JP2005046137A - 新規ヒト遺伝子および遺伝子発現産物 - Google Patents

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Abstract

【課題】核酸配列およびそれによってコードされる蛋白質、並びに該核酸配列に由来するプローブ、該蛋白質に対する抗体、並びに癌細胞、特に結腸癌細胞を検出する診断方法を提供する。
【解決手段】腫瘍細胞、特に結腸癌組織において差異的に制御される新規なヒト遺伝子、該遺伝子により発現される蛋白質、および該蛋白質の変異体、該遺伝子および蛋白質に基づく、プローブ、アンチセンス構成体および抗体を含有する診断方法および治療剤を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、核酸配列およびそれによってコードされる蛋白質、並びに該核酸配列に由来するプローブ、該コード蛋白質に対する抗体、並びに癌細胞、特に結腸癌細胞を検出する診断方法を提供する。
結腸直腸癌は悪性の腫瘍性疾患である。西欧社会、特に米国では結腸直腸癌の発症率は高い。このタイプの腫瘍はリンパ管や血管を通って転移することが多い。結腸直腸癌の患者はこの疾患のために最後には死亡する。実際、米国だけで年間62,000人が結腸直腸癌により死亡すると推定されている。
しかし、初期に診断されれば、結腸癌は、癌組織の外科的切除により有効に治療されうる。結腸直腸癌は、結腸直腸上皮において発生し、一般的には発症の初期段階では血管新生はそれほどでもない（したがって侵襲性ではない）。結腸直腸癌は、結腸または直腸の裏打ち上皮において単一の変異細胞がクローン増殖するために発生すると考えられている。血管新生が著しく、侵襲性であり、かつ最終的には転移性である癌に移行し、それが体中に広がるまでには一般的に10年以上かかる。侵襲前にこの癌が発見されれば、癌組織の外科的切除が有効な治療法である。しかし、多くの場合、痛みや黒いタール状の便などの臨床的な兆候が現れたときにしか、結腸直腸癌は発見されていない。通常、このような兆候は、この疾患が十分に発達したときにしか現れず、多くの場合、転移後に現れ、しかも癌組織を外科的に切除した後ですら患者の予後は芳しくない。したがって結腸直腸癌の早期発見は、その死亡率を有意に下げうる点から重要である。
内視鏡検査などの侵襲的な診断方法により、ポリープなどの潜在的な癌増殖を直接に視覚的に同定し、切除し、そして生検査することができる。内視鏡は費用がかかり、不快であり、本来的に危険であり、したがって結腸直腸癌患者を見つける集団スクリーニング用のツールとしては実際的ではない。結腸直腸癌およびその前癌の存在を意味する特徴を見出すために便試料を非侵襲的に分析することもまた好ましい早期診断方法ではあるが、この目的を確実に達成する利用可能な診断方法は知られていない。初期段階で結腸癌を診断するための、信頼性があり、非侵襲的であり、かつ正確である技術があれば、多くの人命を助けることができるだろう。
本発明は、核酸配列およびそれによってコードされた蛋白質、並びに該核酸配列に由来するプローブ、該コードされた蛋白質に対する抗体、並びに癌、特に結腸癌を検出およびモニターする診断方法および予後診断方法を提供する。本明細書に開示される配列は、結腸癌細胞株および／または結腸癌組織に由来する試料において差異的に発現されることが見出されたものである。
一つの態様では、本発明は、個体において結腸癌の存在を検出する方法であって、その個体から試料を得ること、および配列番号１〜８からなる群から選択された核酸配列を含有する少なくとも１つの核酸配列の存在を検出することを含んでなる当該方法を提供する。
一つの態様では、上記検出過程は、上記試料を、配列番号１〜８を含有する配列からなる群から選択された配列にハイブリダイズすることができる、配列番号１〜８を含有する配列からなる群から選択された配列内の少なくとも12個の連続ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドプローブと接触させること；および、そのポリヌクレオチドプローブと、配列番号１〜８を含有する配列からなる群から選択された該配列とのハイブリダイゼーションを検出することを含んでなり、ここでは、ハイブリダイゼーションの検出が、配列番号１〜８からなる群から選択された核酸配列を含有する核酸配列の存在を意味する。
さらに本発明は、個体において結腸癌を検出する方法であって、その個体から試料を得ること、および配列番号９〜１６からなる群から選択された核酸配列からなる核酸配列の存在を検出することを含んでなる当該方法を提供する。
上記検出過程は、たとえば、上記試料を、配列番号９〜１６を含有する配列からなる群から選択された配列にハイブリダイズすることができる、配列番号９〜１６を含有する配列からなる群から選択された配列内の少なくとも12個の連続ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドプローブと接触させること；および、そのポリヌクレオチドプローブと、配列番号９〜１６を含有する配列からなる群から選択された該配列とのハイブリダイゼーションを検出することを含んでよく、ここでは、ハイブリダイゼーションの検出が、配列番号９〜１６からなる群から選択された核酸配列を含有する核酸配列の存在を意味する。
さらに別の態様では、本発明は、個体において結腸癌を検出する方法であって、その個体から試料を得ること、および配列番号１７〜２４からなる群から選択されたポリペプチド配列を含有するポリペプチド配列の、試料中の存在を検出することを含んでなる当該方法を提供する。
上記検出過程は、たとえば、上記患者試料を、配列番号１７〜２４の１つまたは複数に結合することができるポリペプチドリガンドと接触させること；および、そのポリペプチドリガンドと、配列番号１７〜２４の１または複数との結合を検出することを含んでよく、ここでは、結合の検出が、配列番号１７〜２４からなる群から選択されたポリペプチド配列を含有するポリペプチド配列の、上記試料中の存在を意味する。
好適な態様では、上記ポリペプチドリガンドは抗体または抗体の断片であり、好ましくは検出可能なラベルを含んでいる。
さらに本発明は、配列番号１〜８および９〜１６の配列を含有するヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含有する核酸を提供する。さらに該配列は、該ヌクレオチド配列を発現ベクターとしての使用に適するようにするために、該ヌクレオチド配列に作用可能に連結される転写調節配列を含んでよい。該核酸は、原核細胞または真核細胞において複製できる発現ベクター中に含まれうる。本発明は、該発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。
さらに本発明は、配列番号１〜８および９〜１６の配列またはそれに相補的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する核酸を提供する。さらに該配列は、該ヌクレオチド配列を発現ベクターとしての使用に適するようにするために、該ヌクレオチド配列に作用可能に連結される転写調節配列を含んでよい。該核酸は、原核細胞または真核細胞において複製できる発現ベクター中に含まれうる。関連する態様では、本発明は、該発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。
さらに本発明は、配列番号１〜８または９〜１６の配列またはそれに相補的な配列を含有するヌクレオチド配列を含有する核酸を導入遺伝子(transgene)として細胞内に組み込んだ形で有するトランスジェニック動物を提供する。本発明は、ストリンジェントな条件下で配列番号１〜８または９〜１６の配列を含有する配列にハイブリダイズする核酸配列を含有する核酸を導入遺伝子として有するトランスジェニック動物を提供する。当該導入遺伝子により、該核酸の発現レベル、該核酸のmRNA転写物の安定性、または該核酸によりコードされる生産物の活性が修飾される。
さらに本発明は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列中の、またはその相補的な配列中の、あるいは上記配列が一断片である遺伝子中の、少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドから完全長までの配列に相当する、単離された実質的に純粋な核酸を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列中の、またはその相補的な配列中の、あるいは上記配列が一断片である遺伝子中の、少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドから完全長までの配列に相当する核酸プローブにストリンジェントな条件下にハイブリダイズする、実質的に純粋な核酸を提供する。さらに本発明は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列中の、またはその相補的な配列中の、少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドを含有し、そしてヌクレアーゼ、好ましくは内在性エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対して耐性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを提供する。さらに本発明は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列中の、またはその相補的な配列中の、少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドにストリンジェントな条件下にハイブリダイズし、そしてヌクレアーゼ、好ましくは内在性エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対して耐性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを提供する。
さらに本発明は、実質的に純粋なオリゴヌクレオチドを含有するプローブ／プライマーを提供する。ここで該オリゴヌクレオチドは、おのおの配列番号１〜８または９〜１６の配列に実質的に相補的な核酸にハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜８または９〜１６の核酸配列中の領域を含有するものであり、かつ配列番号１〜８または９〜１６から選択されたセンスまたはアンチセンス配列中の少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチドの配列から配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの完全長までの配列またはその相補的な配列を含有するヌクレオチド配列領域を含有するものである。該プローブ／プライマーは、おのおの配列番号１〜８または９〜１６の配列にハイブリダイズするのに十分である配列番号１〜８または９〜１６の配列に相補的な核酸配列領域を含有する、実質的に純粋なオリゴヌクレオチドを含んでもよい。好ましい態様では、該プローブは、標的核酸と選択的にハイブリダイズするものである。別の態様では、該プローブは、それに結合し、かつ検出可能である標識を含んでよい。標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素の補助因子から選択される。さらに本発明は、少なくとも約１０、少なくとも約２５、少なくとも約５０、または少なくとも約１００個の異なる上記プローブが固体支持体に結合されたアレイを提供する。
本明細書では、「ハイブリダイズするのに十分な」とは、２つの核酸配列間の相補性の程度などの条件であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でその２つの配列がアニールするために十分な条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、多くの科学テキストや実験マニュアルに記載されていよう（例えばManiatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Inc.参照）。２つの配列がハイブリダイズするのに十分であるかどうかに影響するその他の条件には、G/C含量、融解温度、および配列の長さが挙げられる。好ましくは、「ハイブリダイズするのに十分な」配列は、長さが少なくとも８ヌクレオチドであり、かつG/C含量が約50％以下のものである。
さらに本発明は、細胞の表現型を決定する方法であって、配列番号１〜８を含有する少なくとも１つの核酸における、正常細胞と比較した場合の差異的な発現を検出することを含む、ただし該核酸が少なくとも約1.5倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍まで、あるいは約５０倍を超えて差異的に発現するものである、上記方法に関する。本明細書で「差異的な発現」とは、少なくとも約1.5倍の、少なくとも約２倍の、少なくとも約１０倍の、または少なくとも約５０倍までの、あるいは約５０倍を超えた、核酸配列の発現の増加または減少を意味する。好ましい態様では、配列番号１〜８または９〜１６のうち１つまたは複数の配列が差異的に発現するとは、該配列が、少なくとも2人の結腸癌患者において測定した場合に、少なくとも2人の正常者における平均発現レベルに比べて平均して少なくとも約1.5倍増加または減少して発現する場合である。この細胞の表現型の決定方法は、ストリンジェントな条件下に配列番号１〜８のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１つの核酸における、正常細胞と比較した場合の差異的な発現を検出することを含んでよく、ただし該核酸は、少なくとも約1.5倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約５０倍まで、あるいは約５０倍を超えて差異的に発現するものである。あるいは、この細胞の表現型の決定方法は、配列番号９〜１６を含有する少なくとも１つの核酸における、正常細胞と比較した場合の差異的な発現を検出することを含んでもよい。
本発明は、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは配列番号１７〜２４の配列またはその断片を含んでよい。別の態様では、本発明は、配列番号９〜１６のヌクレオチド配列またはその相補的配列を含有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその断片に関する。当該断片は、例えば、本発明のポリペプチドのうち少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、または少なくとも約４０個のアミノ酸を含有するものでよい。
さらに、配列番号１７〜２４の配列を含有するポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体を提供する。さらに本発明は、配列番号９〜１６のヌクレオチド配列またはその相補的配列を含有する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含有するポリペプチド、またはその断片に結合する抗体にも関する。本発明の抗体と結合する断片は、例えば、本発明のポリペプチドのうち少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、または少なくとも約４０個のアミノ酸を含有するものでよい。
本発明は、診断方法および予後の診断方法を提供する。一つの態様では、本発明は、患者に由来する細胞の表現型を決定する方法に関し、この方法は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列中またはその相補的な配列中に存在する少なくとも約８個、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続ヌクレオチド、あるいは上記配列が一断片である遺伝子の完全長までの配列を含有する核酸プローブを提供すること；患者から細胞試料を採取すること；実質的に全ての細胞が非癌性である第２の細胞試料を提供すること；ストリンジェントな条件下で、上記核酸プローブを、第１の細胞試料および第２の細胞試料の各mRNAに接触させること；そして、(a)プローブと第１細胞試料のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と、(b) プローブと第２細胞試料のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション量とを比較することを含み、ここで第２細胞試料のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と比較して、第１細胞試料のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション量が少なくとも約0.5倍、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、または少なくとも約５０倍まで異なることが、第１細胞試料の細胞の表現型を意味する。表現型の決定には、本明細書で使用するように遺伝子型の決定が含まれる。
本発明は、形質転換した（すなわち悪性の）細胞を同定するための検査キットを提供し、該キットは、患者から単離した細胞試料において配列番号１〜８もしくは９〜１６の配列またはその相補的配列を含有する核酸のレベルを測定するための上記プローブ／プライマーを含有する。該キットはさらにキットの使用説明書、細胞の懸濁用組成物または固定用組成物、検出用のタグまたは標識、核酸をハイブリダイゼーションしやすくする組成物、細胞溶解用組成物、または核酸精製用組成物を含んでよい。
さらに本発明は、細胞の表現型を決定する方法であって、配列番号１７〜２４のうち少なくとも１つの蛋白質における、正常細胞と比較した場合の差異的な発現を検出することを含む、ただし該蛋白質は少なくとも約1.5倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約５０倍、あるいは約５０倍を超えて差異的に発現するものである、上記方法を提供する。本明細書で「差異的な発現」とは、少なくとも約1.5倍の、少なくとも約２倍の、少なくとも約１０倍の、または少なくとも約５０倍までの、あるいは約５０倍を超えた、アミノ酸配列の発現の増加または減少を意味する。好ましい態様では、配列番号１７〜２４のうち１つまたは複数の配列が差異的に発現するとは、該配列が、少なくとも2人の結腸癌患者において測定した場合に、少なくとも2人の正常者における平均発現レベルに比べて平均して少なくとも約1.5倍増加または減少して発現する場合である。別の態様では、本発明は、細胞の表現型を決定する方法であって、配列番号１７〜２４のうち少なくとも１つの蛋白質における、正常細胞と比較した場合の差異的な発現を検出することを含む、ただし該蛋白質は少なくとも約0.5倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約２０倍、または少なくとも約５０倍差異的に発現するものである、上記方法を提供する。一つの態様では、蛋白質レベルは免疫検査により決定される。
さらに本発明は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列またはその相補的配列を含有する核酸の、細胞内における有無を決定する方法であって、その細胞を上記プローブと接触させることを含む上記方法に関する。さらに本発明は、配列番号１７〜２４のポリペプチドの、細胞内における有無を決定する方法であって、その細胞を上記抗体と接触させることを含む上記方法を提供する。さらに別の態様では、本発明は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列またはその相補的配列を含有する遺伝子における異常変異（例えば核酸の欠損、挿入または置換）または異常メチル化の存在を決定する方法を提供し、この方法は、患者から細胞試料を収集すること；その試料の細胞から核酸を単離すること；その核酸試料と、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの核酸配列に特異的にハイブリダイズする１または複数のプライマーとを、該核酸のハイブリダイゼーションと増幅が起きる条件下で接触させること；そして増幅産物の有無またはサイズを、正常細胞の増幅産物と比較すること、を含む。
本発明は、形質転換した（すなわち悪性の）細胞を同定するための検査キットであって、配列番号１〜８もしくは９〜１６のいずれかの配列またはその相補的配列を含有する核酸によってコードされる蛋白質に特異的な抗体を含有する検査キットを提供する。該キットは、さらにキットの使用説明書、細胞の懸濁用組成物または固定用組成物、検出用のタグまたは標識、蛋白質を抗体結合しやすくする組成物、細胞溶解用組成物、またはポリペプチド精製用組成物を含んでよい。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含有する医薬組成物を提供する。配列番号１〜８もしくは９〜１６のいずれかの配列またはその相補的配列を含有する核酸の、細胞内における発現レベルを変化させる薬剤を同定することは、細胞を準備し；その細胞を試験薬剤によって処理し；配列番号１〜８もしくは９〜１６のいずれかの核酸配列またはその相補的配列の、細胞内における発現レベルを決定し；そして、処理細胞における該核酸の発現レベルと、未処理細胞における該核酸の発現レベルとを比較することにより行われる。ここでは未処理細胞における該核酸の発現レベルと比較して、処理細胞における該核酸の発現レベルの変化は、細胞内における該核酸の発現レベルを変化させる薬剤を意味する。さらに本発明は、この方法によって同定した薬剤を含有する医薬組成物を提供する。
さらに本発明は、配列番号１〜８もしくは９〜１６のいずれかの配列またはその相補的配列を有するヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされるポリペプチド、または配列番号１７〜２４の配列を有するポリペプチドのいずれかを含有する医薬組成物を提供する。一つの態様では、本発明は、配列番号１〜８もしくは９〜１６のいずれかの配列またはその相補的配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含有する核酸を含有する医薬組成物に関する。本発明の有用な医薬組成物はさらに、配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を含有する融合蛋白質、またはその断片、抗体、または抗体断片を含んでよい。
本発明は、配列番号１〜８の配列を含有する核酸、および配列番号９〜１６の全長cDNA配列を有する核酸、または上記配列に相補的な配列、およびこれらの配列に対応する遺伝子に関し、ならびに上記核酸および遺伝子によってコードされるポリペプチドおよび蛋白質、およびそれらの断片に関する。
さらに本発明は、配列番号９〜１６のcDNA配列に相補的なmRNA配列によってコードされるポリペプチド配列に関し、たとえば、限定ではなく、配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。
配列番号１７〜２４のポリペプチドおよび蛋白質の変異体であるポリペプチドおよび蛋白質もまた本発明の範囲内である。該変異体は、野生型蛋白質の生物活性を増強、追加、軽減する１または複数のアミノ酸置換を有する点で、野生型蛋白質とは異なりうる。アミノ酸の変更が選択されれば、本発明に従い変異体をコードする核酸が構築される。このような核酸は、配列番号９〜１６の変異体であり、本発明に含まれる。
以下では、本発明の核酸に対応するcDNAおよびヒト遺伝子を獲得または作製する方法、該核酸および関連遺伝子の発現方法、該遺伝子の構造モチーフの同定方法、核酸に対応する遺伝子によってコードされる蛋白質の機能の同定方法、マッピングおよび組織プロファイリングにおけるプローブとしての核酸の使用方法、抗体作製における対応ポリペプチドおよび蛋白質の使用方法、ならびに、治療および診断目的における該核酸、ポリペプチドおよび蛋白質の使用方法を詳細に説明する。
したがって本発明は、一面において、腫瘍組織、特に結腸癌細胞株において差異的に発現する核酸、該核酸によってコードされるポリペプチド、該ポリペプチドに対して免疫反応する抗体、およびこのような組成物の調製に関する。さらに本発明は、たとえば該核酸の異常発現が関与する疾患を検出および治療するための診断および治療用検査、試薬および組成物を提供する。
Ｉ．概要
本発明は、部分的には、ヒト腫瘍、特に固体腫瘍、たとえば上皮性悪性腫瘍および肉腫、たとえば乳癌または結腸癌に存在する癌細胞を同定および／または分類する新規な方法に関する。該方法は、正常な大腸細胞など関連する正常細胞に比べて癌細胞株および／または癌組織において差異的に発現する遺伝子を用いるものであり、それによって腫瘍発生に関わる現象である特定遺伝子の増加発現調節および／または低下発現調節に基づいて、腫瘍細胞を同定または分類するものである。
癌遺伝子などの所定の遺伝子の増加調節または増加発現は、悪性増殖を促進するように働く。腫瘍抑制遺伝子などの遺伝子の減少調節または低下発現もまた悪性増殖を促進する。したがっていずれかのタイプの遺伝子の発現が変化することは、患者が癌、例えば結腸癌の発症の危険を有するか、またはその疾患を有するかどうかを決定するための診断指標となる可能性がある。
したがって一面として、本発明は、ヒトの腫瘍細胞、例えば結腸癌細胞のバイオマーカー、例えば核酸マーカーも提供する。さらに本発明は、該核酸マーカーによってコードされる蛋白質も提供する。さらに本発明は、上記癌細胞の治療に、そして結腸癌などの癌症状の治療に有用な薬剤を同定する方法も特徴とする。従来の方法とは異なり、本発明は、発症の初期段階において癌細胞を同定する方法を提供し、したがって前癌状態の細胞を、それらがヒトの全身に伝播する前に同定することができる。これにより、癌細胞が全身に広がる前に、または癌状態が不可逆的になる前に、潜在的な癌症状を早期に検出し、そして治療することができるようになる。
II．定義
便宜上、明細書、実施例および特許請求の範囲で使用する用語および語句の意味を以下に説明する。
本発明の核酸に適用する場合、「異常発現」という用語は、正常組織中の当該核酸の発現レベルと異なる当該核酸の発現レベル、または正常被験体中に存在するポリペプチドの活性と異なる当該核酸の発現レベルを指す。ポリペプチドの活性は、それがその天然対応物の活性よりも強力であるために異常になりうる。あるいは活性は、それがその天然対応物の活性に対して弱いか、または存在しないために異常になりうる。また異常活性は、活性上の変化でもよく、例えば、異常ポリペプチドは、異なる標的ペプチドと相互作用しうる。細胞は、当該遺伝子の過剰発現および過小発現に起因して、遺伝子の異常発現レベルを有しうる。
本明細書で使用する場合、「アゴニスト」という用語は、タンパク質の生理活性を模倣するか、または増加調節する（増強または補足する）作用剤を指す。アゴニストは、野生型タンパク質、または野生型タンパク質の少なくとも１つの生理活性を有するその誘導体であってよい。またアゴニストは、遺伝子の発現を増加調節する化合物、またはタンパク質の少なくとも１つの生理活性を増加させる化合物であってもよい。またアゴニストは、ポリペプチドと、別の分子、例えば標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増加させる化合物であってもよい。
「対立遺伝子」という用語は、本明細書中では「対立遺伝子変異体」と互換的に使用され、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。被験体が、ある遺伝子に関して２つの同一の対立遺伝子を有する場合、その被験体は、当該遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合性であると言える。被験体が、ある遺伝子に関して２つの異なる対立遺伝子を有する場合、その被験体は、当該遺伝子に関してヘテロ接合性であると言える。ある特定遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドの点で互いに異なることがあり、ヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含むことがある。また遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含有する遺伝子形態であってもよい。
「遺伝子の多型領域の対立遺伝子変異体」という用語は、他の個体中の該遺伝子の該領域に見出される数個のヌクレオチド配列の１つを有する遺伝子の領域を指す。
本明細書で使用する場合、「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質の少なくとも１つの生理活性を減少調節する（例えば、抑制または阻害する）作用剤を指す。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子、例えば標的ペプチドまたは酵素基質との間の相互作用を阻害または減少させる化合物であってよい。またアンタゴニストは、遺伝子発現を減少調節するか、または存在する発現タンパク質の量を減少させる化合物であってもよい。
本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、例えば任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の抗体全部を包含し、また脊椎動物、例えば哺乳類のタンパク質と特異的に反応するそれらの断片、および一本鎖抗体を包含する。抗体は、従来の技術を用いて断片化することができ、断片は、全抗体に関して上述するのと同じ方式で有用性に関してスクリーニングすることができる。したがって、この用語は、あるタンパク質と選択的に反応することが可能な抗体分子のタンパク質分解的切断部分または組換え的調製部分のセグメントを包含する。かかるタンパク質分解性断片および／または組換え断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、およびペプチドリンカーにより連結されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、共有結合または非共有結合されて、２つまたはそれ以上の結合部位を有する抗体を形成してよい。本発明は、抗体および組換え抗体のポリクローナル、モノクローナル、または他の精製調製物を包含する。
「アポトーシス」現象は周知であり、プログラムされた細胞死として記載することができる。既知のとおり、アポトーシスは、毒性物質または他の外部の影響により殺された結果として細胞が死亡する現象である「ネクローシス」と対比される。アポトーシスは、核凝縮、膜小胞形成、およびＤＮＡの断片化を伴い、それらは全て、一般に顕微鏡検査で目視することができる。
核酸の異常発現「に関連する」もしくは「を特徴とする」疾患、障害または症状とは、核酸の異常発現レベルにより誘発される、該異常発現レベルに起因する、または該異常発現レベルを原因とする個体の疾患、障害または症状を指す。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドの生理活性断片」という用語は、完全長のポリペプチドの断片であって、野生型ポリペプチドの活性を特異的に作動させる（模倣する）、または拮抗する（阻害する）断片を指す。生理活性断片は、好ましくは、完全長タンパク質が結合することができる少なくとも１つの他の分子、例えばタンパク質、小分子、またはＤＮＡと相互作用することが可能な断片である。
「生物活性」または「生理活性」または「活性」または「生物学的機能」は、本明細書中では互換的に使用され、ポリペプチド（その自然立体構造であろうと変性立体構造であろうと）により、またはそれらの任意の部分配列により、直接的または間接的に実施される効果因子あるいは抗原機能を意味する。生物活性としては、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質または分子への結合、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写調節因子としての活性、損傷したＤＮＡを結合する能力等が挙げられる。生理活性は、当該ポリペプチドに直接影響を及ぼすことにより調節することができる。あるいは、生理活性は、ポリペプチドレベルを調節することにより、例えば相当する遺伝子の発現を調節することにより変化させることができる。
「バイオマーカー」という用語は、生物学的分子、例えば核酸、ペプチド、ホルモンなど、それらの存在または濃度を検出し、疾患状態などの既知の症状と相関させることができるものを指す。
「細胞」、「宿主細胞」、または「組換え宿主細胞」は、本明細書中で互換的に使用される用語である。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫をも指す。突然変異または環境的影響により後続世代ではある種の改変が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞とは同一でない場合があるが、依然として本明細書中で使用される用語の範囲内に包含される。
「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、対象ポリペプチドの１つをコードする第１のアミノ酸配列と、対象ポリペプチドの任意のドメインにとって外来性であり、かつそれとは実質的に相同的でないドメイン（例えば、ポリペプチド部分）を規定する第２のアミノ酸配列との融合体である。キメラポリペプチドは、第１ポリペプチドを発現する生物中にも（ただし異なるポリペプチドに）見出される外来ドメインを提供するものでもよく、あるいは、種々の生物により発現されるポリペプチド構造の、例えば「種間の」、「遺伝子間の」融合であってもよい。一般に、融合ポリペプチドは、一般式（Ｘ）ｎ−（Ｙ）ｍ−（Ｚ）ｎ（式中、Ｙは、対象ポリペプチドの一部を表し、ＸおよびＺはそれぞれ独立して存在しないか、あるいは生物中に見出される天然配列に関連しないアミノ酸配列、または対象配列に隣接したポリペプチド鎖としては見出されないアミノ酸配列を表し、ｍは１以上の整数であり、各々存在するｎは独立して１以上の整数である（ｎおよびｍは、好ましくは５または１０以下である））で表すことができる。
「送達複合体」は、ターゲッティング手段（例えば、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの標的細胞表面への高親和性結合、および／または標的細胞による細胞内または核内への取込増加をもたらす分子）を意味する。ターゲッティング手段の例として、ステロール（例えばコレステロール）、脂質（例えばカチオン脂質、ビロソームまたはリポソーム）、ウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルス）、または標的細胞特異的結合作用物質（例えば、標的細胞特異的受容体に認識されるリガンド）が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による取り込み前に有意に脱共役を防止するようにin vivoで十分に安定である。しかしながら、該複合体は、細胞内の適切な条件下で切断可能であり、その結果、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、機能的形態で放出される。
周知のとおり、遺伝子または特定のポリペプチドは、個体ゲノム内に単一または複数コピーに存在してもよい。かかる重複遺伝子は、同一であってもよく、あるいは全てが依然として実質的に同じ活性を有するポリペプチドをコードするある種の改変、例えばヌクレオチドの置換、付加または欠失を有してもよい。したがって、「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」という用語は、特定の個体内の１つまたは複数の遺伝子を指しうる。さらに、ヌクレオチド配列中のある種の差異は、個々の生物間に存在してもよく、それは対立遺伝子と呼ばれる。かかる対立遺伝子の差異は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に差異を生じても生じなくてもよいが、依然として同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする。
「等価な」という用語は、例えば、機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。等価なヌクレオチド配列は、対立遺伝子変異体のような、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を包含し、したがって遺伝コードの縮重により配列番号１〜８または９〜１６で示される核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列を包含する。
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」、「組換え遺伝子」および「遺伝子構築物」は、エキソン配列および（場合により）イントロン配列の両方を含む、オープンリーディングフレームと結合される本発明の核酸を指す。
「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードし、エキソン配列を含む核酸を指すが、それは、場合により例えば関連または未関連の染色体遺伝子に由来するイントロン配列を含んでもよい。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されず、一般にエキソン間に見出される所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
細胞の「増殖」または「増殖状態」という用語は、細胞の増殖性状態、ならびにその分化状態を指す。したがってこの用語は、細胞が例えばＧ０、Ｇ１、Ｇ２、前期、中期、または終期である細胞周期の期、ならびにその分化状態、例えば未分化、部分的分化、または完全分化を指す。限定されることはないが、細胞の分化は、通常、細胞の増殖速度の減少により達成される。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間、または２つの核酸分子間の配列類似性を指し、同一性は、より厳格な比較である。相同性および同一性はそれぞれ、比較の目的で整列させうる各配列中の位置を比較することにより決定することができる。比較した配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合、それらの分子はその位置で同一である。核酸配列間の相同性または類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置での同一または一致ヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列の同一性の程度は、アミノ酸配列により共有される位置での同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、アミノ酸配列により共有される位置でのアミノ酸、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数の関数である。「未関連」または「非相同性」配列は、本発明の配列の１つに対して４０％未満の同一性を共有するが、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
「同一性％」という用語は、２つのアミノ酸配列間、または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。同一性はそれぞれ、比較の目的で整列させうる各配列中の位置を比較することで決定することができる。比較した配列中の等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合、それらの分子はその位置で同一である。等価な部位が同一または類似のアミノ酸残基（例えば、立体的性質および／または電子的性質が類似したもの）により占められる場合、それらの分子はその位置で相同である（類似である）ということができる。相同性、類似性、または同一性のパーセントとしての表現は、比較した配列により共有される位置での同一または類似のアミノ酸の数の関数である。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺを含む様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが使用され得る。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ(University of Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定を用いて使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md.を介して利用可能である。一実施形態では、２つの配列の同一性％は、例えばギャップウェイト１を用いてＧＣＧプログラムにより決定することができ、各アミノ酸ギャップには、２つの配列間で単一のアミノ酸またはヌクレオチドの不一致が存在するかのように重みをかける。
アラインメントのための他の技術は、Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAに記載されている。好ましくは、配列中のギャップを容認するアラインメントプログラムが、配列を整列するのに利用される。Smith-Watermanアルゴリズムは、配列アラインメントにおいてギャップを容認するアルゴリズムの１つの型である。Meth. Mol. 70-187 (1997)を参照されたい。また、NeedlemanとWunschのアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムも、配列を整列するのに利用することができる。代替的な検索戦略は、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用し、それはＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で作動する。ＭＰＳＲＣＨは、超並列コンピュータ上で配列にスコアを付けるためにSmith-Watermanアルゴリズムを使用する。このアプローチは、関連性が低い一致を見出す能力を増し、小さなギャップおよびヌクレオチド配列誤差に対して特に寛容である。核酸コードアミノ酸配列を用いて、タンパク質およびＤＮＡデータベースを検索することができる。
個々の配列を有するデータベースは、上述のMethods in Enzymology. ed. Doolittleに記載されている。データベースとしては、例えばGenbank、ＥＭＢＬ、およびDNA
Database of Japan (DDBJ)が挙げられる。
好ましい核酸は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかに示される配列の核酸配列に対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも約９５％同一である配列を有する。配列番号１〜８または９〜１６のいずれかに示される核酸配列に対して少なくとも約９０％、より好ましくは約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％同一である核酸も当然のことながら本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、該核酸は、哺乳類のものである。
本明細書中で使用する場合「相互作用する」という用語は、本質的にタンパク質−タンパク質間の、タンパク質−核酸間の、核酸−核酸間の、およびタンパク質−小分子間の、または核酸−小分子間の相互作用のような、分子間の検出可能な相互作用（例えば、生化学的相互作用）を包含する。
ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関して本明細書中で使用する場合「単離」という用語は、高分子の天然源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。本明細書中で使用する場合、単離という用語はまた、組換えＤＮＡ技術で生産される場合には細胞物質、ウイルス物質、または培地を含まない、あるいは化学的に合成される場合には化学前駆物質または他の化学物質を含まない、実質的に純粋な核酸またはペプチドを指す。さらに「単離された核酸」は、天然には断片としては存在せず、また自然状態では見出されない、実質的に純粋な、および／または純化された核酸断片を包含する。本明細書中で使用される場合「単離された」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指し、実質的に純化されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含する。
本明細書中で使用する場合「調節された」および「差異的に調節された」という用語は、増加調節（すなわち活性化または刺激（例えば作動化することまたは増強することによる））および減少調節（すなわち阻害または抑制（例えば拮抗すること、減少させること、または阻害することによる）の両方を指す。
「突然変異遺伝子」という用語は、突然変異遺伝子をもたない被験体に比べて突然変異遺伝子を有する被験体の表現型を改変させることが可能である、ある遺伝子の対立遺伝子形態を指す。被験体が、改変された表現型を有するために、この突然変異に関してホモ接合性でなくてはならない場合、この突然変異は劣性であるという。突然変異遺伝子の１つのコピーが被験体の遺伝子型を変更させるのに十分である場合、この突然変異は優性であるという。被験体が突然変異遺伝子の１つのコピーを有し、（当該遺伝子に関して）ホモ接合性の被験体とヘテロ接合性の被験体との中間の表現型を有する場合、この突然変異は共優性であるという。
記号「Ｎ」は、添付の配列表中に見られる場合、対応するヌクレオチドが何であるかが未知であることを示す。したがって「Ｎ」は、必ずしも任意のヌクレオチド、例えばＡ、Ｔ、ＣまたはＧにより置換が可能であるとわけではなく、むしろそれが何であるのか最終的に決定されていないヌクレオチドの位置を表す。
本発明の「非ヒト動物」には、哺乳類、例えばげっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等が包含される。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類から選択され、最も好ましくはマウスであるが、アフリカツメガエル属などのトランスジェニック両性類、およびトランスジェニックニワトリもまた、例えば胚形成および組織形成に影響を及ぼすことができる作用物質を認識および同定するための重要なツールとして提供することができる。本明細書中で使用される場合「キメラ動物」という用語は、動物内の、全てではないが幾つかの細胞において組換え遺伝子が存在するか、または組換え遺伝子が発現する動物を指す。「組織特異的キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子の１つが、ある組織では存在し、および／または発現もしくは破壊されるが、他の組織ではそうではないことを示す。
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および適宜リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、等価体として、ヌクレオチド類縁体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類縁体、ならびに記載した実施形態に適用可能なものとして、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡは、核酸と称され得る分子の代表例である。
「配列番号ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列」という用語は、配列番号ｘを有する核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列を指す。「相補鎖」という用語は、「相補体」という用語と互換的に本明細書中で使用される。核酸鎖の相補体は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であってよい。
「多型」という用語は、遺伝子またはその部分（例えば、対立遺伝子変異体）について複数の形態が共存することを指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の部分を「遺伝子の多型領域」と呼ぶ。多型領域は、単一ヌクレオチドであってよく、そのヌクレオチドは、異なる対立遺伝子において異なる。多型領域はまた、数個のヌクレオチド長であってもよい。
「多型遺伝子」とは、少なくとも１つの多型領域を有する遺伝子を指す。
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」という用語は、プロモーターに作動可能に連結された選択ＤＮＡ配列の発現を調節し、細胞での選択ＤＮＡ配列の発現を達成するＤＮＡ配列を意味する。この用語は、「組織特異的」プロモーター、すなわち、特定細胞（例えば、特定組織の細胞）でのみ選択ＤＮＡ配列の発現を達成するプロモーターを包含する。この用語はまた、主としてある組織で選択ＤＮＡの発現を調節するが、他の組織でも同様に発現を引き起こす、いわゆる「漏出性(leaky)」プロモーターを包含する。この用語はまた、非組織特異的プロモーター、および構成的に発現されるプロモーターまたは誘導性の（すなわち、発現レベルが制御され得る）プロモーターを包含する。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物に言及する場合、本明細書中で互換的に使用される。
「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技術により生産される本発明のポリペプチドを指し、この技術では概して、ポリペプチドをコードするＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、続いてそれを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質を生産する。さらに、組換え遺伝子に関して「に由来する」という語句は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列、または天然に存在する形態のポリペプチドの突然変異、例えば置換および欠失（短縮を含む）により生成される、それらに類似したアミノ酸配列を有するタンパク質を、「組換えタンパク質」の意味の内部に包含する。
本明細書中で使用する場合「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する成分を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド擬似体、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）分子もしくは無機分子であってよい。多くの製薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、多くの場合は真菌、細菌または藻類抽出物の広範なライブラリーを有しており、それらを本発明のいずれかの検査方法を用いてスクリーニングして、生理活性を調節する化合物を同定することができる。
本明細書中で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」という用語は、配列番号１，３，５または７のいずれかの核酸中の、またはその相補的な配列中の、またはそれらの天然に存在する突然変異体中の、例えば約６個、１２個、１５個、２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、３５０個、４００個、５００個、７５０個または１０００個の連続したヌクレオチドからなる部分に少なくともハイブリダイズすることのできる本発明の核酸分子の能力を指し、したがって本発明の核酸分子は、別のタンパク質をコードする細胞核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に対しては約１５％未満、好ましくは約１０％未満、より好ましくは約５％未満のバックグラウンドハイブリダイゼーションを示す。好ましい実施形態では、当該オリゴヌクレオチドプローブは、特定の核酸のみを検出し、例えばそれは、類似核酸もしくは関連核酸、またはその相補核酸には実質的にはハイブリダイズしない。
「転写調節配列」は、本明細書中で使用される包括的な用語として、それらが作動可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するＤＮＡ配列、例えば開始シグナル、エンハンサーおよびプロモーターを指す。好ましい実施形態では、１つの遺伝子の転写は、発現させようとする細胞タイプでの組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にある。また組換え遺伝子は、天然に存在する形態のポリペプチドの転写を制御する配列と同じ、または異なる転写調節配列の制御下にあってよい。
本明細書中で使用する場合、「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介性の遺伝子移入により、例えば発現ベクターを介して、核酸を受容細胞に導入することを意味する。本明細書中で使用する場合、「形質転換」は、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞への取り込みの結果として、細胞の遺伝子型が変化する過程を指し、たとえば、形質転換細胞は、組換え型のポリペプチドを発現し、あるいは導入遺伝子からアンチセンス発現が起きる場合には、標的遺伝子の発現が破壊される。
本明細書中で使用する場合、「導入遺伝子」という用語は、細胞内に導入された核酸配列（またはそのアンチセンス転写物）を意味する。導入遺伝子は、それを導入したトランスジェニック動物または細胞に対して部分的にまたは完全に異種性であってよく、すなわち外来性であってよく、あるいはそれを導入したトランスジェニック動物または細胞の内在遺伝子に相同であってもよいが、それを挿入した細胞のゲノムが変化するように、その動物のゲノム内に挿入されるように設計され、または挿入されている（例えば、天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入の結果ノックアウトが起きる）。また導入遺伝子は細胞内にエピソームの形で存在してもよい。導入遺伝子は、１つまたは複数の転写調節配列、および選択した核酸の最適な発現に必要となりうる任意の他の核酸、例えばイントロンを含んでよい。
「トランスジェニック動物」は任意の動物、好ましくは非ヒト哺乳類、鳥類または両生類であって、当該動物内の１つまたは複数の細胞が、人為的操作により、例えば当該技術において周知の遺伝子導入技術により導入された異種性核酸を含有するものをいう。該核酸は、慎重な遺伝子操作により、例えばマイクロインジェクションにより、または組換えウイルスに感染させることにより、直接的に細胞内に導入され、または該細胞の前駆体内に導入することにより間接的に細胞内に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な交雑育種またはin vitro受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の導入に関する。該分子は染色体内に組込まれるものでも、染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。ここに説明する典型的なトランスジェニック動物では、該導入遺伝子により、その細胞が、本発明のポリペプチドのいずれかを、組換え型として、例えばアゴニスト性またはアンタゴニスト性のいずれかの形で発現するようになる。しかしながら、例えば下記のＦＬＰまたはＣＲＥリコンビナーゼ依存性構築物のごとく、組換え遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も意図される。さらに「トランスジェニック動物」は、組換えやアンチセンスなどの人為的操作により１つまたは複数の遺伝子が破壊された組換え動物も含む。
本明細書中で使用する場合「治療する」という用語は、症状または疾患のうちの少なくとも１つの徴候を治癒および軽減することを包含する。
「ベクター」という用語は、それらに連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの１つの型は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらに連結された核酸の自己複製および／または発現が可能なものである。本明細書中では、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することが可能なベクターを、「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、大抵「プラスミド」の形態であり、これは通常、ベクターの形では染色体に結合されない環状二本鎖ＤＮＡループである。本明細書中では、プラスミドがベクターの最も普通に使用される形であることから、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用される。しかしながら本発明は、等価な機能を発揮し、かつ以下に記載するとおり当技術分野において知られている他の形の発現ベクターをも包含する。
「野生型対立遺伝子」という用語は、被験体中に２つのコピーが存在する場合に野生型の表現型をもたらす、ある遺伝子の対立遺伝子を指す。特定の遺伝子について幾つかの異なる野生型対立遺伝子が存在しうるが、これは、ある遺伝子中のあるヌクレオチドの変化が、そのヌクレオチド変化を有する遺伝子を２コピー有している被験体の表現型に影響を及ぼさないことがありうるからである。
III．本発明の核酸
以下に記載するように、本発明は、一態様として、単離核酸、かかる核酸の変異体、および／または等価体に関する。
本発明の核酸は、腫瘍細胞および／または腫瘍組織、例えば結腸癌由来細胞株において（正常組織、例えば正常結腸組織および／または正常非結腸組織での発現レベルに比べて）差異的に発現されるものとして同定された。差異的に発現される核酸配列を同定するために本発明の一態様において用いられる方法は、完全長のmRNA分子を、減算的(subtractive)ハイブリダイゼーション法および選択的増幅法による分析のために、小断片に消化するプロセスに基づく。すなわち、配列番号１〜８の配列は、本発明において差異的に発現されると同定されたものであり、おのおの配列番号９〜１６（完全長配列）に示す遺伝子の完全長配列の短縮型である。したがって該完全長配列は、その短い配列以前に得られ、実際に、差異的発現分析用の短い配列を作るために用いられた。BD Biosciences Clontechにより記載されたPCR-SelectTMサブトラクション法を用いて、差異的発現分析プロセスを実行した。簡単に述べると、SMARTTMシステム(BD Biosciences)を用いて、総細胞RNA試料から完全長のmRNAを作り、次にこれを用いて完全長cDNAライブラリーを作った。次にこの完全長cDNAを制限酵素、例えばRsa Iにより切断し、減算的ハイブリダイゼーション用の短い断片を作った（PCR-SelectTM マニュアル; BD Biosciences Clontech参照）。この方法に従って、本発明において、完全長配列（配列番号９〜１６）のRsa I消化産物である配列番号１〜８の配列が、結腸癌において差異的に発現されるものとして同定された。下記表１は、配列番号１〜８または９〜１６の説明を示す。
Figure 2005046137
したがって、本発明は、配列番号１〜８または９〜１６の配列、それらの相補的配列、または配列番号１〜８または９〜１６の配列に特異的にハイブリダイズする配列を提供する。一態様において、本発明の核酸は、少なくとも約0.5倍、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍差異的に発現される。好ましい核酸として、結腸癌細胞組織および結腸癌細胞株の両方において差異的に発現されると同定される配列が挙げられる。好ましい態様において、本発明の核酸は、腫瘍細胞、特に結腸癌組織および／または結腸癌に由来する細胞株中で増加調節される。別の態様において、本発明の核酸は、腫瘍細胞、特に、結腸癌組織および／または結腸癌に由来する細胞株中で減少調節される。
異常増殖する細胞において、癌遺伝子のような増加調節される遺伝子、または腫瘍サプレッサーのような減少調節される遺伝子は、診断または治療における標的として用いうる。例えば、cdc2遺伝子の増加調節は有糸分裂を誘発する。有糸分裂の不活性化因子であるmyt1遺伝子の過剰発現は、cdc2の活性を負に調節する。したがって、cdc2の増加調節またはmyt1の減少調節により、異常増殖が誘発しうる。同様にｐ５３およびＲｂのような腫瘍サプレッサーの減少調節が腫瘍形成に関与している。
本発明のさらに他の好ましい核酸は、配列番号９〜１６のいずれかにコードされたポリペプチドの一部を少なくとも含むポリペプチドをコードする。例えば、プローブ／プライマーまたはアンチセンス分子（すなわち非コード核酸分子）としての使用に好ましい核酸分子は、配列番号１〜８または９〜１６の配列に実質的に相補的な核酸配列とハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜８または９〜１６の核酸配列中の一領域を含んでよい。プローブ／プライマーまたはアンチセンス分子としての使用に好ましい核酸分子は、さらに、配列番号１〜８または９〜１６の配列とハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜８または９〜１６の配列に実質的に相補的な核酸配列中の一領域を含んでよい。プローブ／プライマーまたはアンチセンス分子としての使用に好ましい本発明の核酸分子は、完全な遺伝子中の、少なくとも約１２、２０、３０、５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基対ないし完全長のものである。コード核酸分子は、完全な遺伝子中の、例えば約５０、６０、７０、８０、９０または１００塩基対から完全長までを含んでよい。
本発明の別の態様は、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの核酸配列、またはそれらに相補的な配列に、低、中または高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件は、例えば約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続く約５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄であり、これらは当業者に既知であり、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-12.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程中の塩濃度を、５０℃で約２．０×ＳＳＣという低ストリンジェント性から、５０℃で約０．２×ＳＳＣという高ストリンジェント性まで選択することができる。さらに、洗浄工程の温度は、室温、約２２℃での低ストリンジェント条件から、約６５℃の高ストリンジェント条件まで増加することができる。温度および塩の両方を変更させてもよく、あるいは温度または塩濃度を一定に保ち、他方の変数を変化させてもよい。好ましい態様では、本発明の核酸は、中程度のストリンジェントな条件下で、例えば、約２．０×ＳＳＣおよび約４０℃で、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列、またはその相補的な配列に結合する。特に好ましい態様では、本発明の核酸は、高ストリンジェントな条件下で配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの配列、またはその相補的な配列に結合する。
一態様では、本発明は、室温で６×ＳＳＣ、続く室温で約２×ＳＳＣの洗浄という低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
別の態様では、本発明は、約６５℃で約２×ＳＳＣ、続く約６５℃で約０．２×ＳＳＣの洗浄という高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝コードでの縮重により、配列番号１〜８または９〜１６のいずれかのヌクレオチド配列またはその相補的配列とは異なる配列を有する核酸も本発明の範囲内である。該核酸は、機能的に等価なペプチド（すなわち等価または類似の生物活性を有するペプチド）をコードするが、遺伝コードでの縮重により、配列の点で配列表に示した配列とは異なる。例えば、多数のアミノ酸が、１つ以上のトリプレットによりコードされる。同一アミノ酸を指定するコドン、すなわち同義語コドン（例えばＣＡＵおよびＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコードする）は、ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレントな」突然変異をもたらし得る。しかしながら、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の変化を引き起こすＤＮＡ配列多型が哺乳類間に存在することが予想される。当業者に明白な通り、ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸内の１または複数のヌクレオチド（例えばヌクレオチド中の約３〜５％以下）の当該変異が、天然の対立遺伝子変異により、所定の種の個体間に存在し得る。
配列番号１〜８または９〜１６のいずれかの核酸またはその相補的配列によりコードされるタンパク質または該タンパク質の天然相同体のスプライシング変異体をコードする核酸も本発明の範囲内である。かかる相同体は、本明細書中にさらに記載するように、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによりクローニングすることができる。
当該ポリヌクレオチド配列は、本発明のポリペプチドのためのリーダー配列、例えば天然のリーダー配列または異種のリーダー配列をコードしてもよい。例えば、所望のＤＮＡ配列を、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助長するＤＮＡ配列に、例えば細胞からの該ポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列に、同一リーディングフレームで融合させてもよい。リーダー配列を有するタンパク質はプレタンパク質であり、成熟型のタンパク質を形成するために宿主細胞により切断されるリーダー配列を有してもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のマーキングおよび／または精製を可能にする、本明細書にて「タグポリペプチド」をコードする「タグ配列」とも称されるマーカー配列に、インフレームで融合させてもよい。好ましい態様では、該マーカー配列は、例えばＰＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグである。数多くの他のタグポリペプチドが市販されている。他の頻用するタグとしては、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含むｍｙｃエピトープ（例えばEllison et al., (199) J. Biol. Chem 266:21150-211567参照)、ｐＦＬＡＧ系(International Biotechnologies, Inc.)、ｐＥＺＺ−タンパク質Ａシステム(Pharmacia, NJ)、およびインフルエンザ菌血球凝集素タンパク質の１６アミノ酸部分が挙げられる。さらに、タグポリペプチドと特異的に相互作用する試薬、例えば抗体が入手可能であり、または調製もしくは同定することができる限り、任意のポリペプチドをタグとして使用することができる。
下記の実施例により示されるように、核酸は、例えば多数の真核細胞のいずれかに存在するｍＲＮＡから得ることができ、好ましくは後生動物細胞、より好ましくは脊椎動物細胞、よりいっそう好ましくは哺乳類細胞から得られる。成体と胚の両方からのゲノムＤＮＡから本発明の核酸を得ることも可能である。例えば遺伝子は、当業者に一般に既知の方法に従って、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのいずれかからクローニングすることができる。ｃＤＮＡは、細胞、例えば脊椎動物細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞（胚細胞を含む）から全ｍＲＮＡを単離することにより得ることができる。続いて、全ｍＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡを調製することができ、次に既知の多くの技術のいずれかを用いて、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入することができる。また遺伝子は、本発明が提供するヌクレオチド配列情報に従って、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いてクローニングすることもできる。
本発明は、その範囲内に、この生物材料から得られる核酸であって、配列番号１〜８または９〜１９の少なくとも１つの配列中の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと、ストリンジェントな条件（６５℃で少なくとも約４×ＳＳＣ、または４２℃で少なくとも約４×ＳＳＣ、例えば米国特許第５，７０７，８２９号参照）下でハイブリダイズする核酸のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含する。このことは、配列番号１〜８または９〜１６の１つの配列中の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドをプローブとして使用する場合、そのプローブは、その相補配列を含む（生物材料由来の）遺伝子またはｍＲＮＡと優先的にハイブリダイズすることを意味し、それによって、選択されたプローブに特異的にハイブリダイズする生物材料由来の核酸を同定および回収することが可能となる。配列番号１〜８または９〜１６の１つ以上の配列に由来するプローブは、それらが由来したところのｃＤＮＡが１つのｍＲＮＡに相当する場合に、同じ遺伝子またはｍＲＮＡとハイブリダイズする。１５個を超えるヌクレオチドのプローブを使用することができるが、１５個のヌクレオチドは、特異的な同定に十分な配列である。
別の態様では、該核酸を、正常な結腸特異的組織から調製したライブラリーから単離することができる。核酸配列ライブラリーを作製および検索する技術は、例えばSambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載されている。該ｃＤＮＡを、配列番号１〜８または９〜１６の配列に基づいたプライマーを用いて調製することができる。一態様では、該ｃＤＮＡライブラリーを、ポリアデニル化ｍＲＮＡのみから作製することができる。したがってポリＴプライマーを用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製することができる。配列番号１〜８または９〜１６のアラインメントを行って、関連ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを同定することができる。本明細書中に開示したポリヌクレオチドの幾つかは、検索手順中にマスキングを受けた反復領域を含有する。反復領域に関する情報は以下で検討する。
配列番号１〜８または９〜１６の配列を有するポリヌクレオチドの構築物は、合成によって作製することができる。あるいは、非常に多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドから遺伝子および全プラスミドを単一工程でアセンブリする方法が、Stemmer et al., Gene (Amsterdam) (1995) 164(i):49-53に記載されている。この方法には、アセンブリＰＣＲ（非常に多数のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）からの長いＤＮＡ配列の合成）が記載されている。この方法は、ＤＮＡシャッフリング(Stemmer, Nature (1994) 370:389-391)に由来し、ＤＮＡリガーゼではなく、その代わりにＤＮＡポリメラーゼに基づいて、アセンブリ工程中にさらにより長いＤＮＡ断片をアセンブリするものである。例えば、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼコード遺伝子（ｂｌａ）を含有する１．１ｋｂ断片を、各々４０ヌクレオチド（ｎｔ）長である合計５６個のオリゴから単一反応でアセンブリすることができる。この合成遺伝子をＰＣＲにより増幅し、唯一の選択マーカーとしてテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃ−Ｒ）を含有するベクターにクローニングすることができる。アンピシリン（Ａｐ）選択によらなくとも、Ｔｃ−Ｒコロニーの７６％がＡｐ−Ｒであり、したがってこのアプローチは、任意の遺伝子の、迅速かつ費用効果の高い一般的な合成法となる。
ＩＶ．当該技術分野で知られている方法を用いた、新規遺伝子の機能的および構造的モチーフの同定
核酸、ｃＤＮＡ、または完全遺伝子のヌクレオチド配列の翻訳物を、個々の既知の配列とともに整列させうる。個々の配列との類似性は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性を決定するのに使用することができる。例えばケモカイン配列と類似性を示す配列は、ケモカイン活性を示し得る。また、２以上の個々の配列と類似性を示す配列は、一方または両方の個々の配列に特徴的な活性を示し得る。
最も近い隣接物のポリヌクレオチド配列の完全長配列および断片を、プローブならびにプライマーとして使用して、該核酸の完全長配列を同定および単離することができる。この最も近い隣接物は、該核酸の完全長配列のためのライブラリーを構築するために使用される組織または細胞種を指しうる。
典型的に、核酸は、個々の配列との最良のアラインメントを決定するために、６個全てのフレームで翻訳される。配列表に開示した配列は５’から３’方向であり、３つのフレームで翻訳すれば十分であろう（実施例に記載する少数の特定の例外を除く）。これらのアミノ酸配列は、一般にクエリー配列と呼ばれ、個々の配列とともに整列させる。
核酸配列は、上述の方法のいずれかにより既知の遺伝子と比較することができる。個々の配列とクエリー配列のアラインメントの結果は、３つのカテゴリー：高類似性、弱類似性、および非類似性に分けることができる。高類似性から弱類似性に及ぶ個々のアラインメントの結果は、ポリペプチドの活性および／構造を決定するための基礎を提供する。
個々の結果を分類するためのパラメータとしては、最強のアラインメントが見出されるアラインメント領域長のパーセント、配列同一性のパーセント、およびｐ値が挙げられる。
アラインメント領域長のパーセントは、最強のアラインメント領域に見出される個々の配列の残基数を計数することで算出される。この数をクエリー配列の全残基長で除算して、パーセントを得る。以下に例を示す。
クエリー配列： ＡＳＮＰＥＲＴＭＩＰＶＴＲＶＧＬＩＲＹＭ
｜ ｜｜｜ ｜｜｜｜ ｜｜｜
個別配列： ＹＭＭＴＥＹＬＡＩＰＶ ＲＶＧＬＰＲＹＭ
1 5 10 15
アライメント領域は、アミノ酸９から始まり、アミノ酸１９で終わる。クエリー配列の全長は２０アミノ酸である。アライメント領域長のパーセントは、１１／２０すなわち５５％である。
配列同一性パーセントは、クエリー配列と個々の配列との間のアミノ酸の一致数を計数し、一致の総数を最強のアラインメント領域中に見出される個々の配列の残基数で除算することで算出される。上記の例について、同一性パーセントは、１０個の一致を、１１個のアミノ酸で除算したものであり、すなわち約９０．９％である。
ｐ値は、アラインメントが偶然に生じる確率である。シングルアラインメントに関しては、ｐ値は、Karlrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 2264 (1990)およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: (1993)に従って算出することができる。同じクエリー配列を用いたマルチプルアラインメントのｐ値は、Altschul et al., Genet. 6:119 (1994)に記載された発見的なアプローチを用いて算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムのようなアラインメントプログラムはｐ値を算出することができる。
配列が整列する領域の境界は、上述のDoolittle, Methods in Enzymology；ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡプログラムに従って、あるいは配列同一性が最も高い範囲を決定することにより決定することができる。
同一性または類似性を決定するのに考慮すべき別の要因は、類似性または同一性の位置である。強力な局所的なアラインメントは、アラインメントの長さが短い場合でも類似性を示唆しうる。クエリー配列の長さ全体にわたって散在する配列同一性もまた、クエリー配列とプロファイル配列との間の類似性を示唆しうる。
高類似性
アラインメントの結果が高類似性とみなされるためには、アラインメント領域長パーセントは、典型的にはクエリー配列の全長の少なくとも約５５％、より典型的には少なくとも約５８％、よりいっそう典型的には少なくとも約６０％である。アラインメント領域長パーセントは、通常約６２％程度、より通常的には約６４％程度、よりいっそう通常的には６６％程度であり得る。
さらに高類似性に関して、アラインメント領域は、典型的には少なくとも約７５％の配列同一性、より典型的には少なくとも約７８％、よりいっそう典型的には少なくとも約８０％の配列同一性を示す。配列同一性パーセントは、通常は約８２％程度、より通常的には約８４％程度、よりいっそう通常的には約８６％程度であり得る。
ｐ値は、これらの方法と併せて使用される。高類似性が見出される場合、ｐ値が約１０−２以下、より通常的には約１０−３以下、よりいっそう通常的には１０−４以下である場合に、クエリー配列はプロファイル配列と高類似性を有するとみなされる。クエリー配列が高類似性とみなされるには、ｐ値は、より典型的には約１０−５以下、より典型的には約１０−１０以下、よりいっそう典型的には約１０−１５以下である。
弱類似性
アラインメントの結果が弱いとみなされるためには、アラインメント領域長パーセントの最小値も、またアラインメントの長さの最小値も存在しない。アラインメント領域が、典型的に少なくとも約１５個のアミノ酸残基長、より典型的には少なくとも約２０個、よりいっそう典型的には少なくとも約２５個のアミノ酸残基長である場合に、弱類似性を良好に示すとみなされる。通常、アラインメント領域の長さは、約３０個程度、より通常的には約４０個程度、よりいっそう通常的には約６０個程度のアミノ酸残基であり得る。
さらに弱類似性に関して、アラインメント領域は、典型的には少なくとも約３５％の配列同一性、より典型的には少なくとも約４０％、よりいっそう典型的には少なくとも約４５％の配列同一性を示す。配列同一性パーセントは、通常約５０％程度、より通常的には約５５％程度、よりいっそう通常的には約６０％程度であり得る。
低類似性が見出される場合、ｐ値が通常約１０−２以下、より通常的には約１０−３以下、よりいっそう通常的には１０−４以下である場合に、クエリー配列はプロファイル配列と弱類似性を有するとみなされる。クエリー配列が弱類似性とみなされるには、ｐ値は、より典型的には１０−５以下、より通常的には約１０−１０以下、よりいっそう通常的には約１０−１５以下である。
配列同一性により決定される類似性
配列同一性そのものを用いて、個々の配列に対するクエリー配列の類似性を決定し、配列の活性を示すことができる。かかるアライメントは、好ましくは、配列を整列するためにギャップを容認する。典型的には全クエリー配列にわたる配列同一性が少なくとも約１５％、より典型的に少なくとも約２０％、よりいっそう典型的に少なくとも約２５％、さらにいっそう典型的に少なくとも約５０％である場合に、クエリー配列は、プロファイル配列に関連する。類似性の尺度としての配列同一性そのものは、クエリー配列が通常少なくとも８０残基長、より通常的には９０残基長、よりいっそう通常的には少なくとも９５アミノ酸残基長である場合に、最も有用である。より典型的には、クエリー配列が好ましくは１００残基長、より好ましくは１２０残基長、よりいっそう好ましくは１５０アミノ酸残基長である場合に、配列同一性そのものに基づいて類似性を決定することができる。
プロファイル配列と複数の整列させた配列とのアラインメントから活性を決定すること
核酸の翻訳物を、タンパク質ファミリーまたは共通モチーフのいずれかを規定するアミノ酸プロファイルとともに整列させることができる。また、核酸の翻訳物を、タンパク質ファミリーまたはモチーフのメンバーのポリペプチド配列を含む複数配列アラインメント（ＭＳＡ）に対して整列させることができる。プロファイル配列もしくはＭＳＡとの類似性または同一性を用いて、核酸または対応ｃＤＮＡもしくは遺伝子にコードされるポリペプチドの活性を決定することができる。例えば、ケモカインのプロファイルもしくはＭＳＡと同一性または類似性を示す配列は、ケモカイン活性を示しうる。
プロファイルは、（１）ファミリーに属するメンバーのアミノ酸配列のアラインメントであるＭＳＡを作製すること、および（２）該アラインメントの統計学的表示を構築することにより、手動で設計することができる。かかる方法は、例えば、Birney et al., Nucl. Acid Res. 25(14):2730-2739 (1996）に記載されている。
いくつかのタンパク質ファミリーおよびモチーフのＭＳＡが公的に利用できる。例えば、５４７個の異なるファミリーおよびモチーフのＭＳＡが挙げられる。これらのＭＳＡは、Sonnhammer et al., Proteins 28: 405-420 (1997)にも記載されている。他のソースもまたワールドワイドウェブ上で利用できる。これらのＭＳＡの簡単な説明が、Pascarella et al., Prot. Eng.9(3):249-251 (1996)に報告されている。
ＭＳＡからプロファイルを構築するための技術は、上述のSonnhammer et al、上述のBirney et alおよびMethods in Enzymology, vol.266: ”Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis”, 1996, ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAに記載されている。
クエリー配列とタンパク質ファミリーまたはモチーフとの間の類似性を、（ａ）該プロファイルに対してクエリー配列を比較すること、および／または（ｂ）該ファミリーまたはモチーフのメンバーとともにクエリー配列を整列させることにより決定することができる。
典型的には、Searchwiseなどのプログラムを用いて、プロファイルとしても知られている複数アラインメントの統計学的表示とクエリー配列とを比較することができる。該プログラムは、上述のBirney et al.に記載されている。配列とプロファイルとを比較する他の技術が、上述のSonnhammer et al.および上述のDoolittleに記載されている。
次に、Feng et al., J. Mol. Evol. 25:351-360 (1987)およびHiggins et al., CABIOS 5:151-153 (1989)に記載された方法を使用して、クエリー配列を、ＭＳＡとしても知られているファミリーまたはモチーフのメンバーとともに整列させることができる。PILEUPなどのコンピュータプログラムを使用することができる。下記Feng et al.を参照されたい。
クエリー配列とプロファイルまたはＭＳＡとの間に類似性が存在するかどうかを、以下の要因を用いて決定することができる：（１）クエリー配列中に見出される保存残基数、（２）クエリー配列中に見出される保存残基のパーセント、（３）フレームシフト数、および（４）保存残基間のスペーシング。
配列を翻訳および整列させる幾つかのアラインメントプログラムは、最良のアラインメントを作製するために該ヌクレオチド配列を翻訳する場合に、任意数のフレームシフトを作ることができる。アラインメントを作製するのに必要なフレームシフトが少ないほど、クエリーとプロファイルまたはＭＳＡとの間の類似性または同一性は強い。例えば、フレームシフト無しから生じた弱類似性は、２個のフレームシフトから生じた強い類似性よりも、クエリー配列の活性または構造のより良好な指標になり得る。
好ましくは、３個以下のフレームシフトがアラインメント中に見出される。より好ましくは２個以下のフレームシフト、よりいっそう好ましくは１個以下のフレームシフトが、さらにいっそう好ましくは０個のフレームシフトが、クエリーとプロファイルまたはＭＳＡとのアラインメント中に見出される。
保存残基は、ファミリーまたはモチーフのメンバーの全てまたは幾つかの特定位置に見出されるアミノ酸である。例えば、最も知られているケモカインは、４個の保存システインを含有する。あるいは、あるクラスのアミノ酸のみが、ファミリーメンバーの全てまたは幾つかの特定位置に見出される場合、その位置は保存されているとみなされる。例えば、Ｎ末端位置は、リシン、アルギニンまたはヒスチジンのような正荷電アミノ酸を含有しうる。
典型的には、あるクラスのアミノ酸または単一のアミノ酸が、全てのクラスメンバーの少なくとも約４０％、より典型的にはメンバーの少なくとも約５０％、よりいっそう典型的には少なくとも約６０％において特定の位置で見出される場合に、ポリペプチド中の該残基は保存的である。通常、あるクラスのアミノ酸または単の一アミノ酸が、ファミリーまたはモチーフのメンバーの少なくとも約７０％、より通常的には少なくとも約８０％、よりいっそう通常的には少なくとも約９０％、さらにいっそう通常的には少なくとも約９５％において見出される場合に、該残基は保存的である。
メンバーの幾つかまたは全てにおいて３つの非関連アミノ酸が、より通常には２つの非関連アミノ酸が特定位置で見出される場合に、該残基は保存的とみなされる。非関連アミノ酸が、全てのクラスメンバーの少なくとも約４０％、より典型的にはメンバーの少なくとも約５０％、よりいっそう典型的には少なくとも約６０％において特定の位置に見出される場合に、当該残基は保存的である。通常、あるクラスのアミノ酸または単一のアミノ酸が、ファミリーまたはモチーフのメンバーの少なくとも約７０％、より通常的には少なくとも約８０％、よりいっそう通常的には少なくとも約９０％、さらにいっそう通常的には少なくとも約９５％である場合に、当該残基は保存的である。
クエリー配列が、プロファイルまたはＭＳＡの保存残基の少なくとも約２５％、より通常的には少なくとも約３０％、よりいっそう通常的には少なくとも約４０％を含む場合に、該クエリー配列は、プロファイルまたはＭＳＡに対して類似性を有する。典型的には、クエリー配列がプロファイルまたはＭＳＡの保存残基の少なくとも約４５％、より典型的には少なくとも約５０％、よりいっそう典型的には少なくとも約５５％を含む場合に、該クエリー配列は、プロファイル配列またはＭＳＡに対してより強い類似性を有する。
Ｖ．プローブおよびプライマー
腫瘍細胞、特に結腸癌細胞株および該組織由来の遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列から、さらに、他の細胞型の、例えば他の組織由来の相同体、ならびに他の哺乳動物由来の相同体を同定および／またはクローニングするために設計されたプローブおよびプライマーの作製が可能となる。プローブ／プライマーとして有用なヌクレオチド配列は、配列番号１〜８または９〜１６に列挙される配列の、またはそれらに相補的な配列の、あるいは配列番号１〜８または９〜１６の全部または部分にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部または部分を包んでよい。例えば、本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供し、このオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜８または９〜１６、あるいはそれらの相補的配列、あるいはそれらの天然に存在する変異配列からなる群から選択されるセンス配列またはアンチセンス配列の、少なくとも約８、好ましくは約１２、好ましくは約１５、好ましくは約２５、より好ましくは約４０個の連続ヌクレオチドないし全長の配列に、ストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号１〜８または９〜１６の核酸配列、またはそれらに相補的な配列に基づくプライマーは、当該配列の相同体をクローニングするためのＰＣＲ反応で使用することができる。
さらに別の態様では、本発明は、配列番号１〜８または９〜１６、あるいはそれらの天然に存在する変異配列からなる群から選択されるセンス配列またはアンチセンス配列の、少なくとも約８、好ましくは約１２、好ましくは約１５、好ましくは約２５、より好ましくは約４０個の連続ヌクレオチドないし全長の配列に、中度のストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むプローブ／プライマーを提供する。
特にこれらのプローブは、本発明の野生型遺伝子中の突然変異を検出する方法を提供するので、有用である。本発明の野生型遺伝子に相補的であり、かつ突然変異遺伝子と不一致を成す核酸プローブが提供され、これにより、酵素的もしくは化学的切断による、または電気泳動移動度のシフトによる検出が可能となる。同様に、該対象配列に基づくプローブを用いて、例えば予後検査または診断検査における使用のために、同一タンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出することができる。好ましい態様では、該プローブは、それらに結合され、かつ検出することが可能な標識基をさらに含み、例えば標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、および酵素補因子から選択される。
開示した核酸を含む完全長ｃＤＮＡ分子は、以下のように得られる。配列番号１〜８または９〜１６の配列、あるいはそれらに相補的な配列の、少なくとも約８、好ましくは約１２、好ましくは約１５、好ましくは約２５、より好ましくは約４０個の連続ヌクレオチドないし全長の配列を含有する対象核酸またはその一部を、米国特許第５，６５４，１７３号「分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド(Secreted Proteins and Polynucleotides Encoding Them)」の記載のように、プローブ設計方法、クローニング方法、およびクローン選択技術を用いて、ｃＤＮＡライブラリー中の、ハイブリダイズするメンバーを検出するために、ハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。ｃＤＮＡライブラリーは、選択した組織、例えば正常または腫瘍組織から、あるいは例えば医薬剤で処置した哺乳類の組織から作製してもよい。該核酸とｃＤＮＡの両方が発現遺伝子を表すので、該組織は、該核酸の生産に用いたものと同じである。最も好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、本明細書の実施例に記載する生物学的材料から作製される。あるいは、多くのｃＤＮＡライブラリーが市販されている(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989)。ライブラリー構築のための細胞型は、核酸関連遺伝子によりコードされるタンパク質が何であるかわかった後に、選択されてよい。このことは、組織および細胞型が、関連遺伝子を発現する可能性が高く、したがってｃＤＮＡを作製するためのｍＲＮＡを含有することを示している。
当該核酸よりも大きい、好ましくは天然メッセージの全配列を含有するライブラリーのメンバーが得られうる。完全なｃＤＮＡが得られたことを確認するために、ＲＮＡの保護実験を以下のように実施しうる。完全長ｃＤＮＡとｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ分解酵素による分解からｍＲＮＡを保護し得る。該ｃＤＮＡが完全長でない場合、ハイブリダイズされないｍＲＮＡの部分がＲＮＡ分解酵素による分解を受けやすくなろう。当該技術分野で既知であるように、これを、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の移動度の変化により、または放出されたモノリボヌクレオチドの検出により検査しうる。Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 1989)。部分ｃＤＮＡの末端の５’に付加される配列を得るために、５’ＲＡＣＥ(PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc. 1990))を実施しうる。
ゲノムＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡの単離と同様の方法で核酸を用いて単離し得る。簡潔に述べると、核酸またはその一部を、ゲノムＤＮＡのライブラリーに対するプローブとして使用してよい。好ましくはライブラリーは、核酸を生産したのに使用した細胞型から得られる。最も好ましくはゲノムＤＮＡは、本明細書の実施例に記載する生物学的材料から得られる。かかるライブラリーは、Sambrook et al., 9.4-9.30に詳述されるように、Ｐ１またはＹＡＣのようなゲノムの大きなセグメントを保有するのに適切なベクター中に存在し得る。さらに、ゲノム配列は、例えばヒトＢＡＣライブラリー（これは、Research Genetics, Inc., Huntville, Alabama, USAから市販されている）から単離することができる。さらなる５’または３’配列を得るために、Sambrook et al.に記載されるように、染色体歩行を実施してよく、その結果、ゲノムＤＮＡの隣接断片および重複断片が単離される。当該技術分野で既知のように、制限消化酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、これらをマッピングし、つなぎ合わせてよい。
本発明の核酸を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築および探索するために古典的な方法およびＰＣＲ法の両方を用いて、相当する完全長遺伝子を単離することができる。いずれかの方法を用いて、好ましくはノーザンブロットを多数の細胞型に対して実施して、どの細胞株が最高の割合で所定の遺伝子を発現するかを決定してよい。
上述のSambrook et al.におけるｃＤＮＡライブラリーを構築する古典的な方法。これらの方法により、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから生産し、ウイルスベクターまたは発現ベクターに挿入することができる。典型的には、ポリ（Ａ）テイルを含有するｍＲＮＡライブラリーは、ポリ（Ｔ）プライマーを用いて生産することができる。同様にｃＤＮＡライブラリーは、本配列をプライマーとして用いて生産することができる。
ＰＣＲ方法を用いて、所望の挿入配列を含有するｃＤＮＡライブラリーのメンバーを増幅してよい。この場合、所望の挿入配列は、本核酸に相当する完全長のｃＤＮＡに由来する配列を含有しうる。かかるＰＣＲ方法には、遺伝子トラッピングおよびＲＡＣＥ方法が含まれる。
遺伝子トラッピングは、ｃＤＮＡライブラリーのメンバーをベクターに挿入することを必要とすることがある。次にベクターを変性させて、一本鎖分子を生産し得る。次に、ビオチン化オリゴのような基質結合プローブを用いて、所定のｃＤＮＡ挿入配列をトラップしうる。ビオチン化プローブをアビジン結合固体基材に連結させることができる。ＰＣＲ方法を用いて、トラップしたｃＤＮＡを増幅することができる。完全長遺伝子に相当する配列をトラップするために、標識プローブ配列は、本発明の核酸、例えば配列番号１，３，５または７、またはそれらに相補的な配列に基づくものでよい。ランダムプライマーまたはライブラリーベクターに特異的なプライマーを用いて、トラップしたｃＤＮＡを増幅することができる。かかる遺伝子トラッピング技術は、Gruber et al., ＰＣＴ国際公開公報第９５／０４７４５号、およびGruber et al., 米国特許第５，５００，３５６号に記載されている。遺伝子トラッピング実験を実施するためのキットが、例えばLife Technologies, Gaithersburg, Maryland, USAから市販されている。
「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」、すなわちＲＡＣＥは、多数の異なるＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ方法である。ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドリンカーに連結させて、２つのプライマーを用いてＰＣＲで増幅しうる。一方のプライマーは、完全長配列を望む本核酸由来の配列に基づいてよく、別のプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズする配列を含んでよい。この方法の詳細については、例えばＰＣＴ国際公開公報第９７／１９１１０号に報告されている。
ＲＡＣＥの好ましい態様では、共通プライマーは、ｃＤＮＡ末端に連結された任意のアダプター配列にアニーリングするように設計され得る(Apte and Siebert, Biotechniques, 15:890-893, 1993; Edwards et al., Nuc. Acids Res., 19:5227-5232, 1991)。単一遺伝子特異的ＲＡＣＥプライマーは、共通プライマーと対をなし、単一遺伝子特異的プライマーと共通プライマーとの間の配列の優先的な増幅が起きる。ＲＡＣＥで使用するために修飾された市販のｃＤＮＡプールが利用可能である。
別のＰＣＲベースの方法は、ｃＤＮＡ配列の特定の知見なしで、固着末端を有する完全長ｃＤＮＡライブラリーを生成するものである。この方法は、ロックドッキング(lock-docking)プライマー（Ｉ〜ＶＩ）を使用し、ここで一方のプライマーであるポリＴＶ（Ｉ〜ＩＩＩ）は、真核ｍＲＮＡのポリＡテイル上をロックして、第１鎖合成をもたらし、第２のプライマーであるポリＧＨ（ＩＶ〜ＶＩ）は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により付加されるポリＣテイル上をロックする。この方法は、例えばＰＣＴ国際公開広報第９６／４０９９８号に記載されている。
遺伝子のプロモーター領域は一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＬのための開始部位の５’に位置している。無数のプロモーター領域が、ＴＡＴＴＡまたはＴＡＴＡＡなどの配列である「ＴＡＴＡ」ボックスを含有し、そこは突然変異を受けやすい。プロモーター領域は、遺伝子のコード領域から、プライマーを用いて５’ＲＡＣＥを実施することで得ることができる。あるいは、ｃＤＮＡをゲノム配列用のプローブとして使用することができ、コード領域の５’領域を「歩行(walking up)」により同定する。
遺伝子が高度に発現されるか、または差異的に発現される場合、その遺伝子からのプロモーターは、異種遺伝子のための調節性構築物での使用に有用であり得る。
完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子がいったん得られれば、変異体をコードするＤＮＡを、Sambrook 15.3-15.63に詳述される部位特異的突然変異誘発により調製することができる。置換されるコドンまたはヌクレオチドは、タンパク質の構造および／または機能の変更を達成するためにアミノ酸の任意の変更に関する本明細書の開示に基づいて選択することができる。
生物学的材料からＤＮＡまたはＲＮＡを得るための代替的方法として、本発明の１または複数の核酸の配列を有するヌクレオチドを含む核酸を合成することができる。したがって、本発明は、（配列番号１，３，５または７のいずれかの配列、あるいはそれらに相補的な配列によって表される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは当該核酸に対して少なくとも８０％同一である、少なくとも１２個の連続したヌクレオチドに相当する）約８ヌクレオチド長から、核酸分子の複製および発現などの１つまたは複数の生物学的操作に適切な最大長までの範囲の核酸分子を包含する。本発明は、（ａ）完全な遺伝子のサイズを有し、かつ配列番号１〜８の少なくとも１つを有する核酸（例えば配列番号９〜１６の１つまたは複数の完全長ｃＤＮＡ配列）またはそれらに相補的な配列を有する核酸；（ｂ）融合タンパク質の発現を可能にするように作動可能に連結される少なくとも１つの追加の遺伝子も含む、（ａ）の核酸；（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む発現ベクター；（ｄ）（ａ）または（ｂ）を含むプラスミド；および（ｅ）（ａ）または（ｂ）を含む組換えウイルス粒子を包含するが、これらに限定されない。（ａ）の構築は、パートＶＩで以下に記載するように達成することができる。
本発明の核酸の配列は限定されず、Ａ、Ｔ、Ｇおよび／またはＣ（ＤＮＡに関して）、およびＡ、Ｕ、Ｇおよび／またはＣ（ＲＮＡに関して）、またはイノシンおよび擬似ウリジンなどの、それらの修飾塩基からなる任意の配列であってよい。配列の選択は、所望の機能に依存し、所望のコード領域、所望のイントロン様領域、および所望の調節領域により指示され得る。
ＶＩ．本発明の核酸を保有するベクター
本発明は、宿主細胞で遺伝子を発現させるために使用することができるプラスミドおよびベクターをさらに提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってよい。したがって、タンパク質の全部または選択部分をコードする、配列番号１〜８または９〜１６またはそれらに相補的な配列のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞のプロセスにより組換え型のポリペプチドを生産することができる。ポリヌクレオチド配列を、発現ベクターのような遺伝子構築物内に連結すること、および真核生物（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核生物（細菌細胞）のいずれかの宿主に形質導入または遺伝子導入することは、当該技術分野で周知の標準的な手段である。
細胞での核酸の発現を可能にするベクターを発現ベクターと称する。典型的には、発現ベクターは、少なくとも１つの転写調節配列に作動可能に連結された核酸を含有する。調節配列は、当該技術分野で認識されており、対象核酸の発現を指令するように選択される。転写調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。一態様では、発現ベクターは、対象ポリペプチドのアゴニスト活性を有するペプチドをコードするか、あるいは対象ポリペプチドのアンタゴニスト型であるペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
プラスミドの選択は、増殖を行う所望の細胞のタイプ、および増殖の目的に依存する。あるベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列を増幅および作製するのに有用である。別のベクターは、培養における細胞内発現に適している。さらに別のベクターは、動物またはヒト全体における細胞内導入および発現に適している。適切なベクターの選択は、十分に当業者の範囲内である。多くのかかるベクターが市販されている。核酸または完全長遺伝子を、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ結合を用いてベクターに挿入する。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、in vivoの相同組換えにより挿入してもよい。典型的に、これは、所望のヌクレオチド配列の隣接部分上においてベクターに相同性の領域を結合することにより達成される。相同性の領域は、オリゴヌクレオチドの連結によるか、または相同性の領域と所望のヌクレオチド配列の部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により付加される。
核酸または完全長遺伝子は、所望の発現特性を得るのに適切なように調節配列に連結される。これらには、プロモーター（センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端に結合される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが挙げられる。プロモーターは調節的なものでも、または構成的なものでもよい。組織特異的または発達段階特異的プロモーターのような条件的に活性なプロモーターを使用することが望ましい場合がある。これらは、ベクターに連結するための上記技術を用いて、所望のヌクレオチド配列に連結される。当該技術分野で既知の任意の方法を使用し得る。
上記宿主細胞のいずれか、または他の適切な宿主細胞または生物を、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および／または発現するために使用する場合、得られた複製核酸、ＲＮＡ、発現タンパク質またはポリペプチドは、その宿主細胞または生物の生産物として、本発明の範囲内にある。該産物は、当該技術分野で既知の任意の適切な手段により回収される。
核酸に相当する遺伝子がいったん同定されれば、その遺伝子が天然に存在する細胞において、その発現を調節することができる。例えば、細胞の内因性遺伝子は、米国特許第５，６４１，６７０号”Protein Production and Protein Delivery”に開示されるように、外因性の調節配列により調節することができる。
酵母において組換えタンパク質を発現するための多数のベクターが存在する（例えばBroach et al (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, ed., M. Inouye, Academic Press, p. 83参照）。さらに、アンピシリンのような薬剤耐性マーカーを使用することもできる。例示的な態様において、配列番号１〜８または９〜１６のいずれか、好ましくは配列番号９〜１６のいずれか、またはそれらに相補的な配列によって表される核酸の１つをサブクローニングすることで生成される発現ベクターを組換え的に利用して、ポリペプチドを生産する。
好ましい哺乳動物用発現ベクターは、細菌でのベクターの増殖を容易にするための原核細胞の配列、および真核細胞で発現される１つまたは複数の真核細胞の転写ユニットの両方を含有する。プラスミドの調製、および宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が当該技術分野で既知である。原核細胞および真核細胞の両方に適した発現系、ならびに一般的な組換え手法に関してMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2'Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17を参照されたい。
遺伝子の一部分、例えば短縮型の変異体、のみを発現することが望ましい場合、発現される所望の配列を含有するオリゴヌクレオチド断片に開始コドン（ＡＴＧ）を付加することが必要な場合がある。Ｎ末端位置のメチオニンは、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的に切断することができることが当該技術分野で周知である。ＭＡＰは、大腸菌(Ben-Bassat et al., (1987) J. Bacteriol. 169:751-757)、およびネズミチフス菌からクローニングされ、そのin vitro活性が、組換えタンパク質で実証された(Miller et al., (1987) PNAS 84:2718-1722)。したがって、所望ならば、Ｎ末端メチオニンの除去を、ＭＡＰを生産する宿主（例えば、大腸菌またはＣＭ８９またはＳ．セレビシエ）でポリペプチドを発現することによりin vivoで、または精製ＭＡＰ（例えば上述のMiller et al.の手法）の使用によりin vitroで達成することができる。
さらに、本発明の核酸構築物は、アンチセンス核酸のような核酸を送達するための遺伝子治療プロトコルの一部として使用することもできる。したがって、本発明の別の態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるin vivoまたはin vitroトランスフェクションのための発現ベクターを特徴とする。
高度に細胞型特異的なプロモーターおよび増幅プロモーター要素の制御下にアンチセンスオリゴヌクレオチドのような導入遺伝子を提供する核酸分子および構築物を、ベクター中に組み込み、ヒトを含む任意の哺乳動物に投与することができる。多くのかかるベクターが市販されており、さらにほかの適切なベクターを容易に調製することができ、これは当業者に明らかである。ベクターの正確な設計は、形質転換される宿主細胞の選択、および／または発現を望むタンパク質のタイプなどの要因に依存する。適切なベクターを、真核細胞における発現に適したプラスミドまたはウイルスベクター内に所望の構築物を連結することにより生産することができる（例えばBroach, et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. Inouye (Academic Press, 1983) p.83; Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., ed. Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Chapter 16 and 17を参照されたい）。
使用することができるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＣｏ１Ｅ１のようなプラスミド；アデノウイルス；シンドビスウイルス；シミアンウイルス４０；サイトメガロウイルス；ならびにマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。サルモネラ菌種、エルシニア・エンテロコリチカ、赤痢菌種、コレラ菌、放線菌株ＢＣＧ、およびリステリア・モノサイトゲネスのような細菌のベクターを使用することができる。ＭＣおよびＭＣ１のようなミニ染色体、バクテリオファージ、コスミド（λファージのｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド）およびレプリコン（独立した染色体外複製が可能である遺伝要素）も使用することができる。
上記ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー、例えば、限定するものではないが、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子、ネオマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシンおよびストレプトマイシン耐性を付与する遺伝子などをコードする配列をさらに含むことができる。標的細胞のゲノムへの組み込みを促進するために（所望の場合）、レトロウイルスベクターを使用することができ、長い末端反復（ＬＴＲ）配列を、発現構築物の片側に付加することができる（例えばVile, et al., Virology 214: 307-313 (1995)を参照されたい）。
高度に細胞型特異的なプロモーターの制御下に本発明のヌクレオチド配列を含む核酸構築物の送達は、経口または鼻腔内投与、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下注射、例えば生物学的衝撃銃(Ballistic gun)（「遺伝子銃」）を用いた注射など、当該技術にて既知のあらゆる手段によるものでよい。治療目的のための核酸の投与は、治療効率を達成するのに必要とする所望の任意の間隔にて繰り返すことができる。さらなる構成成分をベクターに付加して、標的細胞へのその選択送達を改善し、非標的細胞へのその送達を抑制することができる。使用することができるアプローチの例としては、Peng and Russell, Cur. Opin. Biotech. 10: 454-457 (1999)に記載されるように、宿主範囲の拡張、進入の増強、および宿主範囲の制限が挙げられ得る。
ウイルス性の導入法のほかに、非ウイルス性の方法もまた、対象核酸、例えば配列番号１〜８または９〜１６の配列あるいはそれらに相補的な配列のいずれかの配列を動物の組織内に導入するために使用することができる。非ウイルス性の遺伝子導入方法のほとんどは、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳動物細胞によって使用される標準的な機構に依る。好ましい態様では、本発明の非ウイルス性ターゲティング手段は、標的細胞による対象核酸の取り込みのためのエンドサイトーシス経路に依る。この型の典型的なターゲティング手段としては、リポソーム系、ポリリシン結合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。
配列番号１〜８または９〜１６あるいはそれらに相補的な配列のいずれかの核酸、対応するｃＤＮＡ、あるいは完全長の遺伝子を用いて、部分的または完全な遺伝子産物を発現させることができる。適切な核酸構築物は、例えばSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載されるように標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて、かつUnited States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinantに記載される現時の規制下で精製される。
ＤＮＡ研究
核酸によりコードされるポリペプチドを、例えば、細菌、酵母、昆虫、両性類および哺乳類の発現系を含むあらゆる発現系において発現させうる。
細菌
細菌における発現系としては、Chang et al., Nature (1978) 275:615; Goeddel et al., Nature (1979) 281:5; Goeddel et al., Nucleic Acids Rec. (1980) 8:4057; 欧州特許0,036,776; 米国特許4,551,433; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:2125およびSiebenlist et al., Cell (1980) 20:269に記載されるものが挙げられる。
酵母
酵母における発現系としては、Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929; Ito et al., J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol.(1986) 6:142; Kunze et al., J. Basic Microbiol.(1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol.(1986) 132:3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet.(1986) 202:302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol.(1983) 154:737; Van den Berget al., Bio/Technology (1990) 8:135; Kunze et al., J. Basic Microbiol.(1985) 25:141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol.(1985) 5:3376; 米国特許4,837,148および4,929,555; Beach and Nurse, Nature (1981) 300:706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10:49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284289; Tilburn et al., Gene (1983) 26:205221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:14701474; Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479; EP 0 244,234およびWO 91/00357に記載されるものが挙げられる。
昆虫細胞
昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許4,745,051; Friesen et al., (1986) “The Regulation of Baculovirus Gene Expression” in The Molecular Biology Of Baculoviruses (W. Doerfler, ed.); EP 0 127,839; EP 0 155,476; およびVlak et al., J.Gen.Virol. (1988) 69:765776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177; Carbonell et al., Gene (1988) 73:409; Maeda et al., Nature (1985) 315:592594; Lebacq Verheyden et al., Mol. Cell. Biol.(1988) 8:3129、Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) (1985) 82:8404; Miyajima et al., Gene (1987) 58:273およびMartin et al., DNA (1988) 7:99に記載されるように達成される。非常に多くのバキュロウイルス株および変異株ならびに対応する宿主由来の許容性昆虫宿主細胞は、Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6:4755; Miller et al., Generic Engineering (Setlow, J.K. et al., eds.), Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277279およびMaeda et al., Nature, (1985) 315:592-594に記載されている。
哺乳動物細胞
哺乳動物発現は、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761; Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1982) 79:6777、Boshart et al., Cell (1985) 41:52 1および米国特許4,399,216に記載されるように達成される。哺乳動物発現の他の特徴は、Ham and Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44; Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980) 102:255; 米国特許4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; WO 90/103430; WO 87/00195および米国再発行U.S. RE 30,985に記載されるように助長される。
ＶＩＩ．治療用核酸構築物
本発明の一態様は、アンチセンス治療における、単離核酸、例えば、配列番号１〜８または９〜１６の配列、あるいはそれらに相補的な配列の使用に関する。本明細書で使用するアンチセンス治療とは、細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと、細胞条件下にて特異的にハイブリダイズする（例えば、結合する）オリゴヌクレオチド分子またはそれらの誘導体の投与あるいはその場での(in situ) 生成によりその遺伝子の転写および／または翻訳を抑制することを指す。結合は、従来型の塩基対の相補性によってでもよく、あるいは例えばＤＮＡ二重鎖に結合する場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用によってでもよい。一般に、アンチセンス治療は、当該技術にて一般的に用いられる技術の範囲を指し、オリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に基づくあらゆる治療を含む。
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞にて転写される場合、細胞ｍＲＮＡの少なくとも特有な部分に相補的であるＲＮＡを生産する発現プラスミドとして送達され得る。あるいは、アンチセンス構築物は、ex vivoにて生成され、細胞中に導入される場合に、対象核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることにより、発現の抑制を引き起こすオリゴヌクレオチドプローブである。かかるオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレア−ゼ、例えば、エキソヌクレーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性である修飾オリゴヌクレオチドであり、したがって、in vivoにて安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のための典型的な核酸分子は、ＤＮＡのホスホラミデート、ホスホロチオエート、およびメチルホスホネート類縁体である（米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２６４，５６４号および第５，２５６，７７５号も参照）。さらに、アンチセンス治療において有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプローチは、例えば、Van der Krolet al. (1988) Bio Techniques 6:958-976、およびStein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668により概説されている。アンチセンスＤＮＡに関して、転写開始部位、例えば所定のヌクレオチド配列の−１０〜＋１０領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンチセンスアプローチは、ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止するであろう。絶対的相補性は、好ましいが、必要というわけではない。したがって、二重鎖アンチセンス核酸の場合には、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が試験されてもよく、または三重鎖形成を検査してもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さに依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それはＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含有し、それでも安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）は形成し得る。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的な手法を用いて、ミスマッチの耐用度を確認することができる。
ｍＲＮＡの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンを含むまでの５’非翻訳配列、に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を抑制する際に最も効率的に作用するだろう。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、同様にｍＲＮＡの翻訳を抑制する際に効果的であることが最近わかった(Wagner, R. 1994. Nature 372:333)。したがって、遺伝子の５’または３’非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するためのアンチセンスアプローチにおいて使用されうる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、より効率の悪い翻訳阻害剤であるが、本発明によれば、使用することも可能である。対象ｍＲＮＡの５’、３’またはコード領域にハイブリダイズするように設計されようとそうでなかろうと、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチド長であるべきであり、かつ、好ましくは約１００個未満、より好ましくは約５０個、２５個、１７個または１０個未満のヌクレオチド長である。
標的配列の選択に関係なく、遺伝子発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量化するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を定量化するin vitroでの研究が、まず行われることが好ましい。これらの研究は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子抑制と非特異的生物学的効果とを区別する対照を利用することが好ましい。これらの研究は、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと比較することもまた好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られる結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と比較することが想定される。対照オリゴヌクレオチドは、試験オリゴヌクレチドとほぼ同じ長さであること、また、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを防止するのに必要とする量以上はアンチセンス配列と異ならないことが好ましい。
オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはキメラ混合物もしくは誘導体、あるいはそれらの修飾型、一本鎖または二本鎖であることがある。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンにて、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改良するために修飾されることがある。オリゴヌクレオチドはまた、ペプチドのような他の追加基（例えば、宿主細胞受容体をターゲティングするために）、あるいは細胞膜の横断輸送を容易にする薬剤（例えば、Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556、Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652、１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開公報第８８／０９８１０号を参照）、または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ国際公開公報第８９／１０１３４号を参照）、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Krol et al., 1988, Bio Techniques 6:958-976を参照）もしくはインターカレート剤（例えば、Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549を参照）を含むことがある。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等に結合されてもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノエチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチド様バックボーンを含有することもできる。かかる分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと呼ばれ、Peny-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 93:14670、およびEglom et al. (1993) Nature 365:566に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの１つの利点は、ＤＮＡの中性バックボーンに起因する、培地のイオン強度に本質的に関係なく、相補的ＤＮＡに結合するそれらの能力である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホラジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそれらの類縁体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ホスフェートバックボーンを含む。
さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、a-アノマーオリゴヌクレオチドである。a-アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のｎ−ユニットと対照的に、鎖は、互いに平行している(Gautier et al, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641)。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoue et al.,1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-12148）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体（Jnoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330）である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術において既知の標準的方法により、例えば自動ＤＮＡ合成機（Biosearch, Applied Biosystems 等から市販されているものなど）を用いて合成してもよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et al. の方法(1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)により合成してもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御された有孔ガラスポリマー支持体の使用(Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)等により合成することができる。
コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得ると同時に、転写非翻訳領域に、および開始メチオニンを含む領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
アンチセンス分子は、in vivoにて標的核酸を発現する細胞に送達することができる。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するために多くの方法が開発されてきた。例えば、アンチセンス分子を、組織部位に直接的に注入することができるし、あるいは所望の細胞を標的にするように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上にて発現する受容体もしくは抗原と特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス）を全身投与することができる。
しかしながら、内因性ｍＲＮＡに関する翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成することは、多くの場合困難である。したがって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なpol IIまたはpol IIプロモーターの制御下に置かれている組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者内の標的細胞をトランスフェクトするためのかかる構築物の使用は、内因性転写物と相補的塩基対を形成し、それにより標的ｍＲＮＡの翻訳を防止するであろう、十分量の一本鎖ＲＮＡの転写という結果を生じるであろう。例えば、ベクターを、細胞に取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写が誘導されるようにin vivoにて導入することができる。かかるベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生産するように転写され得る限り、エピソームのままであっても、または染色体性に統合されてもよい。かかるベクターは、当該技術において標準的である組換えＤＮＡ技術方法によって構築することができる。かかるベクターは、プラスミド、ウイルス性、または哺乳動物細胞における複製および発現のために当該技術で既知の他のものであってもよい。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において作用するための当該技術にて既知の任意のプロモーターによるものであってもよい。かかるプロモーターは、誘発性または構成性であり得る。かかるプロモーターとしては、限定するものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター(Yamamoto et al., 1980. Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42)等が挙げられる。組織部位、例えば脈絡叢または視床下部に直接導入され得る組換えＤＮＡ構築物を調製するために、いかなる型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いることもできる。あるいは、所望の組織を選択的に感染するウイルスベクターを用いることができ（例えば、脳に関してはヘルペスウイルスベクターを用いることができる）、その場合には、投与は別の経路によって（例えば全身的に）行うことができる。
本発明の別の態様では、標的ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を用いて、標的ｍＲＮＡの翻訳および標的タンパク質の発現を防止することができる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開公報第９０／１１３６４号、Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225および米国特許第５，０９３，２４６号を参照）。部位特異的認識配列にてｍＲＮＡを切断するリボザイムは標的ｍＲＮＡを破壊するために使用できるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域が指示する位置にてｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列、５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生産は、当該技術にて既知であり、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591により詳しく記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率を高めて、非機能性ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最低限にするように作製される。
本発明のリボザイムはまた、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（これ以降「チェック(Cech)型リボザイム」と称する）を含み、これは、例えばテトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena Thermophila)にて天然に存在するものであり（ＩＶＳまたはＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡとして既知）、Thomas Cechおよび共同研究者により広範に記載されているものである(Zaug, et al.,1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433; University Patents Inc.による公開国際特許出願WO 88/04300; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216）。チェック型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対活性部位を有し、その後で標的ＲＮＡの切断が起こる。本発明は、標的遺伝子内に存在する８塩基対活性部位配列を標的とするチェック型リボザイムを包含する。
アンチセンスアプローチと同様に、リボザイムを（例えば、安定性、ターゲティング等を改良するために）修飾オリゴヌクレオチドから構成することができ、in vivoにて標的遺伝子を発現する細胞に送達しうる。送達の好ましい方法は、強力な構成的pol IIまたはpol IIIプロモーターの制御下にてリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いることを伴い、したがってトランスフェクトされた細胞は、内因性メッセージを破壊し、翻訳を抑制するのに十分な量のリボザイムを生産するであろう。リボザイムは、アンチセンス分子と異なり、触媒性であるので、効率上より低い細胞内濃度が要求される。
本発明のアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡおよびリボザイム分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のために当該技術にて既知のあらゆる方法によって調製することができる。これらの方法には、例えば固相ホスホラミダイト化学合成のような、当該技術にて既知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための技術が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroおよびin vivo転写により生成されてもよい。かかるＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラ−ゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた多種多様のベクターに組み込むことができる。あるいは、使用するプロモーターに依存して構成的にまたは誘発的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定に組み込むことができる。
さらに、核酸分子に対する様々な既知の修飾が、細胞内安定性および半減期を高める手段として導入されてもよい。可能な修飾としては、分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内での、ホスホジエステラーゼ結合よりはむしろホスホロチオエート結合または２’Ｏ−メチル結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
VIII．本発明のポリペプチド
本発明は、他の細胞タンパク質から単離された、特には対象ポリペプチドに結合しうる他のシグナル伝達因子および／または転写因子から単離された、すなわちそれらを実質的に含まない、利用可能な単離ポリペプチドを作製する。本発明の対象ポリペプチドは、配列番号９〜１６あるいはそれらに相補的な配列の核酸からなる完全長のｃＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドを含む。好ましいポリペプチドは、配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を有するものである。本発明のポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌由来細胞株において（正常細胞、例えば正常結腸組織および非結腸組織と比較して）差異的に調節されるタンパク質を含む。好ましい実施形態では、このポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌由来細胞株において増加調節される。他の実施形態では、このポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌由来細胞株において減少調節される。異常増殖細胞において、癌遺伝子のような増加調節されるタンパク質、または腫瘍サプレッサーのような減少調節されるタンパク質は、診断または治療技術のための標的となり得る。例えば、cdc2遺伝子の増加調節は、有糸分裂を誘発する。有糸分裂不活性剤であるmyt1遺伝子の過剰発現は、cdc2の活性を負の方向に調節する。したがって、異常増殖は、cdc2を増加調節し、またはmyt1を減少調節することにより誘発されうる。
「他の細胞タンパク質（本明細書中では「混入タンパク質」とも称する）を実質的に含まない」または「実質的に純粋な、または精製された調製物」という用語は、混入タンパク質が約２０％未満（乾燥重量で）、好ましくは約５％未満であるポリペプチドの調製物を包含すると定義される。機能的な形態の対象ポリペプチドが、本明細書中に記載するようにクローニングされた核酸を用いることにより、精製調製物として最初に調製され得る。完全長タンパク質、または１つもしくは複数の特定モチーフおよび／またはドメインに相当する断片、または任意の大きさに相当する断片、例えば、少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、７５個、または１００個のアミノ酸長の断片が、本発明の範囲内である。
好ましいポリペプチドは、配列番号９〜１６の核酸配列に相補的なｍＲＮＡ配列と少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％または９８％同一である核酸配列によってコードされるものであり、特に好ましいポリペプチドは、配列番号１７〜２４に記載されるものである。
タンパク質の単離ペプチド群は、かかるペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え的に生産されたペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。さらに、断片は、従来のMerrifield固相f-Mocまたはt-Boc化学のような当該技術分野にて既知の技術を用いて化学的に合成することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、断片の重複のない所望の長さの断片に随意に分割し、または好ましくは所望の長さの重複断片に分割することができる。断片を（組換え的にまたは化学合成により）生産し、試験して、野生型（例えば「標準的」）タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能することができるペプチド断片を同定することができる。
本発明の別の態様は、対象タンパク質の組換え体に関する。上述したように、自然タンパク質のほかに、本発明による好ましい組換えポリペプチドは、配列番号９〜１６あるいはそれらに相補的な配列によってコードされるアミノ酸配列に、少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは約８５％、よりいっそう好ましくは約９０％、さらにいっそう好ましくは約９５％同一である核酸によりコードされる。配列番号９〜１６あるいはそれらに相補的な配列と少なくとも約９８〜９９％同一である核酸によりコードされるポリペプチドもまた、本発明の範囲内である。また、かかるタンパク質の少なくとも一部を含むペプチド断片もまた、本発明に含まれる。
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチド、さらに好ましくはヒトポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは野生型の生物活性を保持する。ある翻訳後修飾、例えばリン酸化等は、非修飾ポリペプチド鎖と比較して、ポリペプチドの見かけの分子量を増加させることができることを理解されたい。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１７〜２４の配列を有する。
本発明はさらに、対象ポリペプチドのうちの１つの組換え体に関する。かかる組換えポリペプチドは、好ましくは、添付の配列表の野生型（「標準」）ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性のアンタゴニストまたはアゴニストとして機能できるものである。タンパク質のアミノ酸配列に関して「進化的に関連する」という用語は、天然に存在しているアミノ酸配列を有するポリペプチド、および例えばコンビナトリアル突然変異誘発により得られるヒトポリペプチドの変異体の両方を指す。
一般に、タンパク質の活性（例えば「生物活性」）を有すると記載されたポリペプチドは、配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を含み、かつ天然に存在するタンパク質の生物学的／生化学的活性のすべてまたは一部に模倣するか、または拮抗するポリペプチドと定義される。本発明によれば、ポリペプチドは、天然に存在する形態のタンパク質の特異的アゴニストまたはアンタゴニストである場合には、生物学的活性を有する。
化合物、例えばタンパク質またはその変異体が、１つ以上の上記の生物学的活性を有するかどうかを確定するための検査は、当該技術分野において周知である。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記に概説したような活性を有する。
別の実施形態では、ポリペプチドをコードする配列は、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子の一部として組み込むことができる。この型の発現系は、ポリペプチドの免疫原性断片を生産するのが望ましい条件下に、有用である（例えば、欧州特許公報第０２５９１４９号、ならびにEvanset al. (1989) Nature 339:3 85、Huang et al. (1988) J. Virol. 62:3 855、およびSchlienger et al., (1992) J. Virol. 66:2を参照）。免疫原性を高めるために融合タンパク質を利用することに加えて、融合タンパク質はまた、タンパク質の発現を促進することができ、したがって本発明のポリペプチドの発現に用いることができることが広く認識されている（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (N.Y. John Wiley &Sons, 1991)を参照）。別の実施形態では、組換えタンパク質の所望の部分のＮ末端において精製用リーダー配列、例えばポリ（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列をコードする融合遺伝子では、Ｎｉ2+金属樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィにより、発現された融合タンパク質の精製が可能となる。次に、精製用リーダー配列は、エンテロキナーゼで処理することにより除去され、精製タンパク質を提供し得る（例えばHochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177およびJanknecht et al. PNAS 88:8972を参照）。
融合遺伝子を作製する技術は、当業者に既知である。本質的に、種々のポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の連結を、従来技術に従って、連結用平滑末端またはふらつき(stagger)末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要ならば付着末端の平滑化(filling-in)、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を用いて行なわれる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成できる。あるいは核酸断片のＰＣＲ増幅を、２つの連続した核酸断片間に相補的なオーバーハングをもたらすアンカープライマーを用いて実行することができ、続いて２つの連続核酸断片をアニールして、キメラ核酸配列を生成することができる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley &Sons:1922を参照）。
本発明はさらに、対象ポリペプチドを生産する方法に関する。例えば、対象ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指令する核酸ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を、ペプチドを発現させるのに適切な条件下にて培養することができる。細胞培養のための適切な培地は、当該技術分野にて周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびかかるペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製などの、当該技術分野で既知のタンパク質精製技術を用いて、組換えポリペプチドを、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、組換えポリペプチドは、ＧＳＴ融合タンパク質のような、精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。
さらに、ある状況においては、天然に存在する形態のタンパク質の生物活性のサブセットのみを促進または抑制するために、アゴニスト（擬似体）またはアンタゴニストのうちの１つとして限定された能力にて機能する、対象ポリペプチドのうちの１つの相同体を提供することが有利であることが一般的に理解されよう。したがって特定の生物学的効果が、限定された機能を有する相同体で処理することにより、天然に存在する形態の対象タンパク質の生物活性のすべてを対象にするアゴニストまたはアンタゴニストで処理した場合に比較して少ない副作用で、誘発できる。
対象ポリペプチドの各々の相同体は、突然変異誘発により、例えば別個の点突然変異により、または切断により生成される。例えば突然変異は、相同体の起源であるポリペプチドの生物活性と実質的に同じもの、または単にそのサブセットを保持する相同体を生じさせる。あるいは、例えば受容体への競合的結合により、天然に存在する形態のタンパク質の機能を抑制することが可能なアンタゴニスト形態のポリペプチドを生成することができる。
本発明の組換えポリペプチドはまた、例えばユビキチン結合を改変する突然変異、または当該タンパク質に結合する他の酵素的ターゲティングを改変する突然変異に起因して、タンパク質分解性切断に耐性となった変異型タンパク質などの、野生型タンパク質の相同体をも含む。
ポリペプチドはまた、化学的に修飾して、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチルル基等のような他の化学部分との共有結合体または凝集結合体を形成することにより、誘導体を作出できる。タンパク質の共有結合誘導体は、タンパク質のアミノ酸側鎖上の官能基、またはポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にある官能基に化学的部分を結合することにより調製することができる。
対象ポリペプチドの構造の修飾は、治療効果または予防効果、安定性（例えばex vivoでの貯蔵安定性およびタンパク質分解に対する耐性）、または翻訳後修飾（例えばタンパク質のリン酸化パターンの改変）を高めるような目的で行うことができる。かかる修飾ペプチドは、天然に存在する形態のタンパク質の少なくとも１つの活性を保持するように、あるいはその特異的アンタゴニストを生産するように設計された場合、本明細書中でより詳述するポリペプチドの機能的等価物とみなされる。かかる修飾ペプチドは、例えばアミノ酸の置換、欠失または付加により生産され得る。置換的変異体は、保存アミノ酸の置換でも非保存アミノ酸の置換でもよい。
例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの独立置換、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の類似置換（すなわち等比体積的および／または等電的な突然変異）は、得られる分子の生物学的活性に大きな影響を与えないであろうと合理的に期待される。保存的置換は、側鎖の点で関連するアミノ酸ファミリー内に起こるものである。一般に、遺伝的にコードされるアミノ酸は、４つのファミリー：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けることができる。同様の様式でアミノ酸のレパートリーを、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン（ただし、セリンおよびトレオニンは、場合により別個に、脂肪族ヒドロキシルとして分類される）、（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン、および（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニンとして分類することができる（例えばBiochemistry, 2 ed., Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1981）。ペプチドのアミノ酸配列の変化が、機能的相同体（例えば、得られたポリペプチドが野生型形態を模倣または拮抗するという意味で機能的）を生じる結果となるかどうかは、その変異体ペプチドが、野生型タンパク質と類似する様式で、細胞における応答を生じさせうるか、またはかかる応答を競合的に抑制しうるかを評価することにより容易に決定することができる。
２つ以上の置換が起こったポリペプチドを、同様の方法にて容易に試験することができる。変異体は、タンパク質の特定領域の生物学的活性を保持するように設計することができる。非限定的な例として、Osawa et al., 1994, Biochemistry and Molecular International 34:1003-1009では、数個の異なる種に由来するタンパク質のアクチン結合領域が検討されている。これらの種のアクチン結合領域は、それらが「相同な残基群」内にあるアミノ酸を有するという事実に基づいて、相同とみなされる。相同な残基は、以下の群（一文字アミノ酸記号表示を用いた）：ＳＴＡＧ、ＩＬＶＭＦ、ＨＲＫ、ＤＥＱＮおよびＦＹＷにより判断される。例えば、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＧは、ある位置に存在してよく、機能（この場合アクチン結合）は保持される。
アミノ酸置換に関するさらなる指針は、タンパク質進化の研究から得られる。Go et al., 1980, Int. J. Peptide Protein Res. 15: 211-224では、接近し易さ(accessibility)によって内側または外側としてアミノ酸残基部位を類別した。外側部位におけるより頻繁な置換が、それらの生物機能に関係なく、および補欠分子族の有無に関係なく、８セットの相同タンパク質ファミリーにおいて一般的であることが確認された。実際、全てのタイプのアミノ酸残基が、内側よりも外側にてより高い変異性を有していた。変異性と極性との相関関係は、内側および外側のアミノ酸残基においてそれぞれ観察されなかった。アミノ酸残基は、極性に依存して、３つの群のうちの１つに類別された：極性(Arg, Lys, His, Gln, Asn, Asp, Glu)；弱い極性(Ala, Pro, Gly, Thr, Ser)；および非極性(Cys, Val, Met, Ile, Leu, Phe, Tyr, Trp)。タンパク質進化におけるアミノ酸置換は非常に保存的であり、内側または外側におけるそれぞれのアミノ酸置換の８８％または７６％が、３つのうちの同じ群内であった。群間の置換では、例えば、弱い極性残基が、内側においては非極性残基によってより頻繁に置換され、外側においては極性残基によってより頻繁に置換される。
Querol et al., 1996, Prot. Eng. 9:265-271は、タンパク質の熱安定性を高めるためのアミノ酸置換に関する一般則を提供する。新たなグリコシル化部位は、Olsen and Thomsen, 1991, J. Gen. Microbiol. 137:579-585に検討されたように、導入することができる。ジスルフィド架橋の付加は、Perry and Wetzel,1984, Science 226:555-557; Pantoliano et al., 1987, Biochemistry 26:2077-2082; Matsumura et al., 1989, Nature 342:291-293; Nishikawa et al., 1990, Protein Eng. 3:443-448; Takagi et al., 1990, J. Biol. Chem, 265:6874-6878; Clarke et al., 1993, Biochemistry 32:4322-43299およびWakarchuk et al., 1994, Protein Eng. 7:1379-1386に検討されたように、導入することができる。
金属結合部位の付加は、Toma et al., 1991, Biochemistry 30:97-106およびHaezerbrouck et al., 1993, Protein Eng. 6:643-649にしたがって導入することができる。ループにおけるプロリンによる置換は、Masul et al., 1994, Appl Env. Microbiol. 60:3579-3584およびHardy et al., FEBS Lett. 317:89-92にしたがって行うことができる。
システイン欠失突然変異タンパク質は、本発明の範囲内の変異体である。これらの変異体は、システインを他のアミノ酸で置換する方法、および置換体の生物学的活性および効果を測定する方法を開示した米国特許第４，９５９，３１４号に記載された方法にしたがって構築することができる。かかる方法は、例えばジスルフィド結合形成を除去するために、かかる置換に適するシステイン残基を有する本発明のタンパク質に適している。
核酸と相関する遺伝子の正体および機能を知るために、その核酸または対応するアミノ酸配列を、タンパク質ファミリーのプロファイルに対してスクリーニングすることができる。かかるプロファイルは、各ファミリーのタンパク質間の共通の構造モチーフに焦点を置く。公的に利用可能なプロファイルは上に記載されている。追加または代わりのプロファイルは以下に記載される。
新規な核酸を既知の配列と比較する際、いくつかのアライメント用ツールが利用できる。例として、複数配列アライメントを作製するPileUpが挙げられ、これはFeng et al., J. Mol. Evol. (1987) 25:35 1-360に記載されている。別の方法であるGAPは、Needleman et al., J. Mol. Biol. (1970) 48:443-453のアライメント法を使用する。GAPは、配列の包括的なアライメントに最適である。第３の方法であるBestFitは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482-489の局所的相同性アルゴリズムを用いて、一致数を最大にするようにギャップを挿入することにより機能する。
かかるプロファイルの例を以下に示す。
ケモカイン
ケモカインは、リンパ球輸送、炎症性疾患、血管新生、血球新生およびウイルス感染に関与しているタンパク質ファミリーである。例えば、Rollins, Blood (1997) 90(3):909-928およびWells et al., J. Leuk. Biol. (1997) 61:545-550を参照されたい。米国特許第５，６０５，８１７号は、胎児脾臓にて発現されるケモカインをコードするＤＮＡを開示している。米国特許第５，６５６，７２４号は、ケモカイン様タンパク質およびその使用方法を開示している。米国特許第５，６２０，００８号は、肝臓により発現されるケモカインをコードするＤＮＡを開示している。
コードされるケモカインの突然変異体は、天然ケモカインと比較して、少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加または欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。断片は、天然ケモカインと同じアミノ酸配列を有し、突然変異体は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の配列を欠失していてもよい。融合体は、突然変異体、断片、またはアミノ末端および／またはカルボキシル末端のアミノア酸伸長をも含む天然ケモカインである。
アミノ酸変化の数および型も重大でなく、またアミノ酸欠失の長さまたは数、あるいは天然ケモカインのアミノ酸配列と比較してケモカイン内に組み込まれるアミノ酸伸長の長さまたは数も重大ではない。これらの変異体ポリペプチドのうちの１つをコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの既知のケモカインと少なくとも約８０％のアミノ酸同一性を保持するであろう。好ましくは、これらのポリペプチドは、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を保持するであろう。さらにこれらの変異体は、天然ケモカインが示す少なくとも１つの活性の少なくとも８０％、好ましくは約９０％、より好ましくは約９５％の活性を示すであろう。ケモカイン活性としては、天然ケモカインの免疫学的機能、生物学的機能、受容体結合機能およびシグナル伝達機能が挙げられる。
走化性
好中球に関する走化性の検査は、Walz et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1987) 149:755; Yoshimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1987) 84:9233およびSchroder et al., J. Immunol. (1987) 139:3474に、リンパ球に関する走化性の検査は、Larsen et al., Science (1989) 243;1464; Carr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1994) 91:3652に、腫瘍浸潤性リンパ球に関する走化性の検査は、Liao et al., J. Exp. Med. (1995). 182:1301に、造血前駆体に関する走化性の検査は、Aiuti et al., J. Exp. Med. (1997) 185:111に、単球に関する走化性の検査は、Valente et al., Biochem. (1988) 27:4162に、ナチュラルキラー細胞に関する走化性の検査は、Loetscher et al., J. Immunol. (1996) 156:322およびAllavena et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:3233に記載されている。
好酸球を誘引する生物活性を測定する検査は、Dahinden et al., J. Exp. Med. (1994) 179:751; Weber et al., J. Immunol. (1995) 154:4166およびNoso et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1994) 200:1470に、樹状細胞を誘引する生物活性を測定する検査は、Sozzani et al., J. Immunol. (1995) 155:3292に、好塩基球を誘引する生物活性を測定する検査は、Dahinden et al., J. Exp. Med. (1994) 179:751; Alamet al., J. Immunol. (1994) 152:1298; Alam et al., J. Exp. Med. (1992) 176:781に、好中球を活性化する生物活性を測定する検査は、Maghazaci et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26:315およびTaub et al. J. Immunol. (1995) 155:3877に記載されている。天然ケモカインは、繊維芽細胞の分裂促進因子として作用することができ、Mullenbach et al., J. Biol. Chem. (1986) 261:719に記載されたように検査される。
受容体結合
天然ケモカインは、多数の受容体と結合活性を示す。かかる受容体および結合を検出する検査は、例えばMurphy et al., Science (1991) 253;1280; Combadiere et al., J. Biol. Chem. (1995) 270:29671; Daugherty et al., J. Exp. Med. (1996) 183:2349; Samson et al., Biochem. (1996)35:3362; Raport et al., J. Biol. Chem. (1996) 271:17161; Combadiere et al., J. Leukoc. Biol. (1996) 60:147; Baba et al., J. Biol. Chem. (1997)23:14893; Yosida et al., J. Biol. Chem. (1997) 272: 13803; Arvannitakis et al., Nature (1997) 385:347に記載され、多くの他の検査が当該技術にて既知である。
キナーゼ活性化
キナーゼ活性化の検査は、Yen et al., J. Leukoc. Biol. (1997)61:529; Dubois et al., J. Immunol. (1996) 156:1356; Turner et al., J. Immunol. (1995) 155:2437に記載されている。血管新生または細胞増殖の抑制の検査は、Malone et al., Science (1990) 247:77に記載されている。グリコサミノグリカン生産は、天然ケモカインによって誘発することができ、Castor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:765に記載されたように検査される。好塩基球からのケモカイン媒介性ヒスタミン放出は、Dahinden et al., J. Exp. Med. (1989) 170:1787およびWhite et al., Immunol. Lett.(1989) 22:151に記載されたように検査される。ヘパリン結合は、Luster et al., J. Exp. Med. (1995) 182:219に記載されている。
二量体化活性
ケモカインは二量化活性を有することができ、それはBurrows et al., Biochem (1994) 33 12741およびZhang et al., Mol. Cell. Biol. (1995) 15:4851に従って検査される。天然ケモカインは、ウイルスの炎症性応答において役割を果たすことができる。この活性は、Bleul et al., Nature (1996) 382:829およびOberlin et al., Nature (1996) 382:833に記載されたように検査することができる。単球のエキソサイトーシスは、天然ケモカインによって促進することができる。かかる活性の検査は、Uguccioni et al., Eur. J.Immunol. (1995) 25:64に記載されている。天然ケモカインはまた、造血幹細胞の増殖を抑制することができる。かかる活性を検査する方法は、Graham et al., Nature (1990) 344:442に報告されている。
デスドメイン(death domain)タンパク質
いくつかのタンパク質ファミリーは、デスドメインモチーフを含有する(Feinstein and Kimchi, TIBS Letters (1995) 20:242-244)。いくつかのデスドメイン含有タンパク質は、細胞障害性細胞内シグナル伝達に関与する(Cleveland and Ihle, Cell (1995) 81:479-482, Pan et al., Science (1997) 276:111-113; Duan and Dixit, Nature (1997) 385:86-89およびChinnaiyan et al., Science (1996) 274:990-992)。米国特許第５，５６３，０３９号は、ＴＲＡＤＤ（腫瘍壊死因子受容体−１関連デスドメイン含有タンパク質）と相同なタンパク質、および該タンパク質の機能的特徴を保持する、ＴＲＡＤＤの活性ドメインの修飾、ならびにかかるデスドメイン含有タンパク質の機能を試験するアポトーシス検査について記載している。米国特許第５，６５８，８８３号は、生物学的に活性なＴＧＦ−Ｂ１ペプチドを開示している。米国特許第５，６７４，７３４号は、Ｃ末端のデスドメインおよびＮ末端のキナーゼドメインを含有するタンパク質ＲＩＰを開示している。
白血病抑制因子（ＬＩＦ）
ＬＩＦプロファイルは、白血病抑制因子、ＣＴ−Ｉ（カルジオトロフィン−１）、ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）、ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）およびＩＬ−６（インターロイキン−６）の配列から構築される。このプロファイルは、肝細胞、破骨細胞、神経細胞および心臓細胞を含む多くの細胞タイプに多面発現効果がある分泌サイトカインのファミリーを包含し、かかるタンパク質をコードする追加の遺伝子を検出するのに使用することができる。これらの分子はすべて構造的に関連しており、ｓｒｃのような細胞質チロシンキナーゼによる細胞内シグナル伝達を仲介する共通の補助受容体ｇｐ１３０を共有する。
また、このファミリーに関連する新規タンパク質は、分泌され、ｇｐ１３０を活性化し、様々な細胞タイプの発生において機能する可能性が高い。したがって、このファミリーの新規メンバーは、それらが刺激する細胞タイプの成長因子または生存因子として開発される候補であろう。このサイトカインのファミリーに関する詳細については、Pennica et al., Cytokine and Growth Factor Reviews (1996)7:81-91を参照されたい。米国特許第５，４２０，２４７号はＬＩＦ受容体および融合タンパク質を開示している。米国特許第５，４４３，８２５号はヒトＬＩＰを開示している。
アンジオポイエチン
アンジオポイエチン−１は、ＴＩＥ−２チロシンキナーゼの分泌性リガンドであり、正常な血管発達に重要な血管新生因子として機能する。アンジオポイエチン−２は、アンジオポイエチン−１の天然アンタゴニストであり、したがって抗血管新生因子として機能する。これらの２つのタンパク質は構造的に類似しており、同じ受容体を活性化する(Folkman and D'Amore, Cell (1996) 87:1153-1155およびDavis et al., Cell (1996) 87:1161-1169)。
アンジオポイエチン分子は、２つのドメイン：コイルドコイル領域およびフィブリノーゲン関連領域から構成される。フィブリノーゲンドメインは、フィコリンおよびテネイシンを含む多くの分子中に見られ、多くのメンバーとともに構造上十分に規定されている。
受容体タンパク質−チロシンキナーゼ
受容体タンパク質−チロシンキナーゼ、すなわちＲＰＴＫは、Lindberg. Annu. Rev. Cell Biol. (1994) 10:25 1-337に記載されている。
成長因子：上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）
成長因子スーパーファミリーの考察に関しては、Growth Factors: A Practical Approach. Appendix A1 (Ed. McKay and Leigh, Oxford University Press, NY, 1993) pp.237-243を参照されたい。
ＥＧＦおよびＦＧＦに関するアライメント(pretty box)を、それぞれ図１および図２に示す。米国特許第４，４４４，７６０号は、酸性脳線維芽細胞成長因子を開示し、これは細胞分裂および創傷治癒の促進において活性を示す。米国特許第５，４３９，８１８号は、ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子をコードするＤＮＡを開示し、これは創傷治癒において活性を示す。米国特許第５，６０４，２９３号は、組換えヒト塩基性繊維芽細胞成長因子を開示し、これは創傷治癒に有用である。米国特許第５，４１０，８３２号は、脳由来の組換え酸性線維芽細胞成長因子を開示し、これは中胚葉および神経外胚葉に由来する培養細胞の分裂促進因子として作用し、軟組織、軟骨組織および筋骨格組織において創傷治癒を促進する。米国特許第５，３８７，６７３号は、活性を保持するＦＧＦの生物学的に活性な断片を開示している。
ＴＮＦファミリーのタンパク質
ＴＮＦファミリーから得られるプロファイルは、以下のＴＮＦファミリーのメンバー：神経成長因子（ＮＧＦ）、リンホトキシン、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＣＤ４０リガンド、ＴＲＡＩＬ、ｏｘ４０リガンド、４−ＩＢＢリガンド、ＣＤ２７リガンドおよびＣＤ３０−リガンドの配列を整列することにより作出される。このプロファイルは、このタンパク質ファミリーの新たなメンバーまたは相同体を構成するタンパク質の配列を同定するように設計される。
米国特許第５，６０６，０２３号は、ＴＮＦタンパク質の突然変異体を開示しており、米国特許第５，５９７，８９９号および米国特許第５，４８６，４６３号は、ＴＮＦ突然変異タンパク質を開示しており、米国特許第５，６５２，３５３号は、ＴＮＦ−ａの突然変異タンパク質をコードするＤＮＡを開示している。
ＴＮＦファミリーのタンパク質のメンバーは、Burrows et al., Biochem. (1994)33: 12741およびZhang et al., Mol. Cell. Biol. (1995) 154851に記載されるように多量体化すること、またBrowning et al., J. Immunol. (1994) 147:1230; Androlewicz et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 2542およびCrowe et al., Science (1994) 264:707に記載されるように受容体を結合することがin vitroで示されている。
ＴＮＦは、Kriegel et al., Cell (1988) 53:45およびMohler et al., Nature (1994) 370:218に記載されるように、in vivoで標的タンパク質をタンパク質分解的に切断し、細胞増殖および分化活性を明示する。Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖は、Armitage et al., Eur. J. Immunol. (1992) 22:447; Current Protocols in Immunology, ed. J.E. Coligan et al., 3.1-3.19; Takai et al., J. Immunol. (1986) 137:3494-3500; Bertagnoli et al., J. Immunol. (1990) 145:1706-1712; Bertagnoli et al., J. Immunol. (1991) 133:327-340; Bertagnoli et al., J. Immunol. (1992) 149:3778-3783およびBowman et al., J.Immunol. (1994) 152:1756-1761に記載されるように検査される。Ｂ細胞の増殖およびＩｇ分泌は、Maliszewski, J. Immunol. (1990) 144:3028-3033およびAssays for B cell Function: In vitro antibody production, Mond and Brunswick, Current Protocols in Immunol., Coligan Ed vol. 1 pp 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Tronto 1994; Kebrl et al., Science (1987) 238:1144およびBoussiotis et al., PNAS USA (1994) 91:7007に記載されるように検査される。
他のin vivo活性としては、Barrett et al., J. Immunol. (1991) 146:1722; Bjorck et al., Eur. J. Immunol. (1993) 23:1771; Clark et al., Annu Rev. Immunol. (1991) 9:97; Ranheim et al., J. Exp. Med. (1994) 177:925; Yellin, J. Immunol. (1994) 153:666およびGruss et al., Blood (1994) 84:2305に記載されるように、細胞表面抗原の増加調節、共刺激分子の増加調節および細胞集合／接着が挙げられる。
ＴＮＦに関してはまた、造血細胞およびリンパ球新生細胞の増殖および分化が、Johansson et al., Cellular Biology (1995) 15:141-151; Keller et al., Mol. Cell. Biol. (1993) 13:473-486; McClanahan et al., Blood (1993) 81: 2903-2915に記載されるように胚分化と造血の検査を用いて、およびCulture of Hematopoietic Cells, Freshney et al. eds, pp 1-21, 23-29, 139-162, 163-179, 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 1994およびHirajama et al., PNAS USA (1992) 89:5907-5911に記載されるように幹細胞の生存と分化を検出する検査を用いて、示されている。
ＴＮＦのin vivo活性としてはまた、リンパ球の生存およびアポトーシスが挙げられ、これは、Darzynkewicz et al., Cytometry (1992) 13:795-808; Gorczca et al., Leukemia (1993) 7:659-670; Itoh et al., Cell (1991) 66:233-243; Zacharduk, J. Immunol. (1990) 145:4037-4045; Zamai et al., Cytometry (1993) 14:891-897およびGorczyca et al., Int'l Oncol. (1992) 1:639-648に記載されるように検査される。
ＴＮＦファミリーのいくつかのメンバーは、細胞表面から切断され、他のメンバーは膜に結合された状態のままである。ＴＮＦの三次元構造が、上述のSprang and Eck, Tumor Necrosis Factorsにて検討されている。
ＴＮＦタンパク質は、膜貫通ドメインを含む。このタンパク質は、Kriegler et al., Cell (1988) 53:45-53; Perez et al., Cell (1990) 63:251-258およびShaw et al., Cell (1986) 46:659-667に記載されるように、より短い可溶型に切断される。ヒト型ＴＮＦαでは、膜貫通ドメインはアミノ酸４６〜７７間にあり、細胞質ドメインは位置１〜４５間にある。ＴＮＦの三次元モチーフは、２つのプリーツの付いたβシートのサンドイッチを含む。各シートは、逆平行のαストランドから構成され、サンドイッチの反対部位にて互いに面しているαストランドは、Van Ostade et al., Protein Engineering (1994) 7(1):5-22および上述のSprang et al., Tumor Necrosis Factorsに記載されるように、短いポリペプチドループで結合される。
βシート二次構造に関与するＴＮＦファミリータンパク質の残基は、上述のVan Ostade et al., Protein Engineering (1994) 7(1):5-22およびSprang et al., Tumor Necrosis Factorsに記載されるように、同定された。
ＴＮＦ受容体は、米国特許第５，３９５，７６０号に開示されている。ＴＮＦ受容体ファミリーから得られるプロファイルは、Ａｐｏ１／Ｆａｓ、ＴＮＦＲ ＩおよびＩＩ、デス受容体3（ＤＲ３）、ＣＤ４０、ｏｘ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０を含むＴＮＦ受容体ファミリーの配列を整列することにより作成される。したがって、このプロファイルは、本発明の核酸から、このタンパク質のファミリーの新たなメンバーまたは相同体を構成するタンパク質の配列を同定するように設計される。
腫瘍壊死因子受容体は、ヒトでは２つの形態：ｐ５５ＴＮＦＲおよびｐ７５ＴＮＦＲで存在し、その両方が、リガンドと結合すると細胞内シグナルを提供する。これらの受容体タンパク質の細胞外ドメインは、システインが豊富である。これらの受容体は、膜に結合した状態のままでありうるが、受容体のいくつかの形態は切断されて可溶性受容体を形成する。可溶性ＴＮＦ受容体の調節、診断的価値、予後的価値および治療的価値は、Aderka, Cytokine and Growth Factor Reviews, (1996) 7(3):231-240に検討されている。
ＰＤＧＦファミリー
米国特許第５，３２６，６９５号は、血小板由来成長因子アゴニストを開示し、ＰＤＧＦ−Ｂの生物活性部分はアゴニストとして使用される。米国特許第４，８４５，０７５号は、生物学的に活性なＢ鎖ホモ二量体を開示し、またＰＤＦＧ−Ｂ鎖の変異体および誘導体を含む。米国特許第５，１２８，３２１号は、ＰＤＧＦ類縁体およびその使用方法を開示している。ＰＤＧＦと同じ生物活性を有するタンパク質が開示されていて、これはＡ鎖およびＢ鎖タンパク質を含む。
キナーゼ（ＭＫＫを含む）ファミリー
米国特許第５，６５０，５０１号は、細胞の有糸分裂および減数分裂に関連するセリン／トレオニンキナーゼを開示し、このタンパク質は、そのＮ末端にキナーゼドメインを、Ｃ末端に３つのＰＥＳＴ領域を有する。米国特許第５，６０５，８２５号は、セリンタンパク質キナーゼであるヒトＰＡＫ６５を開示している。
上記の検討から、本発明の核酸と比較し得る数例のタンパク質プロファイルが提供される。当業者は、これらおよび他のタンパク質プロファイルを用いて、当該核酸と相関する遺伝子を同定することができる。
ＩＸ．コード発現産物の機能の測定
リボザイム、アンチセンス構築物、優性ネガティブ突然変異体、および三重鎖形成を用いて、核酸関連遺伝子の発現産物の機能を測定することができる。
Ａ．リボザイム
トランス切断触媒ＲＮＡ（リボザイム）は、エンドリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定の標的に関して特異的に設計され、標的メッセージは、特異的ヌクレオチド配列を含有しなくてはならない。それらは、バックグラウンドとしての細胞ＲＮＡ中において、いかなる種類のＲＮＡをも部位特異的に切断するように作出される。この切断はｍＲＮＡを不安定にし、タンパク質発現を抑制する。重要なことは、リボザイムは、in vitroまたはin vivoの状況にて表現型の効果を検出することにより、その機能を確定する目的で、未知の機能を有する遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。
１つの一般的に用いられるリボザイムモチーフはハンマーヘッド型であり、それに関する基質配列の要件は最少である。ハンマーヘッド型リボザイムの設計は、Usman et al., Current Opin. Struct. Biol. (1996) 6:527-533に開示されている。Usmanはまた、リボザイムの治療的使用も検討している。またリボザイムを、Long et al., FASEB J. (1993) 7:25; Symons, Ann. Rev. Biochem. (1992) 61:641; Perrotta et al., Biochem. (1992) 31:16-17; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1992) 89:10802-10806および米国特許第５，２５４，６７８号に記載されるように、調製し使用することができる。HIV-I RNAのリボザイム切断が、米国特許第５，１４４，０１９号に記載され、リボザイムを用いたＲＮＡの切断方法が、米国特許第５，１１６，７４２号に記載され、リボザイムの特異性を増加させる方法が、米国特許第５，２２５，３３７号およびKoizumi et al., Nucleic Acid Res. (1989) 17:7059-7071に記載されている。ハンマーヘッド構造のリボザイム断片の調製と使用もKoizumi et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17:7059-7071に記載されている。ヘアピン構造のリボザイム断片の調製と使用が、Chowrira and Burke, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2835に記載されている。リボザイムはまた、Daubendiek and Kool, Nat. Biotechnol. (1997) 15(3):273-277に記載されるように、回転転写により作製され得る。
リボザイムのハイブリダイズ領域は、Horn and Urdea, Nucleic Acids Res. (1989) 17:6959-67に記載されるように、分枝状構造として修飾または調製することができる。リボザイムの基本構造はまた、当業者に公知の方法により化学的に改変されてもよく、化学的に合成されたリボザイムを、単量体ユニットにより修飾された合成オリゴヌクレオチド誘導体として投与することができる。治療では、Birikh et al., Eur. J. Biochem. (1997) 245:1-16に記載されるように、リボザイムをリポソームにより送達して、細胞内取り込みを改良する。
本発明の核酸配列および当該技術分野にて既知の方法を用いて、リボザイムを、相当する種類のｍＲＮＡと特異的に結合して、それを切断するように設計する。したがって、リボザイムは、ここに開示する核酸またはそれらの完全長遺伝子によりコードされるいずれかのタンパク質の発現を抑制する手段を提供する。特異的な抑制リボザイムを設計および使用するために、完全長の遺伝子が分かる必要はない。機能未知の核酸またはｃＤＮＡの場合には、そのヌクレオチド配列に相当するリボザイムを、標的転写物を切断する効力に関してin vitroで検査することができる。In vitroで切断を行うリボザイムは、さらにin vivoで検査される。リボザイムはまた、Birikh et al., Eur. J. Biochem. (1997) 245:1-16に記載されるように、疾患用動物モデルを作るために使用することができる。有効なリボザイムを用いて、遺伝子の転写を妨害し、細胞の変化を検出することにより、注目遺伝子の機能を確定する。遺伝子が疾患を媒介することが分かっている場合、その遺伝子の転写および発現を妨害するために、遺伝子治療において有効なリボザイムを設計し、送達する。
リボザイムの治療適用および機能的ゲノム適用は、抑制されるべき遺伝子のコード配列の一部を知ることから始まって進行する。したがって多くの遺伝子に関して、部分的核酸配列から、有効なリボザイムを構築するのに適した配列が提供される。標的切断部位は、標的配列内にて選択され、リボザイムは、切断部位に隣接する５’および３’ヌクレオチド配列に基づいて構築される。レトロウイルスベクターを、標的コード配列のｍＲＮＡを標的とする単量体および多量体のハンマーヘッド型リボザイムを発現するように作成する。これらの単量体および多量体リボザイムについて、標的ｍＲＮＡを切断する能力を、in vitroで検査する。リボザイムを発現するレトロウイルスベクターにより細胞株を安定に形質導入して、その形質導入を、ノーザンブロット分析および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により確認する。これらの細胞を、標的ｍＲＮＡの不活性化に関して、疾患マーカーの発現低下、または標的ｍＲＮＡの遺伝子産物の低下などの指標によりスクリーニングする。
Ｂ．アンチセンス
アンチセンス核酸は、ＲＮＡに特異的に結合するよう設計され、その結果RNA-DNAまたはRNA-RNAハイブリッドを形成し、これに伴ってＤＮＡ複製、逆転写、またはメッセンジャーＲＮＡの翻訳が停止する。選択核酸配列に基づいたアンチセンスポリヌクレオチドは、対応する遺伝子の発現を妨害しうる。アンチセンスポリヌクレオチドは、典型的には、転写鎖としてアンチセンス核酸鎖を含有するアンチセンス構築物からの発現により、細胞内に生成する。アンチセンス核酸は、核酸関連ｍＲＮＡに結合し、および／またはその翻訳を妨げるであろう。対照細胞およびアンチセンス構築物で処理した細胞の発現産物を比較して、その核酸に対応する遺伝子のタンパク質産物を検出する。日常的な生化学的方法を用いて、そのタンパク質を単離して同定する。
核酸に対応する遺伝子の機能を決定するためにアンチセンス法を用いる１つの根拠は、アンチセンス治療法の生物学的機能である。様々な癌のアンチセンス治療は臨床段階にあり、文献で広く検討されている。Reedは、腫瘍におけるBcl-2遺伝子に対するアンチセンス治療について概説した；腫瘍細胞株における遺伝子導入を介したBcl-2の過剰発現は、多くのタイプの癌薬剤に対して耐性を与えた (Reed, J.C., N.C.I. (1997) 89:988-990)。Cowsert, L.M., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:359-371ではrasのアンチセンス阻害剤の臨床開発の可能性が検討されている。他の重要なアンチセンス標的としては白血病(Geurtz, A.M., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:341-358)、ヒトC-refキナーゼ(Monia, B.P., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:327-339)、およびプロテインキナーゼＣ(McGraw et al., Anti-Cancer Drug Design (1997) 12:315-326)が挙げられる。
アンチセンス治療における広範な背景文献および臨床経験に基づいて、当業者は、追加治療として、選択した本発明の核酸を使用することができる。核酸の選択範囲は、最初に核酸を癌細胞のゲノムの「ホットスポット」領域への結合について検査することにより、絞ることができる。ある核酸が「ホットスポット」に結合すると同定された場合には、相当する癌細胞においてその核酸をアンチセンス化合物として検査することが明確に是認される。
Ogunbiyi et al., Gastroenterology (1997) 113(3):761-766は、結腸癌における難聴の予後的な使用を記載し、Barks et al., Genes, Chromosomes, and Cancer (1997) 19(4):278-285は、悪性黒色腫においてＦＩＳＨにより検出される染色体コピー数の増加を記載し、Nishjzake et al., Genes. Chromosomes, and Cancer (1997) 19(4):267-272は、原発性乳癌およびそれらの転移における遺伝的変化、ならびに改変された比較ゲノムハイブリダイゼーションを用いた直接比較を記載し、Elo et al., Cancer Research (1997)57(16):3356-3359は、16z24.1〜q24.2におけるヘテロ接合性の損失が、前立腺癌の転移性および攻撃的挙動に有意に関係することを開示する。
Ｃ．優性ネガティブ突然変異
核酸関連遺伝子の機能を同定するための代わりの方法として、ホモ多量体の形で活性である対応タンパク質において、優性ネガティブ突然変異を容易に生じさせる。突然変異ポリペプチドは、（他方の対立遺伝子から作製される）野生型ポリペプチドと相互作用し、非機能性の多量体を形成する。したがって、突然変異は、基質結合ドメイン、触媒ドメイン、または細胞局在化ドメイン中に存在する。好ましくは、突然変異ポリペプチドは過剰産生されるであろう。かかる効果を有する点突然変異が作られる。さらにタンパク質の末端に様々な長さの異なるポリペプチドを融合して、優性ネガティブ突然変異体を生じさせうる。優性ネガティブ突然変異体を作製するための一般的な方策を利用できる。Herskowitz, Nature (1987) 329:219-222を参照されたい。かかる技術は、機能損失変異を作るために用いることができ、これはタンパク質の機能を決定するのに有用である。
Ｄ．三重鎖形成
また内因性遺伝子の発現を、標的相同組換えを用いてその遺伝子またはそのプロモーターを不活性化または「ノックアウト」することにより、低減させることができる（例えば、Smithies et al., 1985, Nature 317:230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51:503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5:313-321を参照）。例えば、選択マーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーの有無に関わらず、内在性遺伝子（遺伝子のコード領域または調節領域）に相同性であるＤＮＡにより挟み込んだ変異した非機能化遺伝子（または全く無関係なＤＮＡ配列）を、in vivoでその遺伝子を発現する細胞に導入することができる。標的相同組換えを介して該ＤＮＡ構築物を挿入することにより、遺伝子が不活性化される。
あるいは内因性遺伝子の発現を、標的遺伝子の調節領域（すなわち遺伝子プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を供給して、体内の標的細胞の遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成させることにより、低減することができる（一般にHelene, C. 1991,Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et.al., 1992, Ann, N.Y. Acad. Sci., 660:27-396およびMaher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15を参照）。
転写を阻害するために三重らせんの形成において用いられる核酸分子は、好ましくは一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Hoogsteenの塩基対規則により三重らせん形成を促進するべきであり、それは一般に、プリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長が、二重鎖のうちの一本鎖に存在することを必要とする。ヌクレオチド配列はピリミジン系であってよく、それらは生成する三重らせんの３つの関連鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットを生じるであろう。ピリミジンに富んだ分子は、二重鎖のうちの一本鎖のプリンに富んだ領域に対して、その鎖に平行な方向で、塩基相補性を示す。さらに、例えばＧ残基の伸長を含むプリンに富んでいる核酸分子が選択されてもよい。これらの分子は、ＧＣ対に富んだＤＮＡ二重鎖（ここではほとんどのプリン残基が、標的二重鎖の一方の鎖に位置する）と共に三重らせんを形成し、その結果、三重鎖の３つの鎖にわたってＣＧＣトリプレットが生じるであろう。
あるいは、三重らせん形成のために標的にされる潜在的な配列は、「スイッチバック」と呼ばれる核酸分子を作ることにより増やすことができる。スイッチバック分子は、最初に二重鎖の一方の一本鎖と、次に他方の一本鎖と塩基対をなすように交互に５’−３’、３’−５’の様式で合成され、これにより、プリンまたはピリミジンのかなり大きい伸長が、二重鎖のうちの一本鎖に存在することが必要でなくなる。
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイムならびに三重らせん分子は、当該技術分野に既知のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成方法によって調製することができる。これらには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成など、オリゴデオキシリボヌクレオチドやオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための周知の技術を含む。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroおよびin vivo転写により生成される。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれた多様なベクター内に組み込まれうる。あるいは、使用するプロモーターに依存して構成的または誘発的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞株に安定に導入することができる。
さらに、核酸分子への様々な周知の修飾を、細胞内安定性および半減期を高める手段として導入してもよい。可能な修飾としては、該分子の５’および／または３’末端へのリボヌクレオチドまたはデオキシシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、あるいはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内の、ホスホジエステラーゼ結合よりもむしろホスホロチオエート結合または２’−Ｏ−メチル結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
Ｘ．診断検査および予後検査、および薬剤スクリーニング方法
本発明は、癌患者、および／または健康患者、および／または癌が疑われている患者からの生物学的試料を分析するための検査法であって、配列番号１〜８または９〜１６の１つまたは複数を含有する配列の差異的な発現を検出および測定して、こられの遺伝子配列の１つまたは複数の発現レベルが、正常患者における発現レベルと比べて高いか否かを決定する検査法を提供する。あるいは、本発明は、癌患者、および／または健康患者、および／または癌が疑われている患者からの生物学的試料を分析するための検査方法であって、配列番号９〜１６の１つまたは複数によりコードされる蛋白質のレベル、または配列番号１７〜２４の１つまたは複数のアミノ酸配列を有する蛋白質のレベルを検出および測定して、癌患者におけるこられの蛋白質の１つまたは複数のレベルが、正常患者における各レベルと比べて高いか否かを決定する検査方法を提供する。正常患者と比べて癌患者において配列番号１〜８または９〜１６の１つまたは複数の差異的発現レベルの測定可能または検出可能な増加が、あるいは配列番号１７〜２４の１つまたは複数の蛋白質発現の増加が決定されることにより、患者の疾患状態を監視する手段、および／または癌治療に対する患者の応答や利点、例えば従来の抗癌的および抗腫瘍疾患的な処置および治療（例えば薬剤、ホルモンなど）またはより特には本発明の遺伝子配列またはコード蛋白質のうち１つまたは複数を標的とする処置および治療に対する患者の応答や利点を監視する手段が提供される。
本明細書では、用語「バイオマーカー」または「生物学的マーカー」は、配列番号１〜８または９〜１６のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数、および／または配列番号１７〜２４のポリペプチド配列の１つまたは複数を指す。当業者は容易に認識するであろうが、例えばノーザン分析によるバイオマーカーの検出に言及する場合には、用語「バイオマーカー」は、配列番号１〜８または９〜１６のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数の検出を意味し、したがってまた、例えばELISAによるバイオマーカー発現の検出に言及する場合には、用語「バイオマーカー」は、配列番号１７〜２４のポリペプチド配列の１つまたは複数を意味する。
本発明は、ここに開示したバイオマーカー、すなわち開示した核酸マーカー（配列番号１〜８または９〜１６、またはそれらに相補的な配列、あるいは配列番号１〜８または９〜１６の１つまたは複数にハイブリダイズする配列）、および／またはそれらによりコードされる疾患または症状のポリペプチドマーカーを検出することにより、患者において、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患や症状が発現する危険性があるかどうかを決める方法を提供する。
臨床用途では、ヒト組織試料を、本明細書にて同定されたバイオマーカーの有無に関してスクリーニングすることができる。かかる試料は、組織試料、全細胞、細胞溶解物、または単離核酸を含み、例えば針生検コア、外科的切除試料、リンパ節組織または血清を含む。例えば、上記方法は、生検試料を獲得することを含み、場合によりそれを冷凍切片化して、全細胞集団の約８０％まで腫瘍細胞を高めることにより分画する。ある実施形態では、これらの試料から抽出した核酸を、当該技術分野にて周知の技術を用いて増幅することができる。検出された選択マーカーレベルを、転移性、非転移性悪性、良性または正常の結腸組織試料の統計的に有意な群と比較する。
一つの態様では、該診断方法は、患者が、開示マーカーのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質について異常なレベルを有するかどうか、例えばノーザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、in situハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学などにより決定することを含む。該方法では、患者から細胞を獲得して、開示バイオマーカーであるタンパク質またはｍＲＮＡのレベルを測定して、健常者におけるこれらのマーカーのレベルと比較する。バイオマーカーのポリペプチドまたはｍＲＮＡの異常レベルは、結腸癌などの癌を示唆する可能性が高い。
したがって一つの態様では、本発明は、本明細書中に開示する特有の核酸マーカーに特異的なプローブおよびプライマーを提供する。したがってこの核酸プローブは、配列番号１〜８または９〜１６の配列に実質的に相補的である核酸にハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜８または９〜１６の核酸配列の一領域を含む。プローブ／プライマーとしての使用に好ましい核酸分子はさらに、配列番号１〜８または９〜１６の配列とハイブリダイズするのに十分な、配列番号１〜８または９〜１６の配列に実質的に相補的である核酸配列の一領域を含むことができる。さらに、プローブ／プライマーとして有用な核酸配列は、配列番号１〜８または９〜１６あるいはそれらに相補的な配列によって表されるマーカー核酸配列のコード配列の一部分に相補的である、当該コード配列中の少なくとも約８個のヌクレオチド長、少なくとも約１２個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは約２５個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０個のヌクレオチドから全長またはほぼ全長までのヌクレオチド配列を含む。
一つの態様では、上記方法は、核酸プローブを用いて患者由来の組織中において癌細胞の存在を確認することを含み、これは配列番号１〜８の１つまたは複数の配列を含有する配列の存在を検出することを含む。
具体的には、上記方法は、下記：
1. 配列番号１〜８または９〜１６あるいはそれらに相補的な配列によって表される核酸配列のコード配列の一部分に相補的であり、かつ結腸癌細胞などの腫瘍細胞中に差異的に発現される当該コード配列中の少なくとも約８個のヌクレオチド長、少なくとも約１２個のヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは約２５個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチドから全長またはほぼ全長までのヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供すること；
２．癌細胞を潜在的に含む患者から組織試料を得ること；
３．実質的にその全てが非癌性である細胞を含有する第２の組織試料を提供すること；
４．核酸プローブを、ストリンジェント条件下で、第１および第２の組織試料の各ＲＮＡと接触させること（例えばノーザンブロット検査またはin situハイブリダイゼーション検査において）；および
５．（ａ）該プローブと第１組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と、（ｂ）該プローブと第２組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーション量とを比較すること、そして第１組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーション量が、第２組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーション量と比較して統計学的に有意な差異があるとき、それが第１組織試料中の癌細胞の存在を意味すること、を含む。
一つの態様では、上記方法は、配列番号１〜８または９〜１６あるいはそれらに相補的な配列によって表される所定のマーカー核酸配列から得られるプローブによるin situ ハイブリダイゼーションを含む。この方法は、癌細胞または前癌細胞ならびに標準細胞を潜在的に含有する所定の型の組織試料と、標識化ハイブリダイゼーションプローブを接触させ、そしてそのプローブが、所定の組織型の他の細胞を標識する程度に比べて有意に異なる程度で（例えば、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍で）同じ組織型の一部の細胞を標識するかどうかを確認することを含む。
所定のヒト組織由来の試験細胞の表現型、例えばその細胞が（ａ）正常あるいは（ｂ）癌性または前癌状態であるかどうかを確認する方法であって、試験細胞のｍＲＮＡを、配列番号９〜１６またはそれらに相補的な配列によって表される核酸配列のコード配列の一部分に相補的であり、かつ所定の組織型の正常細胞に比較して腫瘍細胞において差異的に発現される配列中の少なくとも約８個のヌクレオチド長、好ましくは約１２個、好ましくは約１５個、好ましくは約２５個、より好ましくは約４０個のヌクレオチド長から全長またはほぼ全長までの核酸プローブと接触させること、およびｍＲＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションの概算量を測定することを含み、ここでその組織型の正常細胞のｍＲＮＡで見られる量よりも多い、または少ないハイブリダイゼーション量が、試験細胞が癌性または前癌状態であることを示す方法もまた本発明の範囲内である。
あるいは、上記診断検査は、マーカー核酸配列（この核酸配列は、配列番号１〜８または９〜１６あるいはそれらに相補的な配列により表される）によりコードされるタンパク質産物を検出するための抗体を用いて行うことができる。好ましくは、このタンパク質産物は、配列番号１７〜２４の１つまたは複数の配列を有するものである。したがって、一実施形態では、この検査は、試験細胞のタンパク質を、配列番号９〜１６あるいはそれらに相補的な配列により表される核酸の遺伝子産物に特異的な抗体と接触させること、ただし該マーカー核酸配列は、試験細胞と同じ組織型の正常細胞において所定の対照レベルにて発現されるものであること；そして抗体および試験細胞のタンパク質により形成された免疫複合体の概算量を測定することを含み、ここで試験細胞のタンパク質とともに形成された免疫複合体の量が、同じ組織型の正常細胞に比較して統計学的に有意な差異があるとき、試験細胞が癌性または前癌状態であることを示す。
別のかかる方法は、配列番号９〜１６あるいはそれらに相補的な配列により表されるマーカー核酸配列の遺伝子産物に特異的な抗体を提供する工程、ただしこの遺伝子産物は、所定の組織型の非癌性組織における遺伝子産物レベルよりも多いまたは少ないレベルで、同じ組織型（例えば結腸組織）の癌組織に存在するものである；所定の組織型の組織の第１試料を患者から得る工程、ただしこの試料は癌性細胞を含む可能性がある；同じ組織型の組織の第２の試料（同じ患者または正常対照物（例えば別の個体または培養細胞）に由来するものでよい）を得る工程、ただしこの第２試料は、正常細胞を含有し、本質的に癌細胞を含有しない；上記抗体と試料中に存在するマーカー核酸配列産物との間で免疫複合体を形成する条件下で、第１および第２の試料のタンパク質（部分精製したもの、細胞が溶解されているが分画されていないもの、あるいは現場(in situ)のもの）と、上記抗体とを接触させる工程；及び（ａ）第１試料中での免疫複合体の形成量を、（ｂ）第２試料中での免疫複合体の形成量と比較する工程を含み、ここで第１試料における免疫複合体形成量が第２試料における免疫複合体形成量と比較して少ないことが統計学的に有意な差異であるとき、組織の第１試料における癌細胞の存在を示す。
本発明はさらに、被験者から得た細胞試料が、異常量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する方法であって、（ａ）被験者から細胞試料を得ること、（ｂ）そのようにして得た試料におけるマーカーペプチドの量を定量的に測定すること、そして（ｃ）そのようにして測定したポリペプチド量を、既知の標準物質と比較して、それにより被験者から得た細胞試料が、異常量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定することを含む方法を提供する。かかるマーカーポリペプチドは、免疫組織化学検査、ドットブロット検査、ＥＬＩＳＡ等により検出し得る。
免疫検査は、細胞試料におけるタンパク質レベルを定量化するのに一般的に用いられ、多くの他の免疫検査技術が当該技術分野にて既知である。本発明は、特定の検査手法に限定されず、したがって同種的および異種的な方法の両方を含む。本発明により実施し得る典型的な免疫検査としては、蛍光偏光免疫検査（ＦＰＩＡ）、蛍光免疫検査（ＦＩＡ）、酵素免疫検査（ＥＩＡ）、比濁阻害免疫検査（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検査（ＥＬＩＳＡ）、および放射性免疫検査（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分、すなわち標識基は、対象抗体に結合することができ、様々な使用方法の要件（多くの場合検査装置の有無および適合する免疫検査手法により決まる）に適合するように選択される。上述の様々な免疫検査を実施する際に使用される一般技術は、当業者に既知である。
別の実施形態では、患者の生物学的液体（例えば血液または尿）中の当該コード産物、すなわち配列番号９〜１６またはそれらに相補的な配列によりコードされる産物のレベルは、患者の細胞におけるマーカー核酸配列の発現レベルをモニターする手段として測定することができる。かかる方法は、患者から生物学的液体試料を採取する工程；この試料（または試料由来のタンパク質）をコードされたマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程；そして抗体による免疫複合体の形成量を測定する工程を含み、免疫複合体形成量は、試料中のマーカーのコード産物のレベルを示す。この測定は、正常個体から得た対照試料、または同じ個人から予めもしくはその後に得た１または複数の試料における同一抗体による免疫複合体の形成量と比較したときに特に有益である。
別の実施形態では、上記方法を使用して、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を測定することができ、その量は過剰増殖疾患、例えば結腸癌の進行に相関する可能性がある。マーカーポリペプチドレベルを予測的に使用して、細胞試料が形質転換細胞であるか、または形質転換細胞になりやすいものであるどうかを評価することができる。さらに、本方法を使用して、形質転換されることが知られている細胞の表現型を評価することができ、表現型決定の結果は、特定の治療処方を計画する際に有用である。例えば、試料細胞中の非常に高レベルのマーカーポリペプチドは、結腸癌のような癌の強力な診断および予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察は、例えばより強力な治療を行うことを決断する際に有用であろう。
本発明の方法が、生物学的試料中の蛋白質レベル（すなわち配列番号１７〜２４の１つまたは複数のレベル）の決定および／または測定を含む場合、配列番号１７〜２４の１つまたは複数に特異的に結合する抗体を作製することができ、そしてこの抗体を、蛋白質発現を検出するための公知の種々の方法、例えば、限定ではないが、ＥＬＩＳＡ、免疫検査、リガンド結合検査、レクチン結合検査、親和性クロマトグラフィーなどに従って用いることができる。本発明のペプチドに対する抗体、あるいはそれらの抗原性または免疫原性エピトープは、例えばポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。本発明の検査での使用に適する抗体には、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、並びにFab、F(ab’)2またはFv断片、あるいはファージディスプレイライブラリー、例えばFab発現ライブラリーの生成物もまた含まれる。当該技術分野に既知の種々の方法を用いて、かかる抗体および抗体断片を作製できる。本発明で使用する抗体の作製に用いられるファージディスプレイ法の例が、Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene, 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology, 57:191-280; および米国特許5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743および5,969,108に開示されている。
配列番号１７〜２４の１つまたは複数のペプチドに対する抗体は、配列番号１７〜２４の１つまたは複数を含有する免疫原性ポリペプチド調製物を動物に直接的に注入することにより、あるいは該ポリペプチドの全部または一部を動物に、好ましくはヒト以外の動物に投与することにより作製することができる。モノクローナル抗体の調製では、細胞株の連続培養により抗体を生産する任意の方法を用いることができる。その例として、ハイブリドーマ法(Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbor et al., 1983, Immunol. Today, 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を作製するEBV-ハイブリドーマ法(Cole et al., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が挙げられる。単鎖抗体の作製に関して記載された技術（米国特許4,946,778）を用いて、uPA、PAI-1、および／またはuPA:PAI-1 PAシステム分析被検体に対する単鎖抗体を作製することができる。また、トランスジェニックマウスを用いて、配列番号１７〜２４のポリペプチドに対するヒト化抗体を発現させることができる。
上述のように、本発明の一態様は、患者から単離した生物学的試料に関して、マーカーポリペプチド（例えば配列番号１７〜２４）のレベルが、その試料細胞において有意に低下しているかどうかを決定する診断検査に関する。「低下している」という用語は、第２の時点で患者から得た生物学的試料を測定して、それを第１の時点で同一患者から得た同様（例えば同一の組織または細胞型）の生物学的試料と比べた場合に、本発明のポリペプチドの発現レベルが、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、４０％、６０％ないし１００％まで低下している状態を指す。第１の時点と第２の時点は、治療前または治療後であってもよく、あるいは治療中の連続した時点であってもよい。特に、この検査では、検査細胞におけるマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは、その測定したレベルを、少なくとも１つの対照細胞、例えば正常細胞および／または既知の表現型を有する形質転換細胞にて検出されるマーカーポリペプチドレベルと比較する。
本発明にとって特に重要なのは、正常または異常なマーカーポリペプチドレベルを有するとされる細胞の数により決定されるマーカーポリペプチドレベルの定量化である。次に、特定のマーカーポリペプチドの表現型を有する細胞の数を、患者の予後と相関させる。本発明の一態様では、病巣のマーカーポリペプチドの表現型は、生検材料において、異常に高／低レベルのマーカーポリペプチドを有することが判明した細胞のパーセントとして決定される。かかる発現は、免疫組織化学検査、ドットブロット検査、ＥＬＩＳＡ等により検出される。
組織試料を用いる場合、免疫組織化学染色を使用して、マーカーポリペプチドの表現型を有する細胞の数を決定することができる。かかる染色に関して、組織の複数ブロックを、生検材料または他の組織試料から取り出し、プロテアーゼＫやペプシンのような薬剤を用いたタンパク質加水分解に供する。ある態様では、試料細胞から核分画を単離し、核分画におけるマーカーポリペプチドレベルを検出するのが望ましい。
組織試料は、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等の試薬を用いた処理により固定する。次に、マーカーポリペプチドに結合特性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体とともに試料をインキュベートする。この抗体は、次の結合検出のために標識と結合させてもよい。免疫複合体の形成に十分な時間、試料をインキュベートする。次に、抗体の結合を、この抗体に結合した標識によって検出する。抗体が標識化されていない場合は、例えば抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに特異的な二次標識抗体を使用してもよい。使用することができる標識の例としては、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素等が挙げられる。
酵素を用いる場合、酵素基質を試料に添加して、着色生成物または蛍光生成物を生成させてもよい。結合体での使用に適した酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。市販されていない場合、かかる抗体−酵素結合体を、当業者に既知の技術により容易に作ることができる。
一態様では、検査をドットブロット検査として実施する。ドットブロット検査は、組織試料が用いられる場合に特に有用である。なぜなら既定の細胞数から得られる無細胞抽出物におけるマーカーポリペプチド量と相関させることにより、単一細胞に関連したマーカーポリペプチドの平均量を決定できるからである。
癌文献から、同じ型の腫瘍細胞（例えば胸部および／または結腸腫瘍細胞）でも、各癌遺伝子の均一な発現増加や各腫瘍サプレッサー遺伝子の均一な発現低下を示さないことがあることが良く分かっている。また所定の型の癌細胞間でさえも所定のマーカー遺伝子の発現レベルが変化する場合もあり、単一検査よりむしろ一連の検査を信頼する必要性がさらに重要視される。したがって一態様では、本発明は、診断検査の信頼性および／または精度を改善するために、多数の本発明のプローブを利用する一連の検査を提供する。
一実施形態では、本発明はまた、核酸プローブを、組織化されたアレイの形のＤＮＡチップ上に固定する方法を提供する。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィを含む様々なプロセスにより固体支持体に結合することができる。例えば、チップは、最大２５００００個のオリゴヌクレオチドを保持することができる(GeneChip, Affymetrix)。これらの核酸プローブは、配列番号９〜１６により表されるマーカー核酸配列のコード配列の一部に相補的であり、かつ、結腸癌細胞のような腫瘍細胞において差異的に発現される配列のうち少なくとも約８個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１２個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２５個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチドの長さから、全長またはほぼ全長までのヌクレオチド配列を含む。本発明は、単一チップ上のマーカー核酸のアレイを使用することにより検査の信頼性が高まるので、結腸癌などの様々な癌に関する利用可能な検査に対して著しく有利になる。
上記方法は、生検材料を獲得することを含み、場合によってはこれを低温切片の作製により分画を行って、全細胞集団の約８０％まで腫瘍細胞の割合を高めうる。次にＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、増幅して、ＤＮＡチップを用いて分析し、マーカー核酸配列の存在または非存在を決定する。
一実施形態では、核酸プローブは、二次元マトリックスまたはアレイの形で基材上にスポットすることができる。核酸試料を標識化した後、プローブにハイブリダイズすることができる。プローブ核酸に結合された標識化核酸試料を含んでなる二本鎖核酸を、試料中の未結合部分を洗い流してから、検出することができる。
プローブ核酸を、ガラス、ニトロセルロース等を含む基材上にスポットし得る。プローブを、共有結合、または疎水性相互作用のような非特異的相互作用により基材に結合し得る。核酸試料を、放射性標識、蛍光団、発色団等を用いて標識化し得る。
アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを使用する方法が、欧州特許第０７９９８９７号、ＰＣＴ国際公開第９７／２９２１２号、ＰＣＴ国際公開第９７／１２７３１７号、欧州特許第０７８５２８０号、ＰＣＴ国際公開９７／０２３５７号、米国特許第５，５９３，８３９号、米国特許第５，５７８，８３２号、欧州特許第０７２８５２０号、米国特許第５，５９９，６９５号、欧州特許第０７２１０１６号、米国特許第５，５５６，７５２号、ＰＣＴ国際公開第９５／２２０５８号、および米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。
さらにアレイは、遺伝子の差異的発現を検査するために使用することができ、また遺伝子機能を決定するために使用することができる。例えば、当該核酸配列のアレイを用いて、核酸配列のいずれかが、正常細胞と癌細胞との間で差異的に発現しているかどうかを決定することができる。対応する正常細胞においては観察されない、癌細胞における特定のメッセージの高発現から、癌特異的タンパク質の存在を示すことができる。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１７〜２４である本発明のマーカーポリペプチドに対して作製された抗体のパネルを用いることを意図している。かかる抗体パネルは、結腸癌に対する信頼できる診断プローブとして使用することができる。本発明の検査は、細胞（例えば、結腸細胞）を含有する生検試料を、１つまたは複数のコード産物に対する抗体のパネルと接触させて、マーカーペプチドの存在または非存在を決定することを含む。
本発明の診断方法はまた、治療後の追跡検査として使用することができる。例えば、マーカーポリペプチドレベルを定量することにより、現在行っている、または既に行った癌治療の有効性、ならびに患者の予後に対する治療の効果を指摘し得る。
したがって本発明は、例えば細胞の腫瘍原性形質転換から生じる増殖性疾患の診断およびその表現型の決定を補助するために、細胞におけるマーカーペプチドの獲得および／または損失を検出する診断検査および試薬を利用可能にする。
上述の診断検査は、同様に予後検査としての使用に適するようにすることができる。かかる適用では、本発明の検査が、腫瘍の進行中の特徴的病期に起きる症状を感知できることを利用する。例えば、所定のマーカー遺伝子は、非常に早期に、おそらく細胞が不可逆的に悪性になる前に、増加調節または減少調節され、他方で別のマーカー遺伝子は、もっと後期でのみ特徴的に増加調節または減少調節されうる。かかる方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、腫瘍進行の異なる病期で癌細胞または前癌細胞において異なる特徴的なレベルで発現される所定のマーカー核酸に由来する核酸プローブと接触させる工程と、細胞のｍＲＭＡへのプローブのハイブリダイゼーションの概算量を測定する工程とを含み、かかる量が、細胞における遺伝子発現レベルを示し、したがって細胞の腫瘍進行の病期を示す。あるいはこの検査は、所定のマーカー核酸の遺伝子産物に特異的な抗体を用いて行われ、これを試験細胞のタンパク質と接触させる。一連のかかる試験は、腫瘍の存在および位置を明らかにするだけでなく、臨床医が、最適な腫瘍の治療様式を選択すること、その治療の成功の見込みを予想することを可能にするであろう。
また本発明の方法を、腫瘍の臨床経過を追跡するのに使用することができる。例えば、本発明の検査を、患者からの組織試料に適用することができる。すなわち、患者の癌治療後に、別の組織試料を取り出し、検査を繰り返す。治療が成功すれば、癌細胞または前癌細胞に特徴的な差異的発現を示す全細胞が取り除かれ、あるいはこれらの細胞における遺伝子の発現が実質的に増加し、おそらく正常レベルになるか、もしくは正常レベルを上回ることとなる。
さらに別の実施形態では、本発明は、患者が、配列番号１７〜２４のいずれかのポリペプチドの異常活性に関連した疾患、例えば癌（例えば結腸癌）を発症する危険性、例えばそのような疾患になる素質があるかどうかを決定する方法を提供する。ここでポリペプチドの異常活性は、（ｉ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす変化または（ii）コード核酸の誤発現のうち少なくとも１つを特徴とする遺伝的損傷の有無を検出することにより評価される。例えば、かかる遺伝的損傷は、(i) 核酸配列からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、(ii)核酸配列への１つ以上のヌクレオチドの付加、(iii)核酸配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、(iv)核酸配列の総染色体上の再配置、(v)核酸配列のメッセンジャーＲＮＡ転写物レベルにおける総変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのような、核酸配列の異常修飾、(vii)遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)マーカーポリペプチドの非野生型レベル、(ix)遺伝子の対立遺伝子損失、および／または(x)マーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾のうち、少なくとも１つの存在を確かめることにより検出することができる。
本発明は、コード核酸配列における損傷を検出するための検査技術を提供する。これらの方法としては、配列分析、サザンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを含む方法、および分析対象の核酸とプローブと間のヌクレオチド対形成の非存在の検出を含む方法が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の疾患または障害（例えば遺伝的疾患または障害）は、特定の遺伝子の多型領域の特異的対立遺伝子変異体（これは必ずしも突然変異タンパク質をコードしない）が関与する。したがって被験者における遺伝子の多型領域の特異的対立遺伝子変異体の存在により、その被験者は特定の疾患または障害を発症しやすくなる。遺伝子内の多型領域は、個体の集団において遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより同定することができる。多型領域が同定されると、個体の特定集団（例えば、結腸癌のような特定疾患を発症した個体）を研究することにより、特定疾患との関連を確認することができる。多型領域は、遺伝子のいかなる領域にも、例えばエキソンに、エキソンのコード領域または非コード領域に、イントロンに、およびプロモーター領域に見出される。
典型的な実施形態では、ある遺伝子または天然に存在するその突然変異体のセンスもしくはアンチセンス配列に、あるいは対象遺伝子もしくは天然に存在するその突然変異体に天然において結合している５’もしくは３’フランキング配列またはイントロン配列に、ハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列領域を含む核酸プローブを含む核酸組成物を提供する。細胞の核酸を、ハイブリダイゼーションするように処理して、プローブを試料の核酸と接触させて、試料核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを検出する。かかる技術は、欠失、置換等などの、ゲノムまたはｍＲＮＡレベルにおける損傷または対立遺伝子変異体を検出するために、ならびにｍＲＮＡ転写物レベルを測定するために使用することができる。
好ましい検出方法は、突然変異または多型部位に重複し、かつ突然変異または多型領域の周囲にある約５個、１０個、２０個、２５個または３０個のヌクレオチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい実施形態では、対立遺伝子変異体に特異的にハイブリダイズすることが可能ないくつかのプローブを固相支持体、例えば「チップ」に結合させる。オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップ（「ＤＮＡプローブアレイ」とも称する）を用いた突然変異検出分析は、例えばCronin et al. (1996) Human Mutation 7:244に記載されている。一実施形態では、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型領域の対立遺伝子変異体のすべてを含む。次に固相支持体を試験核酸と接触させて、特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって１つ以上の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の正体を、簡単なハイブリダイゼーション実験にて同定することができる。
ある実施形態では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号参照）、あるいはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばLandegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; Nakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364参照）においてプローブ／プライマーを利用することを含む。後者は、遺伝子における点突然変異を検出するのに特に有用である(Abravaya et al. (1995) Nuc Acid Res23:675-682)。単なる例証的実施形態として、上記方法は、(i)患者から細胞試料を収集する工程、(ii)試料細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）を単離する工程、(iii)核酸試料を、（核酸が存在すれば）核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下にて、核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程、および(iv)増幅産物の存在または非存在を検出して、または増幅産物の大きさを検出して、対照試料と長さを比較する工程を含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲを、本明細書に記載した突然変異を検出するために使用する技術のいずれかと組み合わせて、予備的な増幅工程として使用することが望ましい場合があろう。
代わりの増幅方法としては、自己持続性配列複製(Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Ｑ−ベータレプリカーゼ(Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197)、または任意の他の核酸増幅方法を含み、続いて当業者に周知の技術を用いて増幅分子を検出する。これらの検出スキームは、特にかかる分子の存在数が非常に少ない場合に、その核酸分子の検出に有用である。
対象検査の好ましい実施形態では、試料細胞からの遺伝子における突然変異またはその遺伝子の対立遺伝子変異体は、制限酵素切断パターンの変化により同定される。例えば、試料ＤＮＡおよび対照ＤＮＡを単離し、（場合により）増幅し、１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化して、断片の長さをゲル電気泳動により測定する。さらに、配列特異的リボザイムを使用して（例えば米国特許第５，４９８，５３１号参照）、リボザイム切断部位の生成または損失による特異的突然変異の存在を評価することができる。
本明細書に開示した通り、本発明の一態様は、患者から単離した生物学的な試料に関して、本発明の核酸配列（例えば配列番号１〜８および／または９〜１６の１つまたは複数を含む配列）の発現レベルが、その試料の細胞において低下しているかどうかを決定する診断検査に関する。用語「低下している」とは、第２の時点で患者から得た生物学的試料を測定して、それを第１の時点で同一患者から得た同様（例えば同一の組織または細胞型）の生物学的試料と比べた場合に、差異的に発現する本発明のポリヌクレオチドの発現レベルが、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、４０％、６０％ないし１００％まで低下している状態を指す。第１の時点と第２の時点は、治療前または治療後であってもよく、あるいは治療中の連続した時点であってもよい。特に、この検査では、検査細胞におけるマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは、その測定したレベルを、少なくとも１つの対照細胞、例えば正常細胞および／または既知の表現型を有する形質転換細胞にて検出されるマーカーポリペプチドレベルと比較する。
本発明によれば、伝統的または非伝統的な結腸癌の治療が有効である可能性が高い患者の評価および／またはモニターを行う方法が提供される。従って本発明は、癌患者を治療するために、抗癌治療を、単独で、相互に組み合わせて、および／または抗癌薬、抗腫瘍薬、化学療法剤、放射線および／または手術と組み合わせて施した患者を検査し、選別し、そしてモニターすることを包含する。
本発明の利点は、実行可能な癌治療の１つまたは複数が有効でありうる患者を経時的にモニターまたは選別して、好ましくは特定のタイプの治療または複合治療を受けた患者を経時的にモニターして、もし治療の変更、改変または中止があった場合、その患者にとって治療がどの程度無効となるのか；患者の疾患が軽減され、改善され、または減少されたかどうか；あるいは、患者の疾患の状態が進行し、転移性または侵襲性となったかどうかを決定することができる点である。ここに含まれる癌治療には、患者において腫瘍のサイズまたは腫瘍の負担を取り除く、または減らすための手術が挙げられる。従って本発明の方法は、術後の患者の進行および症状をモニターするために有用である。
本発明の癌治療に適した患者を同定することにより、その治療の効率を上げることができ、またその治療による厄介な、生命を脅かす副作用を患者に与えることを回避できる。同様に、本発明の方法を用いて一連の治療を施した患者をモニターすることができるので、さらに検討する通り、患者が治療に適切に経時的に応答しているかどうかを決定し、供給した投与量または供給方法を変更または調整するべきかどうかを決定し、そして治療中に患者が改善しているか、または悪化しているか、またはより重症な、もしくは進行した病状、例えば侵襲状態もしくは転移状態になっているかどうかを確かめることができる。
本発明のモニター方法は、患者の体液試料を経時的に、例えば治療中に、または患者の病気の進行中に検査または分析することによって、癌患者を連続的に検査または分析することを反映する。例えば連続検査では、同一の患者から体液試料、例えば血清もしくは血漿を採取して、患者における本発明の１または複数のバイオマーカーのレベルを観察、検査または調査するために、治療中に、および／または病気の進行中に本発明の方法に従って本発明の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを測定する。
同様に、患者の疾患の状態、および／または患者が受けている癌または腫瘍疾患の治療の効率、反応性および応答性を決定するために、患者を経時的に選別して、体液試料中の１または複数のバイオマーカーのレベルを評価することができる。明らかに分かる通り、一連の治療前に、または治療の開始時に、患者から１または複数の治療前試料を最適に採取して、その後に患者が治療を受け、臨床的および医学的評価を受けている途中の１または複数の時点において患者の進行および／または応答を分析および評価を助けることができよう。
患者における本発明の１または複数のバイオマーカーのレベルを一定の時間にわたって（例えば日、週、月、場合により年、またはそれらの様々な間隔で）モニターする際に、医師、例えば内科医や臨床医によって決められるとおりに、患者の体液試料、例えば血清または血漿試料を、間隔をあけて採取して、疾患の経過中または疾患の治療中に癌患者の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定し、それを正常者の１または複数のバイオマーカーの各レベルと比較する。例えば患者の試料を、本発明に従って１ヶ月毎、２ヶ月毎、または１，２もしくは３ヶ月間隔を組み合わせて採取してモニターすることができる。３ヶ月毎、またはもっと頻繁に患者の試料をモニターすることも望ましい。
患者において認められた１または複数のバイオマーカーレベルを、正常者の１つまたは複数のバイオマーカーの各レベル、そして例えば検査期間前に採取した患者自身のバイオマーカーレベルと比較して、治療または疾患の進行または結果を決定する。従って、経時的にモニターした患者自身のバイオマーカーレベルを用いる場合、比較のために、長期間のバイオマーカーレベルのモニターのための個人的な内部対照として患者自身の値が提供され、従って癌の存在および／または進行度が提供される。本明細書に記載するとおり、治療または疾患の経過後に、癌患者の１または複数のバイオマーカーレベルの経時的な増加を決定し、それを正常者の１または複数のバイオマーカーの各レベルと比較することにより、患者の癌治療の経過または結果において患者の癌の重症度もしくは病期、またはその進行度、またはその喪失を決定することができる。
癌患者のバイオマーカーレベルの増加を、癌患者の試料の分析から得た値を、正常対照範囲の発現レベルと比較することによって決定する。ここでバイオマーカーは、その発現が、正常対照に比べて癌患者において少なくとも1.5倍大きい場合に、過剰発現しているという。
経時的に患者をモニターした際に、患者の１または複数のバイオマーカーレベルが、正常範囲の値に比べて増加したレベル（すなわち少なくとも1.5倍過剰発現したレベル）から、正常者に認められたバイオマーカーレベルまたはそれに近いレベルまで低下した場合、このことは治療の進展または効率、および／または疾患の改善、軽減、癌の減少もしくは除去などを示唆する。同様に、本発明の態様として記載した全ての方法において、患者の１または複数のバイオマーカーレベルが、増加したレベル（すなわち少なくとも1.5倍過剰発現したレベル）から、正常者に認められた１または複数のバイオマーカーの各レベルまたはそれに近いレベルまで低下したことを確認することは、本発明の方法の別の態様を提供するものであり、そこでは当該方法の実施後に経時的に患者の改善、回復または寛解、および／または治療の進展または効率を確認することができる。
本発明の別の態様は、癌患者の疾患の経過、または癌患者の治療の効率をモニターする方法を含む。患者の治療は、伝統的な治療法、例えばホルモン療法、化学療法剤による治療法、放射線療法、または新しい治療法、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。この方法は、癌患者の体液試料中の１または複数のバイオマーカーレベルを測定すること、および、疾患または癌の治療経過中に、患者試料中の１または複数のバイオマーカーレベルが、正常対照中の１または複数のバイオマーカーの各レベルと比べて少なくとも1.5倍増加しているかどうかを決定することを含む。この方法によれば、正常対照中のバイオマーカーの各レベルと比べて、癌患者のバイオマーカーのレベルが増加することは、治療経過中における患者の癌の病期、等級、重症度または進行度の増加、および／または患者に施した癌治療の効率または効果の喪失、例えば治療や臨床結果の悪さを示唆する。
当業者には自明なとおり、好ましくは、本発明のモニター方法は、連続的に、疾患の経過中または疾患の治療中に患者から採取した試料を用いて（例えば数日、数週、数月、場合により数年、または様々なこれらの間隔の後に）行われ、これにより疾患の進行または結果、および／または治療の効率または結果を決定することができる。試料を凍結または低温保存する場合、患者（または正常者）から試料を採取して、分析までの間保存してよい。
別の態様では、本発明は、分析する試料中の本発明の１または複数のバイオマーカーのレベルを決定することと合わせて、１または複数の追加の癌マーカーの量またはレベルを決定することを含む。
別の態様では、本発明は、癌患者の疾患の重傷度または進行度をモニターする方法を含む。この方法は、癌患者の生物学的試料（例えば血清または血漿試料）中の１または複数のバイオマーカーレベルを測定すること、および、その癌患者の血清または血漿中の１または複数のバイオマーカーレベルが、正常者の各バイオマーカーレベルと比べて増加（すなわち少なくとも1.5倍増加）しているかどうかを決定することを含む。この方法では、正常者の各正常バイオマーカーレベルと比べて患者の試料中のレベルが増加していることに基づいて、患者の癌の重症度または進行度をモニターする。この方法によれば、最も重症な癌の病期は、各正常対照バイオマーカーレベルと比べて最高レベルの血漿または血清中のバイオマーカー（例えば1.5倍超）と相関する。
さらに別の態様では、本発明は、治療を受けた癌患者において癌治療またはその効率をモニターする方法を提供する。この方法は、癌患者の血清または血漿中の１または複数のバイオマーカーレベルを測定すること、および、その患者の１または複数のバイオマーカーのレベルが、正常対照の血清または血漿試料において決定された１または複数のバイオマーカーの各レベルと比べて癌治療中に増加するかどうかを決定することを含む。ここで、モニター期間中に、癌患者の１または複数のバイオマーカーのレベルが、正常対照の血漿または血清中の１または複数のバイオマーカーの各レベルに比べて増加することは、下記の中の１または複数を示唆する：(i) 癌の進行；(ii)癌のより重症な病期；(iii) 癌治療に対する患者の応答性の欠失；または(iv)悪い結果またはより短い生存期間。
さらに、治療を受けた患者において１または複数のバイオマーカーのレベルをモニターする間に、測定した１または複数のバイオマーカーのレベルの変化が認められ、１または複数のバイオマーカーのレベルの低下が確認された場合、下記の中の１または複数に関する評価を行うことができる：(i) 治療において患者が良くなってきている；(ii)治療が有効である；(iii) 患者が治療に応答している；および／または(iv)患者の癌が進行しておらず、治療によって軽減または除去された。
本発明によれば、患者の治療中にバイオマーカーの各正常レベル値と比べて１または複数のバイオマーカーレベルをモニターまたは評価する当該方法を用いて、内科医または臨床医は、特定の癌治療または抗腫瘍疾患治療の結果として、場合により患者の進行または回復を判定することができる。有益なことには、かかる判定により、より良くまたはより攻撃的に癌を退治（治療）するように治療を調整することが可能となる。また、患者ごとにより有効な総合的治療および結果を達成するように投与量、投与方法の変更、治療様式の変更、または治療法の組み合わせを行うことが可能となる。
本発明の方法を記載した全ての態様において、疾患の進行または結果、あるいは癌治療の効率または結果に関して癌患者をモニターする場合、第１の時点で患者から採取した治療前の試料を分析することができ、そしてまた疾患の経過中、癌治療もしくは抗腫瘍治療、または複合治療の最中に第２、３、４またはその続きの時点で採取した患者の試料を分析することができる。
本発明の別の態様は、異常増殖を特徴とする細胞の分化および増殖を調節することができる薬剤の同定に関する。これに関して、本発明は、マーカー核酸（配列番号１〜８または９〜１６、あるいはそれらに相補的な配列）の発現を調節する化合物、および／または例えば配列番号９〜１６によってコードされたポリペプチドの生物活性を改変する、例えば抑制する化合物を確定するための検査を提供する。
いくつかのin vivoでの方法を用いて、マーカー核酸（配列番号１〜８または９〜１６、あるいはそれらに相補的な配列）の発現を調節する化合物、および／または配列番号９〜１６によってコードされたポリペプチドの生物活性を改変する、例えば抑制する化合物を同定することができる。
薬剤スクリーニングは、細胞試料に試験化合物を添加して、その効果をモニターすることにより行う。また試験化合物が入っていない対応試料を対照としてモニターする。次に、処理済および未処理の細胞を、任意の適切な表現型基準により、例えば、限定するものではないが、顕微鏡分析、生存度試験、複製能、組織学的検査、細胞関連の特定ＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解物により発現される酵素活性レベル、および他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力の点から比較する。処理細胞と未処理細胞との差異は、試験化合物に起因する効果を示す。
試験化合物の所望の効果は、癌関連マーカー核酸配列により付与された任意の表現型に対する効果を含む。例として、過剰のｍＲＮＡを制限する試験化合物、コードタンパク質の生産を制限する試験化合物、またはタンパク質の機能的効果を制限する試験化合物が挙げられる。試験化合物の効果は、処理細胞と未処理細胞の結果を比較すれば明らかとなろう。
したがって本発明はまた、核酸マーカー（配列番号１〜８または９〜１６、好ましくは配列番号９〜１６、あるいはそれらに相補的な配列）の発現を抑制する薬剤をin vitroでスクリーニングする方法を包含する。この方法は、薬剤がｍＲＮＡの生産を抑制することができるかどうかを確認するために、培養細胞にてマーカー核酸のｍＲＮＡを検出しうる細胞または組織を薬剤に曝露すること；および、曝露した細胞または組織におけるｍＲＮＡレベルを測定することを含む。ここで、細胞株への薬剤の曝露後のｍＲＮＡレベルの減少は、マーカー核酸のｍＲＮＡの生産抑制を示す。
あるいは、該スクリーニング方法は、マーカータンパク質の生産を抑制すると推測される薬剤に対して、培養細胞にてマーカータンパク質を検出しうる細胞または組織をin vitroでスクリーニングすること；および、細胞または組織におけるマーカータンパク質レベルを測定することを含む。ここで、細胞または組織への薬剤の曝露後のマーカータンパク質レベルの減少は、マーカータンパク質の生産抑制を示す。
本発明はまた、マーカー核酸の発現を抑制する薬剤をin vivoでスクリーニングする方法を包含する。この方法は、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質の生産を抑制すると推測される薬剤に対して、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を検出しうる腫瘍細胞を有する哺乳動物を曝露すること；および、曝露した哺乳動物の腫瘍細胞におけるマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを測定することを含む。哺乳動物への薬剤の曝露後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質レベルの減少は、マーカー核酸の発現抑制を示す。
したがって、本発明は、試験化合物とともに、マーカー核酸（配列番号１〜８または９〜１６、好ましくは配列番号９〜１６、あるいはそれらに相補的な配列）を発現する細胞をインキュベートすること；および、そのｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することを含む方法を提供する。本発明はさらに、細胞集団におけるマーカー核酸の発現レベルを定量的に測定する方法、および薬剤が細胞集団におけるマーカー核酸の発現レベルを増加または減少させることが可能かどうかを確認する方法を提供する。薬剤が細胞集団におけるマーカー核酸の発現レベルを増加または減少させることが可能であるかどうかを確認する方法は、（ａ）対照および薬剤処理細胞集団から細胞抽出物を調製する工程、（ｂ）細胞抽出物からマーカーポリペプチドを単離する工程、（ｃ）マーカーポリペプチドと、このポリペプチドに特異的な抗体との間に形成される免疫複合体の量を（例えば並行に）定量することを含む。本発明のマーカーポリペプチドはまた、その生物活性を検査することにより定量することができる。マーカー核酸発現の増加を誘発する薬剤は、対照細胞にて形成される免疫複合体の量と比較して、試験細胞にて形成される免疫複合体の量を増加させる能力により同定することができる。同様に、マーカー核酸の発現を減少させる薬剤は、対照細胞と比較して、処理細胞抽出物にて形成される免疫複合体の量を減少させる能力により同定することができる。
ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションより測定することができる。ｍＲＮＡレベルはまた、ＰＣＲを含む方法により測定することができる。高処理能検査に使用することができる、ｍＲＮＡを測定する他の高感度な方法、例えばDELFIA終点検出および定量の方法は、例えばWebb and Hurskainene (1996) Journal of Biomolecular Screening 1:119に記載されている。マーカータンパク質レベルは、配列番号１７〜２４のタンパク質産物を特異的に認識する抗体を用いて免疫沈降または免疫組織化学により測定することができる。
薬剤スクリーニング検査において活性であると同定された薬剤は、細胞増殖活性を阻止する能力に関して検査される候補物質となる。これらの薬剤は、細胞、特に結腸細胞の異常増殖を含む障害を治療するのに有用であろう。
様々な検査方法が有用であり、本開示から、本明細書に明記しないものも当業者に理解されるであろう。例えば当該検査は多くの異なる方式で行うことができ、無細胞系（例えば、精製タンパク質または細胞溶解産物）による検査、ならびに完全細胞を利用する細胞系検査が含まれる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを検査する多くの薬剤スクリーニングプログラムでは、所定期間中に検査する化合物数を最大にするために、高処理能検査が望ましい。例えば精製蛋白質もしくは半精製蛋白質または溶解産物を用いるなどの無細胞系において実施される本発明の検査は、多くの場合「一次」スクリーニングとして好ましい。なぜならそれらは、迅速な展開、そして試験化合物により媒介される分子標的の変化の比較的簡単な検出を可能にするように行うことができるからである。さらにin vitro系では、試験化合物の細胞毒性の効果および／またはその生物学的利用度を一般に無視することができ、その代わりに検査は、主に分子標的に対する薬剤の効果（これは他のタンパク質との結合親和性の変化、または分子標的の酵素特性の変化から明らかにされうる）に集中される。
Ａ．マッピングおよび組織プロファイリングのプローブとしての核酸の使用
例えばヌクレオチド配列番号１〜８または９〜１６あるいはそれらに相補的な配列から選択される少なくとも８個の連続ヌクレオチドを含む上記ポリヌクレオチドプローブは、ヒト染色体の同定および転写レベルの測定を含む様々な目的のために使用される。核酸配列の好ましい領域に関する追加情報が、添付の表に示される。
ヌクレオチドプローブは、例えば放射性標識、蛍光標識、ビオチン化標識、または化学発光標識を用いて標識され、選択した特定標識に適した周知の方法により検出される。中期染色体の調製物にヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる方法もまた当該技術分野で周知である。ヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチド配列に相補的である、染色体調製物中のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするであろう。核酸に特異的にハイブリダイズするプローブは、他の非関連配列による背景ハイブリダイゼーションよりも少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを生じるのがよい。
非限定的な例として、市販プログラムを、癌などの疾患に一般的に関連する染色体の領域を同定するのに利用できる。本発明の核酸は、これらの領域を探索するのに使用することができる。例えば、プロファイル検索により、ある核酸がキナーゼをコードする遺伝子に対応すると同定されると、その核酸が癌関連の染色体領域に結合することは、腫瘍細胞の発達／成長の１または複数の段階においてそれがキナーゼとして作用することを示唆するであろう。その役割を解明するのにいくらかの実験が必要であろうが、その核酸は、癌の診断または治療を進展させる潜在性を有する特定タンパク質を単離するために新し材料となる。
ヌクレオチドプローブを、該核酸に対応する遺伝子の発現を検出するために用いる。例えばノーザンブロットでは、ｍＲＮＡを電気泳動的に分離し、プローブと接触させる。特定の大きさのｍＲＮＡ種にハイブリダイズするプローブを検出する。ハイブリダイゼーションの量を定量して、例えば特定条件下における発現相対量を決定する。プローブはまた、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を検出するために使用される。反応産物をプローブとハイブリダイズさせて、このハイブリッドを検出する。プローブは、発現を検出するために細胞とのin situハイブリダイゼーションに使用される。プローブはまた、ハイブリダイズする配列を診断的に検出するためにin vivoで使用することができる。プローブは典型的には放射性同位体により標識される。発色団、蛍光発色団および酵素のような他の型の検出可能な標識を用いてもよい。
特定ｍＲＮＡの発現が、異なる細胞型で変動し、組織特異的であることがある。異なる細胞型におけるｍＲＮＡレベルのこの変動を、組織型を決定するために核酸プローブ検査とともに利用することができる。例えば、配列番号１〜８もしくは９〜１６の核酸配列またはそれらに相補的な配列と実質的に同一または相補的な核酸プローブを利用したＰＣＲ、分岐ＤＮＡプローブ検査、またはブロティング法により、標的ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの有無を決定することができる。
ヌクレオチドハイブリダイゼーション検査の例が、ＰＣＴ国際公開公報第９２／０２５２６号(Urdea et al.)および米国特許第５，１２４，２４６号(Urdea et al.)に記載されている（その両方を参照により本明細書に援用する）。これらの引用文献は、サンドイッチヌクレオチドハイブリハイブリダイゼーション検査の例を記載している。
あるいは少量の標的核酸を検出するための別の手段は、Mullis et al., Met/i. Enzymol. (1987) 155:355-350; 米国特許第４，６８３，１９５号；および米国特許第４，６８３，２０２号（すべてを参照により本明細書に援用する）に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。２つのプライマーポリヌクレオチドが標的核酸とハイブリダイズし、反応を初期化するために使用される。プライマーは、配列表のポリヌクレオチドの内部配列または３’および５’部位の配列から構成されうる。あるいはプライマーがこれらのポリヌクレオチドの３’および５’部位である場合、プライマーは、そのヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズする必要はない。熱安定性ポリメラーゼは、もとの標的核酸を鋳型として用いて、プライマーから標的核酸のコピーを生産する。大量の標的核酸がポリメラーゼにより生産された後、サザンブロットなどの方法により検出される。サザンブロット法を用いる場合、標識プローブは、配列表のポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするであろう。
さらに、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載される伝統的なブロッティング技術により検出することができる。ポリメラーゼ酵素を用いてｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を用いて精製および分離することができる。次にゲル上の核酸を、ニトロセルロースなどの固体支持体にブロットする。固体支持体を標識プローブに曝露し、続いて洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブを除去する。次に、標識プローブを含有する二重鎖を検出する。典型的にはプローブを放射能で標識する。
マッピング
本発明の核酸は、対応する遺伝子が存在する染色体を同定するために使用される。例えば、正常な中期の広がりにおいてin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）または蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いることにより、ゲノムハイブリダイゼーションの比較から、ＤＮＡ配列の相対コピー数の変化を総ゲノムにおいて評価することができる。Schwartz and Samad, Current Opinions in Biotechnology (1994) 8:70-74; Kallioniemi et al., Seminars in Cancer Biology (1993) 4:41-46; Valdes and Tagle, Methods in Molecular Biology (1997) 68:1, Boultwood, ed., Human Press, Totowa, NJを参照されたい。
ヒト中期染色体の調製物を、ヒト主要組織または細胞株から、標準的細胞遺伝学的技術を用いて調製する。配列番号１〜８または９〜１６のヌクレオチド配列あるいはそれらに相補的な配列から選択される少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含むヌクレオチドプローブを用いて、対応する染色体を同定する。ヌクレオチドプローブは、例えば放射性標識、蛍光標識、ビオチン化標識または化学発光標識を用いて標識され、選択した特定標識に適した周知の方法により検出される。ヌクレオチドプローブを、中期染色体の調製物にハイブリダイズさせるためのプロトコルもまた当該技術分野で周知である。ヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチド配列に相補的な、染色体調製物中のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするであろう。標的遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブは、非関連のコード配列による背景ハイブリダイゼーションよりも少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを生じる。
核酸配列は、例えば照射ハイブリッドまたは染色体特異的ハイブリッドパネルを用いて、特定の染色体にマッピングされる。Leach et al., Advances in Genetics, (1995) 33: 63-99; Walter et al., Nature Genetics (1994) 7:22-28; Walter and Goodfellow, Trends in Genetics (1992) 9:352を参照されたい。照射ハイブリッドマッピング用パネルが、Research Genetics, Inc., Huntsville,Alabama, USAから入手可能である。様々なパネルを用いたマーカー用のデータベースが、http:/F/shgc-www.stanford.eduや他のところからワールドワイドウェブを介して入手可能である。統計学的プログラムRHMAPを用いて、ある次数の、別の次数に対する相対尤度を測定して、照射ハイブリダイゼーションからのデータに基づいてマップを構築することができる。RHMAPは、http://www.sph.umich.edu/group/statgen/softwareからワールドワイドウェブを介して入手可能である。
かかるマッピングは、機能既知の他の遺伝子との類似性から、標的遺伝子の機能を同定する際に有用であり得る。特定の症候群または疾患が同じ染色体上に位置する場合、標的遺伝子に機能を割り当てることもできる。
組織プロファイリング
本発明の核酸を用いて、所定の試料が得られた由来の組織型を決定することができる。例えば、器官もしくは組織の特定マーカーの発現を同定することにより、発生源の器官または組織から転移性病巣を同定する。核酸が特定の組織型においてのみ発現し、転移性病巣がその核酸を発現していることが分かった場合、その病巣の発生源が同定される。特定核酸の発現を、対応するｍＲＮＡまたはタンパク質産物の検出により検査する。抗体染色のような免疫学的方法を用いて、特定タンパク質産物を検出する。ハイブリダイゼーション方法、例えば、限定ではないがin situハイブリダイゼーションやノーザンブロッティングを用いて、特定ｍＲＮＡ種を検出できる。
多型の使用
遺伝子の対応領域がヒト集団において多型性を示す場合には、その核酸は、法医学、遺伝分析、マッピングおよび診断用途にて有用であろう。核酸の特定の多型を用いて、ある試料が容疑者に由来すると同定すること、またはその試料が容疑者に由来する可能性を排除することができる。遺伝子における多型を検出する手段として、限定するものではないが、タンパク質の多型変異体の電気泳動、制限酵素切断に対する感受性の差異、および対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションを含むあらゆる手段が使用される。
Ｂ．抗体を生産するため核酸およびコードポリペプチドの使用
核酸、それに対応するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡ、または対応する完全遺伝子の発現産物を調製し、これを用いて実験、診断および治療のために抗体を作成する。対応する遺伝子が不明である核酸については、このことより、対応する遺伝子を同定する追加方法が提供される。核酸または関連ｃＤＮＡを上述のように発現し、そして抗体を調製する。これらの抗体は、コードペプチド上のエピトープに特異的であり、細胞もしくは組織調製物中、またはin vitro発現系の無細胞抽出物中の対応する天然タンパク質を沈殿させ、またはそれに結合することができる。
抗体を産生するための免疫原は、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドをアジュバンドと混合することにより調製される。あるいはポリペプチドを、融合タンパク質としてより大きな免疫原性タンパク質に作製する。またポリペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニンのような他のより大きな免疫原性タンパク質に共有結合する。免疫原を典型的には皮内に、皮下に、または筋肉内に投与する。免疫原をウサギ、ヒツジおよびマウスのような実験動物に投与して、抗体を生産させる。場合により、動物の脾臓細胞を単離し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを形成させる。かかる方法は当該技術分野に周知である。当該技術分野に既知の別の方法によれば、核酸を筋肉注射などで直接に投与し、in vivoで発現させる。発現したタンパク質は、タンパク質の投与の場合と同様に、抗体の生産など、様々なタンパク質特異的な免疫応答を起こす。
核酸によりコードされるタンパク質およびポリペプチドに特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製物を、当該技術分野に既知の標準的方法を用いて作製する。該抗体は、配列番号１７〜２４のポリペプチドに存在するエピトープに特異的に結合する。典型的には、エピトープの形成には少なくとも約６個、８個、１０個または１２個の連続アミノ酸を必要とする。しかしながら非連続アミノ酸を含むエピトープは、より多くの、例えば少なくとも約１５個、２５個または５０個のアミノ酸を必要とすることがある。核酸の短い配列は、既知タンパク質との交差反応の潜在性のために、対応する新規タンパク質を同定する抗体を作成するためのエピトープとして使用するには不適切でありうる。しかしながら、該抗体は、他の目的のためには、特に抗体が既知タンパク質と本発明の核酸によりコードされる新規ポリペプチドとの共通の構造的特徴を同定する場合には有用であろう。
ウェスタンブロット法または他の免疫化学的検査において使用する場合、ヒトの核酸によりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、他のタンパク質を用いた場合に生じる検出シグナルよりも少なくとも約５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを生じるのがよい。好ましくは、核酸Ｔによりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学的検査において他のタンパク質を検出せず、核酸によりコードされたタンパク質を溶液から免疫沈降させることができる。
ヒト集団において核酸によりコードされるポリペプチドに対する血清抗体の存在を検査するためには、当該技術分野に周知の方法によってヒト抗体を精製する。好ましくは、該抗体を、核酸によりコードされるタンパク質、ポリペプチドまたは融合タンパク質を結合させたカラムに抗血清を通すことにより、親和性を利用して精製する。その後、結合した抗体を、例えば高塩濃度の緩衝液を用いて、カラムから溶出させることができる。
上述した抗体に加えて、一本鎖抗体などの抗体誘導体が遺伝子操作により作製される。
抗体を、当該技術分野に既知の標準的なプロトコルを用いて作製することができる（例えばAntibodies: A Laboratory Manual, ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press:1988)参照）。マウス、ハムスターまたはウサギなどの哺乳動物を、ペプチドの免疫原性形態（例えば、抗体応答を誘発することが可能な哺乳動物ポリペプチドまたは抗原断片、あるいは上記のような融合タンパク質）を用いて免疫化することができる。
一態様では、本発明は、結腸直腸組織または腫瘍組織、特に結腸癌組織または結腸癌由来細胞株において対象ポリペプチドが高度に発現することを示すモノクローナル抗体を含む。従って一態様では、本発明は、一般的に、そして特に結腸癌診断ツールとして、対象ポリペプチドの発現を分析するための診断ツールを提供する。
タンパク質またはペプチドに免疫原性を与える技術には、担体への結合など、当該技術分野に周知の他の技術が挙げられる。タンパク質の免疫原性部分を、アジュバントの存在下に投与することができる。免疫化の進行を、血漿または血清の抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準的ELISA法または他の免疫検査法を、抗原としての免疫原とともに用いて、抗体のレベルを評価することができる。好ましい態様では、対象抗体は、哺乳動物のタンパク質の抗原決定基、例えば配列番号１７〜２４の蛋白質または近縁の相同体（例えば少なくとも９０％同一体、より好ましくは少なくとも９５％同一体）の抗原決定基に免疫特異的である。
ポリペプチドの抗原調製物を用いて動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合にはその血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を生産するために、免疫化した動物から抗体生産細胞（リンパ球）を採取し、標準的な体細胞融合法によりミエローマ細胞などの不死化細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該技術分野において周知であり、例えばハイブリドーマ法（もともとKohle and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497により開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するEBV-ハイブリドーマ法(Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp.77-96)が挙げられる。本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体を生産するために、免疫化学的にハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、そのハイブリドーマ細胞を含む培養物からモノクローナル抗体を単離することができる。
ここで使用する「抗体」という用語は、対象ポリペプチドの１つと特異的に反応する断片も包む。抗体を、従来技術を用いて断片化して、その断片を、全抗体に関する上記方法と同じ方法にて用途に応じてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）2断片は、抗体をペプシンで処理することにより作成することができる。得られたＦ（ａｂ）2断片を、ジスルフィド架橋を減らすように処理して、Ｆａｂ断片を作成することができる。本発明の抗体はさらに、抗体の少なくとも一つのＣＤＲ領域によって与えられるポリペプチドとの親和性を有する二重特異性の、一本鎖の、ならびにキメラの、およびヒト化した分子をも含む。好ましい態様では、さらに抗体は、それに結合され、検出され得る標識を含む（例えば該標識は放射性同位体、蛍光性化合物、化学発光性化合物、酵素または酵素補因子でよい）。
個体のタンパク質レベルをモニターするために抗体を用いることができ、これにより、例えば被験者が、異常なタンパク質レベルに関連する疾患または症状、例えば結腸癌を有しているかどうかを確定すること、あるいはそのような障害を患っている個体のために所定の治療法の有効性の決めることができる。ポリペプチドレベルを、血液試料のような体液中の細胞から測定することができる。
さらに本発明の抗体を、gt11, gt18-23, ZAPおよびORF8などの発現ベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーを免疫学的にスクリーニングする際に適用する。この型のメッセンジャーライブラリーは、正しいリーディングフレームと配向において挿入されたコード配列を有し、融合タンパク質を産生することができる。例えばgt11は、アミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列から構成され、カルボキシル末端が外来ペプチドから構成される融合タンパク質を生産する。次にタンパク質の抗原エピトープ、例えば特定のタンパク質の他のオルソログまたは同一種由来の他のパラログを、抗体を用いて検出できる（例えば感染プレートから持ち上げたニトロセルロースフィルターを抗体と反応させる）。次にその感染プレートから、この検査により検出された陽性ファージを単離することができる。したがって相同体の存在を検出して、他の動物からクローニングすることができ、同様にヒトから代わりのアイソフォーム（スプライシング変異体を含む）をクローニングすることができる。
別の態様では、モノクローナル抗体のパネルを使用してもよく、そこでは各エピトープの関与する機能が、モノクローナル抗体によって表される。パネルにおけるモノクローナル抗体の結合の欠失または変動は、そのタンパク質、したがってその対応遺伝子の突然変異上の注目を意味するであろう。
Ｃ．差異的発現
本発明はまた、ヒトにおける異常組織または患部組織を同定するための方法を提供する。上記のようなタンパク質ファミリーのプロファイルに対応する核酸に関して、推定される生物学的機能により組織の選択を行いうる。特定の核酸に対応する遺伝子の発現は、疾患の疑いのある第１の組織とヒトの正常組織である第２の組織との間で比較される。正常組織は、ヒトのあらゆる組織、特に標的遺伝子を発現する組織であり、例えば脳、胸腺、精巣、心臓、前立腺、胎盤、脾臓、小腸、骨格筋、膵臓、および結腸の粘膜内層を含むが、それらに限定されない。
異常または罹患の疑いのある組織は、ヒトの種々の組織型から得ることができるが、好ましくは同じ組織型から得る。例えば腸のポリープまたは他の異常増殖は、正常な腸組織と比較されるのがよい。比較する２つの組織間における標的遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質の差異、例えば分子量、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列、あるいは相対存在量の差異は、罹患の疑いのあるヒトの組織における遺伝子の変化、または該遺伝子を調節する遺伝子の変化を示す。
２つの組織における標的遺伝子は、当該技術分野に既知の任意の方法によって比較される。例えば２つの遺伝子が配列決定され、罹患の疑いのある組織における遺伝子の配列は、正常組織の遺伝子配列と比較される。２つの組織における標的遺伝子またはその一部が、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、配列表に示すヌクレオチド配列に基づいたヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。増幅遺伝子またはその一部は、配列番号１〜８または９〜１６に示される対応ヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。正常ヌクレオチド配列と比較して、罹患の疑いのある組織における標的組織のヌクレオチド配列の差異は、その疾患における核酸によりコードされたタンパク質の役割を示唆し、治療薬の調製の指標を提供する。
ヌクレオチドプローブは、様々な方法、例えば放射性標識、ビオチン化、蛍光タグまたは化学発光タグにより標識され、当該技術分野に既知の標準的な方法により検出される。
あるいは、２つの組織における標的ｍＲＮＡも比較する。ポリＡ+ＲＮＡは、当該技術分野に周知のように、２つの組織から単離される。例えば、当業者は、ノーザンブロット法において配列表に示すヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチドプローブを用いて、２つの組織間の標的ｍＲＮＡ転写物の大きさまたは量の差異を容易に測定できる。正常細胞における同じ標的ｍＲＮＡの発現と比較して、罹患の疑いのある組織試料における標的ｍＲＮＡの発現の増加または減少は、発現タンパク質が疾患の一因であり、また、治療薬の調製の指標を提供することを示唆する。
タンパク質を分析する任意の方法を用いて、対の試料からの２つの核酸によりコードされたタンパク質を比較する。２つの組織におけるタンパク質の大きさは、例えば、２つの組織からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットにおいて、核酸によりコードされるタンパク質を検出する本発明の抗体を用いて比較される。発現レベルや細胞内局在のような他の変化もまた、対応タンパク質に対する抗体を用いて免疫学的に検出することができる。正常組織における同じ核酸によりコードされるタンパク質の発現レベルと比較して、罹患の疑いのある組織における核酸によりコードされるタンパク質の高いまたは低いレベルの発現は、発現タンパク質が疾患の一因であることを示し、治療薬の調製の別の指標を提供する。
同様に、罹患の疑いのあるヒト細胞とヒト正常組織との間の、遺伝子配列または遺伝子発現産物、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質の比較を用いて、ヒトにおける疾患の進行または寛解を追跡する。
例えば、腫瘍の疑いのある組織における標的遺伝子の発現の増加または減少は、組織における腫瘍細胞の存在を示し得る。正常組織における遺伝子発現に対する、腫瘍組織における標的遺伝子発現の増加の度合、または腫瘍組織における標的遺伝子発現の経時的な増加量の差異は、当該組織における腫瘍の進行を評価するために、または治療プロトコルに対する腫瘍組織の応答を経時的にモニターするために用いられる。
任意の２つの細胞型（例えば、低および高転移腫瘍細胞株、または、治療薬に曝露された、および曝露されていない組織由来の細胞）の発現パターンを比較することができる。ヒトにおける疾患の遺伝的な素因は、胎児組織における標的遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を、正常な標的遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質と比較することにより検出される。この用途のために用いられる胎児組織として、羊水、絨毛膜絨毛、血液、およびin vitro受精胚の割球が挙げられるが、それらに限定されない。比較可能な正常標的遺伝子は、任意の組織から得られる。ｍＲＮＡまたはタンパク質は、標的遺伝子が発現するヒト正常組織から得られる。胎児の標的遺伝子またはｍＲＮＡのヌクレオチド配列または大きさの変化、あるいは胎児の標的タンパク質の分子量、アミノ酸配列または相対的存在量の変化などの差異は、胎児の標的細胞における生殖細胞系列の突然変異を示す可能性があり、それは疾患の遺伝的素因を示す。
Ｄ. ペプチドのアナログおよびアンタゴニストをスクリーニングするための、核酸およびコードポリペプチドの使用
配列番号１７〜２４のポリペプチド、あるいは本発明の核酸、例えば配列番号９〜１６またはそれらに相補的な配列、および対応する完全長遺伝子によってコードされるポリペプチドを用いて、ペプチドライブラリーをスクリーニングして、該コードポリペプチドの中から結合パートナー、例えば受容体などを同定することができる。
ペプチドライブラリーは、米国特許第５，０１０，１７５号およびPCT国際公開第９１／１７８２３号に開示されている方法に従って合成することができる。以下に要約すると、ペプチド混合物を調製し、次にそれをスクリーニングして、所望のシグナル伝達および受容体結合活性を示すペプチドを同定する。上記第５，０１０，１７５号の方法では、適切なペプチド合成の支持体（例えば樹脂）に、適切に保護された活性化アミノ酸の混合物を結合させる。反応混合液中の各アミノ酸の濃度は平衡化しており、すなわち等モルのアミノ酸混合物が開始樹脂に結合されるように、カップリング反応速度に反比例して調節される。次に、結合したアミノ酸を脱保護化して、別の平衡化しているアミノ酸混合液と反応させ、考えられる全てのジペプチドの等モル混合液を形成する。この過程を、所望の長さ（例えば六量体）のペプチド混合物が形成されるまで繰り返す。各過程において、すべてのアミノ酸が含まれる必要はないことに留意されたい。つまり、いくつかの工程では１つまたは２つのアミノ酸のみを含んでもよく（例えば、ある特定のアミノ酸が、所定の位置に必須であることが知られている場合）、したがって混合物の複雑さが低下する。ペプチドライブラリーの合成が終了した後、ペプチド混合物を、選択されたポリペプチドとの結合についてスクリーニングする。その後、そのペプチドを、活性を抑制または増強する能力について試験する。続いて、所望の活性を示すペプチドを単離し、その配列を決定する。
国際公開第９１／１７８２３号に記載されている方法も似ている。しかしながら、合成樹脂を活性アミノ酸の混合物と反応させる代わりに、樹脂を２０の等しい部分に（または、その工程において添加する種々のアミノ酸の数に対応する部分数に）分け、各アミノ酸を別個にその樹脂の部分に結合させる。その後、樹脂の部分を混合し、再び第２のアミノ酸と反応させるために等しい部分数に分ける。この様にして、各反応を、完了まで容易に行う。さらに、各工程においてすべての樹脂を混合するよりも、むしろ並行して部分を処理することによって、個々の「サブプール」を維持してもよい。こうすることにより、どのペプチドが、観察される受容体結合活性またはシグナル伝達活性を引き起こすのかを決定する過程が簡素化される。
このような場合、例えば１〜２，０００の候補をそれぞれ含むサブプールを、本発明の１または複数のポリペプチドに曝露する。次に、陽性を示した各サブプールを、例えば２０〜１００の候補を含むより小さなサブプール（サブサブプール）群として再合成し、再検査する。陽性のサブサブプールを別個の化合物として再合成し、検査して、高結合定数を示すペプチドを最終的に決定することができる。これらのペプチドについて、自然活性を抑制または増強する能力を試験することができる。国際公開第９１／７８２３号および米国特許第５，１９４，３９２号（参照により本明細書に援用する）に記載される方法により、自動化技術によるこのようなプールおよびサブプールの並行な調製が可能となり、その結果すべての合成および再合成を数日中に行えるようになる。
ペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、利用可能な任意の方法、例えばシグナル伝達、抗体結合、受容体結合、細胞分裂誘発検査、走化性検査等を用いてスクリーニングすることができる。本明細書に記載される方法が、現時点で好ましい。検査条件は、理想的には、自然活性がin vivoで現れる条件、すなわち生理的ｐＨ、温度、およびイオン強度に類似させるのがよい。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体に毒性副作用を引き起こさない濃度で、自然活性の強力な抑制または増強を示すであろう。天然ポリペプチドとの結合を競うアゴニストまたはアンタゴニストは、自然な濃度と等しい濃度、またはそれより高い濃度を必要とすることがあるが、他方、ポリペプチドに不可逆的に結合することが可能な抑制剤は、自然な濃度付近の濃度で添加することができる。
このようなスクリーニングおよび実験の最終的な結果は、本発明の核酸によってコードされる受容体のような少なくとも１つの新規ポリペプチド結合パートナー、およびこの新規結合パートナーの少なくとも１つのペプチドアゴニストまたはアンタゴニストであろう。かかるアゴニストまたはアンタゴニストは、受容体を天然に保有する細胞、または遺伝子操作により受容体を保有する細胞において、その受容体機能を調節、増強、または抑制するために使用することができる。さらに、新規受容体が、生物学的に重要な特質を既知の受容体と共有する場合、アゴニスト／アンタゴニスト結合に関する情報を、既知の受容体の改良型アゴニスト／アンタゴニストの開発に役立てることもできる。
Ｅ． 医薬組成物および治療上の使用
医薬組成物は、請求項に記載の本発明のポリペプチド、抗体またはポリヌクレオチドを含むことができる。この医薬組成物は、治療に有効な量の本発明のポリペプチド、抗体またはポリヌクレオチドのいずれかを含むであろう。
本明細書において使用される「治療に有効な量」という用語は、目的とする疾患または状態を治療、回復または予防する、または検出可能な治療効果または予防効果を示す治療薬の量をいう。その効果は、例えば化学マーカーまたは抗原レベルによって検出することができる。治療効果には、体温の低下のような身体的な症状の軽減も含まれる。被験者に対する的確な有効量は、被験者の大きさおよび健康状態、病状の性質および程度、および投与のために選択される治療法または治療法の組合せに依存する。従って、前もって正確な有効な量を特定することは無意味である。しかしながら、所定の状況における有効量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断に委ねられる。
本発明の目的のために、当該ＤＮＡ構築物の有効投与量は、投与される個体において約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。
医薬組成物はまた、医薬上許容されるキャリアを含有することができる。「医薬上許容されるキャリア」という用語は、抗体またはポリペプチド、遺伝子のような治療薬、および他の治療薬を投与するためのキャリアを指す。この用語は、組成物を摂取する個体に有害な抗体の生産をそれ自身が誘発せず、また不適切な毒性を伴わずに投与できるあらゆる医薬用キャリアを指す。適切なキャリアは、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、および不活性ウイルス粒子など、大きく、ゆっくり代謝される高分子であってもよい。このようなキャリアは、当該業者に周知である。
医薬上許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸塩を、本発明において使用することができる。医薬上許容される賦形剤に関する詳細な議論が、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mark Pub. Co., N.J. 1991)に記載されている。
治療用組成物における医薬上許容されるキャリアとして、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体が含まれる。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等のような補助物質を、このような媒体中に存在させることができる。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射物質として調製される。また注射前に液体媒体中で溶液または懸濁液とするのに適した固体形としても調製されうる。リポソームは医薬上許容されるキャリアの定義の範囲に含まれる。
供給方法
製剤化した後、本発明の核酸組成物を、（１）被験体に直接投与する、（２）ex vivoで被験体由来の細胞に供給する、あるいは（３）組換えタンパク質の発現のためにin vitroで供給することができる。
組成物の直接的な供給は、一般的には皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内への注入により達成され、または組織の間隙に供給される。組成物はまた、腫瘍内または病巣内に投与され得る。他の投与様式として、経口および肺投与、坐薬、および経皮適用、針、および遺伝子銃または皮下噴射器が挙げられる。投薬治療は、単回投与量スケジュールまたは複数回投与量スケジュールであってよい。
ex vivo供給方法および形質転換細胞を被験体へ再移植する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば国際公開公報第９３／１４７７８号に記載されている。ex vivo適用において有用な細胞の例として、例えば、幹細胞、特に造血幹細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。
一般に、ex vivoおよびin vitro 適用における核酸の供給は、例えば、デキストランによるトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによるトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム中への封入、およびＤＮＡの核への直接的なマイクロインジェクションによって達成することができ、これらすべては当該技術分野において周知である。
いったん対象遺伝子が増殖障害、例えば、新形成症、異形成症および過形成症と相関することが見出されれば、その障害は、その核酸または対応ポリペプチドに基づく治療薬の投与により治療されやすいであろう。
アンチセンスポリペプチドの調製は上に記載されている。アンチセンス組成物により治療される新形成症として、子宮頚癌、黒色腫、結腸直腸腺癌、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、肉腫、筋肉腫、肺癌腫、白血病、例えば慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、単球性白血病および骨髄性白血病、並びにリンパ腫、例えば組織球性リンパ腫を含むが、これらに限定されない。該治療組成物によって治療される増殖障害には、脱水性（anhydric）遺伝性外胚葉性形成異常、先天性肺胞形成異常、頚部上皮性形成異常、線維性骨形成異常、乳房形成異常のような障害が含まれる。過形成症、例えば子宮内膜、副腎、乳房、前立腺もしくは甲状腺の過形成症、または皮膚の偽上皮腫性増殖症は、アンチセンス治療組成物によって治療される。対応遺伝子の突然変異が関係していない障害においてさえも、核酸関連遺伝子の発現の減少調節または抑制は、治療に適用され得る。例えば、核酸関連遺伝子の発現の減少は、該遺伝子の増強発現が関係する腫瘍を抑制する助けとなり得る。
アンチセンス組成物の投与量および投与手段の両方が、治療組成物の特質、患者の病状、年齢および体重、疾患の進行、および他の関連因子に基づいて決定される。本発明の治療用アンチセンス薬剤の投与として、局所投与または全身投与、例えば注射、経口投与、粒子銃またはカテーテル挿入投与、および局所投与が挙げられる。好ましくは、治療用アンチセンス組成物は、プロモーターと核酸のアンチセンス鎖の少なくとも約１２個、２２個、２５個、３０個または３５個の連続ヌクレオチドのポリヌクレオチド領域とを含む発現構築物を含む。この発現構築物内では、該ポリヌクレオチド領域は、プロモーターより下流側に位置し、該ポリヌクレオチド領域の転写はプロモーターから始まる。
様々な方法を用いて、治療組成物を体内の特定部位に直接投与する。例えば、小さい転移性病異の位置を見つけて、その腫瘍体内の数箇所の異なる位置に治療組成物を数回注入する。あるいは、腫瘍に供給を行う動脈を同定して、腫瘍に直接組成物を供給するために、治療組成物をそのような動脈に注入する。壊死中心を有する腫瘍を吸引し、今や空となった腫瘍の中心へ組成物を直接注入する。アンチセンス組成物を、例えば組成物の局所適用により腫瘍表面に直接投与する。上記の供給方法を確実に助けるために、Ｘ線画像法を用いる。
アンチセンスポリヌクレオチド、サブゲノムポリヌクレオチド、または特定組織に対する抗体を含有する治療組成物を、受容体媒介性に標的に供給することもまた用いられる。受容体媒介性のＤＮＡ供給技術が、例えばFindeis et al., Trends in Biotechnol. (1993) 11:202-205; Chiou et al., (1994) Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed); Wu & Wu, J. Biol. Chem. (1988) 263:621-24; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542-46; Zenke et al., Proc. Nail. Acad. Sci. (USA) (1990) 87: 3655-59; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338-42に記載されている。好ましくは、本発明の抗体を含有する治療組成物の受容体媒介性の標的供給を用いて、特定の組織に抗体を供給する。
アンチセンスサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物を、遺伝子治療プロトコルにおいて局所投与する場合、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコルの期間に、約５００ｎｇ〜５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２ｍｇ、約５ｍｇ〜約５００ｍｇ、および約２０ｍｇ〜約１００ｍｇの濃度のＤＮＡもまた使用できる。作用方法や形質転換および発現の効率などの要素は考慮すべき事柄であり、これらは、アンチセンスサブゲノム核酸の最終的な効果に必要な投与量に影響を及ぼす。広範囲の組織に高発現を望む場合に、有益な治療結果をもたらすには、より多量のアンチセンスサブゲノム核酸が要求され、あるいは、例えば腫瘍部位の隣接または近接する種々の組織部分に連続的に、または数回投与する場合には再投与される同一量が要求されうる。全ての場合に、臨床試験における日常的な実験により、最適な治療効果を示す特定の範囲が決定されるであろう。遺伝子治療ベクター、特にレトロウイルスベクターのより完全な記載は、米国特許出願第０８／８６９，３０９号（本明細書に明示的に援用する）および以下のセクションＦに見られる。
抗炎症活性を有するポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードする遺伝子に関する適切な用法、用量および投与が、米国特許第５，６５４，１７３号に記載されている（これを参照により本明細書に援用する）。治療薬剤はまた、米国特許第５，６５４，１７３号に記載されるように、対象核酸によりコードされるタンパク質およびポリヌクレオチドに対する抗体を含む。
Ｆ．遺伝子治療
本発明の治療用核酸を、遺伝子供給担体中で利用することができる。この遺伝子供給担体は、ウイルス由来でも非ウイルス由来でもよい（一般的にJolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51-64; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845-852; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185-193およびKaplitt, Nature Genetics (1994) 5:148-153参照）。本発明の治療薬のコード配列を含む構築物を供給するための遺伝子治療用担体を、局所的または全身的に投与することができる。これらの構築物を、ウイルス性または非ウイルス性ベクターによるアプローチに利用することができる。このようなコード配列の発現は、内在性の哺乳動物プロモーターまたは異種性のプロモーターを用いて誘発させることができる。コード配列の発現は構成性でも制御性でもよい。
本発明は、選択した注目核酸分子を運搬または発現するように構築された組換えレトロウイルスを用いることができる。用いることが可能なレトロウイルスベクターとして、欧州特許第０４１５７３１号；国際公開第９０／０７９３６号；国際公開第９４／０３６２２号；国際公開第９３／２５６９８号；国際公開第９３／２５２３４号；米国特許第５，２１９，７４０号；国際公開第９３／１１２３０号；国際公開第９３／１０２１８号；Vile and Hart, Cancer Res.(1993) 53:3860-3864；Vile and Hart, Cancer Res. (1993) 53:962-967；Ram et al., Cancer Res. (1993) 53:83-88；Takamiya et al., J. Neurosci. Res.(1992) 33:493-503；Baba et al., J. Neurosurg. (1993) 79:729-735；米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０３４５２４２に記載されるものが挙げられる。好ましい組換えレトロウイルスとして国際公開第９１／０２８０５号に記載されるものが挙げられる。
上述のレトロウイルスベクター構築物と共に使用するのに適したパッケージング細胞株は容易に調製され（ＰＣＴ国際公開第９５／３０７６３号および第９２／０５２６６号参照）、これを用いて、組換えベクター粒子を生産するためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株ともいう）を作製することができる。本発明における特に好ましい態様では、パッケージング細胞株は、ヒト（例えばＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作製され、これによりヒト血清中における不活性化を生き抜くことができる組換えレトロウイルスの生産が可能となる。
本発明はまた、遺伝子供給担体として機能することができるアルファウイルス系ベクターを用いる。かかるベクターは、多種多様のアルファウイルス、例えばシンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）から構築することができる。かかるベクター系の代表例が、米国特許第５，０９１，３０９号、第５，２１７，８７９号および第５，１８５，４４０号、およびＰＣＴ国際公開第９２／１０５７８号、第９４／２１７９２号、第９５／２７０６９号、第９５／２７０４４号および第９５／０７９９４号に記載されている。
本発明の遺伝子供給担体はまた、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのようなパルボウイルスを用いることができる。代表例として、国際公開第９３／０９２３９号；Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828；Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165；およびFlotte et al., PNAS (1993)90:10613-10617により開示されるＡＡＶベクターがある。
アデノウイルスベクターの代表例は、Berkner, Biotechniques (1988)6:616-627；Rosenfeld et al., Science (1991) 252:431-434；国際公開第９３／１９１９１号；Kolls et al., PNAS (1994) 91:215-219；Kass-Eisler et al., PNAS (1993) 90:11498-11502；Guzman et al., Circulation (1993) 88:2838-2848；Guzman et at., Cir. Res. (1993) 73:1202-1207；Zabner et al., Cell(1993) 75:207-216；Li Ct et al., Hum. Gene Ther. (1993) 4:403-409；Cailaud et al., Eur. J. Neurosci. (1993) 5:1287-1291；Vincent et al., Nat. Genet. (1993) 5:130-134；Jaffe et al., Nat. Genet. (1992) 1:372-378；およびLevrero et al., Gene (1991) 101:195-202に記載されている。本発明に使用可能な典型的なアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、国際公開第９４／１２６４９号；国際公開第９３／０３７６９号；国際公開第９３／１９１９１号；国際公開第９４／２８９３８号；国際公開第９５／１１９８４号；および国際公開第９５／００６５５号に記載されている。Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147-154に記載されるような不活性化(killed)アデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与を用いてもよい。
他の遺伝子供給担体および方法を用いてもよく、例えば、不活性化アデノウイルス単独に連結された、または連結されてないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えばCuriel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147-154参照）；リガンド連結ＤＮＡ（例えばWu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985-16987参照）；真核細胞供給担体細胞（例えば１９９４年５月９日に提出された米国特許出願第０８／２４０，０３０号、および米国特許出願第０８／４０４，７９６号参照）；光重合ヒドロゲル材料の沈着；米国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような携帯型遺伝子移入パーティクルガン；米国特許第５，２０６，１５２号および国際公開第９２１１１０３３号に記載されるような電離放射線；核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられる。さらなるアプローチが、Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411-2418およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 1581-1585に記載されている。
裸のＤＮＡもまた使用することができる。典型的な裸のＤＮＡの導入方法は、国際公開第９０１１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。取り込み効率は、生分解性ラテックスビーズを使用して改善することができる。ＤＮＡ被覆ラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシスの開始後に、効率よく細胞内に輸送される。この方法は、疎水性を高めるようにビーズを処理することによりさらに改善され、それによってエンドソームの破壊とＤＮＡの細胞質への放出が促進される。遺伝子供給担体として働くリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、国際公開第９５／１３７９６号、国際公開第９４／２３６９７号、および国際公開第９１／１４４４５号、ならびに欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。
さらに使用に適した非ウイルス性供給には、Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91(24): 11581-11585に記載されているアプローチのような機械的供給システムがある。さらにコード配列およびその発現産物を、光重合ヒドロゲル材料の沈着により供給することができる。コード配列の供給に使用することのできる他の従来の遺伝子供給方法には、例えば、米国特許第５，１４９，６５５号に記載の携帯型遺伝子移入粒子銃の使用、米国特許第５，２０６，１５２号および国際公開第９２／１１０３３号に記載の移入遺伝子を活性化するための電離放射線の使用がある。
Ｇ．トランスジェニック動物
本発明の一態様は、１または複数の遺伝子の生物活性が染色体に組込まれた導入遺伝子によって改変された生殖系細胞および／または体細胞を有するトランスジェニック非ヒト動物に関する。
好ましい態様では、導入遺伝子は、野生型タンパク質の生物機能の少なくとも一部に拮抗する優性ネガティブタンパク質のような突然変異タンパク質をコードする。
さらに別の好ましいトランスジェニック動物は、導入遺伝子から転写される際に、遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズし、その遺伝子の発現を抑制するアンチセンス転写物をコードする導入遺伝子を含む。
一実施形態において、本発明は、非ヒト動物細胞または動物細胞（ヒト細胞を含む）を癌にかかりやすくさせる所定の特異的な所望の変化を含む所望の非ヒト動物または動物細胞を提供する。具体的に本発明は、腫瘍抑制遺伝子の２つの対立遺伝子のうち少なくとも１つが不完全である遺伝的に改変された非ヒト動物（最も好ましくはマウス）、または培養細胞（非ヒト動物またはヒト細胞）に関する。これらの腫瘍抑制対立遺伝子の少なくとも１つの不活性化により、腫瘍誘発または他の増殖障害もしくは分化障害、あるいは、例えばサイトカインまたは増殖因子由来の異常シグナル伝達によって特徴付けられる障害に対して高い感受性を有する動物が生じる。遺伝子的に改変されたこの型のマウスは、遺伝性癌の有用なモデルとして、および発癌物質の研究用の試験動物として利用可能である。本発明は、さらに研究および医療におけるこのような非ヒト動物細胞または動物細胞、およびそれらの子孫の使用にも関する。
さらに、本発明におけるトランスジェニック動物の細胞は他の導入遺伝子（例えば、第２の腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子の生物学的活性を改変させる導入遺伝子）を含み得ると考えられる。例えば、この第２の導入遺伝子は、ｐ５３、ｐ７３、ＤＣＣ、ｐ２１cip1、ｐ２７kip1、Ｒｂ、ＭａｄまたはＥ２Ｆのような第２の腫瘍抑制遺伝子の生物活性を機能的に崩壊する力を持っている。あるいは、第２導入遺伝子は、ｒａｓ、ｍｙｃのような癌遺伝子、ｃｄｃ２５ホスファターゼ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−６、形質転換成長因子、ｎｅｕ、ｉｎｔ−３、ポリオーマウイルス中型Ｔ抗原、ＳＶ４０大型Ｔ抗原、乳頭腫ウイルスＥ６タンパク質、乳頭腫ウイルスＥ７タンパク質、ＣＤＫ４、またはサイクリンＤ１の過剰発現または制御損失を引き起こすことができる。
本発明における好ましいトランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子の１つ以上の対立遺伝子が、染色体に組み込まれた導入遺伝子によって崩壊された生殖系細胞および／または体細胞を有する。該導入遺伝子は、トランスジェニック動物の細胞において導入遺伝子の存在を確認するための検出可能なシグナルを生じるマーカー配列を含み、かつ該遺伝子の少なくとも一部分を置き換えるか、または該遺伝子内に挿入されるか、または野生型タンパク質の発現を崩壊させる。
本発明のさらに別の態様は、機能的に崩壊された内在性遺伝子を有する非ヒト動物および幹細胞を作製する方法に関する。好ましい実施形態では、上記方法は、下記の工程を含む：
(i) (a) 該遺伝子の少なくとも一部を有する組換え領域であって、導入遺伝子と該遺伝子との組換えを誘導する組換え領域、および(b) 細胞内の導入遺伝子の存在を確認するための検出可能なシグナルを生じるマーカー配列、を含む導入遺伝子構築物を構築する工程、
(ii）導入遺伝子を非ヒト動物の幹細胞に移入する工程、
(iii) 導入遺伝子と該遺伝子との間で正しい標的に対して相同組換えが行われた幹細胞を選択する工程、
(iv)工程(iii)において同定した細胞を非ヒト胚盤胞に移入して、得られたキメラ胚盤胞を非ヒト雌に移植する工程、および
(v) 正しい標的に対して組換えが行われた内在性遺伝子の対立遺伝子を有する子孫を回収する工程。
本発明のさらに別の態様は、（ｉ）試験薬剤を本発明のトランスジェニック動物に接触させること、および（ii）処理動物由来の試料中の形質転換細胞数を、未処理トランスジェニック動物由来または対照薬剤で処理したトランスジェニック動物由来の試料中の形質転換細胞数と比較することにより、薬剤の発癌性を評価する方法を提供する。対照薬剤で処理されていない場合の形質転換細胞数と比較して、処理動物における形質転換細胞数の差異は、試験化合物の発癌性を示唆する。
本発明の別の態様は、試験化合物の抗増殖活性の評価方法を提供する。好ましい態様では、該方法は、本発明のトランスジェニック動物またはそのような動物由来の細胞試料を試験薬剤と接触させること、および上記トランスジェニック動物由来の試料または上記細胞試料における形質転換細胞数を決定すること、を含む。試験薬剤の非存在下における形質転換細胞数と比較して、形質転換細胞数の統計学的に有意な減少は、その試験化合物が抗増殖性薬剤である可能性を示唆する。
本発明の実施では、別記しない限り、当該技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を用いる。かかる技術は、文献に充分に説明されている。例えばMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al., US Patent No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986), B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
上述したとおり、本明細書に記載の配列は、特に結腸癌に関して有用であると考えられる。しかしながら、これらはまた、他の型の癌および他の疾患状態についても有用であり得る。
本発明について、特に好適な実施形態を記載している下記の実施例を参照して説明する。しかしながら、これらの実施形態は例示的であり、いかなる場合においても本発明を制限するものと解釈されない。
ＸＩ． 実施例
Ａ．差異的に発現する配列の同定
ライブラリーの説明
配列番号９〜１６は、下記のとおりＤＥおよびＰＡと指定されるライブラリーから調達され、そして上記のとおりクローニング工程中に短縮化され、配列番号１〜８の配列を生じた。ＤＥライブラリーは、標準化された結腸癌特異的減算的(subtracted) cDNAライブラリーである。ＤＥライブラリーは、結腸癌（近位および遠位のDukes’ B, ミクロサテライト安定型(MSS))に発現される配列に特異的であるが、正常結腸組織を含む正常組織には発現しない。ＰＡライブラリーは、標準化された結腸特異的減算的cDNAライブラリーである。ＰＡライブラリーは、正常結腸に発現される配列に特異的であるが、他の正常組織には発現しない。
結腸癌特異的ライブラリーの構築
減算的結腸癌特異的ライブラリーは、結腸、末梢血白血球（ＰＢＬ）、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、小腸、骨格筋および前立腺組織のｃＤＮＡから作製されたプールされたドライバー正常ｃＤＮＡの組み合わせに対して、プールされた近位(proximal)、ステージＢ、ＭＳＳの、および遠位(distal)、ステージＢ、ＭＳＳの腫瘍組織のｃＤＮＡを差し引くことによって作製された。下記ＲＮＡ試料がOrigene Technologies, Inc., Rockville, Marylandから得られ、プールされたドライバーｃＤＮＡを合成するために使用された：＃ＨＴ−１０１５正常結腸全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００５肝臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００４脾臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００９肺全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００３腎臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００６末梢血白血球全ＲＮＡ、＃ＨＴ−前立腺全ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００２心筋ポリＡ＋ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００７腸ポリＡ＋ＲＮＡ、および＃ＨＭ−１００８骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ。第一鎖ｃＤＮＡを、それぞれＲＮＡ１μｇを使用して調製した。５０容量％の正常結腸第一鎖ｃＤＮＡ反応物および各々５．５６容量％の残りの組織の第一鎖ｃＤＮＡ反応物を含む偏向第一鎖ｃＤＮＡプールを調製した。それぞれに偏向第一鎖ｃＤＮＡ反応プール１μｌを含む８個の増幅反応を１８サイクル行った。８個すべての増幅反応から二本鎖ｃＤＮＡ産物をプールし、次の減算的ハイブリダイゼーションでの使用のために精製した。
簡単に述べると、Clontech SMART PCR cDNA合成キット（Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Calif.から購入した）を用いて、その使用説明書に従って二本鎖ｃＤＮＡを作製した。Clontech PCR-Selectキット（Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Calif.から購入した）（例えばDaitchenko et al., 1996 PNAS 93:6025-6030, Gurskaya et al., 1996 Analytical Biochemistry 240:90-97に記載されている）の使用説明書に従って、減算的ハイブリダイゼーションを行った。各減算的実験において、４５倍過剰量のドライバーｃＤＮＡ(450 ng)を用いた。ドライバーｃＤＮＡによるテスト試料(tester)の減算的ハイブリダイゼーションを２回、それぞれ約８〜１２時間行なった。減算的な癌特異的ＤＥｃＤＮＡを、pCR2.1-TOPOプラスミドベクター（Invitrogen Corporation, Carlsbad CA）内に連結し、ウルトラコンピテント(ultracompetent)なEpicurian大腸菌XL10-Gold細胞(Stratagene, La Jolla, CA)に化学的に導入した。テスト試料とドライバー試料を入れ替えた逆ライブラリーもまた構築し、このライブラリーをＭＤと称した。
正常結腸特異的ライブラリーの構築
この正常結腸組織特異的ライブラリーを、使用説明書(PT1117-1)の指示に従い、Clontech Laboratories, Inc., PCR-Select kit, K1804-1を使用して作製した。
正常試料、非癌試料、患者試料についてそれぞれ４つの１００μｌのＳＭＡＲＴ ＰＣＲ ｃＤＮＡ増幅反応を、それぞれの第一鎖ｃＤＮＡ反応液１μｌから開始して行った。各試料を、次のＰＣＲ条件：９５Ｃ−ｂ秒、６８Ｃ ５ｍｍで、9600 Perkin Elmer装置を使用して１８サイクルのみ増幅した。以下に、増幅されたｃＤＮＡ試料に関するバイエル診断試料識別番号を示す：ＮＰＢ（−）２７３４７、ＮＰＢ（−）２７８５９、ＮＰＢ（−）２８１４７、ＮＰＢ（−）２８１６２、ＮＤＢ（−）２８８００、ＮＤＢ（−）２９２４３、ＮＤＢ（−）２９２４４およびＮＤＢ（−）４２４７２。これらは、近位、ステージＢ、ＭＳＳの、および遠位、ステージＢ、 ＭＳＳの癌試料を提供する同一患者から得られた正常結腸組織試料であり、上述のＤＥライブラリーを調製するために使用した。等容量の８つの正常結腸ｃＤＮＡをプールした。減算的正常結腸組織特異的ライブラリーを、正常結腸ｃＤＮＡプールを、末梢血白血球（ＰＢＬ）、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、小腸、骨格筋、および前立腺組織のｃＤＮＡから作製されたプールされたドライバーｃＤＮＡの組合せに対して差し引くことにより作製した。以下に、プールされたドライバーｃＤＮＡを合成するために使用したＲＮＡ試料を示す：＃ＨＴ−１００５肝臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−ｂ００４脾臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００９肺全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００３腎臓全ＲＮＡ、＃ＨＴ−１００６末梢血白血球全ＲＮＡ、＃ＨＴ−前立腺全ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００２心筋ポリＡ＋ＲＮＡ、＃ＨＭ−１００７腸ポリＡ＋ＲＮＡ、および＃ＨＭ−ｂ００８骨格筋ポリＡ＋ＲＮＡ。各々の第一鎖ｃＤＮＡを、ＲＮＡ１μｇを用いて調製した。続いて、等容量の９つのドライバー組織の第一鎖ｃＤＮＡ反応液から構成される、第一鎖ｃＤＮＡプールの反応を行った。それぞれ１μｌの第一鎖ｃＤＮＡ反応液プールを含む８つの増幅反応を１８サイクル行った。８つすべての増幅反応から二本鎖ｃＤＮＡ産物をプールし、続く減算的ハイブリダイゼーションでの使用のために精製した。正常結腸組織特異的減算的ライブラリーをＰＡと称し、このライブラリーに由来する個々のクローンを、ＰＡを前に付けた番号により参照する。
先に列挙したヒト組織から成る、標準化された減算的正常結腸特異的ｃＤＮＡライブラリーＰＡおよび減算的正常ヒト組織特異的ｃＤＮＡライブラリーを、公知の手法(Daitchenko et al., 1996 PNAS 93:6025-6030; Gurskaya et al., 1996 Analytical Biochemistry 240:90-97)に従い、Clontech Laboratories, Inc., PCR-Select cDNA subtraction kit, P11117-1を使用して作成した。ライブラリーの構築およびクローニングは、結腸癌特異的ライブラリーに関する上記のとおりに行った。差異的発現に関して分析した１１５２クローンのうち、同時係属中の米国出願第０９／３８５,９８２号に記載したとおり、約６９％が差異的に発現していた。
減算的ライブラリーの作製に用いたｃＤＮＡはＲｓａＩ（平均約６００塩基対の大きさの断片を生じる４塩基切断制限エンドヌクレアーゼ）で切断されているので、各上記ライブラリーから単離されたそれぞれのＥＳＴは、部分的ｍＲＮＡ転写物由来の配列を表わす。すなわち、上記ＳＭＡＲＴ（登録商標）システム(BD Biosciences)を用いて、全細胞ＲＮＡ試料から完全長のｍＲＮＡを作製し、次にこれを用いて、完全長のｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。続いて、この完全長ｃＤＮＡをＲｓａＩなどの制限酵素により消化して、減算的ハイブリダイゼーションに有用である短い断片を作製した。この方法に従って本発明において、完全長配列（配列番号９〜１６）のＲｓａＩ消化産物である配列番号１〜８の配列が、結腸癌において差異的に発現されているものとして同定された。
結腸癌における差異的発現の検証
このライブラリーで見出された差異的に発現された配列が結腸癌に特異的であることを検証するために、結腸癌特異的ライブラリー（デラウェア（ＤＥ））、および正常組織特異的ライブラリー（メリーランド（ＭＤ））から調製されたｃＤＮＡを用いて該クローンをスクリーニングした。
ｃＤＮＡクローンを、von Stein et al. (1997, Nucleic Acids Research 25(13):2598-2602)により開発された手法に従い、公知の方法(Jin et al., 1997, Biotechniques 23:1083-1086）により合成されたプローブを用いて、差異的発現に関して分析した。差異的発現に関して分析した１２４８クローンのうち、同時係属中の米国出願第０９／３８５,９８２号に記載したとおり、約８３％が差異的に発現していた。
差異的に発現したクローンの配列決定および分析
差異的に発現されることが示されたクローン内の挿入断片のヌクレオチド配列を、サンガーの配列決定法により、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドを用いて、Ｔ７またはＭ１３プロモーター部位から、一通りの配列決定により決定した。本明細書（ＸＩ．実施例、Ｂ．公的データベースの検索結果）に記載の方法に従い、配列を分析した。
それぞれの核酸は、少なくとも部分的ｍＲＮＡ転写物の配列を表わす。上記のとおり、差異的に発現した配列を同定する本発明の方法は、完全長のｃＤＮＡ分子を部分的なｍＲＮＡ転写物に切断し、次にそれを用いて、その部分配列の差異的発現を調べるという工程を含む。
本発明における差異的に発現する完全長の遺伝子およびその部分配列には、配列番号（図参照）を与えた。これらの核酸配列を添付の配列表に示す。
差異的に発現する配列を確認した例を図３に示す。結腸癌組織から単離したＲＮＡによりAffymetrixヒト遺伝子チップを探索して、配列の差異的発現を決定した。簡単に述べると、２０個の顕微解剖した結腸癌組織試料および２０個の対応正常隣接組織から全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ試料を標識化し、使用説明書に従ってAffymetrix U133Aチップ上で処理した。生シグナルをｙ軸上にプロットし、それぞれの組織試料をｘ軸上に示す。腫瘍試料と正常試料を、表示のとおりグループ化する。ＴＧＦＢｉ（形質転換増殖因子ベータ誘導性蛋白質）に対応するプローブセットによる生シグナルをグラフ中に示す。
Ｂ．公的データベース検索結果
配列番号９〜１６の完全長ｃＤＮＡ配列を、本明細書および同時係属中の米国出願第０９／８７１，１６１号に記載された配列番号１〜８の部分配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ２検索により得た。
８つの配列すべてを分析した。これらの配列をまずマスクしてベクター由来の配列を同定し、続いてそれを除去した。残った配列情報を用いて配列表（配列番号１〜８）を作成した。上記配列の各々をクエリー配列として用いて、先に列挙したデータベースに対してＢＬＡＳＴ２検索を行った。ＢＬＡＳＴ２検索は、２つの配列の最適アライメントを作成するためにギャップの導入を可能とする点で、従来のＢｌａｓｔ検索と異なる。ＢＬＡＳＴ２検索から、部分配列（配列番号１〜８）の各々に対応する完全長配列（配列番号９〜１６）が同定された。これらの配列は、上記のとおり部分配列（配列番号１〜８）を得るために元々用いたものである。ＢＬＡＳＴ２検索により同定された各完全長配列に関するＧｅｎＢａｎｋの記録を用いて、各ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を得た。
当業者は、日常的な範囲の実験を用いて、本明細書に記載した本発明の具体的な態様と等価な多数の態様を認識または確認するであろう。このような具体的な態様および等価な態様は、上述の特許請求の範囲に含まれるものとする。
本明細書に引用したすべての特許公報、特許出願公報および刊行物を、本明細書に全面的に記載したとおりに参照により援用する。
図１−１は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。 図１−２は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−１の続き） 図１−３は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−２の続き） 図１−４は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−３の続き） 図１−５は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−４の続き） 図１−６は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−５の続き） 図１−７は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−６の続き） 図１−８は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−７の続き） 図１−９は、配列番号１〜８および９〜１６の核酸配列を示す。（図１−８の続き） 図２−１は、配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を示す。 図２−２は、配列番号１７〜２４のアミノ酸配列を示す。（図２−１の続き） 図３は、患者の結腸癌試料におけるTGFβiの差異的な発現を示す。

Claims (10)

  1. 個体において結腸癌を検出する方法であって
    （ａ）個体から試料を獲得すること；および
    （ｂ）配列番号１〜８からなる群から選択された核酸配列を含有する核酸配列の存在を検出すること、
    を含む、前記方法。
  2. 個体において結腸癌を検出する方法であって
    （ａ）個体から試料を獲得すること；および
    （ｂ）配列番号９〜１６からなる群から選択された核酸配列から成る核酸配列の存在を検出すること、
    を含む、前記方法。
  3. 個体において結腸癌を検出する方法であって
    （ａ）個体から試料を獲得すること；および
    （ｂ）配列番号１７〜２４からなる群から選択されたポリペプチド配列を含有するポリペプチド配列の、試料中の存在を検出すること、
    を含む、前記方法。
  4. 検出工程が、
    （ａ）試料を、配列番号１７〜２４の１または複数の配列に結合することができるポリペプチドリガンドに接触させること；および
    （ｂ）ポリペプチドリガンドと配列番号１７〜２４の１または複数の配列との結合を検出すること、
    ここで結合の検出が、配列番号１７〜２４からなる群から選択されたポリペプチド配列を含有するポリペプチド配列の、試料中の存在を示唆すること、
    を含む、請求項３に記載の方法。
  5. ポリペプチドリガンドが抗体である、請求項４に記載の方法。
  6. ポリペプチドリガンドが検出可能な標識を含む、請求項４に記載の方法。
  7. 個体が人間である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  8. 検出工程が、
    （ａ）試料を、配列番号１〜８を含有する配列からなる群から選択された配列にハイブリダイズすることができる、配列番号１〜８を含有する配列からなる群から選択された配列内の少なくとも12個の連続ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドプローブに接触させること；および
    （ｂ）ポリヌクレオチドプローブと配列番号１〜８を含有する配列からなる群から選択された配列とのハイブリダイゼーションを検出すること、
    ここでハイブリダイゼーションの検出が、配列番号１〜８からなる群から選択された核酸配列を含有する核酸配列の存在を示唆すること、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  9. 検出工程が、
    （ａ）試料を、配列番号９〜１６を含有する配列からなる群から選択された配列にハイブリダイズすることができる、配列番号９〜１６を含有する配列からなる群から選択された配列内の少なくとも１２個の連続ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドプローブに接触させること；および
    （ｂ）ポリヌクレオチドプローブと配列番号９〜１６を含有する配列からなる群から選択された配列とのハイブリダイゼーションを検出すること、
    ここでハイブリダイゼーションの検出が、配列番号９〜１６からなる群から選択された核酸配列を含有する核酸配列の存在を示唆すること、
    を含む、請求項２に記載の方法。
  10. プローブが検出可能な標識を含む、請求項８に記載の方法。
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