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HINTERGRUND
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Naturprodukte
sind eine reiche Quelle für
neue organische Verbindungen, von denen viele interessante und wünschenswerte
biologische Wirkungen aufweisen. Auf Extrakte eines Organismus von
Interesse, wie eines wirbellosen Meerestieres, können Verfahren zur chemischen
Trennung und Analyse angewandt werden, um die Struktur biologisch
wirksamer Verbindungen zu erhellen. Diese chemischen Strukturen
bilden dann die Basis für
synthetische Modifikationen, um die erwünschte Wirkung zu verstärken.
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Meeresaszidien
oder Seescheiden haben eine Reihe einzigartiger sekundärer Metaboliten
mit starker biologischer Wirkung. Kolonie-Aszidien aus der Familie
Didemnidae sind besonders produktiv und enthalten stickstoffhaltige
von Aminosäure
abgeleitete Metaboliten, einschließlich verschiedener zyklischer
Peptide. Diese als Didemnimide bezeichneten Verbindungen wurden
von Didemnum conchyliatum isoliert. Diese Verbindungen sind Indol-Maleimid-Imidazol-Alkaloide,
die hypothetisch als Kondensation von Tryptophan und Histidin synthetisiert
werden könnten.
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Die
weitere Untersuchung von Didemna-Produkten und die Charakterisierung
ihrer Wirkbestandteile ist von besonderem Interesse für die Entwicklung
neuer Therapiemittel und ihrer Verwendungen.
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Relevante Literatur
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Didemnimidverbindungen
werden von Vervoot et al., J. Org. Chem. 62, 1486-1490 (1997), beschrieben.
Bei der Beschreibung der Synthese derartiger Didemnimidverbindungen
berichten Terpin et al., Tetrahedron 54, 1740-172 (1998), ein Ringschlussereignis,
das bei Bestrahlung oder bei Umkristallisation aus Methanol eines
Boc-geschützten
Zwischenproduktes auftreten kann, das im Didemnimid-Syntheseschema zum
Einsatz kommt.
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Die
Bildung einer Vielzahl substituieter Diarylmaleimide wird von Smith
et al., J. Org. Chem. 55, 3351-3362 (1990), beschrieben.
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Bekannte
G2-Checkpoint-Inhibitoren sind Purin-Analoge, z. B. Coffein, Pentoxifyllin,
2-Aminopurin, 6-Dimethylaminopurin; und Staurosporin mit seinem
Derivat UCN-01 (7-Hydroxystaurosporin). Siehe beispielsweise Busse
et al., Radiat. Res. 76, 292-307
(1978); Schlegel, Science 232, 1264-1266 (1986); Downes et al.,
J. Cell. Biol. 110, 1855-1859 (1990); Steinmann et al., P.N.A.S.
88, 6843-6847 (1991); Andreasson et al., P.N.A.S. 89, 2272-2276
(1992); Tam et al., Cell Growth Differ. 3, 811-817 (1992); und Wang
et al., J. Nat'l
Cancer Inst. 88, 956-965 (1996).
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Versuche,
bei denen Zellen mit einem Mangel an Tumorsuppressorprotein p53
eingesetzt wurden, haben den Wert der beiden Gruppen von oben beschriebenen
G2-Checkpoint-Inhibitoren
gezeigt, um Krebszellen selektiv für Mittel empfindlich zu machen,
die DNA schädigen.
Es ist gezeigt worden, dass Pentoxifyllin die durch Cisplatin herbeigeführte Abtötung von
p53--MCF-7-Zellen um das Dreißigfache
und die durch Strahlung herbeigeführte Abtötung von p53--A549-Human-Lungen-Adenokarzinomzellen
um das Fünffache
erhöht.
Siehe beispielsweise Russell et al., Cancer Res. 55, 1639-1542 (1995);
Powell et al., Cancer Res. 55, 1643-1648 (1995); Russell et al.,
Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 36, 1099-1106 (1996); Yao et
al., Nature Med. 2, 1140-1143 (1996); und Bracey et al., Clin. Cancer
Res. 3, 1371-1381 (1997).
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Die
Behandlung bestimmter Krebsarten unter Verwendung von Anthracenverbindungen
und pharmazeutischer Derivate davon wird in der
WO 96/11933 und EP Nr.
0.841.337 beschrieben.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
werden Granulatimidverbindung der Formel I bereitgestellt, wie hierin
definiert. Die Erfindung umfasst die natürlich vorkommenden Verbindungen,
Granulatimid und Isogranulatimid, in gereinigter oder teilweise
gereinigter Form, einschließlich
von natürlichen
Quellen (z. B. Didemnum granulatum) stammender Extrakte, die diese
Ver bindungen enthalten. Gemäß einer
Asführüngsform
der Erfindung werden Formulierungen der Verbindungen in Kombination
mit einem physiologisch annehmbaren Träger bereitgestellt. Die pharmazeutischen
Formulierungen sind als zytotoxische Mittel; als ein Protein-Kinase-Inhibitor;
sowie zur Hemmung des G2-Checkpoints nützlich. Die vorliegende Erfindung
sieht auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I vor, um
beispielsweise Zellen für
die Wirkungen von DNA-schädigenden
Mitteln empfindlich zu machen; sowie die Verwendung derartiger Verbindungen
bei der Formulierung von Mitteln, einschließlich Medikamenten.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die 1A bis 1C sind eine Reihe von Graphen, die Folgendes
zeigen: 1(A)-G2-Checkpoint-Hemmung durch Isogranulatimid; 1(B) – Isogranulatimid
und γ-Strahlung töten p53--Zellen synergistisch (in einer Menge von
1.000 Zellen pro Napf in 96-Napf-Platten gesäte MCF-7-mp53-Zellen wurden über Nacht
gezüchtet
und mit 0 Gy (O), 2 Gy (∎), 4 (⦁) oder 6 Gy (♦) bestrahlt, unmittelbar
nach der Bestrahlung wurden die Zellen 16 h lang mit Isogranulatimid
behandelt, das Zell-Überleben
wurde unter Einsatz eines Tests mit löslichem Tetrazoliumsalz (CellTiter
96TM, Promega) gemessen, 100 % Zell-Überleben
ist als der Überlebensanteil
nach Bestrahlung allein definiert (6 Gy führte zu etwa 80 % Zell-Abtötung));
und 1(C) – Isogranulatimid und γ-Bestrahlung
töten p53+- Zellen nicht synergistisch (Verfahren
identisch mit (B), wobei jedoch MCF-7-Zellen verwendet werden).
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2 ist
ein Graph, der die G2-Checkpunkt-Hemmung durch Granulatimid zeigt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
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Es
werden neue Granulatimidverbindung der Formel I bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung umfasst die natürlich vorkommenden Verbindungen,
Granulatimid und Isogranulatimid, in gereinigter oder teilweise
gereinigter Form, einschließlich
von natürli chen
Quellen stammende enthalten. Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung werden Formulierungen der Verbindungen in Kombination
mit einem physiologisch annehmbaren Träger bereitgestellt.
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Die
pharmazeutischen Formulierungen sind als zytotoxische Mittel nützlich und
zur Hemmung von Protein-Kinasen, einschließlich jener, die die Regulierung
des G2-Checkpoints
bewirken. Eine derartige G2-Checkpoint-Hemmung verhindert das Anhalten
oder setzt Zellen frei, die an diesem Checkpoint angehalten werden,
wodurch es den. Zellen ermöglicht
wird, zur Mitose zu gelangen. Die vorliegende Erfindung sieht auch
die Verwendung von Verbindungen der Formel I vor, um Zellen für die Wirkungen
von DNA schädigenden Mitteln
empfindlich zu machen; sowie die Verwendung derartiger Verbindungen
bei der Formulierung von Mitteln, einschließlich Medikamenten, um die
Wirkung von DNA schädigenden
Mitteln auf Zellen zu verstärken.
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DEFINITIONEN
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Es
versteht sich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die beschriebene(n)
spezielle(n) Methodik, Vorschriften, Zelllinien, Tierspezies oder
-gattungen und Reagenzien beschränkt
ist, da diese variieren können. Es
versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur
dem Zweck dient, bestimmte Ausführungsformen
zu beschreiben, und nicht dazu bestimmt ist, den Schutzumfang der
vorliegenden Erfindung zu beschränken,
der nur durch die beiliegenden Ansprüche begrenzt ist.
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Alle
hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe haben,
wenn nicht explizit anders angegeben, die Bedeutung, in der sie
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise verstehen.
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Granulatimidverbindungen:
wie hierin verwendet, wird der Begriff "Granulatimidverbindung" allgemein verwendet,
um eine Klasse von Verbindungen mit der Struktur gemäß nachstehender
Formel I zu beschrieben. Dieser Genus umfasst die natürlich vorkommenden
Verbindungen Granulatimid und Isogranulatimid. Verbindungen ge mäß vorliegender
Erfindung, die hierin als Verbindungen der Formel I bezeichnet werden,
haben die in Anspruch 1 dargelegte Struktur, einschließlich aller
Stereoisomere, wenn die Verbindung als Stereoisomere vorliegt.
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Bevorzugte
Verbindungen der Formel I sind die folgenden, mit Substituenten
wie oben definiert oder wie speziell nachstehend definiert, wobei "Me" immer einen Methyl-Substituenten
darstellt.
worin Q=NH ist; R
1=H ist; und aus K, E, T=N oder CH ist;
worin gilt: Q=NH; R
1=H; und jedes von K, E, T=N oder CH ist.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung ist die Granulatimidverbindung eine der natürlich vorkommenden
Verbindungen Granulatimid oder Isogranulatimid.
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Pharmazeutisch
annehmbare Salze der Granulatimidverbindungen fallen ebenfalls in
den Schutzumfang der hierin offenbarten Verbindungen. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare
Salze", wie hierin
verwendet, bezeichnet ein anorganisches Säureadditionssalz, wie Hydrochlorid,
Sulfat und Phosphat, oder ein organisches Säureadditionssalze, wie Acetat,
Malest, Fumarat, Tartrat und Citrat. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare
Metallsalze sind Alkalimetallsalze, wie Natriumsalz und Kaliumsalz,
Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalz und Kalziumsalz, Aluminiumsalz
und Zinksalz. Beispiele für
pharmazeutisch annehmbare Ammoniumsalze sind Ammoniumsalz und Tetramethylammoniumsalz.
Beispiele für
pharmazeutisch annehmbare organische Aminadditionssalze sind Salze
mit Morpholin und Piperidin. Beispiele für pharmazeutisch annehmbare
Aminosäureadditionssalze
sind Salze mit Lysin, Glycin und Phenylalanin.
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Proteinkinasen
und Inhibitoren: Bei diesen Enzymen wird das γ-Phosphat von ATP oder GTP verwendet,
um Phosphatmonoester zu erzeugen, wobei Proteinalkoholgruppen auf
Serin oder Threonin und/oder Proteinphenolgruppen (Tyrosin) als
Phosphatgruppenakzeptoren verwendet werden. Sie sind aufgrund ihrer
homologen Kinase-Domänen
verwandt, die aus 200 bis 300 Aminosäureresten bestehen. Die Kinase-Domänen verleihen
die katalytische Wirkung durch die Bindung und Orientierung des
Phosphat-Donors als Komplex mit zweiwertigem Kation; die Bindung
und Orientierung des Polypeptidsubstrats; sowie Transfer des γ-Phosphats vom
ATP oder GTP zum Akzeptor-Hydroxyrest. Proteinkinasen sind daran
beteiligt, Wege für
solche wichtigen Zellaktivitäten
als Reaktionen auf extrazelluläre
Signale und Zellzyk lus-Checkpoints zu signalisieren. Die Hemmung
spezifischer Proteinkinasen stellt ein Mittel dar, um in diese Signal-Wege
einzugreifen, beispielsweise um die Wirkung eines extrazellulären Signals
zu blockieren, eine Zelle vom Zellzyklus-Checkpoint freizusetzen usw.
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Defekte
in der Aktivität
von Protein-Kinasen sind mit einer Vielzahl pathologischer oder
klinischer Leiden verbunden, wobei ein Defekt bei der durch Protein-Kinasen
vermittelten Signalisierung vorliegt. Zu diesen Zuständen gehören jene,
die mit Defekten in der Zellzyklus-Regulierung oder als Reaktion
auf extrazelluläre Signale
verbunden sind, z. B. Hyperglykämie
und Diabetes Typ I und Typ II, immunologische Störungen, z. B. Autoimmun- und
Immundefizienzerkrankungen; hyperproliferative Störungen,
die Psoriasis, Arthritis, Entzündung,
Krebs usw. umfassen können.
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Zu
den Protein-Kinasen von Interesse gehören jene, die an der Zellzyklus-Regulierung, insbesondere am
G2-Checkpoint, beteiligt sind. Andere Kinasen von Interesse sind
jene, die an den GSK3- und ILK-Signalisierungswegen beteiligt sind.
Glycogen-Synthase-Kinase-3 (GSK3) ist an der Regulierung mehrerer
physiologischer Prozesse beteiligt, einschließlich der Steuerung von Glycogen-
und Protein-Synthese
durch Insulin, Modulation der Transkriptionsfaktoren AP-1 und CREB,
der Spezifizierung des Zell-Werdegangs und der dorsoventralen Musterbildung.
GSK3 wird durch Serinphosporylierung als Reaktion auf Insulin oder
Wachstumsfaktoren und in vitro durch MAP-Kinase-aktiviertes Protein
(MAPKAP) Kinase-1 oder p70-Ribosomal-S6-Kinase
gehemmt.
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Integrin-gebundene
Kinase (ILK) ist eine Ankyrin-Wiederholung, die Serin-Threonin-Protein-Kinase enthält, die
zur Wechselwirkung mit den zytoplasmatischen Domänen von Integrin-β1-, -β2- und -β3-Untereinheiten
fähig ist.
Die Überexpression
von ILK in Epithelzellen unterbricht die Zell-Extrazellulärmatrix-
sowie die Zell-Zell-Wechselwirkung, unterdrückt durch Suspension herbeigeführte Apoptose
und stimuliert den Ankerungs-unabhängigen Zellzyklus-Fortschritt.
Außerdem
führt ILK
zu nuklearer Translokation von β-Catenin,
worin sich letzteres mit einem T-Zellen- Faktor/Lymphozytenverstärker-Bindungsfaktor
1 (TCF/LEF-1) assoziiert, um einen aktivierten Transkriptionsfaktor
zu bilden.
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Die
Granulatimidverbindungen gemäß vorliegender
Erfindung wirken als spezifische Protein-Kinase-Inhibitoren und
sind als Therapiemittel für
die Behandlung von Zuständen
nützlich,
die durch mit diesen Proteinen verbundene Defekte charakterisiert
sind. Die Verbindungen gemäß vorliegender
Erfindung sind auch nützlich
bei der Herstellung eines Medikaments zum Hemmen einer Protein-Kinase.
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G2-Checkpoint:
Normale Zellen reagieren in Abhängigkeit
von ihrem Typ und dem Schädigungsgrad auf
eine von zwei Arten auf DNA-Schädigung.
Die Zellen können
einen apoptotischen Weg aktivieren, der zur Selbsttötung der
Zelle und ihrer Beseitigung führt,
oder das Überleben
einer geschädigten
Zelle kann durch die Aktivierung von Checkpoints gefördert werden,
die den normalen Zyklus von Wachstum und Teilung vorübergehend
anhalten, um Zeit für
DNA-Reparatur einzuräumen.
Die Checkpoints sind während
der G1-Phase des Zyklus tätig,
so dass DNA repariert wird, bevor sie in der S-Phase repliziert
wird; und während
der G2-Phase, so dass DNA repariert wird, bevor Chromosomen in der
Mitosephase (M) segregiert werden.
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Die
erfindungsgemäßen Granulatimidverbindungen
bewirken die Hemmung des G2-Checkpoints.
Sie sind als Therapiereagenzien für die Behandlung von Krebs
usw. von Interesse. Durch die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen
werden Zellen vom G2-Checkpoint freigesetzt; und sie kann zur Apoptose der
behandelten Zellen führen.
Vorzugsweise sind die behandelten Zellen nicht in der Lage, den
G1-Checkpoint zu aktivieren. Viele Tumoren beim Menschen weisen
Mutationen im Protein p53 auf. Als Ergebnis sind sie nicht in der
Lage, den G1-Checkpoint zu aktivieren, können aber den G2-Checkpoint
weiterhin einsetzen. Das Hemmen des Checkpoints treibt Tumorzellen üblicherweise
zur Mitose, wodurch die Wirksamkeit zytotoxischer Mittel erhöht wird,
die durch DNA-Schädigung
wirken können,
beispielsweise Cisplatin, Bleomycin und Etoposid; sowie Strahlentherapie.
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Bei über 50 %
der Karzinome beim Menscheh kommt es zu einem Verlust der Funktion
von Protein p53. Zellen mit mutiertem p53 sind nicht in der Lage,
den G1-Checkpoint
als Reaktion auf DNA-Schädigung zu
aktivieren. Der G2-Checkpoint bietet jedoch (obwohl er üblicherweise
schwächer
als in normalen Zellen ist) weiterhin eine Möglichkeit, die DNA-Schädigung vor
der Zellteilung zu reparieren. Die Hemmung des G2-Checkpoints allein
hat im Allgemeinen keine große
Wirkung auf normale Zellen oder Tumorzellen, die die normale G1-Checkpoint-Wirkung
beibehalten. G2-Checkpoint-Inhibitoren, die in Kombination mit einem DNA-Schädigungsmittel
verwendet werden, erhöhen
die Abtötung
von Zellen, die den G1-Checkpoint nicht aktivieren können, signifikant.
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In
der gesamten vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "G2" oder "G2-Phase" die Phase des Zellzyklus
zwischen dem Ende der DNA-Synthese und dem Beginn der Mitose. Eine
Zelle in G2 weist einen Interphasen-Zellkern, wie durch Mikroskopie
bestimmt, sowie duplizierte DNA (üblicherweise durch Durchflusszytometrie
bestimmt) auf.
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G2-Checkpoint-Inhibitor:
In der gesamten vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "G2-Checkpoint-Inhibitor" eine Substanz, die
fähig ist,
das Anhalten der Zelle in der G2-Phase zu beenden, das durch DNA-Schädigung herbeigeführt wurde,
das Anhalten einer Zellen in der G2-Phase als Reaktion auf DNA-Schädigung zu
verhindern oder beides.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um das Abtöten von
Zellen mit G1-Checkpoint-Defizienz durch DNA-Schädigung zu erhöhen, umfassend
die Schritte der Verabreichung eines DNA-Schädigungsmittels an die Zellen,
wodurch DNA der Zellen geschädigt
wird, und der Verabreichung einer G2-Checkpoint-Inhibitorverbindung
an die Zellen, worin die G2-Inhibitor-Verbindung eine Verbindung
der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung
wie hierin beschrieben zur Herstellung eines Medika ments zum Hemmen
des G2-Checkpoints in einer Zelle. Vorzugsweise ist die Zielzelle
eine hyperproliferative Zelle. Die Erfindung umfasst weiters den Fall,
wo die hyperproliferative Zelle p53-negativ ist.
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In
der gesamten vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff "DNA-Schädigungsmittel" jede Substanz oder
Behandlung, die DNA-Schädigung
in einer Zelle herbeiführt,
darunter UV-Strahlung, γ-Strahlung,
Röntgenstrahlung,
Alkylierungsmittel, Antibiotika, die durch Bindung an DNA DNA-Schädigung herbeiführen, Inhibitoren
von Topoisomerasen sowie jede bei Chemotherapie eingesetzte Verbindung,
die wirkt, indem sie DNA-Schädigung
verursacht. Beispiele für
spezifische Verbindungen sind Cisplatin, VM-26 und Procarbazin.
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G2-Checkpoint-Inhibitor-Test:
Der hierin beschriebene G2-Checkpoint-Inhibitor-Test umfasst die
Behandlung von Zellen, z. B. Zellen, die mit einer hyperproliferativen
Störung
verbunden sind, darunter Krebszellen, mit einem DNA-Schädigungsmittel
unter Bedingungen, durch die das Anhalten der Zellen bei G2 herbeigeführt wird.
Eine auf G2-Checkpoint-Hemmwirkung zu testende Probe und ein Mittel,
das Zellen in der Mitose festhält,
werden auf die Zellen angewandt, woraufhin bestimmt wird, ob der
G2-Checkpoint überwunden
wird und die Zellen in Mitose eintreten. Das Beenden des Anhalten
der Zellen bei G2 oder die Verhinderung des Anhaltens bei G2, so
dass die Zellen zur Mitose gelangen, ist der Indikator für G2-Checkpoint-Hemmwirkung.
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Der
Test erfordert den Einsatz einer Zellkultur, in der die Zellen als
Reaktion auf DNA-Schädigung
nicht zum Anhalten am G1-Checkpoint fähig sind. Die Zellen können von
einer der zahlreichen Zelllinien stammen, von denen bekannt ist,
dass die Zellen nicht zum Anhalten bei G1 fähig sind. Derartige Zellen
umfassen Zellen, die p53-defizient sind, darunter Folgende: jede
Zelllinie mit einer natürlichen
Mutation oder Deletion im p53-Gen, die p53 inaktiv macht; jede Zelllinie,
die ein virales Onocogen exprimiert, das p53 stört; jede Zelllinie, die die
dominant-negative Mutante p53 exprimiert (manche mutanten p53-Proteine
hemmen das Protein der Wildform, wie die in den erfindungsgemäßen Beispielen
verwendeten p53--MCF-7-Zellen); und jede
primäre oder
gebildete Zelllinie die von 1553 "negativen transgenen" Tieren stammt. Spezifische Beispiele
für geeignete
Zellen sind die Folgenden: Zellen, in denen das Human-Papillomavirus-Typ-16-E6-Gen
enthalten ist, Zelllinien, die bezüglich p53-Funktion mutant sind,
darunter Burkitts Human-Lymphoma-Zelllinie CA46, und die Human-Dickdarmkarzinom-Zelllinie
HT-29 (CA46 und HT-29 sind von der American Type Culture Collection erhältlich).
Zelllinien mit einer genetischen Defizienz, die den G1-Checkpoint
auf andere Weise als durch die Störung von p53 stört, können bei
diesem Test ebenfalls eingesetzt werden.
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Sobald
eine Zelllinie gewählt
ist, die nicht zum Anhalten bei G1 fähig ist, werden die Bedingungen
zum Anhalten eines Großteils
der Zellen bei G2 als Reaktion auf ein DNA-Schädigungsmittel optimiert, indem
geeignete Kulturbedingungen, Inkubationszeit sowie Typ und Dosierung
des DNA-Schädigungsmittels
bestimmt werden. Vorzugsweise werden zumindest 50 % der Zellen in
einer Kultur als Reaktion auf das DNA-Schädigungsmittel bei G2 angehalten.
Die Maximierung des Anteils an Zellen in der Population, die bei
G2 angehalten werden, verringert das Hintergrundsignal.
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Sobald
die Bedingungen für
Anhalten bei G2 in der Zellkultur geschaffen worden sind, kann der
Test auf eine Von zwei Arten durchgeführt werden. Zunächst können die
Zellen bei G2 als Reaktion auf das DNA-Schädigungsmittel angehalten und
dann mit der Probe behandelt werden, um zu ermitteln, ob eine Beendigung
des Anhaltens bei G2 vorliegt, oder die Zellen können mit der Probe vor jenem
Zeitpunkt behandelt werden, wo zu erwarten wäre, dass der Großteil der
Zellen bei G2 angehalten ist, und zu bestimmen, ob das Anhalten
der Zellen bei G2 verhindert wurde.
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Das
Beenden des Anhaltens bei G2 oder Verhindern des Anhaltens bei G2
wird durch eine quantitative Bestimmung der Zellen ermittelt, die
zur Mitose fortschreiten. Die Testkultur wird mit einem Mittel behandelt, das
solche Zellen in der Mitose anhält.
Derartige Mittel sind Mikrotubulus-Depolymerisierungsmittel, die
die Zellen in Metaphase anhalten, wie z. B. Nocodazol. Das verhindert,
dass die Zellen aus der Mitose austreten und in den nächsten Zellzyklus
eintreten.
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Bei
dem Test erfolgt die Bestimmung der Zelllen, die zur Mitose fortschreiten,
unter Einsatz der bekannten immunologischen Verfahren, wobei Antikörper eingesetzt
werden, die Spezifität
für mitotische
Zellen aufweisen. Monoklonale Antikörper, die derartige Spezifität zeigen,
sind bekannt und umfassen MPM-2, das gegen mitotische HeLa-Zellen
gezüchtet
wurde und Phosphoepitope erkennt, die in mitototischen Proteinen aller
eukaryotischen Spezies in hohem Maße konserviert werden. Andere
Beispiele sind die monoklonalen Antikörper, die Phosphoepitope in
den gepaarten Helix-Filament-Proteinen (PHF) erkennen, die in Gehirngewebe von
Alzheimer-Patienten
zu finden sind, wie in folgenden Dokumenten beschrieben: der am
4. Juli 1996 unter der Nr.
WO
96/20218 veröffentlichten
internationalen PCT-Anmeldung und I. Vincent, et al., "Mitotic Mechanisms
in Alheimer's Disease?" The Journal of Cell
Biology, 132, 413-425 (1996). Bei den Beispielen in der vorliegenden
Beschreibung werden der in den letzteren zwei Dokumenten beschriebene
Antikörper
TG-3 eingesetzt, der vom Albert Einstein College of Medicine of
Yeshiva University, Bronx, New York, USA, erhalten wurde.
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TG-3
weist hohe Spezifität
für mitotische
Zellen auf. Wenn TG-3 im hierin beschriebenen ELISA-Test verwendet
wird, wird ein sehr gutes Signal/Rausch-Verhältnis erzielt, was es ermöglicht,
den ELISA-Test leicht durch optisches Absorptionsvermögen zu überwachen.
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Absterbende
Zellen weisen einige Eigenschaften auf, die jenen von mitotischen
Zellen ähnlich
sind. TG-3 reagiert mit absterbenden Zellen nicht, wodurch verhindert
wird, dass apoptotische Zellen im Test der vorliegenden Erfindung
gezählt
werden. Die Effizienz des Tests wird durch das Vorhandensein absterbender Zellen
nicht beeinträchtigt.
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Zu
den immunologischen Verfahren, die für die Bestimmung mitotischer
Zellen in diesem Test fähig sind,
gehören
alle Verfahren zum Bestimmen von Antikörper-Antigen-Bindung, darunter: Immunzytochemie
(z. B. Immunfluoreszenz), Durchflusszytometrie, Immunblotting und
ELISA. Mehrere immunologische Verfahren werden im Detail in den
Beispielen gemäß vorliegender
Erfindung sowie in I. Vincent, et al. [oben], beschrieben. Andere
immunoglogische Verfahren, die hierin nicht beschrieben werden,
sind nach dem Stand der Technik allgemein bekannt und können leicht
für den
Einsatz beim vorliegenden Test angepasst werden. Jedoch lässt sich
ein hoher Durchsatz beim Testen von Proben am besten unter Einsatz
von ELISA erreichen.
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VERFAHREN ZUM SYNTHETISIEREN
VON GRANULATIMIDVERBINDUNGEN
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung von
Verbindungen der Formel I bereit. Es können verschiedene Verfahren
eingesetzt werden, einschließlich
Synthesen, wie in den Beispielen bereitgestellt; Isolation aus natürlichen
Quellen; Kopplung von zwei Verbindungen, um ein Didemnimid zu erzeugen, gefolgt
von einem Zyklisierungsschritt; usw. Beispielsweise beginnt ein
Syntheseschema mit einer entsprechend geschützten Indolverbindung, wie
z. B. Indol-3-acetamid, und durchläuft im Wesentlichen zwei Kopplungsschritte,
um eine Verbindung vom Didemnimid-Typ zu erzeugen, gefolgt von einem
Zyklisierungsschritt. Das Verfahren kann gegebenenfalls einen oder
mehrere nachfolgende Schritte umfasst, um bestimmte Substituenten
bereitzustellen, die für
die Herstellung einer bestimmten Verbindung der Formel I erforderlich
sind.
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Ein
exemplarisches Syntheseverfahren ist das folgende, worin P
1, P
2 und P
3 geeignete Schutzgruppen sind. Die Ausgangs-Indolverbindung
(auf angemessene Weise durch R oder Z substituiert) kann nach Verfahren
hergestellt werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
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Ein
nachstehend dargelegtes alternatives Syntheseschema umfasst im Wesentlichen
einen einzigen Kopplungsschritt, um ein Didemnimid-Verbindung zu
erzeugen, gefolgt von Zyklisierung, um eine Verbindung der Formel
I herzustellen, worin F, F',
X und Y wie für
Formel I definiert sind und W wie für Formel I definiert, aber
bei (a) und nicht (b) an den Reaktanden gebunden ist:
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Das
oben beschriebene bevorzugte Syntheseschema wird für die Herstellung
von Granulatimid und Isogranulatimid (typischerweise in einem Verhältnis von
etwa 9:1 hergestellt) adaptiert; wie nachstehend beschrieben. Verbindung
8 kann wie im nachstehenden Beispiel 2 beschrieben hergestellt werden.
Bei dieser Ausführungsform
des bevorzugten Syntheseschemas sollte Kondensation von 8 mit dem
Indol-3- acetamid
(9) in Gegenwart von Molkularsieben durchgeführt werden, da anderntalls
durch Ersetzen der Phenylthiogruppe auf (10) durch eine Methoxylgruppierung
ein zweites Hauptprodukt entsteht.
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Alternativ
dazu können
Verbindungen der Formel I aus Granulatimid oder Isogranulatimid
hergestellt werden, die wie oben beschrieben synthetisiert oder
aus natürlichen
Quellen wie in den Beispielen beschrieben erhalten werden können. Das
nachstehende Schema beschreibt die Modifizierung von Granulatimid,
um Derivate mit unterschiedlichen X- und Y-Substituenten zu erzeugen.
Das Verhältnis
zwischen II und III wird durch die Wahl von Schutzgruppen P1 und P2 oder P3 bestimmt, die (bei spielsweise) Cbz, R oder
H sein können.
Eine Schutzgruppe wird bei beiden P2 oder
P3 verwendet, in Abhängigkeit von der Position der
Doppelbindung im Ring. Die Chemie wird in Link, et al., J. American
Chemical Society 118, 2825 (1996), auf S. 2832 beschrieben.
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Alle
Z- und R-Gruppen können
aromatischen Kohlenstoffen in W und Ar1 vor
dem Kopplungsschritt hinzugefügt
werden, um die Maleimid-Zwischenprodukte herzustellen. Alle R-,
RCO-, Ar2CO- und Ar2CH2-Gruppen können zu Stickstoffatomen unter
Einsatz von Base und eines geeigneten Alkylhalogenids (RX), Acylhalogenids
(RCOX), Anhydrids ((RCO)20) oder Benzylhalogenids
(Ar2CH2X) hinzugefügt werden.
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PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN
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Die
Verbindungen gemäß vorliegender
Erfindung können
in eine Vielzahl von Formulierungen zur therapeutischen Verabreichung
aufgenommen werden. Im Speziellen können die Verbindungen gemäß vorliegender
Erfindung zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden,
indem sie mit geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder
Verdünnern
kombiniert werden, und sie können
zu Präparaten
in fester, halbfester, flüssiger
oder gasförmiger
Form formuliert werden, wie z. B. Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulate,
Salben, Lösungen,
Zäpfchen,
Injektionen, Inhalationsmittel, Gele, Mikrokügelchen und Aerosole. In diesen
Formen kann die Verabreichung der Verbindung auf verschiedene Arten
erfolgen, einschließlich
oraler, bukkaler, rektaler, parenteraler, intraperitonealer, intradermaler,
transdermaler, intrachealer Verabreichung usw. Der Wirkbestandteil
kann nach der Verabreichung systemisch sein oder kann durch den
Einsatz regionaler Verabreichung, intramuraler Verabreichung oder
den Einsatz eines Implantats, das bewirkt, dass die wirksame Dosis
am Implantationsort verbleibt, lokal begrenzt sein.
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In
pharmazeutischen Dosierungsformen können die Verbindungen in Form
ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze verabreicht werden. Sie können auch
in entsprechender Verbindung mit anderen pharmazeutisch wirksamen
Verbindungen verwendet werden. Die nachstehenden Verfahren und Exzipienten
dienen lediglich als Beispiele und sind keineswegs einschränkend.
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Für orale
Präparate
können
die Verbindungen allein oder in Kombination mit geeigneten Additiven
verwendet werden, um Tabletten, Pulver, Granulate oder Kapseln herzustellen,
beispielsweise mit herkömmlichen Additiven,
wie Lactose, Mannit, Maisstärke
oder Kartoffelstärke;
mit Bindemitteln, wie kristalliner Cellulose, Cellulosederivaten,
Akazin, Maisstärke
oder Gelatinen; mit Desintegratoren, wie Maisstärke, Kartoffelstärke oder
Natriumcarboxymethylcellulose; mit Schmiermitteln, wie Talk oder
Magnesiumstearat; und, falls erwünscht,
mit Verdünnern,
Puffern, Befeuchtungsmitteln, Konservierungsmitteln und Geschmacksstoffen.
-
Die
Verbindungen können
zu Präparaten
für Injektibnen
formuliert werden, indem sie in einem wässrigen oder nicht wässrigen
Lösungsmittel,
wie Pflanzen- oder anderen ähnlichen Ölen, synthetischen
aliphatischen Säureglyceriden,
Estern höherer
aliphatischer Säuren
oder Propylenglykol gelöst,
suspendiert oder emulgiert werden; und falls erwünscht mit herkömmlichen
Additiven, wie Solubilisatoren, isotonischen Mitteln, Suspendierhilfen,
Emulgatoren, Stabilisatoren und Konservierungsmitteln.
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Die
Verbindungen können
in Aerosol-Formulierung zur Verabreichung durch Inhalation eingesetzt
werden. Die Verbindungen gemäß vorliegender
Erfindung können
in unter Druck stehende annehmbare Treibmittel, wie Dichlordiflurmethan,
Propan, Stickstoff und dergleichen formuliert werden.
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Weiters
können
die Verbindungen zu Zäpfchen
verarbeitet werden, indem sie mit einer Vielzahl von Basen, wie
emulgierenden Basen oder wasserlöslichen
Basen, gemischt werden. Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können als
Zäpfchen
rektal verabreicht werden. Die Zäpfchen
können
Vehikel, wie Kakaobutter, Carbowachse und Polyethylenglykole, umfassen,
die bei Körpertemperatur
schmelzen, aber bei Raumtemperatur fest sind.
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Es
können
Einheitsdosisformen für
die orale oder rektale Verabreichung, wie Sirupe, Elixiere und Suspensionen,
bereitgestellt werden, worin jede Dosierungseinheit, beispielsweise
Teelöffel,
Esslöffel,
Tablette oder Zäpfchen,
eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung enthält, die eine oder mehrere Verbindungen
gemäß vorliegender
Erfindung enthielt. Auf ähnliche
Weise können
Einheitsdosisformen zur Injektion oder intravenösen Verabreichung die Verbindung
gemäß vorliegender
Erfindung in einer Zusammensetzung als Lösung in sterilem Wasser, normaler
Kochsalzlösung
oder einem anderen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen.
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Implantate
für Retard-Formulierungen
sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Implantate sind als
Mikrokügelchen,
Slabs usw. mit biologisch abbaubaren oder biologisch nicht abbaubaren
Polymeren formuliert. Beispielsweise bilden Milchsäure- und/oder
Glycolsäure-Polymere
ein erodierbares Polymer, das vom Wirt gut vertragen wird. Das Granulatimidverbindungen
enthaltende Implantat wird in der Nähe der Tumorstelle angeordnet,
so dass die lokale Konzentration an Wirkbestandteil in Bezug auf
den Rest des Körpers
erhöht wird.
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Der
Begriff "Einheitsdosisform", wie hierin verwendet,
bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosen
für Menschen
und Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge
an Verbindungen gemäß vorliegender
Erfindung in einer ausreichenden Menge berechnet enthält, um in
Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünner, Träger oder
Vehikel die erwünschte
Wirkung zu erzielen. Die Spezifikationen für die neuen Einheitsdosisformen
gemäß vorliegender
Erfindung hängen
von der speziellen eingesetzten Verbindung und der zu erreichenden
Wirkung sowie von der Pharmakodynamik ab, die mit jeder Verbindung
im Wirt verbunden ist.
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Die
pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, wie Vehikel, Adjuvantien,
Träger
oder Verdünner,
sind allgemein leicht erhältlich.
Darüber
hinaus sind pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen, wie Mittel
zur pH-Einstellung und Puffer, die Tonizität einstellende Mittel, Stabilisatoren,
Benetzungsmittel und dergleichen, allgemein leicht erhältlich.
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Die
kombinierte Verwendung von Granulatimidverbindungen mit anderen
zytotoxischen Mitteln hat die Vorteile, dass die erforderliche Dosis
für das
einzelne Arzneimittel geringer und die Wirkung der verschiedenen Arzneimittel
komplementär
ist. Abhängig
vom Patienten und dem Zustand, der behandelt wird, sowie abhängig vom
Verabreichungsweg können
die Granulatimidverbindungen in Dosen von 0,1 μg bis 10 mg/kg Körpergewicht
pro Tag verabreicht werden. Die Bandbreite ist groß, da die
Effizienz einer therapeutischen Wirkung für verschiedene Säugetiere
im Allgemeinen stark variiert, wobei die Dosen beim Menschen typischerweise
20-, 30- oder sogar 40-mal kleiner (pro Einheit Körpergewicht)
sind als bei Ratten. Auf ähnliche
Weise kann die Art der Verabreichung eine große Wirkung auf die Dosis haben.
So können
beispielsweise orale Dosen bei der Rate das Zehnfache der Injektionsdosis
ausmachen. Für
lokale Verabreichungswege können
höhere
Dosen eingesetzt werden.
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Eine
typische Dosis kann eine Lösung
sein die für
intravenöse
Verabreichung geeignet ist; eine Tablette, die zwei- bis sechsmal
täglich
eingenommen wird, oder eine Einmal-Retard-Kapsel oder Tablette,
die einmal täglich
eingenommen wird und einen proportional höheren Gehalt an Wirkbestandteil
enthält,
usw. Die Retard-Wirkung kann durch Kapselmaterialien erzielt werden,
die sich bei unterschiedlichen pH-Werten lösen, durch Kapseln, die langsam
durch osmotischen Druck freisetzen, oder durch ein anderes bekanntes
Mittel zur gesteuerten Freisetzung.
-
Fachleute
auf dem Gebiet der Erfindung werden feststellen, dass die Dosishöhen in Abhängigkeit
von der spezifischen Verbindung, der Schwere der Symptome und der
Anfälligkeit
des Probanden für
Nebenwirkungen variieren können.
Einige der spezifischen Verbindungen sind stärker als andere. Bevorzugte
Dosen für eine
bestimmte Verbindung können
von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung auf verschiedene Arten leicht
bestimmt werden. Ein bevorzugtes Mittel besteht darin, die physiologische
Stärke
einer bestimmten Verbindung zu messen.
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Zur
Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren
können
die Granulatimidverbindungen mit anderen pharmazeutisch wirksamen
Mitteln, insbesondere anderen anti-metastatischen, Anti-Tumor- oder
anti-angiogenen Mitteln formuliert werden. Angiostatische Verbindungen
von Interesse sind Angiostatin, Endostatin, Carboxyterminale Peptide
von Collagen-α (XV)
usw. Zytotoxische und zytostatische Mittel von Interesse sind Adriamycin,
Alkeran, Ara-C, BICNU, Busulfan, CNNU, Cisplatin, Cytoxan, Daunorubicin,
DTIC, 5-FU, Hydroxyharnstoff, Ifosfamid, Methotrexat, Mithramycin,
Mitomycin, Mitoxantron, Stickstoffsenf, Velban, Vincristin, Vinblastin,
VP-16, Carboplatin, Fludarabin, Gemcitabin, Idarubicin, Irinotecan,
Leustatin, Navelbin, Taxol, Taxoter, Topotecan usw.
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EINSATZMETHODEN
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Die
vorliegenden Granulatimidverbindungen werden einem Probanden verabreicht,
bei dem unerwünschte
Kinase-Aktivität
oder daraus resultierende Zustände
vorlie gen. Die Verbindungen können
einem Probänden
auch verabreicht werden, um den G2-Checkpoint zu hemmen, insbesondere
in Verbindung mit der Behandlung von Krebszellen, im Spezielleren
in Kombination mit zytotoxischer Therapie, die auf die Krebszellen
gerichtet ist; z. B. Strahlungsbehandlung, chemotherapeutische Arzneimittel
usw.
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Der
Wirt oder Patient kann jeder Säugetierspezies
angehören,
beispielsweise Primatenspezies, insbesondere Mensch; Nagetiere,
darunter Mäuse,
Ratten und Hamster; Kaninchen; Pferde, Rinder, Hunde, Katzen; usw.
Tiermodelle sind für
experimentelle Untersuchungen von Interesse und liefern ein Modell
für die
Behandlung von Krankheiten beim Menschen.
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Tumoren,
von denen bekannt ist, dass sie für DNA-schädigende Mittel anfällig sind,
umfassen Karzinome, z. B. Dickdarm-, Prostata-, Brust-, Ductal-,
Endometrial-, Magenkarzinom, dysplastische Mundschleimhaut, invasiver
Mundkrebs, nicht kleinzelliges Lungenkarzinom, transitionale und
squamöse
Zelle, Harnleiterkarzinom usw.; neurologische Malignitäten, beispielsweise
Neuroblastom, Gliom usw.; hämatologische
Malignitäten,
beispielsweise akute Leukämie
im Kindesalter, Nicht-Hodgkin-Lymphome,
chronische lymphozytische Leukämie,
maligne kutane T-Zellen, Mycosis fungoides, Nicht-MF-kutanes T-Zellen-Lymphom,
Lymphomatoid-Papulosis, T-Zellen-reiche
kutane Lymphoid-Hyperplasie, bullöses Pemphigoid, Lupus erythematodes
chronicus discoides, Lichen planus usw.; und dergleichen.
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Eine
kombinierte Therapie aus Granulatimidverbindungen und zytotoxischen
Mitteln wird einem Wirt verabreicht, der an einem anfälligen Tumor
leidet. Die Verabreichung kann in Abhängigkeit von der spezifischen
Erkrankung topisch, lokal oder systemisch erfolgen. Die Verbindungen
werden in einer kombinierten wirksamen Dosis verabreicht, die über einen
geeigneten Zeitraum die Tumorzellenlast wesentlich verringert, während alle
Nebenwirkungen minimiert werden, wobei üblicherweise zumindest etwa
25 % der vorhandenen Tumorzellen abgetötet werden, häufiger zumindest
etwa 50 % und gegebenenfalls bis zu etwa 90 % oder mehr der vorhandenen
Tumorzellen. Es ist daran gedacht, die Zusammensetzung für einen
Einsatz in vivo zu erhalten und unter Leitung eines Arztes zu verwendert.
Um die synergistische Wirkung einer kombinierten Therapie bereitzustellen,
können
die Wirkbestandteile gemeinsam oder getrennt und gleichzeitig oder
zu unterschiedlichen Zeitpunkten innerhalb eines Tages abgegeben
werden.
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Die
Anfälligkeit
einer bestimmten Tumorzelle für
Abtöten
mit der kombinierten Therapie kann durch Tests in vitro bestimmt
werden. Typischerweise wird eine Kultur der Tumorzelle mit einer
Kombination aus einer zytotoxischen Verbindung und einer Granulatimidverbindung
in variierenden Konzentrationen für eine ausreichende Zeitspanne
kombiniert, um es zu ermöglichen,
dass die Wirkbestandteile Zelltod herbeiführen, üblicherweise zwischen etwa
einer Stunde und einer Woche. Für
Tests in vitro können
kultivierte Zellen von einer Biopsieprobe des Tumors verwendet werden.
Die nach der Behandlung zurückbleibenden
lebensfähigen
Zellen werden dann gezählt.
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Die
Dosis variiert in Abhängigkeit
vom spezifischen verwendeten zytotoxischen Mittel, dem Tumortyp, dem
Patientenstatus usw. bei einer Dosis, die ausreicht, um die Tumorzellenpopulation
wesentlich abzutragen, während
die Lebensfähigkeit
des Patienten erhalten bleibt. In manchen Fällen kann Therapie mit Stammzellen-Ersatz-Therapie kombiniert
werden, um die hämatopoetische
Funktion des Patienten wiederherzustellen. Die Behandlung wird im
Allgemeinen fortgesetzt, bis es eine beträchtlich Reduktion, beispielsweise
etwa 50 % Verringerung der Tumorbelastung, gibt, und kann fortgesetzt
werden, bis im Körper
im Wesentlichen keine Tumorzellen vorhanden sind.
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Alle
oben und im gesamten Text erörterten
Publikationen sind nur aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Einreichdatum
der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt. Keine Äußerung in
der vorliegenden Beschreibung ist so aufzufassen, dass die Erfinder
dadurch auf das Rechtsmittel der Vordatierung dieser Offenbarung
aufgrund früherer
Erfindung verzichten.
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Die
folgenden Beispiele sind angeführt,
um Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung eine vollständige Offenbarung
und Beschreibung dessen zu geben, wie die vorliegende Erfindung
herzustellen und zu verwenden ist. Es sind Bemühungen unternommen worden,
Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Zahlenangaben (z. B. Mengen,
Temperatur, Konzentrationen usw.) zu gewährleisten, aber einige Versuchsfehler
und -abweichungen sind einzuräumen.
Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist
das mittlere Molekulargewicht, und die Temperatur ist in Grad Celsius
angegeben; und der Druck liegt am oder nahe dem Atmosphärendruck.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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G2-Checkpoint-Inhibitionstest
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MCF-7-mp53-Zellen
(mutiert in Bezug auf p53) wurden als Monolagen bei 37 °C in feuchtem
5 % CO2 in DMEM kultiviert, das mit 10 %
Rinderfötenserum,
2 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat,
nichtessentiellen MEM-Aminosäuren,
1 μg/ml
Rinderinsulin, 1 μg/ml
Hydrocortison, 1 ng/ml Human-Epidermiswachstumsfaktor und 1 ng/ml β-Östradiol
ergänzt
war. Die Zellen wurden in einer Menge von 10.000 Zellen pro Napf
von 96 Napf-Polystyrol-Gewebekulturplatten
(Falcon) in 100 μl Medium
gesät.
Die Zellen wurden 24 h lang wachsen gelassen und dann unter Einsatz
einer 60Co-Quelle (Gammacell 200TM, Atomic Energy Commission of Canada),
die γ-Strahlen
in einer Dosisrate von 1,4 Gy/min abgab, mit 6,5 Gy bestrahlt.
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Extrakte
von Meeresorganismen mit etwa 10 μg/ml
(aus 1000-facher Stammkultur in DMSO) und 100 ng/ml Nocodazol (Sigma,
aus 1000facher Stammkultur in DMSO) wurden 16 h nach der Bestrahlung
zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 8 h inkubiert. 2
mM Coffein (Sigma, aus einer 100 mM-Lösung in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung)
wurde als positive Kontrolle eingesetzt.
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Nach
der Arzneimittelbehandlung wurde das Zellkulturmedium entfernt,
und die Zellen wurden lysiert, indem 100 μl eiskalter Lysepuffer (1 mM
EGTA pH 7,4, 0,2 mM PMSF) zugegeben und zehnmal hinauf und hinunter
pipettiert wurde. Die Zelllysate wurden auf 96-Napf-PolySorpTM-Platten (Nunc) übertragen und vollständig getrocknet,
indem mit einem Haartrockner, der etwa 3 Fuß über den Platten angeordnet
war, etwa 37 °C
warme Luft darauf geblasen wurde. Proteinbindungsstellen wurden
blockiert, indem für
1 h bei Raumtemperatur 200 μl
pro Napf an Antikörperpuffer
(10 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1 mM PMSF, 3 % (Gew./Vol.)
getrocknete Magermilch (Carnation)) zugegeben wurden. Dieser wurde
entfernt und durch 100 μl Antikörperpuffer
ersetzt, der 0,1-0,15 μg/ml
monoklonalen TG-3-Antikörper
und Meerrettich-Peroxidase-markierten Ziegen-anti-Maus-IgM (Southern
Biotechnology Associates) in einer Verdünnung von 1:500 enthielt.
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Nach
Inkubation bei 4 °C über Nacht
wurde die Antikörperlösung entfernt,
und die Näpfe
wurden dreimal mit 200 μl
10 mM Tris HCl pH 7,4, 0,02 % Tween 20TM,
100 μl 120
mM Na2HPO4, 100
mM Zitronensäure, pH
4,0, gespült,
das 0,5 mg/ml 2,2'-Azinobis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonsäure) enthielt,
und 0,01 % Wasserstoffperoxid wurde für 1 h bei Raumtemperatur zugegeben,
und die Platten wurden unter Einsatz eines BioTekTM-Plattenleser
bei 405 nm abgelesen. Positive Kontrollen, die mit 2 mM Coffein
behandelt wurden, ergaben ein abgelesenes Absorptionsvermögen von
etwa 1,0.
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G2-Checkpoint-Hemmung
wurde in Extrakten von der Aszidie Didemnum granulatum (Subphylum Orochordate,
Klasse Ascidiacea) nachgewiesen, die in felsigen, seichten Meereshabitaten
entlang der Küste im
Süden Brasiliens
gefunden wurde.
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Sammlung und Extraktion von D. Granulatum
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Didemnum
granulatum (85 g Nassgewicht) wurde im Sommer 1995 in Tiefen von
1 m an der Felsenküste
von Araca Beach, Sao Sebastian (Bundesstaat Sao Paulo im Südosten Brasiliens)
entnommen. Eine zweite Entnahme erfolge am Arquipelago do Arvoredo
(Bundesstaat Santa Catarina im Süden
Brasiliens, 150 g Nassgewicht) und im Sao Sebastian-Kanal (Bundesstaat
Sao Paulo, 180 g Nassgewicht) im November 1997. Frisch entnommene
Tiere wurden in Ethanol bei -20 °C
gelagert. Bei den verschiedenen Entnahmen erhaltene Tiere wurden
getrennt wie folgt behandelt: nach Ethanol-Dekantierung wurde das
Tier gemixt und dreimal mit Methanol extrahiert. Die Ethanol- und
Methanol-Extrakte wurden vereinigt, filtriert und im Vakuum abgedampft, was
einen gummiartigen Rückstand
ergab. Die Hauptmenge des Rückstands
wurde in MeOH-CH2Cl2 im
Verhältnis
8:2 gelöst
und filtriert, um anorganische Salze zu beseitigen, während kleine
Mengen des Rückstands in
DMSO gelöst
wurden, um sie beim oben beschriebenen G2-Checkpoint-Inhibitionstest
zu verwenden.
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Isolierung aktiver Verbindungen
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Methanol-Extrakte
von der brasilianischen Aszidie D. granulatum wurden durch Gelfiltration
auf Sephadex LH-20 (Eluens: MeOH) fraktioniert, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC
(Eluens: Acetonitril/0,05 % Trifluoressigsäure (1:1)), was eine Reihe
von 8 Fraktionen ergab, die nach DC unterschiedliche Bestandteile
aufwiesen. Nur eine Fraktion wies G2-Checkpoint-Hemmwirkung auf,
was die neuen Alkaloidverbindungen ergab, die später als Isogranulatimid und
Granulatimid bezeichnet wurden. Andere Fraktionen enthielten verschiedene Formen
des Alkaloids Didemnimid, die inaktiv waren. Didemnimid A und D
wurden identifiziert, indem NMR- und MS-Daten mit Werten aus der
Literatur (H.C. Vervoort, et al. [oben]) verglichen wurden.
-
NMR-Versuche
unter Einsatz einer Verbindung, die von der aktiven Fraktion isoliert
wurde, identifizierten eine disubstituierte Imidazol-Gruppierung.
Die Verbindung unterschied sich von Didemnimid A durch den Verlust
von zwei Wasserstoffatomen.
-
Das
führte
zu der Schlussfolgerung, dass die neue Verbindung eine Bindung zwischen
C-2 des Indols und Ether-C-14 oder -N-17 des Imidazolfragments von
Didemnimid A aufwies. Das Vorliegen eines anisotropen Effekts in
der neuen Verbindung und nicht in Didemnimid A wies auf einen starren
planaren Heterozyklus hin, anders als bei Didemnimid A, wo die Indol-
und Maleimid-Ringe in Bezug aufeinander entlang der C-3-zu-C-8-Bindung
verdreht waren. Für
den heterozyklischen aromatischen Kern der neuen Verbindung gibt es
in natürlichen
Verbindungen keine Entsprechung.
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Charakterisierung von Isogranulatimid
und Granulatimid
-
NMR-Daten
wurden auf Bruker-WH-400-(1H-NMR, COSY und
NOE), -AM-400-(13C NMR) und -AMX-500-(HMBC
und HMQC) Spektrometern erhalten. Protonenspektren wurden unter
Einsatz des internen Restsignals von DMSO-d5(δ 2,49) referenziert,
und Kohlenstoffspektren wurden auf die DMSO-Methyl-Resonanz (δ 39,5) referenziert.
FABMS-Daten wurden auf einem Kratos-Konzept-IIHQ-Hybrid-Massenspektrometer
mit Cäsiumion-Sekundärionisierung
und Magnetsektor-Masseanalyzer erhalten. Proben wurden in einer MeOH-Thioglycerin-Matrix
gelöst,
und Spektren wurden unter Einsatz einer Quellenspannung von 8 kV
und einer Cäsium-Sputterkanonen-Spannung
von 12 kV erhalten. Infrarot-Spektren wurden auf einem Perkin-Elmer-1710-Spektrometer
aufgezeichnet und UV-Spektren auf einem Spektralphotometer.
-
Eine
Verbindung (später
als Isogranulatimid bezeichnet) wurde von aktiver Fraktion als roter
amorpher Feststoff isoliert (UV (λmaxnm(ε))
210 (10.200), 231 (10.600) 280 (6.550), 470 (1.870)), der ein [M
+ H]+-Ion bei m/z 277.0730 im HRFABMS ergab,
das für
eine Molekülformel
C15H8N4O2 angemessen war (ber. Masse für C15H8N4O2: 277,0714). Eine NH-Protonenresonanz bei δ 11,11 zeigte
HMBC-Korrelationen zu Carbonyl-Resonanzen bei δ 169,8 und 168,8 und aromatische
Kohlenstoff-Resonanzen bei δ 126,39
und 112,22, was das Vorhandensein einer Maleimidsubstruktur bestätigt. Das
COSY-Spektrum identifizierte ein Vier-Protonen-Spinsystem (δ 8,51, d,
J = 7 Hz (H-4)); 7,43, dd, J = 7,7 Hz (H-6); 7,35, dd, J = 7,7 Hz
(H-5); 7,67 d, J = 7 (H-7), das den H-4- bis H-7-Protonen eines
Indolrests zugeordnet werden kann. Bestrahlung einer breiten Protonen-Resonanz
bei δ 13,48
induziert einen NOE nur im aromatischen Dublett bei δ 7,68, was
das Dublett H-7 und die breite Protonen-Resonanz dem Indol-NH zuordnet. Das
Fehlen einer Resonanz im 1H-NMR-Spektrum der Verbindung,
die den Indol-H-2- oder -H-3-Protonen zugeordnet werden kann, wies
auf das Vorhandensein von Substituenten bei C-2 und C-3 hin.
-
Sehr
breite Resonanzen bei δ 8,10
und δ 9,12
im 1H-NMR-Spektrum wurden der Imidazol-Gruppierung
zugeordnet. Die Breite der Imidazol-Resonanzen wurde auf Tautomerie
der NH-Protonen zurückgeführt. Die
große
chemische Verlagerung, die für
die H-4-Resonanz (δ 8,51)
in der neuen Verbindung beobachtet wurde, in Bezug auf die chemische
Verlagerung, die für
die H-4-Resonanz in Didemnimid A (δ 7,07) beobachtet wurde, wurde
einem Nachbargruppen-Effekt von einem C-9-Maleimidcarbonyl zugeschrieben.
-
Wie
oben beschrieben, wurde vorhergesagt, dass die neue Verbindung ein
polyzyklischer Aromat ist, das sich vom Didemnimid A durch das Vorhandensein
einer Bindung zwischen dem C-2-Kohlenstoff des Indolfragments und
entweder C-14 oder N-17
des Imidazolfragments unterscheidet. Im ersteren Fall wäre die Verbindung
Granulatimid wie hierin beschrieben und im letzteren Fall Isogranulatimid.
Die Breite der Imidazol-Resonanzen im NMR-Spektrum machte ursprünglich NMR
zum Unterscheiden der zwei Verbindungen erfolglos. Daher wurden
sowohl Granulatimid als auch Isogranulatimid wie hierin beschrieben
synthetisiert und mit der Verbindung verglichen, die von der natürlichen
Quelle stammte, was zeigte, dass die Verbindung Isogranulatimid
war. DC-Analyse (CH2Cl2-MeOH
9:1, UV bei 254 nm) gepoolter aktiver Fraktionen vom natürlichen
Extrakt unter Verwendung von synthetischem Granulatimid als Bezug
zeigte das Vorhandensein der letzteren Verbindung in einer Menge,
die wesentlich geringer als jene von Isogranulatimid war. Es wurde
jedoch ermittelt, dass das synthetische Granulatimid in den meisten üblichen
organischen Lösungsmitteln,
einschließlich
Ethanol und Methanol, sehr unlöslich
ist, und daher im oben beschriebenen Verfahren nicht effizient aus der
natürlichen
Quelle extrahiert wurde.
-
Granulatimid
ist in DMF oder DMSO löslich,
und eines der letzteren Lösungsmittel
wird für
die Extraktion von Granulatimid aus der natürlichen Quelle empfohlen.
-
Tabelle
1 liefert Vergleichs-
1H-NMR-Daten, die unter
Einsatz synthetischer Verbindungen, wie in DMSO-d
6 aufgezeichnet,
ermittelt wurden. Tabelle 1
Atom
Nr. | Granulatimid
(4) | Isogranuletimid
(5) |
1 | 12.58,
bs | 13.48,
bs |
2 | – | – |
4 | 8.89,
d, J = 7 Hz | 8.51,
d, J = 7 Hz |
5 | 7.30,
dd, J = 7,7 Hz | 7.35,
dd, J = 7,7 Hz |
6 | 7.48,
dd, J = 7,7 Hz | 7.43,
dd, J = 7,7 Hz |
7 | 7.61,
d, J = 7 Hz | 7.67,
d, J = 7 Hz |
10 | 10.96,
s | 11.11,
bs |
14 | – | 8.10,
b |
16 | 8.50,
s | 9.12,
b |
17 | 13.57,
s | – |
18 | – | – |
-
Aktivität von Isogranulatimid und Granulatimid
-
Isogranulatimid
weist die Hälfte
der maximalen G2-Checkpoint-hemmung (IC50)
bei 1,8±0,2 μM auf (1A). (Didemnimid A weist bei einer Konzentration
von 0,1-30 μM
keine Wirkung auf.) Isogranulatimid weist schwache Zytotoxizität auf, mit
einem IC50 von 40±4 μM (1B, Kurve
0 Gy), deutlich über
dem IC50 für Checkpoint-Hemmung.
-
Es
ist zu erwarten, dass G2-Checkpoint-Inhibitoren und DNA schädigende
Mittel p53--Zellen synergistisch abtöten. Wenn
derartige Zellen für
16 h 2, 4 oder 6 Gy γ-Strahlung und unterschiedlichen
Konzentrationen an Isogranulatimid ausgesetzt wurden, starben die
Zellen in einer höheren
Zahl ab als die Summe einer jeden Behandlung allein ausmacht (1B), was zeigt, das γ-Strahlung und Isogranulatimid
Synergiewirkung haben.
-
Der
IC50 für
Zytotoxizität
von Isogranulatimid wurde um das Fünffache verringert, wenn Zellen
mit 6 Gy bestrahlt wurden (1B). Im
Vergleich dazu weist Coffein, der am häufigsten verwendete G2-Checkpoint-Inhibitor,
einen IC50 von 1 mM für G2-Checkpoint-Hemmung auf, hat alleine
sehr geringe Zytotoxizität
und verfügt ebenfalls über Synergiewirkung
mit γ-Strahlung.
-
Bestrahlung
mit Isogranulatimid-Behandlung tötet
p53+-Zellen nicht synergistisch ab, wie
in 1C gezeigt. Daher tötet das Isogranulatimid bevorzugt
bestrahlte p53--Zellen gegenüber bestrahlten p53+-Zellen ab, was darauf hinweist, dass es
bevorzugt p53--Tumoren bei mit DNA-Schädigungstherapie
behandelten Menschen abtöten
würde.
-
Wie
in 2 gezeigt, kann Granulatimid im Vergleich zu Isogranulatimid
als G2-Checkpoint-Inhibitor (IC50 = 1,3 μm)
wirksamer sein.
-
Beispiel 2
-
Synthese von Isogranulatimid und Granulatimid
-
In
all diesen Beispielen wurde DC durchgeführt, indem handelsübliche Silikagel-60-Platten mit Aluminium-Rückwand eingesetzt
wurden. Flash-Chromatographie wurde mit Silikagel mit einer Maschenzahl
von 230-400 (E. Merck) durchgeführt.
THF wurde über
Natrium/Benzophenon destilliert, und CH2Cl2 wurde über CaH2 destilliert. Handelsübliches EtOH (Reagens-Reinheit)
und MeCN (HPLC-Reinheit) wurden oh ne weitere Reinigung eingesetzt.
Molekularsiebe wurden 5 Stunden vor der Verwendung unter Vakuum
bei Erwärmung getrocknet.
Alle Reaktionen wurden unter einer trockenen Argonatmosphäre unter
Einsatz von Glasgeräten durchgeführt, die
gründlich
flammengetrocknet worden waren.
-
Methyl-2-(1-methoxymethyl-2-phenylthioimidazol-5-yl)glyoxylat
(8)
-
Einer
kalten (-78 °C)
gerührten
Lösung
von 1-Methoxymethyl-2-phenylthioimidazol (S. Otha, et al., Chem.
Pharm. Bull. 40, 2681 (1992)) (340 mg, 1,55 mmol) in trockenem THF
(8,0 ml) wurde eine Lösung
von n-BuLi (1,47 M in Hexan, 1,26 ml, 1,85 mmol) zugegeben, und
das Gemisch wurde 1 h lang gerührt.
Eine Lösung
von Dimethyloxalat (540 mg, 4,58 mmol) in trockenem THF (2,0 ml)
wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei -78 °C weitere 1,25 h lang gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem
wässrigem
NH4Cl (5,0 ml) und Et2O
(20 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase
wurde mit Et2O (25 ml) extrahiert. Die vereinigten
organischen Extrakte wurden gewaschen (Kochsalzlösung, 10 ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie (35
g Silikagel; 1:1 Petrolether-Et2O) des Rohmaterials
ergaben 305 mg (66 %) von Verbindung 8 als beigen Feststoff mit
einem Schmelzpunkt von 59 bis 60 °C.
IR
(KBr) 1729, 1657, 1305, 1273, 1167, 1114, 784 cm-1; 1H NMR (CDCl3, 400
MHz) δ 8.23
(s, 1H), 7.52-7.54 (m. 2H), 7.37-7.38 (m, 3H), 5,81 (s, 2H); 3.91
(s, 3H), 3.36 (s, 3H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172.2, 161.6, 154.1, 145.4,
145.3, 133.2, 129.5, 129.2, 128.7, 75.8, 56.5, 53.0;
HREIMS – ber. für C14H14N2O4S: 306,0674, gef.: 306,0674.
-
3-[4-(1-Methoxymethyl-1H-2-phenylthioimidazol-5-yl)-2,
5-dioxo-2, 5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol
(10)
-
Einer
gerührten
Lösung
von t-BuOK (150 mg, 1,34 mmol) in DMF (3,0 ml) bei Raumtemperatur
wurden nacheinander Molekularsieb mit 4 A (-500 mg) und eine Lösung von
Verbindung 8 (167 mg, 0,54 mmol) und Indol-3-acetamid (9) (114 mg,
0,66 mmol) in DMF (4,0 ml) zugegeben, das Reaktionsgemisch wurde
auf 45 °C erwärmt und
12 h lang gerührt.
Die tief purpurfarbene Lösung
wurde mit Salzsäure
(1N, 3,0 ml) und EtOAc (30 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt,
und die wässrige
Phase wurde mit EtOAc (2 × 10
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen
(Kochsalzlösung,
4 × 10
ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie
(12 g Silikagel; 30:1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergaben 208 mg (90 %) von Verbindung 10 als orangen
Feststoff mit einem Schmelzpunkt von 243 °C;
IR(KBr) 3400-2600, 1765,
1708, 1537, 1341, 741 cm-1; 1H
NMR (400 MHz) δ 12.11
(br s, 1H), 11.25 (br s, 1H), 8.14 (s, 1H) 7.46 (d, 1H, J = 7.9
Hz), 7.18-7.33 (m, 6H), 7.14 (schlecht aufgelöstes dd, 1H), 6.77 (schlecht
aufgelöstes
dd, 1H), 6.51 (d, 1H, J = 8.0), 500 (s, 2H), 2.97 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.7, 171.6, 140.3, 136.7,
135.3, 133.8, 133.5, 132.5, 129.5, 128.4, 127.2, 125.7, 124.3, 122.7,
120.8, 120.2, 117.4, 112.6, 104.6, 75.8, 55.9;
HREIMS – ber. für C23H18N4O3S: 430,1099, gef.: 430,1099.
-
3-[4-(3-Methoxymethyl-3H-imidazol-4-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihyro-1H-pyrrol-3-yl]indol
(11)
-
Einer
rückflusssiedenden
Lösung
von Verbindung 10 (52 mg, 0,12 mmol) in EtOH (5,0 ml) wurde Raney-Nickel
(W-2, ~150 mg) zugegeben, und die Suspension für 1 h lang rückflusserhitzt.
Eine zusätzliche
Menge Raney-Nickel (W-2, ~100 mg) wurde zugegeben, und das Gemisch
wurde für
weitere 3 h rückflusserhitzt. Das
Reaktionsgemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt und
durch Celit filtriert. Der Celit wurde mit CH2Cl2-MeOH (1:1, 75 ml) gewaschen, und das vereinigte
Filtrat wurde eingeengt. Flash-Chromatographie (14 g Silikagel,
20:1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergab 33 mg (85 %) von Verbindung 11 als orangen
Feststoff: Schmelzpunkt > 235 °C (Zers.);
IR
(KBr) 3400-2600, 1765, 1703, 1537, 1440, 1342, 1113, cm-1; 1H NMR (400 MHz) δ 10.89 (br s, 1H), 10.03 (br
s, 1H), 8,07 (s, 1H), 7.94 (S, 1H), 7.44 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.09
(schlecht aufgelöstes
dd, 1H), 7.0 (s, 1H), 6.79 (schlecht aufgelöstes dd, 1H), 6.46 (d, 1H,
J = 8.0 Hz), 5.02 (s, 2H), 3.07 (s, 3H); 13C
NMR (100 MHz) δ 171.8,
171.7, 140.5, 136.5, 134.3, 132.9, 131.8, 124.3, 122.4, 121.7, 120.5,
120.3, 118.4, 112.3, 104.7, 76.4, 55.6;
HREIMS – ber. für C17H14N4O3: 322,1066, gef.: 322,1066.
-
Synthese von Didemnimid A (1)
-
Einer
gerührten
Suspension von Verbindung 11(67,4 mg, 0,209 mmol) in CH2Cl2 (15,0 ml) bei Raumtemperaturwurde eine
Lösung
von BBr3 in CH2Cl2 (1,0 M, 2,1 ml, 2,1 mmol) zugegeben, und
die tiefblaue Lösung
wurde 5 h lang gerührt.
Das Gemisch wurde mit gesättigtem
wässrigem
NaHCO3 (10 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt
und wurde dann 0,25 h lang gerührt.
Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc
(2 × 15
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden gewaschen
(Kochsalzlösung, 10
ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie
(10 g Silikagel, 15:1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergab 15,8 mg von wiedergewonnener Verbindung 11
sowie 45,0 mg (77 %, 100 % bezogen auf das wiedergewonnene Ausgangsmaterial)
Verbindung 1 als orangen Feststoff. 1H-NMR
(400 MHz, Haupt-Tautomer)
δ 12.45
(br s, 1H), 11.66 (br s, 1H), 10,87 (br s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.71
(br s, 1H), 7.68 (br s, 1H), 7.39 (br d, 1H, J = 7.8 Hz), 7.07 (br
m, 2H), 6.87 (br m, 1H); 13C NMR (100 MHz) δ 172.8, 172.6,
136.1, 135.9, 130.9, 130.5, 126.0, 126.0, 121.7, 121.3, 119.7, 119.2,
112.2, 111.5, 105.0;
HREIMS – ber. für C15H10N4O2:
278,0804, gef.: 278,0804.
-
Granulatimid (4) und Isogranulatimid (5)
-
Einer
Lösung
von 1 (12,9 mg, 0,046 mmol) in MeCN (5,0 ml) wurde eine katalytische
Menge Palladium/Aktivkohle (10 % Pd) zugegeben, und das resultierende
Gemisch wurde 0,5 h lang mit Argon gespült. Das Gemisch wurde 6,5 h
lang bestrahlt (450-Watt-Hanovia-Mitteldruck-Quecksilberdampflampe,
Quarzreaktionsgefäß). Das
Reaktionsgemisch wurde durch Celit filtriert, der Celit wurde mit
DMF (10 ml) gewaschen, und das vereinigte Filtrat wurde eingeengt.
Das verbleibende Material wurde in EtOAc (30 ml) aufgenommen, und
die resultierende Lösung
wurde gewaschen (Kochsalzlösung,
4 × 20
ml), getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatographie
(20 g Silikagel, 10:1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergab 11,7 mg (91 %) an Verbindung 4 als gelben
Feststoff und 1,0 mg (8 %) an Verbindung 5 als roten Feststoff.
Abschließende
Reinigung erfolgte auf RPHPLC (1:1 CH3CN-0,05
% TFA).
-
Granulatimid
(4): 1H-NMR (400 MHz) siehe Tabelle 1; UV
(MeOH) 230, 270, 285, 295 und 380 nm; HREIMS – ber. für C15H8N4O2:
276,0647, gef.: 276,0652. Isogranulatimid (5): siehe oben und Tabelle
1.
-
Beispiel 3
-
Alternative Synthesen von Isogranulatimid
(5):
-
Verfahren
A: Einer gerührten
Lösung
von Didemnimid A (1) (32,6 mg, 0,117 mmol) in 2-Butanon (7,0 ml)
bei Raumtemperatur wurden nacheinander Molekularsieb mit 4 A (-100
mg) und CuCl2 (79 mg, 0,59 mmol) zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde 15 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die
dunkelpurpurfarbene Lösung
wurde mit 10 %iger NaOH-Lösung
behandelt, bis der pH neutral war, und mit EtOAc (30 ml) verdünnt. Die
Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc
extrahiert (5 × 10
ml). Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (10
ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt. Flash-Chromatograpie
(15 g Silikagel, 15:1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergab 19,5 mg (60 %) des wiedergewonnenen Didemnamid
A sowie 12,3 mg (38 %, 95 % bezogen auf wiedergewonnenes Ausgangsmaterial)
Isogranulatimid (5) als purpurfarbenen Feststoff.
-
Verfahren
B: Eine gerührte
Lösung
von Didemnimid A (1) (14,7 mg, 0,053 mmol) in DMSO (5,0 ml) wurde
1 h lang auf 160 °C
erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit
EtOAc (30 ml) verdünnt,
mit Kochsalzlösung
(3 × 10
ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt.
Flash-Chromatographie (25 g Silikagel, 10:1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 12,4 mg (85
%) Isogranulatimid (5) als purpurfarbenen Feststoff;
IR (KBr)
2732, 1758, 1719, 1586, 1568, 1368, 1234, 1109, 744 cm-1; 1H NMR (400 MHz) δ 13.39 (bs, 1H), 11.09 (bs,
1H), 8.84 (s, 1H), 8.44 (d, 1H, J = 7,6 Hz) 7.82 (s, 1H), 7.62 (d,
1H, J = 8.0 Hz), 7.40 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 7.31 (dd, 1H, J = 8,8
Hz); 13C NMR (100 MHz) δ 169.9, 169.0, 135.6, 134.9,
126.9, 124.7, 123.1, 122.3, 121.8, 121.3, 121.0, 113.9, 112.3, 97.6;
HREIMS – ber. für C15H8N4O2: 276,0647, gef.: 276,0647.
-
Beispiel 4
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Synthese
von Granulatimidverbindungen
-
-
-
Imidazol-1H-1-acetamid (20)
-
Einer
gerührten
Suspension von NaH (60 % Dispersion in Öl, 352 mg, 8,80 mmol) in DMF
(5,0 ml) bei 0 °C
wurde eine Lösung
von Imidazol (536 mg, 8,00 mmol) in DMF (10,0 ml) zugegeben. Das
Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 0,5 h lang gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde dann auf 0 °C abgekühlt, und lodacetamid (1,63
g, 8,81 mmol) wurde auf einmal zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde
dann auf Raumtemperatur erwärmt
und für
weitere 1,5 h gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit CH2Cl2 (20 ml) verdünnt, und Nal-Kristalle wurden
durch Filtration entfernt. Die Stammlösung wurden eingeengt und auf
eine neutrale Aluminiumoxidsäule
(40 g) aufgebracht und mit CH2Cl2-MeOH (6:1) eluiert und eingeengt. Flash-Chromatographie
(60 g Silikagel, 7:1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergab 747 mg (75 %) von Verbindung 20 als weißen Feststoff
mit einem Schmelzpunkt von 185-186 °C;
IR (KBr) 3349, 3116,
1685, 1516, 1408, 1312, 1236, 1080, 750, 663 cm-1; 1H NMR (400 MHz) δ 7.54 (s, 1H), 7.51 (bs, 1H),
7.20 (bs, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 4.61 (s, 2H); 13C NMR (100 MHZ) δ 168.5, 138.0, 127.5, 120.4,
48.4;
HREIMS – ber.
für C5H7N3O:
125,0589, gef.: 125,0589.
-
Methylindol-3-ylglyoxylat (21)
-
Einer
kalten (0 °C)
gerührten
Lösung
von 3-Indolglyoxylsäure
(1,00 g, 5,29 mmol) in MeOH (10,0 ml) und Benzol (40,0 ml) wurde
(Trimethylsilyl)diazomethan (2,0 M in Hexan, 5,3 ml, 10,6 mmol)
zugegeben, und das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und
4 h lang gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt, was einen beigen Feststoff ergab. Flash-Chromatographie
(80 g Silikagel, 25:1, dann 10:1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 990 mg (92
%) von Verbindung 21 als beigen Feststoff, der folgende Werte aufwies:
1H NMR (400 MHz) δ 12.40 (bs, 1H), 8.44 (d, 1H,
J = 3.0 Hz), 8.15 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.54 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.24-7.31
(m, 2H), 3.88 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 178.7, 163.9,
138.3, 136.7, 125.4, 123.8, 122.8, 121.1, 112.7, 112.4, 52.5;
HREIMS – ber. für C11H9NO3:
203,0582, gef.: 203,0582.
-
3-[4-(1H-Imidazol-1-yl)-2, 5-dioxo-2,
5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol (19)
-
Einer
gerührten
Lösung
von t-BuOK (140 mg, 1,25 mmol) in DMF (2,0 ml) mit 0 °C wurde eine
Lösung von
Verbindung 20 (31,1 mg, 0,249 mmol) in Methylindol-3-glyoxylat (21)
(101,1 mg, 0,498 mmol) in DMF (3,0 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde 12 h lang bei Raumtemperatur gerührt und dann für 3 h auf
45 °C erwärmt. Das
Reaktionsgemisch wurde dann abgekühlt und mit gesättigtem
wässrigem
NH4Cl (5 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt.
Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc
(2 × 20
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit
Kochsalzlösung
(4 × 10
ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt.
Flash-Chromatographie (25 g Silikagel, 10:1, dann 6:1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials
ergab 54,5 mg (79 %) von Verbindung 19 als roten Feststoff, der
folgende Werte aufwies:
IR (KBr) 3121, 2729, 1767, 1719, 1651,
1495, 1340, 1239, 746 cm-1; 1H
NMR (400 MHz) δ 10.75
(bs, 1H), 10.00 (bs, 1H), 8.03 (d, 1H, J = 3.1 Hz), 7.78 (s, 1H),
7.48 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.29 (s, 1H), 7.11 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 7.04
(s, 1H), 6.80 (dd, 1H, J = 8,8 Hz), 6.21 (d, 1H, J = 7.6 Hz); 13C NMR (100 MHz) δ 170.4, 168.4, 137.8, 136.4,
131.6, 128.8, 125.8, 124.3, 124.1, 122.5, 120.6, 120.1, 119.6, 112.3,
102.3;
HREIMS – ber.
für C15H10N4O2: 278,0804, gef.: 278,0804.
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RAB-009 (40) und RAB-010 (50)
-
Eine
Lösung
von Verbindung 19 in t-BuOH und MeCN wurde 0,5 h lang mit Argon
gespült.
Das gelbe Gemisch wurde dann 4 h lang bestrahlt (450-Watt-Hanovia-Mitteldruck-Quecksilberdampflampe,
Quarzreaktiongefäß). Das
Reaktionsgemisch wurde eingeengt und in Aceton (10 ml) erneut gelöst. Dem
rohen Reaktionsprodukt in Aceton bei Raumtemperatur wurde 10 × CuCl2 zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde
an der Luft über
Nacht gerührt.
Das Lösungsmittel
wurde dann im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in DMF (10 ml)
aufgenommen und durch Celit filtriert. Das Filtrat wurde dann mit
EtOAc (50 ml) verdünnt
und mit Kochsalzlösung
(4 × 10
ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt,
was Verbindung 40 und 50 in einem Verhältnis 3:1 ergab. Triturieren
des rohen Feststoffs mit MeOH ergab kleine Mengen an RAB-009 (40) als
unlöslichen
gelben Feststoff; IR (KBr) 3184, 2931, 2692, 1756, 1718, 1656, 1365,
1309, 1134, 730 cm-1; 1H NMR
(400 MHz) δ 13.14
(bs, 1H), 11.27 (bs, 1H), 8.63 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 8.46 (s, 1H),
7.90 (s, 1H), 7.66 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.50 (dd, 1H, J = 7.7 Hz),
7.36 (dd, 1H, J = 8.8 Hz); HREIMS – ber. für C15H8N4O2:
276,0647, gef.: 276,0647. Unglücklicherweise
konnten die MeOH-Waschlösungen
nicht gereinigt werden, um signifikante Mengen an RAB-010 (50) oder RAB-009
(40) zu ergeben. Eine kleine Menge (etwa 0,5 mg, etwa 70 % rein) RAB-010
(50) wurde durch wiederholte Säulenchromatographie
gewonnen und Biotests unterzogen. Es wurde festgestellt, dass Verbindung
40 inaktiv war, wobei sie im G2-Test einen IC50 > 100 μM aufwies,
während
Verbindung 50 aktiv war und einen IC50 von
1 μM aufwies.
-
Beispiel 5
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Methyl-2-(1-methoxymethyl-1H-imidazol-2-yl)glyoxylat
(101)
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Einer
kalten (-48 °C)
gerührten
Lösung
von 1-Methoxymethyl-1H-imidazol (120) (335 mg, 2,99 mmol) in trockenem
THF (15,0 ml) wurde eine Lösung
von n-BuLi (1,50 M in Hexan, 2,30 ml, 3,45 mmol) zugegeben, und
das Gemisch wurde 1 h lang gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf -78 °C abgekühlt und einer Lösung von
Dimethyloxalat (1,17 g, 9,9 mmol) in THF (10,0 ml) bei -78 °C zugegeben.
Das Gemisch wurde für
weitere 0,33 h bei -78 °C
gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem wässrigem NH4Cl
(5 ml) und EtOAc (15 ml) behandelt. Die Phasen wurden getrennt,
und die wässrige
Phase wurde mit EtOAc (2 × 20
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit
Kochsalzlösung
(10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und
eingeengt. Flash-Chromatographie (50 g Silikagel, 50:1, CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials
ergab 290 mg (49 %) von Verbindung 101 als 01, das folgende Werte
aufwies:
IR (KBr) 2957, 1744, 1679, 1412, 1276, 1215, 1109,
1005 cm-1; 1H NMR
(CDCl3, 400 MHz) δ 7.38 (s, 1H), 7.33 (s, 1H),
5.71 (s, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.33 (s, 3H); 13C
NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 177.9, 164.3, 140.6, 132.9,
126.9, 78.8, 57.5, 53.4;
HREIMS – ber. für C8H10N2O4:
198,0641, gef.: 198,0641.
-
3-[4-(1-Methoxymethyl-1H-imidazol-2-yl)-2,5-dioxo-2,
5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol (140)
-
Einer
gerührten
Lösung
von Verbindung 101 (142,0 mg, 0,717 mmol) und Indolacetamid (62,7
mg, 0,360 mmol) in DMF (5,0 ml) wurde eine Lösung von t-BuOK (101 mg, 0,902
mmol) in DMF (5,0 ml) bei Raumtemperatur zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt,
dann auf 45 °C
erwärmt
und für
weitere 12 h gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde dann gekühlt und mit gesättigtem
wässrigem
NH4Cl (5 ml) und EtOAc (20 ml) behandelt.
Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc
(2 × 20
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit
Kochsalzlösung
(4 × 10
ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt.
Flash-Chromatographie (40 g Silikagel, 40:1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials ergab 79,1 mg (68
%) von Verbindung 140 als roten Feststoff, der folgende Werte aufwies:
IR
(KBr) 2500-3400, 1759, 1713, 1626, 1531, 1341, 1025, 745 cm-1; 1H NMR (400 MHz) δ 12.06 (bs,
1H), 11.17 (bs, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.41 (d, 1H, J
= 7.9 Hz), 7.11 (s, 1H), 7.08 (dd, 1H, J = 8.1 Hz), 6.77 (dd, 1H,
J = 8,8 Hz), 6.23 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 5.06 (s, 2H), 3.08 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz) δ 171.6, 171.4, 138.0, 137.7,
136.6, 132.7, 129.2, 124.8, 122.4, 122.0, 120.7, 120.2, 118.1, 112.1,
105.1, 76.8, 55.7;
HREIMS – ber.
für C17H14N4O2: 322, 1066, gef.: 322, 1066.
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3-[4-(1H-Imidazol-2-yl)-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl]indol
(90)
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Einer
gerührten
Suspension von Verbindung 140 (18,0 mg, 0,056 mmol) in CH2Cl2 (5,0 ml) bei
Raumtemperatur wurde BBr3 (1,0 M in CH2Cl2, 0,56 ml, 0,56
mmol) zu gegeben, und das resultierende blaue Gemisch wurde unter
Rückflussbedingungen
5 h lang erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und
mit gesättigtem
wässrigem
NaHCO3 (5 ml) und EtOAc (10 ml) behandelt
und dann 0,5 h lang gerührt.
Die Phasen wurden getrennt, und die wässrige Phase wurde mit EtOAc
(3 × 10
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit
Kochsalzlösung
(10 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und
eingeengt. Flash-Chromatographie
(25 g Silikagel, 20.1 CH2Cl2-MeOH)
des Rohmaterials ergab 13,5 mg 87 %) von Verbindung 90 als roten
Feststoff, der folgende Werte aufwies:
IR (KBr) 3385, 3140,
1759, 1709, 1630, 1494, 1431, 1346, 1025, 1002, 747 cm-1; 1H NMR(Haupt-Taucomer, 400 MHz) δ 12.32 (bs,
1H), 11.90 (bs, 1H), 11.13 (bs, 1H), 8.48 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.43
(d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.18-7.28 (m, 2H), 7.10 (dd, 1H, J = 7,7 Hz),
6.88-6.96 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz) δ 172.1, 172.0,
170.2, 137.1, 136.4, 133.0, 132.8, 125.2, 122.0, 121.6, 120.2, 120.0,
119.2, 111.9, 105.0;
HREIMS – ber. für C15H10N4O2:
278,0804, gef.: 278,0804.
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RAB-007 (60)
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Eine
gerührte
Lösung
von Verbindung 90 (14,4 mg, 0,052 mmol) in DMSO (5 ml) wurde 8 h
lang auf 120 °C
erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit
EtOAc (30 ml) verdünnt,
mit Kochsalzlösung
(3 × 10
ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4) und eingeengt.
Flash-Chromatographie (20 g Silikagel, 20:1 dann 10:1 CH2Cl2-MeOH) des Rohmaterials
ergab 11,0 mg (76 %) von Verbindung 60 als orangen Feststoff, der
folgende Werte aufwies:
IR (KBr) cm-1 2600-3400,
1755, 1717, 1631, 1591, 1575, 1464, 1376, 1336, 1232, 751; 1H NMR (400 MHz) δ 13.36 (bs, 1H), 11.13 (bs,
1H), 8.63 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 8.40 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.69
(d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.48 (dd, 1H, J = 7,7 Hz), 7.38 (dd, 1H, J
= 7,7 Hz);
HREIMS – ber.
für C15H8N4O2: 276,0647, gef.: 276,0647.
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Beim
G2-Checkpoint-Inhibitionstest hatte Verbindung 60 einen IC50 von 2 μM.
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Beispiel 6
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Hemmung von Protein-Kinasen durch Granulatimidverbindungen
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Granulatimidverbindungen
wie in Tabelle 2 gezeigt wurden wie zuvor beschrieben auf ihre Hemmung von
G2-Checkpoint und auf die Hemmung von Protein-Kinase-Wirkung gegenüber einem
Panel von Protein-Kinasen, einschließlich CDK1, GSK3b und IL1,
getestet.
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Das
verwendete GSK3β-Peptidsubstrat
war YRRAAVPPSPSLSRHSSPHQS(PO4H2)EDEE-Amid. Das
ILK1-Substrat ist CKRRRLASLR-Amid.
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Die
Testverbindungen wurden auf 250 μM
in 1 % DMSO verdünnt,
dann unter Einsatz von Dreifach-Verdünnungsschritten reihenverdünnt. 100
% DMSO wurde als negative Kontrolle verwendet.
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Kinase-Reaktionen
werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthält verdünnte Testverbindung,
die Protein-Kinase, Substrat und γ-32P-ATP.
Das Gemisch wird 15 min lang inkubiert und das Reaktionsgemisch
getüpfelt
und gezählt.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass Granulatimidverbindungen zusätzlich zu
ihrer Hemmwirkung für
den G2-Checkpoint als Kinase-Inhibitoren wirken können.
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Es
sind zwar verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung im Detail
beschrieben worden, es versteht sich jedoch, dass Änderungen
und Modifikationen dieser hierin beschriebenen Aspekte in den Schutzumfang
der beiliegenden Ansprüche
fallen.