DE69911935T2 - Granulatimide-derivate zur behandlung von krebs - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND
  • Naturprodukte sind eine reiche Quelle für neue organische Verbindungen, von denen viele interessante und wünschenswerte biologische Wirkungen aufweisen. Auf Extrakte eines Organismus von Interesse, wie eines wirbellosen Meerestieres, können Verfahren zur chemischen Trennung und Analyse angewandt werden, um die Struktur biologisch wirksamer Verbindungen zu erhellen. Diese chemischen Strukturen bilden dann die Basis für synthetische Modifikationen, um die erwünschte Wirkung zu verstärken.
  • Meeresaszidien oder Seescheiden haben eine Reihe einzigartiger sekundärer Metaboliten mit starker biologischer Wirkung. Kolonie-Aszidien aus der Familie Didemnidae sind besonders produktiv und enthalten stickstoffhaltige von Aminosäure abgeleitete Metaboliten, einschließlich verschiedener zyklischer Peptide. Diese als Didemnimide bezeichneten Verbindungen wurden von Didemnum conchyliatum isoliert. Diese Verbindungen sind Indol-Maleimid-Imidazol-Alkaloide, die hypothetisch als Kondensation von Tryptophan und Histidin synthetisiert werden könnten.
  • Die weitere Untersuchung von Didemna-Produkten und die Charakterisierung ihrer Wirkbestandteile ist von besonderem Interesse für die Entwicklung neuer Therapiemittel und ihrer Verwendungen.
  • Relevante Literatur
  • Didemnimidverbindungen werden von Vervoot et al., J. Org. Chem. 62, 1486–1490 (1997), beschrieben. Bei der Beschreibung der Synthese derartiger Didemnimidverbindungen berichten Terpin et al., Tetrahedron 54, 1740–172 (1998), ein Ringschlussereignis, das bei Bestrahlung oder bei Umkristallisation aus Methanol eines Boc-geschützten Zwischenproduktes auftreten kann, das im Didemnimid-Syntheseschema zum Einsatz kommt.
  • Die Bildung einer Vielzahl substituierter Diarylmaleimide wird von Smith et al, L. Org. Chem. 55, 3351–3362 (1990), beschrieben.
  • Bekannte G2-Checkpoint-Inhibitoren sind Purin-Analoge, z. B. Coffein, Pentoxifyllin, 2-Aminopurin, 6-Dimethylaminopurin; und Staurosporin mit seinem Derivat UCN-01 (7-Hydroxystaurosporin). Siehe beispielsweise Busse et al., Radiat. Res. 76, 292–307 (1978); Schlegel, Science 232, 1264–1266 (1986); Downes et al., J. Cell. Biol. 110, 1855–1859 (1990); Steinmann et al., P. N. A. S. 88, 6843–6847 (1991); Andreasson et al., P. N. A. S. 89, 2272–2276 (1992); Tam et al., Cell Growth Differ. 3, 811–817 (1992); und Wang et al., J. Nat'l Cancer Inst. 88, 956–965 (1996).
  • Versuche, bei denen Zellen mit einem Mangel an Tumorsuppressorprotein p53 eingesetzt wurden, haben den Wert der beiden Gruppen von oben beschriebenen G2-Checkpoint-Inhibitoren gezeigt, um Krebszellen selektiv für Mittel empfindlich zu machen, die DNA schädigen. Es ist gezeigt worden, dass Pentoxifyllin die durch Cisplatin herbeigeführte Abtötung von p53–-MCF-7-Zellen um das Dreißigfache und die durch Strahlung herbeigeführte Abtötung von p53–-A549-Human-Lungen-Adenokarzinomzellen um das Fünffache erhöht. Siehe beispielsweise Russell et al., Cancer Res. 55, 1639–1542 (1995); Powell et al., Cancer Res. 55, 1643–1648 (1995); Russell et al., Int.). Radiat. Oncol. Biol. Phys. 36, 1099–1106 (1996); Yao et al., Nature Med. 2, 1140–1143 (1996); und Bracey et al., Clin. Cancer Res. 3, 1371–1381 (1997).
  • Die Behandlung bestimmter Krebsarten unter Verwendung von Anthracenverbindungen und pharmazeutischer Derivate davon wird in der WO 96/11933 und EP Nr. 0.841.337 beschrieben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es werden Granulatimidverbindung der Formel I bereitgestellt, wie hierin definiert. Die Erfindung umfasst die natürlich vorkommenden Verbindungen, Granulatimid und Iso granulatimid, in gereinigter oder teilweise gereinigter Form, einschließlich von naturlichen Quellen (z. B. Didemnum granulatum) stammender Extrakte, die diese Verbindungen enthalten. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden Formulierungen der Verbindungen in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Träger bereitgestellt. Die pharmazeutischen Formulierungen sind als zytotoxische Mittel; als ein Protein-Kinase-Inhibitor; sowie zur Hemmung des G2-Checkpoints nützlich. Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I vor, um beispielsweise Zellen für die Wirkungen von DNA-schädigenden Mitteln empfindlich zu machen; sowie die Verwendung derartiger Verbindungen bei der Formulierung von Mitteln, einschließlich Medikamenten.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A bis 1C sind eine Reihe von Graphen, die Folgendes zeigen: 1(A)-G2-Checkpoint-Hemmung durch Isogranulatimid; 1(B) – Isogranulatimid und γ-Strahlung töten p53–-Zellen synergistisch (in einer Menge von 1.000 Zellen pro Napf in 96-Napf-Platten gesäte MCF-7-mp53-Zellen wurden über Nacht gezüchtet und mit 0 Gy (O), 2 Gy(∎), 4(•) oder 6 Gy(⧫) bestrahlt, unmittelbar nach der Bestrahlung wurden die Zellen 16 h lang mit Isogranulatimid behandelt, das Zell-Überleben wurde unter Einsatz eines Tests mit löslichem Tetrazoliumsalz (CellTiter 96TM, Promega) gemessen, 100% Zell-Überleben ist als der Überlebensanteil nach Bestrahlung allein definiert (6 Gy führte zu etwa 80% Zell-Abtötung)); und 1(C) – Isogranulatimid und γ-Bestrahlung töten p53+-Zellen nicht synergistisch (Verfahren identisch mit (B), wobei jedoch MCF-7-Zellen verwendet werden).
  • 2 ist ein Graph, der die G2-Checkpunkt-Hemmung durch Granulatimid zeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSRMEN DER ERFINDUNG
  • Es werden neue Granulatimidverbindung der Formel I bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung umfasst die natürlich vorkommenden Verbindungen, Granulatimid und Isogranulatimid, in gereinigter oder teilweise gereinigter Form, einschließlich von natürlichen Quellen stammende Extrakte, die diese Verbindungen enthalten. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden Formulierungen der Verbindungen in Kombination mit einem physiologisch annehmbaren Träger bereitgestellt.
  • Die pharmazeutischen Formulierungen sind als zytotoxische Mittel nützlich und zur Hemmung von Protein-Kinasen, einschließlich jener, die die Regulierung des G2-Checkpoints bewirken. Eine derartige G2-Checkpoint-Hemmung verhindert das Anhalten oder setzt Zellen frei, die an diesem Checkpoint angehalten werden, wodurch es den Zellen ermöglicht wird, zur Mitose zu gelangen. Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I vor, um Zellen für die Wirkungen von DNA schädigenden Mitteln empfindlich zu machen; sowie die Verwendung derartiger Verbindungen bei der Formulierung von Mitteln, einschließlich Medikamenten, um die Wirkung von DNA schädigenden Mitteln auf Zellen zu verstärken.
  • DEFINITIONEN
  • Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die beschriebene(n) spezielle(n) Methodik, Vorschriften, Zelllinien, Tierspezies oder -gattungen und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur dem Zweck dient, bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben, und nicht dazu bestimmt ist, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zu beschränken, der nur durch die beiliegenden Ansprüche begrenzt ist.
  • Alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe haben wenn nicht explizit anders angegeben, die Bedeutung, in der sie Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise verstehen.
  • Granulatimidverbindungen: wie hierin verwendet, wird der Begriff "Granulatimidverbindung" allgemein verwendet, um eine Klasse von Verbindungen mit der Struktur gemäß nachstehender Formel I zu beschrieben. Dieser Genus umfasst die natürlich vorkommenden Verbindungen Granulatimid und Isogranulatimid. Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung, die hierin als Verbindungen der Formel I bezeichnet werden, haben die folgende Struktur, einschließlich aller Stereoisomere, wenn die Verbindung als Stereoisomere vorliegt: Formel I
    Figure 00050001
    worin:
    R4 und R5 unabhängig voneinander R oder Z wie nachstehend definiert sind oder R4 und R5 in Kombination Ar1 sind, wie nachstehend definiert;
    Ar1 ein gegebenenfalls mit R oder Z substituiertes monozyklisches, bizyklisches oder trizyklisches, vollständig oder teilweise aromatisches System ist, das 5- oder 6-gliedrige carbozyklische oder Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefel-hältige heterozyklische Ringe enthält;
    W aus der aus Formel (i), (ii) oder (iii) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die Strukturen folgende sind:
    Figure 00060001
    worin K, E und T jeweils unabhängig voneinander aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind: N, CR und CZ, und worin R und Z wie nachstehend definiert sind;
    Figure 00060002
    worin K und E jeweils unabhängig voneinander aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind: N, CR und CZ, und worin R, Z und Q wie nachstehend definiert sind; und
    Figure 00060003
    worin K, E, T und U jeweils unabhängig voneinander aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind: N, CR und CZ, und worin R und Z wie nachstehend definiert sind;
    R1 aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: R; RCO-; Ar2CO-; und Ar2CH2-, worin Ar2 ein aromatischer Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Penanthryl, Furan, Pyrrol, Thiophen, Benzofuran, Benzothiophen, Chinolin, Isochinolin, Imidazol, Thiazol, Oxazol und Pyridin, und Ar2 gegebenenfalls mit R oder Z substituiert sein kann, worin R und Z wie nachstehend definiert sind;
    R aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist H; und einem strukturellen Fragment mit einem gesättigten oder ungesättigten linearen, verzweigten oder zyklischen Skelett, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, worin die Kohlenstoffatome gegebenenfalls mit einem Substituenten substituiert sind, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: -OH; -OR3; -O2CR3, -SH; -SR3; -SOCR3; -NH2; -NHR3; -NH(R3)2; -NHCOR3; -NRCOR3; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2N; -CO2R3; -CHO; -COR3; -CONH2; -CONHR3; -CON(R3)2; -COSH; -COSR3; -NO2; -SO3H; -SOR3; und -SO2R3, worin R3 eine lineare, verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen ist;
    Z ein optionaler Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: H; -OH; -OR; -O2CR; -SH; -SR; -SOCR; -NH2; -NHR; -NH(R)2; -NHCOR; -NRCOR; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R; -CHO; -COR; -CONH2; -CONHR; -CON(R)2; -COSH; -COSR; -NO2; -SO3H; -SOR; und -SO2R;
    Q aus der aus NR1; 0; S und C(R)2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und
    X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der aus O; H, OH; und H2 bestehenden Gruppe, vorzugsweise O, ausgewählt sind.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind R4 und R5 ein bizyklisches aromatisches System, das einen 5-gliedrigen und einen 6-gliedrigen Ring umfasst und die folgende Struktur aufweist:
    Figure 00070001
    worin die K jeweils unabhängig voneinander aus der aus N, NR, CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und worin Z und R wie zuvor definiert sind.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen R4 und R5 die folgende bizyklische Struktur auf:
  • Figure 00080001
  • Wenn die Granulatimidverbindung die obige R4/R5-Gruppe umfasst, kann die W-Gruppe der Formel (i) verwendet werden, um die in Formel II gezeigte Struktur bereitzustellen.
  • Formel II
    Figure 00080002
  • Die Verbindung der Formel II kann weiter durch die Hinzufügung verschiedener funktioneller Gruppen derivatisiert werden, wie in Formel III gezeigt: Formel III
    Figure 00080003
    worin S1 aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
    Figure 00090001
    worin K, X, Y und R1 wie oben definiert sind und R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, die verzweigt oder unverzweigt, linear oder zyklisch ist.
  • Alternativ dazu ist die Granulatimidverbindung wie nachstehend in Formel IV dargelegt abgeleitet:
    Figure 00090002
    Formel IV worin K, X, Y und R1 wie oben definiert sind, R gleich H oder ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist; und S2 die Formel (iv)
    Figure 00090003
    hat oder S2 eine lineare Alkylkette mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist die ein endstandi- ges NR2 enthält, worin R2 eine verzweigte oder unverzweigte, lineare oder zyklische Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
  • Gemäß einer weiteren alternativen Ausführungsform hat die Granulatimidverbindung die in Formel V gezeigte Struktur:
    Figure 00100001
    Formel V worin K, X, Y und R1 wie oben definiert sind und S3
    Figure 00100002
    ist und X1 aus der aus N(CH3)2, NHCH3, NH2,
    Figure 00100003
    bestehenden Gruppe ausgewählt ist oder S3 eine lineare Brücke aus zwischen 5 und 8 Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatomen ist, worin die Brücken-Kohlenstoffatome OR- oder NR2-Substituenten aufweisen können und BrückenßStickstoffatome R-Sub- stituenten aufweisen können, worin R wie obenstehend definiert ist.
  • Bevorzugte Strukturen für W sind die oben beschriebenen fünfgliedrigen Ringe, die mehr bevorzugt 1 oder 2 Stickstoffatome umfassen. Vorzugsweise sind E, K, T und U (sofern vorhanden): N oder CH. Auch ist vorzugsweise Q NH. Auch ist vorzugsweise R1 H oder CH3. Auch sind vorzugsweise X und Y Sauerstoff.
  • Nachstehend folgen Beispiele für Verbindungen der Formel I, in denen R4 und R5 Ar1 sind, wobei K, Q, R und Z jeweils unabhängig voneinander wie oben definiert ausgewählt sind.
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Granulatimidverbindung einen basischen Stickstoff entweder an Position 16 oder 17, gemäß dem nachstehend in Formel II gezeigten Nummerierungsschema (wie zuvor beschrieben).
  • Figure 00120002
    Formel IIa
  • Vorzugsweise ausgeschlossen als Granulatimidverbindungen gemäß vorliegender Erfindung sind Derivate, die eine Schutzgruppe, beispielsweise Boc usw., an der Position umfassen, die im obigen Schema 1 entspricht.
  • Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind die folgenden, mit Substituenten wie oben definiert oder wie speziell nachstehend definiert, wobei "Me" immer einen Methyl-Substituenten darstellt.
    Figure 00130001
    worin Q=NH ist; R1=H ist; und aus K, E, T=N oder CH ist;
    Figure 00130002
    worin gilt: Q=NH; R1=H; und jedes von K, E, T=N oder CH ist; und
    Figure 00130003
    worin gilt: Q=NH oder NMe; R1=H oder Me; und jedes von K, E, T=N oder CH;
    Figure 00140001
    worin Q=NH oder Nme ist; R1=H oder Meist; und jedes von K, E, T=N oder CH ist;
    Figure 00140002
    worin Q=NH oder Nme ist; R1=H oder Me ist; und jedes von K, E, T=N oder CH ist; und
    Figure 00140003
    worin Q=NH oder Nme ist; R1=H oder Meist; und jedes von K, E, T=N oder CH ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Granulatimidverbindung eine der natürlich vorkommenden Verbindungen Granulatimid oder Isogranulatimid.
  • Figure 00150001
    Granulatimid
  • Figure 00150002
    Isogranulatimid
  • Pharmazeutisch annehmbare Salze der Granulatimidverbindungen fallen ebenfalls in den Schutzumfang der hierin offenbarten Verbindungen. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze", wie hierin verwendet, bezeichnet ein anorganisches Säureadditionssalz, wie Hydrochlorid, Sulfat und Phosphat, oder ein organisches Säureadditionssalze, wie Acetat, Maleat, Fumarat, Tartrat und Citrat. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Metallsalze sind Alkalimetallsalze, wie Natriumsalz und Kaliumsalz, Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalz und Kalziumsalz, Aluminiumsalz und Zinksalz. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Ammoniumsalze sind Ammoniumsalz und Tetramethylammoniumsalz. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare organische Aminadditionssalze sind Salze mit Morpholin und Piperidin. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare Aminosäureadditionssalze sind Salze mit Lysin, Glycin und Phenylalanin.
  • Proteinkinasen und Inhibitoren: Bei diesen Enzymen wird das γ-Phosphat von ATP oder GTP verwendet, um Phosphatmonoester zu erzeugen, wobei Proteinalkoholgruppen auf Serin oder Threonin und/oder Proteinphenolgruppen (Tyrosin) als Phosphatgruppenakzeptoren verwendet werden. Sie sind aufgrund ihrer homologen Kinase-Domänen verwandt, die aus 200 bis 300 Aminosäureresten bestehen. Die Kinase-Domänen verleihen die katalytische Wirkung durch die Bindung und Orientierung des Phosphat-Donors als Komplex mit zweiwertigem Kation; die Bindung und Orientierung des Polypeptidsub- strats; sowie Transfer des γ-Phosphats vom ATP oder GTP zum Akzeptor-Hydroxyrest. Proteinkinasen sind daran beteiligt, Wege für solche wichtigen Zellaktivitäten als Reaktionen auf extrazelluläre Signale und Zellzyklus-Checkpoints zu signalisieren. Die Hemmung spezifischer Proteinkinasen stellt ein Mittel dar, um in diese Signal-Wege einzugreifen, beispielsweise um die Wirkung eines extrazellulären Signals zu blockieren, eine Zelle vom Zellzyklus-Checkpoint freizusetzen usw.
  • Defekte in der Aktivität von Protein-Kinasen sind mit einer Vielzahl pathologischer oder klinischer Leiden verbunden, wobei ein Defekt bei der durch Protein-Kinasen vermittelten Signalisierung vorliegt. Zu diesen Zuständen gehören jene, die mit Defekten in der Zellzyklus-Regulierung oder als Reaktion auf extrazelluläre Signale verbunden sind, z. B. Hyperglykämie und Diabetes Typ I und Typ II, immunologische Störungen, z. B. Autoimmun- und Immundefizienzerkrankungen; hyperproliferative Störungen, die Psoriasis, Arthritis, Entzündung, Krebs usw. umfassen können.
  • Zu den Protein-Kinasen von Interesse gehören jene, die an der Zellzyklus-Regulierung, insbesondere am G2-Checkpoint, beteiligt sind. Andere Kinasen von Interesse sind jene, die an den GSK3- und ILK-Signalisierungswegen beteiligt sind. Glycogen-Synthase-Kinase-3 (GSK3) ist an der Regulierung mehrerer physiologischer Prozesse beteiligt, einschließlich der Steuerung von Glycogen- und Protein-Synthese durch Insulin, Modulation der Transkriptionsfaktoren AP-1 und CREB, der Spezifizierung des Zell-Werdegangs und der dorsoventralen Musterbildung. GSK3 wird durch Serinphosporylierung als Reaktion auf Insulin oder Wachstumsfaktoren und in vitro durch MAP-Kinase-aktiviertes Protein (MAPKAP) Kinase-1 oder p70-Ribosomal-S6-Kinase gehemmt.
  • Integrin-gebundene Kinase (ILK) ist eine Ankyrin-Wiederholung, die Serin-Threonin-Protein-Kinase enthält, die zur Wechselwirkung mit den zytoplasmatischen Domänen von Integrin-β1-, -β2- und -β3-Untereinheiten fähig ist. Die Überexpression von ILK in Epithelzellen unterbricht die Zell-Extrazellulärmatrix- sowie die Zell-Zell-Wechselwirkung, unterdrückt durch Suspension herbeigeführte Apoptose und sumuliert den Ankerungs- unabhängigen Zellzyklus-Fortschritt. Außerdem führt ILK zu nuklearer Translokation von β-Catenin, worin sich letzteres mit einem T-Zellen-Faktor/Lymphozytenverstärker-Bindungsfaktor 1 (TCF/LEF-1) assoziiert, um einen aktivierten Transkriptionsfaktor zu bilden.
  • Die Granulatimidverbindungen gemäß vorliegender Erfindung wirken als spezifische Protein-Kinase-Inhibitoren und sind als Therapiemittel für die Behandlung von Zuständen nützlich, die durch mit diesen Proteinen verbundene Defekte charakterisiert sind. Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung sind auch nützlich bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer Protein-Kinase.
  • G2-Checkpoint: Normale Zellen reagieren in Abhängigkeit von ihrem Typ und dem Schädigungsgrad auf eine von zwei Arten auf DNA-Schädigung. Die Zellen können einen apoptotischen Weg aktivieren, der zur Selbsttötung der Zelle und ihrer Beseitigung führt, oder das Überleben einer geschädigten Zelle kann durch die Aktivierung von Checkpoints gefördert werden, die den normalen Zyklus von Wachstum und Teilung vorübergehend anhalten, um Zeit für DNA-Reparatur einzuräumen. Die Checkpoints sind während der G1-Phase des Zyklus tätig, so dass DNA repariert wird, bevor sie in der S-Phase repliziert wird; und während der G2-Phase, so dass DNA repariert wird, bevor Chromosomen in der Mitosephase (M) segregiert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Granulatimidverbindungen bewirken die Hemmung des G2-Checkpoints. Sie sind als Therapiereagenzien für die Behandlung von Krebs usw. von Interesse. Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden Zellen vom G2-Checkpoint freigesetzt; und sie kann zur Apoptose der behandelten Zellen führen. Vorzugsweise sind die behandelten Zellen nicht in der Lage, den G1-Checkpoint zu aktivieren. Viele Tumoren beim Menschen weisen Mutationen im Protein p53 auf. Als Ergebnis sind sie nicht in der Lage, den G1-Checkpoint zu aktivieren, können aber den G2-Checkpoint weiterhin einsetzen. Das Hemmen des Checkpoints treibt Tu morzellen üblicherweise zur Mitose, wodurch die Wirksamkeit zytotoxischer Mittel er- höht wird, die durch DNA-Schädigung wirken können, beispielsweise Cisplatin, Bleomycin und Etoposid; sowie Strahlentherapie.
  • Bei über 50% der Karzinome beim Menschen kommt es zu einem Verlust der Funktion von Protein p53. Zellen mit mutiertem p53 sind nicht in der Lage, den G1-Checkpoint als Reaktion auf DNA-Schädigung zu aktivieren. Der G2-Checkpoint bietet jedoch (obwohl er üblicherweise schwächer als in normalen Zellen ist) weiterhin eine Möglichkeit, die DNA-Schädigung vor der Zellteilung zu reparieren. Die Hemmung des G2-Checkpoints allein hat im Allgemeinen keine große Wirkung auf normale Zellen oder Tumorzellen, die die normale G1-Checkpoint-Wirkung beibehalten. G2-Checkpoint-Inhibitoren, die in Kombination mit einem DNA-Schädigungsmittel verwendet werden, erhöhen die Abtötung von Zellen, die den G1-Checkpoint nicht aktivieren können, signifikant.
  • In der gesamten vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "G2" oder "G2-Phase" die Phase des Zellzyklus zwischen dem Ende der DNA-Synthese und dem Beginn der Mitose. Eine Zelle in G2 weist einen Interphasen-Zellkern, wie durch Mikroskopie bestimmt, sowie duplizierte DNA (üblicherweise durch Durchflusszytometrie bestimmt) auf.
  • G2-Checkpoint-Inhibitor: In der gesamten vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "G2-Checkpoint-Inhibitor" eine Substanz, die fähig ist, das Anhalten der Zelle in der G2-Phase zu beenden, das durch DNA-Schädigung herbeigeführt wurde, das Anhalten einer Zellen in der G2-Phase als Reaktion auf DNA-Schädigung zu verhindern oder beides.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um das Abtöten von Zellen mit G1-Checkpoint-Defizienz durch DNA-Schädigung zu erhöhen, umfassend die Schritte der Verabreichung eines DNA-Schädigungsmittels an die Zellen, wodurch DNA der Zellen geschädigt wird, und der Verabreichung einer G2-Checkpoint-Inhibitorverbindung an die Zellen, worin die G2-Inhibitor-Verbindung eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung wie hierin beschrieben zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen des G2-Checkpoints in einer Zelle. Vorzugsweise ist die Zielzelle eine hyperproliferative Zelle. Die Erfindung umfasst weiters den Fall, wo die hyperproliferative Zelle p53-negativ ist.
  • In der gesamten vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "DNA-Schädigungsmittel" jede Substanz oder Behandlung, die DNA-Schädigung in einer Zelle herbeiführt, darunter UV-Strahlung, γ-Strahlung, Röntgenstrahlung, Alkylierungsmittel, Antibiotika, die durch Bindung an DNA DNA-Schädigung herbeiführen, Inhibitoren von Topoisomerasen sowie jede bei Chemotherapie eingesetzte Verbindung, die wirkt, indem sie DNA-Schädigung verursacht. Beispiele für spezifische Verbindungen sind Cisplatin, VM-26 und Procarbazin.
  • G2-Checkpoint-Inhibitor-Test: Der hierin beschriebene G2-Checkpoint-Inhibitor-Test umfasst die Behandlung von Zellen, z. B. Zellen, die mit einer hyperproliferativen Störung verbunden sind, darunter Krebszellen, mit einem DNA-Schädigungsmittel unter Bedingungen, durch die das Anhalten der Zellen bei G2 herbeigeführt wird. Eine auf G2-Checkpoint-Hemmwirkung zu testende Probe und ein Mittel, das Zellen in der Mitose festhält, werden auf die Zellen angewandt, woraufhin bestimmt wird, ob der G2-Checkpoint überwunden wird und die Zellen in Mitose eintreten. Das Beenden des Anhalten der Zellen bei G2 oder die Verhinderung des Anhaltens bei G2, so dass die Zellen zur Mitose gelangen, ist der Indikator für G2-Checkpoint-Hemmwirkung.
  • Der Test erfordert den Einsatz einer Zellkultur, in der die Zellen als Reaktion auf DNA-Schädigung nicht zum Anhalten am G1-Checkpoint fähig sind. Die Zellen können von einer der zahlreichen Zelllinien stammen, von denen bekannt ist, dass die Zellen nicht zum Anhalten bei G1 fähig sind. Derartige Zellen umfassen Zellen, die p53-defiziert sind, darunter Folgende: jede Zelllinie mit einer natürlichen Mutation oder Deletion in p53-Gen, die p53 inaktiv macht; jede Zelllinie, die ein virales Onocogen exprimier, das p53 stört; jede Zelllinie, die die dominant-negative Mutante p53 exprimiert (manch mutanten p53-Proteine hemmen das Protein der Wildform, wie die in den erfindungsgemäßen Beispielen verwendeten p53–-MCF-7-Zellen); und jede primäre oder gebildete Zelllinie, die von p53 "negativen transgenen" Tieren stammt. Spezifische Beispiele fügeeignete Zellen sind die Folgenden: Zellen, in denen das Human-Papillomavirus-Typ-16-E6-Gen enthalten ist, Zelllinien, die bezüglich p53-Funktion mutant sind, darunte Burkitts Human-Lymphoma-Zelllinie CA46, und die Human-Dickdarmkarzinom-Zellli- nie HT-29 (CA46 und HT-29 sind von der American Type Culture Collection erhältlich) Zelllinien mit einer genetischen Defizienz, die den G1-Checkpoint auf andere Weise als durch die Störung von p53 stört, können bei diesem Test ebenfalls eingesetzt werden.
  • Sobald eine Zelllinie gewählt ist, die nicht zum Anhalten bei G1 fähig ist, werden die Bedingungen zum Anhalten eines Großteils der Zellen bei G2 als Reaktion auf ein DNA-Schädigungsmittel optimiert, indem geeignete Kulturbedingungen, Inkubationszeit sowie Typ und Dosierung des DNA-Schädigungsmittels bestimmt werden. Vorzugsweise werden zumindest 50% der Zellen in einer Kultur als Reaktion auf das DNA-Schädigungsmittel bei G2 angehalten. Die Maximierung des Anteils an Zellen in der Population, die bei G2 angehalten werden, verringert das Hintergrundsignal.
  • Sobald die Bedingungen für Anhalten bei G2 in der Zellkultur geschaffen worden sind, kann der Test auf eine von zwei Arten durchgeführt werden. Zunächst können die Zellen bei G2 als Reaktion auf das DNA-Schädigungsmittel angehalten und dann mit der Probe behandelt werden, um zu ermitteln, ob eine Beendigung des Anhaltens bei G2 vorliegt, oder die Zellen können mit der Probe vor jenem Zeitpunkt behandelt werden, wo zu erwarten wäre, dass der Großteil der Zellen bei G2 angehalten ist, und zu bestimmen, ob das Anhalten der Zellen bei G2 verhindert wurde.
  • Das Beenden des Anhaltens bei G2 oder Verhindern des Anhaltens bei G2 wird durch eine quantitative Bestimmung der Zellen ermittelt, die zur Mitose fortschreiten. Die Testkultur wird mit einem Mittel behandelt, das solche Zellen in der Mitose anhält. Derartige Mittel sind Mikrotubulus-Depolymerisierungsmittel, die die Zellen in Metaphase anhalten, wie z. B. Nocodazol. Das verhindert, dass die Zellen aus der Mitose austreten und in den nächsten Zellzyklus eintreten.
  • Bei dem Test erfolgt die Bestimmung der Zellen, die zur Mitose fortschreiten, unter Einsatz der bekannten immunologischen Verfahren, wobei Antikörper eingesetzt werden, die Spezifität für mitotische Zellen aufweisen. Monoklonale Antikörper, die derartige Spezifität zeigen, sind bekannt und umfassen MPM-2, das gegen mitotische HeLa-Zellen gezüchtet wurde und Phosphoepitope erkennt, die in mitototischen Proteinen aller eukaryotischen Spezies in hohem Maße konserviert werden. Andere Beispiele sind die monoklonalen Antikörper, die Phosphoepitope in den gepaarten Helix-Filament-Proteinen (PHF) erkennen, die in Gehirngewebe von Alzheimer-Patienten zu finden sind, wie in folgenden Dokumenten beschrieben: der am 4. Juli 1996 unter der Nr. WO 96/20218 veröffentlichten internationalen PCT-Anmeldung und I. Vincent, et al., "Mitotic Mechanisms in Alheimer's Disease?" The Journal of Cell Biology, 132, 413–425 (1996). Bei den Beispielen in der vorliegenden Beschreibung werden der in den letzteren zwei Dokumenten beschriebene Antikörper TG-3 eingesetzt, der vom Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University, Bronx, New York, USA, erhalten wurde.
  • TG-3 weist hohe Spezifität für mitotische Zellen auf. Wenn TG-3 im hierin beschriebenen ELISA-Test verwendet wird, wird ein sehr gutes Signal/Rausch-Verhältnis erzielt, was es ermöglicht, den ELISA-Test leicht durch optisches Absorptionsvermögen zu überwachen.
  • Absterbende Zellen weisen einige Eigenschaften auf, die jenen von mitotischen Zellen ähnlich sind. TG-3 reagiert mit absterbenden Zellen nicht, wodurch verhindert wird, dass apoptotische Zellen im Test der vorliegenden Erfindung gezählt werden. Die Effizi- enz des Tests wird durch das Vorhandensein absterbender Zellen nicht beeinträchtigt.
  • Zu den immunologischen Verfahren, die für die Bestimmung mitotischer Zellen in diesem Test fähig sind, gehören alle Verfahren zum Bestimmen von Antikörper-Antigen-Bindung, darunter: Immunzytochemie (z. B. Immunfluoreszenz), Durchflusszytometrie, Immunblotting und ELISA. Mehrere immunologische Verfahren werden im Detail in den Beispielen gemäß vorliegender Erfindung sowie in I. Vincent, et al. [oben], beschrieben. Andere immunologische Verfahren, die hierin nicht beschrieben werden, sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt und können leicht für den Einsatz beim vorliegenden Test angepasst werden. Jedoch lässt sich ein hoher Durchsatz beim Testen von Proben am besten unter Einsatz von ELISA erreichen.
  • VERFAHREN ZUM SYNTHETISIEREN VON GRANULATIMIDVERBINDUNGEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I bereit. Es können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, einschließlich Synthesen, wie in den Beispielen bereitgestellt; Isolation aus natürlichen Quellen; Kopplung von zwei Verbindungen, um ein Didemnimid zu erzeugen, gefolgt von einem Zyklisierungsschritt; usw. Beispielsweise beginnt ein Syntheseschema mit einer entsprechend geschützten Indolverbindung, wie z. B. Indol-3-acetamid, und durchläuft im Wesentlichen zwei Kopplungsschritte, um eine Verbindung vom Didemnimid-Typ zu erzeugen, gefolgt von einem Zyklisierungsschritt. Das Verfahren kann gegebenenfalls einen oder mehrere nachfolgende Schritte umfasst, um bestimmte Substituenten bereitzustellen, die für die Herstellung einer bestimmten Verbindung der Formel I erforderlich sind.
  • Ein exemplarisches Syntheseverfahren ist das folgende, worin P1, P1 und P3 geeignete Schutzgruppen sind. Die Ausgangs-Indolverbindung (auf angemessene Weise durch R oder Z substituiert) kann nach Verfahren hergestellt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
  • Figure 00230001
  • Ein nachstehend dargelegtes alternatives Syntheseschema umfasst im Wesentlichen einen einzigen Kopplungsschritt, um ein Didemnimid-Verbindung zu erzeugen, gefolgt von Zyklisierung, um eine Verbindung der Formel I herzustellen, worin F, F', X und Y wie für Formel I definiert sind und W wie für Formel I definiert, aber bei (a) und nicht (b) an den Reaktanden gebunden ist:
  • Figure 00240001
  • Das oben beschriebene bevorzugte Syntheseschema wird für die Herstellung von Granulatimid und Isogranulatimid (typischerweise in einem Verhältnis von etwa 9 : 1 hergestellt) adaptiert; wie nachstehend beschrieben. Verbindung 8 kann wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben hergestellt werden. Bei dieser Ausführungsform des bevor zugten Syntheseschemas sollte Kondensation von 8 mit dem Indol-3-acetamid (9) in Ge- genwart von Molekularsieben durchgeführt werden, da andernfalls durch Ersetzen der Phenylthiogruppe auf (10) durch eine Methoxylgruppierung ein zweites Hauptprodukt entsteht.
  • Figure 00250001
  • Alternativ dazu können Verbindungen der Formel I aus Granulatimid oder Isogranulatimid hergestellt werden, die wie oben beschrieben synthetisiert oder aus natürlichen Quellen wie in den Beispielen beschrieben erhalten werden können. Das nachstehende Schema beschreibt die Modifizierung von Granulatimid, um Derivate mit unterschiedlichen X- und Y-Substituenten zu erzeugen. Das Verhältnis zwischen II und III wird durch die Wahl von Schutzgruppen P1 und P2 oder P3 bestimmt, die (beispielsweise) Cbz, R oder H sein können. Eine Schutzgruppe wird bei beiden P2 oder P3 verwendet in Ab- hängigkeit von der Position der Doppelbindung im Ring. Die Chemie wird in Link, et al., J. American Chemical Society 118, 2825(1996), auf S. 2832 beschrieben.
  • Alle Z- und R-Gruppen können aromatischen Kohlenstoffen in W und Ar1 vor dem Kopplungsschritt hinzugefügt werden, um die Maleimid-Zwischenprodukte herzustellen. Alle R-, RCO-, Ar2CO- und Ar2CH2-Gruppen können zu Stickstoffatomen unter Einsatz von Base und eines geeigneten Alkylhalogenids (RX), Acylhalogenids (RCOX), Anhydrids ((RCO)20) oder Benzylhalogenids (Ar2CH2X) hinzugefügt werden.
  • Figure 00260001
  • PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN
  • Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können in eine Vielzahl von Formulierungen zur therapeutischen Verabreichung aufgenommen werden. Im Speziellen können die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden, indem sie mit geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnern kombiniert werden, und sie können zu Präparaten in fester, halbfester, flüssiger oder gasförmiger Form formuliert werden, wie z. B. Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Salben, Lösungen, Zäpfchen, Injektionen, Inhalationsmittel, Gele, Mikrokügelchen und Aerosole. In diesen Formen kann die Verabreichung der Verbindung auf verschiedene Arten erfolgen, einschließlich oraler, bukkaler, rektaler, parenteraler, intraperitonealer, intradermaler, transdermaler, intrachealer Verabreichung usw. Der Wirkbestandteil kann nach der Verabreichung systemisch sein oder kann durch den Einsatz regionaler Verabreichung, intramuraler Verabreichung oder den Einsatz eines Implantats, das bewirkt, dass die wirksame Dosis am Implantationsort verbleibt, lokal begrenzt sein.
  • In pharmazeutischen Dosierungsformen können die Verbindungen in Form ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze verabreicht werden. Sie können auch in entsprechender Verbindung mit anderen pharmazeutisch wirksamen Verbindungen verwendet werden. Die nachstehenden Verfahren und Exzipienten dienen lediglich als Beispiele und sind keineswegs einschränkend.
  • Für orale Präparate können die Verbindungen allein oder in Kombination mit geeigneten Additiven verwendet werden, um Tabletten, Pulver, Granulate oder Kapseln herzustellen, beispielsweise mit herkömmlichen Additiven, wie Lactose, Mannit, Maisstärke oder Kartoffelstärke; mit Bindemitteln, wie kristalliner Cellulose, Cellulosederivaten, Akazin, Maisstärke oder Gelatinen; mit Desintegratoren, wie Maisstärke, Kartoffelstärke oder Natriumcarboxymethylcellulose; mit Schmiermitteln, wie Talk oder Magnesium stearat; und, falls erwünscht, mit Verdünnern, Puffern, Befeuchtungsmitteln Konservie- rungsmitteln und Geschmacksstoffen.
  • Die Verbindungen können zu Präparaten für Injektionen formuliert werden, indem sie in einem wässrigen oder nicht wässrigen Lösungsmittel, wie Pflanzen- oder anderen ähnlichen Ölen, synthetischen aliphatischen Säureglyceriden, Estern höherer aliphatischer Säuren oder Propylenglykol gelöst, suspendiert oder emulgiert werden; und falls erwünscht mit herkömmlichen Additiven, wie Solubilisatoren, isotonischen Mitteln, Suspendierhilfen, Emulgatoren, Stabilisatoren und Konservierungsmitteln.
  • Die Verbindungen können in Aerosol-Formulierung zur Verabreichung durch Inhalation eingesetzt werden. Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können in unter Druck stehende annehmbare Treibmittel, wie Dichlordiflurmethan, Propan, Stickstoff und dergleichen formuliert werden.
  • Weiters können die Verbindungen zu Zäpfchen verarbeitet werden, indem sie mit einer Vielzahl von Basen, wie emulgierenden Basen oder wasserlöslichen Basen, gemischt werden. Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können als Zäpfchen rektal verabreicht werden. Die Zäpfchen können Vehikel, wie Kakaobutter, Carbowachse und Polyethylenglykole, umfassen, die bei Körpertemperatur schmelzen, aber bei Raumtemperatur fest sind.
  • Es können Einheitsdosisformen für die orale oder rektale Verabreichung, wie Sirupe, Elixiere und Suspensionen, bereitgestellt werden, worin jede Dosierungseinheit, beispielsweise Teelöffel, Esslöffel, Tablette oder Zäpfchen, eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung enthält, die eine oder mehrere Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung enthielt. Auf ähnliche Weise können Einheitsdosisformen zur Injektion oder intravenösen Verabreichung die Verbindung gemäß vorliegender Erfindung in einer Zusammensetzung als Lösung in sterilem Wasser, normaler Kochsalzlösung oder einem anderen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
  • Implantate für Retard-Formulierungen sind nach dem Stand der technik wohlbekannt Implantate sind als Mikrokügelchen, Slabs usw. mit biologisch abbaubaren oder biologisch nicht abbaubaren Polymeren formuliert. Beispielsweise bilden Milchsäure- und/ oder Glycolsäure-Polymere ein erodierbares Polymer, das vom Wirt gut vertragen wird. Das Granulatimidverbindungen enthaltende Implantat wird in der Nähe der Tumorstelle angeordnet, so dass die lokale Konzentration an Wirkbestandteil in Bezug auf den Rest des Körpers erhöht wird.
  • Der Begriff "Einheitsdosisform", wie hierin verwendet, bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen für Menschen und Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung in einer ausreichenden Menge berechnet enthält, um in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnen, Träger oder Vehikel die erwünschte Wirkung zu erzielen. Die Spezifikationen für die neuen Einheitsdosisformen gemäß vorliegender Erfindung hängen von der speziellen eingesetzten Verbindung und der zu erreichenden Wirkung sowie von der Pharmakodynamik ab, die mit jeder Verbindung im Wirt verbunden ist.
  • Die pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, wie Vehikel, Adjuvantien, Träger oder Verdünner, sind allgemein leicht erhältlich. Darüber hinaus sind pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen, wie Mittel zur pH-Einstellung und Puffer, die Tonizität einstellende Mittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel und dergleichen, allgemein leicht erhältlich.
  • Die kombinierte Verwendung von Granulatimidverbindungen mit anderen zytotoxischen Mitteln hat die Vorteile, dass die erforderliche Dosis für das einzelne Arzneimittel geringer und die Wirkung der verschiedenen Arzneimittel komplementär ist. Abhängig vom Patienten und dem Zustand, der behandelt wird, sowie abhängig vom Verabreichungsweg können die Granulatimidverbindungen in Dosen von 0,1 μg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Die Bandbreite ist groß, da die Effizienz einer therapeutischen Wirkung für verschiedene Säugetiere im Allgemeinen stark variiert, wobei die Dosen beim Menschen typischerweise 20-, 30- oder sogar 40-mal kleiner (pro Einheit Körpergewicht) sind als bei Ratten. Auf ähnliche Weise kann die Art der Verabreichung eine große Wirkung auf die Dosis haben. So können beispielsweise orale Dosen bei der Rate das Zehnfache der Injektionsdosis ausmachen. Für lokale Verabreichungswege können höhere Dosen eingesetzt werden.
  • Eine typische Dosis kann eine Lösung sein, die für intravenöse Verabreichung geeignet ist; eine Tablette, die zwei- bis sechsmal täglich eingenommen wird, oder eine Einmal-Retard-Kapsel oder Tablette, die einmal täglich eingenommen wird und einen proportional höheren Gehalt an Wirkbestandteil enthält, usw. Die Retard-Wirkung kann durch Kapselmaterialien erzielt werden, die sich bei unterschiedlichen pH-Werten lösen, durch Kapseln, die langsam durch osmotischen Druck freisetzen, oder durch ein anderes bekanntes Mittel zur gesteuerten Freisetzung.
  • Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden feststellen, dass die Dosishöhen in Abhängigkeit von der spezifischen Verbindung, der Schwere der Symptome und der Anfälligkeit des Probanden für Nebenwirkungen variieren können. Einige der spezifischen Verbindungen sind stärker als andere. Bevorzugte Dosen für eine bestimmte Verbindung können von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung auf verschiedene Arten leicht bestimmt werden. Ein bevorzugtes Mittel besteht darin, die physiologische Stärke einer bestimmten Verbindung zu messen.
  • Zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren können die Granulatimidverbindungen mit anderen pharmazeutisch wirksamen Mitteln, insbesondere anderen antimetastatischen, Anti-Tumor- oder anti-angiogenen Mitteln formuliert werden. Angiostatische Verbindungen von Interesse sind Angiostatin, Endostatin, Carboxy-terminate Peptide von Collagen-α (XV) usw. Zytotoxische und zytostatische Mittel von Interesse sind Adriamycin, Alkeran, Ara-C, BICNU, Busulfan, CNNU, Cisplatin, Cytoxan, Daunorubicin, DTIC, 5-FU, Hydroxyharnstoff, Ifosfamid, Methotrexat, Mithramycin, Mitomycin, Mitoxantron, Stickstoffsenf, Velban, Vincristin, Vinblastin, VP-16, Carboplatin, Fludara bin, Gemcitabin, Idarubicin, Irinotecan, Leustatin, Navelbin, Taxol, Taxoter, Topotecan usw.
  • EINSATZMETHODEN
  • Die vorliegenden Granulatimidverbindungen werden einem Probanden verabreicht, bei dem unerwünschte Kinase-Aktivität oder daraus resultierende Zustände vorliegen. Die Verbindungen können einem Probanden auch verabreicht werden, um den G2-Checkpoint zu hemmen, insbesondere in Verbindung mit der Behandlung von Krebszellen, im Spezielleren in Kombination mit zytotoxischer Therapie, die auf die Krebszellen gerichtet ist; z. B. Strahlungsbehandlung, chemotherapeutische Arzneimittel usw.
  • Der Wirt oder Patient kann jeder Säugetierspezies angehören, beispielsweise Primatenspezies, insbesondere Mensch; Nagetiere, darunter Mäuse, Ratten und Hamster; Kaninchen; Pferde, Rinder, Hunde, Katzen; usw. Tiermodelle sind für experimentelle Untersuchungen von Interesse und liefern ein Modell für die Behandlung von Krankheiten beim Menschen.
  • Tumoren, von denen bekannt ist, dass sie für DNA-schädigende Mittel anfällig sind, umfassen Karzinome, z. B. Dickdarm-, Prostata-, Brust-, Ductal-, Endometrial-, Magenkarzinom, dysplastische Mundschleimhaut, invasiver Mundkrebs, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, transitionale und squamöse Zelle, Harnleiterkarzinom usw.; neurologische Malignitäten, beispielsweise Neuroblastom, Gliom usw.; hämatologische Malignitäten, beispielsweise akute Leukämie im Kindesalter, Nicht-Hodgkin-Lymphome, chronische lymphozytische Leukämie, maligne kutane T-Zellen, Mycosis fungoides, Nicht-MF-kutanes T-Zellen-Lymphom, Lymphomatoid-Papulosis, T-Zellen-reiche kutane Lymphoid-Hyperplasie, bullöses Pemphigoid, Lupus erythematodes chronicus discoides, Lichen planus usw.; und dergleichen.
  • Eine kombinierte Therapie aus Granulatimidverbindungen und zytotoxischen Mitteln wird einem Wirt verabreicht, der an einem anfälligen Tumor leidet. Die Verabreichung kann in Abhängigkeit von der spezifischen Erkrankung topisch, lokal oder systemisch erfolgen. Die Verbindungen werden in einer kombinierten wirksamen Dosis verabreicht, die über einen geeigneten Zeitraum die Tumorzellenlast wesentlich verringert, während alle Nebenwirkungen minimiert werden, wobei üblicherweise zumindest etwa 25 der vorhandenen Tumorzellen abgetötet werden, häufiger zumindest etwa 50% und gegebenenfalls bis zu etwa 90% oder mehr der vorhandenen Tumorzellen. Es ist daran gedacht, die Zusammensetzung für einen Einsatz in vivo zu erhalten und unter Leitung eines Arztes zu verwenden. Um die synergistische Wirkung einer kombinierten Therapie bereitzustellen, können die Wirkbestandteile gemeinsam oder getrennt und gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb eines Tages abgegeben werden.
  • Die Anfälligkeit einer bestimmten Tumorzelle für Abtöten mit der kombinierten Therapie kann durch Tests in vitro bestimmt werden. Typischerweise wird eine Kultur der Tumorzelle mit einer Kombination aus einer zytotoxischen Verbindung und einer Granulatimidverbindung in variierenden Konzentrationen für eine ausreichende Zeitspanne kombiniert, um es zu ermöglichen, dass die Wirkbestandteile Zelltod herbeiführen, üblicherweise zwischen etwa einer Stunde und einer Woche. Für Tests in vitro können kultivierte Zellen von einer Biopsieprobe des Tumors verwendet werden. Die nach der Behandlung zurückbleibenden lebensfähigen Zellen werden dann gezählt.
  • Die Dosis variiert in Abhängigkeit vom spezifischen verwendeten zytotoxischen Mittel, dem Tumortyp, dem Patientenstatus usw. bei einer Dosis, die ausreicht, um die Tumorzellenpopulation wesentlich abzutragen, während die Lebensfähigkeit des Patienten erhalten bleibt. In manchen Fällen kann Therapie mit Stammzellen-Ersatz-Therapie kombiniert werden, um die hämatopoetische Funktion des Patienten wiederherzustellen. Die Behandlung wird im Allgemeinen fortgesetzt, bis es eine beträchtlich Reduktion, beispielsweise etwa 50% Verringerung der Tumorbelastung, gibt, und kann fortgesetzt werden, bis im Körper im Wesentlichen keine Tumorzellen vorhanden sind.
  • Alle oben und im gesamten Text erörterten Publikationen sind aufgrund ihrer Offen- barung vor dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Keine Äußerung in der vorliegenden Beschreibung ist so aufzufassen, dass die Erfinder dadurch auf das Rechtsmittel der Vordatierung dieser Offenbarung aufgrund früherer Erfindung verzichten.
  • Die folgenden Beispiele sind angeführt, um Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung eine vollständige Offenbarung und Beschreibung dessen zu geben, wie die vorliegende Erfindung herzustellen und zu verwenden ist. Es sind Bemühungen unternommen worden, Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlenangaben (z. B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen usw.) zu gewährleisten, aber einige Versuchsfehler und -abweichungen sind einzuräumen. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist das mittlere Molekulargewicht, und die Temperatur ist in Grad Celsius angegeben; und der Druck liegt am oder nahe dem Atmosphärendruck.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • G2-Checkpoint-Inhibitionstest
  • MCF-7-mp53-Zellen (mutiert in Bezug auf p53) wurden als Monolagen bei 37°C in feuchtem 5% CO2 in DMEM kultiviert, das mit 10% Rinderfötenserum, 2 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, nicht-essentiellen MEM-Aminosäuren, 1 μg/ml Rinderinsulin, 1 μg/ml Hydrocortison, 1 ng/ml Human-Epidermiswachstumsfaktor und 1 ng/ml β-Östradiol ergänzt war. Die Zellen wurden in einer Menge von 10.000 Zellen pro Napf von 96 Napf-Polystyrol-Gewebekulturplatten (Falcon) in 100 μl Medium gesät. Die Zellen wurden 24 h lang wachsen gelassen und dann unter Einsatz einer 60Co-Quelle (Gammacell 200TM, Atomic Energy Commission of Canada), die γ-Strahlen in einer Dosisrate von 1,4 Gy/min abgab, mit 6,5 Gy bestrahlt.
  • Extrakte von Meeresorganismen mit etwa 10 μg/ml (aus 1000-facher Stammkultur an DMSO) und 100 ng/ml Nocodazol (Sigma, aus 1000facher Stammkultur in DMSO) wurden 16 h nach der Bestrahlung zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 8 h inkubiert. 2 mM Coffein (Sigma, aus einer 100 mM-Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) wurde als positive Kontrolle eingesetzt.
  • Nach der Arzneimittelbehandlung wurde das Zellkulturmedium entfernt, und die Zellen wurden lysiert, indem 100 μl eiskalter Lysepuffer (1 mM EGTA pH 7,4, 0,2 mM PMSF) zugegeben und zehnmal hinauf und hinunter pipettiert wurde. Die Zelllysate wurden auf 96-Napf-PolySorpTM-Platten (Nunc) übertragen und vollständig getrocknet, indem mit einem Haartrockner, der etwa 3 Fuß über den Platten angeordnet war, etwa 37°C warme Luft darauf geblasen wurde. Proteinbindungsstellen wurden blockiert, indem für 1 h bei Raumtemperatur 200 μl pro Napf an Antikörperpuffer (10 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 mM PMSF, 3% (Gew./Vol.) getrocknete Magermilch (Carnation)) zugegeben wurden. Dieser wurde entfernt und durch 100 μl Antikörperpuffer ersetzt, der 0,1 –0,15 μg/ml monoklonalen TG-3-Antikörper und Meerrettich-Peroxidase-markierten Ziegen-anti-Maus-IgM (Southern Biotechnology Associates) in einer Verdünnung von 1 : 500 enthielt.
  • Nach Inkubation bei 4°C über Nacht wurde die Antikörperlösung entfernt, und die Näpfe wurden dreimal mit 200 μl 10 mM Tris HCl pH 7,4, 0,02% Tween 20TM, 100 μl 120 mM Na2HPO4, 100 mM Zitronensäure, pH 4,0, gespült, das 0,5 mg/ml 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonsäure) enthielt, und 0,01% Wasserstoffperoxid wurde für 1 h bei Raumtemperatur zugegeben, und die Platten wurden unter Einsatz eines Bio-TekTM-Plattenleser bei 405 nm abgelesen. Positive Kontrollen, die mit 2 mM Coffein behandelt wurden, ergaben ein abgelesenes Absorptionsvermögen von etwa 1,0.
  • G2-Checkpoint-Hemmung wurde in Extrakten von der Aszidie Didemnum granulatum (Subphylum Orochordate, Klasse Ascidiacea) nachgewiesen, die in felsigen, seichten Meereshabitaten entlang der Küste im Süden Brasiliens gefunden wurde.
  • Sammlung und Extraktion von D. Granulatum
  • Didemnum granulatum (85 g Nassgewicht) wurde im Sommer 1995 in Tiefen von 1 m an der Felsenküste von Araca Beach, Sao Sebastian (Bundesstaat Sao Paulo im Südosten Brasiliens) entnommen. Eine zweite Entnahme erfolge am Arquipelago do Arvoredo (Bundesstaat Santa Catarina im Süden Brasiliens, 150 g Nassgewicht) und im Sao Sebastiao-Kanal (Bundesstaat Sao Paulo, 180 g Nassgewicht) im November 1997. Frisch entnommene Tiere wurden in Ethanol bei –20°C gelagert. Bei den verschiedenen Entnahmen erhaltene Tiere wurden getrennt wie folgt behandelt: nach Ethanol-Dekantierung wurde das Tier gemixt und dreimal mit Methanol extrahiert. Die Ethanol- und Methanol-Extrakte wurden vereinigt, filtriert und im Vakuum abgedampft, was einen gummiartigen Rückstand ergab. Die Hauptmenge des Rückstands wurde in MeOH-CH2Cl2 im Verhältnis 8 : 2 gelöst und filtriert, um anorganische Salze zu beseitigen, während kleine Mengen des Rückstands in DMSO gelöst wurden, um sie beim oben beschriebenen G2-Checkpoint-Inhibitionstest zu verwenden.
  • Isolierung aktiver Verbindungen
  • Methanol-Extrakte von der brasilianischen Aszidie D. granulatum wurden durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20 (Eluens : MeOH) fraktioniert, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC (Eluens : Acetonitril/0,05% Trifluoressigsäure (1 : 1)), was eine Reihe von 8 Fraktionen ergab, die nach DC unterschiedliche Bestandteile aufwiesen. Nur eine Fraktion wies G2-Checkpoint-Hemmwirkung auf, was die neuen Alkaloidverbindungen ergab, die später als Isogranulatimid und Granulatimid bezeichnet wurden. Andere Fraktionen enthielten verschiedene Formen des Alkaloids Didemnimid, die inaktiv waren. Didemnimid A und D wurden identifiziert, indem NMR- und MS-Daten mit Werten aus der Literatur (H. C. Vervoort, et al. [oben]) verglichen wurden.
  • NMR-Versuche unter Einsatz einer Verbindung, die von der aktiven Fraktion isoliert wurde, identifizierten eine disubstituierte Imidazol-Gruppierung. Die Verbindung unterschied sich von Didemnimid A durch den Verlust von zwei Wasserstoffatomen. Das führte zu der Schlussfolgerung, dass die neue Verbindung eine Bindung zwischen C-2 des Indols und Ether-C-14 oder -N-17 des Imidazolfragments von Didemnimid A auf- wies. Das Vorliegen eines anisotropen Effekts in der neuen Verbindung und nicht in Didemnimid A wies auf einen starren planaren Heterozyklus hin, anders als bei Didemnimid A, wo die Indol- und Maleimid-Ringe in Bezug aufeinander entlang der C-3-zu-C-8-Bindung verdreht waren. Für den heterozyklischen aromatischen Kern der neuen Verbindung gibt es in natürlichen Verbindungen keine Entsprechung.
  • Charakterisierung von Isogranulatimid und Granulatimid
  • NMR-Daten wurden auf Bruker-WH-400- (1H-NMR, COSY und NOE), -AM-400- (13C NMR) und -AMX-500- (HMBC und HMQC) Spektrometern erhalten. Protonenspektren wurden unter Einsatz des internen Restsignals von DMSO-d5 (δ 2,49) referenziert, und Kohlenstoffspektren wurden auf die DMSO-Methyl-Resonanz (δ 39,5) referenziert. FABMS-Daten wurden auf einem Kratos-Konzept-IIHQ-Hybrid-Massenspektrometer mit Cäsiumion-Sekundärionisierung und Magnetsektor-Masseanalyzer erhalten. Proben wurden in einer MeOH-Thioglycerin-Matrix gelöst, und Spektren wurden unter Einsatz einer Quellenspannung von 8 kV und einer Cäsium-Sputterkanonen-Spannung von 12 kV erhalten. Infrarot-Spektren wurden auf einem Perkin-Elmer-1710-Spektrometer aufgezeichnet und UV-Spektren auf einem Spektralphotometer.
  • Eine Verbindung (später als Isogranulatimid bezeichnet) wurde von aktiver Fraktion als roter amorpher Feststoff isoliert (UV(λmaxnm(ε))210(10.200), 231 (10.600)280(6.550), 470 (1.870)), der ein [M + H]+-Ion bei m/z 277.0730 im HRFABMS ergab, das für eine Molekülformel C15H8N4O2 angemessen war (ber. Masse für C15H8N4O2 : 277,0714). Eine NH-Protonenresonanz bei δ 11,11 zeigte HMBC-Korrelationen zu Carbonyl-Resonanzen bei δ 169,8 und 168,8 und aromatische Kohlenstoff-Resonanzen bei δ 126,39 und 112,22, was das Vorhandensein einer Maleimidsubstruktur bestätigt. Das COSY-Spektrum identifizierte ein Vier-Protonen-Spinsystem (δ 8,51, d, J = 7 Hz (H-4)); 7,43, dd, J = 7,7 Hz (H-6); 7,35, dd, J = 7,7 Hz (H-5); 7,67 d, J = 7 (H-7), das den H-4- bis H-7-Protonen eines Indolrests zugeordnet werden kann. Bestrahlung einer breiten Protonen-Resonanz bei δ 13,48 induziert einen NOE nur im aromatischen Dublett bei δ 7,68, was das Dublett H-7 und die breite Protonen-Resonanz dem Indot NH zuordnet. Das Fehlen einer Resonanz im 1H-NMR-Spektrum der Verbindung, die den Indol-H-2- oder -H-3-Protonen zugeordnet werden kann, wies auf das Vorhandensein von Substituenten bei C-2 und C-3 hin.
  • Sehr breite Resonanzen bei δ 8,10 und δ 9,12 im 1H-NMR-Spektrum wurden der Imidazal-Gruppierung zugeordnet. Die Breite der Imidazol-Resonanzen wurde auf Tautomerie der NH-Protonen zurückgeführt. Die große chemische Verlagerung, die für die H-4-Resonanz (δ 8,51) in der neuen Verbindung beobachtet wurde, in Bezug auf die chemische Verlagerung, die für die H-4-Resonanz in Didemnimid A (δ 7,07) beobachtet wurde, wurde einem Nachbargruppen-Effekt von einem C-9-Maleimidcarbonyl zugeschrieben.
  • Wie oben beschrieben, wurde vorhergesagt, dass die neue Verbindung ein polyzyklischer Aromat ist, das sich vom Didemnimid A durch das Vorhandensein einer Bindung zwischen dem C-2-Kohlenstoff des Indolfragments und entweder C-14 oder N-17 des Imidazolfragments unterscheidet. Im ersteren Fall wäre die Verbindung Granulatimid wie hierin beschrieben und im letzteren Fall Isogranulatimid. Die Breite der Imidazol-Resonanzen im NMR-Spektrum machte ursprünglich NMR zum Unterscheiden der zwei Verbindungen erfolglos. Daher wurden sowohl Granulatimid als auch Isogranulatimid wie hierin beschrieben synthetisiert und mit der Verbindung verglichen, die von der natürlichen Quelle stammte, was zeigte, dass die Verbindung Isogranulatimid war. DC-Analyse (CH2Cl2 – MeOH 9 : 1, UV bei 254 nm) gepoolter aktiver Fraktionen vom natürlichen Extrakt unter Verwendung von synthetischem Granulatimid als Bezug zeigte das Vorhandensein der letzteren Verbindung in einer Menge, die wesentlich geringer als jene von Isogranulatimid war. Es wurde jedoch ermittelt, dass das synthetische Granulatimid in den meisten üblichen organischen Lösungsmitteln, einschließlich Ethanol und Methanol, sehr unlöslich ist, und daher im oben beschriebenen Verfahren nicht effizient aus der natürlichen Quelle extrahiert wurde.
  • Granulatimid ist in DMF oder DMSO löslich, und eines der letzteren Lösungsmittel wird für die Extraktion von Granulatimid aus der natürlichen Quelle empfohlen.
  • Tabelle 1 liefert Vergleichs-1H-NMR-Daten, die unter Einsatz synthetischer Verbindungen, wie in DMSO-d6 aufgezeichnet, ermittelt wurden.
  • Tabelle 1
    Figure 00380001
  • Wirkung von Isogranulatimid und Granulatimid
  • Isogranulatimid weist die Hälfte der maximalen G2-Checkpoint-hemmung (IC50) bei 1,8 ± 0,2 μM auf (1A). (Didemnimid A weist bei einer Konzentration von 0,1–30 μM keine Wirkung auf.) Isogranulatimid weist schwache Zytotoxizität auf, mit einem IC50 von 40 ± 4 μM (1B, Kurve 0 Gy), deutlich über dem IC50 für Checkpoint-Hemmung. Es ist zu erwarten, dass G2-Checkpoint-Inhibitoren und DNA schädigende Mittel p53–-Zellen synergistisch abtöten. Wenn derartige Zellen für 16 h 2, 4 oder 6 Gy γ-Strahlung und unterschiedlichen Konzentrationen an Isogranulatimid ausgesetzt wurden, starben die Zellen in einer höheren Zahl ab als die Summe einer jeden Behandlung allein ausmacht (1B), was zeigt, das γ-Strahlung und Isogranulatimid Synergiewirkung haben.
  • Der IC50 für Zytotoxizität von Isogranulatimid wurde um das Fünffache verringert, wenn Zellen mit 6 Gy bestrahlt wurden (1B). Im Vergleich dazu weist Coffein, der am häufigsten verwendete G2-Checkpoint-Inhibitor, einen IC50 von 1 mM für G2-Checkpoint-Hemmung auf, hat alleine sehr geringe Zytotoxizität und verfügt ebenfalls über Synergiewirkung mit γ-Strahlung.
  • Bestrahlung mit Isogranulatimid-Behandlung tötet p53+-Zellen nicht synergistisch ab, wie in 1C gezeigt. Daher tötet das Isogranulatimid bevorzugt bestrahlte p53–-Zellen gegenüber bestrahlten p53+-Zellen ab, was darauf hinweist, dass es bevorzugt p53–-Tumoren bei mit DNA-Schädigungstherapie behandelten Menschen abtöten würde.
  • Wie in 2 gezeigt, kann Granulatimid im Vergleich zu Isogranulatimid als G2-Checkpoint-Inhibitor (IC50 = 1,3 μm) wirksamer sein.
  • Beispiel 2
  • Synthese von Isogranulatimid und Granulatimid
  • In all diesen Beispielen wurde DC durchgeführt, indem handelsübliche Silikagel-6O-Platten mit Aluminium-Rückwand eingesetzt wurden. Flash-Chromatographie wurde mit Silikagel mit einer Maschenzahl von 230–400 (E. Merck) durchgeführt. THF wurde über Natrium/Benzophenon destilliert, und CH2Cl2 wurde über CaH2 destilliert. Handelsübliches EtOH (Reagens-Reinheit) und MeCN (HPLC-Reinheit) wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt. Molekularsiebe wurden 5 Stunden vor der Verwendung unter Vakuum bei Erwärmung getrocknet. Alle Reaktionen wurden unter einer trockenen Argonatmosphäre unter Einsatz von Glasggesäten durchgeführt, die gründlich flammengetrocknet worden waren.
  • Methyl-2-(1-methoxymethyl-2-phenylthioimidazol-5-yl)glyoxylat (8)
  • Einer kalten (–78°C) gerührten Lösung von 1-Methoxymethyl-2-phenylthioimidazol (S. Otha, et al., Chem. Pharm. Bull. 40, 2681 (1992))(340 mg, 1,55 mmol) in trockenem THF (8,0 ml) wurde eine Lösung von n-BuLi (1,47 M in Hexan, 1,26 ml, 1,85 mmol) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 h lang gerührt. Eine Lösung von Dimethyloxalat (540 mg, 4,58 mmol) in trockenem THF (2,0 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei –78°C weitere 1,25 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem wässrigem NH4Cl (5,0 ml) und Et2O (20 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit Et2O (25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen (Kochsalzlösung, 10 ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (35 g Silikagel; 1 : 1 Petrolether-Et2O) des Rohmaterials ergaben 305 mg (66%) von Verbindung 8 als beigen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 59 bis 60°C. IR(KBr) 1729, 1657, 1305, 1273, 1167, 1114, 784 cm–1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.23 (s, 1H), 7.52–7.54 (m. 2H), 7.37–7.38 (m, 3H), 5,81 (s, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.36 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172.2, 161.6, 154.1, 145.4, 145.3, 133.2, 129.5, 129.2, 128.7, 75.8, 56.5, 53.0;
    HREIMS – ber. für C14H14N2O4S: 306,0674, gef.: 306,0674.
  • 3-[4-(1-Methoxymethyl-1H-2-phenylthioimidazol-5-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol (10)
  • Einer gerührten Lösung von t-BuOK (150 mg, 1,34 mmol) in DMF (3,0 ml) bei Raumtemperatur wurden nacheinander Molekularsieb mit 4 Å (500 mg) und eine Lösung von Verbindung 8 (167 mg, 0,54 mmol) und Indol-3-acetamid (9)(114 mg, 0,66 mmol) in DMF (4,0 ml) zugegeben, das Reaktionsgemisch wurde auf 45°C erwärmt und 12 h lang gerührt. Die tief purpurfarbene Lösung wurde mit Salzsäure (1 N, 3,0 ml) und EtOAc (30 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen (Kochsalzlösung, 4 × 10 ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromato graphie (12 g Silikagel; 30 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergaben 208 mg (90%) von Verbindung 10 als orangen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 243°C.
    IR (KBr) 3400–2600, 1765, 1708, 1537, 1341, 741 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 12.11 (br s, 1H), 11.25 (br s, 1H), 8.14 (s, 1H) 7.46 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.18–7.33 (m, 6H), 7.14 schlecht auf gelö- stes dd 1H), 6.77 (schlecht auf gelostes dd, 1H), 6.51 (d, 1H, J = 8.0), 500 (s, 2H), 2.97 (s, 3 H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.7, 171.6, 140.3, 136.7, 135.3, 133.8, 133.5, 132.5, 129.5, 128.4, 127.2, 125.7, 124.3, 122.7, 120.8, 120.2, 117.4, 112.6, 104.6, 75.8, 55.9;
    HREIMS – ber. für C23H18N4O3S: 430,1099, gef.: 430,1099.
  • 3-[4-(3-Methoxymethyl-3H-imidazol-4-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihyro-1H-pyrrol-3-yl]indol (11)
  • Einer rückflusssiedenden Lösung von Verbindung 10 (52 mg, 0,12 mmol) in EtOH (5,0 ml) wurde Raney-Nickel (W-2, ~150 mg) zugegeben, und die Suspension für 1 h lang rückflusserhitzt. Eine zusätzliche Menge Raney-Nickel (W-2, ~100 mg) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für weitere 3 h rückflusserhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Celit filtriert. Der Celit wurde mit CH2Cl2-MeOH (1 : 1, 75 ml) gewaschen, und das vereinigte Filtrat wurde eingeengt. Flash-Chromatographie (14 g Silikagel, 20 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 33 mg (85%) von Verbindung 11 als orangen Feststoff: Schmelzpunkt > 235°C (Zers.);
    IR (KBr) 3400–2600, 1765, 1703, 1537, 1440, 1342, 1113, cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 10.89 (br s, 1H), 10.03 (br s, 1H), 8,07 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.44 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.09 schlecht aufgelöstes dd, 1H) 7.0(s, 1H), 6.79 (schlecht auf gelöstes dd, 1H) 6.46 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 5.02 (s. 2H), 3.07 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.8, 171.7, 140.5, 136.5, 134.3, 132.9, 131.8, 124.3, 122.4, 121.7, 120.5, 120.3, 118.4, 112.3, 104.7, 76.4, 55.6;
    HREIMS – ber. für C17H14N4O3: 322,1066, gef.: 322,1066.
  • Synthese von Didemnimid A(1)
  • Einer gerührten Suspension von Verbindung 11 (67,4 mg, 0,209 mmol) in CH2Cl2 (15,0 ml) bei Raumtemperatur wurde eine Lösung von BBr3 in CH2Cl2 (1,0 M, 2,1 ml, 2,1 mmol) zugegeben, und die tiefblaue Lösung wurde 5 h lang geruhrt. Das Gemisch wur- de mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 (10 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt und wurde dann 0,25 h lang gerührt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen (Kochsalzlösung, 10 ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (10 g Silikagel, 15 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 15,8 mg von wiedergewonnener Verbindung 11 sowie 45,0 mg (77%, 100% bezogen auf das wiedergewonnene Ausgangsmaterial) Verbindung 1 als orangen Feststoff. 1H-NMR (400 MHz, Haupt-Tautomer)
    δ 12.45 (br s, 1H), 11.66 (br s, 1H), 10,87 (br s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.71 (br s, 1H), 7.68 (br s, 1H), 7.39 (br d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.07 (br m, 2H), 6.87 (br m, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 172.8, 172.6, 136.1, 135.9, 130.9, 130.5, 126.0, 126.0, 121.7, 121.3, 119.7, 119.2, 112.2, 111.5, 105.0;
    HREIMS – ber. für C15H10N4O2: 278,0804, gef.: 278,0804.
  • Granulatimid (4) und Isogranulatimid (5)
  • Einer Lösung von 1 (12,9 mg, 0,046 mmol) in MeCN (5,0 ml) wurde eine katalytische Menge Palladium/Aktivkohle (10% Pd) zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde 0,5 h lang mit Argon gespült. Das Gemisch wurde 6,5 h lang bestrahlt (450-Watt-Hanovia-Mitteldruck-Quecksilberdampflampe, Quarzreaktionsgefäß). Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert, der Celit wurde mit DMF (10 ml) gewaschen, und das vereinigte Filtrat wurde eingeengt. Das verbleibende Material wurde in EtOAc (30 ml) aufgenommen, und die resultierende Lösung wurde gewaschen (Kochsalzlösung, 4 × 20 ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (20 g Silikagel, 10 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 11,7 mg (91%) an Verbindung 4 als gelben Feststoff und 1,0 mg (8%) an Verbindung 5 als roten Feststoff. Abschließende Reinigung erfolgte auf RPHPLC (1 : 1 CH3CN-0,05% TFA). Granulatimid (4): 1H-NMR (400 MHz) siehe Tabelle 1; UV (MeOH) 230, 270, 285, 295 und 380 nm; HREIMS – ber. für C15H8N4O2 : 276,0647, gef.: 276,0652. Isogranulatimid (5): siehe oben und Tabelle 1.
  • Beispiel 3
  • Alternative Synthesen von Isogranulatimid (5):
  • Verfahren A: Einer gerührten Lösung von Didemnimid A(1)(32,6 mg, 0,117 mmol) in 2-Butanon (7,0 ml) bei Raumtemperatur wurden nacheinander Molekularsieb mit 4 Å (100 mg) und CuCl2 (79 mg, 0,59 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die dunkelpurpurfarbene Lösung wurde mit 10%iger NaOH-Lösung behandelt, bis der pH neutral war, und mit EtOAc (30 ml) verdünnt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc extrahiert (5 × 10 ml). Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatograpie (15 g Silikagel, 15 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 19,5 mg (60%) des wiedergewonnenen Didemnamid A sowie 12,3 mg (38%, 95% bezogen auf wiedergewonnenes Ausgangsmaterial) Isogranulatimid (5) als purpurfarbenen Feststoff.
  • Verfahren B: Eine gerührte Lösung von Didemnimid A(1)(14,7 mg, 0,053 mmol) in DMSO (5,0 ml) wurde 1 h lang auf 160°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit EtOAc (30 ml) verdünnt, mit Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (25 g Silikagel, 10 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 12,4 mg (85%) Isogranulatimid (5) als purpurfarbenen Feststoff;
    IR (KBr) 2732, 1758, 1719, 1586, 1568, 1368, 1234, 1109, 744 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 13.39 (bs, 1H), 11.09 (bs, 1H), 8.84 (s, 1H), 8.44 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.82 (s, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.40 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 7.31 (dd, 1H, J = 8,8 Hz); 13C NMR (100 MHz) δ 169.9, 169.0, 135.6, 134.9, 126.9, 124.7, 123.1, 122.3, 121.8, 121.3, 121.0, 113.9, 112.3, 97.6;
    HREIMS – ber. für C15H8N4O2: 276,0647, gef.: 276,0647.
  • Beispiel 4 Synthese von Granulatimidverbindungen
    Figure 00440001
  • Retrosynthese
    Figure 00440002
  • Imidazol-1H-1-acetamid (20)
  • Einer gerührten Suspension von NaH (60% Dispersion in Öl, 352 mg, 8,80 mmol) in DMF (5,0 ml) bei 0°C wurde eine Lösung von Imidazol (536 mg, 8,00 mmol) in DMF (10,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 0,5 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf 0°C abgekühlt, und Iodacetamid (1,63 g, 8,81 mmol) wurde auf einmal zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 1,5 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit CH2Cl2 (20 ml) verdünnt, und Nal-Kristalle wurden durch Filtration entfernt. Die Stammlösung wurden eingeengt und auf eine neutrale Aluminiumoxidsäule (40 g) aufgebracht und mit CH2Cl2-MeOH (6 : 1) eluiert und eingeengt. Flash-Chromatographie (60 g Silikagel, 7 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 747 mg (75%) von Verbindung 20 als weißen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 185–186°C;
    IR (KBr) 3349, 3116, 1685, 1516, 1408, 1312, 1236, 1080, 750, 663 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 7.54 (s, 1H), 7.51 (bs, 1H), 7.20 (bs, 1H), 7.06 (s, 1 H), 6.84 (s, 1H), 4.61 (s, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 168.5, 138.0, 127.5, 120.4, 48.4;
    HREIMS – ber. für C5H7N3O: 125,0589, gef.: 125,0589.
  • Methylindol-3-ylglyoxylat (21)
  • Einer kalten (0°C) gerührten Lösung von 3-Indolglyoxylsäure (1,00 g, 5,29 mmol) in MeOH (10,0 ml) und Benzol (40,0 ml) wurde (Trimethylsilyl)diazomethan (2,0 M in He-xan, 5,3 ml, 10,6 mmol) zugegeben, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 4 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, was einen beigen Feststoff ergab. Flash-Chromatographie (80 g Silikagel, 25 : 1, dann 10 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 990 mg (92%) von Verbindung 21 als beigen Feststoff, der folgende Werte aufwies:
    1H NMR (400 MHz) δ 12.40 (bs, 1H), 8.44 (d, 1H, J = 3.0 Hz), 8.15 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.24–7.31 (m, 2H), 3.88 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 178.7, 163.9, 138.3, 136.7, 125.4, 123.8, 122.8, 121.1, 112.7, 112.4, 52.5;
    HREIMS – ber. für C11H9NO3: 203,0582, gef.: 203,0582.
  • 3-[4-(1H-Imidazol-1-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol (19)
  • Einer gerührten Lösung von t-BuOK (140 mg, 1,25 mmol) in DMF (2,0 ml) mit 0°C wurde eine Lösung von Verbindung 20 (31,1 mg, 0,249 mmol) in Methylindol-3-glyoxylat (21)(101,1 mg, 0,498 mmol) in DMF (3,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt und dann für 3 h auf 45°C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt und mit gesättigtem wässrigem NH4Cl (5 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (4 × 10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (25 g Silikagel, 10 : 1, dann 6 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 54,5 mg (79%) von Verbindung 19 als roten Feststoff, der folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 3121, 2729, 1767, 1719, 1651, 1495, 1340, 1239, 746 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 10.75 (bs, 1H), 10.00 (bs, 1H), 8.03 (d, 1H, J = 3.1 Hz), 7.78 (s, 1H), 7.48 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.29 (s, 1H), 7.11 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 7.04 (s, 1H), 6.80 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 6.21 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 13C NMR (100 MHz) δ 170.4, 168.4, 137.8, 136.4, 131.6, 128.8, 125.8, 124.3, 124.1, 122.5, 120.6, 120.1, 119.6, 112.3, 102.3;
    HREIMS – ber. für C15H10N4O2: 278,0804, gef.: 278,0804.
  • RAB-009 (40) und RAB-010 (50)
  • Eine Lösung von Verbindung 19 in t-BuOH und MeCN wurde 0,5 h lang mit Argon gespült. Das gelbe Gemisch wurde dann 4 h lang bestrahlt (450-Watt-Hanovia-Mitteldruck-Quecksilberdampflampe, Quarzreaktiongefäß). Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und in Aceton (10 ml) erneut gelöst. Dem rohen Reaktionsprodukt in Aceton bei Raumtemperatur wurde 10 × CuCl2 zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde an der Luft über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in DMF (10 ml) aufgenommen und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde dann mit EtOAc (50 ml) verdünnt und mit Kochsalzlösung (4 × 10 ml) gewa- schen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt, was Verbindung 40 und 50 in einem Verhält- nis 3 : 1 ergab. Triturieren des rohen Feststoffs mit MeOH ergab kleine Mengen an RAB-009 (40) als unlöslichen gelben Feststoff; IR (KBr) 3184, 2931, 2692, 1756, 1718, 1656, 1365, 1309, 1134, 730 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 13.14 (bs, 1H), 11.27 (bs, 1H), 8.63 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.46 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.66 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.50 (dd, 1H, J = 7,7 Hz), 7.36 (dd, 1H, J = 8,8 Hz);
    HREIMS – ber. für C15H8N4O2: 276,0647, gef.: 276,0647. Unglücklicherweise konnten die MeOH-Waschlösungen nicht gereinigt werden, um signifikante Mengen an RAB-010 (50) oder RAB-009 (40) zu ergeben. Eine kleine Menge (etwa 0,5 mg, etwa 70 rein) RAB-010 (50) wurde durch wiederholte Säulenchromatographie gewonnen und Biotests unterzogen. Es wurde festgestellt, dass Verbindung 40 inaktiv war, wobei sie im G2-Test einen IC50 > 100 μM aufwies, während Verbindung 50 aktiv war und einen IC50 von 1 μM aufwies.
  • Beispiel 5 Syntese von 60
    Figure 00470001
  • Retrosynthese
    Figure 00470002
  • Syntheseschema
    Figure 00480001
  • Methyl-2-(1-methoxymethyl-1H-imidazol-2-yl)glyoxylat (101)
  • Einer kalten (–48°C) gerührten Lösung von 1-Methoxymethyl-1H-imidazol (120)(335 mg, 2,99 mmol) in trockenem THF (15,0 ml) wurde eine Lösung von n-BuLi (1,50 M in Hexan, 2,30 ml, 3,45 mmol) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 h lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf –78°C abgekühlt und einer Lösung von Dimethyloxalat (1,17 g, 9,9 mmol) in THF (10,0 ml) bei –78°C zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere 0,33 h bei –78°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem wässrigem NH4Cl (5 ml) und EtOAc (15 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (50 g Silikagel, 50 : 1, CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 290 mg (49%) von Verbindung 101 als Öl, das folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 2957, 1744, 1679, 1412, 1276, 1215, 1109, 1005 cm–1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.38 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 5.71 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.33 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.9, 164.3, 140.6, 132.9, 126.9, 78.8, 57.5, 53.4;
    HREIMS – ber. für C8H10N2O4: 198,0641, gef.: 198,0641.
  • 3-[4-(1-Methoxymethyl-1H-imidazol-2-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol (140)
  • Einer gerührten Lösung von Verbindung 101 (142,0 mg, 0,717 mmol) und Indolacetamid (62,7 mg, 0,360 mmol) in DMF (5,0 ml) wurde eine Lösung von t-BuOK (101 mg, 0,902 mmol) in DMF (5,0 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann auf 45°C erwärmt und für weitere 12 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann gekühlt und mit gesättigtem wässrigem NH4Cl (5 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (4 × 10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (40 g Silikagel, 40 : 1 CH2Cl-MeOH) des Rohmaterials ergab 79,1 mg (68%) von Verbindung 140 als roten Feststoff, der folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 2500–3400, 1759, 1713, 1626, 1531, 1341, 1025, 745 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 12.06 (bs, 1H), 11.17 (bs, 1 H), 8.22 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.41 (d, 1H, J = 7.9 Hz), 7.11 (s, 1H), 7.08 (dd, 1 H, J = 8.1 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 6.23 (d, 1H, J = 8.1 Hz); 5.06 (s, 2H), 3.08 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.6, 171.4, 138.0, 137.7, 136.6, 132.7, 129.2, 124.8, 122.4, 122.0, 120.7, 120.2, 118.1, 112.1, 105.1, 76.8. 55.7;
    HREIMS – ber. für C17H14N4O2: 322,1066, gef.: 322,1066.
  • 3-[4-(1H-Imidazol-2-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol (90)
  • Einer gerührten Suspension von Verbindung 140 (18,0 mg, 0,056 mmol) in CH2Cl2 (5,0 ml) bei Raumtemperatur wurde BBr3 (1,0 M in CH2Cl2, 0,56 ml, 0,56 mmol) zugegeben, und das resultierende blaue Gemisch wurde unter Rückflussbedingungen 5 h lang erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigtem wässrigem NaHCO3 (5 ml) und EtOAc (10 ml) behandelt und dann 0,5 h lang gerührt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (3 × 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (25 g Silikagel, 20.1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 13,5 mg 87%) von Verbindung 90 als roten Feststoff, der folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 3385, 3140, 1759, 1709, 1630, 1494, 1431, 1346, 1025, 1002, 747 cm–1; 1H NMR (Haupt- Tautomer, 400 MHz) δ 12.32 (bs, 1H), 11.90 (bs, 1H), 11.13 (bs, 1H), 8.48 (d, 1 H, J = 3.2 Hz), 7.43 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.18–7.28 (m, 2H), 7.10 (dd, 1H, J = 7,7 Hz), 6.88–6.96 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 172.1, 172.0, 170.2, 137.1, 136.4, 133.0, 132.8, 125.2, 122.0, 121.6, 120.2, 120.0, 119.2, 111.9, 105.0;
    HREIMS – ber. für C15H10N4O2: 278,0804, gef.: 278,0804.
  • RAB-007 (60)
  • Eine gerührte Lösung von Verbindung 90 (14,4 mg, 0,052 mmol) in DMSO (5 ml) wurde 8 h lang auf 120°C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit EtOAc (30 ml) verdünnt, mit Kochsalzlösung (3 × 10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (20 g Silikagel, 20 : 1 dann 10 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 11,0 mg (76%) von Verbindung 60 als orangen Feststoff, der folgende Werte aufwies: IR (KBr) cm–1 2600–3400, 1755, 1717, 1631, 1591, 1575, 1464, 1376, 1336, 1232, 751; 1H NMR (400 MHz) δ 13.36 (bs, 1H), 11.13 (bs, 1H), 8.63 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 8.40 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.69 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.48 (dd, 1H, J = 7,7 Hz), 7.38 (dd, 1H, J = 7,7 Hz);
    HREIMS – ber. für C15H8N4O2: 276,0647, gef.: 276,0647.
  • Beim G2-Checkpoint-Inhibitionstest hatte Verbindung 60 einen IC50 von 2 μM.
  • Beispiel 6 Synthese von Cyclodidemnimid C(70)
    Figure 00510001
  • Retrosynthese
    Figure 00510002
  • Syntheseschema
    Figure 00510003
  • Methyl-2-(1-methyl-1H-2-phenylthioimidazol-5-yl)glyoxylat (160)
  • Einer kalten (–78°C) gerührten Lösung von Diisopropylamin (0,175 ml, 1,25 mmol) in trockenem Et2O (2,0 ml) und trockenem DME (2,0 ml) wurde eine Lösung von n-BuLi (1,60 M in Hexan, 0,740 ml, 1,18 mmol) zugegeben, und das Gemisch wurde 0,5 h lang gerührt. Eine Lösung von 1-Methyl-2-phenylthioimidazol (180)(140 mg, 0,739 mmol) in trockenem Et2O (3,0 ml) wurde zugegeben, und die Lösung wurde bei –78°C 0,25 h lang und bei 0°C für eine weitere Stunde gerührt. Dimethyloxalat (520 mg, 4,40 mmol) wurde dann auf einmal zugegeben, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und weitere 3 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem wässrigem NH4Cl (5,0 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (35 g Silikagel, 70 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 84,5 mg (41%) von Verbindung 160 als beigen Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 98–99°C;
    IR (KBr) 1736, 1651, 1437, 1277, 1216, 1013 cm–1; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.22 (s, 1H), 7.42–7.44 (m, 2 N), 7.34– 7.37 (m, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.92 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172.9, 162.2, 151.8, 144.7, 132.4, 130.2, 129.9, 129.8, 129.1, 53.3, 34.3;
    HREIMS – ber. für C13H12N2O3S: 276,0569, gef.: 276,0569.
  • 3-[4-(1-Methyl-1H-2-phenylthioimidazol-5-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1-pyrrol-3-yl]indol (170)
  • Einer gerührten Lösung von t-BuOK (28 mg, 0,25 mmol) in DMF (1,0 ml) bei Raumtemperatur wurden nacheinander Molekularsieb mit 4 Å (~50 mg) und eine Lösung von Verbindung 160 (28 mg, 0,10 mmol) und Indol-3-acetamid 9 (22 mg, 0,13 mmol) in DMF (1,5 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 40°C erwärmt und 48 h lang gerührt. Die dunkelpurpurfarbene Lösung wurde mit Salzsäure (1H, 1,0 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (4 × 10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chro matographie (20 g Silikagel, 30 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergaben 35 mg (88%) von Verbindung 170 als roten Feststoff, der folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 2500–3600, 1760, 1713, 1631, 1581, 1441, 1339, 744 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 12.06 (bs, 1H), 11.19 (bs, 1H), 8.09 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.46 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.14–7.31 (m, 6H), 7.03 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 6.81 (dd, 1 H, J = 8,8 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 3.07 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.6, 171.4, 138.6, 136.4, 134.6, 133.7, 132.7, 131.8, 129.4, 127.4, 126.7, 126.6, 124.5, 120.8, 119.5, 117.9, 112.4, 104.8, 32.4;
    HREIMS – ber. für C22H16N4O2S: 400,0994, gef.: 400,0994.
  • Didemnimid C (150)
  • Einer rückflusssiedenden Lösung von Verbindung 170 (46,7 mg, 0,117 mmol) in EtOH (10 ml) wurde Raney-Nickel (W-2, 50%ige Aufschlämmung in Wasser, 120 mg) zugegeben, und die Suspension wurde 1 h lang rückflusserhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Celit filtriert. Der Celit wurde mit DMF (6 ml) und MeOH-TFA (100 : 1,30 ml) gewaschen, und die vereinigten organischen Waschlösungen wurden eingeengt. Das organische Konzentrat wurde mit EtOAc (40 ml) verdünnt und mit NaHCO3 (4 × 10 ml) und Kochsalzlösung (3 × 20 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (25 g Silikagel, 10 : 1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 26,4 mg (77%) von Verbindung 150 als orangen Feststoff, der folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 3163, 3041, 1766, 1702, 1538, 1345, 1236, 1221, 748 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 11.97 (bs, 1H), 11.09 (bs, 1 H), 8.06 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.69 (bs, 1H), 7.44 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.10 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 6.78 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 6.40 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 3.17 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.9, 171.7, 140.3, 136.4, 133.9, 132.0, 131.5, 124.7, 122.3, 120.5, 119.7, 112.2, 105.0, 32.0;
    HREIMS – ber. für C16H12N4O2: 292,0960, gef.: 292,0960
  • Cyclodidemnimid C(70)
  • Eine Lösung von Verbindung 150 (20,5 mg, 0,071 mmol) in MeCN (30,0 ml) wurde 0,5 h lang mit Argon gespült. Das orange Gemisch wurde dann 3,5 h lang bestrahlt (450-Watt-Hanovia-Mitteldruck-Quecksilberdampflampe, Quarz-Reaktionsgefäß). Das Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert und getrennt mit MeOH (30 ml) und DMF (40 ml) gewaschen. Die MeOH-Wäschen wurden unter Vakuum eingeengt und mit MeOH (3 × 10 ml) trituriert, was 2,4 mg von Verbindung 70 als gelben Rückstand ergab. Die DMF-Wäschen wurden eingeengt, was 10,1 mg (insgesamt 12,5 mg, 64%) von Verbindung 70 als gelben Feststoff ergab, der kaum in DMSO löslich war und folgende Werte aufwies:
    IR (KBr) 3257, 2951, 2726, 1734, 1703, 1505, 1479, 1461, 1393, 1326, 1225, 1068, 761, 744 cm–1; 1H NMR (400 MHz) δ 12.58 (bs, 1H), 11.04 (bs, 1H), 8.94 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 8.48 (s, 1H), 7.60 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.48 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 7.30 (dd, 1H, J = 8,8 Hz) 4.31 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 170.7, 169.1, 147.1, 140.6, 135.6, 133.8, 128.5, 126.2, 124.0, 123.6, 121.3, 120.1, 113.0, 111.6, 109.8, 35.1;
    HREIMS – ber. für C16H10N4O2: 290,0804, gef.: 290,0804.
  • Im G2-Checkpoint-Inhibitionstest wurde festgestellt, dass Cyclodidemnimid C einen IC50 > 100 μM aufwies.
  • Beispiel 7
  • Synthese von mit K252a, KT-6006, KT-6258 verwandten Verbindungen
  • Die Synthese von Verbindungen der Formel III wird nach den folgenden Syntheseschemata erreicht, die nachstehend in den Beispielen 8 und 9 dargelegt sind. Die Reaktionsbedingungen sind die in den zitierten Dokumenten angeführten.
  • Figure 00550001
  • Beispiel 8 Synthese von mit Granulatimid verwandten Verbindungen
    Figure 00550002
  • Beispiel 9 Synthese von mit Staurosporin verwandten Verbindungen
    Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Beispiel 10 Synthese von mit Rebeccamycin verwandten Verbindungen
    Figure 00570002
  • Figure 00580001
  • Beispiel 11
  • Hemmung von Protein-Kinasen durch Granulatimidverbindungen
  • Granulatimidverbindungen und offene Formen von Granulatimidverbindungen (RAB-004; RAB-006; RAB-011 und RAB-012) wie in Tabelle 2 gezeigt wurden wie zuvor beschrieben auf ihre Hemmung von G2-Checkpoint und auf die Hemmung von Protein-Kinase-Wirkung gegenüber einem Panel von Protein-Kinasen, einschließlich CDK1, GSK3b und IL1, getestet.
  • Das verwendete GSK3β-Peptidsubstrat war YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(PO4H2)EDEE-Amid. Das ILK1-Substrat ist CKRRRLASLR-Amid.
  • Die Testverbindungen wurden auf 250 μM in 1% DMSO verdunnt, dann unter Einsatz von Dreifach-Verdünnungsschritten reihenverdünnt. 100% DMSO wurde als negative Kontrolle verwendet.
  • Kinase-Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthält verdünnte Testverbindung, die Protein-Kinase, Substrat und γ-32P-ATP. Das Gemisch wird 15 min lang inkubiert und das Reaktionsgemisch getüpfelt und gezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Granulatimidverbindungen zusätzlich zu ihrer Hemmwirkung für den G2-Checkpoint als Kinase-Inhibitoren wirken können. Interessanterweise können offene Granulatimide (Didemnimid-artige Verbindungen), die als RAB-004, RAB-006, RAB-011 und RAB-012, obwohl sie im G2-Checkpoint-Test inaktiv sind, als Kinase-Inhibitoren wirksam sein.
  • Es sind zwar verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben worden, es versteht sich jedoch, dass Änderungen und Modifikationen dieser hierin beschriebenen Aspekte in den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche fallen.

Claims (17)

  1. Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00620001
    worin: R4 und R5 in Kombination Ar1 sind, worin Ar1 ein gegebenenfalls mit R oder Z substituiertes monzyklisches, bizyklisches oder trizyklisches, vollständig oder teilweise aromatisches System ist, das 5- oder 6-gliedrige carbozyklische oder Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefel-hältige heterozyklische Ringe enthält; W aus der aus Formel (i) und (ii) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die Strukturen folgende sind:
    Figure 00620002
    worin K, E und T jeweils unabhängig voneinander aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind: N, CR und CZ, und worin R und Z wie nachstehend definiert sind; und
    Figure 00620003
    worin K und E jeweils unabhängig voneinander aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind: N, CR und CZ, und worin R, Z und Q wie nachstehend definiert sind; R1 aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe auch ausgewahlt ist R; RCO-; Ar2CO-; und Ar2CH2-, worin Ar2 ein aromatischer Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Penanthryl, Furan, Pyrrol, Thiophen, Benzofuran, Benzothiophen, Chinolin, Isochinolin, Imidazol, Thiazol, Oxazol und Pyridin, und Ar2 gegebenenfalls mit R oder Z substituiert ist, worin R und Z wie nachstehend definiert sind; R aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: H; und einem strukturellen Fragment mit einem gesättigten oder ungesättigten linearen, verzweigten oder zyklischen Skelett, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, worin die Kohlenstoffatome gegebenenfalls mit einem Substituenten substituiert sind, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: -ON; -OR3; -O2CR3, -SH; -SR3; -SOCR3; -NH2; -NHR3; -NH(R3)2; -NHCOR3; -NRCOR3; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R3; -CHO; -COR3; -CONH2; -CONHR3; -CON(R3)2; -COSH; -COSR3; NO2; -SO3H; -SOR3; und -SO2R3, worin R3 eine lineare, verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen ist; Z ein optionaler Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: H; -OH; -OR; -O2CR; -SH; -SR; -SOCR; -NH2; -NHR; -NH(R)2; -NHCOR; -NRCOR; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R; -CHO; -COR; -CONH2; -CONHR; -CON(R)2; -COSH; -COSR; -NO2; -SO3H; -SOR; und -SO2R; Q aus der aus NR1; O; S und C(R)2 bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der aus O; H, OH; und H2 bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R1 H oder CH3 ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin X und Y Sauerstoff sind.
  4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin W ein fünfgliedriger Ring der Formel (i) oder (ii) ist, der zumindest ein Stickstoffatom umfasst; und worin E, K und T, sofern vorhanden, N oder CH sind.
  5. Verbindung nach Anspruch 4, worin Q NH ist.
  6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R4 und R5 in Kombination ein bizyklisches aromatisches System sind, das einen fünfgliedrigen und einen sechsgliedrigen Ring umfasst und folgende Struktur aufweist:
    Figure 00640001
    worin die K jeweils unabhängig voneinander aus der aus N, CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und worin Z und R wie in Anspruch 1 definiert sind.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, worin R4 und R5 in Kombination die bizyklische Struktur:
    Figure 00640002
    aufweisen.
  8. Verbindung nach Anspruch 7, worin W ein fünfgliedriger Ring der Formel (i) oder der Formel (ii) ist.
  9. Verbindung nach Anspruch 8 mit der Struktur:
    Figure 00650001
  10. Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00650002
    worin K unabhängig aus der aus N, CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin R und Z wie nachstehend definiert sind; S1 aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist:
    Figure 00650003
    worin X1 aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: N(CH3)2,NCH3, NH2,
    Figure 00660001
    oder S1 ein lineare Brücke aus zwischen 5 und 8 Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatomen ist, worin die Brücken-Kohlenstoffatome OR- oder NR2-Substituenten aufweisen können und die Brücken-Stickstoffatome R-Substituenten aufweisen können, worin R wie nachstehend definiert ist; R1 aus der aus R; RCO-; Ar2CO-; und Ar2CH2- bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin Ar2 ein aromatischer Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl, Furan, Pyrrol, Thiophen, Benzofuran, Benzothiophen, Chinolin, Isochinolin, Imidazol, Thiazol, Oxazol und Pyridin, und Ar2 gegebenenfalls mit R oder Z substituiert ist, worin R und Z wie nachstehend definiert sind; R aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H; und einem Strukturfragment besteht, das ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares, verzweigtes oder zyklisches Skelett aufweist, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, worin die Kohlenstoffatome gegebenenfalls mit einem Substituenten substituiert sind, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: -OH; -OR3; -O2CR3, -SH; -SR3; -SOCR3; -NH2; -NHR3; -NH(R3)2; -NHCOR3; -NRCOR3; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R3; -CHO; -COR3; -CONH2; -CONHR3; -CON(R3)2; -COSH; -COSR3; -NO2; -SO3H; -SOR3; und -SO2R3, worin R3 eine lineare, verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen ist; Z ein optionaler Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: H; -OH; -OR; -O2CR; -SH; -SR; -SOCR; -NH2; -NHR; -NH(R)2; -NHCOR; -NRCOR; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R; -CHO; -COR; -CONH2; -CONHR; -CON(R)2; -COSH; -COSR; -NO2; -SO3H; -SOR; und -SO2R; X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der aus Cl; H, OH, und H2 bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und R6 unabhängig aus einer verzweigten oder unverzweigten, linearen oder zyklischen Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist.
  11. Verbindung mit der Struktur:
    Figure 00670001
    worin K unabhängig aus der aus N, CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin R und Z wie nachstehend definiert sind; W aus der aus Formel (i); (ii) und (iii) bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin die Strukturen folgende sind:
    Figure 00670002
    worin K, E und T jeweils unabhängig voneinander aus der aus N, CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt sind und worin R und Z wie nachstehend definiert sind; und
    Figure 00670003
    worin K und E jeweils unabhängig voneinander aus der aus N; CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt sind und worin R, Z und Q wie nachstehend definiert sind; und
    Figure 00680001
    worin K, E, T und U jeweils unabhängig voneinander aus der aus N, CR und CZ bestehenden Gruppe ausgewählt sind und worin R und Z wie nachstehend definiert sind; R1 aus der aus R; RCO-; Ar2CO-; und Ar2CH2- bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin Ar2 ein aromatischer Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Phenanthryl, Furan, Pyrrol, Thiophen, Benzofuran; Benzothiophen, Chinolin, Isochinolin, Imidazol, Thiazol, Oxazol und Pyridin, und Ar2 gegebenenfalls mit R oder Z substituiert ist, worin R und Z wie nachstehend definiert sind; R aus der aus N und einem strukturellen Fragment bestehenden Gruppe ausgewählt ist, das ein gesättigtes oder ungesättigtes, lineares, verzweigtes oder zyklisches Skelett aufweist, das 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, worin die Kohlenstoffatome gegebenenfalls mit einem Substituenten substituiert sind, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: -OH; -OR3; -O2CR3, -SH; -SR3; -SOCR3; -NH2; -NHR3; -NH(R3)2; -NHCOR3; -NRCOR3; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R3; -CHO; -COR3; -CONH2; -CONHR3; -CON(R3)2; -COSH; -COSR3; -NO2; -SO3H; -SOR3; und -SO2R3, worin R3 eine lineare, verzweigte oder zyklische, gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffen ist; Z ein optionaler Substituent ist, der aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt ist: H; -OH; -OR; -O2CR; -SH; -SR; -SOCR; -NH2; -NHR; -NH(R)2; -NHCOR; -NRCOR; -I; -Br; -Cl; -F; -CN; -CO2H; -CO2R; -CHO; -COR; -CONH2; -CONHR; -CON(R)2; -COSH; -COSR; -NO2; -SO3H; -SOR; und -SO2R; X und Y jeweils unabhängig voneinander aus der aus O; H, OH; und H2 bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und S2 die Formel (iv)
    Figure 00690001
    aufweist, worin R7 eine verzweigte, lineare oder zyklische Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist oder S2 eine lineare Alkylkette mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, die ein endständiges NR2 enthält, worin R2 eine verzweigte, lineare oder zyklische Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
  12. Pharmazeutische Formulierung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
  13. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Menschen- oder Tierkörpers.
  14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen eines G2-Checkpoints in einer Zelle.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, worin das Hemmen des G2-Checkpoints zu verstärkter Abtötung einer hyperproliferativen Zelle führt.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, worin die hyperproliferative Zelle p53-negativ ist.
  17. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer Protein-Kinase.
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