die Abwesenheit oder Gegenwart der T oder C Allele identifizierte.
Kombinierte Ergebnisse der COPD genetischen Assoziationsstudie (in Tabelle 9 zusammengefasst)
Die Vergleiche, die in den Tabellen 3, 4 und 5 gezeigt sind, zeigen, dass sich das MMP 12 A Allel/AA Genotyp (-82 Promoter), α1-Antitrypsin T Allel/Tt/tt Genotyp (1237 3' Bereich) und GSTM1 nn (null) Genotyp signifikant in der Frequenz bei COPD Patienten verglichen mit den Kontrollen erhöhte. Die Vergleiche, die in den Tabellen 1, 6, 7 und 8 gezeigt sind, zeigen, dass sich MMP1 2G Allel/2G2G Genotyp (1607 Promoter), P Allel/PP Genotyp (Kodon 10), G Allel/CG Genotyp (+760 exonisch) und TT Genotyp (-1296 Promoter) signifikant in der Frequenz bei resistenten Rauchern verglichen mit COPD Patienten erhöhte.
Tabelle 1a. Daten
MMP1 1G/2G (-1607) Promoterpolymorphismusallel und Genotypfrequenz bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen

*Anzahl der Chromosome (2n)

Tabelle 1b. Analyse
MMP1 1G/2G (-1607) Promoter Polymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die die Allel- und die Genotypfrequenzen bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen vergleichen.

OR = Odd's Ratio, 95% Cl = 95% Konfidenzintervall
χ2-M-H=χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates korrigiert

Tabelle 2a. Daten
MMP9 C-1562T Promoterpolymorphismusallel und Genotypfrequenz bei COPD, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen.

*Anzahl der Chromosome (2n)

Tabelle 2b. Analyse
MMP9 C-1562T Promoterpolymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die die Allel- und die Genotypfrequenzen bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen vergleichen.
Keine signifikanten Differenzen wurden beobachtet
Tabelle 3a. Daten
MMP 12 A-82G Promoterpolymorphismusallel- und Genotypfrequenz bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen.

*Anzahl der Chromosome (2n)

Tabelle 3b. Analyse
MMP 12 A-82G Promoterpolymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die das Allel und die Genotypfrequenzen bei COPD Patienten resistenten Rauchern und Blutspenderkontroller vergleichen.

OR = Odd's Ratio, 95% Cl = 95% Konfidenzintervall
χ2-M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates korrigiert

Tabelle 4a. Daten
Alpha 1-Antitrypsin 3' (1237) Taq 1 Polymorphismus Allel und Genotypfrequenz bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen.

*Anzahl der Chromosome (2n)

Tabelle 4b. Analyse
Alphal-Antitrypsin 3' (1237) Taq 1 Polymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die das Allel und die Genotypfrequenzen bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen vergleichen.

OR = Odd's Ratio, 95% Cl = 95% Konfidenzintervall
χ2-M-H=χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates= χ2 Yates korrigiert

Tabelle 5a. Daten
GSTM1 null Polymorphismusallel und Genotypfrequenz bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspendergruppen.

*Anzahl der Chromosome (2n)

Tabelle 5b. Analyse
GSTM1 null Polymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die das Allel und die Genotypfrequenzen bei den COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen vergleichen.

Tabelle 6a. Daten
TGFβ exonisch T→C (Kodon 10) Polymorphismusallel und Genotypfrequenz bei den COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen

*Anzahl der Chromosome (2n)

Tabelle 6b. Analyse
TGFβ exonischer T→C (Kodon 10) Polymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistik, die das Allel und die Genotypfrequenzen bei den COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen vergleichen.

Tabelle 7a. Daten
SOD3 C+760G (Arg213Gly) exonisches Polymorphismusallel und Genotypfrequenz bei COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen.

*Anzahl der Chromosome (2n)
** Kontrollgruppe von europäischer Abstammung, Ukkola et al. 2001.

Tabelle 7b. Analyse
SOD3 C+760G (Arg213Gly) exonischer Polymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die das Allel und die Genotypfrequenzen bei den COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen vergleichen.

Tabelle 8a. Daten
TIMP3 T-1296 C Promoterpolymorphismusallel und Genotypfrequenz bei den COPD Patienten, resistenten Rauchern und Blutspenderkontrollen.

*Anzahl der Chromosome (2n)
** Kontrollgruppe von europäischer Abstammung, Beranek et al. 2000.

Tabelle 8b. Analyse
TIMP3 T-1296 C Promoterpolymorphismus 2x2 Kontingenztabellenstatistiken, die das Allel und die Genotypfrequenzen bei den COPD Patienten, resistenten Rauchern vergleichen.

Zusammenfassung der kombinierten Analysen
Die Tabellen 10 und 11 fassen die Ergebnisse zusammen, die die Frequenzen von 0, 1 und ≥ 2 der Schutz- oder suszeptiblen Genotypen zwischen den COPD Patienten, resistenten Rauchern und Kontrollen vergleichen. Eine signifikant größere Anzahl an Rauchern mit COPD hatte null Schutzgenotypen verglichen mit resistenten Rauchern. Umgekehrt hatte eine signifikant größere Anzahl resistenter Raucher 2 oder mehr Schutzgenotypen verglichen mit Rauchern mit COPD. Beim Vergleich der Frequenzen von 0.1 und ≥ 2 der Suszeptibilitätsgenotypen hatte eine signifikant größere Anzahl an Rauchern mit COPD ≥ 2 Suszeptibilitätsgenotypen verglichen mit den Blutspenderkontrollen. Eine signifikant größere Anzahl der Kontrollen hatte null Suszeptibilitätsgenotypen verglichen mit Rauchern mit COPD. Tabelle 10a: Frequenz von Rauchern, die auf Rauchen suszeptibel (COPD) oder resistent sind, gemäß Anzahl schützender Genotypen (n = 4) (MMP 1-(-1607)2G2G, TGFβ-PP, SOD3-(+760) CG, TIMP3-(-1296)TT)

Ausgeschlossen* = Lebewesen mit ≤ 2 Schutzgenotypen wurden von der Analyse ausgeschlossen

Ausgeschlossen* = Lebewesen mit ≤ 1 Suszeptibilitätsgenotypen waren von der Analyse ausgeschlossen

2 zeigt graphisch die Daten in Tabelle 10. Die Risikoabschätzung wie durch das standardisierte Verhältnis quantifiziert zeigt, dass die Gegenwart von 0 Schutzgenotypen in dieser Studie das Risiko eines Rauchers COPD zu haben um 167% erhöht. Umgekehrt zeigt diese Analyse, dass das Risiko eines Rauchers mit 2 oder mehr Schutzgenotypen COPD zu haben, um 67% verringert ist. Da das Hintergrundrisiko von COPD bei Rauchern vor den genetischen Tests ungefähr 20% ist, erhöht die Gegenwart von 0 Schutzgenotypen signifikant das Risiko. 3 zeigt graphisch die Daten in Tabelle 11. Die Risikoabschätzungsanalysen zeigten keine signifikanten Unterschiede im Risiko, obwohl Trends, die ein größeres Risiko eines Rauchers mit COPD in Gegenwart von 2 oder mehr Suszeptibilitätsgenotypen zeigten, offensichtlich waren. Die 4–6 zeigen einen Trend in Richtung einer größeren Lungenfunktion bei Rauchern mit steigender Anzahl an Schutzgenotypen.
Diskussion der erweiterten Studie.
Diese Studie zeigt die neue Verwendbarkeit zur Identifizierung genetischer Polymorphismen, die allein oder in Kombination ein erhöhtes Risiko vorhersagen, an beeinträchtigter Lungenfunktion und COPD durch chronisches Rauchen zu leiden. Die Grundlage dieses erhöhten Risikos liegt wahrscheinlich an (1) den direkten Wirkungen dieser Polymorphismen, von denen sich herausgestellt hat, das sie die Genexpression oder Proteinfunktion verändern oder an (2) indirekten Wirkungen, bei denen diese Polymorphismen in einem Verbindungsungleichgewicht (genetische Varianten, die sich zusammen konsistent vererben) mit anderen Mutationen, die diese direkten Wirkungen haben, liegen. Um bei unserer Hypothese zu bleiben, dass COPD aus den kombinierten Wirkungen vieler Polymorphismen bei Rauchern resultiert, hat diese Studie gezeigt, dass verschiedene Gene involviert sind, die für Proteine kodieren, die bei verschiedenen voneinander abhängigen pathophysiologischen Prozessen involviert sind. Im Speziellen zeigen die Ergebnisse dieser Studie, dass die genetische Variation bei den für Proteinen kodierenden Genen, die bei Entzündungsreaktionen (TGFβ1), Antioxidantienverteidigung (SOD3, GSTM1) und Matrixremodulierung (einschließlich Proteasen (MMP1, MMP12) und ihrer Inhibitoren (al Antitrypsin, TIMP3)) wahrscheinlich zu der Entwicklung von COPD beitragen. Die hier beschriebenen genetischen Varianten repräsentieren wahrscheinlich nur eine Probe der Gesamtsumme der genetischen Varianten der oben genannte pathophysiologischen Verfahren, die zu der Entwicklung von COPD bei Rauchern beitragen, aber selbst die Fähigkeit, Raucher mit einem überdurchschnittlichen Risiko für eine beeinträchtigte Lungenfunktion zu identifizieren, signifikant erhöhen. In diesem Zusammenhang können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Prädisposition auf eine zukünftige Erkrankung zu diagnostizieren, bevor sie sich sowohl pathophysiologisch als auch klinisch manifestiert hat, wie bei anderen biologischen Assays, wie zum Beispiel Cholesterinserum. Epidemiologische Studien zeigen, dass die Verfahren, die in beeinträchtigter Lungenfunktion resultieren, über das Risiko der Entwicklung von COPD hinausgehen, aber Koronararterienerkrankung, Schlaganfall und Lungenkrebs beinhalten. Tatsächlich sind viele der in dieser Studie beschriebenen Proteine mit vaskulären Erkrankungen (Koronararterienerkrankung und Schlaganfall) und Krebs in Zusammenhang gebracht worden, was die Verwendbarkeit in der hier beschriebenen Erfindung zur Identifizierung derer, die einem Zigarettenrauch mit einem überdurchschnittlichem Risiko für vaskuläre Erkrankung und Krebs ausgesetzt sind, andeutet.
Beispiel 3. Beeinträchtigte Lungenfunktionsstudie.
3.1. Lebewesenauswahl
Lebewesen mit europäischer Abstammung, die ein Minimum von 20 Packungen pro Jahr geraucht hatten, wurden aus zwei Quellen ausgewählt. Die erste Gruppe war Patienten, bei denen durch einen Arzt eine signifikant beeinträchtigte Lungenfunktion (in diesem Fall als chronisch obstruktive Lungenerkrankung bezeichnet) diagnostiziert wurde, die die folgenden Kriterien erfüllten: sie waren 50 Jahre alt und hatten Symptome der Atemnot nach einem Alter von 40 Jahren entwickelt, hatten eine Einsekundenausatemkapazität (FEV1) als ein prognostizierter Prozentsatz < 70% und ein FEV1/FVC Verhältnis (Einsekundenausatemkapazität/forcierte Vitalkapazität) von < 70% (gemessen unter Verwendung der American Thorarcic Society Kriterien). Vierundachtzig Lebewesen wurde ausgewählt von denen 56% männlich waren, wobei das durchschnittliche FEV1/FVC (± Standardabweichung) 0.44 (0.12) war, das durchschnittliche FEV1 als ein prognostizierter Prozentsatz 33 (13) war. Das durchschnittliche Alter und die durchschnittliche Päckchengeschichte pro Jahr war 73 (9) Jahre und bzw. 45 (29) Packungen pro Jahr. Unter Verwendung eines auf PCR basierenden Verfahrens (Sandford et al., 1999) genotypisierten wir die COPD Gruppe für die α1-Antitrypsinmutationen (S und Z Varianten) und hatten keine Z Allele (MZ, SZ, ZZ Genotyp). Wir haben ebenfalls 58 europäische Lebewesen studiert, die ein Minimum von 20 Päckchen pro Jahr geraucht hatten und die niemals an Atemnot litten und bei denen keine obstruktive Lungenerkrankung in der Vergangenheit, insbesondere Asthma oder chronisch obstruktive Lungenerkrankung, diagnostiziert wurde. Diese Kontrollgruppe wurde durch Clubs für Ältere angeworben und bestand aus 57% Männern, wobei das durchschnittliche FEV1/FVC (± Standardabweichung) 0.82 (0.08) war, das durchschnittlich FEV1 als ein prognostizierter Prozentsatz 97 (11) war. Das durchschnittliche Alter und die durchschnittliche Päckchenhistorie pro Jahr war 54 (11) Jahre und 46 (28) Päckchen pro Jahr.
Genotypisierungsverfahren und Kandidatgene sind wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben.
3.2. Resultate, die die fünf genetischen einzelnen und kollektiven Varianten bei Rauchern mit normaler und beeinträchtigter Lungenfunktion vergleichen.
Wenn die Raucher in Tertile mit Lungenfunktion (FEV1 prognostizierter Prozentsatz, absolute FEV1 und FEV1/FVC) unterteilt wurden, finden wir einen signifikanten Trend in Richtung eines Überschusses der genetischen Suszeptibilitätsvarianten bei der kleinsten tertilen Gruppe (siehe Tabelle 1–3 unten). Tabelle 1. Lebewesen mit Tertilen von FEV1 prognostizierter Prozentsatz und Frequenz der Suszeptibilitätsvarianten (im Blut).

HME = Humanmakrophagenelastase (MMP 12), Gel b = Gelatinase B (MMP 9), MMP 1 = Matrixmetalloproteinase 1 oder interstitielle Collagenase, α1-AT = α1-Antitrypsin, GSTM1 = Glutathion S Transferase M.
* = p Wert für Chi-Square

HME = Humanmakrophagenelastase (MMP 12), Gel b = Gelatinase B(MMP9), MMP1 = Matrixmetalloproteinase 1 oder interstitielle Collagenase, α1-AT = α1-Antitrypsin, GSTM1-Glutathion S Transferase M.
* = p Wert für Chi-Square

HME = Humanmakrophagenelastase (MMP 12), Gel b = Gelatinase B (MMP 9), MMP1 = Matrixmetalloproteinase 1 oder interstitielle Collagenase, α1-AT = α1-Antitrypsin, GSTM1-Glutathion S Transferase M.
* = p Wert für Chi-Square

Die kollektive Wirkung eine oder mehrere der Suszeptibilitätsvarianten auf die Lungenfunktion zu haben, wird in den Boxenplots unten untersucht. Es gibt einen konsistenten Trend in Richtung eine progressiv schlechte Lungenfunktion zu haben (FEV1 prognostizierter Prozentsatz, absolute FEV1 und FEV1/FVC) mit steigender Anzahl genetischer Suszeptibilitätsvarianten (siehe 1-3).
Durch logistische Regressionsanalyse (nach dem Anpassen für alle Variablen) eine schrittweise Selektion fand man, für jeden Parameter der Lungenfunktion, verschiedene genetische und nichtgenetische Faktoren, die signifikant verbunden waren (unten in Tabelle 4 zusammengefasst). Tabelle 4. Ergebnisse der logistischen Regressionsanalyse für genetische und nichtgenetische Faktoren, die mit der Lungenfunktion verbunden sind.
Diskussion der Ergebnisse
Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass unsere Suszeptibilitätsvarianten mit beeinträchtigter Lungenfunktion bei einer Gruppe von Rauchern verbunden sind. Dies ist der Fall, wenn wir die Wirkung des Genotyps auf die Lungenfunktion, wie in den Boxenplots zu sehen (1–3), analysieren. Im Speziellen zeigen die Boxenplotergebnisse, dass wenn Lebewesen gemäß der Anzahl der Suszeptibilitätsvarianten aufgeteilt werden, eine starke inverse lineare Beziehung mit beeinträchtigter Lungenfunktion gesehen wird, egal ob das Letztgenannte verbunden ist durch absolute FEV1, prognostizierter Prozentsatz FEV1 oder FEV1/FVC. Umgekehrt, wenn die Lebewesen gemäß ihrer Lungenfunktion in Tertile eingeteilt werden, zeigen die Ergebnisse konsistent, dass die mit der häufigsten beeinträchtigten Lungenfunktion die größte Frequenz unserer Suszeptibilitätsgenvarianten haben (siehe Tabelle 1–3).
Letztlich tragen in einer schrittweise logistischen Regression nach der Anpassung der Mehrheit der Co-Variablen die Suszeptibilitätsvarianten der menschlichen Makrophagenelastasegene und Glutathion S Transferasegene zu beeinträchtigter Lungenfunktion bei (siehe Tabelle 4).
Die direkte Relevanz zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung und ihren Anwendungen ist das Verknüpfungsungleichgewicht. Dies ist ein Phänomen in der Genetik, bei dem zwei oder mehrere Mutationen oder Polymorphismen in einer solch engen genetischen Nachbarschaft sind, dass sie virtuell immer koinhärent sind. Dies bedeutet, dass beim Genotypisieren für einen Polymorphismus das Vorhandensein eines anderen Polymorphismus im Verknüpfungsungleichgewicht abgeleitet werden kann. Deshalb sind jede genetische Varianten (Mutationen oder Polymorphismen), die in dem Verknüpfungsungleichgewicht mit den genetischen Varianten, die hier beschrieben sind, liegen, ebenfalls in dem hier beschriebenen erfindungsgemäßem Konzept beinhaltet. Die Varianten werden in Publikationen beschrieben, die hier als auch etablierter Literatur beinhaltet sind.
Die oben genannten Daten stellen eine neue biologische Verknüpfung bereit, die der epidemiologischen Erkenntnis zu Grunde liegt, dass beeinträchtigte Lungenfunktion nicht nur ein verwendbarer diagnostischer Test für die Prädisposition und den Tod durch chronische Atemerkrankung (COPD, Asthma, Bronchiektasie und Bronchiolitis) ist, sondern ebenfalls für kardiovaskuläre Erkrankungen (Koronararterienerkrankung und Schlaganfall) und bestimmte Krebsarten (Lungenkrebs). Die vorliegende Erfindung identifiziert spezifische genetische Suszeptibilitätsvarianten, die eine beeinträchtigte Lungenfunktion bestimmen, aber ebenfalls bei den zu Grunde liegenden pathophysiologischen Prozessen, die Artherogenese/Thrombose und Krebs verursachen, impliziert sind.
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Sequenzliste

Claims

Verfahren zum Bestimmen einer Prädisposition eines Lebewesens einen Zustand zu entwickeln, zum Bestimmen eines potentiellen Risikos eines Lebewesens einen Zustand zu entwickeln, oder zum Diagnostizieren eines potentiellen Beginns eines Zustandes in einem Lebewesen, wobei das Verfahren wenigstens die Analyse von wenigstens einem Polymorphismus aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: A-82G in dem Promotor des MMP12 (menschlische Makrophagenelastase) kodierenden Gens; T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ (transformierender Wachstumsfaktor beta) kodierenden Gens; C+760G des SOD3 (Superoxiddismutase 3) kodierenden Gens; T-12960 im Promotor des TIMP3 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinase 3) kodierenden Gens; und Polymorphismen in Bindungsungleichgewicht mit diesen Polymorphismen; wobei der Genotyp des Lebewesens indikativ für die Prädisposition zur Entwicklung eines Zustandes, für das potentielle Risiko zur Entwicklung des Zustandes oder für den potentiellen Beginn des Zustandes, und wobei der Zustand eine chronisch obstruktive Pulmonarerkrankung (COPD) oder eine beeinträchtigte Lungenfunktion ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus A-82G in dem Promotor des MMP12 kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens aufweist. 4, Verfahren nach Anspruch 1, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus C+760G des SOD3 kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus T-12960 im Promotor des TIMP3 kodierenden Gens aufweist.
Verfahren zum Bestimmen der Prädisposition und/oder des potentiellen Risikos eines Lebewesens für die Entwicklung des Risikos der Morbidität/Mortalität einer Krankheit mit beeinträchtigter Lungenfunktion, welches wenigstens die Analyse von wenigstens einem Polymorphismus aufweist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ (transformierender Wachstumsfaktor beta) kodierenden Gens; C+760G des SOD3 (Superoxiddismutase 3) kodierenden Gens; T-1296C im Promotor des TIMP3 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinase 3) kodierenden Gens; und Polymorphismen in Bindungsungleichgewicht mit diesen Polymorphismen, wobei der Genotyp des Lebewesens indikativ für die Prädisposition und/oder für das potentielle Risiko zur Entwicklung des Risikos der Morbidität/Mortalität dieser Krakheit ist. 7. Verfahren nach Anspruch 6, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus C+760G des SOD3 kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, welches zumindest die Analyse des Polymorphismus T-1296C im Promotor des TIMP3 kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus chronisch obstruktiver Lungenkrankheit, Koronararterienerkrankung Schlaganfall und Lungenkrebs.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die chronisch obstruktive Lungenerkrankung chronisch obstruktive Pulmonarerkrankung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verfahren weiters die Analyse von wenigstens einem Polymorphismus in wenigstens einem Gen aufweist, welches ein Protein kodiert, das im Matrixumbau, antioxidativer Abwehr, oder in einer Entzündungsreaktion involviert ist, einschließlich Gene, die Matrixmetalloproteinasen, Entzündungs- und Antientzündungscytokine, Inhibitoren von Matrixmetalloproteinasen und Enzyme kodieren, die in der Metabolisierung von Oxidanzien involviert sind.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das wenigstens eine Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: MMP 1 (interstitielle Collagenase); MMP9 (Gelatinase B); MMP 12 (menschliche Makrophagenelastase); α 1-Antitrypsin; und GSTI (Gluthation S Transferase 1): TGFβ (transformierender Wachstumsfaktor β); SOD3 (Superoxiddismutase 3); oder TIMP3 (Gewebsinhibitor von Metalloproteinase 3).
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der wenigstens eine analysierte Polymorphismus 1G/2G in Position -1607 innerhalb des Promotors von MMP1, C-1562T im Promotor des MMP9 kodierenden Gens, G 1237A in der 3' Region des α I-Antitrypsin kodierenden Gens, der M1 Null-Polymorphismus des GSTI kodierenden Gens, T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens, C+760G des SOD3 kodierenden Gens, T-1296C im Promotor des TIMP3 kodierenden Gens, oder A-82G im Promotor des MMP 12 kodierenden Gens ist.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die folgenden Polymorphismen analysiert werden: 1G/2G in Position -1607 im Promotor von MMP1; T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens; C+760G des SOD3 kodierenden Gens; und T-1296C im Promotor des TIMP3 kodierenden Gens.
Verfahren nach Anspruch 6, welches die Analysen der Polymorphismen 1G/2G in Position -1607 im Promotor von MMP1; C-1562T im Promotor des MMP9 kodierenden Gens; und A-82G im Promotor des MMP12 kodierenden Gens aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, welches die Analysen der Polymorphismen aufweist: A-82G im Promotor des MMP 12 kodierenden Gens G 1237A in der 3' Region des α 1-Anritrypsin kodierenden Gens; und M1 Null-Polymorphismus in dem GSTI kodierenden Gens.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei, wenn der Polymotphismus A-82G in dem Promotor des MMP12 kodierenden Gens analysiert wird, der Genotyp -82AA in dem Promotor des MMP12 kodierenden Gens indikativ ist für eines oder mehrere von a) Prädisposition zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; b) potentiellem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und c) potentiellem Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei, wenn der Polymorphismus C+760G in dem SOD3 kodierenden Gen analysiert wird, der Genotyp +76000 oder +76000 im SOD3 kodierenden Gen indikativ ist für eines oder mehrere von: a) Schutz gegen Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrtsiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) vermindertem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 15, wobei, wenn der Polymorphismus T-1296C in dem Promotor des TIMP3 kodierenden Gens analysiert wird, der Genotyp 1296TT im Promotor des TIMP3 kodierenden Gen indikativ ist für eines oder mehrere von: a) Schutz gegen Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) vermindertem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei, wenn der Polymorphismus T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens analysiert wird, der Genotyp CC (homozygotes P Allel) im Kodon 10 des TGFβ kodierenden Gens indikativ ist für eines oder mehrere von: a) Schutz gegen Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) vermindertem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter, Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei, wenn der Polymorphismus 1G/2G in Position -1607 im Promotor des MMP1 kodierenden Gens analysiert wird, der Genotyp 2G2G im Promotor des MMP1 kodierenden Gen indikativ ist für eines oder mehrere von: a) Schutz gegen Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) vermindertem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei, wenn der Polymorphismus C-1562T im Promotor des MMP9 kodierenden Gens analysiert wird, die Genotypen -1562CT und -1562TT im Promotor des MMP9 kodierenden Gens indikativ sind für eines oder mehrere von: a) Prädisposition zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) potentiellem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbidität/Mortalitätrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und c) potentiellen Beginn von COPD, und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder 17, wobei, wenn der Polymorphismus G1237A in der 3' Region des α 1-Antitrypsin kodierenden Gens analysiert wird, die Genotypen 1237AG und 1237AA (Tt oder tt allele Genotypen) in der 3' Region des α 1-Antitrypsin kodierenden Gens indikativ sind für eines oder mehrere von: a) Prädisposition zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und b) potentiellem Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätcrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist, und c) potentiellen Beginn von COPD, und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Gegenwart von zwei oder mehreren schützenden Genotypen indikativ sind für ein verringertes Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder des Morbiditäts-/Mortalitätsrisikos einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die Gegenwart von zwei oder mehr Anfälligkeits-Genotypen indikativ sind für ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder des Morbiditäts-/Mortalitätsrisikos einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei das Lebewesen ein Raucher ist oder jemand, der hohen Pegeln von Luftverunreinigungen, wie Umgebungstabakrauch ausgesetzt ist. 28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei, wenn der Polymorphismus T→C innerhalb des Kodons 10 des TGFβ kodierenden Gens und/oder der Polymorphismus C+760G des SOD3 kodierenden Gens analysiert werden, die Analyse unter Verwendung von TGFβ oder SOD3 kodierender RNA oder cDNA ausgefürt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 3, welches zumindest die Schritte des Analysierens der Aminosäure aufweist, welche in einer Position, die auf Kodon 10 des TGFβ kodierenden Gens kartiert ist, vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Gegenwart von Leucin an der genannten Position indikativ für die Prädisposition und/oder ein potentielles Risiko für Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und/oder potentiellen Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Gegenwart von Prolin an der genannten Position indikativ ist für vermindertes Risiko zur Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 4, welches zumindest den Schritt des Analysierens der Aminosäure an Position 213 von SOD3 in dem Lebewesen aufweist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Gegenwart von Glycin an der Position 213 indikativ für ein potentielles Risiko für Entwicklung und/oder die Prädisposition für Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist; und/oder potentiellen Beginn von COPD und/oder beeinträchtigter Lungenfunktion.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Gegenwart von Arginin an der genannten Position indikativ ist für ein. verringertes Risiko der Entwicklung von COPD, beeinträchtigter Lungenfunktion, und/oder Morbiditäts-/Mortalitätsrisiko einer Krankheit, die mit beeinträchtigter Lungenfunktion verbunden ist.