PT1402073E - Métodos e composições para avaliação da função e distúrbios pulmonares. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Métodos e composições para avaliação da função e distúrbios pulmonares"

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a métodos para avaliação da função e/ou distúrbios pulmonares e em particular para o diagnóstico da predisposição para, e/ou a gravidade da doença pulmonar obstrutiva crónica em fumadores e não fumadores, utilizando análise de polimorfismos genéticos e expressão alterada de genes. A presente invenção também se refere a métodos para o diagnóstico de défice da função pulmonar e em particular para o diagnóstico da predisposição para, e/ou gravidade do défice da função pulmonar e o risco associado de morbidez/mortalidade de outras doenças. A invenção também se refere a composições para utilização nos referidos métodos.

ARTE ANTERIOR A doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) é a 4a causa principal de morte nos países desenvolvidos e uma das causas principais de readmissão hospitalar em todo o mundo.

Caracteriza-se por inflamação insidiosa e destruição progressiva do pulmão. Torna-se clinicamente evidente após os fumadores afectados notarem falta de ar após exercício, quando 50% ou mais da função do pulmão já está irremediavelmente perdida. Esta perda de função do pulmão é detectada clinicamente por taxas de fluxo expiratório reduzidas (especificamente, volume expiratório forçado num segundo, ou FEVl). Mais de 95% da DPOC é atribuída ao fumo de cigarro, mas no entanto apenas cerca de 20% dos fumadores desenvolvem DPOC (fumador susceptível). Alguns estudos mostram, surpreendentemente, que a dose de fumo é responsável por apenas cerca de 16% do défice da função pulmonar. Vários estudos de família que comparam a concordância entre irmãos (gémeos e não gémeos) mostram consistentemente uma forte tendência familiar e está em curso uma pesquisa de genes para susceptibilidade à doença DPOC (ou modificadores de doença). Os factores de risco genético para doenças pulmonares crónicas 2 ΕΡ 1 402 073 /PT estão revistos em Sandford et al. (Eur. Respir. J. 1997, 10: 1380-1391).

Apesar dos avanços no tratamento da doença das vias respiratórias, as terapias actuais não alteram significativamente a história natural da DPOC com perda progressiva da função pulmonar que provoca insuficiência respiratória e morte. Embora se tenha demonstrado que deixar de fumar reduz este declinio da função pulmonar, se não for feito nos primeiros cerca de 20 anos de fumador para fumadores susceptiveis, a perda é considerável e os sintomas de agravamento da falta de ar não podem ser revertidos. Estudos sobre deixar de fumar indicam que as técnicas que ajudam os fumadores a deixar de fumar têm um sucesso limitado. Em analogia com a constatação da ligação do colesterol sérico à doença arterial coronária, há a necessidade de compreender melhor os factores que contribuem para a DPOC, de modo a se poderem desenvolver testes que identifiquem fumadores em risco e a se desenvolverem novos tratamentos para reduzir os efeitos adversos de fumar. Vários estudos epidemiológicos mostraram consistentemente que a doses de exposição de 20 ou mais maços-ano, a distribuição na função pulmonar tende a ser trimodal, havendo uma proporção de fumadores que mantêm uma função pulmonar normal (fumadores resistentes) mesmo após 60+ maços-ano, uma proporção que apresenta reduções modestas na função pulmonar e que poderá nunca desenvolver sintomas e uma proporção que apresenta uma perda acelerada da função pulmonar e que invariavelmente desenvolve DPOC. Isto sugere que existem 3 populações entre os fumadores, os resistentes ao desenvolvimento de DPOC, os que têm um risco moderado e os que têm um risco elevado (designados por fumadores susceptiveis). A patof isiologia subjacente da DPOC não é ainda compreendida. A exposição ao fumo de cigarro no pulmão resulta quer numa resposta inflamatória, quer numa carga oxidativa que inicia pelo menos quatro processos. São libertadas várias citóquinas localmente e são recrutados para o pulmão tanto neutrófilos, como macrófagos. 3

ΕΡ 1 402 073 /PT A DPOC é uma doença heterogénea que inclui, a vários graus, enfisema e bronquite crónica que se desenvolvem como parte de um processo de remodelação após o insulto inflamatório devido à exposição crónica ao fumo de tabaco e outros poluentes do ar. É provável que estejam envolvidos muitos genes no desenvolvimento da DPOC.

Além disso, estudos epidemiológicos mostraram que o défice da função pulmonar, medido por métodos espirométricos, proporciona um método directo para diagnosticar a presença e/ou tendência para distúrbios pulmonares obstrutivos (e.g. doença pulmonar obstrutiva crónica, asma, bronquiectasia e bronquiolite) (Subramanian D, et al. 1994)) e um método indirecto para determinar o risco de morbidez/mortalidade de outras doenças, tais como doença arterial coronária, AVC e cancro do pulmão (Hole DJ, et al. 1996, Knuiman MW, et al. 1999, Sorlie PD, et al. 1989, Bang KM, et al. 1993, Rodriguez BL, et al. 1994 e Weiss ST, et al. 1995). É reconhecido desde há muito que o défice da função pulmonar, tal como actualmente medido por métodos espirométricos, é a base clinica para determinar a presença e gravidade de doenças pulmonares obstrutivas, tais como doença pulmonar obstrutiva crónica, asma, bronquiectasia e bronquiolite. No caso de fumadores crónicos estes distúrbios podem ser caracterizados por uma obstrução das vias respiratórias minimamente reversível, tal como reflectido pelo baixo volume expiratório forçado num segundo (FEV1), baixa percentagem prevista de volume expiratório forçado num segundo e razão reduzida entre volume expiratório forçado num segundo e capacidade vital forçada (referência geral).

Nos últimos 20 anos, estudos epidemiológicos analisaram a relação entre o défice da função pulmonar (muitas vezes FEVl) com o risco de mortalidade de outras causas de morte que não a DPOC, em particular doença arterial coronária (DAC), AVC e cancro do pulmão. Embora estas sejam consequências bem reconhecidas de exposição crónica ao fumo de cigarro, torna-se claro a partir de estudos epidemiológicos que apenas uma proporção de fumadores morre destas complicações. No entanto, o contrário mostra que mais de 90% da DPOC e cancros do pulmão são atribuíveis a uma exposição crónica ao fumo de cigarro. 4

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Fumar é considerado o factor de risco de estilo de vida mais importante que contribui para a mortalidade por doença arterial coronária. Embora alguns estudos epidemiológicos tenham recrutado um grupo diverso de indivíduos, eles identificam de forma consistente um FEVl reduzido (ou uma medição relacionada) como um factor de risco de morte significativo e independente, não só da DPOC mas também de DAC, AVC e cancro de pulmão (Hole DJ, et al. 1996, Knuiman MW, et al. 1999, Sorlie PD, et al. 1989, Athonisen NR. 1989, Bang KM, et al. 1993, Rodriguez BL, et al. 1994 e Weiss ST, et al.

1995). No maior destes estudos, o risco de morte por DAC atribuído a défice da função pulmonar era tão grande quanto o do colesterol sérico (Hole DJ, et al. 1996). O risco de mortalidade associado com um FEVl reduzido para DAC é observado tanto para fumadores, como não fumadores, mas é aproximadamente duas vezes maior nos primeiros (Hole DJ, et al. 1996). É reconhecido desde há muito que a doença pulmonar obstrutiva crónica, o cancro do pulmão, o AVC e a doença arterial coronária existem todas nas famílias e que a exposição crónica ao fumo de cigarro é um contributo ambiental importante para o desenvolvimento destas doenças. Embora alguns estudos prospectivos tenham mostrado que um FEVl reduzido permite prever de forma fiável um risco aumentado para todas estas doenças, poderão ser necessários trinta ou mais anos de fumo crónico antes que haja um dano suficiente nos pulmões para que esta susceptibilidade possa ser detectada clinicamente (por teste de função pulmonar reduzida).

Seria desejável e vantajoso dispor de métodos que pudessem ser utilizados para determinar a predisposição de um indivíduo para desenvolver distúrbios pulmonares, tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), ou uma predisposição para desenvolver défice da função pulmonar e o risco associado de doença pulmonar obstrutiva crónica e o risco de doenças relacionadas, tais como DAC, AVC e cancro do pulmão, em particular se o indivíduo é um fumador e/ou tem uma susceptibilidade aumentada ao estresse oxidativo.

Os métodos anteriores incluem a investigação de padrões de expressão de TGF-βι, receptores de TGF8 do tipo I e II (de 5

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Boer et al. Am J Respir Crit Care Med 1998, 158; 1951-1957) e análise de polimorfismos de nucleótidos individuais no promotor de TGF-βι (WO 02/08468). Wert et al. (PNAS 2000: 97, no 11: 5972 a 5977) estudaram a proteina D tensioactiva e metaloproteinases de matriz.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se em parte na constatação surpreendente de os polimorfismos de alguns genes e grupos de genes, em particular dos envolvidos na remodelação da matriz, defesa antioxidante, resposta inflamatória e seus inibidores, se encontrarem mais frequentemente em pacientes com DPOC do que em indivíduos de controlo. Noutra parte a presente invenção baseia-se noutra constatação surpreendente de que os polimorfismos nestes genes e/ou nas suas regiões reguladoras estão associados com a gravidade do défice da função pulmonar nos fumadores.

Até agora não foi possível determinar os efeitos colectivos (aditivos, protectores ou multiplicativos) de várias variantes genéticas de "susceptibilidade" na contribuição para a DPOC/enfisema ou défice da função pulmonar. Assim, a presença de várias variantes (mutações e/ou polimorfismos) dos genes de susceptibilidade para DPOC/enfisema parece conferir um maior risco de ter DPOC/enfisema e/ou défice da função pulmonar num modelo aditivo simples.

Assim, de acordo com um aspecto proporciona-se um método para determinar a predisposição de um indivíduo para desenvolver uma condição, para determinar o risco potencial de um indivíduo para desenvolver a condição ou para diagnosticar num indivíduo o início potencial da condição, em que o método compreende pelo menos a análise de pelo menos um polimorfismo seleccionado do grupo constituído por: A-82G no promotor do gene que codifica para MMP12 (elastase de macrófago humano); T^C no codão 10 do gene que codifica para ΤΰΡβ (factor de crescimento transformante beta); 6

ΕΡ 1 402 073 /PT C+760G do gene que codifica para SOD3 (superóxido- dismutase 3); T-1296C no promotor do gene que codifica para TIMP3 (inibidor tecidular de metaloproteinase 3); e

Polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes polimorfismos; em que o genótipo do indivíduo é indicativo de predisposição para desenvolver a condição, de risco potencial para desenvolver a condição ou do início potencial da condição e em que a condição é a doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) ou défice da função pulmonar.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, proporciona-se um método para determinar a predisposição de um indivíduo para, e/ou o risco potencial de, risco de desenvolver morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar, compreendendo pelo menos a análise de pelo menos um polimorfismo seleccionado do grupo constituído por T^C no codão 10 do gene que codifica para TGFp (factor de crescimento transformante beta); C+76 0G do gene que codifica para SOD3 (superóxido- dismutase 3); T-1296C no promotor do gene que codifica para TIMP3 (inibidor tecidular de metaloproteinase 3); e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes polimorfismos; em que o genótipo do indivíduo é indicativo de predisposição para e/ou risco potencial de, risco de desenvolver morbidez/mortalidade da referida doença.

Os peritos na arte deverão entender que a determinação dos polimorfismos pode ser realizada num ou numa combinação de genes. A determinação da predisposição de um indivíduo para desenvolver DPOC, por exemplo, pode assim basear-se na análise de, por exemplo, apenas a região promotora da colagenase intersticial, ou da de gelatinase B, ou da de elastase de macrófago. Prefere-se, no entanto, utilizar polimorfismos reguladores e/ou de promotor de uma combinação dos genes aqui descritos, dois ou todos em qualquer combinação, nos métodos da presente invenção. 7

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Deve ser entendido no contexto da presente invenção que o termo "polimorfismos" é utilizado para descrever quaisquer variantes e mutações, incluindo a ausência total ou parcial de genes (e.g. mutações nulas).

De preferência, uma "doença associada com défice da função pulmonar", tal como aqui utilizado, é seleccionada de um grupo constituído por doenças pulmonares obstrutivas crónicas, doença das artérias coronárias, AVC e cancro do pulmão.

Pode-se proporcionar um conjunto de sondas e/ou iniciadores de nucleótidos para utilização nos métodos de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Os iniciadores e/ou sondas preferidos são os que abrangem, ou podem ser utilizados para abranger as regiões polimórficas dos genes que codificam para proteínas de remodelação da matriz (incluindo proteases e/ou seus inibidores), proteínas inflamatórias e proteínas de resposta ao estresse oxidativo e de outros genes utilizados nos métodos da presente invenção. O genótipo do indivíduo é indicativo de predisposição para e/ou risco potencial de, risco de desenvolver de morbidez/mortalidade da referida doença.

De preferência a doença é seleccionada de um grupo que consiste de doenças pulmonares obstrutivas crónicas, doença das artérias coronárias, AVC e cancro do pulmão. De preferência, a doença do pulmão obstrutiva crónica é doença pulmonar obstrutiva crónica.

De preferência, um método de uma forma preferida da invenção compreende também a análise de um polimorfismo em pelo menos um gene que codifica para uma proteína envolvida na remodelação da matriz, defesa antioxidativa ou resposta inflamatória, incluindo genes que codificam para metaloproteinases de matriz, citóquinas infamatórias e anti-inflamatórias, inibidores de metaloproteinases de matriz e enzimas envolvidas em oxidantes de metabolização. De preferência, o pelo menos um gene é seleccionado do grupo constituído por: MPl (colagenase intersticial); MMP9 (gelatinase B); 8

ΕΡ 1 402 073 /PT ΜΜΡ12 (elastase de macrófago humano); αΐ-antitripsina; e GSTl (glutationa S transferase 1). TGFp (factor de crescimento transformante β); SOD3 (Superóxido-dismutase 3); ou TIMP3 (inibidor tecidular de metaloproteinase 3).

De preferência a análise de polimorfismo é 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMP1, C-1562T no promotor do gene que codifica para MMP9, G1237A na região 3' do gene que codifica para αΐ-antitripsina, o polimorfismo nulo de Ml no gene que codifica para GSTMl, A-82G no promotor do gene que codifica para MMP12.

Um método preferido da invenção compreende analisar polimorfismos; 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMPl; C-1562T no promotor do gene que codifica para MMP9; e, A-82G no promotor do gene que codifica para MMP12.

Outro método preferido da invenção compreende analisar os polimorfismos: 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMPl; T->C no codão 10 do gene que codifica para TGFp C+760G do gene que codifica para SOD3; e T-1296C no promotor do gene que codifica para TIMP3.

Outro método preferido da invenção compreende analisar os polimorfismos: A-82G no promotor do gene que codifica para MMP12. G1237A na região 3' do gene que codifica para al-antitripsina; e polimorfismo nulo de Ml no gene que codifica para GSTl.

De acordo com um método da invenção em que é analisado o polimorfismo A-82G no promotor do gene que codifica para MMP12, o genótipo -82AA no promotor do gene que codifica para 9

ΕΡ 1 402 073 /PT ΜΜΡ12 é indicativo de um ou mais de entre: uma predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; b) risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e c) inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.

De acordo com um método da invenção em que o polimorfismo C+760G no gene que codifica para SOD3 é analisado, os genótipos +760GG ou +760CG no gene que codifica para SOD3 são indicativas de um ou mais de entre: a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar, e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

De acordo com um método da invenção em que se analisa o polimorfismo T-1296C no promotor do gene que codifica para TIMP3, o genótipo -1296TT no promotor do gene que codifica para TIMP3 é indicativo de um ou mais de entre: a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

De acordo com um método da invenção em que se analisa o polimorfismo T -» C no codão 10 do gene que codifica para TGFp, o genótipo CC (alelo P homozigótico) no codão 10 do gene que codifica para TGFp é indicativo de um ou mais de entre: a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

De acordo com um método da invenção em que se analisa o polimorfismo 1G12G na posição -1607 no promotor de MMPl, o 10

ΕΡ 1 402 073 /PT genótipo 2G2G no promotor do gene que codifica para MMPl é indicativo de um ou mis de entre: a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

De acordo com um método da invenção em que se analisa o polimorfismo C-1562T no promotor do gene que codifica para MMP9 os genótipos -1562CT e -1562TT no promotor do gene que codifica para MMP9 são indicativos de um ou mais de entre: a) predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; b) risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar e c) inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.

De acordo com um método da invenção em que se analisa o polimorfismo G1237A na região 3' do gene que codifica para αΐ-antitripsina, os genótipos 1237AG e 1237AA (genótipos dos alelos Tt ou tt) na região 3' do gene que codifica para αΐ-antitripsina são indicativos de um ou mais de entre: a) predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar, b) risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar e c) inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.

Numa forma preferida da invenção, a presença de dois ou mais genótipos protectores é indicativa de risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

Numa forma preferida da invenção, a presença de dois ou mais genótipos de susceptibilidade é indicativa de risco aumentado de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou 11 ΕΡ 1 402 073 /PT risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

Num aspecto preferido da invenção, o indivíduo é um fumador ou alguém exposto a níveis elevados de poluentes do ar, tais como fumo de tabaco do meio ambiente.

Num aspecto da invenção em que se analisa o polimorfismo T->C no codão 10 do gene que codifica para TGFp e/ou o polimorfismo C+760G do gene que codifica para SOD3, a análise é realizada utilizando ARN ou ADNc que codifica para TGFp ou SOD3.

Pode-se proporcionar um conjunto de sondas e/ou iniciadores de nucleótidos para utilização nos métodos preferidos da invenção aqui anteriormente descritos. De preferência, as sondas e/ou iniciadores de nucleótidos são as que abrangem, ou podem ser utilizados para abranger as regiões polimórficas dos genes.

Num outro aspecto preferido a invenção compreende pelo menos o passo de analisar no indivíduo o aminoácido presente numa posição que está mapeada no codão 10 do gene que codifica para TGFp. A presença de leucina na referida posição é indicativa de uma predisposição para e/ou risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar e/ou início potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar. A presença de prolina na referida posição é indicativa de risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

Noutro aspecto preferido, a invenção compreende pelo menos o passo de analisar no indivíduo o aminoácido presente na posição 213 de SOD3. A presença de glicina na posição 213 é indicativa de risco potencial de desenvolver e/ou de predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de 12

ΕΡ 1 402 073 /PT morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar e/ou inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar. A presença de arginina na referida posição é indicativa de risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.

Quando se faz referência a "fumadores" o termo designa aqui também ex-fumadores.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: O gráfico da percentagem de pessoas com DPOC em função do número de variantes genéticas de susceptibilidade mostra uma relação linear com uma probabilidade estimada de ter DPOC tão elevada quanto 80% nos que têm quatro ou mais variantes de susceptibilidade.

Figura 2: Representação gráfica dos dados da tabela 10. A estimativa de risco, quantificada pelo risco padronizado, mostra que a presença de 0 genótipos protectores neste estudo aumenta significativamente o risco de um fumador ter DPOC em 167%. Pelo contrário, esta análise mostra que o risco de um fumador com 2 ou mais genótipo protectores ter DPOC é reduzido em 67%. Tendo em conta que o risco de fundo de DPOC em fumadores antes do teste genético é de cerca de 20%, a presença de 0 genótipos protectores aumenta significativamente este risco.

Figura 3: Representação gráfica dos dados da tabela 11. As análises de estimativa de risco não apresentaram diferenças significativas no risco, embora fosse evidente uma tendência para um maior risco de um fumador ter DPOC na presença de 2 ou mais genótipos de susceptibilidade. 13

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Figuras 4-6: As Figuras 4-6 mostram uma tendência para uma maior função pulmonar em fumadores com números maiores de genótipos protectores.

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Utilizando estudos de caso-controlo comparámos as frequências de várias variantes genéticas (polimorfismos) de genes candidatos em fumadores e dadores de sangue. A maioria destes genes candidatos confirmou (ou semelhantes) efeitos funcionais na expressão de genes ou função de proteina.

Especificamente, comparámos as frequências de polimorfismos entre controlos dadores de sangue, fumadores resistentes e os que têm DPOC (subdivididos nos que têm inicio precoce e nos que têm inicio normal). A presente invenção demonstra que há tanto genótipos protectores como de susceptibilidade derivados de polimorfismos de genes candidatos seleccionados. Tendo em conta que a DPOC é um distúrbio poligénico e que muitos genótipos estão provavelmente envolvidos no desenvolvimento de DPOC em qualquer fumador susceptivel, apenas se podem explorar modelos genéticos simples (í.e. o efeito global dos genótipos de susceptibilidade e protectores não é conhecido). Numa concretização aqui descrita identificam-se 3 polimorfismos genéticos de susceptibilidade e 4 polimorfismos genéticos protectores. As análises estatísticas dos efeitos combinados destes polimorfismos mostram que os testes genéticos da presente invenção podem ser utilizados para identificar fumadores com um risco maior de desenvolver DPOC.

Assim, por análise sistemática da frequência destes polimorfismos em grupos bem definidos de fumadores e não fumadores, como aqui descrito, é possível implicar algumas proteínas no desenvolvimento de DPOC e melhorar a nossa capacidade para identificar quais os fumadores que estavam em maior risco de desenvolver défice da função pulmonar e DPOC, para fins de previsão.

Uma vez que apenas a minoria dos fumadores sofre de uma, ou uma combinação destas doenças, poderão existir "fumadores susceptíveis" que através dos efeitos combinados de mecanismos genéticos e elevada exposição a oxidantes têm um risco maior de ter uma doença pulmonar relacionada com o fumo (DPOC e 14 ΕΡ 1 402 073 /PT cancro do pulmão). Tendo em conta as descobertas epidemiológicas até agora, é provável que esta susceptibilidade genética também se estenda a outros distúrbios relacionados com o fumo, tais como DAC e AVC.

Além disso, pensamos que um FEVl reduzido é um biomarcador de uma susceptibilidade geral aos efeitos adversos do fumo crónico e estresse oxidativo. Isto é, sob condições de estresse oxidativo (como no que se observa com a exposição crónica ao fumo de cigarro) há uma alteração na actividade das proteinas envolvidas na remodelação da matriz, inflamação e/ou estresse oxidativo. As actividades alteradas destas proteinas (tipicamente enzimas) ao longo de periodos prolongados levam à promoção da inflamação pulmonar, fibrose e dano do parênquima, provocando doenças pulmonares obstrutivas crónicas e contribui para o cancro do pulmão. Estes mesmos processos ocorrem na parede arterial, promovendo desse modo a progressão e/ou instabilidade da placa ateromatosa, resultando, se não no desenvolvimento de doença arterial coronária e AVC, na progressão de placa ateromatosa para a formação de um trombo (Waltenberger J. 2001) . A formação de trombos por sua vez leva às entidades clinicas de angina instável, enfarte do miocárdio agudo e AVC, acarretando todos uma mortalidade elevada. Foi proposto que o processo de inflamação, remodelação da matriz e/ou resposta ao estresse oxidativo podem contribuir para a instabilidade da placa que caracteriza estas entidades clinicas. Neste contexto, um FEVl reduzido é um biomarcador indirecto dos que tem susceptibilidade para remodelação de matriz adversa, inflamação e dano aumentado consequente de estresse oxidativo. Assim, através destes mecanismos, pode associar-se um FEVl e risco de mortalidade reduzidos para estas doenças através da actividade das proteinas de remodelação da matriz, proteinas inflamatórias e resposta inerente do indivíduo ao estresse oxidativo. Embora um FEVl reduzido seja um factor de previsão fiável de risco aumentado para todas estas doenças, poderá levar trinta ou mais anos de fumo crónico antes que haja dano suficiente nos pulmões para que esta susceptibilidade possa ser clinicamente detectada (através do teste de uma função pulmonar reduzida). Os métodos da presente invenção ultrapassam esta desvantagem. 15

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EXEMPLOS A invenção será agora descrita em mais detalhe, com referência a exemplos não limitativos.

Exemplo 1. Estudo preliminar 1.1 Recrutamento de indivíduos

Os pacientes de ascendência europeia admitidos no hospital com uma exacerbação da sua DPOC foram recrutados consecutivamente. A DPOC foi definida em indivíduos que fumaram um mínimo de vinte maços-ano e tinham uma razão FEVl/FVC1 (volume expiratório forçado em um segundo/capacidade vital forçada) <70% e FEVl como uma percentagem do previsto <70% (medido utilizando os critérios da American Thoracic Society). Os pacientes com os testes de função pulmonar acima a quem foi diagnosticada DPOC por médicos especialistas foram recrutados se tinham mais de 50 anos e se desenvolveram sintomas de falta de ar após os 40 anos de idade. Os que têm uma história de asma, bronquiectasia ou cirurgia pulmonar foram excluídos. Recrutaram-se oitenta e quatro pacientes, dos quais 56% eram homens, o FEVl/FVC médio (± desvio padrão) era 0,44 (0,12), o FEVl médio como uma percentagem do previsto era 33 (13) . A idade media e história de maços-ano era de 73 anos (9) e 45 maços-ano (29) respectivamente. Utilizando um método baseado em PCR (Sandford et al., 1999), determinámos o genótipo do grupo de DPOC para as mutações de al-antitripsina (variantes S e Z) e nenhuma tinha o alelo Z (genótipo MZ, SZ, ZZ). Também estudámos 178 dadores de sangue europeus (estatuto de fumador desconhecido) que foram recrutados consecutivamente através do serviço de doação de sangue. Cinquenta e cinco porcento eram homens e a sua idade média era de 45 anos. 1.2. Genotipagem de polimorfismos do promotor MMPl

Extraiu-se ADN genómico de amostras de sangue total (Maniatis, T., Fritsch, E.F. e Sambrook, J.; Molecular Cloning Manual. 1989). O polimorfismo do promotor de MMPl foi determinado por pequenas modificações de um método anteriormente publicado (Dunleavey et al., 2000).

Os iniciadores oligonucleotídicos de PCR eram 5'-TCG-TGA-GAA-TGT-CTT-CCC-ATT-3' (iniciador directo) e 5'-TCT-TGG-ATT- 16

ΕΡ 1 402 073 /PT GAT-TTG-AGrA-TAA-GTG-AAA-TC-3' (iniciador inverso). A reacção PCR foi realizada num volume total de 25 μΐ e continha 50 ng de ADN genómico, 10 pmol de iniciadores directo e inverso, os dNTP 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM e 1 unidade de polimerase de Taq. Os tempos de ciclização foram incubações durante 2 min a 95°C seguido de 35 ciclos de 45 s a 92°C, 50 s a 60°C e 50 s a 72°C. Visualizaram-se 4 μΐ de produtos de PCR (118 pb) por transiluminação ultravioleta de um gel de agarose a 3% corado com brometo de etidio. O restante foi digerido durante 4 horas com 10 unidades de Asp 700 (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 37°C. Os produtos digeridos foram separados num gel de agarose a 3% corrido durante 2,5 horas a 80 V com tampão TBE. O produto de PCR permaneceu não cortado (i.e. 118 pb) na presença do alelo 2G ou foi cortado em bandas de 100 pb e 17 pb na presença do alelo 1G. Fez-se a sequenciação directa em três indivíduos a que se atribuíram os genótipos 1G1G, 1G2G ou 2G2G pelo método acima e confirmou-se que os últimos identificavam correctamente a ausência ou presença dos alelos 1G ou 2G. 1.3. Genotipagem de polimorfismos do promotor MMP9

Extraiu-se ADN genómico de sangue total pelos mesmos métodos descritos no Exemplo 3. A genotipagem do polimorfismo do promotor C-1562T de gelatinase B (MMP9) foi feita por PCR (modificado dos métodos publicados por Zhang B, et al. 1999) utilizando os iniciadores gelb 1 (5'-GCC-TGG-CAC-ATA-GTA-GGC-CC-3') e gclb2 (5-CTT-CCT-AGC-CAO-CCG-GCA-TC-3'). A amplificação por PCR foi realizada num ciclizador térmico PTC-100 (MJ Research, Inc.) em 25 μΐ de mistura reaccional. A mistura reaccional era 50 ng de ADN genómico, 50 ng de cada iniciador, dNTP 20 μΜ, MgCl2 1,5 mM, 0,5 unidades de polimerase de ADN de Taq, Tris-HCl 10 mM, KC1 50 mM e gelatina a 0,001%. As condições do ciclo de PCR foram: Um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 3 minutos, 35 ciclos de PCR (desnaturação a 92°C durante 50 segundos, fusão a 66°C durante 48 segundos e alongamento a 72°C durante 58 segundos) seguido de um ciclo de alongamento a 72°C durante 5 minutos. Digeriram-se alíquotas de 4 μΐ dos produtos de PCR com 10 U da enzima de restrição Sphl (LifeTech) no sistema tampão recomendado a 37°C, durante cinco horas. Todos os fragmentos digeridos foram analisados num gel de agarose a 3%. A sequenciação directa foi realizada em três indivíduos a que 17

ΕΡ 1 402 073 /PT foram atribuídos os genótipos CC, CT ou TT pelo método acima e confirmou-se que o último identificava correctamente os alelos C e T. 1.4. Genotipagem de polimorfismos do promotor MMP12

Extraiu-se ADN genómico de sangue total pelos mesmos métodos descritos no Exemplo 3. A genotipagem do polimorfismo do promotor A-82G de elastase de macrófago humano (MMP12) foi realizada por PCR (modificado dos métodos publicados por Jormsjo S et al. 2000) utilizando os iniciadores hmepl (5'-AGA-TAG-TCA-AGG-GAT-GAT-ATC-AGC-T-3') e hmep2 (5-GGC-TTG-TAG-AGC-TGT-TCA-CGG-3'). A amplificação por PCR foi realizada num ciclizador térmico PTC-100 (MJ Research, Inc.) em 25 μΐ de mistura reaccional. A mistura reaccional era 50 ng de ADN genómico, 50 ng de cada iniciador, dNTP 20 μΜ, MgCl2 1,5 mM, 0,5 unidades de polimerase de ADN de Taq, Tris-HCl 10 mM, KC1 50 mM e gelatina a 0,001%. As condições do ciclo de PCR foram: Um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 2 minutos, 35 ciclos de PCR (desnaturação a 92°C durante 50 segundos, fusão a 66°C durante 48 segundos e alongamento a 72°C durante 58 segundos) seguido de um ciclo de alongamento a 72°C durante 5 minutos. Digeriram-se alíquotas de 4 μΐ dos produtos de PCR com 10 U da enzima de restrição PvuII (LifeTech) no sistema tampão recomendado a 37°C, durante cinco horas. Todos os fragmentos digeridos foram analisados num gel de agarose a 3%. A sequenciação directa foi realizada em três indivíduos a que foram atribuídos os genótipos AA, AG ou GG pelo método acima e confirmou-se que o último identificava correctamente os alelos A e G.

Os genótipos foram atribuídos ao fenótipo (DPOC e controlo) por dois investigadores, de um modo independente e cego. As diferenças entre as frequências de alelo e genótipo foram comparadas pela razão de Odds utilizando limites de confiança de 95% de Cornfield, teste do χ2 corrigido de Yates com significância de p ^ 0,05. 1.5. Frequências de alelo e genótipo dos promotores MMPl/MMP9/MMP12 A análise dos nossos dados de genotipagem mostrou que se atingiu o equilíbrio de Hardy Weinberg em ambas as coortes e 18 ΕΡ 1 402 073 /PT que se encontraram diferenças significativas (resumidas nas Tabelas 1, 2 e 3) .

Tabela 1. Frequência de alelos e genótipos do polimorfismo do promotor MMPl 1G/2G nos pacientes com DPOC e controlos dadores de sangue.

Frequência Alelo* Genótipo 1G 2G 1G1G 1G2G 2G2G DPOC n=84 67 IõF 16 35 33 a (%) (40%) (60%) (19%) (42%) (39%) Controlos n=178 197 159 56 85 37 (%) (55%) (45%) (31%) (48%) (21%) * número de cromossomas (2n) 1. Alelo: 2G vs 1G para DPOC vs controlos, razão de Odds (RO) =1,89, limites de confiança de 95% 1,3-2,7 , X2 (Yates corrigido)= 10,67, p= 0,001 Genótipo: 2G2G vs 1G1G + 1 G2G para DPOC vs controlos, RO= 2,47, limites de confiança de 95% 1,3-4,5, χ" (Yates corrigido)= 9,05, p= 0,003

Tabela 2. Frequência de alelo e genótipo do polimorfismo do promotor MMP9 C-1562T nos pacientes com DPOC e controlos dadores de sangue.

Frequência Alelo* Genótipo C T CC CT TT DPOC n=84 (%) 124 (74%) 441 (26%) 45 (53%) 34 (40%) 5 a (7%) Controlos n=178 (%) 301 (85%) 55 (15%) 126 (71%) 49 (27%) 3 (2%) * número de cromossomas (2n)l. Alelo: T vs C para DPOC vs controlos, razão de Odds (RO)= 1,94, limites de confiança de 95% 1,2-3,1, χ2 (Yates corrigido)= 7,91, p= 0,004 2. Genótipo: CT/TT vs CC para DPOC vs controlos, RO= 2,1, limites de confiança de 95% 2,2-3,7, χ2 (Yates corrigido)= 6,7, p= 0,009. 19

ΕΡ 1 402 073 /PT

Tabela 3. Frequência de alelos e genótipos do polimorfismo do promotor MMP12 A-82G nos pacientes com DPOC e controlos dadores de sangue.

Frequência Alelo* Genótipo A G AA AG GG DPOC n=84 151 171 67 17 0 (%) (90%) (10%) (80%) (20%) (0%) Controlos n=178 286 70 114 58 6 (%) (80%) (20%) (64%) (33%) (3%) * número de cromossomas (2n) 3. Alelo: A vs G para DPOC vs controlos, razão de Odds (RO)= 2,17, limites de confiança de 95% 1,8-2,8, χ2 (Yates corrigido)= II a OO co CQ 0,009 2. Genótipo: AA vs AG/GG para DPOC vs controlos, RO =2,21, limites de confiança de 95% 1,2-4,3, x2 (Yates corrigido) = 5,89, p= 0,02.

Os dados acima indicam que os polimorfismos dos promotores MMPl 1G/2G, MMP9 C-1562T e MMP12 A-82G são loci independentemente candidatos para susceptibilidade ao desenvolvimento de DPOC. No caso de MMPl, tanto a frequência do alelo 2G como a frequência do genótipo 2G2G eram significativamente mais prevalecentes nos pacientes com DPOC do que na população controlo saudável (60% vs 45% e 39% vs 21% respectivamente). De igual modo, no caso de MMP9 tanto a frequência do alelo T e as frequências do genótipo CT/TT eram significativamente mais prevalecentes nos pacientes com DPOC do que na população de controlo saudável (26% vs 15% e 47% vs 29% respectivamente) . Por fim, no caso do MMP12 tanto a frequência do alelo A como a frequência do genótipo AA eram significativamente mais prevalecentes nos pacientes com DPOC do que na população de controlo saudável (90% vs 80% e 80% vs 64%, respectivamente). 1.6. Genotipagem do polimorfismo de alfal-antitripsina 3' Taql.

Extraiu-se ADN genómico de sangue total como nos exemplos anteriores. O polimorfismo de alfal-antitripsina 3' Taq 1 foi determinado pelos seguintes métodos utilizando iniciadores publicados anteriormente (Sandford AJ, et al. 1997b). Os iniciadores oligonucleotidicos de PCR eram 5'-CTA-CCA-GGA-ATG-GCC-TTG-TCC-3' (iniciador directo) e 5'-CTC TC A GGT CTG TGT 20

ΕΡ 1 402 073 /PT TCA TCC-3' (iniciador inverso). A reacção de PCR foi realizada num volume total de 25 μΐ e continha 50 ng de ADN genómico, 10 pmol de iniciadores directo e inverso, os dNTP 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM e 1 unidade de polimerase Taq. Os tempos de ciclização foram incubações durante 2 min a 95°C seguido de 35 ciclos de 45 s a 94°C, 40 s a 62°C e 45 s a 72°C com um ciclo final de 5 min a 72°C. Visualizaram-se 4 μΐ de produtos de PCR (205 pb) por transiluminação ultravioleta de um gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etidio. O restante do produto de PCR foi digerido durante 4 h com 10 unidades da enzima de restrição Taq 1 (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 65°C. Os produtos digeridos foram separados num gel de agarose a 2% corrido durante 2,5 h a 80 V com tampão TBE. O produto de PCR permaneceu não cortado (i.e. 205 pb) na presença do alelo t (mutante) ou foi cortado em bandas de 130 pb e 75 pb na presença do alelo T (tipo selvagem). 1.7. Genotipagem do polimorfismo nulo de glutationa-S-transferase (GST)Ml.

Extraiu-se ADN genómico de sangue total como nos exemplos anteriores. O polimorfismo da eliminação nula de glutationa-S-transferase (GST)Ml foi determinado pelos seguintes métodos utilizando iniciadores publicados anteriormente (Cantlay AM, et al. 1994). Os iniciadores oligonucleotidicos de PCR eram (5'-CTG-CCC-TAC-TTG-ATT-GAT-GG-3'; 5'-ATC-TTC-TCC-TCT-TCT-GTC-TC-3' e 5'-TTC-TGG-ATT-GTA-GCA-GAT-CA-3'). A reacção de PCR foi realizada num volume total de 25 μΐ e continha 50 ng de ADN genómico, 50 ng de cada iniciador, os dNTP 20 μΜ, Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM e 0,5 unidades de polimerase Taq. Os tempos de ciclização foram incubações durante 3 min a 95°C seguido de 35 ciclos de 45 s a 94°C, 48 s a 56°C e 48 s a 72°C com um alongamento final de 3 min a 72°C. Visualizaram-se 6 μΐ de produtos de PCR por transiluminação ultravioleta de um gel de agarose a 2% corado com brometo de etidio. Os produtos de PCR eram uma banda de 202 pb (controlo interno GSTM4 para amplificação) e, ou uma banda de 275 pb para um GSTM1 normal (homozigótico ou heterozigótico), ou nenhuma banda de 275 pb, indicando homozigotia para a eliminação nula GSTMl. 21

ΕΡ 1 402 073 /PT

Tabela 4. Frequência de alelos e genótipos do polimorfismo alfal-antitripsina 3' prime Taq 1 nos pacientes com DPOC e controlos dadores de sangue.

Frequência Alelo* Genótipo T t TT Tt tt DPOC n=84 150 181 66 18 0 (%) (89%) (11%) (79%) (21 %) (0%) Controlos n=178 345 11 167 11 0 (%) (97%) (3%) (94%) (6%) (0%) * número de cromossomas (2n) 4. Alelo: t vs T para DPOC vs controlos, razão de Odds (RO)= 3,76, limites de confiança de 95% 1,6-8,8, χ2 (Yates corrigido)= 11,27, p= 0,0008 2. Genótipo: Tt/tt vs TT para DPOC vs controlos, RO= 11,98 , limites de confiança de 95% 1,7-10 ,0, χ2 (Yates corrigido)= 11,98, p= 0,0005.

Tabela 5. Frequência de alelos e genótipos do polimorfismo GSTMl nos pacientes com DPOC e controlos dadores de sangue.

Frequência N N DPOC n=84 29 55 (%) (35%) (65%) Controlos n=178 103 75 (%) (58%) (42%) n vs N em DPOC em comparação com controlos RO= 2,6, IC 95% 1,5-4,6, χ2 (Yates corrigido)= 11,52, p= 0,0007.

Embora este polimorfismo esteja localizado numa região que contém elementos reguladores, estudos in vitro não demonstraram um efeito funcional importante a partir desta variante genética (Sandford et al. 1997). Para a mutação GSTMl encontrámos uma frequência de 42% nos controlos e de 65% nos nossos pacientes com DPOC.

Quando o efeito combinado destas variantes genéticas foi determinado numa equação logística (estimativas da razão de Odds) que assumia frequências semelhantes em fumadores 22

ΕΡ 1 402 073 /PT saudáveis como nossos controlos, estimou-se que cerca de 42% (IC 95%=31-56%) da tendência para DPOC podia ser explicada de forma independente, por cada uma das cinco variantes genéticas. Quando analisada graficamente, a percentagem de pessoas com DPOC em função do número de variantes genéticas de susceptibilidade, apresentava uma relação linear com uma probabilidade estimada de ter DPOC tão elevada quanto 80% nos que têm quatro ou mais variantes de susceptibilidade (veja-se a Figura 1). A nossa coorte de DPOC é provavelmente um grupo heterogéneo de pacientes com vários graus de enfisema, bronquite e obstrução reversível das vias respiratórias (a componente asmática da DPOC). O presente estudo proporciona evidências de que a sobre-expressão de MMPl, MMP9 e/ou MMP12 pode ser a causa do desenvolvimento de DPOC nalguns fumadores e é o primeiro a implicar directamente os polimorfismos de promotor do alelo 2G (em MMPl), alelo T (em MMP9) e alelo G (em MMP12) como a base genética deste processo.

Como referido acima, a coorte de DPOC utilizada nos presentes estudos é provavelmente um grupo heterogéneo de pacientes com uma gravidade de enfisema variável como parte da

sua DPOC. Nós propomos que um e/ou uma combinação do alelo 2G de MMPl e/ou alelo τ de MMP9 e/ou alelo A de MMP12, exerçam o seu efeito no desenvolvimento da DPOC através da sobre-expressão da metaloproteinase de matriz relevante e subsequente desenvolvimento de enfisema. No entanto, não é claro o modo como o estímulo inflamatório de exposição crónica ao cigarro resulta numa sobre-expressão de MMP. A este respeito, é interessante notar que se verificou que o factor-a de necrose de tumor (TNF-a), uma citóquina inflamatória libertada em resposta ao fumo de cigarro (e implicada na remodelação da DPOC), se liga à sequência nuclear do sítio de ligação do factor de transcrição Ets (von der Ahe et al., 1993). Apesar de não se pretender estar ligado a nenhum mecanismo de acção particular, é de referir que os polimorfismos acima estão associados (encontrados próximo de, ou produzem) sítios de ligação de transcrição de Ets que podem aumentar a resposta a estímulos inflamatórios, tal como TNF-a, 23

ΕΡ 1 402 073 /PT fazendo com que esses fumadores fiquem em risco de desenvolver enfisema.

Exemplo 2. Estudo expandido. A determinação preliminar de polimorfismos 9 e 12 do promotor MMPl como loci candidatos para susceptibilidade de desenvolver DPOC foi seguida de um segundo estudo mais abrangente que incluia a determinação do genótipo de polimorfismos candidatos dos genes de ΤΰΕβ, SOD3 e TIMP3. Este estudo foi concebido para investigar se ambos um genótipo protector e de susceptibilidade podem ser derivados deste subconjunto de genes. 2.1 Recrutamento de indivíduos

Recrutaram-se de duas fontes indivíduos de ascendência europeia que fumaram um minimo de quinze maços-ano e a quem foi diagnosticada por um médico uma doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC). O primeiro grupo eram pacientes admitidos com uma exacerbação da sua DPOC que satisfaziam os seguintes critérios: tinham mais de 50 anos de idade e desenvolveram sintomas de falta de ar após os 40 anos de idade, tinham um volume expiratório forçado num segundo (FEV1) como uma percentagem do previsto <70% e uma razão FEV1/FVC2 (volume expiratório forçado num segundo/capacidade vital forçada) <70% (medida utilizando critérios da American Thoracic Society). Recrutaram-se 111 indivíduos, dos quais 58% eram homens, a FEV1/FVC mediana (± gama interquartil (IRQ)) era de 44% (37-50), o FEV1 mediano como percentagem do previsto era 32 (24— 47) . A idade mediana e história de maços-ano eram de 73 anos (66-77) e 43 maços-ano (30-57), respectivamente. O segundo grupo recrutado eram pacientes encaminhados por falta de ar para uma clinica de ambulatório torácica que, após determinação clinica e espirométrica foram diagnosticados como tendo DPOC (por um médico do tórax) e que satisfaziam os seguintes critérios: tinham menos de 65 anos de idade e desenvolveram sintomas de falta de ar após os 40 anos de idade, tinham um volume expiratório forçado num segundo (FEV1) como uma percentagem do previsto <70% e uma razão FEVl/FVC3 (volume expiratório forçado num segundo/capacidade vital forçada) <70% (medido utilizando critérios da American Thoracic Society). Recrutaram-se 61 indivíduos, dos quais 43% 24

ΕΡ 1 402 073 /PT eram homens, a FEVl/FVC mediana (± gama interquartil (IRQ)) era de 44% (38-55), o FEVl mediano como uma percentagem do previsto era 37 (24-47). A idade mediana e história de maços-ano eram 58 anos (53-62) e 41 maços-ano (31-52), respectivamente. Utilizando um método baseado em PCR (Sandford et ai., 1999), determinámos os genótipos de ambos os grupos de DPOC para as mutações de αΐ-antitripsina (variantes S e Z) e excluiram-se os que têm o alelo Z (genótipo MZ, SZ, ZZ). Também estudámos 85 indivíduos europeus que fumaram um mínimo de vinte maços-ano e que nunca tinham sofrido de falta de ar e a quem nunca foi diagnosticada uma doença pulmonar obstrutiva crónica no passado, em particular asma ou doença pulmonar obstrutiva crónica. Este grupo de controlo foi recrutado através de clubes para idosos e consistia de 58% de homens, a FEVl/FVC mediana (± IQR) era de 82% (76-88), o FEVl mediano como percentagem do previsto era de 94 (87-101). A idade mediana e história de maços-ano eram de 52 anos (46-61) e 38 maços-ano (25-59), respectivamente. Também recrutámos 178 dadores de sangue europeus (estatuto de fumador desconhecido) consecutivamente através de serviços locais de doação de sangue. 55% eram homens e a sua idade mediana era 45 anos.

Este estudo mostra que os polimorfismos encontrados em maior frequência em pacientes com DPOC em comparação com controlos pode reflectir uma susceptibilidade aumentada ao desenvolvimento de défice da função pulmonar e DPOC. De igual modo, os polimorfismos encontrados em maior frequência em fumadores resistentes em comparação com fumadores susceptíveis (pacientes com DPOC) pode reflectir um papel protector.

Sumário das características para fumadores com DPOC (hosp), com DPOC (clínica) e fumadores resistentes.

Mediana do parâmetro (IQR) DPOC, n=lll Admissão em hospital DPOC, n=61 Clínica de ambulatório Resistente, n=85 Fumadores saudáveis % homens 58% 43% 58% Idade (anos) 73 (66-77) 58 (53-62) 52 (46-61) Maços-ano 43 (30-57) 41 (31-52) 38 (25-59) FEVi (L) 0, 76(0, 55-1, 6) 0, 93 (0, 65-1,2) 2,8 (2,5-3,3) FEV: % do previsto 32% (24-47) 37% (24-47) 94% (87-101) FEVjFVC 44 (37-50) 44 (38-55) 82 (76-86) 25

ΕΡ 1 402 073 /PT 2.2. Genotipagem do polimorfismo do codão 10 do factor de crescimento transformante β (TGFβ).

Extraiu-se ADN genómico de amostras de sangue total (Maniatis, T., Fritsch, E.F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). O polimorfismo do codão 10 (TGFP) foi determinado por pequenas modificações de um método anteriormente publicado (Syrris et al., 1998, aqui incorporado na sua totalidade como referência)). Os iniciadores oligonucleotidicos de PCR eram 5'-ACC ACA CCA GAA atg ttc GC-3' (iniciador directo) e 5' -AGT AGC CAC AGC GGT AGC AGC TGC-3' (iniciador inverso). A reacção de PCR foi realizada num volume total de 25 μΐ e continha 20 ng de ADN genómico, 500 pmol de iniciadores directo e inverso, os dNTP 0,2 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KC1 150 mM, MgCl2 1,0 mM e 1 unidade de polimerase Taq (Life Technologies). Os tempos de ciclização foram incubações durante 3 min a 95°C seguido de 33 ciclos de 50 s a 94°C, 60 s a 66°C e 60 s a 72°C. Seguiu-se um alongamento final de 10 min a 72°C. Visualizaram-se 4 μΐ de produtos de PCR por transiluminação ultravioleta de um gel de agarose a 3% corado com brometo de etidio. Digeriu-se uma aliquota de 3 μΐ do produto de amplificação durante 1 h com 4 unidades de PstI (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 37°C. Os produtos digeridos foram separados num gel de agarose a 2,5% corrido durante 2,0 h a 80 mV com tampão TBE. Utilizando transiluminação ultravioleta após coloração com brometo de etidio os produtos foram visualizados contra uma escada de 123 pb. Na presença do alelo de leucina (L) os produtos com tamanho de 110 pb foram cortados em produtos de 86 pb e 24 pb, enquanto que o produto amplificado permaneceu não cortado na presença do alelo de prolina (P) . A sequenciação directa foi realizada em indivíduos a que se atribuíram os genótipos LL, LP e PP pelo método acima e confirmou-se que o último identificava correctamente a ausência ou presença dos alelos L ou P. 2.3. Genotipagem do polimorfismo de superóxido-dismutase 3 (SOD3) C+760G (Arg213Gly) .

Extraiu-se ADN genómico de amostras de sangue total (Maniatis, T., Fritsch, E.F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). O polimorfismo C+760G de SOD3 foi determinado por pequenas modificações de um método anteriormente publicado (Ukkola et al., 2001, aqui incorporado na sua totalidade como 26

ΕΡ 1 402 073 /PT referência)). Os iniciadores oligonucleotidicos de PCR eram 5' -GCA ACC AGG CCA GCG TGG AGA ACG GGA A-3' (iniciador directo) e 5'-CCA GAG GAG AAG CTC AAA GGC AGA-3' (iniciador inverso). A reacção de PCR foi realizada num volume total de 25 μΐ e continha 175 ng de ADN genómico, 1 nmol de iniciadores directo e inverso, os dNTP 0,1 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KC1 150 mM, MgCl2 1,0 mM e 0,5 unidades de polimerase Taq (Life Technologies). Os tempos de ciclização foram incubações durante 3 min a 95°C seguido de 33 ciclos de 50 s a 94°C, 60 s a 66°C e 60 s a 72°C. Seguiu-se um alongamento final de 10 min a 72°C. Visualizaram-se 4 μΐ de produtos de PCR por transiluminação ultravioleta de um gel de agarose a 3% corado com brometo de etidio. Digeriu-se uma aliquota de 3 μΐ de produto de amplificação durante 1 h com 10 unidades de Mwol (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 60°C. Os produtos digeridos (221 pb) foram separados num gel de agarose a 3,5% corrido durante 1,0 h a 80 V com tampão TBE. Utilizando transiluminação ultravioleta após coloração com brometo de etidio, os produtos foram visualizados contra uma escada de 123 pb. Na presença do alelo Gly-213 (ou G) o tamanho do produto de 221 pb era não cortado, mas na presença do alelo Arg 213 (ou C) do tipo selvagem, o produto é cortado em 2 bandas. Fez-se a sequenciação directa em três indivíduos a quem se atribuíram os genótipos CC e CG pelo método acima e confirmou-se que o último tinha identificado correctamente a ausência ou presença dos alelos C ou G. 2.4. Genotipagem de polimorfismos do promotor do inibidor tecidular de metaloproteinase 3 (TIMP 3) T-1296C.

Extraiu-se ADN genómico de amostras de sangue total (Maniatis, T., Fritsch, E.F. e Sambrook, J., Molecular Cloning Manual. 1989). O polimorfismo do promotor TIMP 3 T-1296C foi determinado por modificações pequenas de um método previamente publicado (Beranek., 2000, aqui incorporado na sua totalidade para referência)). Os iniciadores oligonucleotidicos de PCR eram 5'-CAA AGC AGA ATC AAG ATG TCA AT-3' (iniciador directo) e 5'-CTG GGT TAA GCA ACA CAA AGC-3' (iniciador inverso). A reacção de PCR foi realizada num volume total de 25 μΐ e continha 1 pg de ADN genómico, 10 pmol de iniciadores directo e inverso, os dNTP 0,2 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,4), KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM e 0,7 unidades de polimerase Taq (Life Technologies). Os tempos de ciclização foram incubações 27

ΕΡ 1 402 073 /PT durante 5 min a 95°C seguido de 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 61°C e 30 s a 72°C. Seguiu-se um alongamento final de 10 min a 72°C. Visualizaram-se 4 μΐ de produtos de PCR por transiluminação ultravioleta de um gel de agarose a 3% corado com brometo de etidio. Digeriu-se uma aliquota de 10 μΐ do produto de amplificação durante a noite com 5 unidades de Alui (Roche Diagnostics, Nova Zelândia) a 37°C. Os produtos digeridos (221 pb) foram separados num gel de agarose a 3,5% corrido durante 1,0 h a 80 V com tampão TBE. Utilizando transiluminação ultravioleta após coloração com brometo de etidio os produtos foram visualizados contra uma escada de 123 pb. Na presença do alelo T as bandas digeridas eram 201, 128, 69, 53 e 32 enquanto que na presença do alelo C as bandas digeridas eram 201, 160, 69, e 55. Realizou-se a sequenciação directa em três indivíduos a quem se atribuíram os genótipos TT, TC e CC pelo método acima e confirmou-se que o último identificou correctamente a ausência ou presença dos alelos T ou C.

Resultados combinados do estudo de associação genética de DPOC. (resumido na tabela 9)

As comparações apresentadas nas tabelas 3, 4 e 5 mostram que alelo A/genótipo AA de MMP12 (promotor -82), alelo t/genótipo Tt/tt de αΐ-antitripsina (região 3' 1237) e genótipo nn (nulo) de GSTM1 têm uma frequência significativamente aumentada em pacientes com DPOC, em comparação com controlos. As comparações apresentadas nas tabelas 1, 6, 7 e 8 mostram que alelo 2G/genótipo 2G2G de MMP1 (promotor -1607), alelo P/genótipo PP (codão 10), alelo G/genótipo CG (exónico +760) e genótipo TT (promotor -1296) têm uma frequência significativamente aumentada em fumadores resistentes em comparação com pacientes com DPOC. 28

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Tabela la. Dados

Frequência de alelos e genótipo dos polimorfismos do promotor MMP1 1G/2G (-1607) em pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue.

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) 1G 2G 1G1G 1G2G 2G2G Fumadores DPOC (hospital) N =109(111) 100 (45%) 118 (55%) 26 (24%) 48 (44%) 35 32%) DPOC (clínica) N=58 (61) 44 (38%) 72 (62%) 12 (21%) 20 (34%) 26 (45%) 'HODC.. 1....... .............1-4-4-.............. ..............i.aft.............. ........../Í.O........... ..........£n........ L/irvJL·· .......... 3o uQ 01 ( 1 ' %) (57%) (Λ-Λ) (Ί I %) (3í>%) Controlos ||||s||;|||||/ mmrnmmmm «« 56 7:///11///...... 7/111/ /7 N=178 (178) iiiiiiiiii!;;!; !!!!!|!|;||!!!|| (31%) (48%) 1111)// • número de cromossomas (2n)

Tabela lb. Análise

Estatística da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo do promotor de MMP1 1G/2G (-1607) comparando as frequências de alelos e genótipos em pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Grupos Alelo/ genótipo RO IC 95% para RO x2-m-h P X2 Yates P 2G vs 1G Resist. vs DPOC total 1,93 1,27-2, 93 10, 53 0, 001 9, 95 0, 001 2G2G vs 1G2G/1G1G Resist. vs DPOC total 2,48 1,41-4,39 11,32 0, 0008 10,48 0, 001 RO = razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 29

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Tabela 2a. Dados

Frequência de alelo e genótipos do polimorfismo do promotor de MMP9 C-1562T nos DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) C T CC CT TT Fumadores DPOC (hospital) 185 31 79 27 2 N =108(111) (86%) (14%) (73%) (25%) (2%) DPOC (clinica) 98 18 40 18 0 N=58 (61) (84%) (16%) (69%) (31%) (0%) DPOC total 'd? "1 3 119 3 ::= (.85.%.)... . (151) (72%) (27%)...... (1%) WÊÊÈ^^M .ϊ.ϊ.ϊ.ϊ.ϊ.ϊ.ϊ.31;117ϊ.ϊ.ϊ.1 .ÍC 111111:9:::::::::: ..............si '§41.7.8.....(17.8.).4!!!;!................. ............(sfgl........ ........(15.%.)............ (71%) |||||%.)....... :,,::11111 I Número de cromossomas (2n)

Tabela 2b. Análise

Estatísticas da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo do promotor de MMP9 C-1562T comparando as frequências dos alelos e genótipos nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Não foram observadas diferenças significativas 30

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Tabela 3a. Dados

Frequências dos alelos e genótipos do polimorfismo do promotor de MMP12 A-82G nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) A G AA AG GG Fumadores DPOC (hospital) N =108(111) 190 (88%) 26 (12%) 82 (75%) 26 (25%) 0 (0%) DPOC (clínica) N=53 (61) 90 (85%) 16 (15%) 38 (72%) 14 (26%) 1 (2%) DPOC total 'èl !!||/''''' '''''''''''''' : (87%)..... 43 .........120........ 41 ............1............ llllliillilllll (-1-:.) (25%) Π ) BBIb 1, .ContrnÊÊ......... 286 (80%) siOll: 114 (64%) 1118......... .....(33%)......... ...................... .................................. *Número de cromossomas (2n)

Tabela 3b. Análise

Estatística da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo do promotor de MMP12 A-82G comparando as frequências de alelo e genótipo em pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Grupos Alelo/ genótipo RO IC 95% para RO χ2-Μ-Η P χ2 Yates P A vs G DPOC Total vs controlos 1,60 1,04-2,47 4,99 0, 03 4,55 0, 03 AA vs AG DPOC Total vs controlos 1, 60 0, 98-2, 63 3, 96 0, 05 3, 52 0,06 RO = razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% X2 - M-H = x2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 31

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Tabela 4a. Dados

Frequência dos alelos e genótipos do polimorfismo do promotor de alfal-antitripsina 3' (1237) Taq 1 nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) T tt TT Tt tt Fumadores DPOC (hospital) N =111(111) 197 (89%) 25 (11%) 87 (78%) 23 (21%) 1 (1%) DPOC (clínica) N=61 (61) 111 (91%) 11 (9%) 52 (85%) 7 (12%) 2 (3%) DPOC total N=172(172) 308 ...............36................ .........139........ ...........30.......... ............3............ (90%) ............(.10%..)............ .......(.81%)...... (1-.¾) (2%) BW 17"" ControloSMMMMMMMk Illlllllll/ iilll!!!! mmmmm N=178 (ímiÊÊÊÊÊÊÊm 111111% ) :1|;;| |||1111;|||| lllllllll lllllllll *Número de cromossomas (2n)

Tabela 4b. Análise

Estatística da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo do promotor de alfal-antitripsina 3' (1237) Taq 1 comparando as frequências de alelos e genótipos em pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Grupos Alelo/genótipo RO IC 95% para RO χ2-Μ-Η P χ2 Yates P t vs T DPOC (hosp) vs controlos 3, 98 1,83-8, 82 15, 63 0, 00008 14,26 0, 0002 Tt/tt vs TT DPOC (hosp) vs controlos 4,19 1,86-9, 60 15,26 0, 00009 13,90 0, 0002 t vs T DPOC (hosp) vs controlos 3, 67 1, 76-7, 79 15,17 0, 0001 14, 04 0, 0002 Tt vs TT DPOC (hosp) vs controlos 3, 69 1,68-7, 89 13, 42 0,0002 12, 31 0,0005 Tr vs TT DPOC (hosp) vs controlos 3, 69 1,68-7, 89 13, 42 0,0002 12, 31 0,0005 t vs T DPOC (hosp) vs resistente 2, 01 0, 89-4, 62 3,29 0,07 2,62 0,10 Tt/tt vs TT DPOC (hosp) vs resistente 2, 04 0, 86-4, 92 3,12 0, 08 2,50 0,11 RO = razão de Odd, TC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 32

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Tabela 5a. Dados

Frequência dos alelos e genótipos do polimorfismo nulo GSTM1 nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado NN/Nn nn Fumadores DPOC (hospital) N =110(111) 46 (42%) 64 (58%) DPOC (clínica) N=56 (61) 28 (50%) 28 (50%) iiiiiiiiíiiiiiiiii (45%) ............ 92 (55%) BB 1Controlos βϊ1β: 75 N=178 (178) llll lli WÊÊÈÈÈm (42%) *Número de cromossomas (2n)

Tabela 5b. Análise

Estatísticas da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo nulo GSTM1 comparando as frequências dos alelos e genótipos em pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Grupos Alelo/genótipo RO IC 95% para RO χ2-Μ-Η P χ2 Yates P nn vs Nn/NN DPOC Total vs controlos 1, 71 1, 09-2, 68 6, 05 0, 01 5, 55 0, 02 nn vs Nn/NN DPOC (hosp) vs controlos 1,91 1,15-3,19 6, 99 0, 008 6,38 0, 01 nn vs Nn/NN DPOC (hosp) vs resistentes 1, 64 0, 89-3, 03 2,90 0, 09 2,44 0,12 RO = razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 33

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Tabela 6a. Dados

Frequências dos alelos e genótipos do polimorfismo exónico de TGF/3 T—>C (codão 10) nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) P L PP PL LL Fumadores DPOC (hospital) 40 72 4 32 20 N =56(111) (36%) (64%) (7%) (57%) (36%) DPOC (clínica) 38 82 5 28 27 N=60 (61) (32%) (68%) (8%) (47%) (45%) ΡΓ ' ' ~.zai : :1.34 . 47 11=116(172)..................... (34%) (66%) (8%) (52%) (40%) :€OTtro2.os:|lllllll|v:v:v/||; /::::::::::::.12.5::::::::::::::. ::::::::::::::155::::::::::/ //////////li//:::::::: .::::::::::73.::::::::1 ////////1:¾½ N=i4o.....(ipsfmmm...... .........(45%)............. ............(55%)........ 111111½..... (21%) *Número de cromossomas (2n)

Tabela 6b. Análise

Estatísticas da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo exónico de TGFfi T^C (codão 10) canparando as frequências de alelos e genótipos nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Grupos Alelo/genótípo RO IC 95% para RO χ2-Μ-Η P χ2 Yates P Ρ vs L Resistente vs DPOC (total) 1,58 1,01-2,48 4,51 0, 03 4,07 0, 04 PP vs PL/LL Resistente vs DPOC(total) 2, 82 1,07-7,58 5,44 0, 02 4,45 0, 03 RO = razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 34

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Tabela 7a. Dados

Frequência dos alelos e genótipos do polimorfismo exónico de SOD3 C+760 (Arg213Gly) nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) C G CC CG GG Fumadores DPOC (hospital) N =94(111) 187 (99,5%) 1 (0,5%) 93 (99%) 1 (1%) 0 (0%) DPOC (clínica) N=57 (61) 111 (97%) 3 (3%) 54 (95%) 3 (5%) 0 (0%) DPOC·· total........................... 198 c.-: >) 4 (j%) 147 (97%) 1111111111 =111= 1|! B— m II íi!§!!§!is§|!!!! N=2i)9 408|||| !|||||98:)|!|| 10 (2%) 199 (95%) lil JÍ|||) v 0 11/ .................... * Número de cromossomas (2n) ** grupo de controlo de ascendência europeia Ukkola et al. 2001

Tabela 7b. Análise

Estatísticas da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo exónico de SOD3 C+760G (Arg213Gly) comparando as frequências de alelos e genótipos nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue.

Grupos Alelo/genótipo RO IC 95% para RO χ2-Μ-Η P χ2 Yates P G vs C Resistente vs DPOC (total) 3, 76 1,08-14,29 5, 62 0,02 4,45 0, 03 CG vs CC Resistente vs DPOC (total) 6, 03 1, 69-23, 43 10,97 0,0009 9,23 0, 002 RO = Razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 35

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Tabela 8a. Dados

Frequência dos alelos e genótipos do polimorfismo do promotor de TIMP3 T-1296C nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue

Grupo N = genotipado Frequência de alelos (%) * Frequência de genótipos (%) T C TT TC cc Fumadores DPOC (hospital) N =92(111) 119 (65%) 65 (35%) 35 (38%) 49 (53%) 8 (9%) DPOC (clínica) N=55 (61) 72 (65%) 38 (35%) 19 (34%) 34 (62%) 2 (4%) ΞΜι (65%) 103 ...........(35%)............ iiiiiiiiiiii lllllill! .......(.5.6.%.)...... llllillllllll (7%) ip B1B ,5;, . Controlos** iiil6 71///// /1/39 // ////:3g//// /1/111/ N=95......iliiiiil .....(61%) (3ÍIÍIII |||||:1%)|;|; lllllllllll; 111:1111) /! * Número de cromossomas (2n) ** grupo de controlo de ascendência europeia Beranek et al. 2000.

Tabela 8b. Análise

Estatísticas da tabela de contingência 2x2 do polimorfismo do promotor de TIMP3 T-1296C comparando as frequências de alelos e genótipos nos pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos dadores de sangue. Grupos Alelo/genótipo RO IC 95% para RO χ2-Μ-Η P χ2 Yates P TT vs TC/CC Resistente vs DPOC(total) 1, 77 0, 98-3,18 4,12 0, 04 3,59 0,06 TT vs TC/CC Resistente vs DPOC (hosp) 1, 94 0,90-4,19 3, 41 0, 06 2, 81 0, 09 RO = razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido 36

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Tabela 9: Sumário de polimorfismos protectores (resistentes) e polimorfismos de susceptibilidade

Gene Número OMIM Polimorfismo Genótipo Efeito Razão de Odd IC de 95% P MMP1 120353 Promotor -1607 1G—>2G 2G2G Protector 2,48 1,41-4,39 0,001 MMP12 601046 promotor -82 A—>G AA Susceptivel 1,60 0,98-2,63 0,05 Oíl- antitripsina 107400 Região 3' 1237 G—»A (alelo t) Tt/tt Susceptivel 4,19 1,86-9,60 0,0002 GSTM1 138350 Polimorfismo nulo nn Susceptivel 1,71 1,09-2,68 0,01 ΤΘΕβ 190180 Codão 10 (exãol) T->C (alelo P) PP Protector 2,82 1,07-7,58 0,02 SOD3 185490 Arg213gly C—ΧΞί (+760) AC Protector 6,03 1,69- 23,43 0,0009 TIMP3 188826 Promotor -1296 T->C TT Protector 1,77 0,98-3,18 0,04

Chave para a tabela MMP1 = metaloproteinase 1 = colagenase intersticial MMP12 = metaloproteinase 12 = elastase de macrófagos GSTM1 = glutationa-S-transferase 1 TGFp = factor de crescimento transformante β S0D3 = superóxido-dismutase 3 TIMP3 = inibidor tecidular de metaloproteinase 3 RO = razão de Odd IC de 95% = intervalo de confiança de 95% P = valor de p

Protector refere-se a genótipos encontrados com uma frequência significativamente maior nos fumadores resistentes em comparação com pacientes com DPOC (+ controlos) Susceptivel refere-se a genótipos encontrados com uma frequência significativamente maior nos pacientes com DPOC em comparação com controlos (+ fumadores resistentes) 37

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Sumário das análises combinadas

As tabelas 10 e 11 resumem os resultados comparando as frequências de 0, 1 e >2 genótipos protectores ou de susceptibilidade entre os pacientes com DPOC, fumadores resistentes e controlos. Números significativamente maiores de fumadores com DPOC tinham 0 genótipos protectores em comparação com fumadores resistentes. Pelo contrário, um número significativamente maior de fumadores resistentes tinha 2 ou mais genótipos protectores em comparação com fumadores com DPOC. Comparando as frequências de 0, 1 e ^2 genótipos de susceptibilidade, um número significativamente maior de fumadores com DPOC tinha >2 genótipos de susceptibilidade em comparação com controlos dadores de sangue. Um número significativamente maior de controlos tinha 0 genótipos de susceptibilidade em comparação com fumadores com DPOC.

Tabela 10a: Frequência de fumadores susceptiveis (DPOC) ou resistentes ao fumo de acordo com o número de genótipos protectores (n=4) (MMPl-(1607) 2G2G, TGF/3-PP, SOD3-(+760) CGf TIMP3- (-1296) TT)

Frequência de genótipos protectores (%) (para indivíduos com >3 dos 4 tipificados) Excluídos* Grupo 0 1 2 + DPOC (hospital) 40 37 16 18 N = 93 (111) (43%) (40%) (17%) (16%) DPOC (clínica) 16 29 11 5 N = 56 (61) (29%) (52%) (19%) (8%) DPOC total 56 r> n " 7 - ;iillil!l§il§! (38%) (44%) (18%) (15%) MB WM Βββ Total N =227 67 95 65 (29%) (42%) (29%)

Excluídos* = indivíduos com < 2 genótipos protectores tipificados foram excluídos da análise. 38

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Tabela 10b: Frequência de fumadores susceptíveis (DPOC) a resistentes ao fumo de acordo com o número de genótipos protectores

Genótipo Alelo/genótipo RO IC 95% para RO X2-M-H P X^ Yates P 2+ vs 0-1 Resist. vs DPOC total 4,29 2,24-8,27 23, 35 0, 000001 21,98 0, 000003 0 vsl-2+ DPOC total vs Resistente 3, 67 1, 70-8, 05 13, 51 0, 0002 12,46 0, 0004 tabela 2x3 Resist. vs DPOC total ' " 26,92 0, 000001 RO = razão de Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido

Tabela 11a: Frequência de fumadores susceptíveis (DPOC) ou resistentes ao fumo de acordo com o número de genótipos de susceptibilidade (n=3) (MMP12- (-82) AA, otlAT3' - (1237) Tt/tt, GSTMl-nulo (nn) )

Frequência de genótipos susceptíveis (%) (para indivíduos com > 2 dos 3 tipificados) Excluídos* Grupo 0 1 2+ DPOC (hospital) 5 49 57 0 N = 111 (111) (5%) (44%) (51%) (0%) DPOC (clínica) 7 30 21 3 N = 58 (61) (12%) (52%) (36%) (5%) DPOC total 12 79 78 3 N=169 (172) (7%) (47%) (46%) (2%) Fumadores resistentes 11 40 33 1 N =84 (85) (13%) (48%) (39%) (1%) Total N =253 23 119 111 (9%) (47%) (44%) Controlos (dadores) 32 89 57 0 N = 178 (18%) (50%) (32%) (0%)

Excluídos* = indivíduos com <1 genótipos de susceptibilidade tipificados foram excluídos da análise. 39

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Tabela 11b: Frequência de fumadores susceptíveis (DPOC) ou resistentes ao fumo de acordo com o número de genótipos de susceptibilidade

Genótipo Alelo/genótipo RO IC 95% para RO x2-m-h P X^ Yates P 2+ vs 0-1 DPOC total vs controlo 1, 82 1,15-2,88 7,26 0, 007 6, 70 0, 009 2+ vs 0-1 DPOC (hosp) vs controlo 2,24 1,34-3, 76 10, 66 0, 001 9,90 0, 002 2+ vs 0-1 DPOC (hosp) vs Resistente 1, 63 0, 88-3, 01 2, 78 0,10 2,34 0,13 tabela 2x3 Total DPOC vs controlo ' ' ' ' 12, 73 0, 002 tabela 2x3 DPOC (hosp) vs controlo 16, 66 0, 0002 tabela 2x3 DPOC (hosp) vs Resistente 5, 94 0, 05 RO = razão Odd, IC 95% = intervalo de confiança de 95% χ2 - M-H = χ2 Mantel-Haenszel, χ2 Yates = χ2 Yates corrigido

A Figura 2 mostra graficamente os dados da tabela 10. A estimativa de risco, quantificada pela razão padronizada, mostra que a presença de 0 genótipos protectores neste estudo aumenta significativamente o risco de um fumador ter DPOC em 167%. Pelo contrário, esta análise mostra que o risco de um fumador com 2 ou mais genótipos protectores ter DPOC é reduzido em 67%. Tendo em conta que o risco de fundo de DPOC em fumadores antes do teste genético é de cerca de 20%, a presença de 0 genótipos protectores aumenta significativamente este risco. A Figura 3 mostra graficamente os dados da tabela 11. As análises de estimativa de risco não mostraram diferenças significativas no risco embora fossem evidentes tendências mostrando um maior risco de um fumador ter DPOC na presença de 2 ou mais genótipos de susceptibilidade. As

Figuras 4-6 mostram uma tendência para uma maior função pulmonar em fumadores com números maiores de genótipos protectores.

Discussão do estudo expandido.

Este estudo mostra a nova utilidade de identificar polimorfismos genéticos que, isolados ou em combinação, prevêem um risco aumentado de sofrer de défice da função 40

ΕΡ 1 402 073 /PT pulmonar e DPOC devido a fumo crónico. A base deste maior risco é provavelmente devido a (1) efeitos directos desses polimorfismos que se verificou alterarem a expressão de genes ou função de proteina ou (2) efeitos indirectos em que estes polimorfismos estão em desequilíbrio de ligação (variantes genéticas consistentemente herdadas em conjunto) com outras mutações que têm estes efeitos directos. Admitindo a nossa hipótese de que a DPOC resulta dos efeitos combinados de muitos polimorfismos em fumadores, este estudo mostrou que estão envolvidos vários genes que codificam para proteínas envolvidas em vários processos patofisiológicos interrelacionados. Especificamente, os resultados deste estudo mostram que a variação genética nos genes que codificam para proteínas envolvidas na resposta inflamatória (TGFpi), defesa antioxidante (SOD3, GSTMI) e remodelação da matriz (incluindo proteases (MMPl, MMP12) e seus inibidores (al-antitripsina, TIMP3)) contribuem provavelmente para o desenvolvimento de DPOC. As variantes genéticas aqui descritas representam provavelmente apenas uma amostra da soma total de variantes genéticas dos processos patofisiológicos acima que contribuem para o desenvolvimento de DPOC em fumadores mas que eles próprios aumentam significativamente a capacidade de identificar fumadores com um risco maior do que a média para um défice da função pulmonar. A este respeito, tal como outros testes biológicos como o colesterol no soro, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para diagnosticar uma predisposição para uma doença futura, antes que esta se manifeste quer patofisiológica, quer clinicamente. Estudos epidemiológicos indicam que os processos que resultam num défice da função pulmonar se estendem para além do risco de desenvolver DPOC, mas incluem doença das artérias coronárias, AVC e cancro do pulmão. De facto, muitas das proteínas descritas nestes estudo foram implicadas na doença vascular (doença das artérias coronárias e AVC) e cancro, sugerindo utilidade na invenção aqui descrita identificando que os que estão expostos ao fumo de cigarro têm um risco maior que a média de ter doença vascular e cancro.

Exemplo 3. Estudo do défice da função pulmonar 3.1. Recrutamento de indivíduos

Recrutaram-se a partir de duas fontes indivíduos de ascendência europeia que fumaram um mínimo de 20 maços-ano. O 41

ΕΡ 1 402 073 /PT primeiro grupo eram pacientes a quem foi diagnosticado por um médico que tinham um défice significativo da função pulmonar (neste caso marcados como doença pulmonar obstrutiva crónica) que satisfazem os seguintes critérios: tinham mais de 50 anos de idade e desenvolveram sintomas de falta de ar após os 40 anos de idade, tinham um volume expiratório forçado num segundo (FEVl) como uma percentagem do previsto <70% e uma razão FEVl/FVC (volume expiratório forçado num segundo/capacidade vital forçada) <70% (medido utilizando os critérios da American Thoracic Society). Recrutaram-se 84 indivíduos destes 56% eram homens, o FEVl/FVC médio (± desvio padrão) era de 0,4 4 (0,12), o FEVl médio como uma percentagem do previsto era 33 (13). A idade média e história de maços-ano era de 73 anos (9) e 45 maços-ano (29), respectivamente. Utilizando um método baseado em PCR (Sandford et al., 1999), determinámos os genótipos do grupo de DPOC para as mutações de αΐ-antitripsina (variantes S e Z) e nenhum tinha o alelo Z (genótipos MZ, SZ, ZZ) . Também estudámos 58 indivíduos europeus que fumaram um mínimo de vinte maços-ano e que nunca tinham sofrido de falta de ar e a quem não foi diagnosticada doença pulmonar obstrutiva no passado, em particular asma ou doença pulmonar obstrutiva crónica. Este grupo de controlo foi recrutado através de clubes para idosos e consistia de 57% de homens, o FEVl/FVC médio (± desvio padrão) era de 0,82 (0,08), o FEVl médio como uma percentagem do previsto era de 97 (11) . A idade média e história de maços-ano era de 54 anos (11) e 46 maços-ano (28), respectivamente.

Os métodos de determinação de genótipos e genes candidates são como descrito em exemplos anteriores. 3.2 Resultados comparando as cinco variantes genéticas individualmente e em conjunto em fumadores com função pulmonar normal e deficiente.

Quando os fumadores foram subdivididos em tereis de função pulmonar (FEVl percentagem do previsto, FEVl absoluto e FEVl/FVC) observamos uma tendência significativa para um excesso das variantes genéticas de susceptibilidade nos grupos de tercil mais baixo (veja-se tabelas 1-3 a seguir). 42

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Tabela 1. indivíduos por tereis de percentagem prevista de FEVl e frequência de variantes de susceptibilidade (a cheio). A-82G HME C-1562T Gel B 1G/2G MMP1 G1237A 3'al-AT GSTM1 nulo Tercil aa ag/gg CC CT/TT 1G1G 2G2 G TT Tt/tt N n 1G2G Mais 37 10 26 21 30 17 37 10 12 35 baixo (79%) (21%) (55%) (45%) (64%) (36%) (79%) (21%) (25%) (74%) médio 36 13 29 20 29 20 40 9 23 25 (73%) (27%) (59%) (41%) (59%) (41%) (82%) (18%) (48%) (52%) Mais 17 29 36 10 33 13 44 2 19 23 elevado (37%) (63%) (78%) (21%) (72%) (28%) (96%) (4%) (45%) (55%) Valor <0,0001 0,05 Ns 0,05 0, 05 de P* HME= elastase de macrófago humano (MMP12), Gel b= = gelatinase B (MMP9), MMP1 = metaloproteinase de matriz 1 ou colagenase intersticial, al-AT= = al- antitripsina, GSTM1 = glutat iona-S-transferase M *= valor de p para Qui -quadrado.

Tabela 2. Indivíduos por tereis de FEVl absoluto e frequência de variantes de susceptibilidade (a cheio). A-82G HME C-1562T Gel B 1G/2G MMP1 G1237A 3'al-AT GSTM1 nulo Tercil aa ag/gg CC CT/ TT 1G1G 2G2 G TT Tt/tt N n 1G2G Mais 36 10 20 26 31 15 36 10 10 36 baixo (78%) (22%) (43%) (57%) (67%) (33%) (78%) (22%) (22%) (78%) médio 33 14 32 15 25 22 37 10 21 26 (70%) (30%) (68%) (32%) (53%) (47%) (79%) (21%) (45%) (55%) Mais 21 28 39 10 36 13 48 1 23 21 elevado (43%) (57%) (80%) (20%) (73%) (27%) (98%) (2%) (52%) (48%) Valor 0,0008 0,0009 0,10 0,008 0,008 de P HME= elastase de macrófago humano (MMP12), Gel b= gelatinase B (MMP9), MMP1 = metaloproteinase de matriz 1 ou colagenase intersticial, al-AT= = al- antitripsina, GSTM1 = glutationa-S-transferase M *= valor de p para Qui -quadrado. 43

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Tabela 3. indivíduos por tereis da razão FEVl/FVC e frequência de variantes de susceptibilidade (a cheio). A-82G HME C-1562T Gel B 1G/2G MMP1 G1237A 3'al-AT GSTM1 nulo Tercil aa ag/gg CC CT/TT 1G1G 2G2 G TT Tt/tt N n 1G2G Mais 39 10 30 19 29 20 40 9 16 33 baixo (80%) (20%) (61%) (39%) (59%) (41%) (82%) (18%) (33%) (67%) médio 34 12 23 23 28 18 37 9 17 28 (74%) (26%) (50%) (50%) (61%) (39%) (80%) (20%) (38%) (62%) Mais 17 30 38 9 35 12 44 3 21 22 elevado (36%) (64%) (81%) (19%) (74%) (26%) (94%) (6%) (49%) (51%) Valor <0,0001 0, 007 ns 0,14 0,11 de P HME= elastase de macrófago humano (MMP12), Gel b= gelatinase B (MMP9), MMP1= metaloproteinase de matriz 1 ou colagenase intersticial, Ofl-AT= = otl- antitripsina, GSTM1 = glutationa-S-transferase M. *= valor de p para Qui- quadrado. O efeito colectivo de ter uma ou mais variantes de susceptibilidade na função pulmonar é analisado nos gráficos de barras a seguir. Há uma tendência consistente no sentido de ter uma função pulmonar progressivamente pior (percentagem prevista de FEV1, FEVl absoluto e FEVI/FVC) com um número crescente de variantes genéticas de susceptibilidade (vejam-se as Figuras 1-3).

Numa análise de regressão logística (após ajuste de todas as variáveis) uma selecção gradual encontrou para cada parâmetro da função pulmonar, vários factores genéticos e não genéticos que estavam significativamente associados (resumidos na tabela 4 a seguir). 44

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Tabela 4. Resultados da análise de regressão logística para factores genéticos e não genéticos associados com a função pulmonar.

Função pulmonar Variável R2 Parcial R2 Modelo Valor P FEVl % do previsto idade 0,37 0,37 <0,0001 A-82G HME 0,065 0,44 <0,0001 GSTM1 nulo 0,013 0,45 0,07 FEVl absoluto idade 0,52 0,52 <0,0001 GSTM1 nulo 0,026 0,54 0,006 A-82G HME 0,02 0,56 0,015 G1237A 3' al-AT 0,01 0,57 0,068 FEVl/FVC idade 0,34 0,34 <0,0001 A-82G HME 0,06 0,40 0,0003 Maços-ano de fumo 0,03 0,43 0,01 GSTMl nulo 0,02 0,45 0,03

Discussão de resultados

Os resultados do nosso estudo indicam que as nossas variantes de susceptibilidade estão associadas com um défice da função pulmonar num grupo de fumadores. Este é o caso quando analisamos o efeito do genótipo na função pulmonar, como se pode ver nos gráficos de barras (figuras 1-3). Especificamente, os resultados do gráfico de barras mostram que quando os indivíduos são divididos de acordo com o número de variantes de susceptibilidade, se observa uma relação linear inversa forte com o défice da função pulmonar, quer o último seja determinado por FEVl absoluto, percentagem prevista de FEVl ou FEVl/FVC. Pelo contrário, quando os indivíduos são divididos de acordo com a sua função pulmonar em tereis, os resultados mostram de forma consistente que os que têm um maior défice da função pulmonar têm a maior frequência das nossas variantes genéticas de susceptibilidade (veja-se tabelas 1-3). Por fim, uma regressão logística gradual, após ser ajustada para a maioria das co-variáveis, as variantes de susceptibilidade do gene de elastase de macrófago humano e o gene de glutationa S transferase contribuem para um défice da função pulmonar (veja-se tabela 4).

De relevância directa para os métodos da presente invenção e suas aplicações é o desequilíbrio de ligação. Este 45

ΕΡ 1 402 073 /PT é um fenómeno da genética em que duas ou mais mutações ou polimorfismos estão numa proximidade genética tal que praticamente são sempre co-herdados. Isto significa que na determinação do genótipo de um polimorfismo, a presença de outro polimorfismo em desequilíbrio de ligação pode ser inferida. Assim, quaisquer variantes genéticas (mutações ou polimorfismos) que estão em desequilíbrio de ligação com as variantes genéticas aqui descritas também estão incluídas no conceito inventivo aqui descrito. Estas variantes estão descritas em publicações aqui incluídas, bem como na literatura estabelecida.

Os dados acima proporcionam uma nova ligação biológica subjacente às observações epidemiológicas de que o défice da função pulmonar é não só um teste de diagnóstico útil para a predisposição para, e morte por, doença respiratória crónica (DPOC, asma, bronquiectasia e bronquiolite), mas também doenças cardiovasculares (doença das artérias coronárias e enfarte) e alguns cancros (cancro do pulmão). A presente invenção identifica variantes genéticas de susceptibilidade específicas que determinam um défice da função pulmonar, mas estão também implicadas em processos patofisiológicos subjacentes que provocam aterogénese/trombose e cancro.

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<210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial 53 ΕΡ 1 402 073 /PT <22 0>

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<210> 12 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> INICIADOR < 4 0 0 > 12 gcaaccaggc cagcgtggag aacgggaa 28

<210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

<223> INICIADOR < 4 0 0 > 13 ccagaggaga agctcaaagg caga 24

<210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 >

<223> INICIADOR < 4 0 0 > 14 caaagcagaa tcaagatgtc aat 23

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> INICIADOR < 4 0 0 > 15 ctgggttaag caacacaaag c 21

Lisboa

Claims (34)

1. ΕΡ 1 402 073 /PT 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Método para determinar a predisposição de um indivíduo para desenvolver uma condição, para determinar o risco potencial de um indivíduo desenvolver a condição, ou para diagnosticar num indivíduo o início potencial da condição, em que o método compreende pelo menos a análise de pelo menos um polimorfismo seleccionado do grupo constituído por: A-82G no promotor do gene que codifica MMP12 (elastase de macrófago humano); T^C no codão 10 do gene que codifica TGFp (factor de crescimento transformante beta); C+760G do gene que codifica SOD3 (Superóxido-dismutase 3); T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3 (inibidor tecidular de metaloproteinase 3); e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes polimorfismos; em que o genótipo do indivíduo é indicativo de predisposição para desenvolver a condição, de risco potencial para desenvolver a condição ou do inicio potencial da condição, e em que a condição é a doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) ou défice da função pulmonar.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo A-82G no promotor do gene que codifica MMP12.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo T-»C no codão 10 do gene que codifica TGFp.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo C+760G do gene que codifica SOD3.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3. ΕΡ 1 402 073 /PT 2/7
6. 6. Método para determinar a predisposição de um indivíduo para, e/ou o risco potencial de, risco de desenvolver morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar, compreendendo pelo menos a análise de pelo menos um polimorfismo seleccionado do grupo constituído por T->C no codão 10 do gene que codifica TGFp (factor de crescimento transformante beta); C+760G do gene que codifica SOD3 (Superóxido-dismutase 3); T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3 (inibidor tecidular de metaloproteinase 3); e polimorfismos em desequilíbrio de ligação com estes polimorfismos; em que o genótipo do indivíduo é indicativo de predisposição para, e/ou risco potencial de, risco de desenvolver morbidez/mortalidade da referida doença.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo T->C no codão 10 do gene que codifica TGFp.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 6 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo C+760G do gene que codifica S0D3.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 6 compreendendo pelo menos a análise do polimorfismo T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a doença é seleccionada do grupo constituído por doenças pulmonares obstrutivas crónicas, doença arterial coronária, AVC e cancro do pulmão.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a doença do pulmão obstrutiva crónica é doença pulmonar obstrutiva crónica.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o método compreende ainda a análise de pelo menos um polimorfismo em pelo menos um gene que codifica uma proteína envolvida na remodelação da matriz, defesa antioxidativa ou resposta inflamatória, incluindo genes ΕΡ 1 402 073 /PT 3/7 que codificam metaloproteinases de matriz, citóquinas inflamatórias e anti-inflamatórias, inibidores de metaloproteinases de matriz e enzimas envolvidas em oxidantes de metabolização.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12 em que pelo menos um gene é seleccionado do grupo constituído por: MMPl (colagenase intersticial); MMP9 (gelatinase B); MMPl2 (elastase de macrófago humano); αΐ-antitripsina; e GSTl (glutationa-S-transferase 1). TGFp (factor de crescimento transformante β); SOD3 (superóxido-dismutase 3); ou TIMP3 (inibidor tecidular de metaloproteinase 3).
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13 em que pelo menos um polimorfismo analisado é 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMPl, C-1562T no promotor do gene que codifica MMP9, G1237A na região 3' do gene que codifica αΐ-antitripsina, o polimorfismo Ml nulo no gene que codifica GSTl, T-»C no codão 10 do gene que codifica TGFp, C+760G do gene que codifica SOD3, T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3, ou A-82G no promotor do gene que codifica MMPl2.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou a reivindicação 14, em que se analisam os seguinte polimorfismos: 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMPl; T^C no codão 10 do gene que codifica TGFP; C+760G do gene que codifica SOD3; e, T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 6 compreendendo a análise dos polimorfismos: 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMPl; ΕΡ 1 402 073 /PT Ml C-1562T no promotor do gene que codifica MMP9; e, A-82G no promotor do gene que codifica MMP12.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 6 compreendendo a análise dos polimorfismos: A-82G no promotor do gene que codifica MMP12; G1237A na região 3' do gene que codifica αΐ-antitripsina; e, polimorfismo Ml nulo no gene que codifica para GST1.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que, quando se analisa o polimorfismo A-82G no promotor do gene que codifica MMP12, o genótipo -82AA no promotor do gene que codifica MMP12 é indicativo de um ou mais de entre a) predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; b) risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e c) inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que, quando é analisado o polimorfismo C+760G no gene que codifica SOD3, o genótipo +760GG ou +760CG no gene que codifica SOD3 é indicativo de um ou mais de entre: a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que, quando se analisa o polimorfismo T-1296C no promotor do gene que codifica TIMP3, o genótipo -1296TT no promotor do gene que codifica TIMP3 é indicativo de um ou mais de entre a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, ΕΡ 1 402 073 /PT 5/7 défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que, quando se analisa o polimorfismo T^C no codão 10 do gene que codifica TGFp, o genótipo CC (alelo P homozigótico) no codão 10 do gene que codifica TGFp é indicativo de um ou mais de entre: a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que, quando se analisa o polimorfismo 1G/2G na posição -1607 no promotor de MMP1, o genótipo 2G2G no promotor do gene que codifica MMPl é indicativo de um ou mais de entre a) protecção contra o desenvolvimento de DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e b) risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ao 16, em que, quando se analisa o polimorfismo C-1562T no promotor do gene que codifica MMP9, os genótipos -1562CT e -1562TT no promotor do gene que codifica MMP9 são indicativos de um ou mais de entre: a) predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; b) risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e c) inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou 17, em que, quando se analisa o polimorfismo G1237A na região 3' do gene que codifica αΐ-antitripsina, os genótipos 1237AG e 1237AA (genótipos dos ΕΡ 1 402 073 /PT 6/7 alelos Tt ou tt) na região 3' do gene que codifica para αΐ-antitripsina são indicativos de um ou mais de entre: a) predisposição para desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; b) risco potencial de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar; e c) inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, em que a presença de dois ou mais genótipos protectores é indicativa de risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, em que a presença de dois ou mais genótipos de susceptibilidade é indicativa de maior risco de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que o indivíduo é um fumador ou alguém exposto a níveis elevados de poluentes do ar, tais como fumo de tabaco do meio ambiente.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, em que, quando se analisa o polimorfismo T->C no codão 10 do gene que codifica TGFp e/ou o polimorfismo C+760G do gene que codifica SOD3, a análise é realizada utilizando ARN ou ADNc que codifica TGFp ou SOD3.
29. 29. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 3 compreendendo pelo menos o passo de analisar o aminoácido presente numa posição mapeada no codão 10 do gene que codifica TGFp.
30. 30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a presença de leucina na referida posição é indicativa de uma ΕΡ 1 402 073 /PT 7/7 predisposição para, e/ou risco potencial de, desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar, e/ou inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.
31. 31. Método de acordo com a reivindicação 29 em que a presença de prolina na referida posição é indicativa de risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar.
32. 32. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 4 compreendendo pelo menos o passo de analisar no indivíduo o aminoácido presente na posição 213 de SOD3.
33. 33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a presença de glicina na posição 213 é indicativa de risco potencial de desenvolver, e/ou de predisposição para desenvolver, DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar, e/ou inicio potencial de DPOC e/ou défice da função pulmonar.
34. 34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a presença de arginina na referida posição é indicativa de risco reduzido de desenvolver DPOC, défice da função pulmonar e/ou risco de morbidez/mortalidade de uma doença associada com défice da função pulmonar. Lisboa,