JP2008201790A

JP2008201790A - プロテアーゼ阻害剤

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Publication number: JP2008201790A
Application number: JP2008098616A
Authority: JP
Inventors: Jiyunji Yodoi; 淳司淀井; Hajime Nakamura; 肇中村; Tomoaki Hoshino; 友昭星野; Hisamichi Aizawa; 久道相澤
Original assignee: Redox Bioscience Inc
Current assignee: Redox Bioscience Inc
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2008-04-04
Publication date: 2008-09-04
Anticipated expiration: 2025-03-11
Also published as: EP1736168A1; US20130072441A1; JP2011140511A; JP4737648B2; WO2005087249A1; JPWO2005087249A1; JP4823389B2; JP2012087136A; EP1736168A4; JP4160615B2

Abstract

【課題】新たなプロテアーゼ阻害剤、慢性閉塞性肺疾患・免疫不全症候群・肺胞蛋白症・循環器疾患の根治的治療薬及び治療法を提供すること。
【解決手段】（１）チオレドキシン、（２）チオレドキシンのアミノ酸配列のうち１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつチオレドキシンと同等の活性を有する蛋白質、（３）（１）をコードする遺伝子、（４）（２）をコードする遺伝子から選択される、少なくとも一種類以上を有効成分として含み、カスパーゼ−１の阻害作用を有することを特徴とするプロテアーゼ阻害剤とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、慢性閉塞性肺疾患の病因の一つと考えられるプロテアーゼの阻害剤に関するものである。

慢性閉塞性肺疾患Chronic Obstructive Pulmonary Disease: (以下、「COPD」と記載する。）とは、肺気腫、慢性気管支炎、あるいは両者の併存により、進行性の閉塞性換気障害を特徴とする疾患である。COPDにおける気流制限は、末梢気道病変における気道抵抗上昇と肺気腫による肺弾性収縮力低下に因り、２者の関与の程度は症例によって様々ではあるが、COPD患者の多くは肺気腫優位の傾向を示す。肺気腫の最大のリスクファクターが喫煙である事は多くの疫学的研究より明らかである。２００１年に米国National Heart, Lung and Blood Institution (NHLBI)とWorld Health Organization (WHO)との共同で報告されたGlobal Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD)にも述べてあるように、１９９０年の調査では世界でのCOPDの罹患率は、全人口に対し、男性で９．３４／１０００，また女性では７．３３／１０００となっており、罹患率が非常に高い疾患である。現時点でのCOPDによる呼吸不全が原因の死亡は、アメリカの死因の４位と推定されている。また、日本における厚生労働省の報告でもCOPDによる死亡率は、最近の３０年間で約４倍に増加した。COPD治療薬として従来知られているのは、気管支拡張剤とステロイドもしくはこの組み合わせである。しかしながらあまり効果がなく、新規の治療薬が求められている。また、臭化チオトロピウム水和物も上市されているが、さらに有効な薬剤が求められている。

このため、COPDの根治的治療薬及び治療法はいまのところ確立されていない。

Pauwels, R. A., Buist, A. S., Calverley, P. M., Jenkins, C. R., and Hurd, S. S. "Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) Workshop summary." 「American journal of respiratory and critical care medicine」, vol.163: PP.1256-1276, 2001. Barnes, P. J. "Novel approaches and targets for treatment of chronic obstructive pulmonary disease." 「American journal of respiratory and critical care medicine」, vol.160: S72-79, 1999.

また、COPDを含む慢性肺疾患による右心負荷が原因となって起こる肺性心等の心不全や、それに続く肝不全、肺高血圧症等の循環不全等が、COPDに関連する循環器疾患として知られている。

このため、COPDの根治的治療薬及び治療法が求められている。

また、1980年代、エイズ（免疫不全症候群）に感染した患者のほとんどは死を免れなかった。HIV（ヒト免疫不全ウイルス）と呼ぶウイルスがCD4（抗原蛋白の一種で、分子量59kDaの単鎖膜貫通型ｄ糖タンパク。）陽性細胞に感染し体の免疫系が破壊され、体力が弱って消耗し、死に至る。

しかし、近年米国をはじめ先進各国では、HIV感染者の運命は劇的に様相が違ってきた。1996年７月にカナダのバンクーバーで開かれた国際エイズ会議では、関係者に希望を抱かせる発表が相次いだ。例えばニューヨークにあるアーロン・ダイヤモンド・エイズ研究センターのホー（David Ho）は、プロテアーゼ阻害剤とすでに1991年以降に市場に出回るようになっていたAZT（ジドブジン，逆転写酵素阻害剤の一種）タイプの抗ウイルス剤とを組み合わせたカクテル療法（人体内でHIVが増えるのを邪魔する薬を複数使用して、AIDSの発症を押さえる方法）によって、非常に優れた結果が得られたと報告した。また、カクテル療法の中でも、HAART療法（高活性抗レトロウイルス療法）等が注目されている。

このカクテル療法は、根本治療にはならないものの、エイズ患者の免疫細胞を増やすだけでなく、血液中のウイルス数を検出限界以下にまで減らしたことが報告された。

AZT、d4T（スタブジン，逆転写酵素阻害剤の一種）、ddI（ジダノシン，逆転写酵素阻害剤の一種）のような以前からの逆転写酵素阻害剤薬と一緒に服用すると、これらのプロテア−ゼ阻害剤は最も有効に働くことが知られている（いわゆる抗HIV療法(highly active antiretroviral therapy)HAART療法）。事実、1996年から1998年の間に、米国ではHIV感染に伴う死者が70％以上も減り、エイズは死因の上位10位から外れた。エイズの死亡率は統計がとられるようになった1987年以降、1998年に最低となり、更に低下する見通しである。

1995年12月、米食品医薬品局（FDA）は最初のプロテアーゼ阻害剤「サキナビル」を認可した。1996年春までには、さらに２つの阻害剤「リトナビル」と「インジナビル」が認可された。しかしながら、HIVプロテアーゼ阻害剤は、阻害作用は優れているものの副作用が多いという欠点を有している。

ところで、HIV患者の血清中にチオレドキシンが著明に発現している（Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Feb 27;98(5):2688-93）ことが分かっているが、今のところその意義は明らかになっていない。

一方、エラスターゼは、肺を構成する弾性線維（elastic fiber）の主成分である不溶性タンパク質エラスチンを加水分解するプロテアーゼとして知られている。このエラスターゼは、気管内へ投与することによって、COPDの一種である肺気腫を誘導することが古くから知られており、エラスターゼ投与動物が、肺気腫の動物モデルとして用いられている。

我々は、上記の通り、エラスターゼが肺気腫を引き起こすことに鑑み、エラスターゼ等に代表されるプロテアーゼの阻害が、COPDの一種である肺気腫の治療に役立つのではないかという仮説に基づき、プロテアーゼ阻害剤を探索し、また得られたプロテアーゼ阻害剤であるレドックス活性蛋白質が、実際にCOPDを強力に抑制することや、免疫不全症候群の治療の為に、単独であるいはHAART療法等のカクテル療法に用いられるプロテアーゼ阻害剤として使用できる可能性を見出し、本発明を完成するに至った。

上述の目的は、下記（１）乃至（４）から選択される、少なくとも一種以上を有効成分として含み、カスパーゼ−１の阻害作用を有することを特徴とする、プロテアーゼ阻害剤によって達成される。

（１）チオレドキシン
（２）チオレドキシンのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつチオレドキシンと同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子

本発明のチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類又はその遺伝子を含むプロテアーゼ阻害剤は、COPDを強力に抑制することができる他、免疫不全症候群の治療の為に、単独であるいはHAART療法等のカクテル療法に用いられるプロテアーゼ阻害剤として使用可能である。チオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類又はその遺伝子は、もともと生物細胞中に存在するものであるため、従来免疫不全症候群のカクテル療法に用いられているプロテアーゼ阻害剤のような副作用が無いという利点を有している。

〈プロテアーゼ〉
プロテアーゼとは、蛋白質分解酵素のことであるが、例えば、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）等が挙げられる。

メタロプロテアーゼとは、亜鉛などの重金属を活性中心に持つタンパク質分解酵素であり、マトリックス・メタロプロテアーゼ（以下、「ＭＭＰ」と記載する。）やサーモリシン等が挙げられる。
ＭＭＰとは、動物細胞の細胞間の接着性マトリックス・タンパク質を加水分解し、細胞分裂や形態形成、さらにはガン転移に関与している亜鉛含有プロテアーゼである。ＭＭＰとしては、ＭＭＰ−１，２，・・・２８等３０種類近くが同定されている。

システインプロテアーゼとは、システイン残基を活性中心に持つプロテアーゼであり、
カスパーゼ，パパイン(papain)等が挙げられる。カスパーゼとしては、カスパーゼ−１，
２，３・・等２０種類近くが挙げられるが、中でもカスパーゼ−１、−３や−９が、本発
明のプロテアーゼ阻害剤のターゲットとして重要である。

カスパーゼは、アスパラギン酸のC末端側を切断するが、不活性型前駆体として存在し、アポトーシスのシグナルにより切断されて活性型になるものである。具体的には、カスパーゼ−１等が挙げられ、これはインターロイキン１β変換酵素とも呼ばれ、IL-18前駆体を切断し、活性型のIL-18とすることも知られている。

セリンプロテアーゼとしては、エラスターゼの他、キモトリプシン(chymotrypsin)やスブチリシン(subtilisin)等が挙げられる。

エラスターゼとは、肺を構成する弾性線維（elastic fiber）の主成分である不溶性タンパク質エラスチンを加水分解するプロテアーゼとして知られている。

アスパラギン酸プロテアーゼとしては、ペプシン(pepsin)やカテプシンD(cathepsin D)等が挙げられる。

〈本発明のプロテアーゼ阻害剤〉

（レドックス活性蛋白質）
本発明のプロテアーゼ阻害剤の有効成分として用いられるものとしては、下記（１）乃至（４）単独の他、これらの組み合わせ等が挙げられる。
（１）チオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類
（２）チオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類のアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類と同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子

レドックス活性蛋白質と同等の活性とは、下記に示す、レドックス制御活性を言う。

レドックス活性蛋白質とは、レドックス（酸化と還元，reduction-oxidation)の両方の活性を有することによって、レドックス制御（酸化還元状態を調節すること）のできる蛋白質であり、レドックス活性ペプチド等をも含むものである。例えば、チオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類や、ＨＯ−１（ヘムオキシゲナーゼ−１）等が挙げられる。

チオレドキシン（以下「ＴＲＸ」と記載する。）ファミリーに属するポリペプチド類（以下、「ＴＲＸ−Ｐ」と記載する。）とは、ジチオール結合やジスルフィド結合の酸化還元活性を有するポリペプチド類であって、もともと、生物細胞中に存在するポリペプチド類である（特開２００２−１７９５８８等参照）。

本発明で言う「ＴＲＸ−Ｐ」には、天然のヒトを含む動物、植物、大腸菌、酵母からの抽出ポリペプチド類以外に、遺伝子組換えにより酵母や大腸菌等から抽出されるポリペプチド類、化学合成で作成されるポリペプチド類等も含まれる。但し、ヒト由来のもの、及びそれを大腸菌、酵母において遺伝子組換えで作成したもの、及びそれらと同一又は類似の配列からなる合成ペプチドが、生体に与える影響がより少ないと考えられるため好ましい。

ＴＲＸ−Ｐは、システイン残基を含む活性部位(−Cys−X1−X2−Cys −：X1 ，X2は、アミノ酸残基を表し、同一であっても異なるものでも良い。)を有し、類似の３次元構造を持つ分子群である。従って、本発明で言う「ＴＲＸ−Ｐ」には、上記の他、ジチオール結合やジスルフィド結合の酸化還元活性を損なわない範囲で、一部のアミノ酸が欠失又は置換されたものや、他のアミノ酸，ペプチドが融合されたものであっても良い。

活性部位の具体例としては、−Cys−Gly−Pro−Cys −，−Cys−Pro−Tyr−Cys −，−Cys−Pro−His−Cys −，−Cys−Pro−Pro−Cys −等が挙げられるが、中でも、−Cys−Gly−Pro−Cys −が、種を超えて保存されている配列であるため、マウスモデルによる実験結果の人間への応用がより確実であるという理由で好ましい。

「ＴＲＸ−Ｐ」には、具体的には、例えば、活性部位が−Cys−Gly−Pro−Cys −であるチオレドキシン（ＴＲＸ），グルタレドキシン等が挙げられる。

ＴＲＸ−Ｐには、ヒト，大腸菌，酵母由来のものがあり、グルタレドキシンには、ヒト、大腸菌由来のものがある。

ヒト細胞から「ＴＲＸ−Ｐ」を抽出する具体的な方法としては、以下の方法が例示される。
（Ａ）ヒト由来の細胞株から抽出する方法（特開平１−８５０９７号公報等参照）。
（Ｂ）遺伝子組換え法を用いる方法（特開平１−８５０９７号公報等参照）。
（Ｃ）ペプチド合成法を用いる（特開平５−１３９９９２号公報等参照）。

本発明のプロテアーゼ阻害剤中の、有効成分の含有量は、剤形によって様々であり、一概に限定できず、各種剤形化が可能な範囲で、投与量との関係で適宜選択すれば良いが、例えば液剤の場合、０．０００１〜１０（ｗ／ｖ％），好ましくは０．００１〜５（ｗ／ｖ％），特に注射剤の場合、０．０００２〜０．２（ｗ／ｖ％），好ましくは０．００１〜０．１（ｗ／ｖ％），固形剤の場合、０．０１〜５０（ｗ／ｗ％），好ましくは０．０２〜２０（ｗ／ｗ％）等として調製できるが、必ずしもこの範囲に限定されるものでは無い。

本発明のプロテアーゼ阻害剤の投与量は、投与経路、症状、年齢、体重、剤の形態等によって異なるが、例えば、プロテアーゼ阻害剤中の有効成分の量が、処置を必要としている対象体重１ｋｇ当たり０．００５〜５００ｍｇ，好ましくは、０．１〜１００ｍｇ，但し、成人に対して１日あたり、下限として０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ），上限として、２０ｇ（好ましくは２０００ｍｇ，より好ましくは５００ｍｇ，更に好ましくは１００ｍｇ）となるように、１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。

本発明のプロテアーゼ阻害剤は、従来知られている本発明の目的とする疾患の予防又は治療成分との合剤としても良い。その予防又は治療成分としては、以下の１．−５．等が挙げられる。

１．メディエーターアンタゴニスト：
例えば、LTB4 antagonists (例えばLY29311, SC-53228, CP-105,696, SB201146, BIIL284)、5'-Lipxygenase inhibitors (例えばzileutin, Bayx1005)、Chemokine inhibitors、IL-8 antagonists (例えばSB225002; CXCR2 antagonists)、TNF inhibitors (例えばmonoclonal Ab, soluble receptors, MMP inhibitors)、Antioxydants (例えばNAC, NAL, グルタチオン，スーパーオキシドジスムターゼ等)、Prostanoid inhibitors (例えばCOX-2 inhibitors, thromboxane antagonists、isoprostane receptor antagonists)、iNOS inhibitor 等

２．抗炎症剤：
例えば、Phosphodiesterase 4 inhibitors (例えばSB207499, CP80633, CDP-840)、Adhesion inhibitors (例えばanti-CD11/CD18, anti-ICAM1, E-selectin inhibitors)、Prostaglandin E analogs (例えばmisoprostil, butaprost)、サイトカイン（例えばIL-10）、Colchicine、Macrolide antibiotics (例えばerythromycin, clarithromycin, roxithromycin)等

３．プロテアーゼインヒビター：
例えば、Neutrophil elastase inhibitors (例えばICI200355, ONO-5046, MR-889, L658,758)、Cathepsin inhibitors (例えばsuramin)、Matrix metalloprotease inhibitors (例えばbatimastat, marimastat、KBR7785)、alpha1-antitrypsin (例えばpurified, human recombinant, gene transfer)、Secretory leukoprotease inhibitor、Elafin等

４．Immunoregulators：
例えば免疫抑制剤FK506等

５．呼吸器炎症疾患又は呼吸器過敏症治療剤：
テオフィリン等のキサンチン誘導体，β２受容体刺激剤，抗コリン剤，抗アレルギー用剤，副腎皮質ホルモン剤及び吸入ステロイド等のステロイド剤等

また、本発明のプロテアーゼ阻害剤には、その阻害効果を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば薬学的に許容される担体として、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、乳化剤、可溶化剤、吸収促進剤、保湿剤、吸着剤、充填剤、増量剤、付湿剤、防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。

ここに、賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。

本発明のプロテアーゼ阻害剤は、主に経口投与するためのものであるが、具体的には、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ、もしくはシロップ剤等の形態で、経口投与される。

投与形態としては、経口投与のほか、静注等の静脈投与、筋肉内投与、経皮投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、直腸内投与、粘膜投与、吸入等が挙げられるが、静注等の静脈投与が安全かつ血中濃度を一定に保つという点で好ましい。

尚、上述のレドックス活性蛋白質をコードする遺伝子を、遺伝子療法における、プロテアーゼ阻害剤やCOPD又は免疫不全症候群の予防・治療剤として用いることもできる。

その際の遺伝子形態としては、ＤＮＡの他、ＲＮＡ、プラスミド、ウイルスベクター等が使用可能であり、一本鎖であっても二本鎖であっても良い。

プラスミドを用いる場合、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。

ウイルスベクターを用いる場合、（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４）等）に記載されているように、ウイルスに、目的とする遺伝子を組み込むことによって行うことができる。

ウイルスベクターに用いるウイルスとしては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスが挙げられる。
ウイルスの中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等が好ましく、特にアデノウイルスが好ましい。

遺伝子を実際に医薬として作用させるには、当該遺伝子を直接体内に導入する「ｉｎｖｉｖｏ法」の他、ヒトから採集した細胞に当該遺伝子を導入し、その後、遺伝子導入細胞を体内に戻すという、「ｅｘｖｉｖｏ法」等がある（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），（１９９４））が、「ｉｎｖｉｖｏ法」がより好ましい。

「ｉｎｖｉｖｏ法」により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択することができる。投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等が挙げられる。

「ｉｎｖｉｖｏ法」によって投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である遺伝子を含有する注射剤等の形態が好ましく、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。

また、遺伝子を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態として用いることができる。

〈本発明の阻害剤を用いた、プロテアーゼ阻害方法〉
本発明のプロテアーゼ阻害剤を、上記のような様々な形態で投与すること、あるいは、本発明のプロテアーゼ阻害剤である遺伝子を、遺伝子治療において用いることによって、予防又は治療することができる。

〈本発明の効果確認に用いる疾患動物モデルの作製方法〉
［伝統的COPD動物モデル］
本発明において、COPD抑制効果の確認のために用いる肺気腫動物モデルは、文献記載の方法を用いることができるが（Shapiro, S. D. Animal models for COPD. Chest, 117: 223S-227S, 2000）、具体的には、例えば無菌のPBSに懸濁したブタエラスターゼを、シリンジで気管内投与すること等によって作製することができる。

［新規疾患動物モデル］
本発明において、COPD抑制効果の確認のために用いる疾患動物モデルとしては、本発明者（星野，特願2004−069835）によって開発された、新たなCOPD動物モデルも用いることができる。その作製方法を以下に記載する。

ここで用いられるCOPD動物モデルとは、肺特異的に発現するプロモーターの制御下にある下記（Ｘ１）乃至（Ｙ２）のいずれかの遺伝子を含むことを特徴とする組換え遺伝子を導入した動物モデルである。
（Ｘ１）インターロイキン−１８遺伝子
（Ｘ２）インターロイキン−１８のアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつインターロイキン１８と同等の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（Ｙ１）カスパーゼ−１遺伝子
（Ｙ２）カスパーゼ−１のアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつカスパーゼ−１と同等の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子

この動物モデルを用いることによって、生後約５から８週間という短期間で、肺気腫等の慢性閉塞性肺疾患（COPD）を発症することが確認されている。これによって、従来、起炎物となるタバコの繰り返し投与のために６ヶ月に亘る長期間を要していた動物モデル作製期間が短縮され、しかもブタエラスターゼやパパイン等も含めて起炎物の投与を一切行わないで簡便に行うことができる。

〈組換え遺伝子〉
この動物モデルに導入する組換え遺伝子は、下記（Ｘ１）又は（Ｘ２）遺伝子（以下、併せて「IL-18遺伝子類」と記載することがある。）、あるいは下記（Ｙ１）又は（Ｙ２）遺伝子（以下、併せて「カスパーゼ１遺伝子類」と記載することがある。）を、肺特異的に発現するプロモーターの制御下に置くことによって、得ることができる。肺特異的に発現するプロモーターとしては、肺構成細胞由来プロモーター等が挙げられ、例えば肺サーファクタントプロモーター又はクララ細胞プロモーター等が挙げられる。

（Ｘ１）IL-18遺伝子
（Ｘ２）IL-18のアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつIL-18と同等の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（Ｙ１）カスパーゼ−１遺伝子
（Ｙ２）カスパーゼ−１のアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつカスパーゼ−１と同等の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子

IL-18と同等の活性とは、IL-18レセプターを通じたシグナル伝達等を意味し、例えばインタ−フェロンγ（ＩＦＮ−γ）を誘導する活性等を意味する。また、カスパーゼ−１と同等の活性とは、IL-18前駆体（プロIL-18: proIL-18）を切断して、活性型（成熟型IL-18: matureIL-18）とする活性を意味する。

肺サーファクタントプロモーターとしては、ヒト肺サーファクタントプロモーター（surfactant protein-C遺伝子プロモーター、以下、「SPCプロモーター」と記載する。）等が挙げられる。SPCプロモーターは、例えばEarly restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16):10482-7.に記載された手法に準じて得ることができる。

クララ細胞プロモーターとしては、CC10プロモーター（CCSPと言うことがある。）等が挙げられる。CC10プロモーターは、例えばcis-acting elements that confer lung epithelial cell expression of the CC10 gene. J Biol Chem. 1992 Jul 25;267(21):14703-12.に記載された手法に準じて得ることができる。

これらのプロモーターを用いることで、本発明の疾患動物モデルを効率良く作成することができる。

組換え遺伝子は、このほか、導入遺伝子の細胞外への放出を促進するためのシグナルペプチド（ＳＰ）遺伝子や、コザック配列等のタンパク発現を最適化する作用を持つ配列、発現遺伝子の釣り出し等に有用なポリＡ配列等を含んでいることが好ましい。

シグナルペプチドとは、タンパク質が細胞外に分泌される際、その疎水性により脂質で出来た細胞膜を通過するのに役立つアミノ酸配列であり、膜を通過した後、シグナルペプチダーゼと言う酵素で切断されるものである。
シグナルペプチドとしては、例えばマウスの免疫グロブリン（以下「Ig」と記載する。）κ−チェーン・シグナルペプチド等が挙げられる。
マウスのIgκ−チェーン・シグナルペプチドは、例えば、Carroll, W. L., E. Mendel, S. Levy. 1985. Hybridoma fusion cell lines contain an aberrant kappa transcript. Mol. Immunol. 25:991.等に記載されている。

コザック配列とは、遺伝子のATG開始コドンの周辺で見つかった、細菌由来の、グアニン−シトシンを多く含むＤＮＡ配列で、タンパク発現を最適化する作用をもち、クローニングの際に用いられている配列である。
例えば、Nucleic Acids Res. 1984 Jan 25;12(2):857-72. Compilation and analysis of sequences upstream from the translational start site in eukaryotic mRNAs. に記載されている。

ポリＡ配列とは、遺伝子中のヌクレオチド配列で、アデニル酸（Ａ）が連続している部分を言う。
ポリＡ配列としては、ウシ由来のポリＡ配列等が挙げられる。例えば、Goldman, L. A., E. C. Cutrone, S. V. Kotenko, C. D. Krause, J. A. Langer. 1996. Modifications of vectors pEF-BOS, pcDNA1 and pcDNA3 result in improved convenience and expression. BioTechniques 21:1013.等に記載されている。

また、組換え遺伝子が（Ｘ１）又は（Ｘ２）等のIL-18遺伝子類を用いたものである場合には、導入遺伝子の細胞外への放出を促進するためには、シグナルペプチド遺伝子の導入のほか、proIL-18を活性型IL-18に変換するIL-１β変換酵素（カスパーゼ−１）遺伝子を、IL-18遺伝子類とともに動物モデルに導入し、共に発現させる方法等、他の公知の技術を用いることもできる。

〈疾患動物モデル〉
疾患動物モデルは、例えば次のような方法で、作成することができる。

本発明に使用される動物としては、げっ歯類動物、イヌ、ネコ、サル、ウマ、ブタ等が挙げられ、このうち、げっ歯類動物としてはマウス、ラット等が挙げられるが、マウスが好ましく、マウスは、例えば、C57BL/6Nマウス（B6マウスとも言う）、Balb/cマウス等が好ましく用いられ、中でも、B6マウスが好ましい。

以下本発明の説明においては、おもに、導入動物がマウスの場合を例に挙げて説明することがあるが、本発明は、マウスに関するものに限定されるものではない。

上記を含む組換え遺伝子の作出方法としては、遺伝子組換えの公知の方法を用いることができるが、例示すると、以下の通りである。尚、以下では主にIL-18遺伝子によって説明するが、上記（Ｘ２）のIL-18関連遺伝子や、上記（Ｙ１），（Ｙ２）のカスパーゼ１遺伝子類の場合も同様に行うことができる。

マウスIgκ−チェーンの、V-J2-C領域から取り出したシグナルペプチド（文献(1)Hoshino T, Kawase Y, Okamoto M, Yokota K, Yoshino K, Yamamura K, Miyazaki J, Young HA, Oizumi K. Cutting edge: IL-18-transgenic mice: in vivo evidence of a broad role for IL-18 in modulating immune function. J Immunol 2001;166:7014-7018／文献(2)Kawase Y, Hoshino T, Yokota K, Kuzuhara A, Kirii Y, Nishiwaki E, Maeda Y, Takeda J, Okamoto M, Kato S, Imaizumi T, Aizawa H, Yoshino K. Exacerbated and Prolonged Allergic and Non-Allergic Inflammatory Cutaneous Reaction in Mice with Targeted Interleukin-18 Expression in the Skin. J Invest Dermatol 2003;121:502-509）と、マウスのpro-IL-18ｃＤＮＡ（上記文献(1)参照）を用い、シグナルペプチドを持つ成熟IL-18ｃＤＮＡを、ＰＣＲ法によって取得する(上記文献(1)，(2)参照)。pro-IL-18ｃＤＮＡは、活性型（mature IL-18）になった際に、上記（Ｘ）又は（Ｙ）遺伝子となるものであれば良い。

シークエンス（DNA配列）を図１２及び配列１に例示する。図１２（配列１）の配列中、7〜9番目にある開始コドン「ATG」の直後の、10番目の配列Gから、69番目の配列Cまでが、マウスIgκ鎖のV-J2-C領域由来シグナルペプチド遺伝子，その直後の「AAC」コドンから541〜543番目の「TAG」STOPコドンの直前の「AGT」コドンまでが、マウスの成熟IL-18ｃＤＮＡである。

尚、開始コドンの前の、「GGA ACA」は、元々マウスのpro-IL-18ｃＤＮＡのゲノムにあった、コザック配列を含む、タンパク発現を最適化する配列領域である。

また、STOPコドンの後の「GTG」は、元々マウスのpro-IL-18ｃＤＮＡのゲノムにあった配列であるが、特に必要ではないと考えられる。

次に、pCR2.1ベクター（Invitrogen製）を用いてPCR産物をクローニングし、シークエンスする（上記文献(1)，(2)参照）。続いてヒトサーファクタントのプロモーターSPC(Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16):10482-7.)、SV40 small T intron(Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 6;99(16):10482-7.)とウシ由来ポリＡ(Goldman, L. A., E. C. Cutrone, S. V. Kotenko, C. D. Krause, J. A. Langer. 1996. Modifications of vectors pEF-BOS, pcDNA1 and pcDNA3 result in improved convenience and expression. BioTechniques 21:1013.)を含む3.7SPC/SV40ベクター（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, August 6, 2002 vol. 99 no. 16 10482-10487）を、EcoRI［New England Biolabs (MA, USA)］で切り出してEcoRIサイトに組み込む方法によってサブクローニングし、SPC-IL-18SPとする（図１３）。

SPC-IL-18SP をNdeI［New England Biolabs (MA, USA)］とNotI［New England Biolabs (MA, USA)］の制限酵素部位で３７℃、２時間以上で（New England Biolabs (MA, USA)のプロトコールに準ずる)切断することによって、直鎖状ＤＮＡフラグメントを得ることができる。

組換え遺伝子をマウスに導入する方法としては、公知の遺伝子導入方法を用いることができるが、例えば、マウスの受精卵に上述のようにして得られた組換え遺伝子（上述の直鎖状ＤＮＡフラグメント）をマイクロインジェクション法(注入時期：前核期受精卵，注入箇所：雄生前核)にて注入し、代理母マウスの卵管に挿入して作製したSPC-IL-18TGマウス(founder)を得る。組換え遺伝子注入の確認は、生まれたマウス（ファウンダー）の尾部等の組織からDNAesay kit [Qiagen, Germany]等を用いて、DNAを抽出し、PCRで確認できる。雄性の野生型のマウス（代理母と同系で無いもの）と掛け合わせ、その子孫（雌雄どちらでも可。Ｆ２，Ｆ３，・・・・を含む）のうち、IL-18を発現しているものを選別することで、組換え遺伝子導入の作製を行うことができる。選別する方法としては、尾部等の組織のゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲ分析、血清中の成熟IL-18のＥＬＩＳＡ分析，肺や心臓，肝臓等における、成熟IL-18のウェスタンブロッティング分析等が挙げられる（上記文献(1)，(2)参照）。

肺特異的に発現するプロモーターの制御下にあるIL-18遺伝子の導入量は、マウスの種類や発症させたいタイミング、発症させたい程度等にて合わせて、適宜調節することができ、特に限定されるものではないが、一般的には、マウスの肺で1 ng/lung以上（50 ng/kg 体重），10 ng/lung以下（500ng/kg体重）が適当と考えられる。

動物モデルにおけるIL-18発現が、例えばマウス血清中の成熟IL-18のＥＬＩＳＡ分析で1 ng/mL以上、10ng/mL以下となる程度に導入することが好ましい。導入量が多いほど、上記の標的とする肺疾患や循環器疾患の殆どが発症する傾向にある。本モデル動物においては、同時に様々な疾患が発症し得るが、例えば肺疾患と心疾患では、病巣が異なるので、スクリーニングに当たって、いずれの部位に効く薬かは、区別可能である。また、疾患部位が同じ病気の場合でも、それぞれ特徴となる病態が異なるため、いずれの疾患の薬剤候補となり得るかは個々の臓器を解析することで判断可能である。

SPC-IL-18導入から発症までの時期は、特に限定されるものではないが、早ければ４週齢前後から発症し始め、５週齢前後で殆どが発症し、高齢になるほど強い症状が現れる傾向にある。早い段階では、発症する疾患の種類やその出方に差があるが、５から８週齢前後で、上記の肺疾患や循環器疾患の殆どが発症する傾向にある。

上記のようにして得られた疾患動物モデルは、慢性閉塞性肺疾患動物モデルとして有用であり、この動物モデルを用いることによって、この疾患の予防又は治療剤のスクリーニングが可能となる。

［試験管レベルでのＴＲＸによる、プロテアーゼ抑制確認試験］
ＴＲＸによる、カスパーゼ−１，ＭＭＰ−１,ＭＭＰ−９の抑制効果を調べた。
アッセイ方法：

〈カスパーゼ−１〉
Thornberry NA (Nature 356(30):768-775,1992)に準じて行った。つまりリコンビナントヒトカスパーゼ−１を用い基質は20μM Ac-YVAD-AMC、37℃3時間反応させＡＭＣ（7-amino-4-methylcoumarin）の蛍光量で2回定量した(MDS Pharma Services Japan, 京都に測定委託) 。

〈ＭＭＰ−１,９〉
リコンビナントＭＭＰ−１（ペプチド研究所,京都）, リコンビナントＭＭＰ−９（ペプチド研究所,京都）を用い、基質は50μM P3163-v（ペプチド研究所,京都）：MOCAc‐Pro‐Leu-Gly‐Leu-A₂pr(DNP)-Ala-Arg-NH₂を用い、37℃で2時間反応させ、蛍光量で2回定量した。

〈試験結果〉
精製ＴＲＸ 100μg/mLの存在下で、カスパーゼ−１は２１％抑制された。また精製ＴＲＸ 100 μg/mLの存在下でＭＭＰ−１,ＭＭＰ−９がそれぞれ４７％、７６％抑制された。このことから、ＴＲＸには、システインプロテアーゼやメタロプロテアーゼ等のプロテアーゼの抑制効果があることが確認された。

［伝統的動物モデルを用いた、ＴＲＸのCOPD抑制効果実験］
上述した、エラスターゼを用いた伝統的なCOPD動物モデルを使って、剤の効果を確認する実験を行った。８週齢C57BL/6Nマウスを下記１〜４の各群について５匹ずつ用いた。

（第１群）ＤＡＹ１に、無菌のPBS 100μＬをシリンジで気管内投与した群（参考例：controlマウス）。
（第２群）ＤＡＹ１に、無菌のPBS 100μＬに懸濁したブタエラスターゼ(SIGMA社製、0.3U)をシリンジで気管内投与した群（比較例１：病態マウスモデル１）。
（第３群）ＤＡＹ０からＤＡＹ２０まで隔日で、ＴＲＸ投与のコントロールとして無菌のPBS 100μＬに懸濁した卵白アルブミン（ＯＶＡ，SIGMA社製、40μg）を腹腔内投与し、無菌のPBS 100μＬに懸濁したブタエラスターゼ(SIGMA社製カタログ番号E1250、0.3U)を、ＤＡＹ１にシリンジで気管内投与した群（比較例２：病態マウスモデル２）。
（第４群）ＤＡＹ０からＤＡＹ２０まで隔日で、無菌のPBS 100μＬに懸濁したヒトリコンビナントＴＲＸ（40μg）を腹腔内投与し、無菌のPBS 100μＬに懸濁したブタエラスターゼ(SIGMA社製カタログ番号E1250、0.3U)をＤＡＹ１にシリンジで気管内投与した群（実施例２：病因＋治療剤投与マウス）。

すべてのマウスはＤＡＹ２１で回収した。２０％中和ホルマリンを気管支から１５cmH₂O圧をかけてマウス肺を還流固定。肺パラフィン切片はＨＥ染色した。顕微鏡画像は顕微鏡用デジタルカメラＤＸＭ１２００（ＮＩＫＯＮ製）で取り込み、解析ソフトはＡＣＴ−１（ＮＩＫＯＮ製）、Photoshop (Ａｄｏｂｅ社製)を用いた。具体的には各群からランダムに肺組織（スライド）を選ぶ。一匹のマウスの両肺から左右の上肺野、中肺野と下肺野の計６断面のＨＥ染色スライドから各断面５視野の画像をＡＣＴ−１で取り込む。Photoshop (Ａｄｏｂｅ社製)を用いて各視野で３００マイクロメーターのグリッド（線）を４つ引く。肺胞がこのグリッドを横切った数を数える。例えば３回横切ると平均の肺胞の長さ（mean linear intercept: Lm）は３００マイクロメーター/3=1００マイクロメーターである。一匹のマウスのＬｍを６断面ｘ５視野ｘ４グリッド（線）＝１２０グリッド（線）から求め各群の平均及びWelchのt検定で統計解析を行った。

組織学的に（第１群：controlマウス）には肺に有意な変化はなかった（図１）。

一方、（第２群：病態マウスモデル１）には著明に肺胞腔が広がり、実験病理学的COPDが出来た（図２）。

また、（第３群：病態マウスモデル２）には、著明に肺胞腔が広がり、実験病理学的COPDが出来るが、第２群と差がなかった。つまりレドックス蛋白でないコントロール蛋白であるＯＶＡの腹腔内投与ではCOPDの発症は抑制されないことが判明した（図３）。

（第４群：病因＋治療剤投与マウス）では、肺に変化は少なく、ＴＲＸが実験病理学的COPDを強力に抑制することが分かった(図４)。

そこで、これらＨＥ染色スライドを用いて画像解析を行い、Lmを求めたところ、第１群, 第２群，第３群，第４群のLmの平均はそれぞれ31.7, 69.0, 82.0, 30.4マイクロメーターだった（図５）。

Lmを計測すると、第４群（病因＋治療剤投与マウス）は、第２群（病態マウスモデル１, p=2.62x10e-24）、第３群(病態マウスモデル２, p=4.00x10e-20)に比べCOPDを統計学的有意に抑制した。

一方、第４群（病因＋治療剤投与マウス）は、第１群（controlマウス）に比べLmに有意差はなかった。

実験の結果、この系を用いてレドックス活性蛋白質であってチオレドキシンファミリーに属するポリペプチド類であるＴＲＸが、実験病理学的COPDを強力にかつ統計学的有意に抑制することが確認された。

また、レドックス活性蛋白質が、エラスターゼによって誘導される肺気腫動物モデルを抑制することから、このレドックス活性蛋白質が、エラスターゼ阻害剤として機能していることが確認された。つまり、実施例１の結果と考え併せると、レドックス活性蛋白質、又はこれらをコードする遺伝子が、エラスターゼに代表されるプロテアーゼを阻害する効果を有することは明らかである。

［新規動物モデルを用いた、ＴＲＸの実験病理学的COPD抑制効果実験］
上述した新規COPD動物モデルを使って、剤の効果を確認する実験を行った。
上述の様にして作製した、7から8週齢のSPC-IL-18TGマウス（各群5匹）に、隔日で0.1mLの無菌のリン酸緩衝液（PBS）（コントロール）もしくは0.2mLに溶解したリコンビナントヒトＴＲＸ400μg/mL（つまり一匹あたり40μg）を腹くう内投与した。21日後にマウス肺を回収し、肺組織をＨＥ染色した。

結果を図６，７に示す。その結果、PBS を投与したコントロール（図６）では、実験病理学的COPDが発症していたのに対し、ＴＲＸ投与群（図７）では、COPDは見られなかった。

上記のマウスモデルは、肺特異的にIL-18を発生させることにより、疾患を発症させるものである。そして、ＴＲＸにはIL-18阻害作用が知られており、これらのことから、IL-18のシグナルを抑制すると、COPDを初めとする、上記のマウスモデルの呈する疾患の予防又は治療が可能となることは明らかである。

参考例

［COPD患者の病変局所におけるTRXの強発現］
COPD患者10人の外科手術で得た組織及び交通事故等で亡くなった人等の6人の肺組織を、ホルマリン固定しパラフィン切片を作製した。抗ヒトTRX抗体(Serotec製)で免疫組織染色を行った。免疫組織染色は以下の論文の方法に従った。
Kitasato, Y., Hoshino, T., Okamoto, M., Kato, S., Koda, Y., Nagata, N., Kinoshita, M., Koga, H., Yoon, D. Y., Asao, H., Ohmoto, H., Koga, T., Rikimaru, T., and Aizawa, H. Enhanced expression of interleukin-18 and its receptor in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol, 31: 619-625, 2004.

その結果を、図８〜１１に示す。健常者の肺胞上皮には、ＴＲＸは、弱くしか発現していなかった（図８，９）。
これに対して、COPD患者の肺病変部には、ＴＲＸが強く発現していた。特に浸潤炎症細胞、肺胞上皮や気管支の繊維芽細胞に強く発現していることが確認された（図１０，１１）。

本発明のチオレドキシン又はその遺伝子を含むプロテアーゼ阻害剤は、COPDを強力に抑制すること，及び免疫不全症候群の治療の為に、単独であるいはHAART療法等のカクテル療法に用いられるプロテアーゼ阻害剤として使用可能である。

実施例２の第１群（controlマウス）の肺組織の顕微鏡画像である（ＨＥ染色，×４０倍）実施例２の第２群（病態マウスモデル１）の肺組織の顕微鏡画像である（ＨＥ染色，×４０倍）実施例２の第３群（病態マウスモデル２）の肺組織の顕微鏡画像である（ＨＥ染色，×４０倍）実施例２の第４群（病因＋治療剤投与マウス）の肺組織の顕微鏡画像である（ＨＥ染色，×４０倍）実施例２の第１〜４群のマウスの、平均の肺胞の長さ（mean linear intercept: Lm）を表す図である。実施例３のSPC-IL-18TGマウスに、PBSを投与した群（コントロール）の肺組織の顕微鏡画像である(ＨＥ染色，×４０倍）実施例３のSPC-IL-18TGマウスに、TRXを投与した群の肺組織の顕微鏡画像である(ＨＥ染色，×４０倍)。参考例の、健常人の肺組織における、ＴＲＸの発現量を示す、免疫組織染色の結果を示す図である（免疫組織染色，×４０倍）。参考例の、健常人の肺組織における、ＴＲＸの発現量を示す、免疫組織染色の結果を示す図である（免疫組織染色，×２００倍）。参考例の、COPD患者の肺組織における、ＴＲＸの発現量を示す、免疫組織染色の結果を示す図である（免疫組織染色，×４０倍）。参考例の、COPD患者の肺組織における、ＴＲＸの発現量を示す、免疫組織染色の結果を示す図である（免疫組織染色，×２００倍）。シグナルペプチドを持つ成熟IL-18ｃＤＮＡのシークエンス（DNA配列）である。本発明で用いられる組換え遺伝子SPC-IL-18SPである。

Claims

下記（１）乃至（４）から選択される、少なくとも一種以上を有効成分として含み、カスパーゼ−１の阻害作用を有することを特徴とするプロテアーゼ阻害剤。
（１）チオレドキシン
（２）チオレドキシンのアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失，置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなりかつチオレドキシンと同等の活性を有するタンパク質
（３）（１）をコードする遺伝子
（４）（２）をコードする遺伝子
前記プロテアーゼ阻害剤が、慢性閉塞性肺疾患の治療又は予防のために使用されることを特徴とする請求項１に記載のプロテアーゼ阻害剤。