WO2005087249A1 - プロテアーゼ阻害剤及び疾患の予防又は治療剤 - Google Patents

プロテアーゼ阻害剤及び疾患の予防又は治療剤

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WO2005087249A1
WO2005087249A1 PCT/JP2005/004301 JP2005004301W WO2005087249A1 WO 2005087249 A1 WO2005087249 A1 WO 2005087249A1 JP 2005004301 W JP2005004301 W JP 2005004301W WO 2005087249 A1 WO2005087249 A1 WO 2005087249A1
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inhibitor
protein
gene encoding
copd
amino acid
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PCT/JP2005/004301
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Tomoaki Hoshino
Hisamichi Aizawa
Original Assignee
Kurume University
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to an inhibitor of a protease considered to be one of the causes of chronic obstructive pulmonary disease, and an agent for preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease, immunodeficiency syndrome, alveolar proteinosis, and cardiovascular disease. Things.
  • COPD Chronic Obstructive Pulmonary Disease
  • Non-patent document 1 Pauwels, R.A "Buist, AS, Calverley, PM, Jenkins, C.R” and Hurd, SS 'Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.NHLBI / WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) Workshop summary. "American journal of respiratory and critical care medicinej, vol.163: PP.1256—1276, 2001.
  • Non-Patent Document 2 Barnes, P.J. "Novel approaches and targets for treatment of chronic obstructive pulmonary disease.” American journal of respiratory and critical care medicinej, vol. 160: S72-79, 1999.
  • Alveolar alveolar proteinosis is a disease of unknown cause that surfatatante protein and phospholipids accumulate in the alveoli.
  • 90% of idiopathic cases show the presence of autoantibodies that suppress the activity of GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor).
  • GM-CSF Gramulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor
  • Heart failure such as pulmonary heart caused by right heart load caused by chronic lung disease including COPD, and subsequent circulatory insufficiency such as liver failure and pulmonary hypertension, etc., cause the circulation related to COPD. It is known as organ disease.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • CD4 a type of antigenic protein, a single-chain transmembrane d-glycoprotein with a molecular weight of 59 kDa
  • cocktail therapy highly active antiretroviral therapy
  • HAART therapy highly active antiretroviral therapy
  • this cocktail therapy was not a radical treatment, it was reported that it not only increased immune cells in AIDS patients but also reduced the number of viruses in the blood to below the detection limit.
  • elastase is known as a protease that hydrolyzes an insoluble protein elastin, which is a main component of elastic fibers constituting the lung. It has been long known that elastase induces emphysema, a type of COPD, when administered intratracheally, and elastase-administered animals have been used as animal models for emphysema.
  • the present inventors came up with the possibility of using other IL-18 inhibitors as a therapeutic agent for COPD, and completed the present invention.
  • the purpose of the present invention was to use proteases including elastase.
  • proteases including elastase.
  • a protease inhibitor which comprises at least one selected from the following (1) to (4):
  • a protease is meta-mouth protease, serinbu mouth
  • a chronic obstructive agent characterized by containing at least one protease inhibitor, [3] selected from the following (1) to (4), wherein the protease and cysteine protease are also selected.
  • a prophylactic or therapeutic agent for pulmonary disease or immunodeficiency syndrome [4] preventing or treating chronic obstructive pulmonary disease, comprising at least one selected from the following (5) to (8): [5]
  • a prophylactic or therapeutic agent for alveolar proteinosis comprising at least one selected from the following (5) to (8): [6]
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of an interleukin 18 inhibitor and having an interleukin 18 inhibitory activity (7) Gene encoding (1)
  • the protease inhibitor containing the redox-active protein or its gene and the prophylactic or therapeutic agent for COPD of the present invention can strongly suppress COPD and can be used alone for the treatment of immunodeficiency syndrome groups. Or as a protease used in cocktail therapy such as HAART therapy. Since the redox-active protein or its gene is originally present in living cells, it has the advantage that it is conventionally used in cocktail therapy for immunodeficiency syndrome and has no side effects such as protease inhibitors. Have.
  • the preventive or therapeutic agent for a disease containing an IL-18 inhibitor or a gene thereof according to the present invention is effective for treating cardiovascular diseases such as COPD, alveolar proteinosis, circulatory insufficiency associated with heart failure, hepatic insufficiency or pulmonary hypertension. Can be treated.
  • FIG. 1 is a microscopic image of the lung tissue of the first group (control mice) of Example 2 (HE staining, X40 magnification)
  • FIG. 2 is a microscopic image of lung tissue of the second group (pathological mouse model 1) of Example 2 (HE staining, X40 (f)
  • FIG. 3 is a microscopic image of lung tissue of the third group (pathological mouse model 2) of Example 2 (HE staining, X40 (f)
  • FIG. 4 is a microscopic image of lung tissue of the fourth group (etiology + therapeutic agent-administered mouse) of Example 2 (HE staining, X 40 ⁇ )
  • FIG. 5 is a graph showing the mean alveolus length (mean linear intercept: Lm) of the mice in Groups 1 to 4 of Example 2.
  • FIG. 6 is a microscopic image of lung tissue of a group (control) to which PBS was administered to the SPC-IL-18TG mouse of Example 3 (HE staining, ⁇ 40)
  • FIG. 7 is a microscopic image of lung tissue of a group to which TRX was administered to the SPC-IL-18TG mouse of Example 3 (HE staining, X 40-fold).
  • FIG. 8 Immunohistochemical staining showing the expression level of IL-18 in lung tissue of healthy human lung in Reference Example 1. It is a figure which shows the result of a color (immunostaining, X400 time).
  • FIG. 9 is a view showing the results of immunohistochemical staining showing the expression level of IL-18 in lung tissue of a COPD patient in Reference Example 1 (immunohistochemical staining, ⁇ 40).
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining showing the expression level of IL-18 in the lung tissue of a COPD patient in Reference Example 1 (immunohistological staining, ⁇ 200).
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining showing the expression level of TRX in healthy human lung tissue in Reference Example 2 (immunohistological staining, ⁇ 40).
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining showing the expression level of TRX in healthy human lung tissue in Reference Example 2 (immunohistological staining, X200-fold).
  • FIG. 13 is a diagram showing the result of immunohistochemical staining showing the expression level of TRX in the lung tissue of a COPD patient in Reference Example 2 (immunohistological staining, ⁇ 40).
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of immunohistochemical staining showing the expression level of TRX in the lung tissue of a COPD patient in Reference Example 2 (immunohistological staining, X200-fold).
  • FIG. 15 Sequence (DNA sequence) of mature IL-18 cDNA having a signal peptide.
  • FIG. 16 is the recombinant gene SPC-IL-18SP used in the present invention.
  • the protease is a protease that is a proteolytic enzyme.
  • examples of the protease include meta-oral proteases, cysteine proteases, serine proteases, and aspartic proteases (acid proteases).
  • the meta-mouth protease is a proteolytic enzyme having a heavy metal such as zinc as an active center, and examples thereof include matrix 'meta-mouth protease (hereinafter referred to as "MMP") ⁇ thermolysin and the like.
  • MMP matrix 'meta-mouth protease
  • MMPs are zinc-containing proteases that hydrolyze intercellular adhesive matrix proteins in animal cells and are involved in cell division, morphogenesis, and cancer metastasis. Nearly 30 types of MMPs, such as MMP-1, 2, ⁇ ⁇ ⁇ 28, have been identified.
  • Cysteine protease is a protease having a cysteine residue as an active center, and examples thereof include caspase, ze, and papain.
  • caspase 1 , 2, 3 ⁇ Nearly 20 types are among them.
  • caspases 1, 3 and 9 are important as targets of the protease inhibitor of the present invention.
  • Caspase which cleaves the C-terminal side of aspartic acid, exists as an inactive precursor and is cleaved by an apoptotic signal to become an active form.
  • Specific examples include caspase 1 and the like, which is also called interleukin 1/3 converting enzyme and is known to cleave an IL-18 precursor to form an active form of IL-18.
  • serine proteases include chymotrypsin, subtilisin, and the like in addition to elastase.
  • Elastase is known as a protease that hydrolyzes insoluble protein elastin, which is a main component of elastic fibers constituting the lung.
  • Aspartic proteases include pepsin and cathepsin D.
  • the activity equivalent to the redox-active protein refers to a redox-regulating activity shown below.
  • a redox-active protein is a protein capable of controlling redox (regulating the redox state) by having both redox activities (oxidation and reduction, reduction-oxidation). Quality, including redox-active peptides and the like.
  • redox-active peptides and the like.
  • polypeptides belonging to the thioredoxin family, HO-1 (hemoxygenase-1) and the like can be mentioned.
  • Polypeptides belonging to the thioredoxin family refer to polypeptides belonging to the thioredoxin (hereinafter, referred to as "TRX") family (hereinafter, referred to as "TRX-P”) and dithiol bonds. And polypeptides having an acid-reducing activity of disulfide bonds, which are naturally present in biological cells (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-179588, etc.).
  • TRX-P includes, in addition to polypeptides extracted from natural animals including humans, plants, Escherichia coli, and yeasts, polypeptides such as yeasts and Escherichia coli that are extracted by genetic recombination And polypeptides produced by chemical synthesis.
  • polypeptides such as yeasts and Escherichia coli that are extracted by genetic recombination And polypeptides produced by chemical synthesis.
  • those derived from humans, those produced by genetic recombination in Escherichia coli and yeast, and synthetic peptides consisting of the same or similar sequences to them are preferred because they are considered to have less influence on living organisms.
  • TRXP has an active site containing a cysteine residue (one Cys XI—X2-Cys—: XI and X2 represent amino acid residues and may be the same or different). And a group of molecules with a similar three-dimensional structure. Therefore, in addition to the above, "TRX-P" referred to in the present invention includes those in which some amino acids are deleted or substituted within a range not impairing the dithiol bond or disulfide bond oxidation-reducing activity. And other amino acids and peptides may be fused.
  • Specific examples of the active site include Cys—Gly—Pro—Cys—, Cys—Pro—Tyr—Cys —, — Cys—Pro—His—Cys—, Cys—Pro—Pro—Cys— and the like.
  • Cys-Gly-Pro-Cys- is a sequence conserved across species, and is therefore preferable because the results of experiments using mouse models can be more reliably applied to humans.
  • TRX P include thioredoxin (TRX), which is an active site mosquito Cys-Gly-Pro-Cys-, and daltaredoxin.
  • TRX includes human, Escherichia coli, and yeast-derived TRX
  • daltaredoxin includes human and Escherichia coli-derived.
  • Examples of the active ingredient of the preventive or therapeutic agent for COPD, alveolar proteinosis, and circulatory disease of the present invention include the following (5) to (8) alone, and combinations thereof.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of an interleukin 18 inhibitor and having an interleukin 18 inhibitory activity
  • the IL-18 inhibitor of the present invention includes a substance that inhibits the conversion of IL-18 precursor to active IL-18, such as a cysteine protease inhibitor including an IL-1 ⁇ converting enzyme inhibitor. , IL-18 binding protein (IL-18 binding protein (IL-18BP) group, etc.) ⁇ Substances that neutralize the activity of IL-18, such as anti-IL-18 antibodies, recombinant type (The Combination of Soluble IL- 18R a and IL- 18R j8 Chains Inhioits IL-18- Induced IFN- ⁇ (Journal of Interferon and cytoine research 22: P.593-601, 2002, Mary and Liebert, Inc.)) or natural solubilized IL Substances that inhibit the binding of IL-18 to IL-18 receptor, such as -18 receptor (WO2005 / 12352), inhibitors of signal transduction after binding to IL-18 receptor, or genes encoding these No.
  • IL-18 binding protein IL-18 binding protein (IL
  • IL-1 ⁇ converting enzyme inhibitors Various compounds are known as IL-1 ⁇ converting enzyme inhibitors (ICE). Peptides similar to a site having affinity for ICE in the IL-1 ⁇ precursor include, for example, Aspl 16 force at the IL-1 ⁇ precursor cleavage site ⁇ 4 amino acid force toward the terminal side A peptide having the same peptide (TytVal-Ala-Asp) sequence is known to inhibit the binding of ICE to the IL_1 ⁇ precursor! / Puru (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-147895, [0002] See [Prior Art]). Further, as a specific example, for example, the peptide induction described in JP-A-5-255218 is disclosed.
  • the IL-18 binding protein is a protein described in [Immunity, 10, 127-136 (1999)] and its subclasses, that is, a protein described at the end of P.136 of the reference.
  • GenBank accession number means the IL-18 binding protein encoded by the gene represented by AF110798 or a subclass thereof.
  • Examples of the subclass include proteins encoded by genes represented by GenBank accession numbers AF110799, AF110800, AF110801, AF110802, AF110803, AF110460, and the like described in the literature. These can be prepared according to the method described in the literature [Immunity, 10, 127-136 (1999)].
  • a monoclonal antibody specific to IL-18 can be prepared according to the method described in the literature [J. Immunol. Methods, 217, 97-102 (1998)].
  • Specific examples of the substance that inhibits the binding of IL-18 to the IL-18 receptor include, for example, a monoclonal antibody specific to the IL-18 receptor protein and the IL-18 receptor. I can do it.
  • Monoclonal antibodies specific for the IL-18 receptor include Kitasato, Y., Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, S., Koda, Y., Nagata, N., Kinoshita, M., Koga, H., Yoon, DY, Asao, H., Ohmoto, H., Koga, T., Rikimaru, T., and Aizawa, H.
  • the monoclonal antibody specific to the IL-18 receptor may be an antibody derived from a mammal, a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the monoclonal antibody specific to the IL-18 receptor protein and the IL-18 receptor used in the present invention can be prepared, for example, according to the method described in JP-A-11-100400. it can.
  • IL lactate deacetylase
  • RAF6 ⁇ receptor—associated Factor
  • ⁇ - 1 TGF- ⁇ activated kinase
  • MAPKK3,4,6 MAP kinase kinase
  • JNK Jun
  • N-terminal kinase N-terminal kinase
  • p38 N-terminal kinase
  • NIK NF- ⁇ B-inducing kinase
  • IKK I ⁇ B-kinase
  • Substances that inhibit IL-18 signal transduction molecules include, for example, p38 MAP kinase inhibitors SB203580, SB220025, RWJ 67657 (American Journal of Respiratory and
  • the IL-18 inhibitor used in the present invention includes, in addition to the above-described IL-18 inhibitor itself, when the IL-18 inhibitor is a polypeptide, a gene encoding the polypeptide, Includes proteins with IL-18 inhibitory activity consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of an IL-18 inhibitor, or a gene encoding these. It is.
  • the active ingredients of the agent for preventing or treating COPD of the present invention include the above-mentioned substances ((1) to (4)) related to the redox-active protein and the substances related to the IL-18 inhibitor ((5 ) — (8)) can be used in combination.
  • the content of the active ingredient in the protease inhibitor or the prophylactic or therapeutic agent for diseases of the present invention varies depending on the dosage form, and cannot be unconditionally limited. It may be selected appropriately in relation to the amount, for example, in the case of liquids, 0.0001-10 (w / v%), preferably ⁇ 0.001-5 (w / v%), especially in the case of injections , 0.0002-0.2 (w / v%), preferably 0.001-0.1 (w / v%), for solids, 0.01-50 (w / w%), preferably Is a force that can be adjusted to 0.02-20 (wZw%) or the like, but is not necessarily limited to this range.
  • the dosage of the protease inhibitor or disease preventive or therapeutic agent of the present invention varies depending on the administration route, symptom, age, body weight, form of the preventive or therapeutic agent, and the like.
  • the amount of the active ingredient in the prophylactic or therapeutic agent is 0.005 to 500 mg / kg, preferably 0.1 to 100 mg / kg body weight of the subject in need of treatment, provided that the Divide once or several times a day so that the lower limit is 0.1 Olmg (preferably 0.1 mg) and the upper limit is 20 g (preferably 200 mg, more preferably 500 mg, and still more preferably 100 mg) per day. It is desirable to administer according to the symptoms.
  • the protease inhibitor and the agent for preventing or treating a disease of the present invention may be combined with a conventionally known component for preventing or treating a disease which is the object of the present invention.
  • the preventive or therapeutic components include the following 1.5.
  • LTB4 antagonists for example, LY29311, SC-53228, CP-105,696, SB201146, BIIL284
  • o-Lipxygenase inhibitors for column? J or zileutin, Bayxl005
  • hemokine inhibitors ⁇ IL-8 antagonists for example, SB225002; CXCR2 antagonists
  • TNF inhibitors e.g., monoclonal Ab, soluble receptors, MMP inhibitors
  • Antioxydants e.g., NAC, NAL, glutathione, superoxide dismutase, etc.
  • Prostanoid inhibitors ⁇ row OX- 2 inhioitors, tnromboxane antagonists ⁇ isoprostane receptor
  • Phosphodiesterase 4 inhibitors for example, SB207499, CP80633, CDP-840
  • Adhesion inhibitors for example, anti-CD11 / CD18, anti- ICAM1, E-selectin inhibitors
  • Prostaglandin E analogs for example, misoprostil, butaprost
  • IL-10 Colchicine ⁇ Macrolide antibiotics
  • Neutrophil elastase inhibitors for example, ICI200355, ONO-5046, MR-889, L658,758
  • atnepsin inhioitors f row, j3 ⁇ 4 suramin
  • Matrix metalioprotease innibitors f row for batimastat, marimastat, KBR7785
  • alpha 1—antitrypsin f sequence is purified, human recomoinant, gene transfer
  • Secretory leukoprotease inhibitor ⁇ Elafin etc.
  • immunosuppressant FK506 For example, immunosuppressant FK506 etc.
  • Agent for treating respiratory inflammatory disease or respiratory hypersensitivity Xanthine derivatives such as theophylline, ⁇ 2 receptor stimulants, anticholinergic agents, antiallergic agents, corticosteroids, and steroids such as inhaled steroids.
  • the protease inhibitor or the preventive or therapeutic agent for diseases of the present invention may contain other components as long as the inhibitory effect, the preventive or therapeutic effect is not inhibited, and for example, pharmaceutically.
  • Acceptable carriers include excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, emulsifiers, solubilizers, absorption enhancers, humectants, adsorbents, It can be formulated by well-known methods using additives such as fillers, extenders, humectants, and preservatives.
  • examples of the excipient include an organic excipient and an inorganic excipient.
  • the protease inhibitor and the prophylactic or therapeutic agent for diseases of the present invention are mainly for oral administration, and specifically include, for example, tablets, capsules, granules, powders, pills, troches and the like. It is orally administered in the form of a syrup or a syrup.
  • Examples of the administration form include oral administration, intravenous administration such as intravenous injection, intramuscular administration, transdermal administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, mucosal administration, and inhalation.
  • intravenous administration such as intravenous injection is preferable in terms of safety and keeping blood concentration constant.
  • the gene encoding the above-mentioned redox active protein can also be used as a protease inhibitor or a preventive or therapeutic agent for COPD or immunodeficiency syndrome in gene therapy.
  • the IL-18 inhibitor is a polypeptide
  • the gene encoding the IL-18 inhibitor may be used as a prophylactic or therapeutic agent for COPD, alveolar proteinosis, or cardiovascular disease in gene therapy.
  • RNA in addition to DNA, RNA, a plasmid, a virus vector and the like can be used as the gene form, and it may be single-stranded or double-stranded.
  • a method of directly administering an expression plasmid intramuscularly (DNA vaccine method), a ribosome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method
  • viruses used for the virus vector include a DNA virus or an RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a poliovirus, and a simbis virus.
  • a DNA virus or an RNA virus such as a retrovirus, an adenovirus, an adeno-associated virus, a herpes virus, a vaccinia virus, a box virus, a poliovirus, and a simbis virus.
  • viruses retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus, etc. are preferred, and adenovirus is particularly preferred.
  • an appropriate administration route can be selected according to the disease, symptom and the like to be treated.
  • the administration route includes, for example, vein, artery, subcutaneous, intradermal, intramuscular and the like.
  • the preparation When administered by the “in vivo method”, for example, the preparation may be in the form of a liquid or the like. However, in general, the form of an injection or the like containing the gene as an active ingredient is necessary. If necessary, a conventional carrier may be added.
  • ribosomes or membrane-fused ribosomes containing genes can be used in the form of ribosome preparations such as suspensions, freezers, and centrifugal concentrated freezers.
  • HVJ Sendai virus
  • Administering the protease inhibitor of the present invention or the agent for preventing or treating COPD or immunodeficiency syndrome, alveolar proteinosis, or circulatory disease in various forms as described above, or administering the protease inhibitor of the present invention or A gene that is a preventive or therapeutic agent for COPD, immunodeficiency syndrome, alveolar proteinosis, and cardiovascular disease can be prevented or treated by using gene therapy.
  • the emphysema animal model used for confirming the COPD inhibitory effect can be a method described in the literature (Shapiro, SD Animal models for COPD. Chest, 117: 223S-227S, 2000). Specifically, for example, it can be prepared by intratracheally administering a pig elastase suspended in clean PBS using a syringe.
  • a new COPD animal model developed by the present inventors can be used as a disease animal model used for confirming the COPD inhibitory effect.
  • This animal model can be used as an animal model for alveolar proteinosis or cardiovascular disease in addition to COPD, but in the following description, it may be referred to as a COPD animal model for convenience. The manufacturing method is described below.
  • the COPD animal model used herein is a recombinant gene characterized by containing any of the following genes (XI) to (Y2) under the control of a promoter that is expressed in a lung-specific manner. This is an animal model into which is introduced.
  • (X2) a gene encoding a protein having the same amino acid sequence as that of interleukin 18, in which one or several amino acids in the amino acid sequence of interleukin 18 have been deleted, substituted or added.
  • (Y2) a gene encoding a protein having the same amino acid sequence as that of caspase-1, which has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of caspase-1
  • the recombinant gene to be introduced into this animal model may be the following (XI) or (X2) gene (hereinafter sometimes collectively referred to as “IL-18 genes”), or the following (Y1) or (Y2) It can be obtained by placing a gene (hereinafter sometimes referred to as “caspase 1 genes”) under the control of a promoter that is expressed in a lung-specific manner.
  • a promoter that is specifically expressed in the lung include a promoter derived from a lung constituent cell, such as a lung surfatatatant promoter or a Clara cell promoter.
  • (X2) a gene encoding a protein having an activity equivalent to that of IL-18, wherein the amino acid sequence of IL-18 has one or several amino acids deleted, substituted, or substituted, and the amino acid sequence has the same activity.
  • (Y2) a gene encoding a protein having the same amino acid sequence as that of caspase-1, which has an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of caspase-1
  • the activity equivalent to IL-18 means signal transduction through an IL-18 receptor and the like, for example, an activity of inducing interferon ⁇ (IFN- ⁇ ) and the like.
  • the activity equivalent to that of caspase 1 means the activity of cleaving the IL-18 precursor (pro-IL-18, proIL-18) to form the active form (mature IL-18, maturel-18). I do.
  • lung surfatantant promoter human lung surfatantant promoter
  • SPC promoter surfactant protein-C gene promoter.
  • SPC promoter can be obtained, for example, according to the method described in Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung.Proc Natl Acad Sci US A. 2002 Aug 6; 99 (16): 10482-7. it can.
  • CC10 promoter examples include the CC10 promoter (sometimes referred to as CCSP).
  • the CC10 promoter is, for example, cis-acting elements that confer lung epithelial cell expression of the CC10 gene.J Biol Chem. 1992 Jul 25; 267 (21): 14703-12.
  • the disease animal model of the present invention can be efficiently created.
  • a recombinant gene includes a signal peptide (SP) gene for promoting the release of a transgene to the outside of a cell, a sequence having an action of optimizing protein expression such as Kozak sequence, and an expressed gene. It is preferable to include a poly A sequence useful for fishing or the like.
  • SP signal peptide
  • a signal peptide is an amino acid sequence that helps a protein to pass through a cell membrane made of lipids due to its hydrophobicity when the protein is secreted outside the cell. After passing through the membrane, it is called a signal peptidase. It is cleaved by enzymes.
  • Examples of the signal peptide include mouse immunoglobulin (hereinafter referred to as “Ig”) ⁇ chain ′ signal peptide and the like.
  • Mouse Ig K chain 'signal peptide is described, for example, in Carroll, WL, E. Mendel, S. Levy. 1985.Hybndoma lusion cell lines contain an aberrant Kappa transcript. Ol. Immunol. 25: 991. .
  • a Kozak sequence is a bacterial-derived DNA sequence rich in guanine-cytosine that was found around the ATG start codon of a gene, and has the effect of optimizing protein expression. This is the array used.
  • the poly A sequence refers to a nucleotide sequence in a gene, in which adenylic acid (A) is continuously present.
  • poly A sequence examples include a bovine poly A sequence and the like.
  • a bovine poly A sequence For example, Goldman, LA, EC and utrone, SV Kotenko, and D. Krause, JA Langer. 1996. Modifications of vectors pEF—BOS, pcDNAl and pcDNA3 result in improved convenience and expression.BioTechniques 21: 1013. O.
  • the recombinant gene is a gene using an IL-18 gene such as (XI) or (X2)
  • a signal peptide is required to promote the release of the transgene to the outside of the cell.
  • the IL-1 ⁇ converting enzyme (caspase-1) gene which converts proIL-18 to active IL-18, is introduced into an animal model together with IL-18 genes and expressed together. Other known techniques can also be used.
  • the disease animal model can be created, for example, by the following method.
  • the animals used in the present invention include rodents, dogs, cats, monkeys, pumas, pigs, and the like.
  • rodents include mice, rats, and the like.
  • a C57BL / 6N mouse also referred to as a # 6 mouse
  • a Balb / c mouse or the like is preferably used as a mouse preferred by a force mouse
  • a B6 mouse is particularly preferable.
  • the case where the introduced animal is a mouse may be mainly described as an example, but the present invention is not limited to a mouse.
  • a method for producing a recombinant gene including the above known methods for gene recombination can be used, and examples thereof are as follows.
  • the power mainly explained by the IL-18 gene can be similarly applied to the IL-18-related gene (X2) and the caspase-1 genes (Yl) and (Y2). .
  • the pro-IL-18 cDNA may be any of the above (X) or (Y) gene when it becomes active (mature IL-18).
  • the sequence is exemplified in FIG. Figure 15 (Array 1)
  • Array 1 The signal peptide gene derived from the V-J2-C region of the mouse Ig K chain from the sequence G at position 10 to the sequence C at position 69 immediately after the start codon "C.” From the AAC codon to the 3rd “AGT” immediately before the 541-543 “TAG” STOP codon is the mature mouse IL-18 cDNA.
  • the "GGA ACA" before the start codon is a sequence region containing a Kozak sequence, which was originally present in the genome of mouse pro-IL-18 cDNA, and which optimizes protein expression.
  • GTG after the STOP codon is a sequence originally present in the genome of mouse pro-IL-18 cDNA, but it is thought that it is not particularly necessary.
  • the PCR product is cloned using the pCR2.1 vector (manufactured by Invitrogen) and sequenced (see references (1) and (2) above).
  • the human surfatatatant promoter SPC (Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation or the lung.Proc Natl Acad Sci US A. 2002 Aug 6; 99 (16): 10482-7.)
  • SV40 small T intron (Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung.Proc Natl Acad Sci US A.
  • a known gene introduction method can be used as a method for introducing a recombinant gene into a mouse.
  • the recombinant gene obtained as described above in a mouse fertilized egg (the above-described linear gene) can be used.
  • DNA fragment) by microinjection injection time: pronuclear stage fertilized egg, Injection site: male pronucleus
  • injection time pronuclear stage fertilized egg
  • Injection site male pronucleus
  • the recombinant gene injection can be confirmed by extracting DNA from tissues such as the tail of a born mouse (founder) using a DNAesay kit [Qiagen, Germany] and performing PCR. Mating with a male wild-type mouse (one that is not syngeneic to the surrogate mother), and selecting the offspring (either male or female, including F2, F3, '...) that express IL-18 By doing so, it is possible to produce recombinant gene introduction. Methods for selection include PCR analysis using genomic DNA from tissues such as the tail, ELISA analysis of mature IL-18 in serum, and Western blot analysis of mature IL-18 in lung, heart, liver, etc. (See the above references (1) and (2)).
  • the amount of IL-18 gene under the control of a lung-specific promoter can be appropriately adjusted according to the type of mouse, the timing of onset, the degree of onset, and the like. Although not particularly limited, it is generally considered appropriate that the lung concentration of the mouse is 1 ng / lung or more (50 ng / kg body weight) and 10 ng / lung or less (500 ng / kg body weight).
  • IL-18 it is preferable to introduce IL-18 in an animal model to such an extent that IL-18 expression becomes 1 ng / mL or more and lOng / mL or less in, for example, ELISA analysis of mature IL-18 in mouse serum.
  • the larger the amount introduced the more the above-mentioned targeted lung diseases and cardiovascular diseases tend to develop.
  • various diseases can develop at the same time.For example, since the lesions are different between lung disease and heart disease, it is possible to distinguish which site is effective in screening. . In addition, even when the disease site is the same disease, the characteristic disease states are different from each other, so that it is possible to determine which disease can be a drug candidate by analyzing individual organs.
  • SPC-IL-18 introduction ability The time to onset is not particularly limited, but it begins to develop around 4 weeks of age as early as possible, almost starts around 5 weeks of age, and becomes stronger as the age increases Symptoms tend to appear. Early on, there is a difference in the type of disease that develops and its appearance, but around 5 to 8 weeks of age, most of the above lung and cardiovascular diseases tend to develop.
  • the disease animal model obtained as described above includes lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease and alveolar proteinosis, and circulatory failure such as heart failure such as pulmonary heart, liver failure, and pulmonary hypertension.
  • lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease and alveolar proteinosis
  • circulatory failure such as heart failure such as pulmonary heart, liver failure, and pulmonary hypertension.
  • heart failure such as pulmonary heart, liver failure, and pulmonary hypertension.
  • Recombinant MMP-1 (Peptide Research Institute, Kyoto), Recombinant MMP-9 (Peptide Research Institute, Kyoto), using 50 M P3163-V (Peptide Research Institute, Kyoto) as substrate: MOCAc-Pro-Leu-Gly + Leu -Azpr (DNP) -Ala-Arg-NH2 was reacted at 37 ° C for 2 hours, and the amount of fluorescence was measured twice.
  • TRX has an inhibitory effect on proteases such as cysteine protease and meta-mouth protease.
  • Ovalbumin (OVA, SIGMA, 40 ⁇ g) suspended in 100 ⁇ L was intraperitoneally administered, and swine elastase (SIGMA Cat.No.E1250, 0.3U) suspended in 100 L of clean PBS was added.
  • mice were collected on DAY21.
  • Mouse lungs were perfused and fixed with 20% neutralized formalin at 15 cmH20 pressure from the bronchi.
  • Lung paraffin sections were HE stained.
  • Microscope images were captured by a digital camera for microscopes DXM1200 (manufactured by NIKON), and the analysis software was used by ACT-1 (manufactured by NIKON) and Photoshop (manufactured by Adobe). Specifically, each group randomly selects a lung tissue (slide). For both lungs of a single mouse, ACT-1 is used to capture images of 5 visual fields in each section from HE-stained slides of a total of 6 sections in the left, right, upper and middle lung fields.
  • TRX which is a redox active protein, strongly and statistically significantly suppressed experimental pathological COPD using this system.
  • mice Seven- to eight-week-old SPC-IL-18TG mice (5 mice per group), prepared as described above, are mixed with 0.1 mL of sterile phosphate buffer (PBS) (control) or 0.2 mL every other day. Dissolved recombinant human TRX 400 g / mL (ie, 40 g per animal) was administered intraperitoneally. Twenty-one days later, mouse lungs were collected and lung tissues were stained with HE.
  • PBS sterile phosphate buffer
  • TRX is known to have an inhibitory effect on IL-18, and by suppressing the IL-18 signal, TRX can prevent or treat the above-mentioned mouse models including COPD.
  • the above-mentioned IL-18 inhibitors such as anti-IL-18 antibodies can also be used as therapeutic agents for cardiovascular diseases such as COPD, alveolar proteinosis, and circulatory insufficiency associated with heart failure, liver failure or pulmonary hypertension. Do you get it.
  • Reference example 1
  • Tissues obtained by surgery from 10 COPD patients and 6 lung tissues such as those who died in a traffic accident were fixed in formalin, and slices were prepared. Immunohistochemical staining was performed with an anti-human HL-18 antibody (cl one 8).
  • Kitasato, Y. Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, Koaa, Y., Nagata, N.,
  • IL-18 was strongly expressed in the lung lesions of COPD patients. In particular, it was confirmed to be strongly expressed in infiltrating inflammatory cells and alveolar epithelium (Figs. 9 and 10).
  • Paraffin sections were prepared by fixing formalin the tissues obtained from the surgery of 10 COPD patients and the lung tissues of six people, including those who died in traffic accidents. Immunohistological staining was performed with an anti-human TRX antibody (manufactured by Serotec). Immunohistochemical staining was performed according to the method described in the following article. Kitasato, Y., Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, S., Koda, Y., Nagata, N., Kinoshita, M., Koga, H., Yoon, DY, Asao, H., Ohmoto , H., Koga, T., Rikimaru, T., and Aizawa, H. Enhanced expression of interleukin— 18 and its receptor in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 31: 619—625, 2004.
  • TRX was strongly expressed in the lung lesions of COPD patients. In particular, it was found to be strongly expressed in infiltrative cells, alveolar epithelium, and fibroblasts of the bronchi (Figs. 13, 14).
  • Reference Examples 1 and 2 also support the possibility that the living body can express TRX to suppress IL-18 that is excessively expressed in COPD, and the above-mentioned IL-18 inhibitor Is also useful in the prevention or treatment of COPD.
  • the prophylactic or therapeutic agent for COPD can be used alone or as a protease used in cocktail therapy such as HAART therapy for potently suppressing COPD and treating immunodeficiency syndrome.
  • the preventive or therapeutic agent for a disease containing an IL-18 inhibitor or its gene of the present invention is effective against circulatory diseases such as circulatory insufficiency associated with COPD, alveolar proteinosis, heart failure, liver failure or pulmonary hypertension. Can be treated.

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Abstract

【課題】新たなプロテアーゼ阻害剤，慢性閉塞性肺疾患・免疫不全症候群・肺胞蛋白症・循環器疾患の根治的治療薬及び治療法を提供すること。 【解決手段】レドックス活性蛋白質，又はこれらをコードする遺伝子から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、プロテアーゼ阻害剤，及び慢性閉塞性肺疾患又は免疫不全症候群の予防又は治療剤，並びに、IL-18又はこれをコードする遺伝子から選択される少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患・肺胞蛋白症・循環器疾患の予防又は治療剤である。

Description

明 細 書
プロテアーゼ阻害剤及び疾患の予防又は治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、慢性閉塞性肺疾患の病因の一つと考えられるプロテアーゼの阻害剤，及 び慢性閉塞性肺疾患，免疫不全症候群，肺胞蛋白症，循環器疾患の予防又は治療 剤に関するものである。
背景技術
[0002] 慢性閉塞性肺疾患 Chronic Obstructive Pulmonary Disease: (以下、「COPD」と記載 する。）とは、肺気腫、慢性気管支炎、あるいは両者の併存により、進行性の閉塞性 換気障害を特徴とする疾患である。 COPDにおける気流制限は、末梢気道病変にお ける気道抵抗上昇と肺気腫による肺弾性収縮力低下に因り、 2者の関与の程度は症 例によって様々ではある力 COPD患者の多くは肺気腫優位の傾向を示す。肺気腫 の最大のリスクファクターが喫煙である事は多くの疫学的研究より明らかである。 200 1年に米国 National Heart, Lung and Blood Institution (NHLBI)と World Health Organization (WHO)との共同で報告された Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD)にも述べてあるように、 1990年の調査では世界での COPDの 罹患率は、全人口に対し、男性で 9. 34/1000,また女性では 7. 33Z1000となつ ており、罹患率が非常に高い疾患である。現時点での COPDによる呼吸不全が原因 の死亡は、アメリカの死因の 4位と推定されている。また、 日本における厚生労働省の 報告でも COPDによる死亡率は、最近の 30年間で約 4倍に増加した。 COPD治療薬 として従来知られているのは、気管支拡張剤とステロイドもしくはこの組み合わせであ る。し力しながらあまり効果がなぐ新規の治療薬が求められている。また、臭化チオト 口ピウム水和物も上巿されて 、るが、さらに有効な薬剤が求められて 、る。
[0003] このため、 COPDの根治的治療薬及び治療法は 、まのところ確立されて ヽな 、。
[0004] 非特許文献 1 : Pauwels, R. A" Buist, A. S.， Calverley, P. M., Jenkins, C. R" and Hurd, S. S. 'Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) Workshop summary." American journal of respiratory and critical care medicinej , vol.163: PP.1256— 1276, 2001.
非特許文献 2 : Barnes, P. J. "Novel approaches and targets for treatment of chronic obstructive pulmonary disease. 「American journal of respiratory and critical care medicinej , vol.160: S72 - 79, 1999.
[0005] また、肺胞蛋白症とは肺胞腔内にサーファタタント蛋白とリン脂質が集積する原因不 明の疾患である。近年、 90%を占める特発例で GM-CSF (Granulocyte- Macrophage Colony-Stimulating Factor：顆粒球'マクロファージコ口-一刺激因子）の活性を抑 制する自己抗体の存在が示されたが、現在のところ根治的治療法がなぐ気管支鏡 下で肺胞を生理食塩水によって洗浄するぐらいしか治療法はない。
[0006] そして、 COPDを含む慢性肺疾患による右心負荷が原因となって起こる肺性心等の 心不全や、それに続く肝不全，肺高血圧症等の循環不全等が、 COPDに関連する循 環器疾患として知られて 、る。
[0007] このため、 COPD,肺胞蛋白症、循環不全 (肝不全，心不全，肺高血圧症等)の根治 的治療薬及び治療法が求められている。
[0008] また、 1980年代，エイズ (免疫不全症候群）に感染した患者のほとんどは死を免れな かった。 HIV (ヒト免疫不全ウィルス）と呼ぶウィルスが CD4 (抗原蛋白の一種で、分子 量 59kDaの単鎖膜貫通型 d糖タンパク。 )陽性細胞に感染し体の免疫系が破壊され、 体力が弱って消耗し，死に至る。
[0009] しかし、近年米国をはじめ先進各国では， HIV感染者の運命は劇的に様相が違って きた。 1996年 7月にカナダのバンクーバーで開かれた国際エイズ会議では，関係者 に希望を抱力せる発表が相次いだ。例えば-ユーヨークにあるアーロン 'ダイヤモンド 'エイズ研究センターのホー（David Ho)は，プロテアーゼ阻害剤とすでに 1991年以 降に市場に出回るようになって!/、た AZT (ジドブジン，逆転写酵素阻害剤の一種)タイ プの抗ウィルス剤とを組み合わせたカクテル療法 (人体内で HIVが増えるのを邪魔す る薬を複数使用して、 AIDSの発症を押さえる方法）によって，非常に優れた結果が得 られたと報告した。また、カクテル療法の中でも、 HAART療法 (高活性抗レトロウィル ス療法)等が注目されている。 [0010] このカクテル療法は、根本治療にはならないものの，エイズ患者の免疫細胞を増や すだけでなく，血液中のウィルス数を検出限界以下にまで減らしたことが報告された
[0011] AZT、 d4T (スタブジン，逆転写酵素阻害剤の一種）、 ddl (ジダノシン，逆転写酵素阻 害剤の一種)のような以前力 の逆転写酵素阻害剤薬と一緒に服用すると、これらの プロテアーゼ阻害剤は最も有効に働くことが知られて ヽる (V、わゆる抗 HIV療法 (highly active antiretroviral therapy)HAART療法）。事実、 1996年から 1998年の間に，米国 では HIV感染に伴う死者が 70%以上も減り，エイズは死因の上位 10位カゝら外れた。ェ ィズの死亡率は統計がとられるようになった 1987年以降， 1998年に最低となり，更に 低下する見通しである。
[0012] 1995年 12月，米食品医薬品局（FDA)は最初のプロテアーゼ阻害剤「サキナビル」を 認可した。 1996年春までには，さらに 2つの阻害剤「リトナビル」と「インジナビル」が認 可された。し力しながら、 HIVプロテアーゼ阻害剤は，阻害作用は優れているものの 副作用が多 ヽと 、う欠点を有して 、る。
[0013] ところで、 HIV患者の血清中にチォレドキシンが著明に発現して!/、る (Proc Natl Acad
Sci U S A. 2001 Feb 27;98(5):2688-93)ことが分かっている力 今のところその意義 は明らかになっていない。
[0014] 一方、エラスターゼは、肺を構成する弾性線維 (elastic fiber)の主成分である不溶性 タンパク質エラスチンを加水分解するプロテアーゼとして知られて 、る。このエラスタ ーゼは、気管内へ投与することによって、 COPDの一種である肺気腫を誘導すること が古くから知られており、エラスターゼ投与動物が、肺気腫の動物モデルとして用い られている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 我々は、上記の通り、エラスターゼが肺気腫を引き起こすことに鑑み、エラスターゼ等 に代表されるプロテアーゼの阻害力 COPDの一種である肺気腫の治療に役立つの ではないかという仮説に基づき、プロテアーゼ阻害剤を探索し、また得られたプロテ ァーゼ阻害剤であるレドックス活性蛋白質が、実際に COPDを強力に抑制することや 、免疫不全症候群の治療の為に、単独であるいは HAART療法等のカクテル療法に 用いられるプロテアーゼ阻害剤として使用できる可能性を見出し、更に、レドックス活 性蛋白質力 ある種の IL-18阻害活性を有していることから、他の IL-18阻害剤の COPD治療薬へのの可能性に思い至り、本発明を完成するに至ったものであって、 その目的とするところは、エラスターゼを含むプロテアーゼの阻害剤，引いては COPD、免疫不全症候群、肺胞蛋白症、心不全や肝不全あるいは肺高血圧症を伴う 循環不全等の循環器疾患の根治的治療薬及び治療法を提供するにある。 課題を解決するための手段
[0016] 上述の目的は、 [1]下記（1)乃至 (4)から選択される、少なくとも一種以上を含むこと を特徴とする、プロテアーゼ阻害剤， [2]プロテアーゼがメタ口プロテアーゼ，セリンブ 口テアーゼ，システィンプロテア一ゼカも選択されるものである、当該プロテアーゼ阻 害剤， [3]下記（1)乃至 (4)から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴と する、慢性閉塞性肺疾患又は免疫不全症候群の予防又は治療剤， [4]下記 (5)乃 至 (8)から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、慢性閉塞性肺疾 患の予防又は治療剤， [5]下記（5)乃至 (8)から選択される、少なくとも一種以上を 含むことを特徴とする、肺胞蛋白症の予防又は患治療剤， [6]下記（5)乃至 (8)から 選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、循環器疾患の予防又は治 療剤によって達成される。
[0017] (1)レドックス活性蛋白質
(2)レドックス活性蛋白質のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなりかつレドックス活性蛋白質と同等の活性を 有するタンパク質
(3) (1)をコードする遺伝子
(4) (2)をコードする遺伝子
(5)インターロイキン 18阻害剤
(6)インターロイキン 18阻害剤のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつインターロイキン 18阻害活性を 有するタンパク質 (7) (1)をコードする遺伝子
(8) (2)をコードする遺伝子
発明の効果
[0018] 本発明のレドックス活性蛋白質又はその遺伝子を含むプロテアーゼ阻害剤，及び COPDの予防又は治療剤は、 COPDを強力に抑制することができる他、免疫不全症 候群の治療の為に、単独であるいは HAART療法等のカクテル療法に用いられるプロ テアーゼとして使用可能である。レドックス活性蛋白質又はその遺伝子は、もともと生 物細胞中に存在するものであるため、従来免疫不全症候群のカクテル療法に用いら れて 、るプロテアーゼ阻害剤のような副作用が無 、と 、う利点を有して 、る。また本 発明の IL-18阻害剤又はその遺伝子を含む疾患の予防又は治療剤は、 COPD,肺胞 蛋白症、心不全や肝不全あるいは肺高血圧症等を伴う循環不全等の循環器疾患を 、効果的に治療することができる。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]実施例 2の第 1群 (controlマウス）の肺組織の顕微鏡画像である（HE染色， X 4 0倍）
[図 2]実施例 2の第 2群 (病態マウスモデル 1)の肺組織の顕微鏡画像である（HE染 色， X 40(f)
[図 3]実施例 2の第 3群 (病態マウスモデル 2)の肺組織の顕微鏡画像である（HE染 色， X 40(f)
[図 4]実施例 2の第 4群 (病因 +治療剤投与マウス)の肺組織の顕微鏡画像である (H E染色， X 40倍）
[図 5]実施例 2の第 1一 4群のマウスの、平均の肺胞の長さ（mean linear intercept: Lm )を表す図である。
[図 6]実施例 3の SPC-IL-18TGマウスに、 PBSを投与した群（コントロール）の肺組織 の顕微鏡画像である (HE染色， X 40倍）
[図 7]実施例 3の SPC- IL- 18TGマウスに、 TRXを投与した群の肺組織の顕微鏡画像 である (HE染色， X 40倍)。
[図 8]参考例 1の、健常人肺の肺組織における、 IL-18の発現量を示す、免疫組織染 色の結果を示す図である（免疫染色， X 400倍)。
[図 9]参考例 1の、 COPD患者の肺組織における、 IL-18の発現量を示す、免疫組織 染色の結果を示す図である（免疫組織染色， X 40倍)。
[図 10]参考例 1の、 COPD患者の肺組織における、 IL-18の発現量を示す、免疫組織 染色の結果を示す図である（免疫組織染色， X 200倍)。
[図 11]参考例 2の、健常人の肺組織における、 TRXの発現量を示す、免疫組織染色 の結果を示す図である（免疫組織染色， X 40倍)。
[図 12]参考例 2の、健常人の肺組織における、 TRXの発現量を示す、免疫組織染色 の結果を示す図である（免疫組織染色， X 200倍)。
[図 13]参考例 2の、 COPD患者の肺組織における、 TRXの発現量を示す、免疫組織 染色の結果を示す図である（免疫組織染色， X 40倍)。
[図 14]参考例 2の、 COPD患者の肺組織における、 TRXの発現量を示す、免疫組織 染色の結果を示す図である（免疫組織染色， X 200倍)。
[図 15]シグナルペプチドを持つ成熟 IL-18cDNAのシークェンス（DNA配列）である。
[図 16]本発明で用いられる組換遺伝子 SPC- IL- 18SPである。
発明を実施するための最良の形態
[0020] 〈プロテアーゼ〉
プロテアーゼとは、蛋白質分解酵素のことである力 例えば、メタ口プロテアーゼ，シ スティンプロテアーゼ，セリンプロテアーゼ，ァスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテ ァーゼ)等が挙げられる。
[0021] メタ口プロテアーゼとは、亜鉛などの重金属を活性中心に持つタンパク質分解酵素で あり、マトリックス 'メタ口プロテアーゼ（以下、「MMP」と記載する。）ゃサーモリシン等 が挙げられる。
MMPとは、動物細胞の細胞間の接着性マトリックス 'タンパク質を加水分解し、細胞 分裂や形態形成、さらにはガン転移に関与して 、る亜鉛含有プロテアーゼである。 MMPとしては、 MMP-1, 2, · ' · 28等 30種類近くが同定されている。
[0022] システィンプロテアーゼとは、システィン残基を活性中心に持つプロテアーゼであり、 カスパー、ゼ，パパイン (papain)等が挙げられる。カスパーゼとしては、カスパーゼー 1 , 2, 3 · ·等 20種類近くが挙げられる力 中でもカスパーゼー 1、— 3や 9が、本発明の プロテアーゼ阻害剤のターゲットとして重要である。
[0023] カスパーゼは、ァスパラギン酸の C末端側を切断するが、不活性型前駆体として存在 し、アポトーシスのシグナルにより切断されて活性型になるものである。具体的には、 カスパーゼー 1等が挙げられ、これはインターロイキン 1 /3変換酵素とも呼ばれ、 IL-18 前駆体を切断し、活性型の IL-18とすることも知られて 、る。
[0024] セリンプロテアーゼとしては、エラスターゼの他、キモトリブシン (chymotrypsin)ゃスブ チリシン (subtilisin)等が挙げられる。
[0025] エラスターゼとは、肺を構成する弾性線維 (elastic fiber)の主成分である不溶性タン パク質エラスチンを加水分解するプロテアーゼとして知られている。
[0026] ァスパラギン酸プロテアーゼとしては、ペプシン (pepsin)やカテブシン D(cathepsin D) 等が挙げられる。
[0027] 〈本発明のプロテアーゼ阻害剤，及び COPD,免疫不全症候群，肺胞蛋白症、循環 不全 (肝不全、肺性心等の心不全や肺高血圧症)等の循環器疾患の予防又は治療 剤〉
[0028] (レドックス活性蛋白質）
本発明のプロテアーゼ阻害剤，及び COPD又は免疫不全症候群の予防又は治療剤 の有効成分として用いられるものとしては、下記（1)乃至 (4)単独の他、これらの組み 合わせ等が挙げられる。
(1)レドックス活性蛋白質
(2)レドックス活性蛋白質のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなりかつレドックス活性蛋白質と同等の活性を 有するタンパク質
(3) (1)をコードする遺伝子
(4) (2)をコードする遺伝子
[0029] レドックス活性蛋白質と同等の活性とは、下記に示す、レドックス制御活性を言う。
[0030] レドックス活性蛋白質とは、レドックス（酸化と還元， reduction-oxidation)の両方の活 性を有することによって、レドックス制御（酸化還元状態を調節すること）のできる蛋白 質であり、レドックス活性ペプチド等をも含むものである。例えば、チォレドキシンファ ミリ一に属するポリペプチド類や、 HO— 1 (ヘムォキシゲナーゼー 1)等が挙げられる。
[0031] チォレドキシンファミリーに属するポリペプチド類とは、チォレドキシン (以下「TRX」と 記載する。）ファミリーに属するポリペプチド類 (以下、「TRX-P」と記載する。）とは、 ジチオール結合やジスルフイド結合の酸ィヒ還元活性を有するポリペプチド類であつ て、もともと、生物細胞中に存在するポリペプチド類である（特開 2002-179588等 参照)。
[0032] 本発明で言う「TRX-P」には、天然のヒトを含む動物，植物，大腸菌，酵母からの抽 出ポリペプチド類以外に、遺伝子組み換えにより酵母や大腸菌等力 抽出されるポリ ペプチド類，化学合成で作成されるポリペプチド類等も含まれる。但し、ヒト由来のも の，及びそれを大腸菌，酵母において遺伝子組み換えで作成したもの，及びそれら と同一又は類似の配列からなる合成ペプチドが、生体に与える影響がより少ないと考 えられるため好ましい。
[0033] TRX Pは、システィン残基を含む活性部位 (一 Cys XI— X2— Cys—: XI , X2は、アミ ノ酸残基を表し、同一であっても異なるものでも良い。）を有し、類似の 3次元構造を 持つ分子群である。従って、本発明で言う「TRX— P」には、上記の他、ジチオール結 合やジスルフイド結合の酸ィ匕還元活性を損なわな 、範囲で、一部のアミノ酸が欠失 又は置換されたものや、他のアミノ酸，ペプチドが融合されたものであっても良い。
[0034] 活性部位の具体例としては、 Cys— Gly— Pro— Cys —， 一 Cys— Pro— Tyr— Cys —，—Cys —Pro— His— Cys —， 一Cys— Pro— Pro— Cys—等が挙げられるが、中でも、一Cys— Gly— Pro— Cys—力 種を超えて保存されている配列であるため、マウスモデルによる実験 結果の人間への応用がより確実であるという理由で好ましい。
[0035] 「TRX P」には、具体的には、例えば、活性部位カ Cys— Gly— Pro— Cys—であるチ ォレドキシン (TRX) ,ダルタレドキシン等が挙げられる。
[0036] TRXには、ヒト，大腸菌，酵母由来のものがあり、ダルタレドキシンには、ヒト，大腸菌 由来のものがある。
[0037] ヒト細胞から「TRX— P」を抽出する具体的な方法としては、以下の方法が例示される (A)ヒト由来の細胞株から抽出する方法 (特開平 1 - 85097号公報等参照)。
(B)遺伝子組み換え法を用いる方法 (特開平 1 - 85097号公報等参照)。
(C)ペプチド合成法を用いる (特開平 5-139992号公報等参照)。
[0038] (IL- 18阻害剤）
本発明の COPD,肺胞蛋白症，循環器疾患の予防又は治療剤の有効成分として用 いられるものとしては、下記（5)乃至（8)単独の他、これらの組み合わせ等が挙げら れる。
(5)インターロイキン 18阻害剤
(6)インターロイキン 18阻害剤のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつインターロイキン 18阻害活性を 有するタンパク質
(7) (1)をコードする遺伝子
(8) (2)をコードする遺伝子
[0039] 本発明の IL-18阻害剤としては、 IL-1 β変換酵素阻害剤を含むシスティンプロテア ーゼ阻害剤等の、 IL-18前駆体力 活性型 IL- 18への変換を阻害する物質， IL-18結 合蛋白質（IL- 18 binding protein (IL- 18BP)グループ等)ゃ抗 IL- 18抗体等の、 IL- 18 の活性を中和する物質，リコンビナント型（The Combination of Soluble IL-18R a and IL- 18R j8 Chains Inhioits IL- 18- Induced IFN- γ (Journal of Interferon and cyto ine research 22:P.593-601, 2002, Mary and Liebert,Inc.) )又は天然型の可溶化 IL-18 レセプター (WO2005/12352)等の IL- 18受容体への IL- 18の結合を阻害する物質， IL-18受容体結合後のシグナル伝達の阻害剤等，又はこれらをコードする遺伝子等 が挙げられる。
[0040] IL-1 β変換酵素阻害剤 (ICE)としては、種々の化合物が知られて 、る。 IL-1 β前駆 体中の、 ICEと親和性を有する部位に類似するペプチド類等が挙げられ、例えば、 IL-1 β前駆体切断部位の Aspl 16力 Ν末端側へかけての 4アミノ酸力 なるペプチド (TytVal— Ala— Asp)配列を有するペプチド類力 ICEの IL_1 β前駆体への結合を阻 害するとして知られて!/ヽる（特開許平 11-147895号公報， [0002]の [従来の技術] 参照)。また、具体例として、例えば、特開平 5— 255218号公報に記載のペプチド誘 導体、特開平 11— 147873号公報に記載のスルホンアミド誘導体、特表平 10-504 285号公報に記載のペプチド誘導体、特開平 11— 147895号公報に記載のグリシン 誘導体および国際出願 W097Z24339号公報に記載のテトラゾール誘導体等が挙 げられる。
[0041] IL-18結合蛋白質 (IL-18BP)とは、 [Immunity, 10, 127-136(1999) ]に記載された蛋白 質及びそのサブクラス，すなわち当該文献の P.136末尾に記載された GenBank accession number AF110798で表される遺伝子がコードする IL- 18結合蛋白質または そのサブクラスを意味する。サブクラスとしては、例えば当該文献記載の GenBank accession number AF110799, AF110800, AF110801, AF110802, AF110803, AF110460等で表される遺伝子がコードする蛋白質が挙げられる。これらは、文献 [Immunity, 10, 127-136(1999)]に記載の方法に準じて調製することができる。
[0042] IL-18に特異的なモノクローナル抗体は、文献 [J.Immunol.Methods,217,97-102(1998) ]に記載の方法に準じて調製することができる。
[0043] IL-18受容体への IL-18の結合を阻害する物質の具体例としては、例えば、 IL-18受 容体蛋白質および IL-18の受容体に特異的なモノクローナル抗体等を挙げることがで きる。 IL- 18の受容体に特異的なモノクローナル抗体としては、 Kitasato, Y., Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, S., Koda, Y., Nagata, N., Kinoshita, M., Koga, H., Yoon, D. Y., Asao, H., Ohmoto, H., Koga, T., Rikimaru, T., and Aizawa, H. Enhanced expression of interleukin— 18 and its receptor in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 31: 619-625, 2004.に報告してあるように H44モノクローナル抗 体（Human IL-18R ( a chain)に対する抗体）等が挙げられる。
[0044] 上記 IL-18の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、哺乳動物由来の抗体、キメラ 抗体又は擬人化抗体の 、ずれであっても良 、。
[0045] 本発明に用いられる IL-18受容体蛋白質および IL-18の受容体に特異的なモノクロ ナル抗体は、例えば、特開平 11-100400号公報に記載の方法に準じて調製すること ができる。
[0046] IL-18受容体結合後のシグナル伝達の阻害剤としては、 Myd88, IRAK (
IL—lreceptor— associated kinase) , i，RAF6、 ΓΝΡ receptor— associated Factor) , ΑΚ- 1 (TGF- β activated kinase) , MAPKK3,4,6 (MAP kinase kinase) , JNK (c— Jun
N- terminal kinase) , p38, NIK (NF— κ B- inducing kinase) , IKK (I κ B- kinase) ,等の
IL-18のシグナル伝達分子を、阻害する物質が挙げられ、例えば p38MAPキナーゼ阻 害剤である SB203580, SB220025, RWJ 67657 (American Journal of Respiratory and
Critical Care Medicine vol.160 pp S72-S79, 1999) , NF— κ B
阻舍: ^(Jで teる、 I— K Binhibitor, I— κ B a gene transfer (American Journal of
Respiratory and Critical Care Medicine vol.160 pp S72- S79, 1999)や PS- 341 (
Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.95 PP.15671— 15676, December 1998 Medical Sciences) 等が挙げられる。
[0047] 尚、本発明で用いられる IL-18阻害剤としては、上記の IL- 18阻害剤そのものの他、 IL-18阻害剤がポリペプチドの場合には、それをコードする遺伝子の他， IL-18阻害 剤のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加された アミノ酸配列からなりかつ IL-18阻害活性を有するタンパク質，あるいは、これらをコー ドする遺伝子も含まれる。
[0048] 本発明の COPDの予防又は治療剤の有効成分としては、上記のレドックス活性蛋白 質に関連する物質（（1)乃至 (4) )と IL-18阻害剤に関連する物質（ (5)— (8) )を、組 み合わせて用いることもできる。
[0049] 本発明のプロテアーゼ阻害剤や疾患の予防又は治療剤中の、有効成分の含有量は 、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与 量との関係で適宜選択すれば良いが、例えば液剤の場合、 0. 0001- 10 (w/v% ) ,好まし <は 0. 001-5 (w/v%) ,特に注射剤の場合、0. 0002-0. 2 (w/v%) ,好ましくは 0. 001—0. 1 (w/v%) ,固形剤の場合、 0. 01-50 (w/w%) ,好ま しくは 0. 02— 20 (wZw%)等として調製できる力 必ずしもこの範囲に限定されるも のでは無い。
[0050] 本発明のプロテアーゼ阻害剤や疾患の予防又は治療剤の投与量は、投与経路，症 状，年齢，体重，予防又は治療剤の形態等によって異なるが、例えば、プロテアーゼ 阻害剤や疾患の予防又は治療剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象 体重 lkg当たり 0. 005— 500mg,好ましくは、 0. 1一 lOOmg,但し、成人に対して 1 日あたり、下限として 0. Olmg (好ましくは 0. lmg) ,上限として、 20g (好ましくは 20 OOmg,より好ましくは 500mg,更に好ましくは lOOmg)となるように、 1回又は数回に 分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
[0051] 本発明のプロテアーゼ阻害剤や疾患の予防又は治療剤は、従来知られている本発 明の目的とする疾患の予防又は治療成分との合剤としても良い。その予防又は治療 成分としては、以下の 1. 5.等が挙げられる。
[0052] 1.メディエーターアンタゴ-スト：
例えば、 LTB4 antagonists (例えば LY29311, SC- 53228, CP- 105,696, SB201146, BIIL284)、 o -Lipxygenase inhibitors (f列？ Jま zileutin, Bayxl005)、し hemokine inhibitorsゝ IL— 8 antagonists (例えば SB225002; CXCR2 antagonists), TNF inhibitors (例えば monoclonal Ab, soluble receptors, MMP inhibitors) ^ Antioxydants (例えば NAC, NAL,グルタチオン，スーパーォキシドジスムターゼ等)、 Prostanoid inhibitors ( ί列 ばし OX— 2 inhioitors, tnromboxane antagonists ^ isoprostane receptor
antagonists) ^ iNOb inhibitor等
[0053] 2.抗炎症剤：
例えば、 Phosphodiesterase 4 inhibitors (例えば SB207499, CP80633, CDP- 840)、 Adhesion inhibitors (例えば anti— CD11/CD18, anti— ICAM1, E— selectin inhibitors), Prostaglandin E analogs (例えば misoprostil, butaprost)、サイト力イン (例えば IL- 10) 、 Colchicine ^ Macrolide antibiotics (f列えば erythromycin, clarithromycin,
roxithromycin)等
[0054] 3.プロテアーゼインヒビター：
例えば、 Neutrophil elastase inhibitors (例えば ICI200355, ONO- 5046, MR- 889, L658,758)、し atnepsin inhioitors (f列 j¾ suramin)、 Matrix metalioprotease innibitors (f列えば batimastat, marimastat、 KBR7785)、 alpha 1— antitrypsin (f列えは purified, human recomoinant, gene transfer)ゝ Secretory leukoprotease inhibitor ^ Elafin等
[0055] 4. Immunoregulators：
例えば免疫抑制剤 FK506等
[0056] 5.呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症治療剤： テオフィリン等のキサンチン誘導体， β 2受容体刺激剤，抗コリン剤，抗アレルギー用 剤，副腎皮質ホルモン剤及び吸入ステロイド等のステロイド剤等。
[0057] また、本発明のプロテアーゼ阻害剤や疾患の予防又は治療剤には、その阻害効果 や予防又は治療効果を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例え ば薬学的に許容される担体として、賦形剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，矯味 矯臭剤，希釈剤，界面活性剤，乳化剤，可溶化剤，吸収促進剤，保湿剤，吸着剤， 充填剤，増量剤，付湿剤，防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化すること ができる。
[0058] ここに、賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。
[0059] 本発明のプロテアーゼ阻害剤や疾患の予防又は治療剤は、主に経口投与するため のものであるが、具体的には、例えば錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，丸剤，トロー チ，もしくはシロップ剤等の形態で、経口投与される。
[0060] 投与形態としては、経口投与のほか、静注等の静脈投与，筋肉内投与、経皮投与， 皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与、吸入等が挙げられるが 、静注等の静脈投与が安全かっ血中濃度を一定に保つという点で好ましい。
[0061] 尚、上述のレドックス活性蛋白質をコードする遺伝子を、遺伝子療法における、プロ テアーゼ阻害剤や COPD又は免疫不全症候群の予防'治療剤として用いることもでき る。また、 IL- 18阻害剤がポリペプチドの場合には、 IL-18阻害剤をコードする遺伝子 を、遺伝子療法における、 COPD、肺胞蛋白症、循環器疾患の予防，治療剤として用 いることちでさる。
[0062] その際の遺伝子形態としては、 DNAの他、 RNA,プラスミド，ウィルスベクター等が使 用可能であり、一本鎖であっても二本鎖であっても良い。
[0063] プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法 (DNAワクチン 法）、リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法
、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リボソーム法が好ま しい。
[0064] ウィルスベクターを用いる場合、（日経サイエンス， 1994年 4月号， 20— 45頁、月刊 薬事， 36 (1) , 23— 48 (1994)、実験医学増刊, 12 (15) , (1994)、およびこれらの 引用文献等)等に記載されているように、ウィルスに、目的とする遺伝子を組み込むこ とにによって行うことができる。
[0065] ウィルスベクターに用いるウィルスとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ァ デノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオゥ ィルス、シンビスウィルス等の DNAウィルス又は RNAウィルスが挙げられる。
ウィルスの中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアゥ ィルス等が好ましぐ特にアデノウイルスが好まし 、。
[0066] 遺伝子を実際に医薬として作用させるには、当該遺伝子を直接体内に導入する「in vivo法」の他、ヒトかから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導 入細胞を体内に戻すという、「ex vivo法」等がある [日経サイエンス， 1994年 4月号 , 20— 45頁、月刊薬事， 36 (1) , 23— 48 (1994)、実験医学増刊， 12 (15) , (1994 )、およびこれらの引用文献等]が、 in vivo法がより好ましい。
[0067] 「in vivo法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与 経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、 筋肉内等が挙げられる。
[0068] 「in vivo法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一 般的には有効成分である遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましぐ必要に応じ て、慣用の担体を加えてもよい。
[0069] また、遺伝子を含有するリボソームまたは膜融合リボソーム (センダイウィルス (HVJ) リボソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム 製剤の形態として用いることができる。
[0070] 〈本発明の阻害剤や予防又は治療剤を用いた、プロテアーゼ阻害方法，及び COPD 、免疫不全症候群，肺胞蛋白症、循環器疾患の予防又は治療方法〉
本発明のプロテアーゼ阻害剤や COPD又は免疫不全症候群，肺胞蛋白症、循環器 疾患の予防又は治療剤を、上記のような様々な形態で投与すること、あるいは、本発 明のプロテアーゼ阻害剤や COPD、免疫不全症候群、肺胞蛋白症、循環器疾患の 予防又は治療剤である遺伝子を、遺伝子治療によって用いることによって、予防又は 、治療することができる。 [0071] 〈本発明の効果確認に用いる疾患動物モデルの作製方法〉
[伝統的 COPD動物モデル]
本発明において、 COPD抑制効果の確認のために用いる肺気腫動物モデルは、文 献記載の方法を用いることができるが（Shapiro, S. D. Animal models for COPD. Chest, 117: 223S-227S, 2000)、具体的には、例えば清潔 PBSに懸濁した豚ェラスタ ーゼを、シリンジで気管内投与すること等によって作製することができる。
[0072] 規疾患動物モデル]
本発明にお 、て、 COPD抑制効果の確認のために用いる疾患動物モデルとしては、 本発明者 (星野，特願 2004— 069835)によって開発された、新たな COPD動物モデル も用いることができる。この動物モデルは、 COPDの他、肺胞蛋白症や循環器疾患の 動物モデルとしても使用可能であるが、下記の説明におていは、便宜上、 COPD動 物モデルと記載することがある。その作製方法を以下に記載する。
[0073] ここで用いられる COPD動物モデルとは、肺特異的に発現するプロモーターの制御 下にある下記 (XI)乃至 (Y2)の ヽずれかの遺伝子を含むことを特徴とする組換遺伝 子を導入した動物モデルである。
(XI)インターロイキン- 18遺伝子
(X2)インターロイキン 18のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失， 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなりかつインターロイキン 18と同等の活性を 有するタンパク質をコードする遺伝子
(Y1)カスパーゼ -1遺伝子
(Y2)カスパーゼ -1のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若 しくは付加されたアミノ酸配列力もなりかつカスパーゼ -1と同等の活性を有するタン パク質をコードする遺伝子
[0074] この動物モデルを用いることによって、生後約 5から 8週間という短期間で、 COPDや 肺気腫等の慢性閉塞性肺疾患，肺胞蛋白症等の肺疾患，循環不全 (肝不全，肺性 心等の心不全，肺高血圧症)等の循環器疾患等の循環器疾患を発症することが確 認されている。これによつて、従来、起炎物となるタバコの繰り返し投与のために 6ケ 月に亘る長期間を要していた動物モデル作製期間が短縮され、しかもブタエラスター ゼゃパパイン等も含めて起炎物の投与を一切行わないで簡便に行うことができる。
[0075] 〈組換遺伝子〉
この動物モデルに導入する組換遺伝子は、下記 (XI)又は (X2)遺伝子（以下、併せ て「IL-18遺伝子類」と記載することがある。），あるいは下記 (Y1)又は (Y2)遺伝子（ 以下、併せて「カスパーゼ 1遺伝子類」と記載することがある。）を、肺特異的に発現 するプロモーターの制御下に置くことによって、得ることができる。肺特異的に発現す るプロモーターとしては、肺構成細胞由来プロモーター等が挙げられ、例えば肺サー ファタタントプロモーター又はクララ細胞プロモーター等が挙げられる。
[0076] (X1) IL-18遺伝子
(X2) IL- 18のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付 カロされたアミノ酸配列力もなりかつ IL-18と同等の活性を有するタンパク質をコードす る遺 子
(Y1)カスパーゼ -1遺伝子
(Y2)カスパーゼ -1のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若 しくは付加されたアミノ酸配列力もなりかつカスパーゼ -1と同等の活性を有するタン パク質をコードする遺伝子
[0077] IL-18と同等の活性とは、 IL-18レセプターを通じたシグナル伝達等を意味し、例えば インターフェロン Ύ (IFN— γ )を誘導する活性等を意味する。また、カスパーゼー 1と同 等の活性とは、 IL-18前駆体 (プロ IL-18, proIL-18)を切断して、活性型 (成熟型 IL-18, maturelL- 18)とする活性を意味する。
[0078] 肺サーファタタントプロモーターとしては、ヒト肺サーファタタントプロモーター（
surfactant protein- C遺伝子プロモーター。以下、「SPCプロモーター」と記載する。 ) 等が挙げられる。 SPCプロモーターは、例えば Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16): 10482-7.に記載された手法に準じて得ることができる。
[0079] クララ細胞プロモーターとしては、 CC10プロモーター（CCSPと言うことがある。 )等が 挙げられる。 CC10プロモーターは、例えば cis- acting elements that confer lung epithelial cell expression of the CC10 gene. J Biol Chem. 1992 Jul 25;267(21): 14703-12.に記載された手法に準じて得ることができる。
[0080] これらのプロモーターを用いることで、本発明の疾患動物モデルを効率良く作成する ことができる。
[0081] 組換遺伝子は、このほか、導入遺伝子の細胞外への放出を促進するためのシグナ ルペプチド (SP)遺伝子や、コザック配列等のタンパク発現を最適化する作用を持つ 配列，発現遺伝子の釣り出し等に有用なポリ A配列等を含んで 、ることが好ま 、。
[0082] シグナルペプチドとは、タンパク質が細胞外に分泌される際、その疎水性により脂質 で出来た細胞膜を通過するのに役立つアミノ酸配列であり、膜を通過した後、シグナ ルぺプチダーゼと言う酵素で切断されるものである。
シグナルペプチドとしては、例えばマウスの免疫グロブリン (以下「Ig」と記載する。 ) κ チェーン 'シグナルペプチド等が挙げられる。
マウスの Ig K チェーン 'シグナルペプチドは、例えば、 Carroll, W. L. , E. Mendel, S. Levy. 1985. Hybndoma lusion cell lines contain an aberrant Kappa transcript. ol. Immunol. 25:991.等に記載されている。
[0083] コザック配列とは、遺伝子の ATG開始コドンの周辺で見つ力つた、細菌由来の、グァ ニン-シトシンを多く含む DNA配列で、タンパク発現を最適化する作用をもち、クロー ユングの際に用いられて 、る配列である。
例えば、 Nucleic Acids Res. 1984 Jan 25;12(2):857-72. Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs. 【こ， [i載 されている。
[0084] ポリ A配列とは、遺伝子中のヌクレオチド配列で、アデニル酸 (A)が連続して 、る部 分を言う。
ポリ A配列としては、牛由来のポリ A配列等が挙げられる。例えば、 Goldman, L. A., E. C. し utrone, S. V. Kotenko, し. D. Krause, J. A. Langer. 1996. Modifications of vectors pEF— BOS, pcDNAl and pcDNA3 result in improved convenience and expression. BioTechniques 21 : 1013.等に己載されてい o。
[0085] また、組換遺伝子が (XI)又は (X2)等の IL-18遺伝子類を用いたものである場合に は、導入遺伝子の細胞外への放出を促進するためには、シグナルペプチド遺伝子の 導入のほか、 proIL- 18を活性型 IL- 18に変換する IL- 1 β変換酵素 (カスパーゼ- 1)遺 伝子を、 IL-18遺伝子類とともに動物モデルに導入し、共に発現させる方法等、他の 公知の技術を用いることもできる。
[0086] 〈疾患動物モデル〉
疾患動物モデルは、例えば次のような方法で、作成することができる。
[0087] 本発明に使用される動物としては、げっ歯類動物、ィヌ、ネコ、サル、ゥマ、ブタ等が 挙げられ、このうち、げっ歯類動物としてはマウス、ラット等が挙げられる力 マウスが 好ましぐマウスは、例えば、 C57BL/6Nマウス（Β6マウスとも言う）、 Balb/cマウス等が 好ましく用いられ、中でも、 B6マウスが好ましい。
[0088] 以下本発明の説明においては、おもに、導入動物がマウスの場合を例に挙げて説明 することがあるが、本発明は、マウスに関するものに限定されるものではない。
[0089] 上記を含む組換遺伝子の作出方法としては、遺伝子組み換えの公知の方法を用い ることができるが、例示すると、以下の通りである。尚、以下では主に IL-18遺伝子に よって説明する力 上記 (X2)の IL-18関連遺伝子や、上記 (Yl) , (Y2)のカスパー ゼ 1遺伝子類の場合も同様に行うことができる。
[0090] マウス Ig κ チェーンの、 V-J2-C領域から取り出したシグナルペプチド（文献
(l)Hoshino T, Kawase Y, Okamoto M, Yokota K, Yoshino K, Yamamura K, iyaza i J, Young HA, Oizumi K. Cutting edge: IL— 18— transgenic mice: in vivo evidence of a broad role for IL-18 in modulating immune function. J Immunol
2001 ; 166:7014- 7018Z文献 (2)Kawase Y, Hoshino T, Yokota K, Kuzuhara A, Kirii Y, Nishiwaki E, Maeda Y, Takeda J, Okamoto M, Kato S, Imaizumi T, Aizawa H, Yoshino K. Exacerbated and Prolonged Allergic and Non-Allergic Inflammatory Cutaneous Reaction in Mice with Targeted Interleukin— 18 Expression in the Skin. J Invest Dermatol 2003;121 :502- 509)と、マウスの pro- IL- 18cDNA (上記文献 (1)参照 )を用い、シグナルペプチドを持つ成熟 IL-18cDNAを、 PCR法によって取得する (上 記文献 (1), (2)参照)。 pro-IL-18cDNAは、活性型 (mature IL-18)になった際に、上 記 (X)又は (Y)遺伝子となるものであれば良 、。
[0091] シークェンス（DNA配列）を図 15及び配列 1に例示する。図 15 (配列 1)の配列中、 7 一 9番目にある開始コドン「 丁。」の直後の、 10番目の配列 Gから、 69番目の配列 Cま で力 マウス Ig K鎖の V-J2-C領域由来シグナルペプチド遺伝子，その直後の「AAC」 コドンから 541— 543番目の「TAG」STOPコドンの直前の「AGT」3ドンまでが、マウス の成熟 IL-18cDNAである。
[0092] 尚、開始コドンの前の、「GGA ACA」は、元々マウスの pro-IL-18cDNAのゲノムに あった、コザック配列を含む、タンパク発現を最適化する配列領域である。
[0093] また、 STOPコドンの後の「GTG」は、元々マウスの pro-IL-18cDNAのゲノムにあった 配列であるが、特に必要ではな 、と考えられる。
[0094] 次に、 pCR2.1ベクター（Invitrogen製）を用いて PCR産物をクローユングし、シークェン スする（上記文献 (1), (2)参照）。続いてヒトサーファタタントのプロモーター SPC(Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation or the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16): 10482-7.)、 SV40 small T intron(Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16):10482- 7.)と牛由来ポリ A(Goldman, L. A" E. C. Cutrone, S. V. Kotenko, C. D. Krause, J. A. Langer. 1996. Modifications of vectors pEF— BOS, pcDNAl and pcDNA3 result in improved convenience and expression. BioTechniques 21 : 1013.)を含む 3.7SPC/SV40ベクター（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, August 6, 2002 vol. 99 no. 16 10482- 10487)で、 EcoRl [New England Biolabs (MA, USA)]で切り出し て EcoRIサイトに組み込む方法によってサブクローユングし、 SPC-IL-18SPとする（図 16)。
[0095] SPC-IL-18SPを Ndel [New England Biolabs (MA, USA)]と Notl [New England Biolabs
(MA, USA)]の制限酵素部位で 37°C、 2時間以上で（New England Biolabs (MA, USA)のプロトコールに準ずる)切断することによって、直鎖状 DNAフラグメントを得る ことができる。
[0096] 組換遺伝子をマウスに導入する方法としては、公知の遺伝子導入方法を用いること ができる力 例えば、マウスの受精卵に上述のようにして得られた組換遺伝子（上述 の直鎖状 DNAフラグメント）をマイクロインジェクション法 (注入時期：前核期受精卵， 注入箇所：雄生前核)にて注入し、代理母マウスの卵管に挿入して作製した
SPC-IL-18TGマウス (founder)を得る。組換遺伝子注入の確認は、生まれたマウス（フ ァゥゥンダ一）の尾部等の組織から DNAesay kit [Qiagen, Germany]等を用いて、 DNAを抽出し、 PCRで確認できる。雄性の野生型のマウス（代理母と同系で無いもの )と掛け合わせ、その子孫 (雌雄どちらでも可。 F2, F3, '…を含む）のうち、 IL-18を 発現しているものを選別することで、組換遺伝子導入の作製を行うことができる。選別 する方法としては、尾部等の組織のゲノム DNAを用いた PCR分析，血清中の成熟 IL-18の ELISA分析，肺や心臓，肝臓等における、成熟 IL-18のウェスタンブロッティ ング分析等が挙げられる (上記文献 (1), (2)参照)。
[0097] 肺特異的に発現するプロモーターの制御下にある IL-18遺伝子）の導入量は、マウス の種類や発症させたいタイミング，発症させたい程度等にて合わせて、適宜調節する ことができ、特に限定されるものではないが、一般的には、マウスの肺で 1 ng/lung以 上 (50 ng/kg体重）， 10 ng/lung以下 (500ng/kg体重）が適当と考えられる。
[0098] 動物モデルにおける IL-18発現が、例えばマウス血清中の成熟 IL- 18の ELISA分析 で 1 ng/mL以上、 lOng/mL以下となる程度に導入することが好ましい。導入量が多い ほど、上記の標的とする肺疾患や循環器疾患の殆どが発症する傾向にある。本モデ ル動物にお!、ては、同時に様々な疾患が発症し得るが、例えば肺疾患と心疾患では 、病巣が異なるので、スクリーニングに当たって、いずれの部位に効く薬かは、区別 可能である。また、疾患部位が同じ病気の場合でも、それぞれ特徴となる病態が異な るため、いずれの疾患の薬剤候補となり得るかは個々の臓器を解析することで判断 可能である。
[0099] SPC-IL-18導入力 発症までの時期は、特に限定されるものではないが、早ければ 4 週齢前後から発症し始め、 5週齢前後で殆どが発症し、高齢になるほど強い症状が 現れる傾向にある。早い段階では、発症する疾患の種類やその出方に差があるが、 5から 8週齢前後で、上記の肺疾患や循環器疾患の殆どが発症する傾向にある。
[0100] 上記のようにして得られた疾患動物モデルは、慢性閉塞性肺疾患，肺胞蛋白症等の 肺疾患や、肺性心等の心不全，肝不全、肺高血症等の循環不全を含む、循環器疾 患動物モデルとして有用であり、この動物モデルを用いることによって、これら疾患の 予防又は治療剤のスクリーニングが可能となる。
実施例 1
[0101] [試験管レベルでの TRXによる、プロテアーゼ抑制確試験]
TRXによる、カスパーゼー 1, MMP— Ι,ΜΜΡ— 9の抑制効果を調べた。
アツセィ方法：
[0102] 〈カスパーゼー 1〉
Thornberry NA (Nature 356(30):768-775, 1992)に準じて行った。つまりリコンビナント ヒトカスパーゼー 1を用い基質は Ac- WAD- AMC、 37°C3時間反応させ AMC ( 7- amino- 4- methylcoumarin)の 光量で 2[HJ疋量した (MDS Pharma services Japan, 京都に測定委託）。
[0103] く MMP— 1,9〉
リコンビナント MMP— 1 (ペプチド研究所,京都） ,リコンビナント MMP— 9 (ペプチド研 究所,京都）を用い基質は 50 M P3163- V (ペプチド研究所,京都）： MOCAc-Pro- Leu- Gly+Leu- Azpr(DNP)- Ala- Arg- NH2、 37°Cで 2時間反応させ、蛍光量で 2回定 量した。
[0104] 〈試験結果〉
精製 TRX 100 g/mLの存在下で、カスパーゼー 1は 21%抑制された。また精製 TR X 100 /z g/mLの存在下で MMP— Ι,ΜΜΡ— 9がそれぞれ 47%、 76%抑制された。 このことから、 TRXには、システィンプロテアーゼゃメタ口プロテアーゼ等のプロテア ーゼの抑制効果があることが確認された。
実施例 2
[0105] [伝統的動物モデルを用いた、 TRXの COPD抑制効果実験]
上述した、エラスターゼを用いた伝統的な COPD動物モデルを使って、 COPD治療剤 の効果を確認する実験を行った。 8週齢 C57BL/6Nマウスを下記 1一 4の各群につい て 5匹ずつ用いた。
[0106] (第 1群) DAY1に、清潔 PBS 100 Lをシリンジで気管内投与した群 (参考例：
controlマウス) 0
(第 2群） DAY1に、清潔 PBS 100 Lに懸濁した豚エラスターゼ (SIGMA社製、 0.3U) をシリンジで気管内投与した群 (比較例 1 :病態マウスモデル 1)。
(第 3群） DAYOから DAY20まで隔日で、 TRX投与のコントロールとして清潔 PBS
100 μ Lに懸濁した卵白アルブミン (OVA, SIGMA社製、 40 μ g)を腹腔内投与し、清 潔 PBS 100 Lに懸濁した豚エラスターゼ (SIGMA社製 カタログ番号 E1250、 0.3U)を
、 DAY1にシリンジで気管内投与した群 (比較例 2：病態マウスモデル 2)。
(第 4群） DAY0から DAY20まで隔日で、清潔 PBS 100 μ Lに懸濁したヒトリコンビナ ント TRX(40 μ g)を腹腔内投与し、清潔 PBS 100 μ Lに懸濁した豚エラスターゼ
(SIGMA社製 カタログ番号 E1250、 0.3U)を DAY1にシリンジで気管内投与した群（ 実施例 2：病因 +治療剤投与マウス)。
[0107] すべてのマウスは DAY21で回収した。 20%中和ホルマリンを気管支から 15cmH20 圧をかけてマウス肺を還流固定。肺パラフィン切片は HE染色した。顕微鏡画像は顕 微鏡用デジタルカメラ DXM1200 (NIKON製）で取り込み、解析ソフトは ACT— 1 ( NIKON製）、 Photoshop (Adobe社製)で用いた。具体的には各群力もランダムに肺 組織 (スライド）を選ぶ。一匹のマウスの両肺カも左右の上肺野、中肺野と下肺野の 計 6断面の HE染色スライドから各断面 5視野の画像を ACT— 1で取り込む。
Photoshop (Adobe社製)を用いて各視野で 300マイクロメーターのグリッド（線） 4つ 引く。肺胞がこのグリッドを横切った数を数える。例えば 3回横切ると平均の肺胞の長 さ（mean linear intercept: Lm)は 300マイクロメーター /3=100マイクロメーターである 。一匹のマウスの Lmを 6断面 x5視野 x4グリッド（線） = 120グリッド（線）から求め各群 の平均及び Welchの t検定で統計解析を行つた。
[0108] 組織学的に（第 1群: controlマウス）には肺に有意な変化はな力つた（図 1)。
[0109] 一方、（第 2群:病態マウスモデル 1)には著明に肺胞腔が広がり、実験病理学的 C0PDが出来た（図 2)。
[0110] また、（第 3群:病態マウスモデル 2)は、著明に肺胞腔が広がり、実験病理学的
C0PDが出来る力 第 2群と差がなかった。つまりレドックス蛋白でないコントロール蛋 白である OVAの腹腔内投与では C0PDの発症は抑制されないことが判明した（図 3)
[0111] (第 4群:病因 +治療剤投与マウス)では、肺に変化は少なぐ TRXが実験病理学的 COPDを強力に抑制することが分力つた (図 4)。
[0112] そこで、これら HE染色スライドを用いて画像解析を行い、 Lmを求めたところ、第 1群， 第 2群，第 3群，第 4群の Lmの平均はそれぞれ 31.7, 69.0, 82.0, 30.4マイクロメーター だった（図 5)。
[0113] Lmを計測すると、第 4群 (病因 +治療剤投与マウス）は、第 2群 (病態マウスモデル 1, p=2.62xl0e- 24)、第 3群 (病態マウスモデル 2, p=4.00xl0e- 20)に比べ有意に COPD を統計学的有意に抑制した。
[0114] 一方、第 4群 (病因 +治療剤投与マウス）は、第 1群 (controlマウス）に比べ Lmに有意 差はなかった。
[0115] 実験の結果、この系を用いてレドックス活性蛋白質である TRXが、実験病理学的 COPDを強力にかつ統計学的有意に抑制することが確認された。
[0116] また、レドックス活性蛋白質力 エラスターゼによって誘導される肺気腫動物モデルを 抑制することから、このレドックス活性蛋白質が、エラスターゼ阻害剤として機能して いることが確認された。つまり、実施例 1の結果と考え併せると、レドックス活性蛋白質 ,又はこれらをコードする遺伝子力 エラスターゼに代表されるセリンプロテアーゼゃ メタ口プロテアーゼ，システィンプロテアーゼ等のプロテアーゼを阻害する効果を有 することは明らかである。
実施例 3
[0117] if規動物モデルを用いた、 TRXの実験病理学的 COPDモデル抑制効果実験] 上述した新規 COPD動物モデルを使って、 COPD治療剤の効果を確認する実験を行 つた o
上述の様にして作製した、 7から 8週齢の SPC- IL-18TGマウス（各群 5匹）に、隔日で O.lmLの無菌のリン酸緩衝液（PBS) (コントロール)もしくは 0.2mLに溶解したリコンビ ナントヒト TRX400 g/mL (つまり一匹あたり 40 g)を腹くう内投与した。 21日後にマ ウス肺を回収し、肺組織を HE染色した。
[0118] 結果を図 6, 7に示す。その結果、 PBSを投与したコントロール（図 6)では、実験病理 学的 COPDモデルが発症していたのに対し、 TRX投与群（図 7)では、 COPDや肺胞 蛋白症は見られず、また HE染色で肺動脈が肥厚していないことや肺に著明なうつ血 がな 、ことからこのマウスの心臓は、心不全等の循環器疾患等の症状が改善したと 判断される。
[0119] 上記のマウスモデルは、肺特異的に IL-18を発生させることにより、疾患を発症させる ものである。そして、 TRXには IL-18阻害作用が知られており、これらのこと力 、 IL-18のシグナルを抑制すると、 COPDを初めとする、上記のマウスモデルの呈する疾 患の予防又は治療が可能となることは明らかである。つまり、抗 IL-18抗体等の上述 の IL-18抑制剤も、 COPD,肺胞蛋白症、心不全や肝不全あるいは肺高血圧症を伴う 循環不全等の循環器疾患等の治療剤となることが分かった。 参考例 1
[0120] [COPD患者の病変局所における IL-18の強発現]
COPD患者 10人の外科手術で得た組織及び交通事故等で亡くなった人等の 6人の 肺組織をホルマリン固定し、ノ《ラフィン切片を作製した。抗ヒ HL- 18抗体 (clone8)で免 疫組織染色を行った。
[0121] 結果を、図 8— 10に示す。
「Kitasato, Y., Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, Koaa, Y., Nagata, N.,
Kinoshita, M., Koga, H., Yoon, D. Y., Asao, H., Ohmoto, H., Koga, T., Rikimaru, T., and Aizawa, H. enhanced expression of interleukin— 18 and its receptor in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 31: 619—625, 2004.」に報 告してあるように、健常人の肺にはほとんど発現して ヽな 、（図 8)。
[0122] その一方、 COPD患者の肺病変部には、 IL-18が強く発現していた。特に浸潤炎症 細胞、肺胞上皮に強く発現していることが確認された（図 9, 10)。
このことは、肺での IL- 18の過剰発現力 COPDの病因であることを裏付けるものであ る。
参考例 2
[0123] [2.1 COPD患者の病変局所における TRXの強発現]
COPD患者 10人の外科手術で得た組織及び交通事故等で亡くなった人等の 6人の 肺組織を、ホルマリン固定しパラフィン切片を作製した。抗ヒト TRX抗体 (Serotec製)で 免疫組織染色を行った。免疫組織染色は以下の論文の方法に従った。 Kitasato, Y., Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, S., Koda, Y., Nagata, N., Kinoshita, M., Koga, H., Yoon, D. Y., Asao, H., Ohmoto, H., Koga, T., Rikimaru, T., and Aizawa, H. Enhanced expression of interleukin— 18 and its receptor in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 31: 619—625, 2004.
[0124] その結果を、図 11一 14に示す。健常者の肺胞上皮には、 TRXは、弱くし力発現して いなかった（図 11, 12)。
これに対して、 COPD患者の肺病変部には、 TRXが強く発現していた。特に浸潤炎 症細胞、肺胞上皮や気管支の繊維芽細胞に強く発現していることが確認された（図 1 3, 14)。
[0125] 参考例 1, 2の結果力もも、 COPDで過剰に発現する IL-18を抑制するために、生体が TRXを発現させて 、る可能性が裏付けられ、上述の IL-18阻害剤もまた COPDの予 防又は治療剤で有用であることが裏付けられた。
産業上の利用可能性
[0126] 本発明のレドックス活性蛋白質又はその遺伝子を含むプロテアーゼ阻害剤，及び
COPDの予防又は治療剤は、 COPDを強力に抑制すること，及び免疫不全症候群の 治療の為に、単独であるいは HAART療法等のカクテル療法に用いられるプロテア一 ゼとして使用可能である。また本発明の IL-18阻害剤又はその遺伝子を含む疾患の 予防又は治療剤は、 COPD,肺胞蛋白症、心不全や肝不全又は肺高血圧症等を伴 う循環不全等の循環器疾患を効果的に治療することができる。

Claims

請求の範囲 [1] 下記（1)乃至 (4)から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、プロ テアーゼ阻害剤。 (1)レドックス活性蛋白質 (2)レドックス活性蛋白質のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなりかつレドックス活性蛋白質と同等の活性を 有するタンパク質 (3) (1)をコードする遺伝子 (4) (2)をコードする遺伝子 [2] プロテアーゼがメタ口プロテアーゼ，セリンプロテアーゼ，システィンプロテアーゼから 選択されるものである、請求項 1記載のプロテアーゼ阻害剤。 [3] 下記（1)乃至 (4)から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、慢性 閉塞性肺疾患又は免疫不全症候群の予防又は治療剤。
(1)レドックス活性蛋白質
(2)レドックス活性蛋白質のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失，置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなりかつレドックス活性蛋白質と同等の活性を 有するタンパク質
(3) (1)をコードする遺伝子
(4) (2)をコードする遺伝子
[4] 下記 (5)乃至 (8)力も選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、慢性 閉塞性肺疾患の予防又は治療剤。
(5)インターロイキン 18阻害剤
(6)インターロイキン 18阻害剤のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつインターロイキン 18阻害活性を 有するタンパク質
(7) (1)をコードする遺伝子
(8) (2)をコードする遺伝子
[5] 下記（5)乃至 (8)から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、肺胞 蛋白症の予防又は患治療剤。
(5)インターロイキン 18阻害剤
(6)インターロイキン 18阻害剤のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつインターロイキン 18阻害活性を 有するタンパク質
(7) (1)をコードする遺伝子
(8) (2)をコードする遺伝子
下記（5)乃至 (8)から選択される、少なくとも一種以上を含むことを特徴とする、循環 器疾患の予防又は治療剤。
(5)インターロイキン 18阻害剤
(6)インターロイキン 18阻害剤のアミノ酸配列のうち、 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつインターロイキン 18阻害活性を 有するタンパク質
(7) (1)をコードする遺伝子
(8) (2)をコードする遺伝子
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