JPWO2004016784A1 - プロテアーゼ阻害剤 - Google Patents
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Abstract
SCCA1、SCCA2、およびそれらの変異体からなる群から選択されたいずれかの蛋白質を有効成分として含む、プロテアーゼ阻害剤が提供された。本発明のプロテアーゼ阻害剤は、ダニアレルゲンである、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害作用を有し、合成ペプチドを基質とした場合のみならず、Der p1がT細胞表層のCD25抗原を切断する活性をも阻害する作用を有する。したがって、本発明のプロテアーゼ阻害剤は、ダニアレルギーの治療に有用である。本発明はまた、SCCA1、あるいはSCCA2の発現や活性レベルを指標とするスクリーニング方法を提供する。本発明によってスクリーニングされた化合物は、ダニアレルギーの治療薬として有用である。
Description
本発明は、SCCA、これをコードするポリヌクレオチド、またはSCCAを標的とする化合物を有効成分とするプロテアーゼ阻害剤またはダニアレルギー性疾患の治療薬に関する。
アレルギー性疾患の患者の増加は、世界的な問題となっている。アレルギー性疾患は、特定のアレルゲンに対する異常な免疫応答が原因となって生じる一群の疾患である。たとえば、ハウスダストダニの糞便物(house dust mite fecal pellets;HDMFP)等のアレルゲンに感作されることが、次のようなアレルギー性疾患の発症における主要な危険因子であることは広く知られている。
▲1▼気管支喘息:Tovey ER et al.,Nature,289:592−593,1981、Sporik R et al.,N Engl J Med,323:502−507,1990、Platts−Mills TA et al.,J Allergy Clin Immunol,89:1046−1060,1992
▲2▼鼻炎:Korsgaard J et al,Allergy,46:14−18,1991
▲3▼アトピー性皮膚炎:Tupker RA et al.,Allergy,53(suppl 48):92−96,1998、Friedmann PS,Clin Exp Allergy,29:869−872,1999
吸入されたHDMFPは気道上皮細胞と接触し、水分を吸収して、アレルゲンとなる内容物を粘膜上皮上に排出する。そのアレルゲンは気道上皮細胞を経由して樹状突起細胞などの抗原提示細胞に貪食される。そして抗原提示細胞はアレルゲン由来のペプチドをT細胞に提示する(Robinson C et al.,Clin Exp Allergy,27:10−21,1997)。その結果、T細胞はTh2型に分化する(Yssel H et al.,J Immunol,148:738−745,1992)。Th2型のT細胞は、IL−4、IL−5、IL−13といったアレルギー性疾患の病態形成に重要なサイトカインを産生する。気道組織以外のアレルギー性疾患病変部位でも同じような様式でHDMFP由来のアレルゲンは体内に吸収され、免疫機構に認識されていると考えられている。
HDMFPに含まれるアレルゲンのうち、ヤケヒョウダニ由来のDer p1はハウスダストダニに感作されたアレルギー患者の約80%に対してアレルギー反応を引き起こす主要な構成成分である(Sporik R et al.,N Engl J Med,323:502−507,1990、Platts−Mills TA et al.,J Allergy Clin Immunol,80:755−775,1987、Sreedharan SK et al.,Biochem J,316:777−786,1996)。システインプロテアーゼの一種であるDer p1は(Chua K−Y et al.,J Exp Med,167:175−182,1988)、次のような蛋白質を切断して炎症反応を引き起こすことが知られている。
▲1▼細胞間接着機構:Wan H et al.,J Clin Invest,104:123−133,1999
▲2▼低親和性IgE受容体(CD23):Hewitt CRA,et al.J Exp Med,182:1537−1544,1995
▲3▼α1−アンチトリプシン:Kalsheker NA et al.,Biochem Biophys Res Commun,221:59−61,1996
このため、Der p1のシステインプロテアーゼ活性を阻害できれば、炎症反応を抑制し、アレルギー性疾患の発症を防ぐことが可能になると考えられる。しかし、現時点でDer p1のシステインプロテアーゼ活性を阻害するような内因性分子の存在は知られていない。
▲1▼気管支喘息:Tovey ER et al.,Nature,289:592−593,1981、Sporik R et al.,N Engl J Med,323:502−507,1990、Platts−Mills TA et al.,J Allergy Clin Immunol,89:1046−1060,1992
▲2▼鼻炎:Korsgaard J et al,Allergy,46:14−18,1991
▲3▼アトピー性皮膚炎:Tupker RA et al.,Allergy,53(suppl 48):92−96,1998、Friedmann PS,Clin Exp Allergy,29:869−872,1999
吸入されたHDMFPは気道上皮細胞と接触し、水分を吸収して、アレルゲンとなる内容物を粘膜上皮上に排出する。そのアレルゲンは気道上皮細胞を経由して樹状突起細胞などの抗原提示細胞に貪食される。そして抗原提示細胞はアレルゲン由来のペプチドをT細胞に提示する(Robinson C et al.,Clin Exp Allergy,27:10−21,1997)。その結果、T細胞はTh2型に分化する(Yssel H et al.,J Immunol,148:738−745,1992)。Th2型のT細胞は、IL−4、IL−5、IL−13といったアレルギー性疾患の病態形成に重要なサイトカインを産生する。気道組織以外のアレルギー性疾患病変部位でも同じような様式でHDMFP由来のアレルゲンは体内に吸収され、免疫機構に認識されていると考えられている。
HDMFPに含まれるアレルゲンのうち、ヤケヒョウダニ由来のDer p1はハウスダストダニに感作されたアレルギー患者の約80%に対してアレルギー反応を引き起こす主要な構成成分である(Sporik R et al.,N Engl J Med,323:502−507,1990、Platts−Mills TA et al.,J Allergy Clin Immunol,80:755−775,1987、Sreedharan SK et al.,Biochem J,316:777−786,1996)。システインプロテアーゼの一種であるDer p1は(Chua K−Y et al.,J Exp Med,167:175−182,1988)、次のような蛋白質を切断して炎症反応を引き起こすことが知られている。
▲1▼細胞間接着機構:Wan H et al.,J Clin Invest,104:123−133,1999
▲2▼低親和性IgE受容体(CD23):Hewitt CRA,et al.J Exp Med,182:1537−1544,1995
▲3▼α1−アンチトリプシン:Kalsheker NA et al.,Biochem Biophys Res Commun,221:59−61,1996
このため、Der p1のシステインプロテアーゼ活性を阻害できれば、炎症反応を抑制し、アレルギー性疾患の発症を防ぐことが可能になると考えられる。しかし、現時点でDer p1のシステインプロテアーゼ活性を阻害するような内因性分子の存在は知られていない。
本発明は、Der P1に代表されるプロテアーゼに対して阻害作用を有する蛋白質の提供を課題とする。あるいは本発明は、該蛋白質を介したアレルギー性疾患の治療に有用な化合物の提供を課題とする。
本発明者は、気管支上皮細胞をインターロイキン4(IL−4)あるいはIL−13で刺激して、誘導されてくる遺伝子をDNAチップを用いて探索した。その結果、squamous cell carcinoma antigen 1(SCCA1)とSCCA2を、誘導遺伝子として同定した。さらに、本発明者は、気管支喘息患者、特に増悪期の血中においてSCCAレベルが上昇しており、同疾患の診断マーカーに使えることを示している(Yuyama N et al.,Cytokine,Vol.19,No.6:287−296,2002、特願2001−239857、PCT/JP02/07918)。もともとSCCA1とSCCA2は子宮頸部扁平上皮癌細胞に発現している遺伝子として同定された。SCCA1とSCCA2は種々の扁平上皮癌細胞にて発現が亢進しており、腫瘍マーカーとして用いられている。
SCCA1とSCCA2のアミノ酸配列は相同性が高く(92%)、いずれもセルピン(Serpin)と呼ばれるプロテアーゼインヒビターに属している(Kato H,Anticancer Res,16:2149−2153,1996)。しかし、SCCA1はカテプシンK、S、Lといったシステインプロテアーゼの活性を阻害するのに対して、SCCA2はカテプシンG、マスト細胞キマーゼといったセリンプロテアーゼを阻害する。そのため同じプロテアーゼインヒビターでも、両者の性質は異なると考えられていた(Cataltepe S et al,J Histochem Cytochem 48:113−122,2000、Silverman GA et al.,J Biol Chem,276:33293−33296,2001)。しかし、最近になって、マウスのカウンターパートであるSepin SQN−5がセリンとシステインプロテアーゼ両方を阻害すると報告された(Al−Khunaizi M.et al.,Biochemistry,41:3189−3199,2002)。
本発明者は、Der p1がカテプシンK、S、Lと構造が類似していることに着目した。さらに本発明者は、気管支喘息患者におけるSCCA1あるいはSCCA2の発現の亢進が、ダニアレルゲンと関連しているのではないかと考えた。これらの知見に基づいて、SCCA1あるいはSCCA2がDer p1の酵素活性に与える影響を解析した。その結果、SCCA1あるいはSCCA2がDer p1の酵素活性を阻害する内因性の分子であることを見出した。
さらに、本発明者らは、自然の蛋白質そのものを基質とした場合のDer p1の活性に及ぼすSCCAの作用について解析した。Der p1がT細胞表層に発現しているCD25抗原を切断することはすでに知られている(Schulz O et al.,J Exp Med.Jan 19;187(2):271−5,1998、Ghaemmaghami AM et al.,Eur J Immunol.Apr;31(4):1211−6,2001.)。上記の論文にも報告されているように、T細胞表層に発現しているCD25抗原はIL−2受容体を構成するIL−2レセプターα鎖であり、Der p1による切断でその機能が失われるとT細胞は増殖能を減少させるとともに、2型サイトカインのプロファイルに傾く。これがダニ抗原であるDer p1によりアレルギーを惹起しやすい原因の一つになっていると考えられている。本発明において発明者らはSCCAはDer p1がT細胞表層のCD25抗原を切断する活性をも阻害することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下に示すプロテアーゼ阻害剤、その用途に関する。あるいは本発明は、これらのプロテアーゼ阻害作用を有する蛋白質の発現や活性を指標とする、アレルギー性疾患の治療剤のスクリーニング方法に関する。
(1) 下記(a)または(b)のいずれかを有効成分として含む、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤。
(a)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体
(b)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド
(2) 有効成分が、配列番号:4(SCCA2)に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(1)に記載の阻害剤。
(3) 有効成分が、配列番号:4(SCCA2)に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(1)に記載の阻害剤。
(4) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(1)に記載の阻害剤。
(5) 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質。
(6) 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、そして357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
(7) 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
(8) (5)から(7)のいずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(9) 下記(a)または(b)のいずれかを有効成分として含む、ダニアレルギー性疾患の治療剤。
(a)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体
(b)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド
(10) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(9)に記載の治療剤。
(11) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(9)に記載の治療剤。
(12) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(9)に記載の治療剤。
(13) SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物を有効成分として含む、ダニアレルギー性疾患の治療剤。
(14) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)被験動物に候補化合物を投与する工程、
(2)被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
(3)候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
(15) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)被験細胞に候補化合物を接触させる工程
(2)指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(3)候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
(16) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
(17) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
(2)前記蛋白質の活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
(18) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)候補物質存在下で、指標遺伝子によってコードされる蛋白質とDer p1を接触させる工程、
(2)前記蛋白質とDer p1との結合活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質とDer p1との結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
(19) SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されており、ダニアレルギー性疾患の症状を示す非ヒト高等動物。
(20) SCCA遺伝子の遺伝子対の一方または双方の遺伝子が改変していることを特徴とする(19)に記載の非ヒト高等動物。
(21) 非ヒト高等動物がげっ歯類である、(19)または(20)に記載の非ヒト高等動物。
(22) げっ歯類がマウスである、(21)に記載の非ヒト高等動物。
(23) (19)〜(22)のいずれかに記載の非ヒト高等動物に分化させることが可能な、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている非ヒト高等動物細胞。
(24) 以下の(a)〜(c)の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
(a)被験化合物を(19)〜(22)のいずれかに記載の非ヒト高等動物に投与する工程
(b)該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該症状または該変化を改善させる化合物を選択する工程
(25) (14)〜(18)及び(24)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、ダニアレルギー性疾患の治療薬。
(26) 指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも15塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドを含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCAと機能的に同等な遺伝子であるキット。
(27) 指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCAと機能的に同等な遺伝子であるキット。
SCCA1およびSCCA2の遺伝子は、いずれもその存在が明らかにされている遺伝子である。SCCA1およびSCCA2は、いずれも扁平上皮ガン抗原をコードする遺伝子として報告された、OVA familyに属する45KDの遺伝子である。exonでの塩基配列では98%のホモロジーを持ち、アミノ酸レベルでは92%のホモロジーを持つ。両者の塩基配列の相違はPCR等で識別することができる。ゲノムにおいては、いずれの遺伝子も18q21.3にマッピングされる。SCCA1およびSCCA2には、これまでに以下のような有用性が示されている。
SCCA1;squamous cell carcinoma antigen 1(cystein protease inhibitor):
扁平上皮がんの診断マーカーとして使用(DE4139418−A)。
SCCA2;squamous cell carcinoma antigen 2(serine protease inhibitor):
診断マーカーの他、細胞増殖やアポトーシスの調節、あるいはアゴニストのガンや乾癬の治療への応用(WO9714425−A1)。
さらに、いずれの遺伝子もIL−4やIL−13に応答して気道上皮細胞で発現が増強することも明らかにされている(Wang et al.,Immunology 2000,Seattle,May 12−16,2000)。しかし、これらの遺伝子がDer p1のプロテアーゼ阻害作用を有することは知られていない。
なお、本明細書における「SCCA」には、SCCA1、SCCA2およびこれらとファミリーを形成する蛋白質が含まれ、ヒトのみならず、他種におけるホモログをも含む。
本明細書において、アレルギー性疾患(allergic disease)とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因(allergic diathesis)とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本明細書において、ダニアレルギー性疾患の指標とすることができる遺伝子および蛋白質をそれぞれ指標遺伝子および指標蛋白質と言う。
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドであって、複数の塩基または塩基対からなる重合体を意味する。ポリヌクレオチドには、一本鎖型および二本鎖型のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾された塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。
本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸からなる重合体を意味する。従って、オリゴペプチドおよび蛋白質もまた、ポリペプチドの概念に含まれる。ポリペプチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような蛋白質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などが含まれる。
本明細書において「単離」とは、本来の環境(たとえば自然に発生するのであればその自然環境)から取り出された物質(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)を指し、その自然状態から「人の手によって」変えられたものである。「単離」とは、対象化合物に実質的に富む試料中に存在する化合物および/または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。ここで「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも60%、好ましくは75%、および最も好ましくは90%含まない化合物(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)を指す。
本明細書において用いられる「変異」とは、アミノ酸配列におけるアミノ酸の変化または塩基配列における塩基の変化(すなわち単一または複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換、欠失、付加または挿入)を指す。従って、本明細書において用いられる「変異体」は、一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列または一つ以上の塩基が変化している塩基配列を指す。この変異体の塩基配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。変異体はアレリック変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保存的変化を有しうる。よりまれに、変異体は、非保存的置換を有しうる。生物学的または免疫学的活性を阻害することなく、いずれの、およびどれほど多くのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失するかを決定する手引きは、当技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えばDNAスター・ソフトウェアを用いて発見することができる。
「欠失」はその中で1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化である。
「挿入」または「付加」は、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれアミノ酸またはヌクレオチド残基1つ以上が付加されたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
「置換」とは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、アミノ酸またはヌクレオチド1つ以上がそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドに入替えられたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
本明細書において用いられる「ハイブリダイズ」とは、核酸鎖が塩基対形成を通じて相補鎖と結合するプロセスを意味する。
本明細書で用いられる「治療」とは、概して、薬理学的なおよび/または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書で用いられる「治療」という用語は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患の素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させることなどもこの用語に含まれる。
本発明は、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤を提供する。本発明者は、SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体がDer p1の酵素活性に与える影響を解析した結果、これらがDer p1の酵素活性を阻害する内因性の分子であることを見出した。従って、SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体、さらにはこれらをコードするポリヌクレオチドは、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤となる。
本発明の薬剤における「SCCA」は、天然の蛋白質であってもよく、また遺伝子組み換え技術を利用して調製された組換え蛋白質であってもよい。本発明の阻害剤における「SCCAをコードするポリヌクレオチド」は、染色体DNAであっても、cDNAであっても、化学合成DNAであってもよい。
本発明の阻害剤における「SCCA」や「SCCAをコードするポリヌクレオチド」は、その由来する生物に特に制限はない。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来(例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌなど)であり、最も好ましくはヒト由来である。
本発明者が同定した、ヒト由来のSCCA1 cDNAの塩基配列を配列番号:1に、ヒト由来のSCCA1のアミノ酸配列を配列番号:2に示し、ヒト由来のSCCA2 cDNAの塩基配列を配列番号:3に、ヒト由来のSCCA2のアミノ酸配列を配列番号:4に示した。
ヒト及びそれ以外の生物に由来するSCCA、その部分ペプチドやその変異体は、当業者に汎用されている技術を利用して調製することができる。例えば、天然の蛋白質は、例えばSCCAが発現していると考えられる組織の抽出液に対し、SCCAに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組み換え蛋白質であれば、本発明のSCCA、その部分ペプチドやその変異体をコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。また、本発明の変異体をグルタチオンS−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞(例えば、動物細胞や大腸菌など)内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
ヒト及びそれ以外の生物に由来するSCCA、その部分ペプチドやその変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、当業者に汎用されている技術を利用して調製することができる。例えば、SCCAを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、SCCA cDNAの配列(配列番号:1または3)の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより、cDNAを調製できる。cDNAライブラリーは、例えば、文献(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))に記載の方法により調製してもよいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。また、SCCAを発現している細胞よりRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、SCCA cDNAの配列(配列番号:1または3)に基づいて合成されたオリゴDNAをプライマーとしてPCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを増幅することも可能である。ゲノムDNAライブラリーを利用したハイブリダイゼーションやゲノムDNAを鋳型としたPCRにより、SCCA、その部分ペプチドやその変異体をコードするゲノムDNAを調製することもできる。
このような調製において選択されるハイブリダイゼーションの条件としては、通常「1xSSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1%SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1%SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるDNAがコードするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40%以上、好ましくは60%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは少なくとも95%以上、さらに好ましくは少なくとも97%以上(例えば、98〜99%)の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 87:2264−2268,1990、Proc.Natl.Acad.Sei.USA 90:5873−5877,1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403−410,1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
なお、DNAの調製のためのmRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.and Sacchi,N.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia社)等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia社)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成するには、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社)等を利用することができる。得られたcDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明の阻害剤においては、Der p1のプロテアーゼ活性を阻害する限り、「SCCA」や「SCCAをコードするポリヌクレオチド」の配列が改変された変異体を用いることができる。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Kunkel法(Kunkel,T.A.et al.,Methods Enzymol.154,367−382(1987))、ダブルプライマー法(Zoller,M.J.and Smith,M.,Methods Enzymol.154,329−350(1987))、カセット変異法(Wells,et al.,Gene 34,315−23(1985))、メガプライマー法(Sarkar,G.and Sommer,S.S.,Biotechniques 8,404−407(1990))などが知られている。
このような変異体において改変されるアミノ酸残基数や改変部位は、変異体がDer p1のプロテアーゼ活性を阻害する限り制限はない。改変が置換の場合には、改変されるアミノ酸残基数は一般的には30残基以内(例えば、20、15、12、10、8、5残基以内)であろう。改変が欠失の場合には、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害に重要なSCCAの反応部位ループ以外の領域は、適宜欠失させることが考えられる。従って、欠失させるアミノ酸残基数は、例えば、350から370残基でありうる。一般的には、300残基以内(例えば、250、200、150、100、50、30、10残基以内)であろう。
改変が付加や挿入の場合には、改変されるアミノ酸残基数は、特に上限はない。SCCAに付加や挿入させるポリペプチドとしては、例えば、タグのような数残基の短いペプチドから蛋白質のような長いポリペプチドまで任意のポリペプチドが挙げられる。具体的には、Hisタグ、HAタグ、GFP、マルトース結合蛋白質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)などが挙げられる。また、リーダー配列、分泌シグナル、プレ蛋白質またはプロ蛋白質の配列などが挙げられるが、それらに制限されない。人体へ投与を行う場合には、低分子量であると扱いやすい。
本発明者はSCCAの変異体を用いたさらに詳細な解析を行い、SCCA2の反応部位ループのアミノ酸部位をSCCA1の反応部位ループのアミノ酸部位で置換した変異体を作製したところ、353番目のグルタミン酸をグリシンに置換した変異体は、Der p1との混合比が、I/E=1ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍、Der p1のシステインプロテアーゼ活性を阻害する活性が上昇した。また、356、357番目のアミノ酸残基であるセリン、プロリンをSCCA1型のプロリン、トレオニンに置換したところ、I/E=1ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍阻害活性が上昇することが判明した。さらに、353、356、357番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、セリン、プロリンをSCCA1型のグリシン、プロリン、トレオニンに置換したところ、SCCA2野生型のときよりI/E=1で94%のDer p1のプロテアーゼ活性阻害が証明された。また、これら3つの置換を有する反応部位ループの13残基のペプチドが、I/E比1000でDer p1の酵素活性を50%阻害した。
これら実験事実から、SCCAの変異体としては、好ましくは配列番号:4に記載のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、または配列番号:4に示されるSCCA2の構造類似体におけるこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体である。より好ましくは、配列番号:4に記載のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの置換、356位のセリンのプロリンへの置換、および357位のプロリンのトレオニンへの置換の少なくとも1つの置換がされた変異体である。中でも特に好ましい変異体は、配列番号:4に記載のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの置換、356位のセリンのプロリンへの置換および357位のプロリンのトレオニンへの置換の3つの置換を含む変異体である。また、これら変異を含むSCCA2の反応部位ループのペプチドも、本発明の変異体の好ましい態様である。
本発明の阻害剤は、試薬および医薬の双方を含む概念である。試薬として用いる場合、有効成分以外に、例えば、後述する医薬の場合と同様、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等とを含んでいてもよい。
一方、医薬として用いる場合において、使用の対象となる疾患としては、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害により患者の症状を改善しうる疾患であれば制限はない。上記SCCAやその変異体、さらにそれらをコードするポリヌクレオチドは、医薬の中でも、ダニアレルギー性疾患の治療剤として特に有用である。ダニアレルギー性疾患の治療剤の有効成分としては、これら以外に、例えば、SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物を用いることもできる。本発明において「機能的に同等な蛋白質」とは、各指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性、即ち、Der p1のプロテアーゼ活性を阻害する活性を備えたSCCA以外の蛋白質である。一般的には、ヒトSCCA蛋白質のアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上(例えば、97%、98%、99%以上)の相同性を有する蛋白質を、ヒトSCCAと機能的に同等な蛋白質として示すことができる。SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物は、後述するスクリーニングにより同定することができる。これら化合物は、天然の化合物であっても人工の化合物であってもよい。
医薬は、有効成分と生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等とを混合することによって製造することができる。医薬として使用する阻害剤は、例えば、経口あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。投与量は、本発明の阻害剤により改善を行う疾患の種類、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なる。通常成人一人あたり、一回につき0.1mgから500mgの範囲で、好ましくは0.5mgから20mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
有効成分が蛋白質の場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。治療用遺伝子の生体への導入には、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。ベクターの導入の手法としては、in vivo、あるいはex vivoで行う方法が公知である。
本発明は、ダニアレルギー性疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供する。Der p1はハウスダストダニに感作されたアレルギー患者の約80%に対してアレルギー反応を引き起こす主要な構成成分であるが(Sporik R et al.,N Engl J Med,323:502−507,1990、Platts−Mills TA et al.,J Allergy Clin Immunol,80:755−775,1987、Sreedharan SK et al.,Biochem J,316:777−786,1996)、本発明者は、SCCAがDer p1への結合により、その酵素活性を阻害することを見出した。従って、SCCA遺伝子やそれと機能的に同等な遺伝子の発現レベルや活性を上昇させることができる化合物や、これら遺伝子がコードする蛋白質とDer p1との結合活性を促進する化合物を選択することによって、ダニアレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して促進的に作用する作用を持つ化合物である。これらスクリーニングに用いる被検候補化合物としては、特に制限はないが、例えば、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明のダニアレルギー性疾患の治療候補化合物のスクリーニング方法は、in vivoで行なうこともin vitroで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、先に指標遺伝子として挙げたSCCAに加え、それらの遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
(1)被験動物に、候補化合物を投与する工程、
(2)被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(3)対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、たとえば、内因性の指標遺伝子の発現が低下している動物、好ましくはダニアレルギーの症状を示す動物を利用することができる。このような動物に薬剤候補化合物を投与し、動物の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。
被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、次のようにして検出することができる。即ち、転写レベルでは、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、RT−PCR法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。RT−PCR法においては、遺伝子の増幅過程においてPCR増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。PCR遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象(DNAもしくはRNAの逆転写産物)にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaqポリメラーゼの5’−3’エクソヌクレアーゼ(exonuclease)活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する(Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276−7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357−362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986−994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995−1001)。PCR増幅モニター法においては、例えば、ABI PRISM7700(PEバイオシステムズ社)を用いることができる。一方、翻訳レベルでは、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ELISA法などを利用することができる。
さらにこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを上昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、平滑筋細胞、角化細胞、鼻粘膜上皮細胞、腸上皮細胞、リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、あるいは好中球等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用点を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化
・指標遺伝子の転写活性の上昇
・指標遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の促進
また、in vitroでのスクリーニングにおいては、例えば、被験細胞に候補化合物を接触させ、これら遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
(1)被験細胞に候補化合物を接触させる工程、
(2)指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(3)対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
本発明における被験細胞としては、特に制限はないが、ヒト肺がん細胞A549(ATCC Acc.No.CCL−185)、ヒト皮膚由来表皮角化細胞HaCaTやヒト気管支上皮細胞BEAS−2B(ATCC Acc.No.CRL−9609)が好適である。これらの細胞は、ATCCより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞に候補化合物を添加する。その後、該細胞における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するmRNAを検出することにより比較することもできる。mRNAによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなmRNA試料の調製工程を実施する。mRNAやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、SCCA、およびこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子である方法に関する。
(1)指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
(3)対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるCAATボックス、TATAボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、CAT(chloramphenicol acetyl transferase)遺伝子、ルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。本発明における指標遺伝子には、既に転写調節領域が明らかにされているものも少なくない。
あるいは本発明における指標遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、BACライブラリー、YACライブラリー等のヒトゲノムDNAライブラリーから、PCRまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該cDNAの配列を含むゲノムDNAクローンを得る。得られたゲノムDNAの配列を基に、本発明で開示したcDNAの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。本発明の指標遺伝子であるSCCA1とSCCA2とは、ゲノム上では同じ領域にマッピングされる遺伝子なので、転写調節領域は共通である。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
in vitroでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCA、およびこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子である方法に関する。
(1)指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
(2)前記蛋白質の活性を測定する工程、および
(3)対照と比較して前記蛋白質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質であるSCCAが、プロテアーゼインヒビター活性を有することは既に述べた。これらの活性を指標として、その活性を促進する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、SCCAの働きの促進を通じて、ダニアレルギー性疾患の改善をすることができる。
in vitroでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質とDer p1との結合活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCA、およびこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子である方法に関する。
(1)候補物質存在下で、指標遺伝子によってコードされる蛋白質とDer p1を接触させる工程、
(2)前記蛋白質とDer p1との結合活性を測定する工程、および
(3)対照と比較して前記蛋白質とDer p1との結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
このようにして得ることができる化合物は、SCCAとDer p1との結合活性を促進し、その結果、SCCAのDer p1に対する阻害活性の増強を通じて、ダニアレルギー性疾患の改善をすることができる。
本発明によるスクリーニング方法においては、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変非ヒト高等動物を利用することも考えられる。このような動物は、ダニアレルギー性疾患のモデル動物になりうるため、このモデル動物においてダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を改善させる化合物を選択することにより、ダニアレルギー性疾患の治療剤の候補化合物をスクリーニングしうる。すなわち、本スクリーニングは、次の工程を含む。
(1)被験化合物を、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変非ヒト高等動物に投与する工程
(2)該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する工程
(3)被験化合物を投与していない場合と比較して、該症状または該変化を改善させる化合物を選択する工程
本方法において「遺伝子の発現を人為的に抑制されている」とは、完全な抑制および部分的な抑制の双方が含まれる。また、遺伝子対の一方の発現が抑制されている場合も含まれる。抑制する方法として、当業者においては一般的に公知の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子改変技術(標的遺伝子部位の組み換えを促進する酵素、例えば、Cre−loxにおけるCre、の導入による条件的遺伝子改変技術も含む)を用いた方法、アンチセンスDNAを用いた方法、または、RNAi技術を用いた方法等が挙げられる。
本方法における「非ヒト高等動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いた遺伝子の発現を人為的に抑制することができる非ヒト高等動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物(例えば、マウスやラットなどのげっ歯類)である。
遺伝子を改変させた動物の作製は、例えば次のようにして行うことができる。まず、標的遺伝子を含むDNA断片をクローニングして、これを基に、内在性の標的遺伝子改変のための相同組み換え用ベクターを構築する。該相同組み換え用ベクターには、標的遺伝子またはその発現制御領域の少なくとも1部を欠失/変異させた核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域にヌクレオチドやポリヌクレオチドが挿入された核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域に他の遺伝子が挿入された核酸配列を含むが、標的遺伝子の活性が失われる核酸配列であれば、前記の欠失/変異部位および挿入部位は限定されない。
挿入される遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子等が挙げられる。また、これらの組み合わせも考えられる。該相同組み換え用ベクターの基本骨格は、特に、制限はなく、pKONeo(レキシコン)等を用いることができる。
構築した相同組み換え用ベクターを、個体へ分化させることが可能な非ヒト哺乳動物細胞(例えば、胚性幹細胞(ES細胞))に導入し、内因性の標的遺伝子との相同組み換えを行うことで、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を作製する。遺伝子対の双方の発現が抑制されている該細胞を作製するには、例えば、高濃度のネオマイシンで細胞を選択する方法で得ることが可能である。相同組み換え用ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、エレクトロポレーション法等を例示することができる。
本方法において個体へ分化させることが可能な動物細胞としてES細胞を用いた場合は、例えば、該細胞を胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製し、偽妊娠させた動物の子宮に移植して産仔を得る。遺伝子改変ES細胞由来の組織を有するキメラ動物を選別できるようにするために、より好適には、作製された個体の外部的特徴(例えば、毛色)が、遺伝子改変ES細胞由来の組織と胚盤胞由来の組織とで異なるように、胚盤胞を選択する。また、遺伝子改変ES細胞由来の生殖組織を有するキメラ動物であるか否かの判定は、一般的には、該キメラ非ヒト哺乳動物と適当な系統の同種非ヒト哺乳動物との交配により得られた仔の毛色で行うが、その他の方法として、例えば、該キメラ非ヒト哺乳動物の生殖細胞から抽出したDNAを鋳型としたPCR反応を行い、挿入された遺伝子の有無を検出する方法を用いることも可能である。
該キメラ動物と適当な系統の同種動物との交配により得られた仔が、ヘテロ接合型遺伝子改変動物であるか否かは、例えば、該動物細胞から抽出したDNAを鋳型とするPCRやサザンハイブリダイゼーションで判定することができる。また、ヘテロ接合型遺伝子改変動物同士の交配により、ホモ接合型遺伝子改変動物を作製することができる。交配により得られた仔が、ホモ接合型遺伝子改変動物であるか否かも上記の判定法に従う。
遺伝子改変動物の作製は、上記の方法に制限されない。例えば、体細胞クローン動物の作製技術に従って遺伝子改変動物を作製することもできる。具体的には、ES細胞以外の体細胞(例えば、皮膚細胞等)を用いて、ES細胞の場合と同様な方法に従って遺伝子改変動物細胞を作製することができる。さらに、該遺伝子改変動物細胞から、体細胞クローン作製技術を応用し、遺伝子改変動物を作製することができる。
このようにして調製した遺伝子改変非ヒト高等動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的に、また注射により行うことができるが、それらに限定されない。被験化合物が蛋白質である場合には、例えば、該蛋白質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、非ヒト高等動物に該遺伝子を導入することも可能である。
この方法においては、次いで、該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する。
本方法においては、次いで、被験化合物を投与していない場合と比較して、これら症状または該生体内の変化を改善させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、ダニアレルギー性疾患の治療剤の候補となる。
SCCA遺伝子の発現を人為的に抑制することができる非ヒト高等動物から調製した細胞は、ダニアレルギー性疾患の治療剤の候補化合物のスクリーニングなどに用いることができる有用な細胞である。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、ダニアレルギー性疾患の治療薬として有用である。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、本発明のキットは、指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含み、さらに指標遺伝子を発現する細胞を含みうる。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも1つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも15塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。ここで「相補鎖」とは、A:T(RNAの場合はU)、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、BLAST等のアルゴリズムにより決定することができる。このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子(またはその相補鎖)の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用いられる。プライマーとして用いる場合、3’側の領域は相補的である必要があるが、5’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブDNAは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・DNAポリメラーゼIを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識(Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press)
・RNAポリメラーゼを用いる転写による標識(Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056)
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに取り込ませる方法(Kricka LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Press)
あるいは、少なくとも1つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体(Milstein C,et al.,1983,Nature 305(5934):537−40)であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインAやプロテインGを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ELISA法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長cDNAによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
本発明者は、気管支上皮細胞をインターロイキン4(IL−4)あるいはIL−13で刺激して、誘導されてくる遺伝子をDNAチップを用いて探索した。その結果、squamous cell carcinoma antigen 1(SCCA1)とSCCA2を、誘導遺伝子として同定した。さらに、本発明者は、気管支喘息患者、特に増悪期の血中においてSCCAレベルが上昇しており、同疾患の診断マーカーに使えることを示している(Yuyama N et al.,Cytokine,Vol.19,No.6:287−296,2002、特願2001−239857、PCT/JP02/07918)。もともとSCCA1とSCCA2は子宮頸部扁平上皮癌細胞に発現している遺伝子として同定された。SCCA1とSCCA2は種々の扁平上皮癌細胞にて発現が亢進しており、腫瘍マーカーとして用いられている。
SCCA1とSCCA2のアミノ酸配列は相同性が高く(92%)、いずれもセルピン(Serpin)と呼ばれるプロテアーゼインヒビターに属している(Kato H,Anticancer Res,16:2149−2153,1996)。しかし、SCCA1はカテプシンK、S、Lといったシステインプロテアーゼの活性を阻害するのに対して、SCCA2はカテプシンG、マスト細胞キマーゼといったセリンプロテアーゼを阻害する。そのため同じプロテアーゼインヒビターでも、両者の性質は異なると考えられていた(Cataltepe S et al,J Histochem Cytochem 48:113−122,2000、Silverman GA et al.,J Biol Chem,276:33293−33296,2001)。しかし、最近になって、マウスのカウンターパートであるSepin SQN−5がセリンとシステインプロテアーゼ両方を阻害すると報告された(Al−Khunaizi M.et al.,Biochemistry,41:3189−3199,2002)。
本発明者は、Der p1がカテプシンK、S、Lと構造が類似していることに着目した。さらに本発明者は、気管支喘息患者におけるSCCA1あるいはSCCA2の発現の亢進が、ダニアレルゲンと関連しているのではないかと考えた。これらの知見に基づいて、SCCA1あるいはSCCA2がDer p1の酵素活性に与える影響を解析した。その結果、SCCA1あるいはSCCA2がDer p1の酵素活性を阻害する内因性の分子であることを見出した。
さらに、本発明者らは、自然の蛋白質そのものを基質とした場合のDer p1の活性に及ぼすSCCAの作用について解析した。Der p1がT細胞表層に発現しているCD25抗原を切断することはすでに知られている(Schulz O et al.,J Exp Med.Jan 19;187(2):271−5,1998、Ghaemmaghami AM et al.,Eur J Immunol.Apr;31(4):1211−6,2001.)。上記の論文にも報告されているように、T細胞表層に発現しているCD25抗原はIL−2受容体を構成するIL−2レセプターα鎖であり、Der p1による切断でその機能が失われるとT細胞は増殖能を減少させるとともに、2型サイトカインのプロファイルに傾く。これがダニ抗原であるDer p1によりアレルギーを惹起しやすい原因の一つになっていると考えられている。本発明において発明者らはSCCAはDer p1がT細胞表層のCD25抗原を切断する活性をも阻害することができることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下に示すプロテアーゼ阻害剤、その用途に関する。あるいは本発明は、これらのプロテアーゼ阻害作用を有する蛋白質の発現や活性を指標とする、アレルギー性疾患の治療剤のスクリーニング方法に関する。
(1) 下記(a)または(b)のいずれかを有効成分として含む、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤。
(a)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体
(b)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド
(2) 有効成分が、配列番号:4(SCCA2)に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(1)に記載の阻害剤。
(3) 有効成分が、配列番号:4(SCCA2)に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(1)に記載の阻害剤。
(4) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(1)に記載の阻害剤。
(5) 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質。
(6) 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、そして357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
(7) 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
(8) (5)から(7)のいずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
(9) 下記(a)または(b)のいずれかを有効成分として含む、ダニアレルギー性疾患の治療剤。
(a)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体
(b)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド
(10) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(9)に記載の治療剤。
(11) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(9)に記載の治療剤。
(12) 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、(9)に記載の治療剤。
(13) SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物を有効成分として含む、ダニアレルギー性疾患の治療剤。
(14) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)被験動物に候補化合物を投与する工程、
(2)被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
(3)候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
(15) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)被験細胞に候補化合物を接触させる工程
(2)指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(3)候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
(16) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
(17) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
(2)前記蛋白質の活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
(18) 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)候補物質存在下で、指標遺伝子によってコードされる蛋白質とDer p1を接触させる工程、
(2)前記蛋白質とDer p1との結合活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質とDer p1との結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
(19) SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されており、ダニアレルギー性疾患の症状を示す非ヒト高等動物。
(20) SCCA遺伝子の遺伝子対の一方または双方の遺伝子が改変していることを特徴とする(19)に記載の非ヒト高等動物。
(21) 非ヒト高等動物がげっ歯類である、(19)または(20)に記載の非ヒト高等動物。
(22) げっ歯類がマウスである、(21)に記載の非ヒト高等動物。
(23) (19)〜(22)のいずれかに記載の非ヒト高等動物に分化させることが可能な、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている非ヒト高等動物細胞。
(24) 以下の(a)〜(c)の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
(a)被験化合物を(19)〜(22)のいずれかに記載の非ヒト高等動物に投与する工程
(b)該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該症状または該変化を改善させる化合物を選択する工程
(25) (14)〜(18)及び(24)のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、ダニアレルギー性疾患の治療薬。
(26) 指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも15塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドを含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCAと機能的に同等な遺伝子であるキット。
(27) 指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCAと機能的に同等な遺伝子であるキット。
SCCA1およびSCCA2の遺伝子は、いずれもその存在が明らかにされている遺伝子である。SCCA1およびSCCA2は、いずれも扁平上皮ガン抗原をコードする遺伝子として報告された、OVA familyに属する45KDの遺伝子である。exonでの塩基配列では98%のホモロジーを持ち、アミノ酸レベルでは92%のホモロジーを持つ。両者の塩基配列の相違はPCR等で識別することができる。ゲノムにおいては、いずれの遺伝子も18q21.3にマッピングされる。SCCA1およびSCCA2には、これまでに以下のような有用性が示されている。
SCCA1;squamous cell carcinoma antigen 1(cystein protease inhibitor):
扁平上皮がんの診断マーカーとして使用(DE4139418−A)。
SCCA2;squamous cell carcinoma antigen 2(serine protease inhibitor):
診断マーカーの他、細胞増殖やアポトーシスの調節、あるいはアゴニストのガンや乾癬の治療への応用(WO9714425−A1)。
さらに、いずれの遺伝子もIL−4やIL−13に応答して気道上皮細胞で発現が増強することも明らかにされている(Wang et al.,Immunology 2000,Seattle,May 12−16,2000)。しかし、これらの遺伝子がDer p1のプロテアーゼ阻害作用を有することは知られていない。
なお、本明細書における「SCCA」には、SCCA1、SCCA2およびこれらとファミリーを形成する蛋白質が含まれ、ヒトのみならず、他種におけるホモログをも含む。
本明細書において、アレルギー性疾患(allergic disease)とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因(allergic diathesis)とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
本明細書において、ダニアレルギー性疾患の指標とすることができる遺伝子および蛋白質をそれぞれ指標遺伝子および指標蛋白質と言う。
本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドであって、複数の塩基または塩基対からなる重合体を意味する。ポリヌクレオチドには、一本鎖型および二本鎖型のDNAを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾された塩基としては、例えば、トリチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基がある。
本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸からなる重合体を意味する。従って、オリゴペプチドおよび蛋白質もまた、ポリペプチドの概念に含まれる。ポリペプチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む意である。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような蛋白質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化などが含まれる。
本明細書において「単離」とは、本来の環境(たとえば自然に発生するのであればその自然環境)から取り出された物質(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)を指し、その自然状態から「人の手によって」変えられたものである。「単離」とは、対象化合物に実質的に富む試料中に存在する化合物および/または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。ここで「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも60%、好ましくは75%、および最も好ましくは90%含まない化合物(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)を指す。
本明細書において用いられる「変異」とは、アミノ酸配列におけるアミノ酸の変化または塩基配列における塩基の変化(すなわち単一または複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換、欠失、付加または挿入)を指す。従って、本明細書において用いられる「変異体」は、一つ以上のアミノ酸が変化しているアミノ酸配列または一つ以上の塩基が変化している塩基配列を指す。この変異体の塩基配列の変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。変異体はアレリック変異体のように天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有する保存的変化を有しうる。よりまれに、変異体は、非保存的置換を有しうる。生物学的または免疫学的活性を阻害することなく、いずれの、およびどれほど多くのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失するかを決定する手引きは、当技術分野において周知のコンピュータープログラム、例えばDNAスター・ソフトウェアを用いて発見することができる。
「欠失」はその中で1つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して存在しない、アミノ酸またはヌクレオチド配列のいずれかの変化である。
「挿入」または「付加」は、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、それぞれアミノ酸またはヌクレオチド残基1つ以上が付加されたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
「置換」とは、天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、アミノ酸またはヌクレオチド1つ以上がそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドに入替えられたアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化である。
本明細書において用いられる「ハイブリダイズ」とは、核酸鎖が塩基対形成を通じて相補鎖と結合するプロセスを意味する。
本明細書で用いられる「治療」とは、概して、薬理学的なおよび/または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患や症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であってもよく、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であっても良い。本明細書で用いられる「治療」という用語は、哺乳類、特にヒトにおける疾患の治療すべてを含んでいる。そしてさらに、疾患の素因があるが未だ発病していると診断されていない被検者の発病の予防、疾患の進行を抑制すること、または疾患を軽減させることなどもこの用語に含まれる。
本発明は、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤を提供する。本発明者は、SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体がDer p1の酵素活性に与える影響を解析した結果、これらがDer p1の酵素活性を阻害する内因性の分子であることを見出した。従って、SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体、さらにはこれらをコードするポリヌクレオチドは、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤となる。
本発明の薬剤における「SCCA」は、天然の蛋白質であってもよく、また遺伝子組み換え技術を利用して調製された組換え蛋白質であってもよい。本発明の阻害剤における「SCCAをコードするポリヌクレオチド」は、染色体DNAであっても、cDNAであっても、化学合成DNAであってもよい。
本発明の阻害剤における「SCCA」や「SCCAをコードするポリヌクレオチド」は、その由来する生物に特に制限はない。ヒトの疾患の治療や予防に用いる場合には、好ましくは哺乳動物由来(例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌなど)であり、最も好ましくはヒト由来である。
本発明者が同定した、ヒト由来のSCCA1 cDNAの塩基配列を配列番号:1に、ヒト由来のSCCA1のアミノ酸配列を配列番号:2に示し、ヒト由来のSCCA2 cDNAの塩基配列を配列番号:3に、ヒト由来のSCCA2のアミノ酸配列を配列番号:4に示した。
ヒト及びそれ以外の生物に由来するSCCA、その部分ペプチドやその変異体は、当業者に汎用されている技術を利用して調製することができる。例えば、天然の蛋白質は、例えばSCCAが発現していると考えられる組織の抽出液に対し、SCCAに対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組み換え蛋白質であれば、本発明のSCCA、その部分ペプチドやその変異体をコードするDNAを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明の変異体に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。また、本発明の変異体をグルタチオンS−トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞(例えば、動物細胞や大腸菌など)内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的の変異体以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
ヒト及びそれ以外の生物に由来するSCCA、その部分ペプチドやその変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、当業者に汎用されている技術を利用して調製することができる。例えば、SCCAを発現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、SCCA cDNAの配列(配列番号:1または3)の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより、cDNAを調製できる。cDNAライブラリーは、例えば、文献(Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))に記載の方法により調製してもよいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。また、SCCAを発現している細胞よりRNAを調製し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、SCCA cDNAの配列(配列番号:1または3)に基づいて合成されたオリゴDNAをプライマーとしてPCR反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを増幅することも可能である。ゲノムDNAライブラリーを利用したハイブリダイゼーションやゲノムDNAを鋳型としたPCRにより、SCCA、その部分ペプチドやその変異体をコードするゲノムDNAを調製することもできる。
このような調製において選択されるハイブリダイゼーションの条件としては、通常「1xSSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1%SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1%SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるDNAがコードするポリペプチドは、通常、本発明者らにより同定されたポリペプチドとアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40%以上、好ましくは60%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは少なくとも95%以上、さらに好ましくは少なくとも97%以上(例えば、98〜99%)の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 87:2264−2268,1990、Proc.Natl.Acad.Sei.USA 90:5873−5877,1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403−410,1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
なお、DNAの調製のためのmRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.and Sacchi,N.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia社)等を使用して全RNAからmRNAを精製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia社)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成するには、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社)等を利用することができる。得られたcDNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明の阻害剤においては、Der p1のプロテアーゼ活性を阻害する限り、「SCCA」や「SCCAをコードするポリヌクレオチド」の配列が改変された変異体を用いることができる。このような変異体は、天然のものでも人工のものでもよい。人工的に変異体を調製するための方法は当業者に公知である。例えば、Kunkel法(Kunkel,T.A.et al.,Methods Enzymol.154,367−382(1987))、ダブルプライマー法(Zoller,M.J.and Smith,M.,Methods Enzymol.154,329−350(1987))、カセット変異法(Wells,et al.,Gene 34,315−23(1985))、メガプライマー法(Sarkar,G.and Sommer,S.S.,Biotechniques 8,404−407(1990))などが知られている。
このような変異体において改変されるアミノ酸残基数や改変部位は、変異体がDer p1のプロテアーゼ活性を阻害する限り制限はない。改変が置換の場合には、改変されるアミノ酸残基数は一般的には30残基以内(例えば、20、15、12、10、8、5残基以内)であろう。改変が欠失の場合には、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害に重要なSCCAの反応部位ループ以外の領域は、適宜欠失させることが考えられる。従って、欠失させるアミノ酸残基数は、例えば、350から370残基でありうる。一般的には、300残基以内(例えば、250、200、150、100、50、30、10残基以内)であろう。
改変が付加や挿入の場合には、改変されるアミノ酸残基数は、特に上限はない。SCCAに付加や挿入させるポリペプチドとしては、例えば、タグのような数残基の短いペプチドから蛋白質のような長いポリペプチドまで任意のポリペプチドが挙げられる。具体的には、Hisタグ、HAタグ、GFP、マルトース結合蛋白質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)などが挙げられる。また、リーダー配列、分泌シグナル、プレ蛋白質またはプロ蛋白質の配列などが挙げられるが、それらに制限されない。人体へ投与を行う場合には、低分子量であると扱いやすい。
本発明者はSCCAの変異体を用いたさらに詳細な解析を行い、SCCA2の反応部位ループのアミノ酸部位をSCCA1の反応部位ループのアミノ酸部位で置換した変異体を作製したところ、353番目のグルタミン酸をグリシンに置換した変異体は、Der p1との混合比が、I/E=1ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍、Der p1のシステインプロテアーゼ活性を阻害する活性が上昇した。また、356、357番目のアミノ酸残基であるセリン、プロリンをSCCA1型のプロリン、トレオニンに置換したところ、I/E=1ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍阻害活性が上昇することが判明した。さらに、353、356、357番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、セリン、プロリンをSCCA1型のグリシン、プロリン、トレオニンに置換したところ、SCCA2野生型のときよりI/E=1で94%のDer p1のプロテアーゼ活性阻害が証明された。また、これら3つの置換を有する反応部位ループの13残基のペプチドが、I/E比1000でDer p1の酵素活性を50%阻害した。
これら実験事実から、SCCAの変異体としては、好ましくは配列番号:4に記載のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、または配列番号:4に示されるSCCA2の構造類似体におけるこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体である。より好ましくは、配列番号:4に記載のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの置換、356位のセリンのプロリンへの置換、および357位のプロリンのトレオニンへの置換の少なくとも1つの置換がされた変異体である。中でも特に好ましい変異体は、配列番号:4に記載のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの置換、356位のセリンのプロリンへの置換および357位のプロリンのトレオニンへの置換の3つの置換を含む変異体である。また、これら変異を含むSCCA2の反応部位ループのペプチドも、本発明の変異体の好ましい態様である。
本発明の阻害剤は、試薬および医薬の双方を含む概念である。試薬として用いる場合、有効成分以外に、例えば、後述する医薬の場合と同様、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等とを含んでいてもよい。
一方、医薬として用いる場合において、使用の対象となる疾患としては、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害により患者の症状を改善しうる疾患であれば制限はない。上記SCCAやその変異体、さらにそれらをコードするポリヌクレオチドは、医薬の中でも、ダニアレルギー性疾患の治療剤として特に有用である。ダニアレルギー性疾患の治療剤の有効成分としては、これら以外に、例えば、SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物を用いることもできる。本発明において「機能的に同等な蛋白質」とは、各指標遺伝子によってコードされる蛋白質において明らかにされている活性と同様の活性、即ち、Der p1のプロテアーゼ活性を阻害する活性を備えたSCCA以外の蛋白質である。一般的には、ヒトSCCA蛋白質のアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上(例えば、97%、98%、99%以上)の相同性を有する蛋白質を、ヒトSCCAと機能的に同等な蛋白質として示すことができる。SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物は、後述するスクリーニングにより同定することができる。これら化合物は、天然の化合物であっても人工の化合物であってもよい。
医薬は、有効成分と生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等とを混合することによって製造することができる。医薬として使用する阻害剤は、例えば、経口あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。投与量は、本発明の阻害剤により改善を行う疾患の種類、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なる。通常成人一人あたり、一回につき0.1mgから500mgの範囲で、好ましくは0.5mgから20mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
有効成分が蛋白質の場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。治療用遺伝子の生体への導入には、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターを利用することができる。ベクターの導入の手法としては、in vivo、あるいはex vivoで行う方法が公知である。
本発明は、ダニアレルギー性疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供する。Der p1はハウスダストダニに感作されたアレルギー患者の約80%に対してアレルギー反応を引き起こす主要な構成成分であるが(Sporik R et al.,N Engl J Med,323:502−507,1990、Platts−Mills TA et al.,J Allergy Clin Immunol,80:755−775,1987、Sreedharan SK et al.,Biochem J,316:777−786,1996)、本発明者は、SCCAがDer p1への結合により、その酵素活性を阻害することを見出した。従って、SCCA遺伝子やそれと機能的に同等な遺伝子の発現レベルや活性を上昇させることができる化合物や、これら遺伝子がコードする蛋白質とDer p1との結合活性を促進する化合物を選択することによって、ダニアレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して促進的に作用する作用を持つ化合物である。これらスクリーニングに用いる被検候補化合物としては、特に制限はないが、例えば、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
本発明のダニアレルギー性疾患の治療候補化合物のスクリーニング方法は、in vivoで行なうこともin vitroで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、先に指標遺伝子として挙げたSCCAに加え、それらの遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
(1)被験動物に、候補化合物を投与する工程、
(2)被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(3)対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、たとえば、内因性の指標遺伝子の発現が低下している動物、好ましくはダニアレルギーの症状を示す動物を利用することができる。このような動物に薬剤候補化合物を投与し、動物の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。
被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、次のようにして検出することができる。即ち、転写レベルでは、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、DNAマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、RT−PCR法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。RT−PCR法においては、遺伝子の増幅過程においてPCR増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。PCR遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象(DNAもしくはRNAの逆転写産物)にハイブリダイズさせる。PCR反応が進んでTaqポリメラーゼの5’−3’エクソヌクレアーゼ(exonuclease)活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する(Holland,P.M.et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276−7280;Livak,K.J.et al.,1995,PCR Methods and Applications 4(6):357−362;Heid,C.A.et al.,Genome Research 6:986−994;Gibson,E.M.U.et al.,1996,Genome Research 6:995−1001)。PCR増幅モニター法においては、例えば、ABI PRISM7700(PEバイオシステムズ社)を用いることができる。一方、翻訳レベルでは、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ELISA法などを利用することができる。
さらにこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを上昇させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。生体試料としては、平滑筋細胞、角化細胞、鼻粘膜上皮細胞、腸上皮細胞、リンパ球、マスト細胞、好酸球、好塩基球、あるいは好中球等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用点を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
・指標遺伝子の発現をもたらすシグナル伝達経路の活性化
・指標遺伝子の転写活性の上昇
・指標遺伝子の転写産物の安定化もしくは分解の促進
また、in vitroでのスクリーニングにおいては、例えば、被験細胞に候補化合物を接触させ、これら遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
(1)被験細胞に候補化合物を接触させる工程、
(2)指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
(3)対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
本発明における被験細胞としては、特に制限はないが、ヒト肺がん細胞A549(ATCC Acc.No.CCL−185)、ヒト皮膚由来表皮角化細胞HaCaTやヒト気管支上皮細胞BEAS−2B(ATCC Acc.No.CRL−9609)が好適である。これらの細胞は、ATCCより購入することができる。
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞に候補化合物を添加する。その後、該細胞における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する。
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するmRNAを検出することにより比較することもできる。mRNAによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなmRNA試料の調製工程を実施する。mRNAやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、SCCA、およびこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子である方法に関する。
(1)指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
(3)対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるCAATボックス、TATAボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、CAT(chloramphenicol acetyl transferase)遺伝子、ルシフェラーゼ(luciferase)遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。本発明における指標遺伝子には、既に転写調節領域が明らかにされているものも少なくない。
あるいは本発明における指標遺伝子の転写調節領域を、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、BACライブラリー、YACライブラリー等のヒトゲノムDNAライブラリーから、PCRまたはハイブリダイゼーションを用いる方法によりスクリーニングを行い、該cDNAの配列を含むゲノムDNAクローンを得る。得られたゲノムDNAの配列を基に、本発明で開示したcDNAの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。本発明の指標遺伝子であるSCCA1とSCCA2とは、ゲノム上では同じ領域にマッピングされる遺伝子なので、転写調節領域は共通である。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
in vitroでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCA、およびこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子である方法に関する。
(1)指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
(2)前記蛋白質の活性を測定する工程、および
(3)対照と比較して前記蛋白質の活性を上昇させる化合物を選択する工程
本発明における指標蛋白質であるSCCAが、プロテアーゼインヒビター活性を有することは既に述べた。これらの活性を指標として、その活性を促進する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、SCCAの働きの促進を通じて、ダニアレルギー性疾患の改善をすることができる。
in vitroでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質とDer p1との結合活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCA、およびこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子である方法に関する。
(1)候補物質存在下で、指標遺伝子によってコードされる蛋白質とDer p1を接触させる工程、
(2)前記蛋白質とDer p1との結合活性を測定する工程、および
(3)対照と比較して前記蛋白質とDer p1との結合活性を上昇させる化合物を選択する工程
このようにして得ることができる化合物は、SCCAとDer p1との結合活性を促進し、その結果、SCCAのDer p1に対する阻害活性の増強を通じて、ダニアレルギー性疾患の改善をすることができる。
本発明によるスクリーニング方法においては、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変非ヒト高等動物を利用することも考えられる。このような動物は、ダニアレルギー性疾患のモデル動物になりうるため、このモデル動物においてダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を改善させる化合物を選択することにより、ダニアレルギー性疾患の治療剤の候補化合物をスクリーニングしうる。すなわち、本スクリーニングは、次の工程を含む。
(1)被験化合物を、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている遺伝子改変非ヒト高等動物に投与する工程
(2)該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する工程
(3)被験化合物を投与していない場合と比較して、該症状または該変化を改善させる化合物を選択する工程
本方法において「遺伝子の発現を人為的に抑制されている」とは、完全な抑制および部分的な抑制の双方が含まれる。また、遺伝子対の一方の発現が抑制されている場合も含まれる。抑制する方法として、当業者においては一般的に公知の方法によって行うことができる。例えば、遺伝子改変技術(標的遺伝子部位の組み換えを促進する酵素、例えば、Cre−loxにおけるCre、の導入による条件的遺伝子改変技術も含む)を用いた方法、アンチセンスDNAを用いた方法、または、RNAi技術を用いた方法等が挙げられる。
本方法における「非ヒト高等動物」とは、ヒトを含まない脊椎動物や無脊椎動物を意味する。遺伝子改変技術を用いた遺伝子の発現を人為的に抑制することができる非ヒト高等動物としては、非ヒト哺乳動物や昆虫等が挙げられるが、より好適には、非ヒト哺乳動物(例えば、マウスやラットなどのげっ歯類)である。
遺伝子を改変させた動物の作製は、例えば次のようにして行うことができる。まず、標的遺伝子を含むDNA断片をクローニングして、これを基に、内在性の標的遺伝子改変のための相同組み換え用ベクターを構築する。該相同組み換え用ベクターには、標的遺伝子またはその発現制御領域の少なくとも1部を欠失/変異させた核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域にヌクレオチドやポリヌクレオチドが挿入された核酸配列、標的遺伝子またはその発現制御領域に他の遺伝子が挿入された核酸配列を含むが、標的遺伝子の活性が失われる核酸配列であれば、前記の欠失/変異部位および挿入部位は限定されない。
挿入される遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素遺伝子等が挙げられる。また、これらの組み合わせも考えられる。該相同組み換え用ベクターの基本骨格は、特に、制限はなく、pKONeo(レキシコン)等を用いることができる。
構築した相同組み換え用ベクターを、個体へ分化させることが可能な非ヒト哺乳動物細胞(例えば、胚性幹細胞(ES細胞))に導入し、内因性の標的遺伝子との相同組み換えを行うことで、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を作製する。遺伝子対の双方の発現が抑制されている該細胞を作製するには、例えば、高濃度のネオマイシンで細胞を選択する方法で得ることが可能である。相同組み換え用ベクターの細胞への導入は、当業者に公知の方法によって行うことができる。具体的には、エレクトロポレーション法等を例示することができる。
本方法において個体へ分化させることが可能な動物細胞としてES細胞を用いた場合は、例えば、該細胞を胚盤胞に注入することによりキメラ胚を作製し、偽妊娠させた動物の子宮に移植して産仔を得る。遺伝子改変ES細胞由来の組織を有するキメラ動物を選別できるようにするために、より好適には、作製された個体の外部的特徴(例えば、毛色)が、遺伝子改変ES細胞由来の組織と胚盤胞由来の組織とで異なるように、胚盤胞を選択する。また、遺伝子改変ES細胞由来の生殖組織を有するキメラ動物であるか否かの判定は、一般的には、該キメラ非ヒト哺乳動物と適当な系統の同種非ヒト哺乳動物との交配により得られた仔の毛色で行うが、その他の方法として、例えば、該キメラ非ヒト哺乳動物の生殖細胞から抽出したDNAを鋳型としたPCR反応を行い、挿入された遺伝子の有無を検出する方法を用いることも可能である。
該キメラ動物と適当な系統の同種動物との交配により得られた仔が、ヘテロ接合型遺伝子改変動物であるか否かは、例えば、該動物細胞から抽出したDNAを鋳型とするPCRやサザンハイブリダイゼーションで判定することができる。また、ヘテロ接合型遺伝子改変動物同士の交配により、ホモ接合型遺伝子改変動物を作製することができる。交配により得られた仔が、ホモ接合型遺伝子改変動物であるか否かも上記の判定法に従う。
遺伝子改変動物の作製は、上記の方法に制限されない。例えば、体細胞クローン動物の作製技術に従って遺伝子改変動物を作製することもできる。具体的には、ES細胞以外の体細胞(例えば、皮膚細胞等)を用いて、ES細胞の場合と同様な方法に従って遺伝子改変動物細胞を作製することができる。さらに、該遺伝子改変動物細胞から、体細胞クローン作製技術を応用し、遺伝子改変動物を作製することができる。
このようにして調製した遺伝子改変非ヒト高等動物への被検化合物の投与は、例えば、経口的に、また注射により行うことができるが、それらに限定されない。被験化合物が蛋白質である場合には、例えば、該蛋白質をコードする遺伝子を有するウイルスベクターを構築し、その感染力を利用して、非ヒト高等動物に該遺伝子を導入することも可能である。
この方法においては、次いで、該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する。
本方法においては、次いで、被験化合物を投与していない場合と比較して、これら症状または該生体内の変化を改善させる化合物を選択する。このようにして選択された化合物は、ダニアレルギー性疾患の治療剤の候補となる。
SCCA遺伝子の発現を人為的に抑制することができる非ヒト高等動物から調製した細胞は、ダニアレルギー性疾患の治療剤の候補化合物のスクリーニングなどに用いることができる有用な細胞である。
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、ダニアレルギー性疾患の治療薬として有用である。
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、本発明のキットは、指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬を含み、さらに指標遺伝子を発現する細胞を含みうる。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも1つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも15塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。ここで「相補鎖」とは、A:T(RNAの場合はU)、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、BLAST等のアルゴリズムにより決定することができる。このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100bp、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子(またはその相補鎖)の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長のDNAが用いられる。プライマーとして用いる場合、3’側の領域は相補的である必要があるが、5’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブDNAは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・DNAポリメラーゼIを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識(Berger SL,Kimmel AR.(1987)Guide to Molecular Cloning Techniques,Method in Enzymology,Academic Press;Hames BD,Higgins SJ(1985)Genes Probes:A Practical Approach.IRL Press;Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.(1989)Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2nd Edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press)
・RNAポリメラーゼを用いる転写による標識(Melton DA,Krieg,PA,Rebagkiati MR,Maniatis T,Zinn K,Green MR.(1984)Nucleic Acid Res.,12,7035−7056)
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをDNAに取り込ませる方法(Kricka LJ.(1992)Nonisotopic DNA Probing Techniques.Academic Press)
あるいは、少なくとも1つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体(Milstein C,et al.,1983,Nature 305(5934):537−40)であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインAやプロテインGを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ELISA法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長cDNAによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
図1は、GST−SCCA1またはGST−SCCA2融合蛋白質のDer p1のプロテアーゼ活性の阻害効果を測定した結果を示すグラフの図である。
図2は、SCCA2の反応部位ループに人工的に変異を導入して、Der p1プロテアーゼ活性阻害に対する影響を示すグラフの図である。351番目のバリンをグリシン、352番目のバリンをフェニルアラニン、353番目のグルタミン酸をグリシン、354番目のロイシンをセリン、356番目と357番目のセリン−プロリンをプロリン−トレオニンへと置換した。
図3は、353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2のDer p1プロテアーゼ活性阻害効果を示すグラフの図である。
図4は、353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2の反応部位ループのペプチド(13残基;TM13、7残基;TM7)を示す図である。
図5は、図4で示したTM13とTM7によるDer p1の酵素活性の阻害効果を示す図である。
図6は、SCCA1、SCCA2、および353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2のDer p1のCD25抗原切断活性の阻害効果を示す図である。
図2は、SCCA2の反応部位ループに人工的に変異を導入して、Der p1プロテアーゼ活性阻害に対する影響を示すグラフの図である。351番目のバリンをグリシン、352番目のバリンをフェニルアラニン、353番目のグルタミン酸をグリシン、354番目のロイシンをセリン、356番目と357番目のセリン−プロリンをプロリン−トレオニンへと置換した。
図3は、353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2のDer p1プロテアーゼ活性阻害効果を示すグラフの図である。
図4は、353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2の反応部位ループのペプチド(13残基;TM13、7残基;TM7)を示す図である。
図5は、図4で示したTM13とTM7によるDer p1の酵素活性の阻害効果を示す図である。
図6は、SCCA1、SCCA2、および353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2のDer p1のCD25抗原切断活性の阻害効果を示す図である。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例1〕 リコンビナントSCCAの作製
ヒトSCCA1,2の完全な翻訳領域を含む領域を大腸菌発現プラスミドであるpET−30(a)SCCA1または、pET−30(c)SCCA2を本出願で使用する大腸菌発現プラスミドの鋳型とした(Suminami Y et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.181,51−58,1991)。DNAシーケンスによりSCCA1,2部分の塩基配列が既知のものと同じであることを確かめた。
SCCAの5’側にBamH I部位、3’側にXba I部位を持つようにプライマー(forward:5’GGAGGATCCATGAATTCACTCAGTGAAGCC3’(配列番号:5),reverse:5’GCTCTAGACTATGGGGATGAGAATCTGCC3’(配列番号:6))を設計し、付加配列を持つSCCA DNAフラグメントをPCR法にて得た。
これをBamH I/Xba I処理後、pGEX−KG大腸菌発現プラスミド(Guan K L et al,Anal.Biochem.192,262−267,1991)のBamH I/Xba I部位に連結し、pGEXKG−SCCAプラスミドを構築した。接合部及びSCCAの塩基配列が正しいことをシーケンスにて確認した。
pGEXKG−SCCAを大腸菌(BL−21)に形質転換し、アンピシリン入りLBプレートで37℃一晩培養した。
シングルコロニーを選抜し、10mlのアンピシリン入りLB液体培地に植菌し37℃で一晩振盪培養した。その菌液を1000mlアンピシリン入りLB液体培地に加え37℃で数時間振盪培養し、OD 600=0.5の時に100mM IPTGを10ml(最終濃度1mM)添加し、更に25℃で15時間培養した。
4℃、6000xgで10分遠心し大腸菌を回収した。5mlの1mM PMSFを含んだPBSに懸濁し−20℃にてオーバーナイトで保存した。
超音波ホモジェナイザー(セントラル科学貿易)で超音波にて菌体を破壊した。4℃、12000xg、20分間遠心し、上清を回収し可溶性蛋白画分を得た。
可溶性蛋白画分をglutathione sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)に添加し30分間4℃で振盪した。ゲルの10倍量のPBSで4回洗浄後、1mlの溶出緩衝液(50mM Tris−HCL,10mM還元型グルタチオン)を加え4℃で10分間振盪しGST−SCCA融合蛋白を溶出した。3回溶出し、それらをまとめてbradford色素結合法(BioRad)で蛋白定量した。
このようにglutathione Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)を用いたアフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)によりGST−SCCA融合蛋白質を精製した。
〔実施例2〕 Der p1プロテアーゼ活性阻害測定
上記実施例1の方法で精製したGST−SCCA1または2融合蛋白質をIndoor社より購入したDer p1と混合した後、Der p1の活性を測定した。
測定の方法は以下の通りである。
2μMのDer p1(最終濃度40nM)10μlと390μlの1mM EDTAと1mM DTT入り50mMリン酸緩衝液を混ぜ、25℃で10分間前反応させた。そして4μM(最終濃度400nM)あるいは0.4μM(最終濃度40nM)のGST−SCCAを50μl加え、さらに25℃で15分間反応させた。15分後に基質であるBoc−Gln−Ala−Arg−MCA(1mM)(ペプチド研究所)を50μl加え蛍光吸光光度計(SHIMADZU RF−5000)を用いて励起波長380nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を経時的に500秒間測定した。
その結果、I/E=10の比で混合した際にSCCA1は25%、SCCA2は86%の阻害効果を示した。この事よりセリンプロテアーゼインヒビターと考えられているSCCA2の方がDer p1に対して阻害効果が強いことが判明した(図1)。
〔実施例3〕 SCCA2反応部位ループにおけるアミノ酸配列置換変異体の阻害活性
一般に、セルピンと呼ばれるプロテアーゼインヒビターは反応部位ループと呼ばれる部分を持ち、この部分がプロテアーゼの活性中心と結合することによってその酵素活性を阻害する。そして、反応部位ループのアミノ酸配列によってどのプロテアーゼを阻害するのかという特異性が決定される(Silverman GA,et al.J Biol Chem,276:33293−33296,2001)。
Der p1に対するSCCA2の阻害効果もSCCA2が持つ反応部位ループによって決定されていると考え、SCCA2の反応部位ループに人工的に変異を導入して、その阻害効果に対する影響を解析した。SCCA1と2の反応部位ループを比較すると341、351、352、353、354、356、357および364番目に違いが見られた(表1)。
部分的にSCCA1の配列で置換した変異体を作製したところ、353番目のグルタミン酸をSCCA1由来のグリシンに置換した変異体は、I/E=1の比ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍阻害活性が上昇した。また、356、357番目のアミノ酸残基であるセリン、プロリンをSCCA1型のプロリン、トレオニンに置換したところ、I/E=1の比ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍阻害活性が上昇した。351番目のアミノ酸残基であるバリンをSCCA1型のグリシンに置換したところSCCA1と同等にほとんど阻害活性を示さなかった。同様に352番目のバリンをSCCA1型のフェニルアラニンに、354番目のロイシンをSCCA1型のセリンにそれぞれ置換したものもSCCA1と同等にほとんど阻害活性を示さなかった。(図2)。しかしながら、353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれSCCA1型のグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2(SCCAtm)はI/E=1の比でも、対照群、SCCA1あるいはSCCA2野生型に比べて94%の非常に高い阻害効果を示した(図3)。
また、これら3アミノ酸変異型のSCCA2の反応部位ループペプチド13mer(TM13、図4)が、I/E比1000でDer p1の酵素活性を50%阻害した(図5)。
以上の結果から、反応部位ループのアミノ酸配列がプロテアーゼインヒビター活性には重要であり、その配列を適宜調整することにより天然型を超えるプロテアーゼインヒビターが作製できることが示された。
〔実施例4〕 SCCA2およびその変異体はDer p1のCD25抗原切断活性を阻害する
実施例3で、われわれはSCCA蛋白質、とりわけSCCA2およびその変異体蛋白質がDer p1プロテアーゼを阻害する作用を有していることを明らかにしたが、その作用はDer p1の合成ペプチドを基質として測定した活性に対するものであった。
そこで次に、自然の蛋白質そのものを基質とした場合のDer p1の活性に及ぼすSCCA蛋白質の作用について解析を行った。
細胞表層に発現しているIL−2レセプターα鎖であるCD25抗原をDer p1が切断することはすでに知られている(Schulz O et al.,J Exp Med.Jan 19;187(2):271−5,1998、Ghaemmaghami AM et al.,Eur J Immunol.Apr;31(4):1211−6,2001)。そこでDer p1プロテアーゼによるCD25抗原蛋白質の切断に対する各種SCCA蛋白質(SCCA1、SCCA2、およびSCCAtm)の阻害作用を次のように測定した。
ヒト急性T細胞白血病細胞株であるJurkat細胞を100nMのPMAと1μMのionomycinで30時間刺激した。その後血清なしの培養液に移し、4x105個の細胞を0.6μMのDer p1と0.3μMのSCCA蛋白質の存在下、37度で2時間混合しCD25抗原の切断反応を行った。
次に細胞表面上のCD25発現をFACSで解析した。抗体は市販の抗CD25抗体を用いた。細胞をまずマウス抗CD25抗体と混合し、さらにFITCラベルされた抗マウス免疫グロブリン抗体と混合した。flow cytometry(FACS Calibur;ベクトンデイッキンソン社製)を用いてFITCによる蛍光発光を測定し、これをもとにCD25発現を定量した。
結果としては、Der p1により31%のCD25が切断されるが、SCCA蛋白質を共存させるとDer p1の活性が阻害されてCD25が切断から保護されることが認められた。SCCAtmではほぼ100%その切断が回復した(図6)。
以上の結果から、SCCA蛋白質、とりわけSCCA2およびその変異体がDer p1プロテアーゼを阻害する作用を有し、合成ペプチドを基質とした場合のみならず、Der p1がT細胞表層のCD25抗原を切断する活性をも阻害することができることが示された。
〔実施例1〕 リコンビナントSCCAの作製
ヒトSCCA1,2の完全な翻訳領域を含む領域を大腸菌発現プラスミドであるpET−30(a)SCCA1または、pET−30(c)SCCA2を本出願で使用する大腸菌発現プラスミドの鋳型とした(Suminami Y et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.181,51−58,1991)。DNAシーケンスによりSCCA1,2部分の塩基配列が既知のものと同じであることを確かめた。
SCCAの5’側にBamH I部位、3’側にXba I部位を持つようにプライマー(forward:5’GGAGGATCCATGAATTCACTCAGTGAAGCC3’(配列番号:5),reverse:5’GCTCTAGACTATGGGGATGAGAATCTGCC3’(配列番号:6))を設計し、付加配列を持つSCCA DNAフラグメントをPCR法にて得た。
これをBamH I/Xba I処理後、pGEX−KG大腸菌発現プラスミド(Guan K L et al,Anal.Biochem.192,262−267,1991)のBamH I/Xba I部位に連結し、pGEXKG−SCCAプラスミドを構築した。接合部及びSCCAの塩基配列が正しいことをシーケンスにて確認した。
pGEXKG−SCCAを大腸菌(BL−21)に形質転換し、アンピシリン入りLBプレートで37℃一晩培養した。
シングルコロニーを選抜し、10mlのアンピシリン入りLB液体培地に植菌し37℃で一晩振盪培養した。その菌液を1000mlアンピシリン入りLB液体培地に加え37℃で数時間振盪培養し、OD 600=0.5の時に100mM IPTGを10ml(最終濃度1mM)添加し、更に25℃で15時間培養した。
4℃、6000xgで10分遠心し大腸菌を回収した。5mlの1mM PMSFを含んだPBSに懸濁し−20℃にてオーバーナイトで保存した。
超音波ホモジェナイザー(セントラル科学貿易)で超音波にて菌体を破壊した。4℃、12000xg、20分間遠心し、上清を回収し可溶性蛋白画分を得た。
可溶性蛋白画分をglutathione sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech)に添加し30分間4℃で振盪した。ゲルの10倍量のPBSで4回洗浄後、1mlの溶出緩衝液(50mM Tris−HCL,10mM還元型グルタチオン)を加え4℃で10分間振盪しGST−SCCA融合蛋白を溶出した。3回溶出し、それらをまとめてbradford色素結合法(BioRad)で蛋白定量した。
このようにglutathione Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)を用いたアフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)によりGST−SCCA融合蛋白質を精製した。
〔実施例2〕 Der p1プロテアーゼ活性阻害測定
上記実施例1の方法で精製したGST−SCCA1または2融合蛋白質をIndoor社より購入したDer p1と混合した後、Der p1の活性を測定した。
測定の方法は以下の通りである。
2μMのDer p1(最終濃度40nM)10μlと390μlの1mM EDTAと1mM DTT入り50mMリン酸緩衝液を混ぜ、25℃で10分間前反応させた。そして4μM(最終濃度400nM)あるいは0.4μM(最終濃度40nM)のGST−SCCAを50μl加え、さらに25℃で15分間反応させた。15分後に基質であるBoc−Gln−Ala−Arg−MCA(1mM)(ペプチド研究所)を50μl加え蛍光吸光光度計(SHIMADZU RF−5000)を用いて励起波長380nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を経時的に500秒間測定した。
その結果、I/E=10の比で混合した際にSCCA1は25%、SCCA2は86%の阻害効果を示した。この事よりセリンプロテアーゼインヒビターと考えられているSCCA2の方がDer p1に対して阻害効果が強いことが判明した(図1)。
〔実施例3〕 SCCA2反応部位ループにおけるアミノ酸配列置換変異体の阻害活性
一般に、セルピンと呼ばれるプロテアーゼインヒビターは反応部位ループと呼ばれる部分を持ち、この部分がプロテアーゼの活性中心と結合することによってその酵素活性を阻害する。そして、反応部位ループのアミノ酸配列によってどのプロテアーゼを阻害するのかという特異性が決定される(Silverman GA,et al.J Biol Chem,276:33293−33296,2001)。
Der p1に対するSCCA2の阻害効果もSCCA2が持つ反応部位ループによって決定されていると考え、SCCA2の反応部位ループに人工的に変異を導入して、その阻害効果に対する影響を解析した。SCCA1と2の反応部位ループを比較すると341、351、352、353、354、356、357および364番目に違いが見られた(表1)。
部分的にSCCA1の配列で置換した変異体を作製したところ、353番目のグルタミン酸をSCCA1由来のグリシンに置換した変異体は、I/E=1の比ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍阻害活性が上昇した。また、356、357番目のアミノ酸残基であるセリン、プロリンをSCCA1型のプロリン、トレオニンに置換したところ、I/E=1の比ではSCCA2野生型のときより、2.5倍、I/E=10では4倍阻害活性が上昇した。351番目のアミノ酸残基であるバリンをSCCA1型のグリシンに置換したところSCCA1と同等にほとんど阻害活性を示さなかった。同様に352番目のバリンをSCCA1型のフェニルアラニンに、354番目のロイシンをSCCA1型のセリンにそれぞれ置換したものもSCCA1と同等にほとんど阻害活性を示さなかった。(図2)。しかしながら、353番目のアミノ酸残基であるグルタミン酸、356番目であるセリン、357番目であるプロリンをそれぞれSCCA1型のグリシン、プロリン、トレオニンに置換した3アミノ酸変異型SCCA2(SCCAtm)はI/E=1の比でも、対照群、SCCA1あるいはSCCA2野生型に比べて94%の非常に高い阻害効果を示した(図3)。
また、これら3アミノ酸変異型のSCCA2の反応部位ループペプチド13mer(TM13、図4)が、I/E比1000でDer p1の酵素活性を50%阻害した(図5)。
以上の結果から、反応部位ループのアミノ酸配列がプロテアーゼインヒビター活性には重要であり、その配列を適宜調整することにより天然型を超えるプロテアーゼインヒビターが作製できることが示された。
〔実施例4〕 SCCA2およびその変異体はDer p1のCD25抗原切断活性を阻害する
実施例3で、われわれはSCCA蛋白質、とりわけSCCA2およびその変異体蛋白質がDer p1プロテアーゼを阻害する作用を有していることを明らかにしたが、その作用はDer p1の合成ペプチドを基質として測定した活性に対するものであった。
そこで次に、自然の蛋白質そのものを基質とした場合のDer p1の活性に及ぼすSCCA蛋白質の作用について解析を行った。
細胞表層に発現しているIL−2レセプターα鎖であるCD25抗原をDer p1が切断することはすでに知られている(Schulz O et al.,J Exp Med.Jan 19;187(2):271−5,1998、Ghaemmaghami AM et al.,Eur J Immunol.Apr;31(4):1211−6,2001)。そこでDer p1プロテアーゼによるCD25抗原蛋白質の切断に対する各種SCCA蛋白質(SCCA1、SCCA2、およびSCCAtm)の阻害作用を次のように測定した。
ヒト急性T細胞白血病細胞株であるJurkat細胞を100nMのPMAと1μMのionomycinで30時間刺激した。その後血清なしの培養液に移し、4x105個の細胞を0.6μMのDer p1と0.3μMのSCCA蛋白質の存在下、37度で2時間混合しCD25抗原の切断反応を行った。
次に細胞表面上のCD25発現をFACSで解析した。抗体は市販の抗CD25抗体を用いた。細胞をまずマウス抗CD25抗体と混合し、さらにFITCラベルされた抗マウス免疫グロブリン抗体と混合した。flow cytometry(FACS Calibur;ベクトンデイッキンソン社製)を用いてFITCによる蛍光発光を測定し、これをもとにCD25発現を定量した。
結果としては、Der p1により31%のCD25が切断されるが、SCCA蛋白質を共存させるとDer p1の活性が阻害されてCD25が切断から保護されることが認められた。SCCAtmではほぼ100%その切断が回復した(図6)。
以上の結果から、SCCA蛋白質、とりわけSCCA2およびその変異体がDer p1プロテアーゼを阻害する作用を有し、合成ペプチドを基質とした場合のみならず、Der p1がT細胞表層のCD25抗原を切断する活性をも阻害することができることが示された。
変異型SCCA2をHDMFPが体内に侵入する気管支上皮、皮膚、鼻腔粘膜などに投与すれば、そのプロテアーゼ阻害作用によって、Der p1プロテアーゼによりT細胞がTh2に偏ることが有効に阻止され、アレルギー疾患を予防・治療する手段となりうる。
Der p1のプロテアーゼの三次元構造は既知であり(Topham C M et al,Protein Engineering vol.7,869−894,1994)、Der p1の活性部位も反応部位ループへの相互作用も構造的に解析することができる。これにより、効果的にDer p1を阻害するペプチド配列を設計し、ペプチド構造にミミックした低分子有機化合物を設計することも可能となる。
さらに、この変異型SCCA2の反応部位ループのみでも同様な効果が期待されるとともに、その構造と一致する低分子化合物でも同様の治療効果が期待される。
Der p1のプロテアーゼの三次元構造は既知であり(Topham C M et al,Protein Engineering vol.7,869−894,1994)、Der p1の活性部位も反応部位ループへの相互作用も構造的に解析することができる。これにより、効果的にDer p1を阻害するペプチド配列を設計し、ペプチド構造にミミックした低分子有機化合物を設計することも可能となる。
さらに、この変異型SCCA2の反応部位ループのみでも同様な効果が期待されるとともに、その構造と一致する低分子化合物でも同様の治療効果が期待される。
Claims (27)
- 下記(a)または(b)のいずれかを有効成分として含む、Der p1のプロテアーゼ活性の阻害剤。
(a)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体
(b)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド - 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、請求項1に記載の阻害剤。
- 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、請求項1に記載の阻害剤。
- 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、請求項1に記載の阻害剤。
- 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質。
- 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、そして357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
- 配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
- 請求項5から7のいずれかに記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
- 下記(a)または(b)のいずれかを有効成分として含む、ダニアレルギー性疾患の治療剤。
(a)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体
(b)SCCA、その部分ペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド - 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸、356位のセリン、および357位のプロリンから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基、またはこれらの位置に相当する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、請求項9に記載の治療剤。
- 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における353位のグルタミン酸のグリシンへの変異、356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも1つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、請求項9に記載の治療剤。
- 有効成分が、配列番号:4に記載のアミノ酸配列またはその反応ループ部位のアミノ酸配列における356位のセリンのプロリンへの変異、および357位のプロリンのトレオニンへの変異の少なくとも2つの変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質または該蛋白質をコードするポリヌクレオチドである、請求項9に記載の治療剤。
- SCCAまたはSCCAと機能的に同等な蛋白質の発現レベルまたは活性を上昇させる化合物を有効成分として含む、ダニアレルギー性疾患の治療剤。
- 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)被験動物に候補化合物を投与する工程、
(2)被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および
(3)候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)被験細胞に候補化合物を接触させる工程
(2)指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
(3)候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
(2)前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
(2)前記蛋白質の活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を上昇させる化合物を選択する工程 - 次の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCA遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
(1)候補物質存在下で、指標遺伝子によってコードされる蛋白質とDer p1を接触させる工程、
(2)前記蛋白質とDer p1との結合活性を測定する工程、および
(3)候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質とDer p1との結合活性を上昇させる化合物を選択する工程 - SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されており、ダニアレルギー性疾患の症状を示す非ヒト高等動物。
- SCCA遺伝子の遺伝子対の一方または双方の遺伝子が改変していることを特徴とする請求項19に記載の非ヒト高等動物。
- 非ヒト高等動物がげっ歯類である、請求項19または20に記載の非ヒト高等動物。
- げっ歯類がマウスである、請求項21に記載の非ヒト高等動物。
- 請求項19〜22のいずれかに記載の非ヒト高等動物に分化させることが可能な、SCCA遺伝子の発現が人為的に抑制されている非ヒト高等動物細胞。
- 以下の(a)〜(c)の工程を含む、ダニアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品候補化合物のスクリーニング方法。
(a)被験化合物を請求項19〜22のいずれかに記載の非ヒト高等動物に投与する工程
(b)該非ヒト高等動物におけるダニアレルギー性疾患の症状または該疾患の指標となる生体内の変化を検出する工程
(c)被験化合物を投与していない場合と比較して、該症状または該変化を改善させる化合物を選択する工程 - 請求項14〜18及び24のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、ダニアレルギー性疾患の治療薬。
- 指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも15塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドを含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCAと機能的に同等な遺伝子であるキット。
- 指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体を含む、ダニアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子がSCCAまたはSCCAと機能的に同等な遺伝子であるキット。
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