JP2006518182A - Ｄｎａマクロアレイプロテオミクスプラットフォームに基づく前立腺癌関連組成物、方法およびキット - Google Patents

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Abstract

本発明は、前立腺癌が包含されるがそれに限定されるものではない、ある種の疾患、疾病もしくは症状においてその発現が増加される、哺乳類ＰＣＡＤＭ−１遺伝子をコードする新規な核酸およびそれによりコードされるタンパク質に関する。本発明はさらに、ＰＣＡＤＭ−１発現ならびに／もしくはＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドの生産および活性を調節することもしくは検出することを含んでなる、前立腺癌を検出しそして処置する方法に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質およびそれらと特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチド配列の同定のための新規なアッセイに関する。最後に、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１遺伝子発現を阻害するようにＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡに特異的に結合しそしてそれにより腫瘍細胞および腫瘍組織を破壊するＤＮＡＺＹＭもしくはＤＮＡ酵素に関する。

Description

関連出願へのクロスリファレンス
本願は、１９９９年９月２４日に出願された米国仮出願第６０／１５５，８６５号に、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で優先権が与えられている、２０００年９月２４日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２５９８１号の継続である、２００２年３月１５日に出願された米国出願第１０／０９８，９９２号の一部継続である、２００２年３月２１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０８６７３号の一部継続である、２００１年３月２１日に出願された米国出願第０９／８１３，３８０号の一部継続である、２００２年５月７日に出願された米国出願第１０／１４０，６０２号に基づき、これらの全ては、本明細書にそれらの全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
先行技術は、リボソームタンパク質がある種の疾患、疾病もしくは症状において重要な役割を果たす可能性があることを示唆する。さらに特に、リボソームタンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの過剰発現と癌との間の関連を示す多数の報告がある（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９）。例えば、Ｃｈｉａｏ ｅｔ ａｌ．（非特許文献１）は、Ｓ２リボソームタンパク質ｍＲＮＡの発現が頭頚部癌において上昇しているが、Ｓ２ ｍＲＮＡは正常組織ではほとんど検出可能でないと決定した。これらの研究に基いて、いくつかのリボソームｍＲＮＡの過剰発現は、従って、癌の発症と関連する可能性があると考えられている。例えば、いくつかのリボソームタンパク質（例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｌ７、ラットＳ２７およびＳ２９）に特徴的な特定のジンクフィンガー、ロイシンジッパーモチーフ、ｂＺＩＰエレメント、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフもしくは他のモチーフは、核酸に結合し得ることが提示されている（非特許文献１０；非特許文献４；非特許文献７；非特許文献１１）。ラットリボソームタンパク質Ｓ３ａは、ラットｖ−ｆｏｓトランスフォーメーションエフェクタータンパク質と同一であることが見出されている（非特許文献５）。Ｓ３ａは、通常、タンパク質合成の開始に関与し、そしてまた増殖の調節および細胞周期に関与するタンパク質にも関係している（非特許文献５）。同様に、ラットリボソームタンパク質Ｌ１０は、推定上のウィルムス腫瘍サプレッサー遺伝子に相同である（非特許文献６）。悪性細胞は、突然変異体「リボソーム様」タンパク質を発現する可能性がある。しかしながら、現在、これらのリボソームタンパク質のいずれかが過剰発現されるかもしくはこれらのタンパク質が悪性細胞においてＤＮＡ結合活性を獲得する証拠はない。
リンパ系腫瘍における染色体異常の存在は確立している。Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）と関連する染色体転座は、いくつかの潜在的癌遺伝子の同定に至っている（非特許文献１２）。Ｔ−ＡＬＬと関連する染色体転座の多くは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子に位置が特定されている。免疫グロブリン遺伝子の組み換えは、Ｂリンパ球分化の初期に起こる。部位特異的組み換えにより２もしくは３つの生殖細胞系セグメント（すなわち、可変−Ｖ；多様性−Ｄ；および連結−Ｊセグメント）を可変遺伝子エキソンに連結するＶ−（Ｄ）−Ｊ組み換えは、Ｖ領域多様性の増幅に寄与する。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの側面に位置する領域のヌクレオチド配列の比較により、１２もしくは２３塩基のいずれかのスペーサー配列で隔てられている、ヘプタマーＣＡＣＴＧＴＧおよびＴリッチノナマーＧＧＴＴＴＴＴＧＴを包含する、ヌクレオチド配列の２つの共通ブロックが保存されていることが示されている（非特許文献１３）。Ｔ細胞受容体および免疫グロブリン遺伝子のヘプタマー−スペーサー−ヘプタマー−ノナマー配列間の相同性は、切断点クラスター領域もしくはＢＰＣＲと一般に呼ばれるこれらの要素がＶ−（Ｄ）−Ｊ組み換えにおいて重要な役割を果たすことを示唆する。
先行技術は、保存されている組み換えシグナル配列（ＲＳ）を認識するＤＮＡ結合タンパク質（１つもしくは複数）が、シグナルとコーディング領域配列との間の連結点でＤＮＡを切断しそして切断末端を連結する組み換え機構に関与し得ることを示唆する。最も初期の報告は、ＲＳタンパク質をリンパ系細胞に位置すると開示した（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；および非特許文献１７）。さらに最近では、異なるＲＳタンパク質が同定されている。例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えシグナル配列のカッパＢ結合および認識成分のＤＮＡ結合タンパク質が同定されている。転写因子のこのファミリーの活性化は、カッパＢにより制御される遺伝子調節要素を有する遺伝子を発癌性チロシンキナーゼが調節するメカニズムを提供すると考えられる。
Ｔ細胞異常に関する研究は、特に染色体バンド１１ｐ１３内の切断点に関して、組み換え酵素の関与に関して特に情報を提供している。両方の相互転座染色体は、組み換え酵素活性の特質であるＮ−領域ヌクレオチド付加を有することが多いので、組み換え酵素は異常な染色体結合に関与すると思われる（非特許文献１８）。これらの転座は、正常な染色体連結プロセスの突然変異と見なされる。
要約すると、遺伝子を再編成することと関連する染色体異常が起こるメカニズム（１つもしくは複数）および正常な抗原受容体遺伝子再編成に関与するＤＮＡ結合酵素（すなわち、組み換え酵素）の役割（非特許文献１９）は、よく研究されているにもかかわらず、依然としてほとんど理解されていない。従って、特に非リンパ系タイプ疾患および固形癌発症を理解するために、新規なＢＰＣＲおよび新規な組み換え酵素の同定が必要とされる。
さらに、先行する研究は、ＤＮＡ結合タンパク質がある種の疾患、疾病もしくは症状と関連しそして／もしくはそれらを媒介することを示唆するが、これらのタンパク質はほとんど同定されておらず（例えば、現在まで；固形癌において何も同定されていない）、そして疾患プロセスにおけるそれらの役割（１つもしくは複数）はほとんど理解されていない。ＤＮＡ結合タンパク質の同定のための様々な先行技術アッセイがある（例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４）という事実にもかかわらずこれはそうである。従って、ＤＮＡ結合タンパク質およびそれらのコグネート二本鎖ＤＮＡ配列結合部位の同定のための簡単で有効なアッセイの長い間の切実な必要性がある。
さらに、診断および治療法の開発におけるＤＮＡ結合タンパク質の潜在的有用性にもかかわらず、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはそれらのコグネート結合ＤＮＡ二本鎖に基づく診断および治療法は、たとえあるとしても、少数である。
前立腺癌は男性における癌関連死亡率および罹患率の主要原因の一つであるが、この疾患の有効な診断および治療法はほとんどなく、そしてＢＰＣＲに結合するタンパク質を包含するＤＮＡ結合タンパク質の検出にいずれも基づかない。現在まで、科学文献において同定された約４５０の部分的に特性化された組織マーカーがあるが、１個のみがＦＤＡにより認可された臨床マーカーとして開発されている（すなわち、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその誘導体）。前立腺癌が包含されるがこれに限定されるものではない癌の診断および検出に有用なマーカーの不足にもかかわらず、癌の早期発見のためのマーカーの開発は、癌の改善された処置にとって必須である。
前立腺癌に関して、血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルは、前立腺癌の患者の同定に対して高感度でも特異的でもないと一般に考えられている（非特許文献２０）。前立腺癌の男性の４０％ほどは正常なＰＳＡレベルを有し（すなわち、偽陰性）そして逆に、高いＰＳＡレベルを有する男性の３０％はＰＣＡをもたないと概算されている。従って、前立腺癌を包含する癌のより高感度で且つ特異的なアッセイの開発が不可欠である。さらに、集団地域検診プログラムによるかもしくは日常的な臨床検査における広範な実施を可能にする、非侵襲的で且つ安価な尿に基づくスクリーニングアッセイは、前立腺癌を包含する癌の診断および処置に特に有用である。
要約すると、特にＤＮＡ結合タンパク質の改変された発現と関連する疾患、疾病もしくは症状の診断および治療法の開発のために、ＤＮＡ結合タンパク質およびそれらが特異的に結合するコグネート二本鎖ＤＮＡ分子の同定および特性化の長い間の切実なそして深刻な必要性がある。さらに、前立腺癌を包含する癌に関連する改善された診断および治療法の長い間の切実なそして深刻な必要性がある。本発明は、これらの必要性を満たす。
Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，米国特許第６，０６６，４５２号明細書 Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，米国特許第６，０１０，８４９号明細書 Ｅｄｗａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，米国特許第５，８６９，２４１号明細書 Ｓｕｋｈａｔｍｅ，１９９９，米国特許第５，８６６，３２５号明細書 Ｃｈｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．５：２１９−２３１ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１９８−２１１２０４ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５：８２１−８２５ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ，１９９６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：２１７７−２１８６ Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２８：１４１−１４７ Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２５：９５２−９５６ Ｗｏｏｌ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２１：１６４−１６５ Ｗｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３：９３３−９４７ Ｖａａｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８：２７−３２ Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３；２１：６４９−６５５ Ｗｏｏｌ，１９９７，Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ａｎｄ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｉｎｔｒｏｎｓ，ｐｐ．１５３−１７８，Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，ｅｄｓ．，Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ Ｒａｂｂｉｔｔｓ，１９９１，Ｃｅｌｌ ６７：６４１−６４４ Ｅａｒｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ １９：９８１−９９２ Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：９０９−９１７ Ｈａｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７０１９−７０２３ Ｈａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：９０１５−９０２６ Ｍａｋ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：３８３−３９０ Ａｌｔ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：４１１８−４１２３ Ｃｒｏｃｅ，１９８７，Ｃｅｌｌ ４９：１５５−１６９ Ｇａｒｎｉｃｋ ａｎｄ Ｆａｉｒ，１９９８，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒ．Ｄｅｃｅｍｂｅｒ：７５−８３
［発明の要約］
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸が包含される。
本発明にはまた、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ならびにそのホモログ、バリアント、突然変異体およびフラグメントをコードする単離された核酸も包含される。
一つの態様として、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）をコードする核酸と９９％より大きい配列同一性を共有する。
別の態様として、該単離された核酸は、配列番号：１に対してヌクレオチド番号１９０でアデニン、ヌクレオチド番号１９１でシトシン、ヌクレオチド番号４６５でシトシン、ヌクレオチド番号４７５でグアニン、ヌクレオチド番号４８８でグアニン、そしてヌクレオチド番号５０５でシトシンを含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸が包含され、ここで、該核酸の配列は配列番号：１の配列からなる。
別の態様として、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸は、それに共有結合しているタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる。
さらに別の態様として、該タグポリペプチドは、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、フラグ（ｆｌａｇ）タグポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドよりなる群から選択される。
一つの態様として、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなるベクターが包含される。一つの態様として、本発明には該ベクターを含んでなる組み換え細胞が包含される。
別の態様として、該ベクターは、哺乳類癌診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
さらに別の態様として、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含される。
本発明にはまた、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなるベクターを含んでなる組み換え細胞も包含され、ここで、該ベクターは、哺乳類癌診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸が包含され、該相補的な核酸はアンチセンスの向きである。
一つの態様として、該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
別の態様として、該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
さらに別の態様として、該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、ここで、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなり、さらにここで、該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明にはさらに、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、該相補的な核酸はアンチセンスの向きである。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、ここで、該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターを含んでなる組み換え細胞が包含され、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、ここで、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
本発明には、ベクターを含んでなる組み換え細胞が包含され、該ベクターは、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなり、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなり、さらにここで、該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有する。
一つの態様として、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン（Ｔ）、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン（Ｎ）、残基番号１５９でアラニン（Ａ）、残基番号１６３でアルギニン（Ｒ）、そして残基番号１６９でアルギニン（Ｒ）を含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２の配列からなる。
一つの態様として、該核酸は、それに共有結合しているタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる。
別の態様として、該タグポリペプチドは、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、フラグタグポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドよりなる群から選択される。
さらに別の態様として、該核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列をコードする核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、そしてここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン（Ｔ）、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン（Ｎ）、残基番号１５９でアラニン（Ａ）、残基番号１６３でアルギニン（Ｒ）、そして残基番号１６９でアルギニン（Ｒ）を含んでなる。
一つの態様として、該ベクターは、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
別の態様として、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有する。
本発明にはまた、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸を含んでなる組み換え細胞も包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、そしてここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン（Ｔ）、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン（Ｎ）、残基番号１５９でアラニン（Ａ）、残基番号１６３でアルギニン（Ｒ）、そして残基番号１６９でアルギニン（Ｒ）を含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は配列番号：２の配列からなり、該核酸は、それに共有結合しているタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなり、ここで、該タグポリペプチドは、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、フラグタグポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドよりなる群から選択され、そして該核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列をコードする核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸を含んでなるベクターを含んでなる組み換え細胞が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、そしてここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１の該アミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン（Ｔ）、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン（Ｎ）、残基番号１５９でアラニン（Ａ）、残基番号１６３でアルギニン（Ｒ）、そして残基番号１６９でアルギニン（Ｒ）を含んでなる。
一つの態様として、ベクターは細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きである。
一つの態様として、該相補的な配列は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きである。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、ここで、該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、そしてここで、該核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
一つの態様として、該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、そしてここで、該核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクターが包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、そしてここで、該核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有し、そして該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
一つの態様として、該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、そしてここで、該核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなる組み換え細胞が包含され、ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有し、該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、そしてここで、該核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有し、そして該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
一つの態様として、該核酸は該細胞において発現される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１を含んでなる単離されたポリペプチドが包含される。
一つの態様として、該哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１は、配列番号：２のアミノ酸と少なくとも９９％の配列同一性を共有する。
別の態様として、該ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン、残基番号１５９でアラニン、残基番号１６３でアルギニン、そして残基番号１６９でアルギニンを含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１を含んでなる単離されたポリペプチドが包含され、ここで、該単離されたポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２からなる。
本発明には、前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドと特異的に結合する単離された核酸が包含される。
一つの態様として、該核酸は二本鎖ＤＮＡである。
別の態様として、該単離された核酸は、核酸配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる。
本発明には、哺乳類白血病細胞切断点クラスター領域結合タンパク質と特異的に結合する単離された核酸が包含される。
一つの態様として、該白血病切断点クラスター領域結合タンパク質は、Ｒａｇ１タンパク質およびＲａｇ２タンパク質よりなる群から選択される。
さらに別の態様として、該単離された核酸は二本鎖ＤＮＡを含んでなり、該ＤＮＡは、核酸配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）および核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる。
本発明には、原核生物の切断点クラスター領域結合タンパク質と特異的に結合する単離された核酸が包含される。
一つの態様として、該原核生物の切断点クラスター領域結合タンパク質は、ＲｅｃＡタンパク質およびＲｅｃＢタンパク質よりなる群から選択される。
別の態様として、該ポリペプチドは、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）からなる核酸、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）からなる核酸、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）からなる核酸および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）からなる核酸よりなる群から選択される核酸の少なくとも一つと特異的に結合する。
本発明には単離された酵素核酸（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）が包含され、ここで、該核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する。
一つの態様として、該単離された酵素核酸の核酸配列は、配列番号：９の配列（ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ）および配列番号：１０の配列（ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ）よりなる群から選択される。
本発明には単離された酵素核酸が包含され、ここで、該核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断し、そしてさらにここで、該単離された酵素核酸の配列は、配列番号：９の配列および配列番号：１０の配列よりなる群から選択される。
本発明にはまた、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断し、そしてさらに、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸が配列番号：１の配列もしくはその一部を有する核酸を含んでなる、単離された酵素核酸も包含される。
一つの態様として、該酵素核酸は少なくとも一つの結合アームを含んでなり、そしてさらにここで、該結合アームは配列番号：１もしくはその一部に相補的な配列を含んでなる。
別の態様として、該核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる。
さらに別の態様として、該核酸は「１０〜２３」モチーフ構造を含んでなる触媒ドメインを含んでなる。
さらなる態様として、該酵素核酸は触媒コアドメインを含んでなり、そして該ドメインの側面に位置する少なくとも一つの結合アームをさらに含んでなり、ここで、該結合アームは約６〜１０個のヌクレオチドを含んでなる。
別の態様として、該側面に位置するヌクレオチドは、配列番号：１もしくはその一部に相補的な配列を含んでなる。
本発明には、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸が包含され、ここで、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該核酸によりコードされる前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有する。
本発明には、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸が包含され、該酵素核酸は、配列ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号：９）および配列ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号：１０）を含んでなる。
本発明には、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸が包含され、ここで、該酵素核酸の核酸配列は、配列番号：９の配列および配列番号：１０の配列よりなる群から選択される。
一つの態様として、該酵素核酸は結合アームを含んでなり、ここで、該結合アームは配列番号：１もしくはその一部に相補的な配列を含んでなる。
別の態様として、該結合アームは約６〜１０個のヌクレオチドを含んでなる。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドもしくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体が包含される。
一つの態様として、該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および合成抗体よりなる群から選択される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドもしくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物が包含される。
本発明にはまた、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物も包含される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１を含んでなる単離されたポリペプチドおよび製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物が包含される。
本発明には、前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドと特異的に結合する単離された核酸および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物が包含される。
本発明にはまた、単離された酵素核酸（ここで、該単離された酵素核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する）および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物も包含される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドもしくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物が包含される。
本発明には、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳類が包含される。
本発明には、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現（ｍａｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）により媒介される疾患を処置する方法が包含される。該方法は、前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患にかかっているヒトに哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸、および哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体よりなる群から選択される少なくとも一つの物質の発現阻害量を投与することを含んでなる。
一つの態様として、該疾患は前立腺癌である。
別の態様として、該哺乳類はヒトおよびイヌよりなる群から選択される
さらに別の態様として、該方法は、血管上皮増殖因子１（ＶＥＧＦ−１）およびメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸を投与することをさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類における前立腺癌を診断する方法が包含される。該方法は、哺乳類から生体サンプルを得ること、該生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価すること、および該生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルを前立腺癌にかかっていない類似哺乳類から得られる生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較すること（ここで、該類似哺乳類からの生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較して該哺乳類からの生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１の高いレベルは、該哺乳類が前立腺癌にかかっている指標である）、それにより該哺乳類における前立腺癌を診断することを含んでなる。
一つの態様として、該哺乳類はヒトおよびイヌよりなる群から選択される。
別の態様として、該生体サンプルは、前立腺組織サンプル、血液サンプル、尿サンプル、痰サンプル、腹膜腔液サンプル、会陰腔液サンプル、胸膜腔液サンプル、精液サンプル、前立腺液サンプル、便サンプルおよび骨髄サンプルよりなる群から選択される。
本発明には、哺乳類における前立腺癌を診断する方法が包含される。該方法は、哺乳類から生体サンプルを得ること、該生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルを評価すること、および該生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルを前立腺癌にかかっていない類似哺乳類から得られる生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルと比較すること（ここで、該類似哺乳類からの生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルと比較して該哺乳類からの生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体の高いレベルは、該哺乳類が前立腺癌にかかっている指標である）、それにより該哺乳類における前立腺癌を診断することを含んでなる。
一つの態様として、該哺乳類はヒトおよびイヌよりなる群から選択される。
別の態様として、該生体サンプルは前立腺組織サンプル、血液サンプル、尿サンプル、痰サンプル、腹膜腔液サンプル、会陰腔液サンプル、胸膜腔液サンプル、精液サンプル、前立腺液サンプル、便サンプルおよび骨髄サンプルよりなる群から選択される。
本発明には、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現に影響を及ぼす試験化合物を同定する方法が包含される。該方法は、細胞を試験化合物と接触させることおよび該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルを該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較することを含んでなり、ここで、該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現の高いかもしくは低いレベルは、該試験化合物が細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現に影響を及ぼす指標である。一つの態様として、本発明には、該方法により同定される化合物が包含される。
本発明には、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を減少する化合物を同定する方法が包含される。該方法は、細胞を試験化合物と接触させることおよび該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルを該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較することを含んでなり、ここで、該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現の低いレベルは、該試験化合物が細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を減少する指標である。一つの態様として、本発明には、該方法により同定される化合物が包含される。
本発明には、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を増加する化合物を同定する方法が包含される。該方法は、細胞を試験化合物と接触させることおよび該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルを該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較することを含んでなり、ここで、該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現の高いレベルは、該試験化合物が細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を増加する指標である。一つの態様として、本発明には、該方法により同定される化合物が包含される。
本発明には、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸と前立腺癌抗原診断マーカー１との結合に影響を及ぼす化合物を同定する方法が包含される。該方法は、化合物の存在下での前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のレベルを該化合物がない場合の前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のレベルと比較すること（ここで、該化合物がない場合の前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のレベルと比較して該化合物の存在下での前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合の高いかもしくは低いレベルは、該化合物が前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸と前立腺癌抗原診断マーカー１との結合に影響を及ぼす指標である）、それにより前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸と前立腺癌抗原診断マーカー１との結合に影響を及ぼす化合物を同定することを含んでなる。
一つの態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸は、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される配列を有する。
別の態様として、該前立腺癌抗原診断マーカー１は、配列番号：２の配列と９９％より大きいアミノ酸相同性を共有する配列を有する。さらに別の態様として、本発明には、該方法により同定される化合物が包含される。
本発明には、前立腺癌にかかっているヒトの処置をモニターする方法が包含される。該方法は：
（ａ）前立腺癌抗原診断マーカー１の初期レベルを決定するためにヒトから得られる第一の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを評価すること；
（ｂ）該ヒトに抗前立腺癌治療を施すこと；
（ｃ）該治療の間もしくは後に該ヒトから得られる第二のそのほかの点では同一の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを評価すること；
（ｄ）該第一の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを該第二の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルと比較すること；および
（ｅ）前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルの任意の減少を該抗前立腺癌治療の効果と相関させること、
それにより、前立腺癌にかかっているヒトの処置をモニターすること
を含んでなる。
一つの態様として、該方法は、該前立腺癌の存続期間、該ヒトの寿命および該抗前立腺癌治療の期間よりなる群から選択される期間の間に（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことをさらに含んでなる。
別の態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルは、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸を検出する方法および前立腺癌抗原診断マーカー１を検出する方法よりなる群から選択される方法を用いて評価される。
さらに別の態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１を検出する方法は、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体を検出する方法および前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸の結合を検出する方法（ここで、該核酸は、配列番号：５の配列を有する核酸、配列番号：６の配列を有する核酸、配列番号：７の配列を有する核酸および配列番号：８の配列を有する核酸よりなる群から選択される）よりなる群から選択される。
本発明には、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患を軽減するためのキットが包含される。該キットは、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸に相補的な単離された核酸（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）、および前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸よりなる群から選択される少なくとも一つの分子の前立腺癌抗原診断マーカー１発現阻害量を含んでなり、該キットはアプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる。
一つの態様として、該疾患は前立腺癌である。
別の態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるＲＮＡを特異的に切断する該単離された酵素核酸は、配列番号：９の配列および配列番号：１０の配列よりなる群から選択される配列を含んでなる。
なおさらなる態様として、該キットは血管上皮増殖因子１（ＶＥＧＦ−１）およびメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸をさらに含んでなる。
本発明には、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患を処置するためのキットが包含され、該キットは、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸に相補的な単離された核酸（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）、および前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸よりなる群から選択される少なくとも一つの分子の前立腺癌抗原診断マーカー１発現阻害量を含んでなり、該キットはアプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる。
本発明には、サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを評価するためのキットが包含される。該キットは、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する分子を含んでなり、該キットはアプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる。
一つの態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該分子は、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体および前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸よりなる群から選択される。
一つの態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該核酸は、配列番号：１の配列を有する核酸と９９％より大きい配列同一性を共有する。
別の態様として、該前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドは、配列番号：２の配列と９９％より大きいアミノ酸配列同一性を共有する。
さらなる態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸は、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される配列を含んでなる。
本発明には、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１を検出するためのキットが包含される。該キットは、前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドともしくは前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸と特異的に結合する分子を含んでなり、該キットはアプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる。
一つの態様として、該哺乳類はイヌおよびヒトよりなる群から選択される。
別の態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドと特異的に結合する該分子は、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体および前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸よりなる群から選択される。
さらに別の態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸は、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される配列を有する。
さらなる態様として、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸と特異的に結合する該分子は、配列番号：１の配列と９９％より大きい配列同一性を共有する核酸と相補的な核酸よりなる群から選択される。
本発明には、ＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの同定のためのモンテカルロ様スクリーニングアッセイが包含される。該アッセイは：
（ａ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２塩基対を含んでなる既知の配列が側面に位置するランダムコアヌクレオチド配列を含んでなる）；および
（ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する該組の任意のオリゴヌクレオチドメンバーを検出すること、それによりＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定すること
を含んでなる。
一つの態様として、本発明には、該アッセイにより同定されるＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する単離された二本鎖オリゴヌクレオチドが包含される。
一つの態様として、（ｂ）の検出することは、電気泳動移動度シフトアッセイおよびポリペプチドと結合している二本鎖オリゴヌクレオチドを検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなる。
別の態様として、該ランダムコアヌクレオチド配列は、約３〜１２塩基対を含んでなる。
さらに別の態様として、該二本鎖オリゴヌクレオチドは、約７〜１６塩基対の長さの間である。
さらなる態様として、該ランダムコアヌクレオチド配列は、７塩基対、８塩基対および９塩基対よりなる群から選択される長さを含んでなる。
なおさらなる態様として、該アッセイは：
（ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を同定すること；ならびに
（ｄ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｃ）において同定される既知の側面に位置する配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、未知のランダムコア配列が（ｃ）において同定される配列より１個少ない未知の塩基対からなるように追加の既知のものをさらに含んででなる）、および二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を検出しそして同定するアッセイ段階を繰り返すこと
をさらに含んでなる。
別の態様として、該アッセイは、ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの全配列が同定されるまで（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含んでなる。
本発明には、腫瘍と関連するＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定する方法が包含され、該方法は：
（ａ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２塩基対を含んでなる既知の配列が側面に位置するランダムコアヌクレオチド配列を含んでなる）；
（ｂ）該組における二本鎖オリゴヌクレオチドの１つもしくはそれ以上がＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する条件下で、該組の二本鎖オリゴヌクレオチドメンバーを腫瘍細胞もしくは組織から調製されたＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる混合物を含有するサンプルと混合すること；
（ｃ）該組における二本鎖オリゴヌクレオチドの１つもしくはそれ以上がＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する条件下で、該組の同一の二本鎖オリゴヌクレオチドメンバーを腫瘍を含んでならないそのほかの点では同一の細胞もしくは組織から調製されたＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる混合物を含有するそのほかの点では同一のサンプルと混合すること；
（ｄ）（ａ）および（ｂ）において任意の特異的オリゴヌクレオチド−タンパク質結合を検出すること；および
（ｅ）（ｂ）においてＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合するが（ｃ）においてＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合しない任意の二本鎖オリゴヌクレオチドを同定すること、それにより腫瘍と関連するＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定すること
を含んでなる。
一つの態様として、本発明には、この方法により同定される単離された二本鎖オリゴヌクレオチドが包含される。
別の態様として、（ｄ）の検出することは、電気泳動移動度シフトアッセイおよびポリペプチドと結合している標識した二本鎖オリゴヌクレオチドを検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなる。
さらに別の態様として、該ランダムコアヌクレオチド配列は、約３〜１２塩基対を含んでなる。
さらなる態様として、該二本鎖オリゴヌクレオチドは、約７〜１６塩基対の長さの間である。
なおさらなる態様として、該ランダムコアヌクレオチド配列は、７塩基対、８塩基対および９塩基対よりなる群から選択される長さを含んでなる。
別の態様として、該方法は：
（ｆ）（ｅ）においてＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を同定すること；
（ｇ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｆ）において同定される既知の側面に位置する配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、未知のランダムコア配列が（ｆ）において同定される配列より１個少ない未知の塩基対からなるように該未知のランダムコア配列に隣接する追加の既知の塩基対をさらに含んでなる）；ならびに
（ｈ）（ｂ）および（ｅ）を繰り返すこと
をさらに含んでなる。
一つの態様として、該方法は、ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの全配列が同定されるまで（ｂ）〜（ｈ）を繰り返すことをさらに含んでなる。
本発明には、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の同定のためのモンテカルロ様スクリーニングアッセイが包含される。該アッセイは：
（ａ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２塩基対を含んでなる既知の配列が側面に位置するランダムコアヌクレオチド配列を含んでなる）；および
（ｂ）該組のオリゴヌクレオチドメンバーと特異的に結合する任意のＤＮＡ結合タンパク質を検出すること、それにより二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を同定すること
を含んでなる。
一つの態様として、（ｂ）の検出することは、電気泳動移動度シフトアッセイおよびポリペプチドと結合している二本鎖オリゴヌクレオチドを検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなる。
別の態様として、該ランダムコアヌクレオチド配列は、約３〜１２塩基対を含んでなる。
さらに別の態様として、該二本鎖オリゴヌクレオチドは、約７〜１６塩基対の長さの間である。
さらなる態様として、該ランダムコアヌクレオチド配列は、７塩基対、８塩基対および９塩基対よりなる群から選択される長さを含んでなる。
別の態様として、該アッセイは：
（ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を同定すること；
（ｇ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｃ）において同定される既知の側面に位置する配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、未知のランダムコア配列が（ｃ）において同定される配列より１個少ない未知の塩基対からなるように追加の既知のものをさらに含んでなる）、および二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を検出しそして同定するアッセイ段階を繰り返すこと
をさらに含んでなる。
さらなる態様として、該アッセイは、ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの全配列が同定されるまでアッセイの段階を繰り返すことをさらに含んでなる。
別の態様として、本発明には、該アッセイにより同定される単離された二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が包含される。
本発明には、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を設計する方法が包含される。該方法は、（ａ）触媒コアドメインを含んでなる試験核酸を合成すること（ここで、該コアドメインは、相補的アームを含んでなる核酸が側面に位置し、そしてここで、該相補的アームの配列は、配列番号：１の配列を含んでなる配列と相補的な配列から選択され、そしてさらにここで、該相補的アーム配列は約８〜１０ヌクレオチドの長さである）；および（ｂ）該試験核酸がＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するかどうかを評価すること、それによりＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を設計することを含んでなる。
一つの態様として、本発明には、該方法により設計されるＤＮＡ酵素が包含される。
本発明には、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を同定する方法が包含される。該方法は：（ａ）結合アームを含んでなる核酸が側面に位置する触媒コアドメインを含んでなる試験核酸を合成すること（ここで、該結合アームの配列は、翻訳開始部位に対して配列番号：１の約ヌクレオチド−９〜約ヌクレオチド＋４５０を含んでなる配列に相補的であり、そしてさらにここで、該結合アーム配列は約８〜１０ヌクレオチドの長さである）；および（ｂ）該試験核酸がＰＣＡＤＭ−１をコードするリボ核酸を特異的に切断するかどうかを評価すること、それによりＰＣＡＤＭ−１をコードするリボ核酸を特異的に切断するＤＮＡ酵素を同定することを含んでなる。
一つの態様として、該結合アームの配列は、該翻訳開始部位に対して配列番号：１の約ヌクレオチド＋１５５〜約ヌクレオチド＋１７１を含んでなる配列に相補的である。さらなる態様として、本発明には該方法により同定されるＤＮＡ酵素が包含される。
別の態様として、該結合アームの配列は、該翻訳開始部位に対して配列番号：１の約ヌクレオチド−７〜約ヌクレオチド＋９を含んでなる配列に相補的である。
本発明には、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を阻害する方法が包含される。該方法は、該前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸を細胞に投与すること、それにより該細胞における該前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を阻害することを含んでなる、
一つの態様として、該単離された酵素核酸は、配列番号：９の配列を有する酵素核酸および配列番号：１０の配列を有する酵素核酸よりなる群から選択される。
［発明の詳細な記述］
本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質およびそれらのコグネイトＤＮＡ分子結合相手の同定のための新規な「モンテカルロ様」アッセイに関する。さらに、本発明は、新規なＤＮＡ結合タンパク質およびそれらと特異的に結合するコグネイトＤＮＡ配列の同定に関する。すなわち、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１（前立腺癌抗原診断マーカー１、以前はＰＳＴＦ−１と呼ばれた）と称する、新規なＤＮＡ結合タンパク質の核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明はさらに、ＰＣＡＤＭ−１を切断する、ＰＣＡＤＭ−１に相補的な核酸酵素（ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭと称する）、およびそれらを用いて癌を処置する方法に関する。
本発明は、前立腺癌にかかっていないことが既知であるヒトから得られるそのほかの点では同一の生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較して生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価することにより患者における前立腺癌の有無を容易に且つ効率よく評価するＰＣＡＤＭ−１に基づくアッセイに関する。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２５９８１号の開示は、本明細書に引用することによりその全部が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示するように、ＰＣＡＤＭ−１の発現は、前立腺癌組織においてそして前立腺癌患者の尿において増加されていることもまた見出された。さらに、ＰＣＡＤＭ−１の発現は、整合する精嚢（ＳＶ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）もしくは高悪性度前立腺上皮内新生物（ＨＧＰＩＮ）病巣におけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較して前立腺癌腫瘍からの核タンパク質抽出物において特に増加されている。さらに、本明細書に開示するデータは、生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１タンパク質のレベルと調べた前立腺癌のグリーソンスコア（ＧＳ）との間の相関関係を示し、従って、ＰＣＡＤＭ−１は、前立腺癌の正確な病期診断に有用なステージ特異的前立腺癌マーカーであり得ることを示す。
さらに、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１発現の調節およびそれにより媒介される前立腺癌を包含する癌を処置する方法に関する。本明細書に開示するデータは、ＰＣＡＤＭ−１の発現が前立腺癌と関連することを示唆し、そして本発明は、前立腺癌を包含する、ＰＣＡＤＭ−１の改変された発現と関連する疾患、疾病もしくは症状を処置することおよび診断することに有用な診断の方法ならびに治療法の開発の方法を提供する。
定義
本明細書において用いる場合、以下の用語の各々は、本節におけるそれと関連する意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、該冠詞の文法的対象の１つもしくは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）をさすために本明細書において用いる。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素もしくは１つより多くの要素を意味する。
本明細書において用いる場合、「隣接する」という用語は、介在するヌクレオチドがない、相互に直接結合しているヌクレオチド配列をさすために用いる。一例として、ペンタヌクレオチド５’−ＡＡＡＡＡ−３’はトリヌクレオチド５’−ＴＴＴ−３’に、これら２つがこのように：５’−ＡＡＡＡＡＴＴＴ−３’もしくは５’−ＴＴＴＡＡＡＡＡ−３’連結されている場合には隣接しているが、これら２つがこのように： ５’−ＡＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’連結されている場合には隣接していない。
本明細書において用いる場合、アミノ酸は、以下の表に示すように、そのフルネームで、それに対応する３文字コードで、もしくはそれに対応する１文字コードで表される。
フルネーム ３文字コード １文字コード
アスパラギン酸 Ａｓｐ Ｄ
グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｅ
リシン Ｌｙｓ Ｋ
アルギニン Ａｒｇ Ｒ
ヒスチジン Ｈｉｓ Ｈ
チロシン Ｔｙｒ Ｙ
システイン Ｃｙｓ Ｃ
アスパラギン Ａｓｎ Ｎ
グルタミン Ｇｌｎ Ｑ
セリン Ｓｅｒ Ｓ
トレオニン Ｔｈｒ Ｔ
グリシン Ｇｌｙ Ｇ
アラニン Ａｌａ Ａ
バリン Ｖａｌ Ｖ
ロイシン Ｌｅｕ Ｌ
イソロイシン Ｉｌｅ Ｉ
メチオニン Ｍｅｔ Ｍ
プロリン Ｐｒｏ Ｐ
フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｆ
トリプトファン Ｔｒｐ Ｗ
本明細書に用いる場合、癌を「軽減する」ことは、前立腺癌の一つもしくはそれ以上の症状の重さを軽減することを意味する。これには、処置の方法の前のもしくはそれがない場合の患者におけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較して、患者において、細胞もしくは組織において発現されるＰＣＡＤＭ−１のレベルを減少すること、細胞増殖のレベルを減少すること、血流におけるまたは尿もしくは他の体液におけるＰＣＡＤＭ−１のレベルを減少することもしくは増加することなどを包含することができるが、これらに限定されるものではない。
「ＰＣＡＤＭ−１の改変された発現」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞、組織、器官もしくは体液におけるＰＣＡＤＭ−１の発現のレベルが、そのほかの点では同一の細胞、組織、器官もしくは体液（ここで、そのほかの点では同一の細胞、組織、器官もしくは体液は、前立腺癌、他の癌および骨粗鬆症のような変性疾患、免疫抑制疾患もしくは炎症性疾患のような、しかしこれらに限定されるものではない、ＰＣＡＤＭ−１の発現と関連するかもしくはそれにより媒介される任意の検出可能な疾患、疾病もしくは症状を示さない正常患者から得られる）におけるＰＣＡＤＭ−１の発現のレベルより検出可能に高いかもしくは低いことを意味する。
「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列もしくは非コーディング鎖に実質的に相同な配列をさす。本明細書に定義するように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、ＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分にのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上に特定される調節配列に相補的であることができ、これらの調節配列は、コーディング配列の発現を制御する。
「アプリケーター」という用語は、該用語を本明細書において用いる場合、哺乳類に本発明のＰＣＡＤＭ−１核酸、タンパク質および／もしくは組成物を投与するための、皮下注射器、ピペットなどが包含されるがこれらに限定されるものではない任意の装置を意味する。
「生体サンプル」は、該用語を本明細書において用いる場合、ＰＣＡＤＭ−１の発現のレベル、存在するＰＣＡＤＭ−１タンパク質のレベル、もしくは両方を評価するために用いることができる動物から得られるサンプルを意味する。そのようなサンプルには、血液サンプル、前立腺生検、尿サンプル、前立腺液、精液、リンパ液、会陰腔液サンプル、腹膜腔液サンプル、胸膜腔液サンプル、骨髄サンプル、唾液腺液および精嚢組織サンプルが包含されるが、これらに限定されるものではない。
「切断点クラスター領域」は、本明細書において用いる場合、白血病に関する研究において同定されるもののような、しかしこれらに限定されるものではない、染色体転座部位と関連する核酸配列をさす。
「候補抗ＰＣＡＤＭ−１薬」は、該用語を本明細書において用いる場合、細胞と接触させた時に、細胞を化合物と接触させる前の該細胞におけるＰＣＡＤＭ−１発現のレベルと比較して該細胞におけるＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の発現のレベルを減少する化合物を意味し、もしくは該化合物は、該化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞におけるＰＣＡＤＭ−１発現のレベルと比較して該細胞における発現のレベルを減少する。
「ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の一部もしくは全部に相補的な」は、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードしない核酸の配列を意味する。むしろ、細胞において発現されている該配列は、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードする核酸の非コーディング鎖と同一であり、従って、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードしない。
「相補的な」および「アンチセンス」という用語は、本明細書において用いる場合、全く同意語というわけではない。「アンチセンス」は、特に、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列もしくは非コーディング鎖に実質的に相同な配列をさす。「相補的な」は、本明細書において用いる場合、２つの核酸、例えば２つのＤＮＡ分子間で相補的なサブユニット配列の広範な概念をさす。該分子の両方のあるヌクレオチド位置が、通常は相互に塩基対合することができるヌクレオチドで占められている場合、該核酸はこの位置で相互に相補的であると考えられる。従って、２つの核酸は、分子の各々の対応する位置の十分な数（少なくとも５０％）が、通常は相互に塩基対合するヌクレオチド（例えば、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）で占められる場合に相互に相補的である。
遺伝子の「コーディング領域」は、遺伝子の転写により生産されるｍＲＮＡ分子のコーディング領域とそれぞれ相同であるかもしくは相補的である、遺伝子（すなわち、エキソン）のコーディング鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コーディング鎖のヌクレオチドからなる。
ｍＲＮＡ分子の「コーディング領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳中にトランスファーＲＮＡ分子のアンチコドン領域とマッチするかもしくは終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からもなる。従って、コーディング領域は、ｍＲＮＡ分子によりコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質移行シグナル配列におけるアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を含むことができる。
「コンセンサス」という用語は、本明細書において用いる場合、未解読（ｕｎ−ｃａｌｌｅｄ）塩基を解明するために再シーケンスされているか、またはＲＴ−ＰＣＲ伸長キット（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴから入手可能であるもののような）を用いて５’および／もしくは３’方向に伸長されそして再シーケンスされているか、または一つより多くの得られるクローンの重複配列から組み立てられている（もしくは伸長され且つ組み立てられている）核酸配列を意味する。
遺伝子の「非コーディング」領域は、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳に関与するリボソームタンパク質へのｍＲＮＡ結合に重要である「リーダー配列」を包含する遺伝子（すなわち、イントロン）のヌクレオチド残基からなる。
「ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１」は、該用語を本明細書において用いる場合、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に標的とする、配列番号：９を含んでなるＤＮＡＺＹＭを意味する。
「ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−２」は、本明細書において用いる場合、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に標的とする、配列番号：１０を含んでなるＤＮＡＺＹＭを意味する。
「ＤＮＡ−タンパク質ハイブリダイゼーションアッセイ」は、本明細書において用いる場合、特定のＤＮＡ配列と結合するタンパク質（１つもしくは複数）の同定のための、そしてＤＮＡへのタンパク質結合の量を評価するための結合アッセイをさす。
「基質相補的アーム」は、ＤＮＡＺＹＭのその基質の部分に相補的な（すなわち、塩基対合することができる）部分を意味する。一般に、そのような相補的配列は８塩基対配列で１００％であるが、必要に応じてさらに少ないかもしくはさらに多いことができる。例えば、８〜１０のうちわずか４塩基が塩基対合することができる。
「電気泳動移動度シフトアッセイ」もしくは「ＥＭＳＡ」は、これらの用語を本明細書において用いる場合、特定のＤＮＡ配列に結合するタンパク質（１つもしくは複数）の同定のための、そしてＤＮＡへのタンパク質結合の量を評価するためのゲルに基づくアッセイをさす。
「コードすること」は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の特定の配列もしくはアミノ酸の特定の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて他のポリマーおよび高分子の合成の鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の特性およびそれに起因する生物学的特性をさす。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞もしくは他の生物系においてタンパク質を生産する場合に該タンパク質をコードする。コーディング鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一であり、そして通常、配列表に提供される）および非コーディング鎖（遺伝子もしくはｃＤＮＡの転写の鋳型として用いられる）は両方とも、タンパク質またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると言うことができる。
他に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、相互の縮重バージョンでありそして同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が包含される。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含むことができる。
「高い酵素活性」には、細胞においてそして／もしくはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において測定される活性が包含されるものとし、ここで、該活性は、触媒活性およびＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ安定性の両方を反映したものである。
本明細書において用いる場合、「固相酵素免疫サンドイッチアッセイ」は、タンパク質の同定のためのそして細胞もしくは組織調製物におけるタンパク質レベルの測定のための抗体に基づくアッセイである。
「触媒もしくは酵素ドメイン」は、ＲＮＡ基質の切断にとって必須であるＤＮＡ酵素の部分を意味する。
ＰＣＡＤＭ−１に「同等な」ＲＮＡには、ヒトを包含する様々な動物における癌と関連する天然に存在するＲＮＡ分子が包含されるものとする。「相補的な」は、伝統的なワトソン−クリックもしくは他の非伝統的なタイプの塩基対合相互作用のいずれかにより別のＲＮＡ配列と水素結合（１つもしくは複数）を形成することができる核酸を意味する。
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に操作可能に連結された発現制御配列を含んでなる組み換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターをさす。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含んでなり；発現のための他の要素は、宿主細胞によりもしくはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系において供給されることができる。発現ベクターには、組み換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、裸のもしくはリポソームに含有される）およびウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、当該技術分野において既知である全てのものが包含される。
オリゴヌクレオチドの第一の領域は、オリゴヌクレオチドの第二の領域に対して、これら２つの領域が相互に隣接する場合にもしくはこれら２つの領域が約１００ヌクレオチド以下、そして好ましくは約５０ヌクレオチド以下、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは約３０ヌクレオチド以下、さらにより好ましくは約２０ヌクレオチド以下、好ましくは約１０ヌクレオチド以下で、そしてさらにより好ましくは約５ヌクレオチド以下で隔てられている場合に「側面に位置する」。
本明細書において用いる場合、「フラグメント」という用語は、核酸に適用する場合、通常、少なくとも２０ヌクレオチドの長さ、典型的には少なくとも約３０ヌクレオチド、さらに典型的には約５０〜約１００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００〜約２００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは少なくとも約３００〜約３５０、さらにより好ましくは少なくとも約３５０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは少なくとも約５００〜約６００、さらにより好ましくは少なくとも約６００ヌクレオチド〜約６２０ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは少なくとも約６２０〜約６５０であることができ、そして最も好ましくは、核酸フラグメントは約６５０ヌクレオチドより大きい長さである。
タンパク質に適用する場合、ＰＣＡＤＭ−１の「フラグメント」は約２０アミノ酸の長さである。より好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１のフラグメントは約３０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約４０、さらにより好ましくは少なくとも約６０、さらにより好ましくは少なくとも約８０、さらにより好ましくは少なくとも約１００、さらにより好ましくは約１００、そしてより好ましくは１１０アミノ酸より大きい長さである。
「ゲノムＤＮＡ」は、遺伝子と相同なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖である。一例として、染色体のフラグメントおよび哺乳類ｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡは両方ともゲノムＤＮＡである。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、該二本鎖オリゴヌクレオチドがメンバーである半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組の任意の他のメンバーによって生成される任意のシグナルと比較して該二本鎖オリゴヌクレオチドがタンパク質／ＤＮＡ結合を示す最も高い検出可能なシグナルを生成する場合に「最大の親和性」で結合する（該用語を本明細書において用いる場合）。
「相同な」は、本明細書において用いる場合、２つのポリマー分子間、例えば２つの核酸分子間、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性をさす。２つの分子の両方のあるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンで占められる場合、それらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、マッチするかもしくは相同な位置の数の直接関数であり、例えば、２つの化合物配列における半分の位置（例えば、１０個のサブユニットの長さのポリマーの５個の位置）が相同である場合、それら２つの配列は５０％相同であり、９０％の位置、例えば１０個のうち９個がマッチするかもしくは相同である場合、それら２つの配列は９０％の相同性を共有する。一例として、ＤＮＡ配列３’−ＡＴＴＧＣＣ−５’および３’−ＴＡＴＧＧＣ−５’は７５％の相同性を共有する。
本明細書において用いる場合、「相同性」は「同一性」と同義的に用いる。
さらに、「相同性」もしくは「同一性」という用語を核酸およびタンパク質をさすために本明細書において用いる場合、核酸およびアミノ酸配列レベルの両方での相同性もしくは同一性に適用されると解釈されるべきである。
第一のオリゴヌクレオチドは第二のオリゴヌクレオチドと、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、そして好ましくは少なくとも約９０％、もしくはより好ましくは少なくとも約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみが相互にアニーリングする条件下でこれら２つのオリゴヌクレオチドがアニーリングする場合に「高いストリンジェンシー」でもしくは「高いストリンジェンシー条件下」でアニーリングする。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせるために用いる条件のストリンジェンシーは、他の因子の中でも、温度、アニーリング媒質のイオン強度、インキュベーション期間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量、および既知である場合、２つのオリゴヌクレオチド間の非相同性の予想される程度の関数である。アニーリング条件のストリンジェンシーを調整する方法は既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて成し遂げることができる。例えば、２つの配列を比較するのに有用な数学アルゴリズムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７）におけるように改変した、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８）のアルゴリズムである。このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに導入され、そして例えばＵＲＬ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｌｏｃａｔｏｒ）“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／”を有する全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ワールドワイドウェブサイトでアクセスすることができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記述する核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために以下のパラメーター：ギャップペナルティー＝５；ギャップエクステンションペナルティー＝２；ミスマッチペナルティー＝３；マッチリワード＝１；期待値１０．０；およびワードサイズ＝１１を用いてＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と表される）で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記述するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために以下のパラメーター：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いて、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と表される）もしくはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで行うことができる。
比較目的用にギャップを考慮したアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）に記述されているように利用することができる。あるいはまた、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔもしくはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の遠い関係（同文献（ｉｄ．））および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する、反復検索を行うために用いることができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔおよびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを考慮に入れてもしくは入れずに、上記のものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際には、典型的に、正確なマッチを計数する。
「ＰＣＡＤＭ−１を阻害する」は、ＰＣＡＤＭ−１の活性もしくはＰＣＡＤＭ−１によりコードされるｍＲＮＡのレベルが、核酸のない場合に検出されるものより下に減少されることを意味する。より好ましくは、ＤＮＡＺＹＭもしくはＤＮＡ酵素での阻害は、ｍＲＮＡ上の同じ部位に結合することができるが該ＲＮＡを切断することができない不活性ＲＮＡ分子の存在下で認められるレベルより下である。
本明細書において用いる場合、「グリーソンスコア」という用語は、Ｇｌｅａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４９：１５６８−１５７６）により開発された病理学的スコアリングシステムをさす。
本明細書において用いる場合、「遺伝子」および「組み換え遺伝子」という用語は、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含んでなる核酸分子をさす。そのような天然の対立遺伝子バリエーションは、典型的には、既定の遺伝子のヌクレオチド配列における１〜５％の相違をもたらすことができる。代わりの対立遺伝子は、多数の異なる個体において興味のある遺伝子をシーケンスすることにより同定することができる。これは、様々な個体における同じ遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いることにより容易に実施することができる。天然の対立遺伝子バリエーションの結果でありそして機能活性を改変しないありとあらゆるそのようなヌクレオチドバリエーションおよび得られるアミノ酸多型もしくはバリエーションは、本発明の範囲内であるものとする。
さらに、本明細書に記述するヒトタンパク質のものと異なるヌクレオチド配列を有する、他の種からの本発明のタンパク質をコードする核酸分子（ホモログ）は、本発明の範囲内である。本発明のｃＤＮＡの天然の対立遺伝子バリアントおよびホモログに対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡもしくはその一部を用いてヒト核酸分子に対するそれらの同一性に基づいて単離することができる。例えば、本発明のヒトＰＣＡＤＭ−１タンパク質のホモログは、高いストリンジェンシー条件下でヒトＰＣＡＤＭ−１の全部もしくは一部をコードする核酸分子とのそのハイブリダイゼーションに基づいて単離することができる。
本明細書において用いる場合、「説明用資料」には、本明細書に列挙する様々な疾患もしくは疾病の軽減をもたらすためのキットにおいて本発明の核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物の有用性を伝えるために用いることができる、出版物、記録、図もしくは任意の他の表現媒体が包含される。場合により、あるいはまた、説明用資料は、哺乳類の細胞もしくは組織における疾患もしくは疾病の軽減の一つもしくはそれ以上の方法を記述することができる。本発明のキットの説明用資料は、例えば、本発明の核酸、ペプチド、ＤＮＡＺＹＭおよび／もしくは組成物を含有する容器に添付することができ、または核酸、ペプチドおよび／もしくは組成物を含有する容器と一緒に発送することができる。あるいはまた、説明用資料は、説明用資料および化合物が受取人によって協調的に用いられることを意図して容器と別個に発送することができる。
「単離された核酸」は、天然に存在する状態においてそれの側面に位置する配列から分離されている核酸セグメントもしくはフラグメント、例えば、該フラグメントに通常は隣接する配列、例えばそれが天然で存在するゲノムにおいて該フラグメントに隣接する配列から取り除かれているＤＮＡフラグメントをさす。該用語はまた、核酸に生来付随する他の成分、例えば細胞においてそれに生来付随するＲＮＡもしくはＤＮＡもしくはタンパク質から実質的に精製されている核酸にも適用する。従って、該用語には、例えば、ベクターに、自律複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに導入されるか、あるいは他の配列から独立して別個の分子として（例えば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲもしくは制限酵素消化により生成されるゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組み換えＤＮＡが包含される。それにはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡが包含される。
本発明の文脈では、一般に存在する核酸塩基の以下の略語を用いる。「Ａ」はアデノシンをさし、「Ｃ」はシチジンをさし、「Ｇ」はグアノシンをさし、「Ｔ」はチミジンをさし、そして「Ｕ」はウリジンをさす。
「ＰＣＡＤＭ−１分子の異常発現」という用語は、本明細書において用いる場合、異常発現が疾患、疾病もしくは症状と関連するかもしくはそれを媒介するように、細胞におけるＰＣＡＤＭ−１の発現のレベルが、そのほかの点では同一の細胞（ここで、該そのほかの点では同一の細胞は、前立腺癌、他の癌および骨粗鬆症のような変性疾患、免疫抑制疾患もしくは炎症性疾患などのような、しかしこれらに限定されるものではない、ＰＣＡＤＭ−１の発現と関連するかもしくはそれにより媒介される任意の検出可能な疾患、疾病もしくは症状を示さない正常組織から得られる）におけるＰＣＡＤＭ−１の発現のレベルより検出可能に高いかもしくは低いことを意味する。
「モンテカルロ様」スクリーニングアッセイは、本明細書において用いる場合、ランダム７塩基対（ｂｐ）、８ｂｐおよび９ｂｐ ＤＮＡ配列の作製ならびに腫瘍組織により生産されるＤＮＡ結合タンパク質（１つもしくは複数）（ここで、該ＤＮＡ結合タンパク質は、そのほかの点では同一の非腫瘍組織において生産されないか、もしくは低レベルで生産されるか、もしくはそうでなければ検出されないいずれかである）に結合する７ｂｐ、８ｂｐおよび／もしくは９ｐｂ配列を同定するために用いるタンパク質結合アッセイをさす。
２つのポリヌクレオチドを「操作可能に連結された」と記述することは、２つのポリヌクレオチドの少なくとも一方が、もう一方に対して、それが特徴とする生理学的影響を及ぼすことができるように核酸部分内で配置されている２つのポリヌクレオチドを一本鎖もしくは二本鎖核酸部分が含んでなることを意味する。一例として、遺伝子のコーディング領域に操作可能に連結されたプロモーターは、該コーディング領域の転写を促進することができる。
好ましくは、所望のタンパク質をコードする核酸がプロモーター／調節配列をさらに含んでなる場合、該プロモーター／調節配列は、それが細胞において所望のタンパク質の発現を導くように所望のタンパク質をコードする配列の５’末端に位置する。所望のタンパク質をコードする核酸およびそのプロモーター／調節配列は、一緒に、「導入遺伝子」を含んでなる。
「患者」は、外移植細胞のドナーもしくはレシピエントである生物体または細胞自体を意味する。「患者」はまた、酵素核酸分子を投与することができる生物体もさす。好ましくは、患者は哺乳類もしくは哺乳類細胞である。より好ましくは、患者はヒトもしくはヒト細胞もしくはヒト腫瘍である。
「ＰＣＡＤＭ−１」は、本明細書において用いる場合、任意の種もしくは組織もしくは細胞からまたは組み換え、合成もしくは半合成源から得られる精製された組み換えのもしくは天然の「ＰＣＡＤＭ−１」タンパク質のアミノ酸配列をさす。好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１は、ストリンジェントな条件下で配列番号：１の配列を有する核酸とハイブリダイズする核酸によりコードされる。さらに、ＰＣＡＤＭ−１は、配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を共有する。さらに、ＰＣＡＤＭ−１は過剰発現され、すなわち、疾患、疾病もしくは症状のないことが既知である細胞もしくは組織に存在するレベルより高いレベルで発現される。
また、「ＰＣＡＤＭ−１」は、ヒトＳ２遺伝子に対して６個のヌクレオチド置換を有する約３２ｋＤａの細胞質および核タンパク質である。さらに特に、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸は、ヌクレオチド番号１９０でＴ→Ａの変異、ヌクレオチド番号１９１でＡ→Ｃ、ヌクレオチド番号４６５でＧ→Ｃ、ヌクレオチド番号４７５でＣ→Ｇの変異、ヌクレオチド番号４８８でＣ→Ｇの変異、そしてヌクレオチド番号５０５でＴ→Ｃを含んでなる（ここで、該ヌクレオチド番号は配列番号：１に対する）。従って、ＰＣＡＤＭ−１は、ＡＴＧ翻訳開始部位に対してｎｔ１９０でＡ、ｎｔ１９１でＣ、ｎｔ４６５でＣ、ｎｔ４７５でＧ、ｎｔ４８８でＧ、ｎｔ５０５でＣを含んでなると理解される。より好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡは、本明細書に開示するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ、例えば、配列ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号：９）、ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号：１０）などを有するＤＮＡ酵素により切断される。
他に示さない限り、「ＰＣＡＤＭ−１」および「前立腺癌抗原診断マーカー１」は代替的に用いられ、そしてＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸によりコードされるポリペプチドをさす。好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸は、配列番号：１の配列と９９％より大きい同一性を共有するか、ＰＣＡＤＭ−１は配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質と９８％より大きい同一性を共有するか、もしくは両方である。さらに、該ポリペプチドは、好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する少なくとも一つの二本鎖核酸オリゴマー、例えば、配列番号３〜６の配列を有するオリゴヌクレオチドに結合する。さらに、ＰＣＡＤＭ−１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％の配列同一性を共有する
さらに、ヒトＳ２のアミノ酸配列に対して、ＰＣＡＤＭ−１は、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４、１５５、１５９、１６３および１６９で５個のアミノ酸置換を含んでなる。なおさらに特に、ＰＣＡＤＭ−１は、配列番号：２のアミノ酸配列対して、アミノ酸残基番号６４でＴ（トレオニン）、アミノ酸残基番号１５５でＮ（アスパラギン）、残基番号１５９でＡ（アラニン）、残基番号１６３でＲ（アルギニン）、そして残基番号１６９でＲ（アルギニン）を含んでなると理解される。
本明細書において用いる場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、該プロモーター／調節配列に操作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。ある場合には、この配列はコアプロモーター配列であることができ、そしてある場合には、この配列はエンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節要素を含むこともできる。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現させるものであることができる。
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかもしくは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結した場合に、細胞の大部分のもしくは全ての生理的条件下で生きているヒト細胞において遺伝子産物を生産させるヌクレオチド配列である。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかもしくは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結した場合に、プロモーターに対応する誘導因子が細胞に存在する場合にのみ実質的に生きているヒト細胞において遺伝子産物を生産させるヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかもしくは特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結した場合に、細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ実質的に生きているヒト細胞において遺伝子細胞を生産させるヌクレオチド配列である。
「ポリアデニル化配列」は、転写されたメッセンジャーＲＮＡ配列上にポリＡ尾部の付加を導くポリヌクレオチド配列である。
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖もしくは平行および逆平行鎖を意味する。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖核酸のいずれかであることができる。
「核酸」という用語は、典型的に、大きいポリヌクレオチドをさす。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、一般に約５０ヌクレオチドより大きくない、短いポリヌクレオチドをさす。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表される場合、これには「Ｕ」が「Ｔ」に置き換わるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も包含されると理解される。
ポリヌクレオチド配列を記述するために通常の表記法を本明細書において用いる：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と呼ばれる。
新生ＲＮＡ転写産物へのヌクレオチドの５’→３’付加の方向は、転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コーディング鎖」と呼ばれ；ＤＮＡ上の基準点に対して５’に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ；ＤＮＡ上の基準点に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
ポリヌクレオチドの「一部」は、ポリヌクレオチドの少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド残基を意味する。ポリヌクレオチドの一部には、ポリヌクレオチドのあらゆるヌクレオチド残基を包含することができると理解される。
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしそして相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することができるポリヌクレオチドをさす。そのような合成は、合成が誘導される条件下に、すなわち、ヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための作用因子の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる場合に起こる。プライマーは、典型的には一本鎖であるが、二本鎖であることもできる。プライマーは、典型的にはデオキシリボ核酸であるが、多種多様な合成のおよび天然に存在するプライマーが多数の用途に有用である。プライマーは、ハイブリダイズして合成の開始部位として働くようにそれが設計される鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにより決まる。プライマーは、例えば、発色、放射性もしくは蛍光部分で標識し、そして検出可能な部分として用いることができる。
「プローブ」は、別のポリヌクレオチドの指定された配列に特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをさす。プローブは標的の相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。そのような場合、標的へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにより決まる。プローブは、例えば、発色、放射性もしくは蛍光部分で標識し、そして検出可能な部分として用いることができる。
「組み換えポリヌクレオチド」は、生来一緒に連結されない配列を有するポリヌクレオチドをさす。増幅されたもしくは組み立てられた組み換えポリヌクレオチドは、適当なベクターに含むことができ、そして適当な宿主細胞を形質転換するために該ベクターを用いることができる。
組み換えポリヌクレオチドはまた、非コーディング機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を供給することもできる。
「組み換えポリペプチド」は、組み換えポリヌクレオチドの発現の際に生産されるものである。
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、およびペプチド結合によって連結されるその合成の天然に存在しないアナログからなるポリマー、関連する天然に存在する構造バリアント、およびその合成の天然に存在しないアナログをさす。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成機を用いて、合成することができる。
「タンパク質」という用語は、典型的に、大きいポリペプチドをさす。
「ペプチド」という用語は、典型的に、短いポリペプチドをさす。
ポリペプチド配列を表すために通常の表記法を本明細書において用いる：ポリペプチド配列の左端はアミノ末端であり；ポリペプチド配列の右端はカルボキシル末端である。
本明細書において用いる場合、「レポーター遺伝子」という用語は、既知の方法を用いてその発現を検出することができる遺伝子を意味する。一例として、エシェリキア・コリｌａｃＺ遺伝子は、培地に発色基質ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトシドを加えることにより既知の方法を用いてｌａｃＺ遺伝子の発現を検出することができるので培地中のレポーター遺伝子として用いることができる（Ｇｅｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐ．５７４）。
「ＰＣＡＤＭ−１阻害量」は、本明細書において用いる場合、物質もしくは分子がない場合のＰＣＡＤＭ−１発現、量および／もしくは活性のレベルと比較してＰＣＡＤＭ−１発現、量および／もしくは活性のレベルを検出可能に減少する物質もしくは分子の任意の量を意味する。従って、存在するＰＣＡＤＭ−１の量および／またはＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡもしくはタンパク質発現のレベルの検出可能な減少をもたらす任意の量は、本発明に包含される。これらの条件を調べるアッセイは当該技術分野において周知であり、そしていくつかを本明細書に例示する。
「ＰＣＡＤＭ−１活性」という用語は、本明細書において用いる場合、細胞の生存および増殖を保証する、前立腺癌組織において検出されるが非癌組織では検出されないなどの分子もしくは化合物の能力をさす。さらに、ＰＣＡＤＭ−１活性には、本明細書のほかの場所でさらに十分に説明するように配列番号：５〜８の少なくとも一つの配列を有する核酸と特異的に結合するポリペプチドの能力が包含される。
「ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ」は、特定の遺伝子標的に対して基質結合領域中に相補的配列を有し、そしてまたその標的においてＲＮＡを特異的に切断することに有効である、酵素もしくは触媒活性も有する核酸分子を意味する。すなわち、酵素核酸分子はＲＮＡを分子間的に切断し、そしてそれにより標的ＲＮＡ分子を不活性化することができる。配列のこの相補的マッチングは、切断を起こさせるために標的ＲＮＡへの酵素核酸分子の十分なハイブリダイゼーションを与える働きをする。「ＤＮＡＺＹＭ」、「ＤＮＡ酵素」もしくは「酵素核酸」もしくは「ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ」という用語は、特に、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡ配列に相補的なもしくは部分的に相補的なＤＮＡ配列をさし、そして該用語は本明細書において代替可能に用いる。しかしながら、それらは共通の機能能力を共有するので、「ＤＮＡＺＹＭ」という用語は、当該技術分野において用いるように、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、ヌクレオザイム（ｎｕｃｌｅｏｚｙｍｅ）、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、ミニザイム（ｍｉｎｉ−ｚｙｍｅ）、もしくはリードザイム（ｌｅａｄｚｙｍｅ）、オリゴザイムのような語句と代替可能に用いる。これらの専門用語は全て、酵素活性を有する核酸分子を表す。
ＰＣＡＤＭ−１「異常発現」と関連しそして／もしくはそれにより媒介される疾患、疾病もしくは症状の文脈において用いる「関連する」および「媒介される」は、ＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡの阻害、従ってそれぞれのタンパク質活性レベルの減少が、該疾患、疾病もしくは症状の徴候をある程度軽減することを意味する。
「制限部位」は、制限エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖核酸の部分である。
二本鎖核酸の部分は、核酸およびエンドヌクレアーゼを接触させた時にエンドヌクレアーゼが該部分で核酸の両方の鎖を切断することができる場合、制限エンドヌクレアーゼにより「認識される」。
「特異的に結合する」という用語は、本明細書において用いる場合、特定の分子を認識しそして結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識もしくは結合しない化合物、例えば、タンパク質、核酸、もしくは抗体、酵素、ＤＮＡＺＹＭなどを意味する。
第一のオリゴヌクレオチドは第二のオリゴヌクレオチドと、触媒コアの側面に位置する２〜１０ｂｐの相補的領域を有するオリゴヌクレオチドのみが相互にアニーリングすることができる条件下でこれら２つのオリゴヌクレオチドがアニーリングする場合に「高いストリンジェンシーで」アニーリングする。２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせるのに用いる条件のストリンジェンシーは、他の因子の中でも、温度、イオン条件、アニーリング媒質のイオン強度、インキュベーション期間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量、および既知である場合、２つのオリゴヌクレオチド間の非相同性の予想される程度の関数である。アニーリング条件のストリンジェンシーを調整する方法は既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照）。
本明細書において用いる場合、「導入遺伝子」という用語は、トランスジェニック細胞もしくは哺乳類によりコードされる外来核酸配列を意味する。
「組み換え細胞」は、導入遺伝子を含んでなる細胞である。そのような細胞は、真核細胞もしくは原核細胞であることができる。また、トランスジェニック細胞には、導入遺伝子を含んでなる胚性幹細胞、細胞が導入遺伝子を含んでなるトランスジェニックＥＳ細胞から生じるキメラ哺乳類から得られる細胞、トランスジェニック哺乳類またはその胎児もしくは胎盤組織から得られる細胞、および導入遺伝子を含んでなる原核細胞が包含されるが、これらに限定されるものではない。
「外来核酸」という用語は、細胞もしくは動物への核酸の導入を促進する目的のために開発されている技術を用いて核酸が細胞もしくは動物に導入されていることを意味する。
「側面に位置する基質領域（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」は、触媒コアの両側に位置しそしてその基質の部分に相補的である（すなわち、塩基対合することができる）ＤＮＡＺＹＭの部分を意味する。一般に、そのような相補的配列は１００％である。例えば、８〜１０のうちわずか２塩基が塩基対合することができる。
「タグ」ポリペプチドは、興味のあるタンパク質にペプチド結合により連結した場合に、タンパク質の位置を特定するために、それを細胞抽出物から精製するために、結合アッセイ用にそれを固定するために、またはそうでなければその生物学的特性および／もしくは機能を研究するために用いることができる任意のタンパク質を意味する。
本明細書において用いる場合、「トランスジェニック哺乳類」は、その生殖細胞が外来核酸を含んでなる哺乳類を意味する。
本明細書において用いる場合、「処置する」ことは、前立腺癌の症状を患者が経験する頻度を減らすことを意味する。
「ベクター」という用語は、本明細書において用いる場合、外来核酸をコードする任意のプラスミドもしくはウイルスを意味する。該用語にはまた、例えばポリリシン化合物などのような、ビリオンもしくは細胞への核酸の導入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物も包含されると解釈されるべきである。ベクターは、患者へのＰＣＡＤＭ−１タンパク質もしくは哺乳類ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、もしくはＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸に相補的なＤＮＡＺＹＭ、もしくはその一部の送達ための送達媒体として適当なウイルスベクターであることができ、またはベクターは該目的のために適当な非ウイルスベクターであることができる。細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当該技術分野において周知であり、そして例えばＭａ ｅｔ ａｌ．（１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６）に記述されている。ウイルスベクターの例には、組み換えワクシニアウイルス、組み換えアデノウイルス、組み換えレトロウイルス、組み換えアデノ随伴ウイルス、組み換えトリポックスウイルスなどが包含されるが、これらに限定されるものではない（Ｃｒａｎａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／１７８１０号；１９９４年１０月２７日に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／２３７４４号）。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが包含されるが、これらに限定されるものではない。
「ノックアウトターゲッティングベクター」は、該用語を本明細書において用いる場合、取り除かれそして／もしくは別の核酸配列で置換される興味のある標的配列の側面に位置する核酸領域にその各々が相補的である２つの核酸配列を含んでなるベクターを意味する。従って、これら２つの核酸配列は、相同的組み換えのプロセスによって取り除かれる標的配列の側面に位置する。
［説明］
Ｉ．単離された核酸
Ａ．センス核酸
本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸に関し、ここで、該核酸は配列番号１の配列を有する核酸と少なくとも９８％一致を共有する。好ましくは、該核酸は、配列番号１と約９９％ホモロガス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である。さらに好ましくは、該核酸は配列番号１である。
好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸は、ヌクレオチド番号１９０においてＴからＡへの変化、ヌクレオチド番号１９１においてＡからＣへの変化、ヌクレオチド番号４６５においてＧからＣへの変化、ヌクレオチド番号４７５においてＣからＧへの変化、ヌクレオチド番号４８８においてＣからＧへの変化、およびヌクレオチド番号５０５においてＴからＣへの変化を含んでなり、ここでヌクレオチド番号は配列番号１に対するものである。従って、ＰＣＡＤＭ−１はＡＴＧ翻訳開始部位に関してヌクレオチド１９０におけるＡ、ヌクレオチド１９１におけるＣ、ヌクレオチド４６５におけるＣ、ヌクレオチド４７５におけるＧ、ヌクレオチド４８８におけるＧ、ヌクレオチド５０５におけるＣを含んでなると理解される。
さらに好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡは、本明細書中に開示されるＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭヌクレアーゼ、例えば配列
ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号９）、および配列ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号１０）
を有するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭにより切断される。
別の局面では、本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１、またはそのフラグメントをコードする単離された核酸に関し、ここで、核酸によりコードされるタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９８％ホモロジーを共有する。好ましくは、該タンパク質は、配列番号２と約９９％ホモロガスであり、そして最も好ましくは約１００％ホモロガスである。より一層好ましくは、該核酸によりコードされるＰＣＡＤＭ−１タンパク質は配列番号２である。
さらに、配列番号１を有する核酸によりコードされるポリペプチドは、ＰＣＡＤＭ−１、例えば配列番号５〜８を有するオリゴヌクレオチドと特異的に結合する少なくとも１つの二本鎖核酸オリゴマーを優先的に結合する。
さらに、ＰＣＡＤＭ−１のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約９８％の配列一致を共有し、そして配列番号２のＰＣＡＤＭ−１タンパク質のアミノ酸残基番号６４、１５５、１５９、１６３および１６９におけるアミノ酸置換を含んでなり、そしてヒトＳ２のアミノ酸と比較される。より一層好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基番号６４におけるＴ（トレオニン）残基、アミノ酸残基番号１５５におけるＮ（アスパラギン）残基、残基番号１５９におけるＡ（アラニン）、残基番号１６３におけるＲ（アルギニン）、および残基番号１６９におけるＲ（アルギニン）を含んでなると理解される。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１ホモログが存在すると考えられそして本明細書中に開示される配列データを用いて本明細書中に記載される方法を用いて容易に同定および単離できることを認めるであろう。従って、本発明は、ヒトアイソフォームおよび本明細書中に提供される開示に基づいて容易に同定できる他の種よりのＰＣＡＤＭ−１ホモログの双方である別のＰＣＡＤＭ−１類も包含する。
本発明の単離された核酸は、本発明のＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列、およびそれが細胞を含まない場合または細胞と関連する場合にヌクレオチド配列にさらに安定性を与えるＤＮＡまたはＲＮＡの化学修飾を含むそのいずれの修飾形も含むと解釈されるべきである。ヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチド配列が細胞により取り上げられる場合の効率または細胞内でそれが発現される効率を増大するために使用されてもよい。ヌクレオチド配列の修飾のいずれかまたはすべての組み合わせが本発明に入ると考えられる。
本発明は、本明細書中に開示される核酸およびアミノ酸配列のみに限定されると解釈されるべきではない。一旦本発明を武器とすると、当該技術分野の熟練者にとって、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質、例えば哺乳動物の他の種（例えばサル、テナガザル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコなど）内に存在するものをコードする他の核酸は、本明細書中に開示されるＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドをコードするヒトＰＣＡＤＭ−１核酸の単離のための実験の詳細部分中に本明細書中で記載された方法（例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング）、および当該技術分野で周知（例えばｍＲＮＡ試料を用いる逆転写ＰＣＲおよび抗体に基づく方法）または今後開発される方法に従って得られることは容易に分かる。
さらに、例えばサムブルックら「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびオースベルら「分子生物学における最近のプロトコール」（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中に記載の方法を用いるＰＣＡＤＭ−１の変異体、誘導体または変種の生成のためにいかなる数の方法を用いてもよい。
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することによるタンパク質またはポリペプチド内のアミノ酸変化の導入のための方法は、当該技術分野で周知でありそしてサムブルックら（１９８９、上記）およびオースベルら（１９９７、上記）中にも記載されている。
本発明は、タグ（ｔａｇ）ポリペプチドをコードする核酸が共有結合によりそれに連結している哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸を含む。すなわち、本発明は、タグポリペプチドをコードする核酸配列がヒトＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸に共有結合により連結されているキメラ核酸を包含する。このようなタグポリペプチドは、当該技術分野で周知でありそして例えば、緑色蛍光タンパク質、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピリビン酸キナーゼ、（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルス血球凝集素タグポリペプチド、フラッグ（ｆｌａｇ）タグポリペプチド、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグポリペプチドを含む。しかし、本発明は、上記のタグポリペプチドをコードする核酸に限定されると決して解釈されてはならない。むしろ、それらのタグポリペプチドに本質的に類似する様式で機能するポリペプチドをコードするいずれの核酸配列も本発明内に含まれると解釈されるべきである。
タグポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸は、細胞、組織、および／または生物体全体（例えば哺乳動物胚）内でＰＣＡＤＭ−１を定位（ｌｏｃａｌｉｚｅ）し、細胞から分泌されるＰＣＡＤＭ−１を検出し、そして細胞内のＰＣＡＤＭ−１の役割を研究するために使用できる。さらに、タグポリペプチドの付加は、本発明のタンパク質が産生されそして容易に精製できるように「タグ付された」タンパク質の単離および精製を容易にする。
本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドと特異的に結合するデュプレックス（すなわち二本鎖）核酸も含む。当該技術分野の熟練者は、本明細書内に提供される開示に基づいて、このような二本鎖核酸が、ＰＣＡＤＭ−１プローブ１（５’−ＣＡＣＧＧＡＴＧ−３’（配列番号５））およびＰＣＡＤＭ−１プローブ２（５’−ＣＡＣＡＡＴＧＡ−３’（配列番号６））、５’−ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号７）、および５’−ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号８）を含むことを理解するであろう。熟練者は、本明細書中の別の部分でさらに十分考察されるように、ＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する核酸は、充実組織または流体より誘導されたタンパク質試料中のＰＣＡＤＭ−１の存在または不在を検出するため、およびその中のＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価するために使用できることを認めるであろう。従って、デュプレックス（すなわち二本鎖、これらは本明細書中では相互交換可能に使用される）核酸は、前立腺ガンを含み、それに限定はされないが、ＰＣＡＤＭ−１の不良−発現と関連するいかなる疾患、障害、または症状の検出のために有用な強力なプローブである。
Ｂ．アンチセンス核酸
ある状況中では、ＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害することが望ましく、従って本発明はＰＣＡＤＭ−１発現の阻害のために有用な組成物を含む。従って、本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の一部分または全体に相補的な単離された核酸を特徴とし、該核酸は転写に関してアンチセンス方向にある。好ましくは、アンチセンス核酸は、配列番号１と少なくとも約９５％ホモロジーを有する核酸と相補的である。好ましくは、該核酸は、転写に関してアンチセンス方向である配列番号１の配列を有する哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１、またはそのフラグメントをコードする核酸の一部分または全体に相補的な核酸に対して、約９０％ホモロガス、さらに好ましくは約９７％ホモロガス、さらに好ましくは約９８％ホモロガス、そして最も好ましくは約９９％ホモロガスである。最も好ましくは、核酸は、配列番号１、またはそのフラグメントを有する核酸の一部分または全体に対して相補的である。このようなアンチセンス核酸は、ＰＣＡＤＭ−１の発現、機能または双方を阻害するために役立つ。
あるいは、本発明のアンチセンス分子は合成により作製され次いで細胞に提供されてもよい。約１０〜約３０、そしてさらに好ましくは約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーは、それらが容易に合成されそして標的細胞内に導入されるので好ましい。本発明で考慮される合成アンチセンス分子は、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された生物学的活性を有する、当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチド誘導体を含む（コーエン、上記、タリス（Ｔｕｌｌｉｓ、１９９１、米国特許第５，０２３，２４３号（その全体を本明細書に編入する）参照）。
ＩＩ．単離されたポリペプチド
本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１分子を含んでなる単離されたポリペプチドも含む。好ましくは、単離されたポリペプチドは、配列番号２に約９８％ホモロガス、そしてさらに好ましくは９９％ホモロガスである。さらに好ましくは、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１を含んでなる単離されたポリペプチドは、ヒトＰＣＡＤＭ−１である。最も好ましくは、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１を含んでなる単離されたポリペプチドは配列番号２である。
さらに、ヒトＳ２のアミノ酸配列に関して、ＰＣＡＤＭ−１は、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４、１５５、１５９、１６３および１６９でアミノ酸置換を含んでなる。さらに特定すると、ＰＣＡＤＭ−１は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸残基番号６４におけるＴ（トレオニン）、アミノ酸残基番号１５５におけるＮ（アスパラギン）、残基番号１５９におけるＡ（アラニン）、残基番号１６３におけるＲ（アルギニン）、および残基１６９におけるＲ（アルギニン）を含んでなると理解される。
ＰＣＡＤＭ−１タンパク質の生物学的性質は、ＣＡＣＧＧＡＴＧ（ＰＣＡＤＭ−１プローブ１、配列番号５）およびＣＡＣＡＡＴＧＡ（ＰＣＡＤＭ−１プローブ２、配列番号６）、ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号７）、およびＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号８）などの少なくとも１種の配列を有する核酸配列と特異的に結合する能力を含むと解釈されるべきであるが、しかし限定はされない。
本発明は、本明細書に開示されるように、ＰＣＡＤＭ−１を含んでなるタンパク質またはペプチドの類似体も提供する。類似体は、天然に存在するタンパク質またはペプチドと、保存アミノ酸配列の相違によりまたは配列に影響しない修飾により、または双方により異なってもよい。例えば、保存アミノ酸変化は、タンパク質またはペプチドの一次配列を改変するけれどもその機能は通常改変しないように作製されてもよい。保存アミノ酸置換は、典型的には、下記の基内での置換を含む。
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
修飾（通常は一次配列を改変しない）は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または実験室内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）におけるポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、またはカルボキシル化を含む。さらにグリコシル化のまま、例えば合成およびプロセシングまたはその後のプロセシング工程の間のポリペプチドのグリコシル化パタンを変更することにより、例えばグリコシル化に影響する酵素、例えば哺乳動物グリコシル化酵素または脱グルコシル化酵素にポリペプチドを暴露することにより行われるものを含む。リン酸化されたアミノ酸残基を有する配列、例えばホスホトリシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンも包含される。
タンパク質分解劣化に対する抵抗を改善するためまたは溶解特性を最適化するためまたは治療剤としてさらに適するようにするために通常の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドも含まれる。このようなポリペプチドの類似体には、天然に存在するＬ−アミノ酸以外、例えばＤ−アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸の残基を含むものが含まれる。本発明のペプチドは、本明細書に表示した特定の例示プロセスのいずれの生成物にも限定されない。
本発明は、変異体、誘導体および変種が、得られたペプチド（またはＤＮＡ）が本明細書中に記載の配列と一致せず、反対に本明細書中に開示されたペプチドと同様の生物学的性質を有し、ペプチドが本発明のＰＣＡＤＭ−１ペプチドの生物学／生化学的性質を有するような１種またはそれ以上のアミノ酸（またはそれらをコードするヌクレオチド配列に言及する場合には、１個またはそれ以上の塩基対で改変されている）内で改変されるＰＣＡＤＭ−１ペプチドである、本発明のペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ）の「変異体」、「誘導体」および「変種」を包含するとも解釈されるべきである。
さらに、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１配列の天然に存在する変種または組換え誘導された変異体を含むと解釈されるべきであり、その変種または変異体は、本発明の全長クローンと比較して、それ以上、以下または同等のいずれかの生物学的活性であるようにそれらによりコードされるタンパク質を与える。
核酸、およびそれらによりコードされるペプチドは、細胞内のＰＣＡＤＭ−１の機能を解明するために有用な道具である。さらに、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１を含んでなる核酸およびアミノ酸は、例えば、ＰＣＡＤＭ−１発現に影響しそして有望な前立腺抗ガン抗細胞増殖剤候補である化合物を同定するために使用できる有用な診断剤である。核酸、それによりコードされるタンパク質、または双方は、哺乳動物内のＰＣＡＤＭ−１の発現を増加または減少するために哺乳動物に投与できる。これは、健康な哺乳動物内のＰＣＡＤＭ−１の正常な発現と比較して、哺乳動物内のＰＣＡＤＭ−１の過少または過大発現が、ＰＣＡＤＭ−１の改変された発現に関連する疾患または病状を媒介する状況下で、哺乳動物に対して有用であり得る。
その上、本発明の核酸およびアミノ酸は、ＰＣＡＤＭ−１作用の研究、新規診断剤の同定および前立腺ガンおよび多分その他のガンの治療のための治療剤のために、そしてなかでもＰＣＡＤＭ−１の細胞での役割を解明するために有用な道具である、組換え細胞およびトランスジェニックの非ヒト（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ）哺乳動物を作製するために使用できる。
さらに、本発明の核酸およびアミノ酸は、遺伝子発現もしくはタンパク質発現のいずれかのレベルを評価することにより、前立腺ガンなどの重症度、段階および予後を評価するために診断的に使用できる。本発明の核酸およびタンパク質は、前立腺ガンの治療の有効性を評価するためのアッセイの開発にも有用である。すなわち、本発明の核酸およびポリペプチドは、ＰＣＡＤＭ−１発現に対する種々の治療方法の効果を検出しそれにより治療方法の有効性を確認するために使用できる。
ＩＩＩ．ベクター
別の関連する局面で、本発明は、核酸が好ましくは核酸によりコードされるタンパク質の発現を指令できるようなプロモーター／調節配列を含んでなる核酸に操作可能に連結される哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含む。従って、本発明は、細胞内の外因性ＤＮＡの同時的発現および転写を伴う細胞内への外因性ＤＮＡの導入のための発現ベクターおよび方法を包含し、これは例えばサムブルックら（１９８９、上記）およびオースベルら（１９９７、上記）中に記載されている。
ベクターを用いてＰＣＡＤＭ−１を発現すると、大量の組換え産生タンパク質の単離を可能とする。さらに、ＰＣＡＤＭ−１発現の欠失または低下したレベルがこのような発現と関連する疾患、障害または病状を起こす場合に、プロモーター／調節配列により推進されるＰＣＡＤＭ−１の発現は、ＰＣＡＤＭ−１が提供される遺伝子治療を含み、それに限定はされない有用な治療剤を提供できる。ＰＣＡＤＭ−１の投与が有用であり得る発現の低下したレベル、タンパク質のレベル、またはタンパク質の低下した活性と関連する疾患、障害または病状には、前立腺ガン、およびその他のガンなどを含むことができるが、それらに限定はされない。従って、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１発現、翻訳、および／または活性を阻害する方法だけではなく、ＰＣＡＤＭ−１発現、タンパク質レベル、および／または活性を上昇させることに関連する方法も含み、それはＰＣＡＤＭ−１発現および／または活性の低下および上昇の双方が、有効な治療剤を提供する際に有用であり得るからである。
いずれの特定のプラスミドベクターまたはその他のＤＮＡベクターの選択も本発明の限定因子ではなく、広範な多数のベクターが当該技術分野で周知である。さらに、特定のプロモーター／調節配列を選定しそして所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にそれらのプロモーター／調節配列を操作可能に連結することは、熟練者の技術の中に十分に入る。このような技術は当該技術分野で周知であり、例えばサムブルックら「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびオースベルら「分子生物学における最近のプロトコール」（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中に記載されている。
このように本発明は哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含んでなるベクターを含む。ベクター内への所望の核酸の組込みおよびベクターの選定は、例えばサムブルックら（上記）およびオースベルら（上記）中に記載されているように当該技術分野では周知である。
本発明は、このようなベクターを含む細胞、ウイルス、プロウイルス等も含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含んでなる細胞を産生するための方法は、当該技術分野では周知である。例えばサムブルックら（上記）およびオースベルら（上記）を参照のこと。
ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸は、さまざまなプラスミドベクター内にクローニングされてもよい。しかし、本発明はプラスミドまたはいかなる特定のベクターに限定されると解釈されるべきではない。反対に、本発明は容易に利用できるかおよび／または当該技術分野で周知の広範囲で多数のベクターを包含すると解釈されるべきである。
ＩＶ．アンチセンス分子、リボザイム、およびＤＮＡ酵素
さらに、本発明は、細胞が細胞プロセスにおけるＰＣＡＤＭ−１の役割を解明するために有用なモデルであるアンチセンス核酸を含んでなる組換え細胞を含む。すなわち、いかなる特定の理論に限定されることも望まないが、前立腺ガン組織内にはあるがしかし良性前立腺ガン内または正常な前立腺組織内にはないＰＣＡＤＭ−１の増加した発現は、ＰＣＡＤＭ−１がガン増殖と関連する細胞生存および細胞増殖に関与することを示す。従って、ＰＣＡＤＭ−１に相補的なアンチセンス核酸を含んでなるトランスジェニック細胞は、細胞内のＰＣＡＤＭ−１の作用の機構およびその役割の研究のためおよびＰＣＡＤＭ−１過剰発現の影響を軽減する治療剤の同定のために有用な道具である。さらに、細胞内のＰＣＡＤＭ−１発現および／または活性を低下させる方法は、上昇したＰＣＡＤＭ−１発現、細胞内のＰＣＡＤＭ−１タンパク質またはそれよりの分泌の上昇したレベル、および／または上昇したＰＣＡＤＭ−１活性により媒介またはそれらと関連する疾患、障害または病状のための有用な診断剤または治療剤を提供できる。このような疾患、障害または病状には、前立腺ガンなどが含まれるが、それらに限定はされない。
当該技術分野の熟練者は、細胞内のＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルを低下させるための一つの方法が、タンパク質をコードする核酸の発現を阻害することであることを認めるであろう。ＰＣＡＤＭ−１の発現は、例えばアンチセンス分子を用いることにより、そしてまた例えばウイアニおよびケルニカ−ゲッツ（Ｗｉａｎｎｙ ａｎｄ Ｋｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２：７０−７５）に記載のようにリボザイムまたは二本鎖ＲＮＡを用いることにより阻害してもよい。
Ａ．アンチセンス分子
遺伝子発現を阻害するためのアンチセンス分子およびそれらの使用は、当該技術分野では周知である（例えばコーエン「オリゴデオキシリボヌクレオチド、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤」（Ｃｏｈｅｎ，１９８９，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）参照）。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に対して相補性（用語は本明細書の別の部分で定義される）であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（ワイントラウブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９９０，Ｓｃｉｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６２：４０））。細胞内で、アンチセンス核酸は相当するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成しこれにより遺伝子の翻訳を阻害する。
遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は当該技術分野で公知であり、そして例えばマーカス−サクラ（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ，１９８８，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２８９）に記載されている。このようなアンチセンス分子は、アンチセンス分子をコードするＤＮＡを用いる遺伝子発現を介して細胞に提供されてもよく、これはイノウエ（Ｉｎｏｕｅ，１９９３、米国特許第５，１９０，９３１号）により教示されている。
あるいは、本発明のアンチセンス分子は合成的に作製され次いで細胞に提供されてもよい。約１０〜約１００、そしてさらに好ましくは約１５〜約５０ヌクレオチドの間のアンチセンスオリゴマーが好ましく、それはそれらが容易に合成されそして標的細胞内に導入されるからである。本発明により考慮される合成アンチセンス分子には、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された生物学的活性を有する、当該技術分野では公知のオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる（コーエン（上記）、タリス（Ｔｕｌｌｉｓ，１９９１）米国特許第５，０２３，２４３号（引用することによりその全体が本明細書に編入される）参照）。
Ｂ．リボザイム
遺伝子発現を阻害するためのリボザイムおよびそれらの使用も当該技術分野で周知である（例えばチェックら（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２）、ハンペルら（Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：４９２９−４９３３）、エクステインら（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）国際特許出願番号ＷＯ９２／０７０６５号、アルトマンら（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，）米国特許第５，１６８，０５３号、引用することによりそれらの全体が本明細書に編入される）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似した様式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。それらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を介して、分子は、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識しそしてそれを切断するように操作できる（チェック（Ｃｅｃｋ，１９８８，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０））。この方法の主要な長所は、それらが配列特異性のために特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化されることにある。
リボザイムの二種の基本形、すなわち、テトラヒメナ型（ハッセルホフ（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５）およびハンマーヘッド型がある。テトラヒメナ型リボザイムは、長さが塩基４個である配列を認識し、反対にハンマーヘッド型リボザイムは長さが塩基１１〜１８個である塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、配列が標的ｍＲＮＡ種内に独占的に存在する可能性が増加する。その結果、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するためにはハンマーヘッド型リボザイムはテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、そして１８塩基認識配列は、種々の無関係なｍＲＮＡ分子内にランダムに存在するような短い配列より好ましい。
ＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害するために有用なリボザイムは、ＰＣＡＤＭ−１によりコードされるＰＣＡＤＭ−１のｍＲＮＡ配列に相補的であるかまたは配列番号１の少なくとも一つに少なくとも約８０％ホモロジーを有する基本リボザイム構造内に標的配列を組み込むことにより設計してもよい。ＰＣＡＤＭ−１を標的とするリボザイムは、市場で入手できる試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて合成しても、またはそれらをコードするＤＮＡから遺伝子的に発現させてもよい。
Ｃ．ＤＮＡ酵素
本発明は、細胞増殖応答のために要求されるＲＮＡ種を切断するように指定されたＤＮＡ酵素、または酵素核酸分子を包含する。具体的には、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１遺伝子によりコードされるＲＮＡを切断できるＤＮＡＺＹＭ（ＤＮＡ酵素）の選定および特性決定を含んでなる。このようなＤＮＡ酵素は、なかでも、１種またはそれ以上のガン内の腫瘍細胞の生存を阻害するために使用できる。
本発明において、ＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡを切断するＤＮＡＺＹＭの例は、図２および図３に記載されている（すなわちＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号９）およびＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−２（配列番号１０））。当該技術分野の通常の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、記載の実施例より、細胞増殖に必要な標的ＲＮＡを切断する他のＤＮＡＺＹＭが、例えばフィンケル（Ｆｉｎｃｋｅｌ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：２４４１−２４４２）中に記載の教示に従って容易に設計でき、そしてこのようなＤＮＡＺＹＭが本発明に包含されることを理解するであろう。
本明細書中でＤＮＡ酵素とも呼ばれるＤＮＡＺＹＭは、それらが簡単な構造を有する短いＤＮＡ分子であり、ヌクレアーゼに対してさらに抵抗性であるので、重要なことが最近証明された。ＤＮＡ酵素として特定された一つの触媒モチーフは、１５ｂｐ’１０−２３’触媒モチーフ（ここで、’１０−２３’はクローンの名称である）、ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ（フィンケル（Ｆｉｎｃｋｅｌ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：２４４１−２４４２）、スリラムら（Ｓｒｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１５：６６７−６７３）、サンら（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７２３６−１７２４１））である。’１０−２３’触媒モチーフを含んでなるＤＮＡ酵素のいくつかの例には、ＨＩＶ−１ｇａｇＲＮＡ（スリラムら（Ｓｒｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１５：６６７−６７３））およびｃ−ｍｙｃ ＲＮＡ（サンら（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７２３６−１７２４１））、およびｅｇｒ−１ ｍＲＮＡ（サンチアゴら（Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：１２６４−１２６９））を標的とするＤＮＡ酵素が含まれる。このようなＤＮＡ酵素は、約１５ｂｐの触媒ドメインを含んでなり、さらに触媒ドメインの両側に６〜１０ｂｐのフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域を含んでなることができる。フランキング領域は、ヒトＰＣＡＤＭ−１（配列番号１）と約１００％ホモロジーを共有することができる（図２および３参照）。従って、当該技術分野に熟練しそして本明細書内で提供される開示を武器とする者は、活性ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭすなわちＤＮＡ酵素が触媒コアとも呼ばれる触媒中心を含んでなり、これは本明細書の別の部分で例示されおよび／または当該技術分野で公知のものに類似し、そして標的部位での切断が起きるようにＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを結合できる結合アームをさらに含んでなることを認めるであろう。本発明のＤＮＡＺＹＭは、このような切断を妨害しない追加の配列を含んでなることができ、これは本明細書内で提供される開示に基づいて熟練者により理解されるであろう。
一般に、酵素核酸は先ず標的ＲＮＡと特異的に結合することにより作用する。結合は、酵素核酸酵素コアドメインが標的ＲＮＡに近い近接位置に保持され次いで切断が起きるように、酵素核酸の標的結合部分（すなわちフランキング結合領域または「アーム」）により媒介される。従って、酵素核酸は、先ず認識し次いで相補的塩基対形成を介して標的ＲＮＡを結合し、そして正しい部位に結合した場合には、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の直接合成のためのその能力を破壊できる。酵素的核酸が結合しそしてそのＲＮＡ標的を切断した後に、それはそのＲＮＡから開放されて他の標的を探索しそして反復して結合して新しい標的を切断でき、一つのＤＮＡＺＹＭ分子が１個を越えるＲＮＡ分子を切断できる。
ＤＮＡＺＹＭがリン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉａｔｅ）修飾を要求せずそしてヌクレアーゼに対して比較的安定なので、ＤＮＡＺＹＭの酵素特性は、他の技術よりも有利である。ＤＮＡＺＹＭの別の長所は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡＺＹＭの「半減期」がリボザイムについて報告された数時間ではなくて数日であることにある。単一のＤＮＡＺＹＭ分子は、標的ＲＮＡの多数の分子を切断できる。それに加えて、ＤＮＡＺＹＭは高度に特異性の阻害剤であり、標的ＲＮＡに結合するフランキング配列の塩基対形成機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡ切断の機構にも依存する阻害の特異性を有する。切断の部位近くの単一ミスマッチ、すなわち塩基置換は、ＤＮＡＺＹＭの触媒活性を完全に排除するように選択され、そして実験的研究における陰性対照オリゴヌクレオチドを提供できる。
エンドヌクレアーゼ酵素活性を有する核酸分子は、ヌクレオチド塩基配列特異性様式で他の別々のＲＮＡ分子を反復して切断できる。このような酵素ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、実際的にいかなるＲＮＡ転写物も標的とすることができ、そして効率的な切断がｉｎ ｖｉｔｒｏで達成される（ザウグら（Ｚａｕｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：４２９）、ウーレンベック（Ｈｈｌｅｎｂｅｃｋ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５９６）、キムら（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８７８８），ドレイフュス（Ｄｒｅｙｆｕｓ，１９８８，Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｑｕａｒｔ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．６：９２）．ハゼロフおよびゲルラッハ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５）、チェック（Ｃｅｃｈ，１９８８，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０）、およびジェフェリーズら（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１３７１））。
それらの配列特異性のために、トランス−切断性ＤＮＡＺＹＭはヒト疾患のための重要な潜在的治療剤である。ＤＮＡＺＹＭは、細胞ＲＮＡの背景内で、特定のＲＮＡ標的を切断するように設計できる。このような切断イベントは、ＲＮＡに非機能性を与えそしてそのＲＮＡからのタンパク質発現を妨げる。この様式において、疾患状態と関連するタンパク質の合成が選択的に阻害できる。
ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡ内の特異性部位を切断するＤＮＡＺＹＭ（すなわちＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１配列番号９および配列番号１０）は、疾患、例えばガンおよびその他の病状を治療するための新規の治療方法を代表する。本明細書中の別の部分に開示されるデータは、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭがＰＣＡＤＭ−１の活性を阻害することおよびＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭの触媒活性が阻害効果のために必要であることを証明する。当該技術分野の通常の熟練者は、本明細書内で提供される開示より、ＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡを切断する別のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭが、本明細書内で提供される開示に基づいて容易に設計できることおよびこのようなＤＮＡＺＹＭが本発明の範囲内であることが明らかであることを見いだすであろう。
本明細書中の本発明の好ましい態様の一つで、酵素核酸分子は、’１０−２３’モチーフ、すなわちハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフを含んでなる。’１０−２３’触媒モチーフ（ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ）を有するＤＮＡＺＹＭは、ＨＩＶ−１ ｇａｇ ＲＮＡ（スリラムおよびバネルジア（Ｓｒｉｒａｍ ａｎｄ Ｂａｎｅｒｊｅａ，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．１５：６６７−６７３））、およびｃ−ｍｙｃ ＲＮＡ（サンら（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７２３６−１７２４１））、およびｅｇｒ−１ ｍＲＮＡ（サンチアゴら（Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１：１２６４−１２６９））を標的とするＤＮＡＺＹＭを含む。ハンマーヘッドモチーフの例は、ドレイフュス（上記）、ロッシら（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ８：１８３）に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、例えばハンペルら（Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．）欧州特許（ＥＰ）第０３６０２５７号、ハンペルら（Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７４：１７１−１７７）、フェルトステインら（Ｆｅｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ８２：５３−６１）、ハゼロフおよびゲルラッハ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１）およびハンペルら（Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４１：５６６−５８０）に記載されている。
本明細書の別の部分で考察される特定のモチーフは、本発明を限定するものではなくそして当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、本発明の酵素核酸分子（またはこのような分子の多重フラグメント）中で重要なすべてのものは、結合アームが標的ＲＮＡ配列の１個またはそれ以上に相補的である触媒ドメインにフランキングする特定の基質結合部位またはアームをＤＮＡＺＹＭが含んでなること、および分子へのＲＮＡ切断活性を与える基質結合部位内またはその周囲のヌクレオチド配列（すなわち酵素部分）をＤＮＡＺＹＭがさらに含んでなることを認めるであろう。
ＤＮＡＺＹＭの触媒コアにフランキングするこのようなアームは本明細書中で例示され（例えば配列番号９および配列番号１０）そしてそれぞれ図２および３に図示されている。すなわち、それらのアームは、相補塩基対形成相互作用を介して互いに十分な近接位置にＤＮＡＺＹＭと標的ＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡとをもたらすように意図されている、ＤＮＡＺＹＭの５’および３’末端での配列を含んでなり、例えばＤＮＡＺＹＭ配列の配列番号９および配列番号１０は、ＤＮＡ酵素の触媒ドメインにフランキングする結合アーム（すなわち８〜１０塩基対）を含んでなり、これにより基質結合ドメインを含んでなる。
一つの局面で、本発明は所望の標的のＲＮＡに高度の特異性を示す酵素切断剤（すなわちＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭまたはＤＮＡ酵素）すなわちそれはＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡを特異的に切断するが試料中に含まれるであろう他のｍＲＮＡは切断しないものを設計および／または作製するための方法を包含する。従って、本明細書中で提供される教示、なかでもＰＣＡＤＭ−１の配列、ＰＣＡＤＭ−１が前立腺ガンと関連しおよび／またはその治療剤であるという驚くべき発見、および本明細書中で例示する２種のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ（すなわち、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号９）およびＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−２（配列番号１０））を実行に移すことを武器とすると、熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を産生および／または設計できる。
酵素核酸分子は、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードする標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域（すなわち、ＡＵＧ翻訳開始部位からほぼヌクレオチド−９〜ほぼヌクレオチド＋４５０までを含んでなる５’ｍＲＮＡ領域）を優先的に標的とする。これは、ＤＮＡ酵素を作製する技術の熟練者が、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡＺＹＭが、ｍＲＮＡの５’末端を優先的に標的とするＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを選択することにより産生できることを認めるであろうからであり、それは、末端短縮されたＰＣＡＤＭ−１タンパク質が、不変のＰＣＡＤＭ−１タンパク質と同様の生物学的活性または性質を含んでなることができるからである。さらに加えて、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡ配列の５’末端から５’翻訳開始部位より約４５０塩基までの間にある領域（重複領域を含む）を標的とするＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭが特に価値がある。すなわち、いかなる特定の理論に限定されることも望まないが、残存ｍＲＮＡ（すなわちＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ処理の後）により発現されるであろういずれの短いペプチドも下流のロイシンジッパー様ドメインを含まず、そのドメインは、ＰＣＡＤＭ−１変異部位および推定ＤＮＡ結合ドメインを含むものである。この観点より、ＰＣＡＤＭ−１−ＤＮＡＺＹＭ−１はＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡの配列１５５〜１７１を標的とし、そしてＰＣＡＤＭ−１−ＤＮＡＺＹ−２ＭはＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡの配列−７〜＋９を標的とする（すなわち、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡのＡＵＧ翻訳開始部位より）。
従って、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡのそれらの領域に相補的な配列を含んでなる結合アームは、リボ核酸を切断できる触媒ドメインを含んでなる核酸に共有結合的に連結されるように合成、またはその他の方法で作製できる。このようにして作製された分子のＤＮＡ酵素活性は、当該技術分野で周知の他のアッセイのなかでも、本発明のＤＮＡ酵素を同定するためにＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを切断するための分子の能力を評価することにより評価できる。それら分子を合成し、そしてそれらのＤＮＡ酵素活性を評価するための方法は、当該技術分野で周知であるかおよび／または本明細書中の別の部分に記載されている。
本明細書中に提供される教示を武器とする熟練者は、本発明が、少なくとも１種の酵素核酸を用いる疾患または病状の治療を包含することを理解するであろう。すなわち、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＤＮＡＺＹＭまたは酵素核酸を互いに組み合わせ、そして化学治療剤、小分子、ペプチド擬似体、アンチセンス、リボザイム、抗体などを含み、それらに限定はされない他の化合物と組み合わせて使用できることを認めるであろう。従って、本発明は、単一の酵素核酸のみの使用には限定されず、むしろ、本発明はＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に切断する少なくとも１種のＤＮＡＺＹＭと組み合わせた他のＤＮＡＺＹＭ、例えばＭＭＰ−２およびＶＥＧＦ−１などに対するＤＮＡ酵素を用いることを包含する。酵素核酸分子は、所要の場合には特定の細胞または組織に外因的に供給されることができる。本発明のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、上記に考察した疾患および病状（例えば前立腺ガン）、および、疾患または病状に悩まされない細胞または組織内のＰＣＡＤＭ−１活性のレベルと比較して細胞または組織内で高いＰＣＡＤＭ−１レベルに関連するいかなる他の疾患または病状の治療、予防、または双方のために有用である。
ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、細胞に直接投与しても、またはカチオン脂質と錯体化、リポソーム内にパッケージング、またはその他の方法で細胞に送達できる。核酸または核酸錯体は、注入、輸液ポンプまたはステントを介して、バイオポリマー内に組込みまたは組み込まずに、ｅｘ ｖｉｖｏ（生体外）、またはｉｎ ｖｉｖｏで関連組織に局所投与できる。好ましい態様では、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、図１Ａに図示するように配列番号１の配列と相補的な結合アーム（８〜１０ｂｐ）を含んでなる。
従って、一つの局面では、本発明はＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸から発現されたＲＮＡの切断を介して遺伝子発現および／または細胞増殖を阻害するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを含む。それらの化学的または酵素的に合成されたＤＮＡ分子は、それらの標的ｍＲＮＡの接近可能領域と結合する結合領域、すなわち「結合アーム」を含んでなる。
ＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡの切断を触媒作用する触媒コアまたはドメインをさらに含んでなる。ＤＮＡ分子は、好ましくは’１０−２３’モチーフ触媒コアを含んでなる。結合すると、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは標的ｍＲＮＡを切断し、翻訳、タンパク質蓄積、またはその双方を防止する。標的ｍＲＮＡの発現がないと、細胞増殖および／または生存が阻害される。
一つの態様では、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭはＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを切断しそして細胞増殖および／または生存を阻害する。このようなＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、ガンまたはその他の疾患の予防および／または治療のために有用である。ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、直接添加するか、またはカチオン脂質と錯体化、リポソーム内にパッケージング、またはその他の方法を用いて平滑筋細胞に送達できる。ＤＮＡまたはＤＮＡ錯体は、カテーテル、輸液ポンプまたはステントの使用を介して、バイオポリマー内に組込みまたは組み込まれずに関連組織に局所的に投与できる。同様に送達されたＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、ＰＣＡＤＭ−１の上昇したレベルと関連するある種のガン、特には前立腺ガンの増殖および／または生存を阻害するためにも有用である。本明細書中に記載された方法を用いて、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを切断しそれにより腫瘍細胞の増殖および／または生存を阻害するする種々のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを、本明細書内の別の部分に記載のように産生、同定、および使用できる。
それらのＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、個別に、または他の薬剤と組み合わせまたは関連させて、本明細書内の別の部分に開示のように疾患または病状を治療するために使用できる。例えば、ＤＮＡＺＹＭは、ＰＣＡＤＭ−１レベルと関連する疾患もしくは病状を治療するために使用でき、患者を治療でき、または他の適当な細胞を処理してもよく、それらは、本明細書中に提供される開示に基づいて当該技術分野の熟練者には明らかなものである。
別の態様では、記載のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、以上に考察した病状または疾患を治療するために他の公知の治療または外科的方法（例えば冷凍アブレーション法）と組み合わせて使用できる。例えば、記載のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、ガンを治療するための１種またはそれ以上の公知治療剤と組み合わせて使用できるであろう。
標的ｍＲＮＡ
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭがＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に標的とするように設計できることを認めるであろう。結合アームと触媒コアとの間の好ましくない分子内相互作用を有するそれらのＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、本明細書中に例示した種々のアッセイまたは当該技術分野で周知のアッセイを用いて考慮対象から除外される。
熟練者は、本明細書中に提供される教示に基づいて、結合アームの長さをｍＲＮＡ切断活性を最適化するように選定できることを理解するであろう。一般に、それぞれのアーム上で少なくとも約６〜８塩基が標的ｍＲＮＡと結合あるいはその他の相互作用をするために十分である。本明細書中で例示するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、化学的に合成された。使用した合成方法は、ユスマンら（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５）、スカリンジら（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３）、およびウインコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：２６７７−２６８４）中に記載のように通常のオリゴヌクレオチド合成のための方法に従い、そして通常の核酸保護およびカプリング基、例えば５’末端におけるジメトキシトリチルおよび３’末端におけるホスホロアミダイトを利用する。しかし、本発明は、本発明のＤＮＡＺＹＭを産生するためのいかなる特定の方法にも限定されない。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、一旦ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の配列（例えば配列番号１と約９８％を越える配列一致を共有する核酸）を武器とすると、ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを特異的に切断する種々のＤＮＡＺＹＭを産生することが熟練者にとって日常的なこととなることを理解するであろう。すなわち、ｍＲＮＡ配列に沿って種々の６〜１０塩基対「アーム」ヌクレオチド配列を選定しそして本明細書中の開示のようにして、または当該技術分野で公知であるかまたは将来開発されるようにしてＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡ切断活性に対する推定ＤＮＡＺＹＭを評価することにより、種々のＰＣＡＤＭ−１特異性酵素核酸が同定および産生できる。従って、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に切断するこのような酵素核酸は、本発明内に包含される。好ましくは、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸は、長さが約６〜１０ヌクレオチドのサイズ範囲の少なくとも１個の結合アームを含んでなる。さらに好ましくは、酵素核酸は、配列番号１に記載のＡＵＧ翻訳開始部位に対して約−９〜約＋４５０のＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡの配列に相補的な少なくとも１個の結合アームを含んでなる。それより一層好ましくは、翻訳開始部位に対して、結合アームは配列番号１の約−７〜約＋９、および配列番号１の約＋１５５〜＋１７１の配列に相補的である。このような酵素は、配列
ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号９）、および
ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号１０）
を有する本明細書中で例示するものを含むが、それらに限定はされない。
ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、一般的方法を用いるゲル電気泳動により精製または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ウインコットら（上記）参照、それは引用することにより本明細書中に編入される）により精製され、そして水中に再懸濁できる。
ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ活性を最適化する
ＤＮＡＺＹＭ活性は、ドレーパーら（上記）による記載のようにして最適化できる。その詳細はここで繰り返さないが、しかしＤＮＡ酵素結合アームの長さを改変すること（約６から１０塩基対に）または血清Ｄｎａｓｅによるそれらの分解を防止および／またはそれらの酵素活性を増強する修飾（塩基、糖類および／またはリン酸）を用いるＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭの化学合成を含む（例えばエクステインら（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）国際特許出願番号ＷＯ９２／０７０６５号、ペローら（Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：５６５）、ピーケンら（Ｐｉｅｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４）、ユスマンおよびシーダーグレン（Ｕｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４）、ユスマンら（Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，）国際特許出願番号ＷＯ９３／１５１８７号、およびロッシら（Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．）国際特許出願番号ＷＯ９１／０３１６２号、スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）米国特許第５，３３４，７１１号、およびバージンら（Ｂｕｒｇｉｎｅｔ ａｌ．、上記）参照）。
ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、リポソーム内のカプセル化、イオン泳動により、または他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルまたはポリマーマトリックス中への混入により、および生物接着性細粒を含み、それらの限定はされない当該技術分野の専門家には公知の種々の方法により細胞に投与されてもよい。いくらかの指摘として、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、上記のビヒクルを用いるかまたは用いないで細胞または組織にｅｘ ｖｉｖｏで直接送達できる。あるいは、ＤＮＡ／ビヒクルの組み合わせは、直接注入によりまたはカテーテル、輸液ポンプまたはステントの使用により局所送達される。送達の他の経路には、静脈内、筋肉内または関節注入、エーロゾル吸入、経口（錠剤または丸薬形）、局所、全身、眼経由、腹腔内および／または髄腔内送達を含みそれらの限定されない方法を含む。ＤＮＡＺＹＭ送達および投与のさらに詳細な記載は、サリバンら（Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，上記）およびドレーパーら（Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記）で提供され、それらは引用することにより本明細書に編入される。
Ｖ．組換え細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物
本発明は、なかでもＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含んでなる組換え細胞を含む。一つの局面では、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含んでなる組換え細胞は、トランスジェニック非−ヒト哺乳動物を産生するために使用される。すなわち、本発明の外因性核酸、または本明細書中で呼ばれる導入遺伝子を細胞内に導入し、次いで細胞を非−ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成するために使用する。導入遺伝子が導入される細胞は、好ましくは胚幹（ＥＳ）細胞である。しかし、本発明は、本発明の導入遺伝子を含んでなるＥＳ細胞、またはトランスジェニック動物を産生するために使用される細胞にみには限定されないと解釈されるべきである。むしろ、本発明のトランスジェニック細胞は、導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物より誘導されたいずれかの細胞、トランスジェニックＥＳ細胞より誘導されたキメラ動物より誘導された導入遺伝子を含んでなる細胞、および非ヒトトランスジェニック動物を生成するための使用してもよいかまたはよくない導入遺伝子を含んでなるいずれかのその他のものを含むが、しかしそれらに限定はされない。
さらに、導入遺伝子を含んでなる細胞、すなわち組換え細胞の目的が、トランスジェニック動物の生成に限定されると解釈されるべきではないことに注意することは重要である。むしろ、本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含んでなる原核細胞および真核細胞を限定されずに含む、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸が導入されたいずれかの細胞タイプを含むと解釈されるべきである。
細胞が真核細胞である場合、細胞は、本発明の導入遺伝子がその中に導入され、そして所望の遺伝子によりコードされるタンパク質がもはやそれより発現されない場合に利益が得られるいずれかの真核細胞であってもよい。このような利益は、細胞が存在する研究室内または哺乳動物内でｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の遺伝子の発現の欠失を研究できる系、導入された遺伝子欠失を含んでなる細胞が研究、診断および治療の道具として使用できる系、および例えば前立腺ガンなどを含む哺乳動物内の選択された疾患状態のための新規の診断および治療道具の開発のために有用である動物モデルを生成する系が提供されるという事実を含んでもよい。
あるいは、本発明は、本発明の導入遺伝子がその中に導入され、そして所望の遺伝子によりコードされるタンパク質が、それが以前に存在しなかったかもしくは細胞内で発現された場所で発現される場合、または以前に導入遺伝子が導入された場合とは異なるレベルでもしくは環境下で今回発現される場合に、利益が得られるような真核細胞を含む。このような利益は、細胞が存在する研究室内または哺乳動物内で所望の遺伝子の発現がｉｎ ｖｉｔｒｏで研究できる系、導入された遺伝子を含んでなる細胞が研究、診断および治療の道具として使用できる系、および哺乳動物内の選択された疾患状態のための新規の診断および治療の道具の開発のために有用である動物モデルが生成される系が提供されたという事実を含んでもよい。
ＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を発現するこのような細胞は、より高いレベルのＰＣＡＤＭ−１が、低いレベルのＰＣＡＤＭ−１発現および／または活性と関連する疾患、障害または病状を治療または軽減するために有用であり得る場合に、細胞、組織、または動物全身にＰＣＡＤＭ−１を提供するために使用できる。このような疾患、障害または病状は、前立腺ガン、および可能性としてその他の充実性ガンまたは白血病、エイズ、ＨＩＶ感染、免疫障害および炎症または退行性障害などを含むことができるが、それらに限定はされない。従って、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１発現、翻訳、および／または活性を増加または誘発するためにＰＣＡＤＭ−１を発現する細胞を含み、ここで増加したＰＣＡＤＭ−１発現、タンパク質レベル、および／または活性は疾患、障害または病状を治療または軽減するために有用であり得る。
通常の熟練者は、本明細書内に提供される開示に基づいて、本発明の「ノックアウト」または「ノックイン」ベクターが、それぞれ置換または欠失されるべき核酸の２個の部分にホモロガスな少なくとも２個の配列を含んでなることを認めるであろう。２個の配列は、遺伝子に隣接する配列とホモロガスであり、すなわち、一つの配列はＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸のコーディング配列の５’部分またはその近傍とホモロガスでありそして他の配列は第一のものよりさらに下流にある。当該技術分野の熟練者は、本明細書内に提供される開示に基づいて、本発明がいかなる特定のフランキング核酸配列にも限定されないことを認めるであろう。反対に、ターゲティングベクターは、それぞれ哺乳動物ゲノムよりもしくはそれらの中に、ＰＣＡＤＭ−１、もしくはそのフラグメントをコードする核酸の一部または全体を除去する（すなわち「ノックアウト」ベクター）または挿入する（すなわち「ノックイン」ベクター）の２個の配列を含んでなってもよい。ターゲティングベクターの重要な特徴は、それが、「ノックアウト」ベクターの場合にＰＣＡＤＭ−１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の反対側すなわち５’および３’末端に向かって位置する２個の配列の十分な部分を含んでなっていることであり、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の全体または一部分が哺乳動物染色体上の位置から欠失またはその中への挿入が起きるようにホモロガス組換えにより欠失／挿入が可能とする。
導入遺伝子およびノックインおよびノックアウトターゲティングベクターの設計は、当該技術分野で周知でありそして標準的論文、例えばサムブルックら「分子クローニング、実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびオースベルら「分子生物学における最近のプロトコール」（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）などに記載されている。ターゲティングベクター内に使用されるＰＣＡＤＭ−１コーディング領域にフランキングまたはその中の上流および下流部分は、公知方法に基づきそしてマウスおよびヒトＰＣＡＤＭ−１の両者の核酸およびアミノ酸配列を含み本明細書内で提供される開示に基づく本明細書内で開示される教示に従って容易に選択されるであろう。それらの配列を武器とすると、当該技術分野の通常の熟練者は、本発明の導入遺伝子およびノックアウトベクターを構築できるであろう。
本発明は、選択可能なマーカーをコードする核酸、例えばｎｅｏＲ 遺伝子をコードする核酸を含んでなるノックアウトターゲティングベクターをさらに含み、これによりＰＣＡＤＭ−１、またはそのフラグメントをコードする核酸が欠失されそしてＧ４１８の存在下で増殖する細胞の能力によりネオマイシン耐性遺伝子で置換された導入遺伝子の選択を可能とする。しかし、本発明は、選択可能マーカーとしてネオマイシン耐性に制限されると解釈されてはならない。むしろ、当該技術分野で周知の他の選択可能マーカーをノックアウトターゲティングベクター内に使用して、ＰＣＡＤＭ−１遺伝子が欠失および／または不活性化されそして選択した選択可能なマーカーをコードする核酸により置換された組換え細胞の選択を可能とするように使用されてもよい。選択可能マーカーを選択しそしてベクター内に組み込む方法は、当該技術分野で周知であり、そして例えばサムブルックら「分子クローニング、実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびオースベルら「分子生物学における最近のプロトコール」（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）などに記載されている。
本明細書中に記載のように、本発明は、そのゲノム内の所望の部位内に挿入されそれにより所望の外因性標的遺伝子のコーディング領域を欠失する外因性核酸を含んでなる非ヒトトランスジェニック哺乳動物、すなわちノックアウトトランスジェニック哺乳動物を含む。さらに、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１をコードする外因性核酸がゲノムの部位内に挿入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物、すなわち「ノックイン」トランスジェニック哺乳動物を含む。挿入されたノックイン導入遺伝子は、例えばポリペプチド、および細胞内に通常は存在しないかまたは典型的にはＰＣＡＤＭ−１に操作可能に連結していない、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸に操作可能に連結するプロモーター／調節領域をコードする種々の核酸を含んでなってもよい。
本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の生成は、好ましくはここで記載する方法を用いて達成される。しかし、本発明は、他の方法が所望のノックアウト哺乳動物を生成するために使用できる場合に、本方法の使用にのみ限定されると決して解釈されるべきではない。
非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成する好ましい方法において、ＥＳ細胞が本発明の導入遺伝子を含んでなって生成され、次いでナジおよびロッサント「遺伝子ターゲティング、実際的方法」（Ｎａｇｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓａｎｔ，１９９３，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１４６−１７９ページ，Ｊｏｙｎｅｒ編集，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているものと本質的に同様にして、ノックアウト動物を生成するために細胞が使用される。ＥＳ細胞は、もしそれらが宿主胚盤胞内に注入されるかまたは割球段階胚と凝集されて胚環境に返還される場合に、正常な胚細胞として挙動する。そのように返還された場合に、細胞は胚のすべての成分と同時に発達する完全な能力を有する。従って、ＥＳ細胞を取得し、その中に所望のＤＮＡを導入し、次いで成熟哺乳動物細胞に発達させるために細胞を胚環境に返還することが可能であり、ここで所望のＤＮＡが発現されてもよい。
トランスジェニックマウスの生成のための正確なプロトコールは、ナジおよびロッサント「遺伝子ターゲティング、実際的方法」（Ｎａｇｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓａｎｔ，１９９３，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ編集，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１４６−１７９ページ）中に開示されており、従って本明細書では繰り返さない。その中に所望のＤＮＡを導入するためのＥＳ細胞のトランスフェクションまたは形質導入は、例えばサムブルックら「分子クローニング、実験マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびオースベルら「分子生物学における最近のプロトコール」（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）などに記載されているような標準プロトコールを用いて達成される。好ましくは、本発明の導入遺伝子内に含まれる所望のＤＮＡはＥＳ細胞内へ電気泳動され、そして細胞はソリアーノら（Ｓｏｒｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃｅｌｌ ６４：６９３−７０２）に記載のようにして繁殖される。
哺乳動物の受精した卵内への単離された核酸の導入は、トランスジェニック技術の標準技術（ホーガンら「マウス胚の操作：実験マニュアル」（Ｈｏｇａｎｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｉｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ））のいずれのものによってでも達成される。最も一般的には、核酸はマイクロインジェクションの方法により胚内に導入される。
一旦核酸が卵内に導入されると、卵は短時間インキュベーションされ次いで同じ種の擬妊娠哺乳動物内に転移され、これから例えばホーガンら「マウス胚の操作：実験マニュアル」（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｉｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）に記載のようにして卵が得られる。典型的には、実験あたりに多数の卵に注入され、そして卵の約３分の２がこの手順で生き残る。次いで約２０個の卵を擬妊娠哺乳動物内に転移し、そして通常このようにして転移された生存可能な卵の４個〜１０個を生きた子（ｐｕｐ）に生育させる。
いかなる哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１遺伝子でも、その哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１遺伝子の全体または一部分の欠失を含んでなる導入遺伝子を内包するトランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック細胞を産生するために本明細書中に記載の方法中に使用してもよい。好ましくは、げっ歯類ＰＣＡＤＭ−１が使用される。
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、哺乳動物のいかなる種であることもできる。従って、本発明は、キメラ核酸をコードするトランスジェニック哺乳動物の生成を含むと解釈されるべきであり、その哺乳動物には、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジおよびウシなどが含まれる。トランスジェニックマウスの生成のために本明細書中に記載の方法は、いかなる哺乳動物種にも使用して同様に適用できる。好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物はげっ歯類でありそしてさらに一層好ましくは本発明のトランスジェニック動物はマウスである。例示として、ルッカリネンら（Ｌｕｋｋａｒｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｔｒｏｋｅ ２８：６３９−６４５）は、トランスジェニックマウスの生成を可能とし、またラットを含む他のトランスジェニックげっ歯類動物の生成も可能とする遺伝子構築物を教示している。同様に、一つの種の動物の遺伝子座内の零変異（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、最初の種に高度にホモロガスな遺伝子座を有する他の種の動物内で複製できる。
本発明のトランスジェニック動物を同定するために、子を標準技術、例えばサザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、および／またはＲＴ−ＰＣＲを用いて単離された核酸の存在について検査する。哺乳動物の細胞内および組織内の核酸の発現も本明細書内に記載の通常の技術を用いて評価できる。さらに、トランスジェニック動物の循環血液内のＰＣＡＤＭ−１の存在または不在は、例えば本明細書中に開示（例えばウエスタンブロット分析）のようにするか、または当該技術分野で周知のタンパク質検出のための標準方法を用いて決定できる。
本明細書中で使用される用語として「トランスジェニック細胞」とも考えられる本発明のトランスジェニック哺乳動物より得られた細胞は、本明細書の別の部分に記載のＰＣＡＤＭ−１（＋／−）および（−／−）トランスジェニック非ヒト哺乳動物より得られた細胞も包含し、ＰＣＡＤＭ−１発現の改変されたレベルと関連すると信じられている哺乳動物の疾患および症状、例えば前立腺ガン、およびＰＣＡＤＭ−１発現の改変されたレベルと関連するあらゆる他の疾患、障害または病状のモデル化のための有用な系である。
さらに、このような前立腺の腫瘍増殖およびその他の異常と関連する経路のマーカーとして、ＰＣＡＤＭ−１発現レベルは、このような疾患、障害または病状の評価における有用なインジケータでもある。
特に適するものは、本明細書中に記載の非ヒトのノックアウトまたはノックイントランスジェニック哺乳動物の組織より誘導された細胞であり、ここでＰＣＡＤＭ−１遺伝子を含んでなる導入遺伝子は、種々の組織中でＰＣＡＤＭ−１を発現されるかまたは発現を阻害される。例示として、このような細胞が誘導される細胞タイプには、（１）ＰＣＡＤＭ−１（＋／＋）、（＋／−）および（−／−）非ヒトトランスジェニック生産哺乳動物児、（２）ＰＣＡＤＭ−１（＋／＋）、（−／−）または（＋／−）動物胎児、および（３）ＰＣＡＤＭ−１（＋／＋）、（−／−）および（＋／−）胎児および哺乳動物生産児より得られた胎盤細胞系統の繊維芽細胞、内皮、脂肪細胞、および筋芽細胞が含まれる。
当該技術分野の熟練者は、この開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質の低下したレベル、ＰＣＡＤＭ−１活性の低下したレベル、または両者を含んでなる細胞が、ＰＣＡＤＭ−１発現の細胞発現阻害剤（例えばＤＮＡＺＹＭ、アンチセンスまたはリボザイム分子）を発現する細胞を含むが、しかしそれらに限定はされないことを認めるであろう。
カルチャー内で哺乳動物細胞を維持するために有用な方法および組成物は、当該技術分野では周知であり、ここで哺乳動物細胞は、本明細書中に記載のトランスジェニックマウスのようなマウスより得られた細胞、または霊長類および非霊長類哺乳動物より得られた細胞を含むが、それらに限定はされない哺乳動物より得られる。
本発明の組換え細胞は、治療および／または診断目的のための使用のためにＰＣＡＤＭ−１を産生するために使用できる。すなわち、ＰＣＡＤＭ−１を発現する組換え細胞は、ＰＣＡＤＭ−１の低下したレベルと関連またはそれから起きる疾患、障害または病状を治療または軽減するために投与できる精製されそして単離された大量のＰＣＡＤＭ−１を産生するために使用できる。
あるいは、ＰＣＡＤＭ−１を発現する組換え細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ治療において投与でき、ここでそれによる組換え細胞の投与は、細胞、組織、および／または動物へタンパク質を投与する。さらに、組換え細胞はＰＣＡＤＭ−１受容体およびＰＣＡＤＭ−１シグナル伝達経路の発見のために有用である。
本発明の組換え細胞は、細胞ホメオスタシスおよび細胞増殖に基づく上昇または低下したＰＣＡＤＭ−１レベルの影響を研究するために使用されてもよいが、それはＰＣＡＤＭ−１が前立腺ガンなどにおいてある役割を有すると仮定されるからである。
細胞がＰＣＡＤＭ−１を発現しないか、または生物学的活性を欠失した低下または改変されたＰＣＡＤＭ−１を発現するように操作された本発明の組換え細胞は、動物自身の細胞（例えば内皮細胞、繊維芽細胞、平滑筋細胞、白血球、樹状細胞など）または同系の対応（ｍａｔｃｈｅｄ）ドナーの細胞どちらかが本明細書の他の部分に記載のようにして操作（例えば、ＰＣＡＤＭ−１発現および／またはタンパク質レベルが組換え細胞中でそれにより低下するようなアンチセンス核酸またはノックアウトベクターの挿入による）された組換え体であり、そして組換え細胞がレシピエント動物に投与されるｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ細胞治療にも使用できる。この方法で、低下したレベルでＰＣＡＤＭ−１を発現する組換え細胞は、動物自身の細胞がＰＣＡＤＭ−１の上昇したレベルを発現する動物に投与でき、それにより本明細書の他の部分の開示のようにして上昇したＰＣＡＤＭ−１発現に関連またはそれにより媒介される疾患、障害または病状を治療または軽減する。
前立腺ガンと疑われる本発明のトランスジェニック動物は、前立腺ガンの病原発生およびその中でのＰＣＡＤＭ−１の可能な役割を研究するために使用できる。
さらに本発明のトランスジェニック動物および／または細胞は、ＰＣＡＤＭ−１の細胞内定位を研究するために使用されてもよい。
また、トランスジェニック動物（＋／−および−／−生産児および胎児の双方）および／または本発明の細胞は、グルコース代謝におけるＰＣＡＤＭ−１の役割を研究するためおよびＰＣＡＤＭ−１作用の標的ならびに細胞内のその効果を媒介するためにＰＣＡＤＭ−１と結合するいずれかの受容体を解明するために使用してもよい。
ＶＩ．抗体
本発明は、ＰＣＡＤＭ−１、またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体も含む。
一つの態様では、抗体は配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるヒトＰＣＡＤＭ−１、またはその免疫原性部分に向けられる。
ポリクローナル抗体は、当該技術分野で周知の標準免疫学的技術に従ってウサギを免疫化して産生される（例えばハーロウら「抗体：実験マニュアル」（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ））。本明細書中で例示される抗体は、標準技術を用いて産生され、これにより、動物は組換え的に産生された抗原で免疫化されそして標準の当該技術分野で認められた方法に従って抗原を用いて反復してブーストされた。しかし、本発明は、本方法またはいかなるその他の方法にも限定されずそして抗体は、他のタンパク質、例えばマルトース結合タンパク質の部分またはグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分、および／またはＰＣＡＤＭ−１部分が免疫原性を与えられる領域（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と共役するＰＣＡＤＭ−１）およびそれぞれげっ歯類および／またはヒトＰＣＡＤＭ−１アミノ酸残基を含んでなる部分を含んでなるキメラタンパク質を用いて動物を免疫化する方法により、しかしそれに限定はされないが、産生できると理解されるべきである。該キメラタンパク質は、ＰＣＡＤＭ−１をコードする適当な核酸（例えば配列番号１）をこの目的に適するプラスミドベクター、例えば、これらに限定はされないが、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＭＡＬ−２またはｐＣＭＸ内にクローニングして産生される。
しかし、本発明は、それらの抗体、またはタンパク質抗原のそれらの部分にのみ限定されると解釈されてはならない。むしろ、本発明は、マウスおよびヒトＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する他の抗体（この用語は本明細書の他の部分で定義される）、またはその部分を含むと解釈されるべきである。さらに、本発明は、なかでもＰＣＡＤＭ−１に結合する抗体を包含すると解釈されるべきでありそしてそれらはウエスタンブロット上、酵素結合免疫アッセイにおける溶液中、蛍光表示式細胞分別化（ＦＡＣＳ）アッセイ中、それにより組織中のＰＣＡＤＭ−１を定位する組織の免疫組織化学染色中、およびＰＣＡＤＭ−１の少なくとも一部分をコードする核酸を用いて一時的にトランスフェクションされた細胞の免疫蛍光顕微鏡において存在するＰＣＡＤＭ−１に結合できる。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、抗体がタンパク質のいずれの部分とも特異的に結合できそして全長タンパク質がそれに特異性の抗体を生成するために使用できることを認めるであろう。しかし、本発明は、免疫原として全長タンパク質を用いることに限定はされない。むしろ、本発明は、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する抗体を産生するためのタンパク質の免疫原部分を用いることを含む。すなわち、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質の免疫原性部分、または抗原決定因子を用いる動物の免疫化を含む。
該抗体は、動物、例えば、これらに限定はされないが、ウサギまたはマウスを、本発明のタンパク質またはその一部分を用いて免疫化し、またはＰＣＡＤＭ−１の少なくとも一部分を含んでなるタンパク質、または例えば、適当なＰＣＡＤＭ−１アミノ酸残基を含んでなる部分と共有結合的に結合したマルトース結合タンパク質タグポリペプチド部分を含んでなるタグポリペプチド部分を含む融合タンパク質を用いて動物を免疫化することにより産生できる。当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、それらタンパク質のさらに小さいフラグメントもＰＣＡＤＭ−１を特異的に結合する抗体を産生するために使用できることを認めるであろう。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、単離されたＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドの種々の部分が、ＰＣＡＤＭ−１の高度保存領域に対し、または変異を含む領域を含むポリペプチドの非保存領域のいずれかに対する抗体を産生するために使用できることを認めるであろう。
ＰＣＡＤＭ−１の配列およびタンパク質の種々の保存および非保存ドメインを定位する詳細分析を武器とすると、熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、当該技術分野で周知であるかまたは今後開発される方法を用いて哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドの種々の部分に対して特異的な抗体をどのようにして得るかを理解するであろう。
さらに、熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、関係するタンパク質の非保存領域が、種々の生物体の間で保存される高度保存領域よりもさらに免疫原性であり得ることを認めるであろう。さらに、非保存免疫原性部分を用いる免疫化は、非保存領域に特異性の抗体を産生し、それにより、１種またはそれ以上の保存部分を共有することがある他のタンパク質との交差反応をしない抗体を産生できる。従って、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１分子の非保存領域が、そのＰＣＡＤＭ−１に対してのみ特異性でありそして他のＰＣＡＤＭ−１とまたは他のタンパク質、例えばヒトＳ２と非特異的に交差反応しない抗体を産生できることを認めるであろう。さらに具体的には、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１がＳ２の同じ残基とは異なる５個のアミノ酸を含んでなる、すなわち配列２のアミノ酸配列に対してＰＣＡＤＭ−１はアミノ酸残基番号６４においてＴ（トレオニン）、アミノ酸残基番号１５５においてＮ（アスパラギン）、残基番号１５９においてＡ（アラニン）、残基番号１６３においてＲ（アルギニン）、および残基番号１６９においてＲ（アルギニン）を含んでなり、それらすべては、ヒトＳ２のアミノ酸配列の同じ位置のアミノ酸残基とは異なる点においてＰＣＡＤＭ−１をＳ２が異なることを認めるであろう（例えばジーンバンクアクセッション番号（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ）ＸＭ０４５０３２、ヒトＳ２ ４０Ｓリボソームタンパク質）。
あるいは、熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、１個またはそれ以上のＰＣＡＤＭ−１分子間に保存されている領域を用いて発生された抗体が、１種またはそれ以上のＰＣＡＤＭ−１分子とおよびＰＣＡＤＭ−１と約９８％アミノ酸ホモロジーを共有するヒトＳ２と特異的に反応する抗体を産生するために使用できることも理解するであろう。すなわち、熟練者は、アミノ酸置換（すなわちアミノ酸残基番号６４、１５５、１５９、１６３および１６９）の領域を含んでなっていないＳ２およびＰＣＡＤＭ−１の部分が、Ｓ２およびＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する抗体を産生するために使用できそしてそれらの抗体が本発明の方法にも使用できることを理解するであろう。Ｓ２の配列は、当該技術分野で周知でありそして、ジーンバンクアクセッション番号ＸＭ０４５０３２などの配列を含むがそれらに限定はされない。
さもなければタンパク質の他の部分よりも免疫原性が低いであろう保存タンパク質ドメインと特異的に結合する抗体を産生する方法は当該技術分野で周知であり、そして関係するタンパク質フラグメントを分子（例えばキーホールインペットヘモシアニンなど）に共役し、それによりタンパク質ドメインに免疫原性を与えるか、またはアジュバント（例えばフロイントの完全および／または不完全アジュバントなど）の使用により与え、または双方を含むが、それらに限定はされない。従って、本発明は、少なくとも１種のＰＣＡＤＭ−１を認識する抗体および１種を越えるＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する抗体を包含し、すべてのＰＣＡＤＭ−１とおよび／またはＳ２と特異的に結合する抗体も含む。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、ＰＣＡＤＭ−１のどの部分が保存ドメインを共有する他のタンパク質とホモロジー性が低いかを認めるであろう。しかし、本発明は、いかなる特定のドメインにも限定されない。反対に熟練者は、本発明のＰＣＡＤＭ−１タンパク質の他の非保存領域が、本明細書中で開示される本発明の抗体を産生するために使用できることを理解するであろう。
従って、熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、本発明が、ＰＣＡＤＭ−１活性（例えば必要なＰＣＡＤＭ−１／ＤＮＡ結合相互作用などによる）を中和および／または阻害する抗体を包含し、その抗体は１種またはそれ以上のＰＣＡＤＭ−１を認識できることを認めるであろう。
本発明は、本明細書中で開示される抗体のみまたは本発明のタンパク質のいずれか特定の免疫原性部分のみに限定されると解釈されてはならない。むしろ、本発明は、ＰＣＡＤＭ−１またはその部分に対して、または配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも約９８％ホモロジーを共有するタンパク質に対する他の抗体（用語は本明細書の他の部分で定義される）を含むと解釈されるべきである。好ましくは、ポリペプチドはヒトＰＣＡＤＭ−１（配列番号２）に９９％ホモロガスである。さらに好ましくは、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１に特異性の抗体と特異的に結合するポリペプチドがヒトＰＣＡＤＭ−１である。最も好ましくは、哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する抗体と特異的に結合するポリペプチドが配列番号２である。
本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、合成抗体などを包含する。当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、本発明の抗体の重要な特徴は、抗体がＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合することにあることを理解するであろう。すなわち、本発明の抗体は、ウエスタンブロット上、細胞の免疫染色において、ＰＣＡＤＭ−１またはそのフラグメント（例えばその免疫原性部分または抗原決定因子）を認識し、そして当該技術分野で周知の標準方法を用いてＰＣＡＤＭ−１を免疫沈降させる。
当該技術分野の熟練者は、ＰＣＡＤＭ−１と４０ＳリボソーマルＳ２タンパク質との間の高度の類似性のために、Ｓ２への抗体は、ＰＣＡＤＭ−１と交差反応できることを認めるであろう。このようなＳ２抗体は、それらがＰＣＡＤＭ−１を検出するために使用できるので、本開示中に記載される方法のためにも有用である。従って、当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、Ｓ２と特異的に結合し、そしてＰＣＡＤＭ−１とも結合する抗体が、本明細書の別の部分にさらに詳しく記載するように本発明の方法に使用できることを理解するであろう。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、抗体が、細胞内の関係があるタンパク質を定位するためおよび細胞プロセス中でそれらにより認識される抗原の役割を研究するために使用できることを認めるであろう。さらに、抗体は、周知の方法、これらに限定はされないが、ウエスタンブロット法および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などを用いて生物学的試料中に存在するタンパク質を検出またはその量を測定するために使用できる。さらに、抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いてそれらの同族抗原を免疫沈降および／または免疫アフィニティー精製するために使用できる。それに加えて、抗体は細胞中のＰＣＡＤＭ−１のレベルを低下させ、それにより細胞内のＰＣＡＤＭ−１の影響を阻害するために使用できる。従って、動物の細胞もしくは組織へまたは動物自体へ抗体を投与することにより、所要のＰＣＡＤＭ−１受容体／リガンド相互作用は、ＰＣＡＤＭ−１媒介信号伝達の影響も阻害されるように阻害される。当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、抗−ＰＣＡＤＭ−１−抗体を用いるＰＣＡＤＭ−１タンパク質／核酸結合相互作用を阻害した際の検出可能な影響が、前立腺ガン細胞などの低下した増殖を含むことができ、それらに限定はされないことを理解するであろう。
熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、本発明が、単一ＰＣＡＤＭ−１エピトープを認識するいずれかの単一抗体の使用を含むこと、しかし本発明は単一抗体の使用で限定はされないことを認めるであろう。反対に、本発明は、抗体が同一または異なるＰＣＡＤＭ−１エピトープに向かうことができるような少なくとも１種の抗体の使用を包含する。
ポリクローナル抗体の生成は、例えばハーロウら「抗体：実験マニュアル」（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に記載されている方法のような標準抗体産生方法を用いて、所望の動物に抗原を接種しそして存在する抗原を特異的に結合する抗原を単離して達成される。
タンパク質またはペプチドの全長またはペプチドフラグメントに対して指向されるモノクローナル抗体は、いずれかの周知のモノクローナル抗体調製方法、例えばハーロウら「抗体：実験マニュアル」（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）およびツシンスキら（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｌｏｏｄ，７２：１０９−１１５）に記載の方法を用いて調製してもよい。所望のペプチドの量は、化学合成技術を用いて合成してもよい。あるいは、所望のペプチドをコードするＤＮＡは、大量のペプチドの生成に適する細胞内の適当なプロモーター配列にクローニングおよびそれから発現されてもよい。ペプチドを指向するモノクローナル抗体は、本明細書中に引用する標準方法を用いてペプチドで免疫化されたマウスから生成される。
本明細書中に記載の方法を用いて得られたモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該技術分野で利用可能でありそして例えばライトら（Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−１６８）およびその中に引用されている抗体を用いてクローニングおよび配列決定されてもよい。
さらに、本発明の抗体は、例えばライトら（上記）中、およびその中に引用されている引用文献、およびグら（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ ７７：７５５−７５９）中に記載の技術、およびその他の当該技術分野で周知かまたは今後開発される抗体をヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ）するための方法を用いて「ヒト化」されてもよい。
ファージ抗体ライブラリーを生成するために、ファージ表面上に発現される所望のタンパク質、例えば所望の抗体を発現する細胞、例えばハイブリドーマから単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーが最初に得れる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーは逆転写酵素を用いて産生される。免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡはＰＣＲにより得られそして得られたＤＮＡを適当なバクテリオファージベクター内にクローニングさせて、免疫グロブリン遺伝子を特定するＤＮＡを含んでなるバクテリオファージＤＮＡライブラリーを生成させる。異種ＤＮＡを含んでなるバクテリオファージライブラリーを作製するための手順は、当該技術分野で周知でありそして例えば上記のサムブルック等中に記載されている。
所望の抗体をコードするバクテリオファージは、その相当する結合タンパク質、例えば抗体が指向する抗原に結合するために適するようにな様式でタンパク質をその表面にディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）するように操作してもよい。従って、特定の抗体を発現するバクテリオファージが相当する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベーションされると、バクテリオファージは細胞に結合する。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。このようなパンニング技術は、当該技術分野では周知でありそしてライトら（上記）中に記載されている。
以上に記載したようなプロセスは、Ｍ１３バクテリオファージディスプレイを用いるヒト抗体の産生のために開発された（バートンら（Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９９４，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０））。本質的には、ｃＤＮＡライブラリーは抗体産生細胞の集団から得られたｍＲＮＡより生成される。ｍＲＮＡは再構成された免疫グロブリン遺伝子をコードし従ってｃＤＮＡはそれをコードする。増幅されたｃＤＮＡは、それらの表面上にヒトＦａｂフラグメントを発現するファージのライブラリーを創成するＭ１３発現ベクター内にクローニングされる。関係する抗体をディスプレイするファージは、抗原結合性により選択されそして可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを産生するために細菌内で繁殖される。従って、通常のモノクローナル抗体合成とは異なり、本方法は細胞ではなくヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化し、それはヒト免疫グロブリンを発現する。
ここに提出した手順は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの生成を記載する。しかし、本発明は、Ｆａｂ抗体をコードするファージの生成のみに限定されると解釈されてはならない。むしろ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリー）をコードするファージも本発明内に含まれる。Ｆａｂ分子はＩｇ軽鎖全体を含んでなり、すなわち、それらは軽鎖の可変および不変領域双方を含んでなるが、しかし重鎖の可変領域および第一不変領域ドメイン（ＣＨ１）のみを含む。一本鎖抗体分子はＩｇＦｖフラグメントを含んでなるタンパク質の一本鎖を含んでなる。ＩｇＦｖフラグメントは、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のみを含み、それらの中に含まれる不変領域は持っていない。ｓｃＦｖ ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーは、マークスら（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）に記載の手順に従って生成されてもよい。所望の抗体の単離のためにこのように生成されたファージのパンニングは、Ｆａｂ ＤＮＡを含んでなるファージライブラリーのために記載されたものと同様の方法で行われる。
本発明は、その中で重鎖および軽鎖可変領域がほとんどすべての可能な特異性を含むように合成されてもよい合成ファージディスプレイライブラリーを含むと解釈されるべきである（バーバス（Ｂａｒｂａｓ，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １：８３７−８３９）、デクルイフら（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７−１０５））。
当該技術分野の熟練者は、本明細書中に提供される開示に基づいて、本発明が、他の薬剤、特には細胞の増殖または細胞分裂を殺すかまたは抑制する能力を有する他の薬剤、特には細胞毒性または抗細胞薬剤に連結したＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合する抗体成分を含んでなるイムノトキシンを包含することを認めるであろう。このようなイムノトキシン、またはイムノコンジュゲートは、当該技術分野では周知でありそしてそれらを産生するために使用できる多数の毒性薬剤があり、例えば、これらに限定はされないが、リシントキシン、ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）Ａ（ＳＥＡ）（ドールステンら（Ｄｏｈｌｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９１：８９４５−８９４９））、植物トキシンのゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）（ローゼンブルムら（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ ｅｔ ａｌ．）米国特許第５，６２４，８２７号）、シュードモナス エキソトキシン（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ，ＰＥ）などである。従って、本発明は、腫瘍細胞に対する細胞毒性薬剤を優先的に標的としてＰＣＡＤＭ−１と特異的に結合し、一方、正常の細胞および組織への細胞毒性作用を最小化するための抗体の使用を包含し、それは、本明細書中に開示するように、腫瘍細胞が、正常で非腫瘍性細胞よりも高いレベルのＰＣＡＤＭ−１を発現するからである。
ＶＩＩ．組成物
本発明は哺乳動物のＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸またはその部分に相補的な単離された核酸（これは転写に関してアンチセンス方向である）を含む。好ましくは組成物は製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。
本発明は、哺乳動物のＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸またはその部分に相補的な単離された核酸（これはＰＣＡＤＭ−１を特異的に開裂するＤＮＡＺＹＭまたはＤＮＡ酵素である）を含む。好ましくは組成物は製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。好ましくは組成物は製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。
本発明は本明細書に記載する単離された哺乳動物のＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドを含んでなる組成物を含む。好ましくは組成物は製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。
また本発明はＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体を含んでなる組成物も含む。好ましくは組成物は製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。
本発明はさらに哺乳動物のＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含んでなる組成物を含む。好ましくは組成物は製薬学的に許容され得る担体を含んでなる。この組成物はＰＣＡＤＭ−１および／またはタンパク質をコードする核酸を細胞、組織または動物に投与するために、あるいは細胞、組織または動物におけるＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害するために使用することができる。この組成物はＰＣＡＤＭ−１の改変された発現により媒介される疾患、障害または状態を処置するために有用であるので、細胞、組織または動物におけるＰＣＡＤＭ−１の発現またはタンパク質レベルを減少または増加させることは動物にとって有益となる。すなわち動物の疾患、障害または状態がＰＣＡＤＭ−１発現の改変されたレベルまたはタンパク質レベルに媒介または関係される場合、この組成物はＰＣＡＤＭ−１のそのような発現またはタンパク質レベルを調節するために使用することができる。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、ＰＣＡＤＭ−１はタンパク質自体を投与することにより、あるいはタンパク質をコードする核酸を投与することにより、細胞または組織に投与され得ると理解するだろう。いずれの方法もＰＣＡＤＭ−１が細胞および／または組織に投与される。
哺乳動物への投与については、ポリペプチドまたはそれをコードする核酸、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを特異的に開裂するリボザイム、および／またはタンパク質をコードする核酸の全部または一部に相補的なアンチセンス核酸を、製薬学的に許容され得る担体、例えば約ｐＨ７．８のＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水に懸濁することができる。
さらに当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明がＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、単離されたＰＣＡＤＭ−１ポリペプチド、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸から転写されたｍＲＮＡを特異的に開裂する酵素的核酸（ＤＮＡＺＹＭ）、およびＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体およびそれらの部分の少なくとも１つを含んでなる組成物を包含すると考えるだろう。
本発明に包含される組成物は、ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドの種々のエピトープに特異的に結合する種々の抗体、およびＰＣＡＤＭ−１ｍＲＮＡの種々の領域および／またはＰＣＡＤＭ−１ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡの重複領域に特異的に結合し、そして開裂するＤＮＡＺＹＭを含んでなるものを含んでなる。
当業者は本開示に基づき、上で検討した化合物、すなわちＤＮＡＺＹＭまたはＤＮＡ酵素、リボザイム、アンチセンス核酸、抗体、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、およびＰＣＡＤＭ−１ポリペプチド、ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドに特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチド等の混合物を含んでなる組成物が本発明に包含されると理解するだろう。
さらに組成物が限定するわけではないが、低分子、ペプチド模造物、ＤＮＡＺＹＭまたはＤＮＡ酵素、リボザイムおよび他のタンパク質に特異的なアンチセンス核酸（例えばＶＥＧＦ−１およびＭＭＰ−２等）、薬剤、化学療法剤等のようなさらなる化合物を含んでなる場合も、上に挙げた少なくとも１つの化合物を含んでなる組成物は本発明に包含されることを意図する。当業者は本明細書に提供する開示に基づき、そのような組成物はＰＣＡＤＭ−１の改変された発現に関係するかまたは媒介される疾患、障害または状態の診断および処置に有用であると考えるだろう。
有用な他の製薬学的に許容され得る担体には、限定するわけではないが、グリセロール、水、塩水、エタノールおよびリン酸塩および有機酸の塩のような他の製薬学的に許容され得る塩溶液を含む。これらおよび他の製薬学的に許容され得る担体の例は、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９９１、マック（Ｍａｃｋ）出版社、ニュージャージー）に記載されている。
製薬学的組成物は、滅菌性の注入可能な水性または油性の懸濁液または溶液の状態で調製、包装または販売され得る。この懸濁液または溶液は既知の技術に従い製剤され、そして有効成分に加えて、本明細書に記載する分散剤、加湿剤または沈殿防止剤のようなさらなる成分を含んでなることができる。そのような滅菌性の注入可能な製剤は、例えば水または１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。他の許容され得る希釈剤および溶媒には限定するわけではないが、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノ−またはジ−グリセリドのような固定油を含む。
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬内、眼内または他の投与経路に適する製剤で投与され、調製され、包装され、かつ／または販売されることができる。他の意図する製剤には、放射放出されるナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含む再封入赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。
本発明の組成物は、限定するわけではないが経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬内または眼内投与経路を含む多数の経路を介して投与することができる。投与経路（１つまたは複数）は当業者には直ちに明白であり、そして処置する疾患の種類および重篤度、処置される動物またはヒト患者の種類および年齢等を含む任意の数の因子に依存する。
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口の固体製剤、眼内製剤、座薬、エーロゾル、局所または他の類似製剤で全身的に投与することができる。ヘパリン硫酸塩またはその生物学的均等物のような化合物に加えて、そのような製薬的組成物は、製薬学的に許容され得る担体および薬剤の投与を強化し、そして促進することが知られている他の成分を含むことができる。ナノ粒子、リポソーム、再封入赤血球および免疫学的に基づく系のような他の可能性な製剤を使用して、本発明の方法によりＰＣＡＤＭ−１および／またはそれをコードする核酸を投与するために使用することもできる。
本明細書に記載する任意の方法を使用して同定される化合物が配合され、そして今、記載する前立腺ガンを処置するために哺乳動物に処置される。
本発明は、有効成分として前立腺ガンの処置に有用な化合物を含んでなる製薬学的組成物の調製および使用を包含する。そのような製薬学的組成物は、個体への投与に適する形態の有効成分のみからなることができ、または製薬学的組成物は有効成分および１以上の製薬学的に許容され得る担体、１以上のさらなる有効成分、またはこれらの幾つかの組み合わせを含んでなることができる。有効成分は製薬学的組成物中に、当該技術分野で周知である生理学的に許容され得るカチオンもしくはアニオンとの組み合わせのような、生理学的に許容され得るエステルまたは塩の形態で存在することができる。
本明細書で使用する用語「製薬学的に許容され得る担体」は、有効成分と組み合わせることができ、そして組み合わせた後、有効成分を個体に投与するために使用することができる化学的組成物を意味する。
本明細書で使用する用語「生理学的に許容され得る」エステルまたは塩は、製薬学的組成物の他の成分と適合性であり、組成物が投与される個体に対して有害ではない有効成分のエステルまたは塩形態を意味する。
本明細書に記載する製薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野で既知の、または今後開発される方法により調製することができる。一般にそのような調製法は、有効成分を担体または１以上の他の補助的成分と合わせるようにし、そして次いで必要または所望する場合、生成物を所望する単一−もしくは多−投与単位に成形または包装する工程を含む。
本明細書に提供する製薬学的組成物の記載は、主に認定基準に合ったヒトへの投与に適する製薬学的組成物を対象としているが、当業者にはそのような組成物が一般にすべての種の動物へ投与するためにも適すると理解するだろう。組成物を種々の動物への投与に適するようにするために、ヒトへの投与に適する製薬学的組成物の修飾は十分に理解されており、そして通常の獣医薬理学者は、もし必要ならば単に通常の実験を行って、そのような修飾を計画し、そして行うことができる。本発明の製薬学的組成物が投与される個体は、限定するわけではないがヒトおよび他の霊長類、牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に興味のある哺乳動物を含む哺乳動物を含む。
本発明の方法に有用な製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬内、眼内、硬膜下腔内または他の投与経路に適する製剤で調製され、包装され、または販売することができる。他の意図する製剤には、放射放出されるナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含む再封入赤血球、および免疫学に基づく製剤を含む。
本発明の製薬学組成物は、バルクで、単回の単位用量として、または複数の単回の単位用量として調製され、包装され、または販売されることができる。本明細書で使用する「単位用量（ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ）」とは、予め定めた量の有効成分を含んでなる製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は一般に個体に投与される有効成分の投薬用量に等しいか、またはそのような投薬用量の例えば１／２または１／３のような便利な画分である。
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容され得る担体および任意のさらなる成分の相対量は、処置する個体の同一性、サイズおよび状態に依存して、さらに組成物が投与される経路に依存して変動する。例として組成物は０．１％から１００（重量／重量）％の有効成分を含んでなることができる。
有効成分に加えて、本発明の製薬学的組成物はさらに１以上の製薬学的に活性な作用物質を含んでなることができる。特に意図するさらなる作用物質には、制吐剤およびシアニドおよびシアネートスカベンジャーのようなスカベンジャーを含む。
本発明の製薬学的組成物の放出制御−または徐放性製剤は、通常の技術を使用して作成することができる。
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、限定するわけではないが各々が予め定めた量の有効成分を含有する錠剤、硬質もしくは軟質カプセル、小袋、トローチまたはロゼンジを含む別個の固体用量単位の状態で調製、包装または販売することができる。経口投与に適する他の製剤には限定するわけではないが、粉末化または粒状製剤、水性もしくは油性懸濁液、水性もしくは油性溶液、または乳液を含む。
本明細書で使用する「油性液体」は、炭素含有液体分子を含んでなり、そして水より低い極性を表すものである。
有効成分を含んでなる錠剤は、例えば有効成分、場合により１以上のさらなる成分を圧縮もしくは成形することにより作成することができる。圧縮錠剤は、適当なデバイス中で粉末または粒状調製物のような自由に流動する状態の有効成分を、場合により１以上の結合剤、潤滑剤、補形剤、表面活性剤および分散剤と混合して圧縮することにより調製できる。成形された錠剤は、適当なデバイス中で有効成分、製薬学的に許容され得る担体および少なくとも混合物を湿らせるために十分な液体の混合物を成形することにより調製できる。錠剤の製造に使用される製薬学的に許容され得る補形剤には、限定するわけではないが不活性な希釈剤、造粒および崩壊剤、結合剤および潤滑剤を含む。既知の分散剤には限定するわけではないが、ジャガイモ澱粉およびグリコール酸ナトリウム澱粉を含む。既知の表面活性剤には限定するわけではないが、ラウリル硫酸ナトリウムを含む。既知の希釈剤には限定するわけではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを含む。既知の造粒および崩壊剤には限定するわけではないがトウモロコシ澱粉およびアルギン酸を含む。既知の結合剤には限定するわけではないが、ゼラチン、アラビアガム、糊化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。既知の潤滑剤には限定するわけではないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを含む。
錠剤はコートされていないか、または既知の方法を使用してコートして、個体の胃腸管で遅延した崩壊を達成し、これにより有効成分の徐放性および吸収を提供することができる。例としてモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような物質を錠剤をコートするために使用することができる。さらに例として、錠剤は米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記載されている方法を使用してコートして、浸透圧で放出制御される錠剤に形成することができる。錠剤はさらに製薬学的に洗練され、そして味が良い調製物を提供するために、甘味料、風味剤、着色剤、保存剤またはこれらの幾つかの組み合わせを含んでなることができる。
有効成分を含んでなる硬質カプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。そのような硬質カプセルは有効成分を含んでなり、そして例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンのような不活性な固体希釈剤を含むさらなる成分をさらに含んでなることができる。
有効成分を含んでなる軟質ゼラチンカプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成することができる。そのような軟質カプセルは、水またはピーナッツ油、液体パラフィンまたはオリーブ油のような油性媒質と混合できる有効成分を含んでなる。
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体状態、または水もしくは別の適当な賦形剤で使用前に再構成することを意図する乾燥生成物の状態で調製、包装、そして販売することができる。
液体懸濁液は、水性または油性賦形剤に有効成分の懸濁液を達成する常法を使用して調製することができる。水性賦形剤には例えば、水および等張性塩水を含む。油性賦形剤には例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマ、またはヤシ油のような植物油、分別植物油、および液体パラフィンのような鉱物油を含む。液体懸濁液は限定するわけではないが、沈殿防止剤、分散剤または加湿剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、バッファー、塩、風味剤、着色剤および甘味料を含む１以上のさらなる成分をさらに含んでなることができる。油性懸濁液はさらに増粘剤を含むことができる。既知の沈殿防止剤には限定するわけではないが、ソルビトールシロップ、水素化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアガム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を含む。既知の分散または加湿剤には限定するわけではないが、レシチンのような自然に存在するホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールに由来する部分エステルとの、または脂肪酸とヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの（それぞれ例えばポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレート、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）の縮合生成物を含む。既知の乳化剤には限定するわけではないが、レシチンおよびアラビアガムを含む。既知の保存剤には限定するわけではないが、メチル、エチルまたはｎ−プロピル−パラ−ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸およびソルビン酸を含む。既知の甘味料には限定するわけではないが、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、シュクロースおよびサッカリンを含む。油性懸濁液用の既知の増粘剤には、例えば蜜蝋、硬質パラフィンおよびセチルアルコールを含む。
水性または油性溶媒中の有効成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ様式で調製することができ、主要な変更は有効成分が溶媒に懸濁されるのではなく溶解される点である。本発明の製薬学的組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記載した各成分を含んでなることができるが、沈殿防止剤は有効成分を溶媒に溶解することを必ずしも促進する必要はないと考えられる。水性溶媒には例えば水および等張性塩水を含む。油性溶媒には例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、落花生、オリーブ、ゴマ、またはヤシ油のような植物油、分別植物油、および液体パラフィンのような鉱物油を含む。
本発明の製薬学的調製物の粉末および粒状製剤は、既知の方法を使用して調製することができる。そのような製剤は例えば錠剤を形成するために、カプセルに充填するために、またはそれらに水性もしくは油性賦形剤を加えることにより水性もしくは油性懸濁液もしくは溶液を形成するために使用して、個体に直接投与することができる。これらの各製剤は、さらに１以上の分散または加湿剤、沈殿防止剤および保存剤を含んでなることができる。充填剤および甘味料、風味剤、着色剤のようなさらなる補形剤もこれらの製剤に含めることができる。
本発明の製薬学的組成物は、水中油型乳液または油中水型乳液の形態で調製、包装または販売することができる。油性相はオリーブまたは落花生油のような植物油、液体パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組み合わせでよい。そのような組成物はさらに、アラビアガムまたはトラガカントガムのような自然に存在するガム、ダイズまたはレシチンホスファチドのような自然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレートのような脂肪酸およびヘキシトール無水物の組み合わせに由来するエステルまたは部分エステル、およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレートのようなエチレンオキシドとの部分エステルのような縮合生成物のような１以上の乳化剤を含んでなることができる。これらの乳液は、例えば甘味料または風味剤を含むさらなる成分も含むことができる。
本発明の製薬学的組成物は、直腸投与に適する製剤で調製、包装または販売することができる。そのような組成物は例えば座薬、滞留浣腸調製物および直腸もしくは結腸潅注用の溶液形態であることができる。
座薬製剤は有効成分を、通常の室温（すなわち約２０℃）では固体であり、そして個体の直腸温度（すなわち健康なヒトでは約３７℃）では液体である非炎症性の製薬学的に許容されうる補形剤と合わせることにより作成することができる。適当な製薬学的に許容され得る補形剤には限定するわけではないが、カカオ脂、ポリエチレングリコールおよび種々のグリセリドを含む。座薬製剤は限定するわけではないが、抗酸化物質および保存剤のような様々なさらなる成分をさらに含んでなることができる。
直腸もしくは結腸潅注用の滞留浣腸調製物または溶液は、有効成分を製薬学的に許容され得る液体担体と合わせることにより作成することができる。当該技術分野で周知であるように、浣腸調製物は個体の直腸の解剖学的構造に適合した送達デバイスを使用して投与し、そしてその中に包装することができる。浣腸調製物は限定するわけではないが、抗酸化物質および保存剤のような様々なさらなる成分をさらに含んでなることができる。
本発明の製薬組成物は、膣投与に適当な製剤で調製、包装または販売することができる。そのような組成物は例えば座薬、タンポンのような含浸またはコートした膣に挿入可能な材料、洗浄調製物、または膣潅注用のゲルもしくはクリームもしくは溶液の形態であることができる。
材料を化学組成物で含浸またはコートする方法は当該技術分野では知られており、そして限定するわけではないが、表面に化学組成物を沈積または結合する方法、化学組成物を材料の合成中に材料の構造に包含させる方法（すなわち、生理学的に分解可能な材料を用いるような）、および後の乾燥を含むか、または含まない、水性もしくは油性溶液または懸濁液の吸収材料への吸収法を含む。
膣潅注用の洗浄調製物または溶液は、有効成分を製薬学的に許容され得る液体担体と合わせることにより作成することができる。当該技術分野で周知であるように、洗浄調製物は個体の膣の解剖学的構造に適合した送達デバイスを使用して投与し、そしてその中に包装することができる。洗浄調製物は限定するわけではないが、抗酸化物質、抗生物質、抗カビ・菌剤および保存剤を含む様々なさらなる成分をさらに含んでなることができる。
本明細書で使用する製薬学的組成物の「非経口投与」には、個体の組織を物理的に裂く（ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）ことを特徴とする投与、および組織中の裂傷（ｂｒｅａｃｈ）を介する製薬学組成物の投与の任意の経路を含む。このように非経口投与には限定するわけではないが、組成物の注入による、外科的切開を介する組成物の適用による、組織を透過する非外科的創傷を介する組成物の適用等による製薬学的組成物の投与を含む。特に非経口投与には限定するわけではないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎臓透析潅流法を含むことを意図する。
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張性塩水のような製薬学的に許容され得る担体と合わせた有効成分を含んでなる。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適する形態で調製、包装または販売することができる。注入用製剤は、アンプルのような単位剤形または保存剤を含む多回投薬容器で調製、包装または販売することができる。非経口投与用の製剤には限定するわけではないが、懸濁液、溶液、油性もしくは水性賦形剤中の乳液、ペーストおよび移植可能な徐放性または生分解性製剤を含む。そのような製剤は、限定するわけではないが沈殿防止、安定化または分散剤を含む１以上のさらなる成分をさらに含んでなることができる。非経口投与用の製剤の１つの態様では、再構成される組成物の非経口投与前に、適当な賦形剤（例えば滅菌性の発熱物質を含まない水）で再構成するために、有効成分が乾燥（すなわち粉末または粒状）状で提供される。
製薬組成物は、滅菌性の注入可能な水性もしくは油性懸濁液または溶液の状態で調製、包装または販売されることができる。この懸濁液または溶液は既知の技術に従い配合されることができ、そして有効成分に加えて、本明細書に記載する分散剤、加湿剤または沈殿防止剤のようなさらなる成分を含んでなることができる。そのような滅菌性の注入可能な製剤は、例えば水または１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒を使用して調製することができる。他の許容され得る希釈剤および溶媒には、限定するわけではないが、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、および合成モノ−もしくはジ−グリセリドのような固定油を含む。有用な他の非経口的に投与可能な製剤には、微結晶形態で、リポソーム調製物に、または生分解性ポリマー系の成分として有効成分を含んでなるものを含む。徐放性または移植用の組成物は、乳液、イオン交換樹脂、溶解し難いポリマーまたは溶解し難い可溶性塩のよう製薬学的に許容され得るポリマー性または疎水性材料を含んでなることができる。
局所的投与に適する製剤は、限定するわけではないが塗布剤、ローション、クリーム、軟膏もしくはペーストのような水中油および油中水乳液のような液体または半液体調製物、および溶液または懸濁液を含む。局所的に投与可能な製剤は、例えば約１％〜約１０（重量／重量）％の有効成分を含んでなることができるが、有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解限界まででよい。局所投与用の製剤は、さらに本明細書に記載する１以上のさらなる成分を含んでなることができる。
本発明の製薬学的組成物は、口腔前庭を介した肺投与に適する製剤で調製、包装または販売することができる。そのような製剤は有効成分を含んでなり、そして約０．５〜約７ナノメートル、そして好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含んでなることができる。そのような組成物は粉末を分散するために推進薬流を向けることができる粉末リザーバーを含んでなるデバイスを使用して、または密閉容器中の低沸点推進薬に溶解もしくは懸濁された有効成分を含んでなるデバイスのような自己推進溶媒／粉末−分散容器を使用して投与するために都合がよい粉末乾燥状である。好ましくはそのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートルよりも大きい直径を有し、そして粒子数の少なくとも９５％が７ナノメートルよりも小さい直径を有する。より好ましくは粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメートルよりも大きい直径を有し、そして粒子数の少なくとも９０％が６ナノメートルよりも小さい直径を有する。乾燥粉末組成物は好ましくは糖のような固体の微細粉末希釈剤を含み、そして単位剤形で都合よく提供される。
低沸点推進薬は、一般に大気圧で６５゜Ｆ未満の沸点を有する液体推進薬を含む。一般に推進薬は組成物の５０〜９９．９（重量／重量）％を構成し、そして有効成分は組成物の０．１〜２０（重量／重量）％を構成する。推進薬はさらに液体の非イオン性または固体のアニオン性表面活性剤または固体の希釈剤（好ましくは有効成分を含んでなる粒子と同じ次元の粒子サイズを有する）のようなさらなる成分を含んでもよい。
肺送達用に配合された本発明の製薬学的組成物は、溶液もしくは懸濁液の小滴状態の有効成分を提供することもできる。そのような製剤は、有効成分を含んでなる場合により滅菌性の水性または希釈されたアルコール性溶液もしくは懸濁液で調製、包装または販売されることができ、そしてネブライザーまたは噴霧化デバイスを使用して投与することができる。そのような製剤はさらに限定するわけではないがサッカリンナトリウムのような風味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、またはメチルヒドロキシベンゾエートのような保存剤を含む１以上のさらなる成分を含んでなることができる。この投与経路により提供される小滴は、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲の直径を有する。
肺送達に有用な本明細書に記載する製剤は、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にも有用である。
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んでなり、そして約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い粉末である。そのような製剤は鼻を嗅ぐ様式で、すなわち外鼻孔付近に維持された粉末の容器から鼻孔を通す迅速な吸入により投与される。
鼻投与に適する製剤は、例えばわずか約０．１（重量／重量）％から１００（重量／重量）％もの有効成分を含んでなることができ、そしてさらに本明細書に記載する１以上のさらなる成分を含んでなることができる。
本発明の製薬学的組成物は、頬内投与に適する形態で調製、包装または販売することができる。そのような製剤は例えば、常法を使用して作成された錠剤またはロゼンジの形態でよく、そして例えば０．１〜２０（重量／重量）％の有効成分、経口で溶解可能または分解可能な組成物を含んでなるバランス、および場合により本明細書に記載する１以上のさらなる成分でよい。あるいは頬内投与に適する製剤は、有効成分を含んでなる粉末またはエーロゾル化または噴霧化溶液または懸濁液を含んでなることができる。そのような粉末化、エーロゾル化またはエーロゾル化製剤は、分散した時、好ましくは約０．１〜約２００ナノメーターの範囲の平均粒子または小滴サイズを有し、そしてさらに本明細書に記載する１以上のさらなる成分を含んでなることができる。
本発明の製薬学的組成物は、眼内投与に適する製剤で調製、包装または販売することができる。そのような製剤は例えば、水性もしく油性液体担体中の０．１〜１．０（重量／重量）％の有効成分の溶液もしくは懸濁液を含む点眼薬の状態でよい。そのような小滴はさらに緩衝剤、塩または本明細書に記載する１以上のさらなる成分を含んでなることができる。有用な他の眼科的に投与可能な製剤は、微結晶状またはリポソーム調製物状の有効成分を含んでなるものである。
本明細書で使用する「さらなる成分」には限定するわけではないが以下の１以上を含む；補形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒および崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味料；風味剤；着色剤；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性賦形剤および溶媒；油性賦形剤および溶媒；沈殿防止剤；分散または加湿剤；乳化剤、粘滑剤；バッファー；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗カビ・菌剤；安定化剤；および製薬学的に許容され得るポリマー性または疎水性材料。本発明の製薬学的組成物に含むことができる他の「さらなる成分」は当該技術分野では知られており、そして例えば引用により本明細書に編入するＧｅｎａｒｏ編集（１９８５，レミングトンの製薬科学、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州）に記載されている。
典型的には動物、好ましくはヒトに投与することができる本発明の化合物の投薬用量は、限定するわけではないが、処置する動物の種類および疾患状態の種類、動物の年齢および投与経路を含む任意の数の因子に依存して変動するだろう。
化合物は、１日に数回もの頻度で投与でき、または１日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回のようなより少ない頻度で、あるいは数カ月に１回またはさらに１年に１回以下のようなさらに少ない頻度で動物に投与することができる。投与の頻度は当業者には直ちに明白であり、そして限定するわけではないが、処置する疾患の種類および重篤度、動物の種類、年齢等のような任意の数の因子に依存するだろう。
ＶＩＩＩ．方法
Ａ．有用な化合物を同定する方法
本発明はさらに細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現に影響を及ぼす化合物を同定する方法を含む。この方法は、細胞を試験化合物と接触させ、そしてそのように接触した細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルを、試験化合物と接触しないこと以外は同一である細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルと比較することを含んでなる。試験化合物と接触した細胞中でＰＣＡＤＭ−１の発現レベルが、試験化合物と接触しないこと以外は同一である細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルと比べて高いか、または低い場合、これは試験化合物が細胞中のＰＣＡＤＭ−１発現に影響を及ぼすことの指標である。
同様に本発明はさらに細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現を減少する化合物を同定する方法を含む。この方法は、細胞を試験化合物と接触させ、そして化合物に接触した細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルを、試験化合物と接触しないこと以外は同一である細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルと比較することを含んでなる。試験化合物と接触した細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルが、試験化合物と接触しなかった細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルと比べて低い場合、これは試験化合物が細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現の減少に影響を及ぼすことの指標である。
当業者は、本明細書に提供する開示に基づき、細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルは、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡの発現レベルを決定することにより測定することができる。あるいはＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡの発現レベルは、本発明の抗−ＰＣＡＤＭ−１抗体を使用したウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ分析、または酵素結合イムノアッセイを使用して、本明細書に例示するｍＲＮＡからのようなＰＣＡＤＭ−１生産を評価する免疫学的方法を使用して決定することができる。さらにノーザンブロットおよびＰＣＲアッセイ等のような核酸に基づく検出法も使用することができる。このように当業者は本明細書に提供される実施に対する徹底的な開示および適合に基づき、本明細書に開示されるこれらの、および将来開発され得る他の方法を含め、細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現レベルを評価するために使用できる当該技術分野では周知の沢山の方法があると考えるだろう。
さらに当業者は以下の実施例に開示されるような本明細書に提供される開示に基づき、内因性のＰＣＡＤＭ−１発現を欠く細胞を、ＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸を含んでなるベクターでトランスフェクトすることができ、これによりＰＣＡＤＭ−１の発現が細胞中で行われる。次いでトランスフェクトされた細胞を試験化合物と接触させ、これにより化合物がＰＣＡＤＭ−１の発現に影響を及ぼすかどうかを決定できるようにする。したがって当業者は本発明から着手すれば、検出可能なレベルのＰＣＡＤＭ−１を欠く細胞をＰＣＡＤＭ−１発現ベクターを使用して選択的にトランスフェクトすることにより、ＰＣＡＤＭ−１発現に選択的に影響を及ぼす化合物を同定することができる。
当業者は本明細書に提供される開示に基づき、本発明が本明細書のいたるところで検討する方法を使用して同定される試験化合物を包含すると理解するだろう。すなわちＰＣＡＤＭ−１発現を阻害する化合物は、前立腺ガンのようなＰＣＡＤＭ−１過剰発現により媒介される疾患、障害または状態の治療法および診断法を開発するために使用できる。このように当業者は、ＤＮＡＺＹＭもしくはリボザイム、またはＰＣＡＤＭ−１を特異的に開裂するアンチセンスについて検討する本明細書のいたるところでさらに完全に説明するように、疾患、障害または状態が関連するＰＣＡＤＭ−１発現レベルを減少させることは、疾患、障害または状態の処置のための潜在的治療法であると考えるだろう。このように本明細書に開示する方法により同定される化合物は、中でも前立腺ガンの処置に潜在的な治療法である。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明が細胞中のＰＣＡＤＭ−１のレベルを上げる化合物を同定する方法を包含すると考えるだろう。これらの方法は本明細書に開示するデータが、ＰＣＡＤＭ−１の上昇した発現が前立腺ガンに関連し、および／または媒介することを初めて証明する点で有用である。すなわちＰＣＡＤＭ−１のレベルを上昇させる化合物は、潜在的な前立腺の発現物質であり、そしてそのような化合物の同定は、化合物の潜在的毒性の評価に重要であり、すなわち例えば新規化合物に付随する潜在的な有害効果の同定が最も重要な薬剤開発の分野で有用なアッセイとなる。したがって本発明は、薬剤開発の分野等において潜在的な負の効果を同定するために有用なアッセイを提供する。
さらに当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明がＰＣＡＤＭ−１のＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖核酸への結合を阻害する化合物を同定する方法を含むと考えるだろう。この方法はＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合することが知られている二本鎖核酸に結合するＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価することを含んでなる。そのような二本鎖核酸には限定するわけではないが、配列番号５の配列、配列番号６の配列、配列番号７および配列番号８を有する核酸配列を含む。すなわち化合物の存在および不存在下でＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖核酸へ結合するＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価および比較することにより、ＰＣＡＤＭ−１と核酸の結合のレベルが化合物の存在下で化合物の不存在下に比べて低い場合の化合物を同定することができる。すなわち、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する核酸とのＰＣＡＤＭ−１の結合を阻害する化合物を同定することができ、そしてそのようなアッセイは本発明に包含される。ＰＣＡＤＭ−１と、それに特異的に結合する核酸との間の特異的な結合の相互作用は、そのような結合の相互作用に関連または媒介される疾患、障害または疾患、例えば前立腺ガン等の処置の潜在的標的となり得るので、これらの化合物は有用な治療薬となることができる。
Ｂ．ＰＣＡＤＭ−１発現に関連または媒介される疾患、障害または状態を処置または緩和する方法
本発明はＰＣＡＤＭ−１の異常発現により媒介される疾患、障害または状態を緩和する方法を含む。この方法は発現調節化合物、例えばＤＮＡＺＹＭ、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸またはリボザイムを、正常組織、すなわち処置または緩和する疾患、障害または状態に関連する検出可能な臨床的パラメーターを表さないこと以外は同一の組織中でのＰＣＡＤＭ−１発現のレベルに比べて、上昇したＰＣＡＤＭ−１発現により媒介される疾患、障害または状態を罹患している患者に投与することを含んでなる。これは次いで、ＰＣＡＤＭ−１発現の減少を媒介し、これによりＰＣＡＤＭ−１の異常発現により媒介される疾患、障害または状態を緩和する。そのような疾患、障害または状態には限定するわけではないが、前立腺ガンＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを含み、すなわちＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害するアンチセンス核酸またはリボザイムは故に疾患、障害または状態に罹患していない細胞および／または患者におけるＰＣＡＤＭ−１の発現と比べた時、ＰＣＡＤＭ−１の上昇した発現に媒介される疾患、障害または状態を処置するための薬剤の製造にも使用することができる。
加えて、本発明は細胞中の前立腺ガン抗原診断マーカー１の発現を阻害する方法を含む。この方法は本明細書のいたるところに開示するデータにより証明されるように、ＰＣＡＤＭ−１発現の阻害がガン細胞（例えば前立腺腫瘍細胞）の成長および／または生存を阻害するが正常な非腫瘍細胞は阻害しなかった点で大変有用である。このように当業者は本明細書に提供する開示に基づき、本発明が限定するわけではないが細胞中のＰＣＡＤＭ−１のｍＲＮＡを開裂するためにＤＮＡＺＹＭを使用し、これにより細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害することを含むＰＣＡＤＭ−１発現を阻害する方法を包含すると考えるだろう。しかし本発明は単にＤＮＡ酵素を使用してＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害することに限定されず；むしろ本発明は当該技術分野で既知の、または将来開発される方法を使用してタンパク質、すなわちＰＣＡＤＭ−１の転写または翻訳を阻害する方法を包含する。
より詳細には、この方法は該前立腺ガン抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されたｍＲＮＡを特異的に開裂する単離された核酸を細胞に投与し、これにより該細胞中の該前立腺ガン抗原診断マーカー１の発現を阻害することを含んでなる。
１つの観点では、単離された酵素的核酸は配列番号９の配列を有する酵素的核酸および、配列番号１０の配列を有する酵素的核酸からなる群から選択される。しかし本明細書に提供される教示に基づき、当業者は本発明がＰＣＡＤＭ−１（配列番号１）の配列に基づく他のＤＮＡＺＹＭを使用すること、および／または細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害する他の方法を使用することも包含し、そのような方法は当該技術分野では周知である（例えばアンチセンス分子、抗体等の使用）ことを理解している。したがって本発明はＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号９）またはＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（発現番号１０）の使用に限定せず、核酸配列が知られている場合、ＰＣＡＤＭ−１の配列（配列番号１）に基づく他のＤＮＡＺＹＭを使用することを含め、核酸の発現を阻害する当該技術分野で周知な方法を含む。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、ＰＣＡＤＭ−１の発現の減少が前立腺ガンに罹患している患者に有益な効果を媒介できるので（細胞にＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを投与することにより媒介される、正常細胞ではなく前立腺ガンの選択的阻害により証明されるように）、低下したＰＣＡＤＭ−１発現がそのような疾患、障害または状態の処置に有用となり得ると理解するだろう。これは本明細書のいたるところに開示するように、ＰＣＡＤＭ−１の上昇した発現が前立腺ガンが関連する異常な細胞増殖および／または細胞生存および／または正味の腫瘍成長に関連しているからである。さらに本明細書中のいたるところに開示するデータにより、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に開裂するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭによる投与によるようなＰＣＡＤＭ−１発現の阻害が、腫瘍に有益な減少をもたらし、そして前立腺ガン治療の研究用に技術的に認識されているマウスモデルにおいて生存期間を増加させたことを証明する。すなわち当業者は本明細書に提供する開示に基づき、ＰＣＡＤＭ−１の阻害がＰＣＡＤＭ−１異常発現の有害効果を阻害できると考えるだろう。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、減少したＰＣＡＤＭ−１発現は有益な効果を媒介できるので、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡの発現を減少させ、細胞に存在するＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドのレベルを減少させ、および／または細胞中のＰＣＡＤＭ−１の活性を減少させる方法（例えばＤＮＡＺＹＭ、アンチセンス核酸、リボザイム、抗体等を使用して）は、より低レべルのＰＣＡＤＭ−１が利益を提供する場合、ＰＣＡＤＭ−１の改変された発現と関連する疾患、障害または状態を処置し、そして／または緩和するために使用できると理解するだろう。
細胞中の核酸の発現を阻害する技術は当該技術分野では周知であり、そして本明細書に開示するような方法（例えば抗体、ＤＮＡＺＹＭ、アンチセンス核酸、リボザイム等を使用する阻害）を包含する。ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の発現を阻害するために有用な他の技術は、限定するわけではないがＰＣＡＤＭ−１プロモーターの特異的配列を標的とするヌクレオチド試薬等を使用することを含む。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、細胞中のＰＣＡＤＭ−１のレベルまたは活性を上昇させることが有用になると考えるだろう。すなわちこれはＰＣＡＤＭ−１を投与することによりＰＣＡＤＭ−１の減少した発現、レベルまたは活性に関連または媒介される疾患、障害または状態を処置または緩和するために有用となり得る。そのような疾患、障害または状態には限定するわけではないが、前立腺ガンおよび恐らく他の充実性ガンまたは白血病、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ感染、免疫障害および炎症性もしくは変性障害等を含む。
ＰＣＡＤＭ−１の発現、ポリペプチドのレベルまたはその活性が上昇しても減少しても、当業者は本開示に基づき、本発明のＰＣＡＤＭ−１を減少または誘導する方法がＰＣＡＤＭ−１を発現するか、または発現を欠く組換え細胞の投与を包含すると考えるだろう。
本発明の別の態様では、改変されたＰＣＡＤＭ−１発現に関連または媒介される疾患、障害または状態に罹患している個体は、ＰＣＡＤＭ−１発現を欠く細胞を補充、増加および／または欠損細胞と置き換えることにより処置することができる。細胞は処置する個体から得た正常な同系の適合ドナーまたは細胞から得た細胞に由来することができる。細胞はＰＣＡＤＭ−１発現を阻害するように遺伝的に修飾することができる。
ＰＣＡＤＭ−１発現に関連または媒介される疾患、障害または状態の例は前立腺ガン等である。欠損細胞を適合するドナーに由来する修復細胞または正常細胞に置き換えることに加えて、本発明の方法は動物に分泌した時、有益な効果を有する所望のタンパク質の発現を促進するために使用することもできる。すなわち細胞は単離され、ＰＣＡＤＭ−１をコードする遺伝子が供給され、そしてドナーまたは同系の適合する受容体に導入され得る。ＰＣＡＤＭ−１の発現は、治療効果を発揮する。本発明のこの観点は治療的量のＰＣＡＤＭ−１が個体に投与される遺伝子治療に関する。
特にＰＣＡＤＭ−１をコードするヘテロロガスな遺伝子を含んでなる遺伝子構築物が細胞に導入される。これらの組換え細胞は、単離されたＰＣＡＤＭ−１を精製するために使用され、これが次いで動物に投与される。当業者は本明細書に提供する開示に基づき、単離されたＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドを投与する代わりに、哺乳動物に組換え細胞自体を投与することにより、ＰＣＡＤＭ−１をそれが必要な哺乳動物に投与できると理解するだろう。これはタンパク質が組換え細胞により受容体の系で発現され、そして分泌される時、利益を受ける受容体個体に有益となるだろう。
本発明に従い、本発明のヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物は細胞に導入される。すなわち本明細書で「組換え細胞」と呼ぶ細胞は、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、または組換え細胞によるＰＣＡＤＭ−１発現および／または分泌を阻害する核酸（例えばアンチセンス核酸、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸から転写されたＲＮＡを特異的に開裂する酵素的核酸）を導入するために遺伝的に改変され、これにより組換え細胞が投与される受容体に有益な効果を媒介する。本発明の幾つかの観点に従い、処置する個体と同じ個体から得た、または他の個体から、あるいは非ヒト動物から得た細胞を遺伝的に改変して、欠損遺伝子を置き換え、および／または発現が個体に有益な効果を有する核酸を導入するか、または阻害が個体に有益な効果を有することができるＰＣＡＤＭ−１発現を阻害することができる。
本発明の幾つかの観点では、疾患、障害または状態に罹患している個体は、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸の正常な機能するコピーを含む遺伝子構築物を含有する単離された組換え細胞を提供することにより、補充、増強および／またＰＣＡＤＭ−１をコードする欠損または欠失核酸を置き換えることにより処置することができる。本発明のこの観点は、存在および／または機能が欠失している個体にＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸が提供される遺伝子治療に関する。細胞により提供されるＰＣＡＤＭ−１をコードする単離された核酸は、核酸が個体中で発現した時、個体の疾患、障害または状態を緩和するか、または処置するために役立つタンパク質が生成されるので、個体の欠損ＰＣＡＤＭ−１発現を相補する。そのような核酸は好ましくは組換え細胞から分泌されるＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドをコードする。
ＰＣＡＤＭ−１をコードする遺伝子構築物が細胞にトランスフェクトされるすべての場合で、核酸は組換え細胞中で核酸の発現を達成するために必要な適切なプロモーター／調節配列に操作可能に連結される。そのようなプロモーター／調節配列には限定するわけではないが、構成的および誘導性および／または組織特異的および分化特異的プロモーターを含み、そして本明細書のいたるところに記載されている。構成的プロモーターには限定するわけではないが、サイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターを含む。さらにハウスキーピング遺伝子の発現を制御するようなハウスキーピングプロモーターも使用することができる。他のプロモーターには、限定すわけではないがグリア繊維酸性タンパク質をコードする遺伝子に関するプロモーターのような中枢神経系の細胞で優先的に発現されるものを含む。さらにプロモーター／調節要素は遺伝子発現が誘導性となるように選択することができる。例えばテトラサイクリン誘導性プロモーターを使用してもよい（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３：１５９−１７３）。
遺伝子構築物は好ましくは発現ベクターとして提供され、これはベクターが細胞にトランスフェクトされた時、コード配列が細胞により発現されるように、必須なプロモーター／調節配列に操作可能に連結された本発明の哺乳動物ＰＣＡＤＭ−１のコード配列を含む。コード配列は細胞中で配列の発現に必要なプロモーター／調節要素に操作可能に連結されている。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはそれらのハイブリッドまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子でよい。
プロモーター／調節要素に操作可能に連結されたＰＣＡＤＭ−１をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、機能するエピソーム分子として細胞に存在し留まるか、または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。遺伝物質は細胞に導入され、そこでこれはプラスミドの状態で別個の遺伝物質として存在することができる。あるいは宿主細胞の染色体に組み込まれることができる直線状のＤＮＡが細胞に導入されてもよい。ＤＮＡを細胞に導入する時、ＤＮＡの染色体への組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みを促進するために有用なＤＮＡ配列もＤＮＡ分子に含むことができる。あるいはＲＮＡが細胞に導入されてもよい。
発現ベクター中の遺伝物質を発現させるために、プロモーター／調節要素は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されなければならない。タンパク質生産を最大とするために、所望する細胞中での遺伝子発現に十分適するプロモーター／調節要素を選択することができる。さらに細胞中で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は所望する細胞中で機能的な発現ベクターとして組換え遺伝物質を生成することができる。
プロモーター／調節要素はタンパク質の組織特異的発現を促進するために選択することができる。すなわち例えば特異的なプロモーター／調節配列は、組換え細胞が移植された組織でのみヘテロロガスな遺伝子が発現するように提供され得る。当業者は本明細書に提供する開示に基づき、ＰＣＡＤＭ−１の発現または発現の欠如が標的とされる好適な組織には限定するわけではないが前立腺組織を含むと理解するだろう。さらにプロモーター／調節要素は、遺伝子発現が誘導性となるように選択することができる。例えばテトラサイクリン誘導性プロモーターを使用することができる（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３：１５９−１７３）。
タンパク質が十分な量および／または機能的状態で存在しないことによる個体の遺伝的欠損を矯正するタンパク質をコードする、および／またはタンパク質に関連する特定の疾患、障害または状態の処置または防止に有益であるとして有用なタンパク質をコードする、および細胞中のＰＣＡＤＭ−１の発現を阻害する（例えばノックアウト標的遺伝子、ＤＮＡＺＹＭ、アンチセンス核酸、リボザイム等）、細胞中の遺伝的欠損をいずれかに矯正する組換え遺伝物質を細胞に提供することに加えて、遺伝物質は本発明で使用する組換え細胞に導入されて、終結が望ましくなるべき細胞を選択的に殺すための手段を提供することができる。破壊のための標的組換え細胞のような手段を、組換え細胞に導入することができる。
本発明に従い、組換え細胞に細胞を破壊に対して特異的に感受性とする遺伝物質を供給することができる。例えば組換え細胞に、細胞傷害剤で特異的に標的化され得るレポーターをコードする遺伝子を提供することができる。選択的な細胞死を誘導するために使用することができる遺伝子の発現可能な形態を、組換え細胞に導入することができる。そのような系では、遺伝子にコードされるタンパク質を発現する細胞は特異的な条件下または特異的な作用物質の存在もしくは不存在下で標的化される殺しに対して感受性である。例えばヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ヘルペスｔｋ）遺伝子の発現可能な形態は、組換え細胞に導入され、そして選択的な細胞死を誘導するために使用することができる。ヘルペスｔｋ遺伝子を含む導入される遺伝物質が個体に導入された時、ヘルペスｔｋが生産される。移植した組換え細胞を殺すことが望ましいか、または必要な場合、ヘルペスｔｋを生産する任意の細胞を選択的に殺す薬剤であるガンシクロビルを個体に投与することができる。このように移植した組換え細胞の選択的破壊を可能とする系を提供することができる。
当業者は本明細書に提供される開示に基づき、本発明が哺乳動物においてＰＣＡＤＭ−１を提供するか、またはＰＣＡＤＭ−１発現を阻害するいずれかの組換え細胞の生産を包含すると理解するだろう。このように細胞はＰＣＡＤＭ−１を動物に投与するために、または分子（例えばノックアウト標的化遺伝子、ＤＮＡＺＹＭ、、アンチセンス核酸、リボザイム［例えば配列番号９、配列番号１０の配列を有する単離された酵素的核酸］およびＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体等）を送達するために使用することができる。
動物へのＰＣＡＤＭ−１の投与は、例えばＰＣＡＤＭ−１／ＤＮＡ結合相互作用を阻害する効果（１つまたは複数）を評価するためのＰＣＡＤＭ−１の作用機作を研究するためのモデル系として、およびＰＣＡＤＭ−１発現に関連する疾患、障害または状態の診断薬および／または治療薬の開発に有用なモデル系を開発するために使用することができる。
さらにＰＣＡＤＭ−１を発現し、そして分泌する組換え細胞の投与に媒介される動物へのＰＣＡＤＭ−１の送達も、ＰＣＡＤＭ−１のレベルの上昇が治療効果を媒介する疾患、障害または状態を処置または緩和するために使用することができる。さらに具体的には、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸を発現する組換え細胞を投与することによる動物へのＰＣＡＤＭ−１の投与は、前立腺ガン（すなわちイヌおよびヒトにおける）前立腺ガン、および中でもヒトおよび動物も罹る恐らく他の充実性ガンまたは白血病、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ感染、免疫障害および炎症もしくは変性障害の処置に有用となり得る。
あるいはその発現がＰＣＡＤＭ−１発現、活性および／またはＰＣＡＤＭ−１のＤＮＡへの結合を阻害または減少する核酸を含んでなる組換え細胞の投与は、ＰＣＡＤＭ−１発現、活性および／またはタンパク質／核酸結合相互作用に関係または媒介される疾患、障害または状態に有用な診断薬および／または治療薬を開発するためのモデルとして使用することができる。本発明は組換え細胞がＰＣＡＤＭ−１発現を阻害する分子を生産でき、これによりそのような分子を動物に提供することを包含する。あるいは特定の理論に拘束されることを望まないが、組換え細胞自体（ＰＣＡＤＭ−１を発現できない事を除く外は機能的な細胞である）は、ＰＣＡＤＭ−１シグナル回路に供されずに、非組換えである以外は同一の細胞の機能を行うことができる。
動物から、または市販の、もしくはこれから開発される樹立細胞株から得た細胞、またはインビトロで培養された初代細胞であろうとも、細胞は当業者に周知な技術を使用してトランスフェクトされることができる。すなわち本発明はドナー動物から、または患者の動物自体から細胞を得ることに限定されない。むしろ本発明は、組換え細胞がＰＣＡＤＭ−１、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭおよび／またはＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体を発現するように（細胞が工作前にはそのような分子を発現しなかったか、または細胞に核酸が導入される前とは異なるレベルで細胞が分子を生産する場合）、あるいは組換え細胞がＰＣＡＤＭ−１、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭおよび／またはＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体を発現しないか、またはより低レベルで発現するように（細胞が以前に分子を発現したか、または細胞に核酸が導入される前とは異なるレベルで細胞が分子を発現する場合）、本発明の核酸を使用して工作することができる任意の細胞を使用することを含む。
核酸は、遺伝子によりコードされるタンパク質を発現するか、またはＰＣＡＤＭ−１発現を阻害する分子を発現する細胞に遺伝子構築物を導入するために使用される標準法を使用して細胞に導入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．）。幾つかの態様では細胞はリン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソームが媒介する転移、化学物質が媒介する転移、リガンドが媒介する転移または組換えウイルスベクター転移によりトランスフェクトされる。
幾つかの場合では、組換えアデノウイルスベクターを使用して、所望する配列を有するＤＮＡを細胞に導入する。幾つかの態様では、組換えレトロウイルスベクターを使用して、所望する配列を有するＤＮＡを細胞に導入する。幾つかの態様では、所望のＤＮＡを分割している細胞に包含するために、標準的なリン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたは脂質担体が媒介するトランスフェクション技法が使用される。標準的な抗生物質選択技術を使用して、トランスフェクトされた細胞を同定し、そして選択することができる。幾つかの態様では、ＤＮＡはマイクロインジェクションにより細胞に直接導入される。同様に周知の電気穿孔または粒子衝撃技術も、外来ＤＮＡを細胞に導入するために使用することができる。第２遺伝子は通常、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、あるいはノックアウト標的化ベクターとコトランスフェクションされるか、かつ／またはそれに共有的に結合される。第２遺伝子は選択可能な抗生物質−耐性遺伝子であることが多い。トランスフェクトされた組換え細胞は、細胞を選択可能な遺伝子を取り込まなかった細胞を殺す抗生物質中で成長させることにより選択することができる。２つの遺伝子が連結されず、そしてコトランスフェクトされるほとんどの場合で、抗生物質処理で生存する細胞は両遺伝子を含み、そして発現する。
本発明の単離されたＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ、ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチド、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体、および／または組換え細胞が動物に存在するＰＣＡＤＭ−１レベルを上昇または減少させるために動物に投与されるいずれかの場合、当業者は本明細書に提供される開示に基づき、動物に投与されるポリペプチド、核酸、抗体または細胞の量は、血液／尿／他の流体に存在するＰＣＡＤＭ−１および／または糖のレベルを評価することにより、あるいは動物の組織中に存在するＰＣＡＤＭ−１ｍＲＮＡを発現レベル、またはＰＣＡＤＭ−１ポリペプチド、またはＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸のレベルを測定することにより滴定することができると理解するだろう。
さらに当業者は本明細書に提供される開示に基づき、ＰＣＡＤＭ−１の効果を阻害する任意の化合物（例えばＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ、抗体、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖核酸、これによりＰＣＡＤＭ−１活性に必要なＰＣＡＤＭ−１／ＤＮＡ結合を破壊する）の混合物も、改変されたＰＣＡＤＭ−１発現に関連または媒介される疾患、障害または状態を緩和および／または処置するために使用できると考えるだろう。さらに１以上のそのような化合物を、前立腺ガンのような疾患、障害または状態を処置するために有用な他の化合物と組み合わせることができる。このように本発明はＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ、抗−ＰＣＡＤＭ−１抗体、およびＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖核酸を単独で、または互いに組み合わせて投与することを包含し、そしてこれらの物質には限定するわけではないが、当業者が当該技術分野で周知な方法、またはそのような分子の投与に関して将来開発される方法を使用して測定できるようなＤＮＡＺＹＭ、または他のタンパク質に向けられた物質（例えばＶＥＧＦ−１、ＭＭＰ−２等）、ペプチド模造物、低分子および薬剤（例えば化学療法剤）およびそれらの様々な順列を含む。
ＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価する方法（例えばウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析または酵素結合免疫アッセイのような他の免疫に基づく分析において抗−ＰＣＡＤＭ−１抗体を使用して）；細胞および／または組織中のＰＣＡＤＭ−１発現のレベルを評価する方法（例えばノーザンブロット分析等を使用して）；および／または二本鎖核酸（例えばＰＣＡＤＭ−１プローブ１（配列番号５）およびＰＣＡＤＭ−１プローブ２（配列番号６））とＰＣＡＤＭ−１との結合の検出（例えば標識した二本鎖核酸のナイロン膜に基づく検出および／またはＰＣＡＤＭ−１／ＤＮＡの結合を評価するために、電気泳動的移動度のシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して）に基づく「モンテカルロ様」のＤＮＡ／タンパク質結合アッセイのような方法はこれから開示され、または当該技術分野では周知である。そのようなアッセイは、ＰＣＡＤＭ−１のレベルを所望するレベルに減少または上昇させるために、動物に投与されるＰＣＡＤＭ−１、核酸、抗体、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ、アンチセンス核酸、リボザイム、組換え細胞等の「有効量または活性」を決定するために使用することができる。
Ｃ．診断法および治療の評価
本発明はＰＣＡＤＭ−１の改変された、かつ／または異常発現に関係または媒介される特定の疾患、障害または状態（例えば前立腺ガン）の診断法を含む。
本発明は以前は診断されなかった哺乳動物における前立腺腫瘍を診断する方法を含む。この方法は哺乳動物から生物学的サンプルを得、そしてサンプル中のＰＣＡＤＭ−１のレベル（発現、量、活性）を、前立腺腫瘍に罹患していないこと以外は同一の正常な哺乳動物に由来するサンプル中のレベルと比較することを含んでなる。前立腺腫瘍に罹患していないことが分かっている哺乳動物から得たサンプル中のＰＣＡＤＭ−１のレベルに比べて、問題の哺乳動物に由来するサンプル中のＰＣＡＤＭ−１のレベルが高いことは、その哺乳動物が前立腺腫瘍に罹患している指標である。これは本明細書のいたるところで開示するように、上昇したレベルのＰＣＡＤＭ−１発現および／または活性が前立腺ガンの存在に関係するからである。このように哺乳動物から得たサンプル中の上昇したレベルのＰＣＡＤＭ−１タンパク質、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、および／または上昇したレベルのＰＣＡＤＭ−１とＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖核酸との結合は、哺乳動物が前立腺ガンに罹患している指標である。
さらに本明細書のいたるところで開示するデータは、サンプル中のＰＣＡＤＭ−１のレベルと種々の腫瘍組織のグリーソンスコア（Ｇｌｅａｓｏｎ Ｓｃｏｒｅ）との間に相関があることを示し、ＰＣＡＤＭ−１のレベルがそのような腫瘍を級別するマーカーであることを示している。このように改変したレベルのＰＣＡＤＭ−１発現の検出（抗体に基づく方法または核酸の検出に基づく方法を使用して検出されても）、あるいはＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する核酸（例えば配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列を有する核酸のような）への上昇したＰＣＡＤＭ−１結合の検出は、本明細書に開示するデータがＰＣＡＤＭ−１の発現レベルが腫瘍のグリーソンスコアに相関することを証明するので、前立腺腫瘍の段階の指標である。すなわち本発明は、前立腺ガン腫瘍ではないことが分かっている正常な、または既知の具体的段階の、かつ／または既知のグリーソンスコアを有する前立腺ガン腫瘍があることが分かっている哺乳動物から得たサンプル中のＰＣＡＤＭ−１のレベルに比べて、哺乳動物から得たサンプル中のＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価することにより状態を評価する、すなわち前立腺腫瘍を「級別」する方法を含む。
１つの観点では、生物学的サンプルは血液サンプル、前立腺生検材料、尿サンプル、前立腺液サンプル、精液サンプル、リンパ液サンプル、精嚢組織サンプル、胸膜腔液サンプル、会陰腔液サンプル、腹腔液サンプル、骨髄サンプル、唾液腺液サンプルおよび前立腺ガン腫瘍サンプルおよび他のガン組織から得たサンプル等からなる群から選択される。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、サンプル中のＰＣＡＤＭ−１レベルを評価する広い種々の方法があることを理解するだろう。そのような方法には限定するわけではないが、抗体に基づく検出法（例えばウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳアッセイおよび酵素結合イムノ−サンドイッチアッセイのような他の免疫に基づく分析で、抗−ＰＣＡＤＭ−１または他の交差反応性抗体を使用して）；細胞および／または組織中のＰＣＡＤＭ−１発現のレベルを評価する方法（例えばノーザンブロット分析等を使用して）、および／または二本鎖核酸の結合、例えばＰＣＡＤＭ−１プローブ１（配列番号５）およびＰＣＡＤＭ−１プローブ２（配列番号６）とＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドの検出（例えばナイロンメンブレンに基づく二本鎖核酸の検出、および／またはＰＣＡＤＭ−１とＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖核酸の結合を評価するためのＥＭＳＡを使用して）に基づく「モンテカルロ様」のＤＮＡ／タンパク質結合アッセイのような方法を含む。このようにＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドまたはＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸（すなわちＲＮＡまたはＤＮＡ）、あるいはＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドに特異的に結合する核酸を検出するいずれかによるＰＣＡＤＭ−１の検出法は本明細書に開示されるか、または当業者には周知であり、そして本発明に包含される。さらに本発明は将来開発され得るようなサンプル中の特異的タンパク質または核酸の検出のための類似アッセイを包含する。
本発明は、哺乳動物における前立腺ガンの処置の効力を評価する方法を含む。この方法は上昇したＰＣＡＤＭ−１発現に媒介または関連する疾患、障害または状態（例えば前立腺ガン）の処置の特定な過程の前、最中および後に、ＰＣＡＤＭ−１発現のレベル、量、および／またはＤＮＡ結合活性を評価することを含んでなる。これは本明細書中のいたるところですでに述べたように、ＰＣＡＤＭ−１発現、量、および／または活性が特定の疾患状態と関連するか、または媒介するからである。このように処置過程がＰＣＡＤＭ−１発現／量／ＤＮＡ結合活性に及ぼす効果を評価することは、より低レベルのＰＣＡＤＭ−１発現、量、活性が処置法の成功を示すような処置の効力を示す。
Ｄ．ＤＮＡ結合タンパク質およびそれらのコグネイト二本鎖オリゴヌクレオチド結合パートナーの同定法
本発明はＤＮＡ結合タンパク質およびタンパク質により結合される二本鎖オリゴヌクレオチドの同定法を含む。この方法は、１組の半−ランダム二本鎖オリゴヌクレオチドの員をＤＮＡ結合タンパク質を含有する混合物と接触させることを含んでなる。オリゴヌクレオチドは、５’および３’側の両方に隣接する、少なくとも２個の既知の塩基対を除き、未知のランダム配列を含んでなる点で半−ランダムである。１つの態様では、オリゴヌクレオチドは８ｂｐ長であり、ここで第１塩基対はＡであり、そして第２塩基対はそれぞれＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃで変動するが、隣接する既知の対は相補的なワトソン−クリック塩基対であるので、位置１でのヌクレオチドがＡの場合、位置８のヌクレオチドは“Ｔ”であった。同様に第２位置がＡである時、第７番目のヌクレオチドはＴであるといった具合であった。このように一群の半−ランダムオリゴヌクレオチドが、５’末端の２塩基対および３’末端の２塩基対が既知であり、そしてそれらの間に約４塩基対の未知のコア配列を持つようにして作成された。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、既知のフランキング塩基対は２個に限定されないと考えるだろう。さらに当業者は未知のランダムなコア配列が約３〜１２塩基対の範囲であることができるので、二本鎖オリゴヌクレオチドは好ましくは約７〜１６塩基対のサイズの範囲であり、すなわち５’末端が２個の既知の塩基対を含んでなり、続いて３〜７個の未知のコア塩基対、これに次いでオリゴマーの３’末端に最初の２個の既知の塩基対の鏡像である２個の既知の塩基対が続き、ここでこの分子の５’末端の２個のヌクレオチドは、ワトソンクリック塩基対の法則に従い分子の３’末端の２個のヌクレオチドと結合することができるので、オリゴヌクレオチドの最初の２個のヌクレオチドおよび最後の２個のヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが一本鎖であるならば互いにハイブリダイズし、そして必要ではないがステム・ループ構造を形成することができる。
この組からの各半−ランダムオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ結合タンパク質を含有する混合物と混合される。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質は、特異的なＤＮＡ−タンパク質結合が起こることができる条件下でインキュベーションされる。そのような条件は当該技術分野では周知であり、そして本明細書に例示され、そして本発明は任意の特定の組の反応条件に限定されない。むしろ本発明は本明細書に開示する当該技術分野で周知の、および当業者が本明細書の教示から着手すれば二本鎖核酸とＰＣＡＤＭ−１の特異的結合を評価するために使用できると理解する将来開発される広い多くの反応条件を含む。
次いでＤＮＡ結合タンパク質に最高の結合親和性を示す二本鎖オリゴヌクレオチドを、次ぎのプローブの設計に使用するために選択する。より詳細には表１に表すように、ＤＮＡ結合タンパク質混合物と最高レベルの結合を示す８塩基対のオリゴヌクレオチド（＊ＣＡＮＮＮＮＴＧ）を選択し、そしてコアのランダム配列が１塩基対減少して、３個のみ未知のもの（すなわちＣＡＣＮＮＮＴＧ、ＣＡＧＮＮＮＴＧ、ＣＡＴＮＮＮＴＧおよびＣＡＡＮＮＮＴＧ）を有する半−ランダムな組のオリゴヌクレオチドを生成する。もう一度、この組の各員をＤＮＡ結合タンパク質を含んでなるサンプルと結合させ、そしてタンパク質と最高の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定し、そして配列を決定する（すなわちアスタリスクおよび太字により示す−ＣＡＣＮＮＮＴＧ）。この手順を既知の塩基対を加え、そして未知のランダムなコア配列の塩基対の数を減少させながら、ＤＮＡ結合タンパク質に結合する二本鎖核酸の全配列が同定されるまで各回を繰り返す。
さらに当業者は本明細書に提供する開示に基づき、二本鎖オリゴヌクレオチドが特異的に結合するタンパク質が、このアッセイを使用しても同定できると考えるだろう。実際に本発明の「モンテカルロ様」アッセイは、新規なＤＮＡ結合タンパク質ＰＣＡＤＭ−１、およびこのタンパク質に結合する新規核酸配列（例えば配列番号５の配列を有する核酸、および配列番号６の配列を有する核酸）を同定した。したがって本発明はＤＮＡ結合タンパク質の同定法および、限定するわけではないが非腫瘍組織であること以外は同一の組織中よりは腫瘍組織中に高いレベルで存在するタンパク質を含め、そのような方法を使用して同定されるタンパク質を包含する。
当業者は本明細書に提供する開示に基づき、約７〜９塩基対長の範囲の二本鎖オリゴヌクレオチドは、本明細書中のいたるところでさらに詳細に説明されているように、これらが遺伝子発現の調節に関与する転写因子タンパク質のようなタンパク質と特異的に結合する多くの既知のＤＮＡ配列の平均長であるので使用されると考えるだろう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，同上）。故にこれらの長さが本発明の方法の使用に選択された。しかし本発明はこれらの長さに限定されず；むしろ本発明は本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドが約７〜１６塩基対長となるように、少なくとも２個の既知の塩基対に挟まれた約３〜１２塩基対の範囲の中央の未知の配列を含む。
この方法はさらに特異的なＤＮＡ−タンパク質結合を検出することを含んでなる。当業者は本明細書に説明する教示から着手すれば、特異的なＤＮＡ−タンパク質の結合は限定するわけではないが、タンパク質をナイロンメンブレンのような固体支持体に乗せ、そして二本鎖オリゴヌクレオチドと特異的に結合するタンパク質を同定するために、メンブレンに特異的に結合した標識されたオリゴヌクレオチドを検出することを含め、本明細書に例示する技法のような当該技術分野で周知の技法を使用して検出できると理解するだろう。
あるいはＤＮＡ−タンパク質複合体の検出は、電気泳動的移動度シフトアッセイ、または本明細書に開示し、かつ／または当該技術分野で知られているようなＥＭＳＡを使用して行うことができる。タンパク質をゲルから切り出し、そして配列決定して二本鎖オリゴヌクレオチドと特異的に結合するタンパク質のアミノ酸を決定することができる。当業者は本明細書に提供される開示に基づき、ＤＮＡ−タンパク質結合の存在を評価し、そしてタンパク質の同一性（例えばアミノ酸配列）を決定する特異的な検出法が重要ではなく、そしてＤＮＡ−タンパク質結合複合体を検出するために、そしてＤＮＡ−タンパク質およびそれらに結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを単離し、そして同定するために使用できる多くの方法があることを理解している。このように本発明の方法を使用して、ＤＮＡ−結合タンパク質およびそれらが結合するコグネイト二本鎖オリゴヌクレオチドの両方を容易に同定し、そして特性決定することができる。
本発明は、疾患、障害または状態、例えば前立腺ガンに関連しているＤＮＡ結合タンパク質およびそれらが特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチド配列の同定法も含む。この方法は、罹患した細胞または組織から調製したタンパク質抽出物中に存在するが、疾患、障害または状態が無いことが分かっている正常細胞および組織から調製された他は同一のタンパク質抽出物から調製されたタンパク質抽出物中には検出されないＤＮＡ結合タンパク質およびそれらのコグネイトオリゴヌクレオチド結合パートナーを同定することを含んでなる。すなわち当業者には本明細書に提供する開示から想定されるように、本発明の方法はＤＮＡ結合タンパク質およびそれらが結合するオリゴヌクレオチドを同定すること、および罹患した組織に由来するタンパク質抽出物中では検出できるが、ＤＮＡ結合タンパク質が存在しないか、異なる比率を有するか、またはアッセイの検出限界を越えた量で存在するいずれかのために検出されないこれらのＤＮＡ検出タンパク質およびオリゴヌクレオチド結合パートナーを選択することを含んでなる。
罹患することにより上昇するが、正常な非疾患組織では上昇しないレベルの新規ＤＮＡ結合タンパク質の同定は、そのようなタンパク質およびそれらのコグネイト二本鎖オリゴヌクレオチドがそのような疾患、障害または状態の診断および処置のための潜在的な診断薬および治療薬の候補であるという点で重要である。このようにそのようなＤＮＡ結合タンパク質は、腫瘍形成に関与する特定の遺伝子の改変された発現のような細胞性プロセスを調節できる点で、疾患プロセスに関与しているか、または関連しているらしい。
実際に本明細書に開示する方法を使用して同定される新規ＤＮＡタンパク質であるＰＣＡＤＭ−１は、前立腺ガンに関与しているか、またはわずかでも関連しているので、組織細胞および体液中のＰＣＡＤＭ−１の検出は、前立腺ガンの診断に効果的な手段である。加えて、腫瘍細胞（ＰＣ−３ＭＬ）および腫瘍組織（ＳＣＩＤマウスにおける）中のＰＣＡＤＭ−１発現の阻害は、腫瘍細胞の生存および腫瘍の生存を低下させた。これらの結果はＰＣＡＤＭ−１に限定するわけではないが、それらがこれらの疾患、障害または状態を処置するための診断薬および治療薬を開発するために重要となるので、疾患、障害または状態に関連するＤＮＡ結合タンパク質、および特異的に結合するＤＮＡを同定することの重要性を示している。
ＩＸ．キット
本発明は、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体、ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に開裂するＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸に部分的に相補的なＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ（すなわちＤＮＡＺＹＭ）（すなわち、配列番号９の配列（ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１）および配列番号１０等の配列を有する核酸）、および／または本発明の組成物、ＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドに特異的に結合する核酸（例えばＰＣＡＤＭ−１プローブ１［配列番号５］およびＰＣＡＤＭ−１プローブ２［配列番号６］）、アプリケーターおよび本発明の方法を行うための化合物の使用を記載する使用説明書を含んでなる種々のキットを含む。以下に例示キットを記載するが、他の有用なキットの内容物は、本開示に照らして当業者には明白である。これら各キットは本発明内に含まれる。
１つの観点では、本発明はＰＣＡＤＭ−１の異常発現により媒介される疾患を緩和するためのキットを含む。このキットは本発明に開示する方法にしたがって使用される。簡単に説明すると、キットは細胞をＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体と、またはＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを特異的に開裂するＤＮＡＺＹＭと接触させるために使用し、ここでＰＣＡＤＭ−１の減少した発現、量または活性が有益な効果を媒介する。さらにキットはキットを使用するためのアプリケーターおよび使用説明書を含んでなる。これらの使用書は本明細書に提供する例を簡略に具体化する。
キットは製薬学的に許容され得る担体を含む。組成物は本明細書のいたるところで説明する適切な量で提供される。さらに投与経路および投与頻度は、本明細書のいたるところですでに説明した通りである。
本発明はさらに抗ガン処置の効力を評価するためのキットを含む。このキットは、サンプル中に存在するＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価できるように、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する化合物、またはＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸を含む。本明細書のいたるところですでに開示したように、そのようなＰＣＡＤＭ−１検出化合物には限定するわけではないが、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する抗体（例えばウエスタンブロット分析、酵素結合イムノ−サンドイッチアッセイ、ＦＡＣＳアッセイまたはＥＬＩＳＡ、酵素イムノアッセイまたはＥＩＡ等のような抗体に基づく検出法を使用するために）、ＰＣＡＤＭ−１をコードする核酸に特異的に結合する核酸（例えばノーザンおよびサザンブロット分析で使用するために）、およびＰＣＡＤＭ−１ポリペプチドに特異的に結合する二本鎖核酸、例えばＰＣＡＤＭ−１プローブ１（配列番号５）およびＰＣＡＤＭ−１プローブ２（配列番号６）、配列番号７および配列番号８の配列を有するＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それらすべてがＤＮＡ／タンパク質結合アッセイ（例えばモンテカルロ様アッセイおよびＥＭＳＡ）を使用してＰＣＡＤＭ−１を検出するために使用できる。
本発明を以下の実験的実施例を参考にしてさらに詳細に記載する。これらの実施例は具体的説明の目的のみに提供され、そして他に特定しない限り限定することを意図していない。すなわち本発明は以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかとなるありとあらゆる変更を包含すると解釈すべきである。
［実施例］
ＤＮＡ結合タンパク質およびそれらに特異的に結合するＤＮＡ分子を同定するための新規アッセイ
この実施例で提示する実験は、以下のようにまとめることができる。
本発明は同じ患者の良性または正常な組織に比べて、罹患した組織中で発現するタンパク質（１つまたは複数）に優先的に結合する二本鎖ＤＮＡ配列の迅速な同定のための「プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）」プラットフォームの開発に関する。基本的取り組みには、縮重配列で始まり、そして「完成された」配列で終わる７塩基対、８塩基対および９塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列の系統的合成が必要である（表２を参照にされたい）。固体支持体（例えばナイロンメンブレン）上の定量的な「ＤＮＡ−タンパク質」結合アッセイを使用して、「ＤＮＡ−タンパク質」結合親和性を評価し、そして同じ患者に由来する良性または正常な組織（すなわち検出可能な疾患、障害または状態を有することが知られていないことを以外は同一の組織）に比べて、罹患した組織（すなわちガン）に由来するタンパク質（１つまたは複数）に優先的に結合するＤＮＡ配列（１つまたは複数）を同定する。
本発明の分野は、罹患した組織および／または正常もしくは良性組織中のタンパク質（１つまたは複数）に独自に結合することができる新規ＤＮＡ配列の同定に関する。本発明はさらに、核酸発現の調節不順（ｄｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）（異常調節または異常発現とも呼ぶ）に関する疾患（ガンを含む）の診断、防止および処置に関する。
本明細書に開示するデータは、ＤＮＡ結合タンパク質およびこのタンパク質に特異的に結合するＤＮＡ分野を同定するための新規「モンテカルロ様」アッセイの知見を示す。
この使用する材料および方法および実施例に提示する実験の結果を、これから記載する。
本発明は、オリゴヌクレオチドが検出可能な疾患、障害または状態（すなわちガン）を有する組織を使用して調製されたタンパク質抽出物中のタンパク質に結合するが、このオリゴヌクレオチドは疾患、障害または状態を示さない（すなわち正常または良性組織）こと以外は同一の組織から得たタンパク質には検出可能に結合しない、約７〜９塩基対長（７〜９塩基対とも呼ぶ）の範囲の新規二本鎖オリゴヌクレオチドを同定するための新規の迅速な「定量的」スクリーニングアッセイを開示する。
この取り組みの理論的解釈は、これらＤＮＡ配列長が細胞および組織中で遺伝子発現の調節に関与する転写因子またはコファクターに通常結合する既知のＤＮＡ配列の平均長を表すということである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９）。したがって同じ患者に由来する適合する組織中で過剰発現されたタンパク質に結合するＤＮＡ配列の「半−ランダム」なスクリーニングは、正常、良性または罹患した組織に関連する遺伝子転写および遺伝子発現の調節に関与するタンパク質（１つまたは複数）に独自に結合する新規ＤＮＡ配列を同定するはずである。しかし本発明はＤＮＡ結合能について、問われる特定長のオリゴヌクレオチドに限定しない。すなわち約７〜９塩基対長を有するオリゴヌクレオチドが本明細書で例示されるが、約７〜１６塩基対（７〜１６ｂｐまたは７〜１６ｍｅｒ）の長さを有するものを含む他の長さを有するオリゴヌクレオチドが本発明に包含される。
本明細書に記載する取り組みの全体的な重要性は、組織の特別な病状と関連する７塩基対、８塩基対または９塩基対配列（７、８および９塩基対のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー、すなわち−ｍｅｒは、本明細書で択一的に称する）の同定が、患者の状態（すなわち、健康、良性または疾患）の診断におけるこれらＤＮＡ配列の使用を可能にするという事実にある。すなわちＤＮＡ−タンパク質結合アッセイは、患者の状態または疾患状態または正常状態を診断するために組織もしくは体液から得たタンパク質について行うことができる。
本発明は、粗組織抽出物に由来するタンパク質（１つまたは複数）に選択的に結合するいずれか７塩基対、８塩基対または９−ｍｅｒの二本鎖ＤＮＡ配列の合成に関する。ＤＮＡ配列が合成され、そして（γＡＴＰ）３２Ｐ−放射標識され、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）の標準法に従いカラムクロマトグラフィーにより精製される。粗タンパク質抽出物は、同じ患者の切開したヒト組織（すなわち正常、良性およびガン、そして検出可能な疾患、障害または状態を表さない組織）から調製され、そして増加した量のタンパク質（１、５、１０および２０μｇの総タンパク質）をナイロンメンブレンフィルターに乗せた。次いでナイロンメンブレンは一定量の放射標識二本鎖ＤＮＡを使用してインキュベーションし、そしてフィルターをリン酸バッファーで洗浄して非特異的に結合したＤＮＡおよびＤＮＡに結合できなかったタンパク質を確立された方法に従い除去した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８７）。
表１は、本明細書に開示する「モンテカルロ様」アレイプロトコールを使用してスクリーニングしたＤＮＡ二本鎖標準配列（８塩基対）の例を提供する。ヒト前立腺の様々な領域（すなわち前立腺ガン、良性前立腺過形成、および前立腺支質）に由来する粗タンパク質抽出物に結合する放射標識プローブの量を、各配列について比較した。ウシ血清アルブミンに対する放射標識プローブのバックグラウンドレベル（０またはゼロ）を各プローブに対して測定した。目的のプローブの日常的なスクリーニングを、最初の配列が４Ｎのコア（すなわちランダム配列）を有する順次の繰り返しで行った。最高の結合レベルを持つバッチに由来する配列を使用して、ランダムな未知の３Ｎのコア配列を有する４種の配列を生成し、そして結合アッセイを繰り返して目的の組織部位（すなわちこの場合ではガン）について最高の結合活性を持つ配列を同定した。同様にこのバッチからの配列を続いて選択し、そして目的の組織部位（すなわちこの場合ではガン）について最高の結合活性を有する配列を同定するために有用な２Ｎ、１ＮおよびゼロＮのコアをそれぞれ有する４配列を生成した。
目的の配列（すなわち前立腺ガンに由来する粗タンパク質抽出物について、順次上昇したレベルの結合活性を持つ）を同定し、次いで実験的試験を行って結果を実証した。表２に開示するデータは、例えば一定量の放射標識プローブ（すなわちγ−ＡＴＰ）３２Ｐ−標識化ＣＡＣＧＧＡＴＧプローブ（１００，０００ｃｐｍで１ｎｇ））の結合活性は、ナイロンメンブレンフィルター上にスポットした前立腺ガン組織に由来する粗タンパク質の量（１０μｇ）を上昇させると増加した。しかし良性の前立腺過形成、正常支質およびウシ血清アルブミンに対して結合するプローブの量は、比較可能な実験において増加しなかった（表２）。これらの比較アッセイで対照として使用した縮重プローブ（ＣＡＮＮＮＮＴＧ）は、ウシアルブミン血清に結合するＣＡＣＧＧＡＴＧのバックグラウンドレベル（非特異的結合）よりも高いレベルでタンパク質に結合できなかった。通常ＡＰ−２に結合する既知のプローブを用いた正の対照実験は、すべてのタンパク質抽出物が「良好」であり、そして結果の差異がどのようにタンパク質が調製されたか、または結合アッセイに使用した方法に起因しないことを確認した。
最後に観察を実証するために、多数の患者の前立腺（ｎ＝１１）に由来する比較可能な組織抽出物について、同定したプローブの選択的結合を比較した。本明細書に開示するデータにより、スクリーニングおよび選択法が実施に適合することが確認される（表３）。
同様にデータは特異的な二鎖ＤＮＡプローブが前立腺ガンに関連するタンパク質（１つまたは複数）に一定して結合することを示す（グリーソンスコア６〜８）。
同一の方法および取り組みを７塩基対および９塩基対についても行うことができる。差異はそれぞれ３Ｎおよび５Ｎのコア配列から始まるはずである。
Figure 2006518182
核タンパク質抽出物のアリコート（全部で３回の試験ウェルについて、５、１０および２０μｇタンパク質の各タンパク質濃度）をナイロンメンブレンフィルターにドットし、そして（γ−ＡＴＰ）３２Ｐ−標識化プローブ（１分あたり１００，０００カウントで１ナノグラム）とインキュベーションした。値は３回の測定について平均し、そして試験した３種のタンパク質濃度へ結合するＤＮＡの測定から１０μｇタンパク質について標準化した。（γ−ＡＴＰ）３２Ｐ−標識化ＡＰ−２結合プローブ（１００，０００ｃｐｍで１ｎｇ）を用いた対照アッセイは、調製されたタンパク質抽出物の質を検証する対照測定を提供し、そして通常、１００〜５０００ｃｐｍ（＋１）カウントを生じた。数は（０）＜１０００；（＋１）１００〜５０００；（＋２）５００１〜１０，０００；（＋３）１０，００１〜２０，０００；（＋４）２０，００１〜３０，０００；（＋５）３０，００１〜４０，０００；（＋６）４０，００１〜５０，０００ｃｐｍを表す。Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ。
Figure 2006518182
表１の符号については方法を参照にされたい。
Figure 2006518182
Figure 2006518182
表１の符号については方法を参照にされたい。
新規なＤＮＡ結合タンパク質、ＰＣＡＤＭ−１の同定およびそれに特異的に結合するＤＮＡ分子
この実施例に提示する実験は、以下にまとめることができる。
本明細書に開示するデータは、前立腺ガンマーカータンパク質をコードする新規核酸およびこのタンパク質に特異的に結合する新規核酸分子の知見を示す。これらの核酸およびアミノ酸配列は、前立腺ガンを検出するために使用することができる。
本発明は本明細書で「ＰＣＡＤＭ−１」タンパク質と呼ぶガンに関する新規なマーカータンパク質に結合するＤＮＡコンセンサスドメインの核酸およびアミノ酸配列に関する。本発明はさらに非調節細胞成長および増殖およびガンに関する疾患の診断、防止および処置において、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質を特異的に認識するこれら配列およびプローブの使用に関する。
実施例で提示する実験で使用する材料および方法をこれから記載する。
切開したヒト前立腺組織に由来する核抽出物中の新規ＤＮＡ結合タンパク質（すなわち染色体組換えに関与する転写因子）を同定のための新規「モンテカルロ様」型アッセイを開発した。８塩基対長のオリゴヌクレオチドを試験するために、１組の標準的ＤＮＡ配列の各員（表１に表すｎ＝４０９６の組み合わせ）を個別にスクリーニングして、ニトロセルロースフィルターおよび電気泳動的移動度ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）でのオリゴヌクレオチドによるタンパク質結合を評価した。
シンチレーション計数およびホスホイメージングでは、前立腺ガン腺に由来する核タンパク質（１つまたは複数）が、「ＰＣＡＤＭ−１プローブ１」と命名された新規ＤＮＡ配列（ＣＡＣＧＧＡＴＧ［配列番号５］）に結合したことが示された。このＣＡＣＧＧＡＴＧ配列は、Ｔ−細胞およびＢ−細胞の染色体切断に関連する既知の切断点クラスター領域配列（Ｒａｂｂｉｔｔｓ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ，１９９１，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５０：１１９−１４６）に大変似ていた。
さらに本明細書に開示するデータは、「ＰＣＡＤＭ−１プローブ２」と命名した別の二本鎖オリゴヌクレオチド（ＣＡＣＡＡＴＧＡ［配列番号６］）も、ＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合することを示す。このようにＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドには以下を含む：
「ＰＣＡＤＭ−１プローブ１」（配列番号５）：
５’−ＣＡＣＧＧＡＴＧ−３’
３’−ＧＴＧＣＣＴＡＣ−５’
「ＰＣＡＤＭ−１プローブ２」（配列番号６）
５’−ＣＡＣＡＡＴＧＡ−３’
３’−ＧＴＧＴＴＡＣＴ−５’
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための二本鎖ＣＡＣＧＧＡＴＧプローブ
の使用によりファージミドクローンが同定され、これは「ＰＣＡＤＭ−１」タンパク質を発現した。組換えタンパク質はＥＭＳＡで仮定のＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号５）、および他の既知の切断点クラスター領域配列（Ｒａｂｂｉｔｔｓ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ、同上）に結合することが分かった。ＥＭＳＡおよびＥＬＩＳＡは、尿および血清中のＰＣＡＤＭ−１タンパク質の過剰発現が、ヒトの前立腺ガンの診断および予後徴候であることを示した。
ＰＣＡＤＭ−１核酸配列は、Ｓ２−リボソームタンパク質の配列と少なくとも９９％相同的であり、そしてＳ２からＰＣＡＤＭ−１タンパク質を識別する少なくとも３個の特異的塩基対の突然変異を表す。比較するとＳ２は正常細胞中でリボソーム複合体の一部であり、そして細胞中でリボソーム複合体から離れた「自由な物体」としては存在しないか、またはＤＮＡ結合活性を表さない全く異なるタンパク質である。したがって本明細書に開示するテータは驚くべきことには、たとえＳ２およびＰＣＡＤＭ−１がわずか５個のアミノ酸残基が異なっていても、２つのタンパク質は本明細書のいたるところで例示し、そして検討するように大きく異なる特性を示す。より重要なことには、ＰＣＡＤＭ−１は前立腺腫瘍細胞および組織中で過剰発現され、そして正常細胞および組織中には見いだされないことである。リボソームタンパク質をコードするｍＲＮＡの過剰発現とガンとの間の関連を示す幾つかの報告があることに注目すべきであり（Ｃｈｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．５：２１９−２３１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１９８−２１１２０４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５：８２１−８２５；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ，１９９６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：２１７７−２１８６；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２８：１４１−１４７；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２５：９５２−９５６；Ｗｏｏｌ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２１：１６４−１６５；Ｗｏｏｌ，１９９７，Ｉｎ：リボゾームＲＮＡおよびグループＩイントロン（Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ａｎｄ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｉｎｔｒｏｎｓ）、第１５３−１７８頁、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、編集、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ社、オースチン、テキサス州；Ｗｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７３：９３３−９４７；Ｖａａｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８：２７−３２）、リボゾームＲＮＡ数の増加は疾患状態と関連することを示唆している。
例えば正常なＳ２ｍＲＮＡを用いたノーザンブロット実験では、Ｓ２ｍＲＮＡが頭部および頸部ガンで上昇するが、正常な組織ではほとんど検出できないことが明らかにされた（Ｃｈａｉｏ ａｎｄ Ｔａｉｎｓｋｙ，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．５：２１９−２３１）。特定の理論に拘束されことを望まないが、広く考えられているのは、どうも特異的なリボゾームタンパク質の過剰発現がガンにおいて重要な役割を果たしているらしいということである（Ｃｈｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．５：２１９−２３１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１９８−２１１２０４；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ５：８２１−８２５；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ，１９９６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：２１７７−２１８６；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２８：１４１−１４７；Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２５：９５２−９５６；Ｗｏｏｌ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２１：１６４−１６５；Ｗｏｏｌ，１９９７，Ｉｎ：リボゾームＲＮＡおよびグループＩイントロン（Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ａｎｄ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｉｎｔｒｏｎｓ）、第１５３−１７８頁、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、編集、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ社、オースチン、テキサス州；Ｗｏｏｌ，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７３：９３３−９４７；Ｖａａｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７８：２７−３２）。
特定の理論に拘束されることは望まないが、別の１つの可能性は多数のリボゾームタンパク質に特徴的な「ロイシンジッパー」配列モチーフまたは変異体モチーフが突然変異するかもしれず、そして突然変異した「ロイシンジッパー」ドメインは核酸に結合することができるということであり（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｐｏｌ，１９９６，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６：２１７７−２１８６；Ｗｏｏｌ，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２１：１６４−１６５；Ｗｏｏｌ，１９９７，Ｉｎ：リボゾームＲＮＡおよびグループＩイントロン（Ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ａｎｄ Ｇｒｏｕｐ Ｉ ｉｎｔｒｏｎｓ）、第１５３−１７８頁、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ、編集、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｅｓ社、オースチン、テキサス州）、そしてＤＮＡ結合タンパク質、ヌクレアーゼとしてのいずれの機能も、ガン細胞中の遺伝子転写および翻訳の連結を制御し、または調節する。例えばラットのリボゾームタンパク質Ｓ３ａはラットのｖ−ｆｏｓ形質転換エフェクター遺伝子の産物と同一である（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２８：１４１−１４７）。Ｓ３ａはタンパク質合成の開始に関与し、そしてまた成長および細胞サイクルの調節に関与しているタンパク質にも関係する（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２８：１４１−１４７）。同様にラットリボゾームタンパク質Ｌ１０はＤＮＡ結合タンパク質および推定されるウィルムス腫のサプレッサー遺伝子と相同的である（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２５：９５２−９５６）。まとめると、これらの実験は変異体「リボゾーム−様」タンパク質がガンの予後判定または診断となり、そして染色体ＤＮＡ活性、遺伝子発現およびガン細胞の挙動を調節する重要な役割を果たすことを示唆している。
本発明で記載するタンパク質、ヌクレオチド配列および方法は記載する特定の方法論、プロトコール、細胞株、ベクター、試薬および応用に限定されないと理解すべきである。これらは変動してよい。同様に本明細書で使用する用語は、厳密に特定の態様を記載する目的のためだけであり、本発明または応用の範囲を限定することを意図していない。本発明の範囲は添付する特許請求の範囲により限定されるだけである。
前立腺ガンのようなガンの初期検出用のマーカーの開発は、ガンの改善された処置に必須である。前立腺ガンに関しては一般に、血清の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルは前立腺ガンを持つ患者の同定に感受性でも特異的でもないと考えられている（Ｇａｒｎｉｃｋ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａｉｒ Ｗ．Ｒ．、前立腺ガン（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ）、サイエンティフック アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ）、１９９８年１２月、７５−８３）。前立腺ガンである男性のわずか約２５％で、約４ｎｇ／ｍｌより高く１０ｎｇ／ｍｌまでの範囲の血清ＰＳＡレベルが検出されると予想された（すなわち偽陰性）。同様に良性の前立腺過形成がある男性の３０％もで、ＰＳＡレベルが上昇した（すなわち偽陽性）。加えてデジタル直腸検査での診断を確認する試みではわずか２５％の患者で成功しただけであり、そして生検は患者の１０〜１５％で成功しているだけである。このように前立腺ガンを含め、ガンについてより感受性で、しかもより特異性のアッセイの開発が明らかに必要である。集団検診または日常的な臨床検査を通して実施可能となる非侵襲的および廉価な尿に基づくスクリーニングアッセイは特に有用である。
本発明はヒトの組織に由来する核酸抽出物中の新規ＤＮＡ結合タンパク質を同定するためのスクリーニングアッセイに使用できる核酸配列に関する。１つの態様では、スクリーニングアッセイは前立腺組織（すなわち腺）の核タンパク質抽出物中で過剰発現した新規な転写因子を同定するために有用である。このアッセイについて、８塩基対の二本鎖ＤＮＡプローブ（ｎ＝４０９６）を設計した。次いでこのＤＮＡは、同じ患者に由来する適合した検体において、ガン、良性、高度な前立腺上皮内新形成、および精嚢組織に由来する適合タンパク質抽出物中で、タンパク質−ＤＮＡ結合親和性における差異をスクリーニングするために使用した。タンパク質の結合はニトロセルロースフィルターおよび電気泳動的移動度ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）で観察されるＤＮＡ−タンパク質結合量の測定を介して決定した。
シンチレーション計数およびホスホイメージングでは、進行したヒト前立腺ガン組織の核抽出物から単離したタンパク質が、ＣＡＣＧＧＡＴＧを含んでなる核酸配列に特異的に結合することが明らかとなった。調査した他の組織に由来するタンパク質抽出物は、この核酸配列に結合できなかった。この配列はＴ細胞およびＢ細胞中の染色体切断と関連する既知のＢＰＣＲ配列に類似するが１塩基対異なる（Ｒａｂｂｉｔｔｓ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ，１９９１，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５０：１１９−１４６）。
同定された特異的ＤＮＡ配列（ＣＡＣＧＧＡＴＧ）は、ＰＣ−３ＭＬ前立腺細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １０：２１９−２３３，１９９８）。このスクリーニングはＰＣＡＤＭ−１タンパク質を発現するファージミドクローンの同定をもたらした。ＰＣＡＤＭ−１遺伝子のサブクローニングは、この遺伝子が染色体タンパク質Ｓ２およびＬＬＲｅｐ３に約９９％の相同性を表すことを示した。このＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号１）を、推定されるこのポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）と一緒に図１に表す。組換えＰＣＡＤＭ−１タンパク質はＥＭＳＡで推定上のＢＰＣＲ領域および既知のＢＰＣＲに結合することが示された。
本明細書に開示するデータは、ＥＭＳＡまたはナイロンフィルターに基づく結合アッセイを利用した「ＤＮＡ−タンパク質」結合アッセイが、生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１の同定に開発されたことを示す。ＥＭＳＡを使用して、ＰＣＡＤＭ−１はヒト患者に由来する組織抽出物、および尿および血清中で検出された。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体（すなわちＩｇＧ抗体）は、精製された組換えタンパク質、この場合は抗原としてＰＣＡＤＭ−１を利用して抗体を生成する当業者に知られている標準法を使用して、それぞれウサギおよびマウスで生成された。
抗体は、当業者に知られている標準的な方法に従い、ウエスタンドットブロット分析、ＥＩＡおよび免疫染色技術を使用して、３３ｋＤａのＰＣＡＤＭ−１抗原に特異的であると特性決定された。本明細書に開示する結果は、ＰＣＡＤＭ−１抗体が組換えプラスミドタンパク質抽出物、前立腺腫瘍細胞タンパク質抽出物および細胞、および前立腺ガン患者から得た尿および血清サンプル中のＰＣＡＤＭ−１を特異的に認識することを証明する。
さらにＰＣＡＤＭ−１特異的抗体を用いた酵素免疫−アッセイまたはＥＩＡは、タンパク質が前立腺ガンの高度に感受性のある組織マーカーであることを示した。表４に示すように、ＰＣＡＤＭ−１は前立腺組織抽出物において、ＰＳＡに比べて前立腺ガンの有意により良い予後判定および診断マーカーである。これらの実験では、前立腺のミクロ切開領域（調査したｎ＝４０の根治的前立腺切除）に由来する核タンパク質抽出物が、適合する精嚢（ＳＶ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）または高度な前立腺上皮内新形成（ＨＧＰＩＮ）の細胞増殖巣で検出される大変低いレベルに比べて、有意に上昇したレベルのＰＣＡＤＭ−１を発現した。
さらに本明細書に開示するデータは、ＰＣＡＤＭ−１の量（μｇ／ｍｇＤＮＡ）がＧｌｅａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４９：１５６８−１５７６に記載されているようにグリーソンスコア（ＧＳ）の関数として増加することを示す。
比較するとＰＳＡレベル（μｇ／ｍｇＤＮＡ）はＢＰＨ、ＨＧＰＩＮおよびＧＳ検体で上昇したが、ＧＳ６、ＧＳ７およびＧＳ８〜１０巣に由来する組織抽出物では有意に減少した。表４に開示するように、組織抽出物中のＰＳＡレベルは、前立腺切除前に検出された血清ＰＳＡレベル（μｇ／ｍｇＤＮＡ）に逆比例した。血清ＰＳＡレベルはグリーソンスコア（表４）の関数として増加した。
Figure 2006518182
根治的前立腺切除（全部でｎ＝４０）の後、種々の腺の細胞増殖巣および組織を前立腺の矢状切片から切開したことに注目されたい。すべてのＢＰＨおよびＨＧＰＩＮ検体はガンを表す同じ前立腺に由来した。サンプルは少なくとも３回アッセイし、そしてデータは実験したコホートのすべての患者について平均化した。＊（検出されるＰＳＡの範囲）。＃ＰＣＡＤＭ−１およびＰＳＡレベル（μｇ／ｍｇＤＮＡ）。ＮＡ−適用できず。すべての血清ＰＳＡ測定は、泌尿器の技術者により、そして根治的前立腺切除前に患者の検査で行われた日常的な診断試験に由来した。
診断試験を行って、患者の尿のＰＣＡＤＭ−１レベルを血清のＰＳＡレベルと比較した。これらの試験からの結果を表５に開示する。
Figure 2006518182
検出限界カットオフは：＊ＰＣＡＤＭ−１陽性（＞０．２ｎｇ／ｍｌ）；＊ＰＣＡＤＭ−１陰性（＜０．２ｎｇ／ｍｌ）。ＰＣＡＤＭ−１レベルは、ＰＣＡＤＭ−１陽性患者で０．２〜９３ｎｇ／ｍｌの範囲であり；そしてＰＣＡＤＭ−１陰性患者で０〜０．２ｎｇ／ｍｌの範囲であった。
ヒトの尿に関するＥＩＡ実験は、新たに集めた尿または当業者により周知な方法に従い凍結保存した尿について行った。簡単に説明すると、尿サンプル（１００〜２００μｌ）を９６ウェルタイタープレートに乗せ、数時間、結合させ、プレートをバッファーで洗浄し、１次および２次抗体を乗せ、そして抗体検出試薬を加え、そしてプレートをマイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダーで読んだ（Ａ４５０ｎｍに設定）（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）、ヘラクレス、カリフォルニア州）。
表５に示すように、尿のＰＣＡＤＭ−１アッセイの感度は７３％（すなわちｎ＝２３／３３）であり、そして上昇した血清ＰＳＡレベルを有する患者および生検陽性検体（ＧＳ４−８）に相関した。興味深いことに。アッセイの３〜４年前に前立腺を切除した２名の患者において（すなわちＧＳ８−１０、Ｔ３段階のガン）、尿のＰＣＡＤＭ−１レベルが上昇し、そしてこれらの患者は血清レベルも高かった（すなわち約５ｎｇ／ｍｌより高い）。これらの患者は現在、ガンが再発したのかどうかを決定するための観察下にある。逆にこれら患者の中の１２名が尿のＰＣＡＤＭ−１について陰性であり（すなわちＧＳ５−６、Ｔ２段階のガン）、そして彼らは大変低い血清ＰＳＡ値（＜１ｎｇ／ｍｌ）を有した。
ＢＰＨと診断された（そしてガンの兆候はない）患者では、約１６％（ｎ＝１５／９６）が上昇したＰＣＡＤＭ−１尿を表した。数名（ｎ＝３／９６）は上昇した血清ＰＳＡレベルを有した。この患者のコホートでは、ＢＰＨ患者の８４％（ｎ＝８１／９６）がＰＣＡＤＭ−１について陰性であった。またこれらの検体では、ｎ＝４０／９６（約４２％）が低い血清ＰＳＡレベル（すなわち約２ｎｇ／ｍｌ未満）であった。４０名の有志の男性の中で全員がＰＣＡＤＭ−１については陰性であり、そして低い血清ＰＳＡレベルを有した。恐らく彼らはＰＳＡについても陰性であったろう。興味深いことに、直腸ガンの１名の患者はＰＣＡＤＭ−１について陽性であり、そして感染または炎症がある５名の患者（ｎ＝５／９）がＰＣＡＤＭ−１について陽性であり、感染または炎症から偽陽性が生じることを示唆している。
すなわちこれらのデータは、ＰＣＡＤＭ−１尿アッセイの感度が前立腺ガンについては約７３％であることを示す。全体的な特異性（すなわち陰性の総数を疾患が無い患者の総数で割った）は１６７／１９４すなわち約８６％であった。したがって本明細書に開示するデータは、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質がガン、そして特に前立腺ガンの独立した診断的マーカーとなり得ることを証明する。
本発明はスクリーニングアッセイおよびＰＣＡＤＭ−１を検出することができる同定された８塩基対核酸配列にも関する。１つの態様では、核酸は配列番号５の核酸配列、および配列番号６の配列を含んでなるプローブである。さらに配列番号７および配列番号８の配列を有する二本鎖オリゴヌクレオチドもＰＣＡＤＭ−１に特異的に結合し、そしてＰＣＡＤＭ−１のレベルを検出し、そして評価するために使用することができる。
本発明の１つの態様では、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードする核酸配列（配列番号１）、およびこれらの核酸配列にコードされるＰＣＡＤＭ−１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）が提供される。ＰＣＡＤＭ−１タンパク質をコードする例示的核酸配列（配列番号１）および例示的な推定アミノ酸配列（配列番号２）は、それぞれ図１Ａおよび１Ｂに表す。
本発明は発現ベクターおよび核酸配列を含んでなる発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。発現ベクターおよび発現ベクターでトランスフェクションされ得る宿主細胞は、当該技術分野では周知である。本発明のもののような選択した核酸配列をベクターに包含させ、そして最終的に宿主細胞に包含される方法も周知である。
本発明の核酸およびアミノ酸配列は、生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１タンパク質を検出するスクリーニングアッセイを開発するために有用である。本明細書で証明するように、１つの態様ではＰＣＡＤＭ−１タンパク質に対して抗体を生成し、そしてＥＩＡまたはＥＬＩＳＡのような免疫アッセイで使用して、組織、痰、尿または血清のような生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１タンパク質を検出することができる。抗体はこのタンパク質に対して、周知な手順に従い生成することができる。あるいは標識した核酸プローブを本発明の核酸配列から調製し、そしてＥＭＳＡで使用して組織生検サンプルの核抽出物中のＰＣＡＤＭ−１を検出することができる。
本発明の別の観点は、生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１を検出するための方法およびキットに関する。本明細書で証明するように、患者の生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１レベルの検出は、患者の診断および前立腺ガンまたは他のガンの予後の判定に有用である。本発明の方法では、生物学的サンプルを患者から得、そして生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１を検出する手段と接触させる。１つの態様ではこれはキットが組織、痰、尿および血清のような生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１タンパク質を検出することができる、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質に対して生成された抗体を含んでなることを意味する。別の態様ではこれはキットが組織生検材料のような生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１タンパク質を検出することができるＣＡＣＧＧＡＴＧのような標識された核酸プローブを含んでなることができることを意味する。
したがって本発明のキットには、サンプル中のＰＣＡＤＭ−１タンパク質を検出するための手段およびＰＣＡＤＭ−１タンパク質標準が提供される。ＰＣＡＤＭ−１タンパク質を検出するための手段は、ＰＣＡＤＭ−１タンパク質に対して生成された抗体またはタンパク質に結合することができる標識された核酸プローブを含んでなることができる。生物学的サンプル中のＰＣＡＤＭ−１の存在は、患者が前立腺ガンを有することの指標である。本発明の方法およびキットは前立腺ガンを有する患者に使用して、経時的に患者中のＰＣＡＤＭ−１レべルの変化を監視することにより、彼らの予後を評価し、そして処置を評価するためにも使用できる。ＰＣＡＤＭ−１レベルの経時的な上昇はガンの進行の指標であり、一方、ＰＣＡＤＭ−１レベルの経時的な減少はガンの退縮の指標である。
さらにＰＣＡＤＭ−１タンパク質レベルを検出するためのこれらの方法およびキットは、他の種類のガン、炎症状態、感染および遺伝的突然変異を診断および予後判定するためにも有用であり得る。
酵素的核酸を使用したＰＣＡＤＭ−１発現の調節およびＰＣＡＤＭ−１発現に関する疾患、障害または状態の処置
この実施例で提示する実験は、以下のようにまとめることができる。
前立腺ガン抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）は３３ｋＤａの細胞質タンパク質であり、これは本明細書のいたるところですでにより完全に開示したように、ヒトの前立腺ガン組織で過剰に発現され、そして前立腺ガンに罹患した患者の尿で検出される。特定の理論に拘束されることを望まないが、ＰＣＡＤＭ−１発現は腫瘍細胞に対して有利な選択的成長および／または生存を伝達し、かつ／または前立腺ガンまたは他のガンの発生を導く染色体の改変（１つまたは複数）を引き起こすことができる。すなわち本明細書のいたるところに開示するデータは、疾患または状態が無いことが分かっている組織中での発現レベルに比べて、ＰＣＡＤＭ−１発現の上昇は、疾患または状態、例えば前立腺ガンに相関し、関連し、かつ／または媒介することを示唆する。したがってＰＣＡＤＭ−１の異常な（すなわち上昇した）発現を潜在的に阻害または下げることができるＰＣＡＤＭ−１発現の調節に基づく治療法が、潜在的な抗−ガン治療として調査された。本明細書に開示するデータは、ＰＣＡＤＭ−１発現を阻害するためのＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号１）と命名されたＰＣＡＤＭ−１に特異的なＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭの使用およびそれに関連する有意な治療効果を証明する。
使用する材料および方法およびこの実施例で提示する実験結果をこれから記載する。
ヒトＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡ中のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ開裂部位の選択
有用なＤＮＡ酵素の標的は、Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９３／２３５６９号パンフレット；Ｓｕｌｌｉｖａｎｔ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９３／２３０５７号パンフレット；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９４／０２５９５号パンフレット；Ｄｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９５／０４７５８号パンフレット；ＭｘＳｗｉｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５２５，４６８号明細書に記載されているように決定することができ、そしてそれらのすべてを引用により本明細書に編入する。ここでこれらの文書に提供されている手引きを繰り返すよりは、当該技術分野における方法あるいは将来開発される方法に限定されないそのような方法の具体例を以下に提供する。
そのような標準的ｍＲＮＡに対するＤＮＡＺＹＭはそのような応用に記載されているように設計し、そして合成して、標準的な論文において記載されているようにインビトロおよびインビボで試験した。ＤＮＡＺＹＭもそれらに記載されているように至適化され、そして送達され得る。
コンピューターに基づくＲＮＡフォールディングアルゴリズムにより予想される部位がＰＣＡＤＭ−１ｍＲＮＡ中の接近可能な部位に対応するのかどうかを試験するために、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ標的部位をヒトＰＣＡＤＭ−１のｃＤＮＡを分析することにより選択し、そしてＰＣＡＤＭ−１遺伝子の転写開始部位上の開裂部位の優先順位を決定した。
各標的に結合するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを設計し、そしてコンピューターフォールディングにより個別に分析して（Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．Ｔｈｅｏｃｈｅｍ．３１１：２７３；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：７７０６；Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＲＮＡ ２：４１９−４２８）、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ配列が適切な２次構造にフォールディングされるかどうかを評価した。結合アームと触媒中心との間に望ましくない分子内相互作用があるＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭは、考察から排除した。以下に注記するように、活性を至適化するために変動する結合アーム長を選択することができる。一般に触媒中心を挟む各アーム上の少なくとも８〜１０塩基が結合には十分であるか、または標的ｍＲＮＡとの相互作用に十分である。
ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１活性の至適化
ＰＣ−３ＭＬの増殖および生存は、化学的に安定化されたＤＮＡＺＹＭの直接的添加により阻害される。おそらく、そして特定の理論に拘束されることは望まないが、ＤＮＡＺＹＭの取り込みは細胞膜をわたるアニオン性核酸の受動的拡散により媒介された。この場合、効率はリガンドのＤＮＡＺＹＭへの直接的カップリングにより大いに強化される。ＤＮＡＺＹＭはレセプターが媒介する取り込みにより細胞に送達されると考えることができる。そのような結合付加物を使用して、細胞性の取り込みはＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ開裂活性に必要なリン酸ジエステル結合を改変させることなく、数次元の規模まで上昇することができる。
あるいはＤＮＡＺＹＭは当該技術分野で知られている様々な既知の方法を使用して細胞に投与することができ、それらの方法には限定するわけではないがＤＮＡＺＹＭ送達と共役したアンテナ様（ａｎｔｅｎｎａｐａｅ）ペプチド、リポソーム中へのカプセル化、イオノフォレシスにより、または他の小胞への包含により、ならびにヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生物接着性微小球を含む。ＤＮＡ／小胞の組み合わせは、直接的注射により、または針、カテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により局所的に送達される。送達の別の経路には限定するわけではないが、筋肉内注射、エーロゾル吸入、経口（錠剤またはピル形態）、局所、全身的、眼内、腹腔内および／または硬膜下腔内の送達を含む。ＤＮＡＺＹＭ送達および投与のより詳細な記載は、Ｓｕｌｌｉｖａｎｔ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９３／２３０５７号パンフレットおよびＤｒａｐｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９５／０４８１８号パンフレットに提供され、これは引用により本明細書に編入する。
化学的修飾
本明細書に記載するＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ配列およびＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１モチーフは非限定的例を意味し、そして当業者はＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭのヌクレアーゼ安定性を強化するために他の修飾（塩基、糖およびホスフェート修飾）を標準的技術を使用して容易に作成することができ、したがって本発明の範囲内にある。
ＰＣＡＤＭ−１を標的とするＤＮＡＺＹＭの使用
本明細書に開示するデータは、ＰＣＡＤＭ−１の上昇した発現が前立腺ガンに関連していることを証明する。さらに本明細書に開示するデータは、ＰＣＡＤＭ−１発現の阻害が（例えばＤＮＡＺＹＭを使用して）、前立腺腫瘍細胞株の細胞増殖数をインビトロおよびインビボの両方で下げることを示す。さらに本明細書に開示するデータは、限定するわけではないがＤＮＡＺＹＭを使用したＰＣＡＤＭ−１発現の阻害が細胞死を誘導しながら前立腺腫瘍細胞株の増殖能力（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を下げることを示す（すなわち４８〜７２時間までに約８０％より高いＰＣ−３ＭＬ細胞死）（図４）。
触媒活性および上昇した部位特異性を持つＤＮＡＺＹＭは、ガンの処置に有力かつ安全な治療用分子を表す。本発明では、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号９）は平滑筋、繊維芽または正常な前立腺上皮細胞の生存または増殖を阻害しなかった。しかしＶＥＧＦ−１およびＭＭＰ−２と組み合わせたＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１は、ＳＣＩＤマウスにおいて局所的に投与されたＤＮＡＺＹＭが、９０％の応答率でヒトの前立腺ＰＣ−３ＭＬ細胞腫瘍の成長をインビボで阻害し、かつ／または根絶した（２〜３カ月間にわたり処置したｎ＝４５／５０マウス腫瘍）。
マウスが未処置であるか、またはランダムなオリゴヌクレオチドで処置された対照実験では、７５％を越えるマウスが同じ時間枠で大きな腫瘍を成長させた。ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１が１回の薬剤として尾の静脈を介してｉ．ｖ．投与された実験では、９２％の応答率で（ｎ＝１２／１３）、ｉ．ｖ．注射したＰＣ−３ＭＬ細胞のＰＣ−３ＭＬ腫瘍成長を阻害した。未処置マウス（ｎ＝９／９）およびランダムオリゴヌクレオチドを投与した対照マウスは（ｎ＝５／５）、すべて２カ月の間隔にわたり多数の転移性小節を発生した。これらすべての実験において、マウスの生存率は処置したマウスについて２〜３カ月の処置間隔にわたり０％から約８０％〜９２％に上昇した。
これらのデータは、ＰＣＡＤＭ−１ＤＮＡＺＹＭ−１が患者のガン細胞に類似様式で送達でき、そしてそれらの増殖および生存および転移を抑制できることを示す。このようにこれらのデータはＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１が既存のガン治療および身体的処置（例えば寒冷麻酔および照射処置）と一緒に使用され、あるいはそれ自体により全体的な患者の生存率を改善できることを示す。
ここでも本明細書に開示するデータは、他のタンパク質、例えばＶＥＧＦ−１およびＭＭＰ−２をコードするＲＮＡを特異的に開裂するＤＮＡＺＹＭを投与することが、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭを局所的送達で投与する治療効果をさらに上げることを証明している。すなわち本発明は、ＤＮＡＺＹＭが増殖因子等のようなタンパク質をコードするＲＮＡを開裂する他のＤＮＡ酵素と同時投与される方法を包含する。
診断的用途
本発明のＤＮＡＺＹＭは罹患した細胞内の遺伝的ドリフトまたは突然変異を調査するための、あるいは細胞、組織または体液中にＰＣＡＤＭ−１ ＲＮＡの存在を検出するための診断的道具を提供する。ＤＮＡＺＹＭ活性と標的ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対および３次元構造を改変する分子の任意の領域の突然変異の検出を可能とする。ＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡを標的とする多数のＤＮＡＺＹＭを使用することによりＲＮＡ構造およびインビトロ、ならびに細胞および組織中での機能に重要なヌクレオチドの変化をマップすることができる。標的ＲＮＡをＤＮＡＺＹＭで開裂することは、遺伝子発現を阻害し、そして疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割を定めるために使用することができる。このように他の遺伝子標的を疾患の重要なメディエーターとして定めることができる。これらの実験は潜在的な組み合わせ治療（例えば種々の遺伝子を標的とする多くのＤＮＡ酵素、既知の低分子インヒビターと共役するＤＮＡ酵素、またはＤＮＡ酵素および／または他の化学的もしくは生物学的分子との組み合わせによる断続的処置）を提供することにより、疾患の進行のより良い処置を導くことができる。
本発明のＤＮＡ酵素の他のインビトロ用途は当該技術分野では周知であり、そしてＰＣＡＤＭ−１関連状態に関係するｍＲＮＡの存在の検出を含む。そのようなＲＮＡは標準的方法を使用してＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭで処置した後の開裂産物の存在を決定することにより検出される。
ＰＣＡＤＭ−１ｍＲＮＡ発現の細胞生存の効果
培養の１〜３日後の細胞生存曲線は、増加する濃度（０．５〜５μｇ／ｍｌ）（図４）のＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号９）で一晩の一過性トランスフェクションが、ＰＣ−３ＭＬ細胞の成長を阻害したことを示した（図４）。ランダムオリゴヌクレオチドを用いた対照実験は、ＰＣ−３ＭＬ細胞の成長に検出可能な影響を与えることができなかった（図４）。対照の非特異的ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ（すなわちＤＮＡＺＹＭ−１１）で処理したＮＰＴＸ−１５３２細胞を使用した類似実験は、細胞成長または細胞生存を阻害することができなかった。これらのデータは、ＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭが前立腺ガン細胞の成長および生存の阻害のための有力な治療薬であることを証明し、そしてＰＣＡＤＭ−１発現が中でも前立腺ガン、ならびに／またはガン細胞の増殖および／または成長に関連および／または媒介することを明らかに証明している。
ＰＣＡＤＭ−１関連タンパク質用抗体の診断的用途
本明細書に開示するデータは、本発明のＰＣＡＤＭタンパク質がリボゾームＳ２タンパク質と高度な相同性、すなわち約９８％のアミノ酸配列相同性を共有することを示す。したがって抗−Ｓ２抗体は本発明による抗体に基づくアッセイにおいて、前立腺ガンの診断薬として使用することができる。本明細書に記載するＳ２タンパク質に対する抗体は、当業者に周知な方法に従い生成され得る。
本発明のさらなる態様において、抗−Ｓ２抗体は前立腺ガンの抗体に基づく尿アッセイに使用することができ、ここで抗−Ｓ２抗体は本明細書のいたるところでさらに詳細に記載するようにＰＣＡＤＭ−１を検出するために使用される。
本明細書に引用した各々の、そしていずれの特許、特許出願および刊行物の開示も参照により全部、本明細書に編入する。
本発明を具体的態様に関して開示してきたが、当業者には本発明の他の態様および変更も本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく考案することができることは明白である。添付する特許請求の範囲はすべてのそのような態様および均等な変更も含むと解釈されることを意図している。
前述の要約ならびに以下の発明の詳細な記述は、添付の図面と併せて読むとより良く理解される。本発明を説明する目的のために、これらは現在好ましい図面態様（１つもしくは複数）として示される。しかしながら、本発明は示される厳密な配置および手段に限定されないと理解されるべきである。
前立腺癌抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）の核酸配列（配列番号：１）を示す。ＡＴＧ翻訳開始部位に対するヌクレオチド位置１９０、１９１、４６５、４７５、４８８および５０５での塩基置換は、ヒトＳ２リボソーム遺伝子をコードする核酸の核酸配列に対する置換を表し、そしてボールド体および下線で示される。 ＰＣＡＤＭ−１のアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ヒトＳ２リボソームタンパク質のアミノ酸配列に対するＰＣＡＤＭ−１配列におけるアミノ酸置換を表す、位置６４（Ｔ）、１５５（Ｎ）、１５９（Ａ）、１６３（Ｒ）および１６９（Ｒ）の５個のアミノ酸残基は、ボールド体および下線で示される。 酵素分子のＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡとマッチする相補的（すなわち、結合）アームおよび１５ｂｐの触媒ドメインを示すＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１（配列番号：９）を示す図である。 酵素分子のＰＣＡＤＭ−１ ｍＲＮＡとマッチする相補的アームおよび１５ｂｐの触媒ドメインを示すＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−２（配列番号：１０）の図である。 ＰＣ−３ ＭＬ細胞の１〜３日後の細胞生存曲線を示すグラフである。Ｙ軸（左端）上の説明文は、それぞれ、未処理の細胞、ランダムオリゴヌクレオチド（５μｇ／ｍｌ）で、もしくは０．５、１．０、２．０、３．０、４．０および５．０μｇ／ｍｌのＰＣＡＤＭ−１ ＤＮＡＺＹＭ−１で処理した細胞の細胞増殖への影響を示す曲線（上から下に）に対応する。
【配列表】
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Claims (157)

  1. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１（ＰＣＡＤＭ−１）もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸。
  2. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ならびにそのホモログ、バリアント、突然変異体およびフラグメントをコードする単離された核酸。
  3. 該核酸が、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）をコードする核酸と９９％より大きい配列同一性を共有する請求項１の単離された核酸。
  4. 該単離された核酸が、配列番号：１に対してヌクレオチド番号１９０でアデニン、ヌクレオチド番号１９１でシトシン、ヌクレオチド番号４６５でシトシン、ヌクレオチド番号４７５でグアニン、ヌクレオチド番号４８８でグアニン、そしてヌクレオチド番号５０５でシトシンを含んでなる請求項３の単離された核酸。
  5. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸（ここで、該核酸の配列は配列番号：１の配列からなる）。
  6. 該核酸が、それに共有結合しているタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる請求項１の単離された核酸。
  7. 該タグポリペプチドが、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、フラグタグポリペプチド、およびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドよりなる群から選択される請求項６の単離された核酸。
  8. 該核酸が、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項１の単離された核酸。
  9. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなるベクター。
  10. 該ベクターが、哺乳類癌診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸に操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項９のベクター。
  11. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該単離された核酸が、細胞に導入した場合に発現される請求項１０のベクター。
  12. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなる組み換え細胞。
  13. 請求項９のベクターを含んでなる組み換え細胞。
  14. 請求項１０のベクターを含んでなる組み換え細胞。
  15. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）。
  16. 該単離された核酸が、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する請求項１５の単離された核酸。
  17. 該単離された核酸が、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項１５の単離された核酸。
  18. 該単離された核酸が、細胞に導入した場合に発現される請求項１７の単離された核酸。
  19. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクター（該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、ここで、哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する）。
  20. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなるベクター（該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、該単離された核酸は、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなり、さらにここで、該単離された核酸は、細胞に導入した場合に発現される）。
  21. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなる組み換え細胞（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）。
  22. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸を含んでなる組み換え細胞（該相補的な核酸はアンチセンスの向きであり、ここで、該単離された核酸は、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する）。
  23. 請求項１９のベクターを含んでなる組み換え細胞。
  24. 請求項２０のベクターを含んでなる組み換え細胞。
  25. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸（ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有する）。
  26. 該前立腺癌抗原診断マーカー１の該アミノ酸配列が、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン（Ｔ）、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン（Ｎ）、残基番号１５９でアラニン（Ａ）、残基番号１６３でアルギニン（Ｒ）、そして残基番号１６９でアルギニン（Ｒ）を含んでなる請求項２５の単離された核酸。
  27. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする単離された核酸（ここで、該前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２の配列からなる）。
  28. 該核酸が、それに共有結合しているタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含んでなる請求項２７の核酸。
  29. 該タグポリペプチドが、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、フラグタグポリペプチドおよびマルトース結合タンパク質タグポリペプチドよりなる群から選択される請求項２８の核酸。
  30. 該核酸が、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列をコードする核酸をさらに含んでなる請求項２９の核酸。
  31. 請求項２６の核酸を含んでなるベクター。
  32. 該ベクターが、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項３１のベクター。
  33. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該単離された核酸が、細胞に導入した場合に発現される請求項３２のベクター。
  34. 請求項２５の単離された核酸を含んでなる組み換え細胞。
  35. 請求項２６の単離された核酸を含んでなる組み換え細胞。
  36. 請求項３０のベクターを含んでなる組み換え細胞。
  37. 請求項３１のベクターを含んでなる組み換え細胞。
  38. 該ベクターが、該細胞に導入した場合に発現される請求項３６の組み換え細胞。
  39. 請求項２５の核酸に相補的な単離された核酸（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）。
  40. 該相補的な核酸が、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項３９の単離された核酸。
  41. 請求項３９の単離された核酸を含んでなるベクター。
  42. 該単離された核酸が、細胞に導入した場合に発現される請求項４０の単離された核酸を含んでなるベクター。
  43. 該核酸が、ヒト前立腺癌抗原診断マーカー１（配列番号：１）の配列を有する核酸と相補的な核酸と９９％より大きい同一性を共有する請求項３９の単離された核酸。
  44. 該単離された核酸が、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項４３の単離された核酸。
  45. 請求項４３の単離された核酸を含んでなるベクター。
  46. 請求項４４の単離された核酸を含んでなるベクター。
  47. 該単離された核酸が、細胞に導入した場合に発現される請求項４６のベクター。
  48. 請求項４３の単離された核酸を含んでなる組み換え細胞。
  49. 請求項４４の単離された核酸を含んでなる組み換え細胞。
  50. 該単離された核酸が、該細胞において発現される請求項４９の組み換え細胞。
  51. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１を含んでなる単離されたポリペプチド。
  52. 該哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１が、配列番号：２のアミノ酸と少なくとも９９％の配列同一性を共有する請求項５１の単離されたポリペプチド。
  53. 該ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基番号６４でトレオニン、アミノ酸残基番号１５５でアスパラギン、残基番号１５９でアラニン、残基番号１６３でアルギニン、そして残基番号１６９でアルギニンを含んでなる請求項５２の単離されたポリペプチド。
  54. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１を含んでなる単離されたポリペプチド（ここで、該単離されたポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２からなる）。
  55. 前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドと特異的に結合する単離された核酸。
  56. 該核酸が二本鎖ＤＮＡである請求項５５の単離された核酸。
  57. 該単離された核酸が、核酸配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる請求項５６の単離された核酸。
  58. 哺乳類白血病細胞切断点クラスター領域結合タンパク質と特異的に結合する単離された核酸。
  59. 該白血病切断点クラスター領域結合タンパク質が、Ｒａｇ１タンパク質およびＲａｇ２タンパク質よりなる群から選択される請求項５８の核酸。
  60. 該単離された核酸が二本鎖ＤＮＡを含んでなり、該ＤＮＡが核酸配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）および核酸配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）よりなる群から選択される核酸配列を含んでなる請求項５９の単離された核酸。
  61. 原核生物の切断点クラスター領域結合タンパク質と特異的に結合する単離された核酸。
  62. 該原核生物の切断点クラスター領域結合タンパク質が、ＲｅｃＡタンパク質およびＲｅｃＢタンパク質よりなる群から選択される請求項６１の核酸。
  63. 該ポリペプチドが、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）からなる核酸、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）からなる核酸、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）からなる核酸および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）からなる核酸よりなる群から選択される核酸の少なくとも一つと特異的に結合する請求項５２のポリペプチド。
  64. 単離された酵素核酸（ここで、該核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する）。
  65. 該単離された酵素核酸の核酸配列が、配列番号：９の配列（ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ）および配列番号：１０の配列（ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ）よりなる群から選択される請求項６４の単離された酵素核酸。
  66. 単離された酵素核酸（ここで、該核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断し、そしてさらにここで、該単離された酵素核酸の配列は、配列番号：９の配列および配列番号：１０の配列よりなる群から選択される）。
  67. 単離された酵素核酸（ここで、該核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断し、そしてさらにここで、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該核酸は、配列番号：１の配列もしくはその一部を有する核酸を含んでなる）。
  68. 該酵素核酸が少なくとも一つの結合アームを含んでなり、そしてさらに該結合アームが配列番号：１もしくはその一部に相補的な配列を含んでなる請求項６４の単離された酵素核酸。
  69. 該核酸が、それに操作可能に連結されたプロモーター／調節配列を特定する核酸をさらに含んでなる請求項６４の単離された酵素核酸。
  70. 該核酸が「１０〜２３」モチーフ構造を含んでなる触媒ドメインを含んでなる請求項６４の単離された酵素核酸。
  71. 該酵素核酸が触媒コアドメインを含んでなり、そして該ドメインの側面に位置する少なくとも一つの結合アームをさらに含んでなる（ここで、該結合アームは約６〜１０個のヌクレオチドを含んでなる）請求項６４の単離された酵素核酸。
  72. 該側面に位置するヌクレオチドが、配列番号：１もしくはその一部に相補的な配列を含んでなる請求項７１の単離された酵素核酸。
  73. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸（ここで、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該核酸によりコードされる前立腺癌抗原診断マーカー１のアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列と９９％より大きい配列同一性を共有する）。
  74. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸（ここで、該酵素核酸は、配列ＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＴＴＧＡ（配列番号：９）および配列ＧＴＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣ（配列番号：１０）を含んでなる）。
  75. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸（ここで、該酵素核酸の核酸配列は、配列番号：９の配列および配列番号：１０の配列よりなる群から選択される）。
  76. 該酵素核酸が結合アームを含んでなる（ここで、該結合アームは、配列番号：１もしくはその一部に相補的な配列を含んでなる）請求項７２の酵素核酸。
  77. 該結合アームが約６〜１０個のヌクレオチドを含んでなる請求項７６の酵素核酸。
  78. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドもしくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体。
  79. 該抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および合成抗体よりなる群から選択される請求項７８の抗体。
  80. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドもしくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
  81. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
  82. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１を含んでなる単離されたポリペプチドおよび製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
  83. 前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドと特異的に結合する単離された核酸および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
  84. 単離された酵素核酸（ここで、該単離された酵素核酸は、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する）および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
  85. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドもしくはそのフラグメントと特異的に結合する抗体および製薬学的に許容しうる担体を含んでなる組成物。
  86. 哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸を含んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳類。
  87. 前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患にかかっているヒトに哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１もしくはそのフラグメントをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸、および哺乳類前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体よりなる群から選択される少なくとも一つの物質の発現阻害量を投与することを含んでなる、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患を処置する方法。
  88. 該疾患が前立腺癌である請求項８７の方法。
  89. 該哺乳類がヒトおよびイヌよりなる群から選択される請求項８８の方法。
  90. 血管上皮増殖因子１（ＶＥＧＦ−１）およびメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸を投与することをさらに含んでなる請求項８８の方法。
  91. 哺乳類から生体サンプルを得ること、該生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルを評価すること、および該生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルを前立腺癌にかかっていない類似哺乳類から得られる生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較すること（ここで、該類似哺乳類からの該生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のレベルと比較して該哺乳類からの該生体サンプルにおけるＰＣＡＤＭ−１のより高いレベルは、該哺乳類が前立腺癌にかかっていることの指標となる）、それにより該哺乳類における前立腺癌を診断することを含んでなる、哺乳類における前立腺癌を診断する方法。
  92. 該哺乳類がヒトおよびイヌよりなる群から選択される請求項９１の方法。
  93. 該生体サンプルが、前立腺組織サンプル、血液サンプル、尿サンプル、痰サンプル、腹膜腔液サンプル、会陰腔液サンプル、胸膜腔液サンプル、精液サンプル、前立腺液サンプル、便サンプルおよび骨髄サンプルよりなる群から選択される請求項９１の方法。
  94. 哺乳類から生体サンプルを得ること、該生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルを評価すること、および該生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルを前立腺癌にかかっていない類似哺乳類から得られる生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルと比較すること（ここで、該類似哺乳類からの該生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のレベルと比較して該哺乳類からの該生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体のより高いレベルは、該哺乳類が前立腺癌にかかっていることの指標となる）、それにより哺乳類における前立腺癌を診断することを含んでなる、哺乳類における前立腺癌を診断する方法。
  95. 該哺乳類がヒトおよびイヌよりなる群から選択される請求項９４の方法。
  96. 該生体サンプルが、前立腺組織サンプル、血液サンプル、尿サンプル、痰サンプル、腹膜腔液サンプル、会陰腔液サンプル、胸膜腔液サンプル、精液サンプル、前立腺液サンプル、便サンプルおよび骨髄サンプルよりなる群から選択される請求項９４の方法。
  97. 細胞を試験化合物と接触させることおよび該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルを該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較すること（ここで、該試験化合物と接触していない該そのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のより高いかもしくはより低いレベルは、該試験化合物が細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現に影響を及ぼすことの指標となる）を含んでなる、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現に影響を及ぼす試験化合物を同定する方法。
  98. 請求項９７の方法により同定される化合物。
  99. 細胞を試験化合物と接触させることおよび該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルを該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較すること（ここで、該試験化合物と接触していない該そのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のより低いレベルは、該試験化合物が細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を減少することの指標となる）を含んでなる、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を減少する化合物を同定する方法。
  100. 請求項９９の方法により同定される化合物。
  101. 細胞を試験化合物と接触させることおよび該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルを該試験化合物と接触していないそのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較すること（ここで、該試験化合物と接触していない該そのほかの点では同一の細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のレベルと比較して該試験化合物と接触させた該細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１発現のより高いレベルは、該試験化合物が細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を増加することの指標となる）を含んでなる、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を増加する化合物を同定する方法。
  102. 請求項１０１の方法により同定される化合物。
  103. 化合物の存在下での前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のレベルを該化合物がない場合の前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のレベルと比較すること（ここで、該化合物がない場合の前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のレベルと比較して該化合物の存在下での前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸との前立腺癌抗原診断マーカー１結合のより高いかもしくはより低いレベルは、該化合物が前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸と前立腺癌抗原診断マーカー１との結合に影響を及ぼすことの指標となる）、それにより前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸と前立腺癌抗原診断マーカー１との結合に影響を及ぼす化合物を同定することを含んでなる、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸と前立腺癌抗原診断マーカー１との結合に影響を及ぼす化合物を同定する方法。
  104. 前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸が、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される配列を有する請求項１０３の方法。
  105. 該前立腺癌抗原診断マーカー１が、配列番号：２の配列と９９％より大きいアミノ酸相同性を共有する配列を有する請求項１０３の方法。
  106. 請求項１０５の方法により同定される化合物。
  107. （ａ）前立腺癌抗原診断マーカー１の初期レベルを決定するためにヒトから得られる第一の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを評価すること；
    （ｂ）該ヒトに抗前立腺癌治療を施すこと；
    （ｃ）該治療の間もしくは後に該ヒトから得られる第二のそのほかの点では同一の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを評価すること；
    （ｄ）該第一の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１の該レベルを該第二の生体サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１の該レベルと比較すること；および
    （ｅ）前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルの任意の減少を該抗前立腺癌治療の効果と相関させること、
    それにより前立腺癌にかかっているヒトの処置をモニターすること
    を含んでなる前立腺癌にかかっているヒトの処置をモニターする方法。
  108. 該方法が、該前立腺癌の存続期間、該ヒトの寿命および該抗前立腺癌治療の期間よりなる群から選択される期間の間（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことをさらに含んでなる請求項１０３の方法。
  109. 前立腺癌抗原診断マーカー１の該レベルが、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸を検出する方法および前立腺癌抗原診断マーカー１を検出する方法よりなる群から選択される方法を用いて評価される請求項１０３の方法。
  110. 前立腺癌抗原診断マーカー１を検出する該方法が、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体を検出する方法および前立腺癌マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸の結合を検出する方法（ここで、該核酸は、配列番号：５の配列を有する核酸、配列番号：６の配列を有する核酸、配列番号：７の配列を有する核酸および配列番号：８の配列を有する核酸よりなる群から選択される）よりなる群から選択される請求項１０３の方法。
  111. 前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸に相補的な単離された核酸（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）、および前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸よりなる群から選択される少なくとも一つの分子の前立腺癌抗原診断マーカー１発現阻害量を含んでなり、アプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患を軽減するためのキット。
  112. 該疾患が前立腺癌である請求項１１１のキット。
  113. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるＲＮＡを特異的に切断する該単離された酵素核酸が、配列番号：９の配列および配列番号：１０の配列よりなる群から選択される配列を含んでなる請求項１１１のキット。
  114. 血管上皮増殖因子１（ＶＥＧＦ−１）およびメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）よりなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する酵素核酸をさらに含んでなる請求項１１１のキット。
  115. 前立腺癌抗原診断マーカー１に特異的と結合する抗体、前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸に相補的な単離された核酸（該相補的な核酸はアンチセンスの向きである）、および前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸よりなる群から選択される少なくとも一つの分子の前立腺癌抗原診断マーカー１発現阻害量を含んでなり、アプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１の異常発現により媒介される疾患を処置するためのキット。
  116. 前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する分子を含んでなり、アプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる、サンプルにおける前立腺癌抗原診断マーカー１のレベルを評価するためのキット。
  117. 前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該分子が、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体および前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸よりなる群から選択される請求項１１６のキット。
  118. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする該核酸が、配列番号：１の配列を有する核酸と９９％より大きい配列同一性を共有する請求項１１６のキット。
  119. 該前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドが、配列番号：２の配列と９９％より大きいアミノ酸配列同一性を共有する請求項１１８のキット。
  120. 前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸が、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される配列を含んでなる請求項１１６のキット。
  121. 前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドともしくは前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸と特異的に結合する分子を含んでなり、アプリケーター、およびその使用のための説明用資料をさらに含んでなる、哺乳類における前立腺癌抗原診断マーカー１を検出するためのキット。
  122. 該哺乳類がイヌおよびヒトよりなる群から選択される請求項１２１のキット。
  123. 前立腺癌抗原診断マーカー１ポリペプチドと特異的に結合する該分子が、前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する抗体および前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する二本鎖核酸よりなる群から選択される請求項１２１のキット。
  124. 前立腺癌抗原診断マーカー１と特異的に結合する該二本鎖核酸が、配列ＣＡＣＧＧＡＴＧ（配列番号：５）、配列ＣＡＣＡＡＴＧＡ（配列番号：６）、配列ＣＡＣＡＡＴＧ（配列番号：７）および配列ＣＡＣＡＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴ（配列番号：８）よりなる群から選択される配列を含んでなる請求項１２３のキット。
  125. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸と特異的に結合する該分子が、配列番号：１の配列と９９％より大きい配列同一性を共有する核酸と相補的な核酸よりなる群から選択される請求項１２１のキット。
  126. （ａ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２塩基対を含んでなる既知の配列が側面に位置するランダムコアヌクレオチド配列を含んでなる）；および
    （ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する該組のオリゴヌクレオチドメンバーを検出し、それによりＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定すること
    を含んでなるＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの同定のためのモンテカルロ様スクリーニングアッセイ。
  127. （ｂ）の該検出が、電気泳動移動度シフトアッセイおよびポリペプチドと結合している二本鎖オリゴヌクレオチドを検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなる請求項１２６のアッセイ。
  128. 該ランダムコアヌクレオチド配列が、約３〜１２塩基対を含んでなる請求項１２６のアッセイ。
  129. 該二本鎖オリゴヌクレオチドが、約７〜１６塩基対の長さの間である請求項１２６のアッセイ。
  130. 該ランダムコアヌクレオチド配列が、７塩基対、８塩基対および９塩基対よりなる群から選択される長さを含んでなる請求項１２８のアッセイ。
  131. 該アッセイが
    （ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を同定すること；
    （ｄ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｃ）において同定される既知の側面に位置する配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、未知のランダムコア配列が（ｃ）において同定される配列より１個少ない未知の塩基対からなるように追加の既知の塩基対をさらに含んでなる）、および二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を検出しそして同定するアッセイ段階を繰り返すこと
    をさらに含んでなる請求項１２６のアッセイ。
  132. 該アッセイが、ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの全配列が同定されるまで（ａ）〜（ｄ）を繰り返すことをさらに含んでなる請求項１３１のアッセイ。
  133. 請求項１２６のアッセイにより同定されるＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する単離された二本鎖オリゴヌクレオチド。
  134. （ａ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２塩基対を含んでなる既知の配列が側面に位置するランダムコアヌクレオチド配列を含んでなる）；
    （ｂ）該組における該二本鎖オリゴヌクレオチドの１つもしくはそれ以上がＤＮＡ結合タンパク質に特異的に結合する条件下で、該組の二本鎖オリゴヌクレオチドメンバーを腫瘍細胞もしくは組織から調製されたＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる混合物を含有するサンプルと混合すること；
    （ｃ）該組における該二本鎖オリゴヌクレオチドの１つもしくはそれ以上がＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する条件下で、該組の同一の二本鎖オリゴヌクレオチドメンバーを腫瘍を含んでならないそのほかの点では同一の細胞もしくは組織から調製されたＤＮＡ結合タンパク質を含んでなる混合物を含有するそのほかの点では同一のサンプルと混合すること；
    （ｄ）（ａ）および（ｂ）において特異的オリゴヌクレオチド−タンパク質結合を検出すること；および
    （ｅ）（ｂ）においてＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合するが（ｃ）においてＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合しない二本鎖オリゴヌクレオチドを同定し、それにより腫瘍と関連するＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定すること
    を含んでなる腫瘍と関連するＤＮＡ結合タンパク質と特異的に結合する二本鎖オリゴヌクレオチドを同定する方法。
  135. 請求項１３４の方法により同定される単離された二本鎖オリゴヌクレオチド。
  136. （ｄ）の該検出が、電気泳動移動度シフトアッセイおよびポリペプチドと結合している標識した二本鎖オリゴヌクレオチドを検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなる請求項１３４の方法。
  137. 該ランダムコアヌクレオチド配列が、約３〜１２塩基対を含んでなる請求項１３４の方法。
  138. 該二本鎖オリゴヌクレオチドが、約７〜１６塩基対の長さの間である請求項１３４の方法。
  139. 該ランダムコアヌクレオチド配列が、７塩基対、８塩基対および９塩基対よりなる群から選択される長さを含んでなる請求項１３７の方法。
  140. 該方法が
    （ｆ）（ｅ）においてＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を同定すること；
    （ｇ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｆ）において同定される既知の側面に位置する配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、該未知のランダムコア配列が（ｆ）において同定される配列より１個少ない未知の塩基対からなるように該未知のランダムコア配列に隣接する追加の既知の塩基対をさらに含んでなる）；ならびに
    （ｈ）（ｂ）および（ｅ）を繰り返すこと
    をさらに含んでなる請求項１３４の方法。
  141. 該方法が、ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの全配列が同定されるまで（ｂ）〜（ｈ）を繰り返すことをさらに含んでなる請求項１４０の方法。
  142. （ａ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも２塩基対を含んでなる既知の配列が側面に位置するランダムコアヌクレオチド配列を含んでなる）；および
    （ｂ）該組のオリゴヌクレオチドメンバーと特異的に結合するＤＮＡ結合タンパク質を検出し、それにより二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を同定すること
    を含んでなる二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の同定のためのモンテカルロ様スクリーニングアッセイ。
  143. （ｂ）の該検出が、電気泳動移動度シフトアッセイおよびポリペプチドと結合している二本鎖オリゴヌクレオチドを検出する方法よりなる群から選択される方法を含んでなる請求項１４１のアッセイ。
  144. 該ランダムコアヌクレオチド配列が、約３〜１２塩基対を含んでなる請求項１４２のアッセイ。
  145. 該二本鎖オリゴヌクレオチドが、約７〜１６塩基対の長さの間である請求項１４２のアッセイ。
  146. 該ランダムコアヌクレオチド配列が、７塩基対、８塩基対および９塩基対よりなる群から選択される長さを含んでなる請求項１４５のアッセイ。
  147. 該アッセイが
    （ｃ）ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を同定すること；
    （ｄ）半ランダム二本鎖オリゴヌクレオチド組を作製すること（ここで、各二本鎖オリゴヌクレオチドは、（ｃ）において同定される該既知の側面に位置する配列からなり、該オリゴヌクレオチドは、未知のランダムコア配列が（ｃ）において同定される配列より１個少ない未知の塩基対からなるように追加の既知の塩基対をさらに含んでなる）、および二本鎖オリゴヌクレオチドの配列を検出しそして同定するアッセイ段階を繰り返すこと
    をさらに含んでなる請求項１４２のアッセイ。
  148. 該アッセイが、ＤＮＡ結合タンパク質と最大の親和性で結合する二本鎖オリゴヌクレオチドの全配列が同定されるまでアッセイの段階を繰り返すことをさらに含んでなる請求項１４７のアッセイ。
  149. 請求項１４２のアッセイにより同定される単離された二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
  150. （ａ）触媒コアドメインを含んでなる試験核酸を合成すること（ここで、該コアドメインは、相補的アームを含んでなる核酸が側面に位置し、そしてここで、該相補的アームの配列は、配列番号：１の配列を含んでなる配列と相補的な配列から選択され、そしてさらにここで、該相補的アーム配列は約８〜１０ヌクレオチドの長さである）、および（ｂ）該試験核酸が、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するかどうかを評価すること、それによりＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を設計することを含んでなる、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を設計する方法。
  151. 請求項１５０の方法により設計されるＤＮＡ酵素。
  152. （ａ）結合アームを含んでなる核酸が側面に位置する触媒コアドメインを含んでなる試験核酸を合成すること（ここで、該結合アームの配列は、翻訳開始部位に対して配列番号：１の約ヌクレオチド−９〜約ヌクレオチド＋４５０を含んでなる配列に相補的であり、そしてさらにここで、該結合アーム配列は約８〜１０ヌクレオチドの長さである）、および（ｂ）該試験核酸が、ＰＣＡＤＭ−１をコードするリボ核酸を特異的に切断するかどうかを評価すること、それによりＰＣＡＤＭ−１をコードするリボ核酸を特異的に切断するＤＮＡ酵素を同定することを含んでなる、ＰＣＡＤＭ−１をコードするｍＲＮＡを特異的に切断するＤＮＡ酵素を同定する方法。
  153. 該結合アームの該配列が、該翻訳開始部位に対して配列番号：１の約ヌクレオチド＋１５５〜約ヌクレオチド＋１７１を含んでなる配列に相補的である請求項１５２の方法。
  154. 該結合アームの該配列が、該翻訳開始部位に対して配列番号：１の約ヌクレオチド−７〜約ヌクレオチド＋９を含んでなる配列に相補的である請求項１５２の方法。
  155. 請求項１５３の方法により同定されるＤＮＡ酵素。
  156. 前立腺癌抗原診断マーカー１をコードする核酸から転写されるｍＲＮＡを特異的に切断する単離された酵素核酸を細胞に投与すること、それにより該細胞における該前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を阻害することを含んでなる、細胞における前立腺癌抗原診断マーカー１の発現を阻害する方法。
  157. 該単離された酵素核酸が、配列番号：９の配列を有する酵素核酸および配列番号：１０の配列を有する酵素核酸よりなる群から選択される請求項１５６の方法。
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