DE60116664T2

DE60116664T2 - Indolocarbazol-antikrebsmittel und verfahren zu ihrer verwendung

Info

Publication number: DE60116664T2
Application number: DE60116664T
Authority: DE
Inventors: E. David LaGrange ZEMBOWER; Yongping Naperville XIE; Yasheen Lafayette ZHOU
Original assignee: Advanced Life Sciences Inc
Current assignee: Advanced Life Sciences Inc
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-29
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2021-10-30
Also published as: DE60116664D1; AU2002243442B2; CA2426754C; WO2002048166A1; US20030087842A1; US6605596B2; JP4060709B2; JP2004515554A; EP1341412A1; ATE315335T1; AU4344202A; CA2426754A1; WO2002048166A8; EP1341412B1

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft synthetische Indolcarbazol-Analoga und deren Verwendung. Genauer gesagt betrifft diese Erfindung Modifikationen der Kernstruktur 12(-β-D-Glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion, die Substitutionen enthalten, bestehend in einem 2,3,9-Trihydroxy-Muster, insbesondere cyclischen und acyclischen Ethern an den 2- und 3-Hydroxy-Positionen. Diese Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen und Verwendungen solcher Indolcarbazol-Analoga für die Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die humane Topoisomerase I (Topo I) stellt ein für die Überlebensfähigkeit der zellulären Funktion entscheidendes Enzym dar, das ein attraktives Ziel für das Design und die Entwicklung von Antikrebs-Therapeutika ist. Derzeit gibt es zwei von der Food and Drug Administration genehmigte Antikrebsmittel für die klinische Behandlung von Tumoren: Topotecan (Hycamtin) und CPT-11 (Camptosar), die beide strukturelle Analoga des natürlichen Produkts Camptothecin sind.
Topo I ist ein monomeres 100 kD-Protein, das Veränderungen im topologischen Zustand von doppelsträngiger DNA (dsDNA) in Zuwachshöhen von einer Verwindungszahl¹ katalysiert. Von der dreidimensionalen Struktur der humanen Topo I ist berichtet worden². Vom Mechanismus, mittels dessen Topo I funktioniert, wird angenommen, dass er durch Induktion eines vorübergehenden einzelsträngigen Einschnitts in die dsDNA über die Bildung eines kovalenten Protein-DNA-Addukts, bezeichnet als der spaltbare Komplex, verläuft, welcher so heißt, weil diese Komplexe als DNA-Brüche auf die Behandlung mit Denaturierungsmitteln oder Alkali hin nachgewiesen werden. Der spaltbare Komplex wird auf die Transveresterung einer DNA-Phosphodiester-Bindung durch den Aktivstellen-Tyrosin-723-Rest an humane Topo I hin gebildet, was zu einer Esterbindung zwischen dem Enzym und dem 3'-Phosphoryl-ende des aufgebrochenen DNA-Strangs führt. Dies erlaubt eine freie Rotation des Protein-gebundenen 3'-Endes des aufgebrochenen DNA-Strangs um den intakten komplementären DNA-Strang, was zu einer Relaxation des Doppelstrangs in Zuwachshöhen von einer Verwindungszahl führt. Die Religation des aufgebrochenen Strangs (über eine zweite Transveresterungsreaktion) und die anschließende Dissoziation der Topoisomerase I vervollständigt den katalytischen Zyklus.
Topoisomerase I hemmt act bzw. den Vorgang über die Stabilisierung des spaltbaren Komplexes, wie durch Bildung eines ternären Komplexes vermittelt, der in Wirkstoff, Topoisomerase I und DNA besteht³. Agenzien wie Camptothecin (der prototypische Topoisomerase-I-Hemmer) binden nicht direkt an DNA, noch an Topoisomerase I allein, sondern lediglich an Topoisomerase I in Komplexierung mit DNA. Als gegeben vorausgesetzt wird, dass der stabilisierte DNA-Protein-Wirkstoff-Komplex letale DNA-Strangbrüche auf eine Kollision mit der voranschreitenden Replikationsgabel hin bewirkt. Es wird auf diesen Mechanismus zurückgeführt, dass der Topoisomerase-I-Hemmer das Enzym zu einem DNA-schädigenden Agens umwandelt, was zu einer Unterbrechung der DNA-Replikation und schließlich zum Zelltod führt. Dieses Postulat wird von der Tatsache gestützt, dass Camptothecin hochgradig phasenspezifisch ist, indem es lediglich Zellen in der S-Phase abtötet.
Über die Camptothecine hinaus haben Indolcarbazole ebenfalls eine potente Antitumor-Aktivität über die Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität^4–7, am deutlichsten ED-110⁸, NB-506⁹ und J-107088¹⁰, gezeigt. Das Indolcarbazol-Analogon, das ein 3,9-Dihydroxy-Substitutionsmuster trägt, wurde mit einer hervorragenden Topoisomerase-I-Hemmfähigkeit als auch einer hervorragenden in vitro-Antitumor-Aktivität relativ zu den anderen "symmetrischen" dihydroxylierten Regioisomeren befunden¹¹. Das 3,9-Dihydroxy-Analogon zeigte außerdem eine beeindruckende in vivo-Antitumor-Aktivität gegen die in Nacktmäuse xenotransplantierte humane DU-145-Prostatatumorlinie. Ohkubo et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9 (1999), 3307–3312, beschreibt die Synthese und biologischen Aktivitäten der NB-506-Analoga.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, Zusammensetzungen und An- bzw. Verwendungen der Verbindungen der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments für die Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität.
Demgemäß besteht eine Aufgabe der Erfindung in der Bereitstellung von Verbindungen der allgemeinen Formeln I und II,
worin R₁ und R₂ unabhängig H, C_1-6-Alkyl, Aryl-C_1-6-alkyl, mono- oder polyfluoriertes C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl sind,
oder ein Aryl, wobei das Aryl vorzugsweise einen sechsgliedrigen aromatischen Carbocyclus wie Phenyl oder einen polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff wie Naphthyl, Phenanthracenyl, Indanyl umfasst,
oder ein Heterocyclus, wobei der Heterocyclus vorzugsweise aus sechsgliedrigen aromatischen Heterocyclen wie Piridyl, Diazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrrolidinyl oder Piperazinyl, oder fünfgliedrigen aromatischen Heterocyclen wie Pyrrolyl, Pyrazol, Imidazolyl, Imidazolidinyl, Imidazolenyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Furanyl, Thiophenyl, oder bi cyclischen Systemen wie Indolyl, Benzthiopheneyl, Benzofuranyl, Isoindolyl, Isobenzothiophenyl, Isobenzofuranyl besteht; wobei das Aryl oder der Heterocyclus jeweils unsubstituiert oder durch ein oder mehrere der Folgenden substituiert sein kann: C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl;
oder R₁ und R₂ sich zur Bildung eines Methylendioxy, Ethylendioxy, Propylendioxy oder einer Butylendioxy-Gruppe kombinieren, worin ein oder mehrere der Kohlenstoffatome mit F, Cl, Br, I, C_1-6-Alkyl, Aryl-C_1-6-alkyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl substituiert sein können,
oder ein Aryl, wobei das Aryl vorzugsweise irgendeinen sechsgliedrigen aromatischen Carbocyclus wie Phenyl oder einen polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff wie Naphthyl, Phenanthracenyl, Indanyl umfasst,
oder ein Heterocyclus, wobei der Heterocyclus vorzugsweise sechsgliedrige aromatische Heterocyclen wie Piridyl, Diazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrrolidinyl oder Piperazinyl, oder fünfgliedrige aromatische Heterocyclen wie Pyrrolyl, Pyrazol, Imidazolyl, Imidazolidinyl, Imidazolenyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Furanyl, Thiophenyl oder bicyclische Systeme wie Indolyl, Benzthiopheneyl, Benzofuranyl, Isoindolyl, Isobenzothiophenyl, Isobenzofuranyl umfasst; worin das Aryl oder der Heterocyclus jeweils unsubstituiert oder mit ein oder mehreren der Folgenden substituiert sein kann: C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl;
R₃ besteht aus H oder NH₂, Nitrilo-(C_1-6)-alkylamin der Formel -NH-Alkyl-CN, 2-Pyrrolidinylethyl-1-amin, Benzylamin, 2-Naphthylamin, 2-Benzothiazolamin, Beta-Phenethylamin, 1-Piperazinamin, 4-(2-Hydoxyethyl)piperazin-1-amin, Piperidin-1-amin, Anilin, 2-Hydroxybutylamin, 3-Sulfolanamin, 4-Methyl-2,3-dihydroisocytosin, (C_1-6)-Alkylsulfonamidyl, 2-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)acetamidyl, 1,4-Dimethylpiperazin-2- formamidyl, Phenoxyformamidyl, Gluconamidyl, Manonamidyl, Gulonamidyl,
oder Arylcarbamat der Formel -NH-CO-Ar, worin das Aryl vorzugsweise sechsgliedrige aromatische Carbocyclen umfasst, bestehend aus Phenyl, Hydroxyphenyl, Dihydroxyphenyl, Trihydroxyphenyl, oder einem polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff wie Naphthyl, Phenanthracenyl, Indanyl,
oder heterocyclischem Carbamat der Formel -NH-CO-Heterocyclus, worin der Heterocyclus vorzugsweise sechsgliedrige aromatische Heterocyclen umfasst, bestehend aus Pyridyl, Diazinyl, Pyrimidinyl, 5-Methoxypyrimidinyl, Pyrrolidinyl, (1,2,4) Triazin-3,5-dion-6-yl, 6-Mercaptopyrimidin-4-yl, oder sechsgliedrige nicht-aromatische Heterocyclen, umfassend Piperazinyl, 4-Methylpiperazinyl, Pyranyl, oder fünfgliedrige aromatische Heterocyclen, umfassend Pyrrolyl, 1-Methylpyrrol-2-yl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Imidazolidinyl, Imidazolenyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, 2-Methylthiazol-4-yl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Furan-2-yl, Thiophen-2-yl, Thiophen-3-yl, 3'-Methoxythiophen-3-yl, oder bicyclische Systeme wie Indolyl, Benzothiopheneyl, Benzofuranyl, Isoindolyl, Isobenzothiophenyl, Isobenzofuranyl,
oder Alkylcarbamat der Formel -NH-CO-Alkan, worin das Alkan umfasst (C_1-6)Alkyl, 4-Methyl-piperazinylmethyl,
oder Morpholino-(C_1-6)alkyl, Piperazino-(C_1-6)alkyl
oder Nitrilo-(C_1-6)acyl,
oder einem Aryl, worin das Aryl vorzugsweise einen sechsgliedrigen aromatischen Carbocyclus wie Phenyl oder einen polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff wie Naphthyl, Phenanthracenyl, Indanyl umfasst,
oder einem Heterocyclus, worin der Heterocyclus vorzugsweise sechsgliedrige aromatische Heterocyclen wie Piridyl, Diazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrrolidinyl oder Piperazinyl, oder fünfgliedrige aromatische Heterocyclen wie Pyrrolyl, Pyrazol, Imidazolyl, Imidazolidinyl, Imidazolenyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Furanyl, Thiophenyl, oder bicyclische Sy steme wie Indolyl, Benzthiopheneyl, Benzofuranyl, Isoindolyl, Isobenzothiophenyl, Isobenzofuranyl umfasst; worin das Aryl oder der Heterocyclus jeweils unsubstituiert oder mit ein oder mehreren der Folgenden substituiert sein kann: C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl;
oder C_1-6-Alkyl, Aryl-C_1-6-Alkyl, mono- oder polyfluoriertes C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl, Hydroxy-(C_1-6)alkyl, Dihydroxy-(C_1-6)alkyl;
R₄ aus H, OH, NH₂, C_1-6-Alkyl, Aryl-C_1-6-alkyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl besteht;
oder einem Aryl, worin das Aryl vorzugsweise einen sechsgliedrigen aromatischen Carbocyclus wie Phenyl oder einen polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoff wie Naphthyl, Phenanthracenyl, Indanyl umfasst,
oder einem Heterocyclus, worin der Heterocyclus vorzugsweise sechsgliedrige aromatische Heterocyclen wie Piridyl, Diazinyl, Pyrimidinyl oder Pyrrolidinyl oder Piperazinyl, oder fünfgliedrige aromatische Heterocyclen wie Pyrrolyl, Pyrazol, Imidazolyl, Imidazolidinyl, Imidazolenyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Furanyl, Thiophenyl, oder bicyclische Systeme wie Indolyl, Benzthiopheneyl, Benzofuranyl, Isoindolyl, Isobenzothiophenyl, Isobenzofuranyl umfasst; worin Aryl oder der Heterocyclus jeweils unsubstituiert oder mit ein oder mehreren der Folgenden substituiert sein kann: C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, C_1-6-Alkylamino, Di(C_1-6-alkyl)amino, C_1-8-Alkylamino-C_1-8-alkyl, Di(C_1-6-alkyl)amino-C_1-8-alkyl;
oder einem pharmazeutisch zulässigen Salz davon.
Die bevorzugten Verbindungen sind die, worin sich R₁ und R₂ zur Bildung eines Methylendioxy-Rings kombinieren, R₃ H ist und R₄ OH ist; oder
worin sich R₁ und R₂ zur Bildung eines Ethylendioxy-Rings kombinieren, R₃ H ist und R₄ OH ist; oder
worin sich R₁ und R₂ zur Bildung eines Isopropylendioxy-Rings kombinieren, R₃ H ist und R₄ OH ist; oder
worin R₁ und R₂ beide CH₃ sind, R₃ H ist und R₄ OH ist; oder
worin R₁ und R₂ beide H sind, R₃ H ist und R₄ OH ist.
Die Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren zur Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität in einem Säuger, umfassend das Verabreichen an einen Säuger, der einer Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität bedarf, einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder II.
Noch eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Zusammensetzungen zur Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität in einem Säuger, der einer Hemmung der Topoisomerase-I-Aktivität bedarf, umfassend eine wirksame Menge mindestens einer Verbindung der Formeln I und II.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden im Lichte der nachstehenden ausführlichen Beschreibung erkennbar werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen sind als Antitumormittel für die Behandlung oder Verhütung von Krebs, entweder alleine oder mit einem Träger, nützlich. Cytotoxische Agenzien werden häufig als Antikrebsmittel verwendet, um Tumoren zu kontrollieren oder auszurotten. Topo I-Hemmer stellen nützliche cytotoxische Agenzien dar, wobei zwei Topo I-Hemmer, die mit Camptothecin verwandt sind, nämlich Camptosar und Hycamtin (Topotecan) derzeit für die Behandlung von Tumoren klinisch eingesetzt werden. Indolcarbazole stellen eine unterschiedliche Klasse von Topo I-Hemmern dar, die nützliche Agenzien für die Behandlung von Tumoren darstellen. Insbesondere wurde von bei dieser Erfindung beschriebenen Topo I-hemmenden Verbindungen gezeigt, dass sie hochgradig cytotoxisch gegen humane Eierstock- und Prostata-Tumorzellen sind.
Die Indolcarbazol-Analoga dieser Erfindung können als eine Lösung von lyophilisierten Pulvern für die parenterale Verabreichung formuliert sein. Die Pulver können durch Zugabe eines geeigneten Verdünnungsmittels oder eines anderen pharmazeutisch zulässigen Trägers vor der Verwendung rekonstituiert werden. Die Flüssigformulierung ist allgemein eine gepufferte, isotonische, wässrige Lösung. Beispiele der geeigneten Verdünnungsmittel sind normale isotonische Saline- bzw. Salzlösung, standardmäßige 5% Dextrose in Wasser oder in gepufferter Natrium- oder Ammoniumacetatlösung. Eine derartige Formulierung ist besonders geeignet für die parenterale Verabreichung, kann aber auch für die orale Verabreichung verwendet werden. Es mag wünschenswert sein, Exzipienten wie Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Hydroxycellulose, Akazie, Polyethylenglycol, Mannitol, Natriumchlorid oder Natriumacetat zuzusetzen.
Alternativ können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verkapselt, tablettiert oder in eine Emulsion (Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl) als Sirup für die orale Verabreichung aufgenommen werden. Pharmazeutisch zulässige Feststoffe oder Flüssigträger, die im Fachgebiet der pharmazeutischen Formulierung allgemein bekannt sind, können zur Verbesserung oder Stabilisierung der Zusammensetzung oder zur Erleichterung der Zubereitung der Zusammensetzung zugesetzt werden. Zu festen Trägern zählen Stärke (Mais oder Kartoffel), Lactose, Calciumsulfatdihydrat, Kaolin, Croscarmellose-Natrium, Magnesiumstearat oder Stearinsäure, Talk, Pectin, Akazie, Agar, Gelatine, Maltodextrine und mikrokristalline Cellulose oder kolloidales Siliziumdioxid. Zu Flüssigträgern zählen Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Maisöl, Sesamöl, Salzlösung und Wasser. Der Träger kann auch ein verzögernd freisetzendes Material enthalten, wie etwa Glycerolmonostearat oder Glyceryldistearat, einzeln oder mit einem Wachs. Die Menge des festen Trägers variiert, doch liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 mg und etwa 1 g pro Dosiseinheit.
Die Dosierungsbereiche für die Verabreichung der in dieser Erfindung beschriebenen Indolcarbazol-Analoga sind solche, die die gewünschte Wirkung erzielen. Die Dosis wird allgemein mit dem Alter, Körpergewicht, Ausmaß der Erkrankung und Gegenanzeigen, sofern vorhanden, variieren. Die Dosis wird auch durch das Vor handensein jeglicher abträglicher Nebenwirkungen bestimmt werden, die die Verbindungen begleiten können. Es ist in jedem Falle wünschenswert, wo immer möglich, die abträglichen Nebenwirkungen auf einem Minimum zu halten. Ein Fachmann des Gebiets kann die geeignete Dosis, Dosierungsschema und Verabreichungsmethode für die exakt anzuwendende Formulierung der Zusammensetzung ohne weiteres bestimmen, um die erwünschte wirksame Konzentration im einzelnen Patienten einzustellen. Die Dosis kann jedoch von etwa 1 mg/kg/Tag bis etwa 500 mg/kg/Tag, und vorzugsweise von etwa 1 mg/kg/Tag bis etwa 50 mg/kg/Tag variieren.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht werden, die nicht als Beschränkung der Erfindung in ihrem Geiste oder Rahmen auf die spezifisch darin beschriebenen Verfahrensweisen oder Zusammensetzungen verstanden werden sollen.
Synthese der Zielmoleküle Schema A
Die erforderlichen 5,6-Indoldioxan- und 5,6-Indoldioxol-Vorläufer können ausgehend von 4-Methylcatechol hergestellt werden, wie in Schema A für 5,6-Ethylendioxyindol veranschaulicht (4). Der Schutz der ortho-Dihydroxy-Funktion wurde unter Verwendung von 1,2-Dibromethan, Dichlormethan bzw. Aceton erreicht. Eine Nitrierung unter Verwendung von rauchender Salpetersäure, gefolgt von der Indolbildung unter Anwendung des Batcho-Leimgruber-Protokolls¹², erbrachte die gewünschten Indole.
Die Konstruktion der Indolcarbazol-Analoga kann wie in Schema B für Ia durchgeführt werden. N-Benzyloxymethyl-3,4-dibrommaleimid wurde wie zuvor beschrieben¹³ hergestellt. Die Reaktion mit einem geeigneten Indol, das unter Verwendung eines organometallischen Stoffes, vorzugsweise, doch nicht beschränkt auf Methylmagnesiumhalogenid oder Litihiumhexamethyldisilazid, vorbehandelt worden war, erbrachte die Bromindolmaleimid-Intermediate, wie dargestellt durch 5. Die Glucosidierung am Indol-Stickstoff wurde mit 2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-D-glucose unter Mitsunobu-Bedingungen¹⁴ erzielt (3 Äquivalente jeweils von Glucose, PPh₃ und Diisopropylazodicarboxylat (DIAD), gefolgt von einer Umkehrphasen-Reinigung, um 6 zu erhalten. Die Einführung der zweiten Indol-Einheit wurde unter ähnlichen Bedingungen wie der Einführung der ersten Indol-Einheit durchgeführt, was die durch 7 dargestellten Bisindolylmaleimide lieferte. Die oxidative Cyclisierung der Bis-indolylmaleimide wurde unter Verwendung entweder des Palladium(II)trifluoracetats in DMF oder über photochemische Cyclisierung erreicht, was die durch 8 dargestellten Indolcarbazole lieferte. Andere Autoren¹⁴ berichteten von der oxidativen Cyclisierung unter Verwendung alternativer Reagenzien wie CuCl₂ und PdCl₂, doch versagten diese darin, die vorliegende Reaktion zu katalysieren. Die Hydrogenolyse der Schutzgruppen (Palladiumhydroxid, HOAc) erbrachte die durch 9 dargestellten 6-N-Hydroxymethyl-Derivate, die sich ohne weiteres zu den gewünschten Endprodukten, wie durch Ia dargestellt, unter Verwendung von Ammoniumacetat in Methanol umwandeln ließen. Alle Verbindungen lieferten spektrale und analytische Eigenschaften (¹H NMR, ¹³C NMR, MS und Elementaranalyse), die mit dem angezielten Strukturen übereinstimmten.
Schema B
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, dienen aber nicht einer Beschränkung ihres Rahmens.
BEISPIEL 1 Synthese von 2,3-Ethylendioxy-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Ia)
Schritt A: Herstellung von 6-Methyl-1,4-benzodioxan (1)
Ein Gemisch von 4-Methylcatechol (33,04 g, 266,1 mmol), 1,2-Dibromethan (100 g, 532,3 mmol), K₂CO₃ (75,4 g, 545,5 mmol) und Natriumiodid (0,2 g, 1,33 mmol) in Ethylenglycol (500 ml) wurde auf 130°C unter Stickstoff für fünf Stunden erhitzt. Die Lösung durfte sich auf Raumtemperatur abkühlen und wurde über Nacht gerührt. Nach dem Filtrieren des Gemischs durch Kieselgur wurde die Lösung mit Salzlösung (800 ml) verdünnt und mit organischen Lösungsmitteln (CH₂Cl₂/Hexan/EtOAc: 1:3:1, 3 × 500 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, um ein Rohöl zu erhalten. Eine Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ether/Hexan (8:2) erbrachte das Titel-Intermediat als ein farbloses Öl, 20,0 g (50%).
Schritt B: Herstellung von 6-Methyl-7-nitro-1,4-benzodioxan (2)
Einer Lösung von 1 (20,0 g, 133,3 mmol) in Essigsäure (135 ml) wurde eine Lösung von rauchender HNO₃ (10 ml) in Essigsäure (50 ml) über 30 Minuten zugetropft. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt, dann in einen Becher gegossen, der Eis enthielt, um ein kristallines Präzipitat zu erhalten, welches durch Vakuumfiltration abgesammelt und mit Wasser gewaschen wurde, um das Produkt (25,8 g, 99,2%) als einen gebrochen weißen bzw. cremefarbenen Feststoff zu erhalten.
Schritt C: Herstellung von (E)-4,5-Ethylendioxy-2-nitro-1-pyrrolidinostyrol (3)
Einer Lösung von 2 (19,5 g, 100 mmol), N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (23,63 g, 198,3 mmol) und Pyrrolidin (14,1 g, 198,3 mmol) wurde auf 110°C erhitzt und für 24 Stunden unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und 250 ml absolutes Methanol wurden zugesetzt. Das Produkt kristallisierte als ein hellroter Feststoff aus. Die Rückgewinnung durch Saugfiltration erbrachte das Produkt (24,3 g, 88,0%).
Schritt D: Herstellung von 4,5-Ethylendioxyindol (4)
Einer Lösung von 3 (24,0 g, 87,0 mmol) in Methanol und THF (240 ml, 1:1) wurde Raney-Nickel (2,0 ml) und Hydrazinhydrat (3 × 3,6 ml, 348 mmol) jede halbe Stunde bei Raumtemperatur unter Stickstoff zugegeben. Dann wurde die Lösung bei 45°C für 2 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der Katalysator durch Filtration durch ein Kieselgurbett entfernt und dreimal mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand durch Eindampfen mit Toluol (100 ml) zum Erhalt eines Rohöls getrocknet. Die Flash-Kieselgel-Säulenreinigung unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ethylacetat/Hexan (40/60%) erbrachte das Titel-Intermediat als einen gebrochen weißen Feststoff (7,0 g, 46,1%).
Schritt E: Herstellung von 2-Brom-3-(5-benzyloxy-1H-indol-3-yl)-N-benzyloxymethylmaleimid (5)
Einer Lösung von 5-Benzyloxyindol (8,93 g, 40 mmol) in Benzol (150 ml) wurde Methylmagnesiumiodid (14,7 ml, 44,0 mmol, 3 M in Ether) bei 0°C zugegeben. Die Lösung wurde für eine Stunde gerührt, woraufhin eine Lösung von N-Benzyloxymethyl-3,4-dibrommaleimid (15,0 g, 40 mmol) in Benzol (50 ml) und THF (100 ml) zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C für 30 Minuten gerührt und dann auf Raumtemperatur erwärmt und für eine Stunde gerührt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (350 ml) verdünnt, dann mit HCL (150 ml, 0,3 N), NaHCO₃ (200 ml) und H₂O (200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Kristallisation des Rohöls mit Methanol erbrachte das Titel-Intermediat als einen gelben Feststoff (12,50 g, 66,0%).
Schritt F: Herstellung von 2-Brom-3-[5-benzyloxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (6)
Einer Lösung von 5 (15,0 g, 29,0 mmol), 2,3,4,5-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose (47,02 g, 87,0 mmol) und Triphenylphosphin (22,8 g, 87,0 mmol) in THF (800 ml) wurde auf –78°C abgekühlt. Diisopropylazodicarboxylat (17,14 ml, 87,0 mmol) wurde zugetropft, wobei die Temperatur bei –78°C gehalten wurde, und dann für drei Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf 0°C mit Hilfe eines Eiswasserbades erwärmt, und das Rühren wurde für zwei Stunden fortgesetzt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (1200 ml) verdünnt, mit HCl, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Das Rohgemisch wurde auf eine Umkehrphasen-Biotage-Kartusche aufgebracht und mit einem CH₃CN/H₂O-(50/50)-Gradienten zu CH₃CN (100%) eluiert, was das Titel-Intermediat als einen gelben Feststoff erbrachte, 22,3 g (74,0%).
Schritt G: Herstellung von 3-(4,5-Ethylendioxy-1H-indol-3-yl)-4-[5-benzyloxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (7)
Einer Lösung von 4 (303,2 mg, 1,73 mmol) in THF (35 ml) wurde Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS, 3,46 ml, 3,46 mmol, 1 M in THF) bei 0°C zugegeben, und die resultierende Lösung wurde für 40 Minuten gerührt. Eine Lösung von 6 in THF (20 ml) wurde dem obigen Gemisch langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten bei 0°C. Das Gemisch wurde mit EtOAc (300 ml) verdünnt, mit HCl (2 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, was ein Rohgemisch ergab. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu EtOAc/Hexan (40/60) erbrachte das Titel-Intermediat als einen roten Feststoff, 1,20 g (73,2%).
Schritt H: Herstellung von 2,3-Ethylendioxy-6-benzyloxymethyl-9-benzyloxy-12-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (8)
Einer Lösung von 8 (550 mg, 0,485 mmol) in DMF (28 ml) wurde Palladium(II)trifluoracetat (338,5 mg, 1,18 mmol) zugegeben und dies bei 80°C für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit EtOAc (280 ml) verdünnt und mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung (150 ml) und H₂O (3 × 120 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Elution mit EtOAc/Hexan (3:7) erbrachte 404 mg (73,6%) als einen gelben Feststoff.
Schritt 1: Herstellung von 2,3-Ethylendioxy-6-hydroxymethyl-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (9)
Einer Lösung von 8 (140 mg, 0,1236 mmol) in HOAc (25 ml) wurde Palladiumhydroxid [Pd(OH)₂, 140 mg] zugesetzt. Die Reaktion wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre (50 psi) bei Raumtemperatur für 63 Stunden geschüttelt. Das Gemisch wurde durch einen Acrodisc-Spritzenfilter filtriert und in vacuo konzentriert, was einen rohen Feststoff ergab. Die Flash-Chromatographie unter Eluieren mit MeOH/HOAc/EtOAC (12/1/87) erbrachte 42,0 mg (57,5%) als einen gelben Feststoff.
Schritt J: Synthese von 2,3-Ethylendioxy-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Ia)
Einer Lösung von 9 (5,0 mg, 0,00845 mmol) in MeOΗ (0,5 ml) wurde NH₄OH (1,5 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, dann in vacuo konzentriert, was einen rohen Feststoff ergab. Die Rekristallisation mit MeOH/Hexan/CHCl₃ erbrachte 4,3 mg (90,5%) als einen gelben Feststoff.
BEISPIEL 2 Synthese von 2,3-Methylendioxy-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Ιb)
Schritt A: Herstellung von 3,4-Methylendioxytoluol (10)
Ein Gemisch von 4-Methylcatechol (26,0 g, 209,4 mmol) und NaOH (18,4 g, 461,0 mmol) in CH₂Cl₂ (40,0 ml) wurde auf 100°C unter Stickstoff für 2 Stunden erhitzt. Die Lösung durfte sich bei Raumtemperatur abkühlen und wurde mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt. Das Gemisch wurde mit NaHCO₃ (200 ml) und H₂O (2 × 200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, was ein Rohöl ergab. Die Flash-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ether/Hexan (1:1) erbrachte das Titel-Intermediat als ein farbloses Öl, 20,5 g (71,9%).
Schritt B: Herstellung von 2-Nitro-4,5-methylendioxytoluol (11)
Einer Lösung von 10 (19,0 g, 139,6 mmol) in Essigsäure (180 ml) wurde eine Lösung von rauchender HNO₃ (10 ml) in Essigsäure (70 ml) über 30 Minuten zugetropft. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt, dann in einen Becher gegossen, der Eis enthielt, um ein kristallines Präzipitat zu erhalten, welches durch Vakuumfiltration abgesammelt und mit Wasser gewaschen wurde, um das Rohprodukt zu erhalten. Eine weitere Reinigung über Rekristallisation aus CH₂Cl₂/Hexan ergab das reine Produkt (16,3 g, 64,4%).
Schritt C: Herstellung von (E)-4,5-Ethylendioxy-2-nitro-1-pyrrolidinostyrol (12)
Eine Lösung von 11 (15,7 g, 86,74 mmol), N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (15,5 g, 130,1 mmol) und Pyrrolidin (9,25 g, 130,1 mmol) wurde auf 110°C erhitzt und für 3 Stunden unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und ein Gemisch aus absolutem Methanol und Ethanol (1:1, 250 ml) wurde zugesetzt. Das Produkt kristallisierte als ein hellroter Feststoff aus. Die Rückgewinnung durch Saugfiltration erbrachte das Produkt (16,2 g, 71,4%).
Schritt D: Herstellung von 5,6-Methylendioxyindol (13)
Einer Lösung von 12 (15,7 g, 59,92 mmol) in Methanol und THF (200 ml, 1:1) wurde Raney-Nickel (1,5 ml) und Hydrazinhydrat (3 × 2,56 ml, 240 mmol) in drei gleichen Anteilen jede halbe Stunde bei Raumtemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Lösung wurde dann bei 45°C für zwei Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Katalysator wurde mittels Filtration durch ein Kieselgurbett entfernt und dann dreimal mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand durch Azeotropieren mit Toluol (100 ml) zum Erhalt eines Rohöls getrocknet. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ethylacetat/Hexan (30/70%) erbrachte das Titel-Intermediat als einen gebrochen weißen Feststoff (5,1 g, 52,9%).
Schritt E: Herstellung von 2-(4,5-Methylendioxy-1H-indol-3-yl)-3-[5-benzyloxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (14)
Einer Lösung von 13 (279,0 mg, 1,73 mmol) in THF (35,0 ml) wurde Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS, 3,46 ml, 3,46 mmol, 1 M in THF) bei 0°C zugegeben und für 40 Minuten gerührt. Eine Lösung von 6 in THF (20 ml) wurde dem obigen Gemisch langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten bei 0°C. Das Gemisch wurde mit EtOAc (350 ml) verdünnt, mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, um ein Rohgemisch zu ergeben. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ethylacetat/Hexan (40/60%) erbrachte das Titel-Intermediat als einen roten Feststoff, 0,73 g (45,3%).
Schritt F: Herstellung von 2,3-Methylendioxy-6-benzyloxymethyl-9-benzyloxy-12-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (15)
Einer Lösung von 14 (650 mg, 0,58 mmol) in DMF (36 ml) wurde Palladium(II)trifluoracetat (405 mg, 1,22 mmol) zugegeben, und die Reaktion wurde bei 80°C für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit EtOAc (350 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Solelösung (150 ml) und H₂O (3 × 150 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit EtOAc/Hexan (3:7) erbrachte 248 mg (38,2%) als einen gelben Feststoff.
Schritt G: Herstellung von 2,3-Methylendioxy-6-hydroxymethyl-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (16)
Einer Lösung von 15 (150 mg, 0,1341 mmol) in HOAc (10 ml) wurde Palladiumhydroxid (150 mg) zugegeben. Die Reaktion wurde unter einer Atmosphäre von H₂ (50 psi) bei Raumtemperatur für 60 Std. geschüttelt. Das Gemisch wurde durch einen Acrodisc-Spritzenfilter filtriert und in vacuo konzentriert, um einen rohen Feststoff zu erhalten. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit MeOH/AcOH/EtOAc (12/1/87) erbrachte 56,2 mg (76,7%) als einen gelben Feststoff.
Synthese von 2,3-Methylendioxy-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Ib)
Einer Lösung von 16 (30,0 mg, 0,052 mmol) in MeOH (2,0 ml) wurde NH₄OH (4,0 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, dann in vacuo konzentriert, um einen rohen Feststoff zu erhalten. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit MeOH/AcOH/EtOAc (12/1/87) erbrachte 26,1 mg (91,1%) als einen gelben Feststoff.
BEISPIEL 3 Synthese von 2,3-(Isopropylendioxy)-9-hydroxy-13-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Ic)
Schritt A: Herstellung von 4-Methyl-2',2'-dimethyl-1,3-benzodioxol (17)
Ein Gemisch aus 4-Methylcatechol (75,0 g, 604,2 mmol, Aldrich), Phosphorpentoxid (85,8 g, 302,3 mmol) in Aceton (200 ml) und Toluol (200 ml) wurde unter Stickstoff für 50 Std. refluxiert. Die Lösung durfte sich auf Raumtemperatur abkühlen und wurde mit Ether (500 ml) verdünnt. Das Gemisch wurde mit 2 M NaOH (2 × 200 ml) und H₂O (2 × 200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zum Erhalt eines Rohöls konzentriert. Die Flash-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ether/Hexan (1:1) erbrachte das Titel-Intermediat als ein farbloses Öl (82,0 g, 82,7%).
Schritt B: Herstellung von 4-Methyl-5-nitro-2',2'-dimethyl-1,3-benzodioxol (18)
Einer Lösung von 17 (65,0 g, 395,9 mmol) in HOAc (450 ml) wurde eine Lösung von rauchender HNO₃ (35 ml) in Essigsäure (100 ml) über 30 Minuten zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt, dann in einen Becher gegossen, der Eis enthielt, um ein kristallines Präzipitat zu erhalten, welches durch Vakuumfiltration abgesammelt und mit Wasser gewaschen wurde, um das Rohprodukt zu erhalten (77,1 g, 93,8%).
Schritt C: Herstellung von (E)-4,5-(Isopropylendioxy)-2-nitro-1-pyrrolidinostyrol (19)
Einer Lösung von 18 (45 g, 215,1 mmol), N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (38,45 g, 322,7 mmol) und Pyrrolidin (22,95 g, 322,7 mmol) wurde auf 110°C erhitzt und für 16 Stunden unter Stickstoff gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt, und ein Gemisch von absolutem Methanol und Ethanol (1:1; 600 ml) wurde zugegeben. Das Produkt kristallisierte als ein hellroter Feststoff aus. Die Rückgewinnung durch Saugfiltration erbrachte das Produkt (51,0 g, 81,5%).
Schritt D: Herstellung von 5,6-(Isopropylendioxy)indol (20)
Einer Lösung von 19 (50,0 g, 171,7 mmol) in Methanol und THF (400 ml, 1:1) wurde Raney-Nickel (4,0 ml) und Hydrazinhydrat (3 × 7,13 ml, 686,6 mmol) in drei gleichen Anteilen alle 30 Minuten bei Raumtemperatur unter Stickstoff zugegeben. Die Lösung wurde bei 45°C für zwei Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Katalysator wurde mittels Filtration durch ein Kieselgurbett entfernt, dann dreimal mit Methylenchlorid gewaschen. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand azeotropisch mit Toluol (100 ml) getrocknet, um ein Rohöl zu erhalten. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ethylacetat/Hexan (30/70%) erbrachte das Titel-Intermediat als einen gebrochen weißen Feststoff, der über Rekristallisation mit Benzol/Petroleumether (2:8) weiter gereinigt wurde, um das Rohprodukt zu ergeben (15,1 g, 46,2%).
Schritt E: Herstellung von 3-[(4,5-Isopropylendioxy-1H-indol-3-yl)]-4-[5-benzyloxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (21)
Einer Lösung von 20 (2,27 mg, 12,02 mmol) in THF (150 ml) wurde Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS, 12,02 ml, 12,02 mmol, 1 M in THF) bei 0°C zugegeben und die Lösung für 40 Minuten gerührt. Eine Lösung von 6 (5,0 g, 4,81 mmol) in THF (50 ml) wurde dem obigen Gemisch langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten bei 0°C. Das Gemisch wurde mit EtOAc (400 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Solelösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, um ein Rohgemisch zu ergeben. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ethylacetat/Hexan (40/60%) erbrachte das Titel-Intermediat als einen roten Feststoff (3,02 g, 54,71%).
Schritt F: Herstellung von 2,3-Isopropylendioxy-6-benzyloxymethyl-9-benzyloxy-12-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (22)
Einer Lösung von 21 (1,60 g, 1,39 mmol) in DMF (85 ml) wurde Palladium(II)trifluoracetat (657 mg, 2,93 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde bei 80°C für zwei Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit EtOAc (250 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung (150 ml) und H₂O (3 × 150 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit EtOAc/Hexan (3:7) erbrachte 1,02 g (63,7%) als einen gelben Feststoff.
Schritt G: Herstellung von 2,3-Isopropylendioxy-6-hydroxymethyl-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (23)
Einer Lösung von 22 (280 mg, 0,244 mmol) in HOAc (12 ml) wurde Palladiumhydroxid (100 mg) zugegeben. Die Reaktion wurde unter einer Atmosphäre von H₂ (50 psi) bei Raumtemperatur für 60 Std. geschüttelt. Das Gemisch wurde durch einen Acrodisc-Spritzenfilter filtriert und in vacuo konzentriert, was einen rohen Feststoff ergab. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit MeOH/AcOH/EtOAc (12/1/87) erbrachte 135 mg (91,4%) als einen gelben Feststoff.
Schritt H: Synthese von 2,3-Isopropylendioxy-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Ic)
Einer Lösung von 23 (100,0 mg, 0,165 mmol) in MeOH (7,0 ml) wurde NH₄OH (6,0 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt, dann in vacuo konzentriert, was einen rohen Feststoff ergab. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit MeOH/HOAc/EtOAc (12/1/87) erbrachte 81,0 g (85,3%) als einen gelben Feststoff.
BEISPIEL 4 Synthese von 2,3-Dimethoxy-9-hydroxy-13-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Id)
Schritt A: Herstellung von 3-[(4,5-Dimethoxy-1H-indol-3-yl)]-4-[5-benzyloxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (24)
Einer Lösung von 5,6-Dimethoxyindol (441 mg, 2,49 mmol) in THF (50 ml) wurde Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS, 4,98 ml, 4,98 mmol, 1 M in THF) bei 0°C zugegeben, und die Lösung wurde für 40 Minuten gerührt. Eine Lösung von 6 (2,25 g, 2,16 mmol) in THF (30 ml) wurde dem obigen Gemisch langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten bei 0°C. Das Gemisch wurde mit EtOAc (250 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, was ein Rohgemisch ergab. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu Ethylacetat/Hexan (60/40%) erbrachte das Titel-Intermediat als einen roten Feststoff (2,79 g, 98,6%).
Schritt B: Herstellung von 2,3-Dimethoxy-6-benzyloxymethyl-9-benzyloxy-12-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (25)
Einer Lösung von 24 (1,50 g, 1,32 mmol) in DMF (60 ml) wurde Palladium(II)trifluoracetat (923 mg, 2,77 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde bei 80°C für zwei Stunden gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit EtOAc (250 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung (150 ml) und H₂O (3 × 150 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Eluieren mit EtOAc/Hexan (3:7) erbrachte 769 mg (51,4%) als einen gelben Feststoff.
Schritt C: Herstellung von 2,3-Isopropylendioxy-9-hydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (Id)
Einer Lösung von 25 (600 mg, 0,529 mmol) in HOAc (25 ml) wurde Palladiumhydroxid (600 mg) zugegeben. Die Reaktion wurde unter einer Atmosphäre von H₂ (50 psi) bei Raumtemperatur für 60 Stunden in einem Parr-Schüttler geschüttelt. Die Lösung wurde durch einen Acrodisc-Spritzenfilter filtriert und in vacuo konzentriert, um einen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wurde in MeOH (150 ml) und wässrigem NH₄OH (50 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt, dann in vacuo konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit MeOH/HOAc/EtOAc (12/1/87) erbrachte 166 mg (60,0%) des gewünschten Produkts als einen gelben Feststoff.
BEISPIEL 5 Synthese von 2,3-Ethylendioxy-9-hydroxy-13-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (IIa)
Schritt A: Herstellung von 3-Brom-4-(4,5-ethylendioxy-1H-indol-3-yl)-N-benzyloxymethylmaleimid (26)
Einer Lösung von 4 (2,1 g, 12,0 mmol) in Benzol (100 ml) wurde Methylmagnesiumiodid (4,4 ml, 13,19 mmol, 3 M in Ether) bei 0°C zugegeben. Nach Rühren für eine Stunde wurde eine Lösung von N-Benzyloxymethyl-3,4-dibrommaleimid (4,5 g, 12,0 mmol) in Benzol (30 ml) und THF (50 ml) langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C für 30 Minuten gerührt und dann für eine Stunde auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (250 ml) verdünnt, dann mit HCl (100 ml, 0,3 M), NaHCO₃ (100 ml) und H₂O (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan zu EtOAc/Hexan (3:2) erbrachte das Titel-Intermediat als einen gelben Feststoff (2,83 g, 50,5%).
Schritt B: Herstellung von 3-Brom-4-[4,5-ethylendioxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (27)
Einer Lösung von 26 (2,7 g, 5,75 mmol), 2,3,4,5-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose (9,33 g, 17,26 mmol) und Triphenylphosphin (4,53 g, 17,26 mmol) in THF (150 ml) bei –78°C wurde Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) (3,4 ml, 17,26 mmol) zugetropft. Das Rühren wurde bei –78°C für 3 Stunden fortgesetzt, woraufhin die Lösung auf 0°C mit Hilfe eines Eiswasserbades erwärmt und das Rühren für 2 Stunden fortgesetzt wurde. Das Gemisch wurde mit EtOAc (300 ml) verdünnt, dann mit HCl, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Toluol-Gradienten zu Toluol/EtOAc (25:1) erbrachte das Titel-Intermediat als einen gelben Feststoff, 3,15 g (55,3%).
Schritt C: Herstellung von 3-(5-Benzyloxy-1H-indol-3-yl)-4-[4,5-ethylendioxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (28)
Einer Lösung von 5-Benzyloxyindol (1,52 g, 6,8 mmol) in THF (70,0 ml) wurde Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS, 6,8 ml, 6,8 mmol, 1 M in THF) bei 0°C zugegeben, und die Lösung wurde für 30 Minuten gerührt. Eine Lösung von 27 in THF (80 ml) wurde dem obigen Gemisch langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 30 Minuten bei 0°C. Das Gemisch wurde mit EtOAc (300 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, was das Rohprodukt ergab. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu EtOAc/Hexan (2:3) erbrachte das Titel-Intermediat als einen roten Feststoff, 1,62 g (52,6%).
Schritt D: Herstellung von 2,3-Ethylendioxy-6-benzyloxymethyl-9-benzyloxy-13-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (25)
Einer Lösung von 28 (1,0 g, 0,882 mmol) in DMF (50 ml) wurde Palladium(II)trifluoracetat (615,4 mg, 1,85 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde bei 80°C für 1 Stunde gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit EtOAc (350 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung (150 ml) und H₂O (3 × 150 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit EtOAc/Hexan (3:7) erbrachte 471,0 g (47,2%) des gewünschten Produkts als einen gelben Feststoff.
Schritt E: Synthese von 2,3-Ethylendioxy-9-hydroxy-13-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (IIa)
Einer Lösung von 29 (350 mg, 0,309 mmol) in HOAc (12 ml) wurde Palladiumhydroxid (350 mg) zugegeben. Die Reaktion wurde unter einer Atmosphäre von H₂ (50 psi) bei Raumtemperatur für 62 Stunden in einem Parr-Schüttler geschüttelt. Die Lösung wurde durch einen Acrodisc-Spritzenfilter filtriert und in vacuo konzentriert, um einen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wurde in MeOH (200 ml) und wässrigem NH₄OH (10 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, dann in vacuo konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Die Flash-Kiesegel-Chromatographie unter Eluieren mit MeOH/HOAc/EtOAc (12/1/87) erbrachte 164 mg (94,5%) des gewünschten Produkts als einen gelben Feststoff.
BEISPIEL 6 Synthese von 2,3-Methylendioxy-9-hydroxy-13-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (IIb)
Schritt A: Herstellung von 3-Brom-4-(4,5-methylendioxy-1H-indol-3-yl)-N-benzyloxymethylmaleimid (30)
Einer Lösung von 13 (2,7 g, 16,75 mmol) in Benzol (100 ml) wurde Methylmagnesiumiodid (6,14 ml, 18,42 mmol, 3 M in Ether) bei 0°C zugegeben. Die Lösung wurde für 1 Stunde gerührt, woraufhin eine Lösung von N-Benzyloxymethyl-3,4-dibrom maleimid (6,28 g, 16,75 mmol) in Benzol (30 ml) und THF (50 ml) langsam zugegeben wurde. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0°C für 30 Minuten gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und für 1 Stunde gerührt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (200 ml) verdünnt, dann mit HCl (100 ml, 0,3 M), NaHCO₃ (100 ml) und H₂O (100 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Auskristallisation des Rohöls mit MeOH erbrachte das Titel-Intermediat als einen gelben Feststoff (2,92 g, 38,2%).
Schritt B: Herstellung von 3-Brom-4-[5,6-methylendioxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (31)
Einer Lösung von 30 (2,3 g, 5,05 mmol), 2,3,4,5-Tetra-O-benzyl-D-glucopyranose (8,2 g, 15,2 mmol) und Triphenylphosphin (4,0 g, 15,2 mmol) in THF (150 ml) bei –78°C wurde Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) (2,98 ml, 15,2 mmol) zugetropft. Die Lösung wurde bei –78°C für 3 Stunden gerührt, dann auf 0°C erwärmt und für weitere 2 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde mit EtOAc (300 ml) verdünnt, dann mit HCl, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Toluol-Gradienten zu Toluol/EtOAc (25:1) erbrachte das Titel-Intermediat als einen gelben Feststoff, 3,05 g (61,8%).
Schritt C: Herstellung von 3-(5-Benzyloxy-1H-indol-3-yl)-4-[5,6-methylendioxy-1-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-1H-indol-3-yl]-N-benzyloxymethylmaleimid (32)
Einer Lösung von 5-Benzyloxyindol (822,0 g, 3,68 mmol) in THF (35 ml) wurde Lithiumhexamethyldisilazid (LiHMDS, 3,68 ml, 3,68 mmol, 1 M in THF) bei 0°C zugegeben, und die resultierende Lösung wurde für 40 Minuten gerührt. Eine Lösung von 31 in THF (20 ml) wurde dem obigen Gemisch langsam zugegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten bei 0°C. Das Gemisch wurde mit EtOAc (300 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit einem Gradienten von Hexan (100%) zu EtOAc/Hexan (2:3) erbrachte das Titel-Intermediat als einen roten Feststoff (1,56 g, 91,2%).
Schritt D: Herstellung von 2,3-Methylendioxy-6-benzyloxymethyl-9-benzyloxy-13-(2,3,4,5-tetra-O-benzyl-β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (33)
Einer Lösung von 32 (1,45 g, 1,294 mmol) in DMF (75 ml) wurde Palladium(II)trifluoracetat (904 mg, 2,72 mmol) zugegeben, und die Lösung wurde bei 80°C für 1 Stunde gerührt. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und mit EtOAc (350 ml) verdünnt, dann mit HCl (1 M), NaHCO₃, Sole- bzw. Salzlösung und H₂O (3 × 150 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit EtOAc/Hexan (3:7) erbrachte 1,05 g (72,6%) des gewünschten Produkts als einen gelben Feststoff.
Schritt E: Synthese von 2,3-Methylendioxy-9-hydroxy-13-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion (IIb)
Einer Lösung von 33 (330 mg, 0,268 mmol) in HOAc (14 ml) wurde Palladiumhydroxid (300 mg) zugegeben. Die Reaktion wurde unter einer Atmosphäre von H₂ (50 psi) bei Raumtemperatur für 60 Stunden in einem Parr-Schüttler geschüttelt. Die Lösung wurde durch einen Acrodisc-Spritzenfilter filtriert und in vacuo konzentriert, um das Rohprodukt als einen Feststoff zu erhalten. Der Feststoff wurde in MeOH (20,0 ml) und wässrigem NH₄OH (30,0 ml) gelöst, bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt und dann in vacuo konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Die Flash-Kieselgel-Chromatographie unter Eluieren mit MeOH/HOAc/EtOAc (12/1/87) erbrachte 92,0 mg (62,7%) als einen gelben Feststoff.
BEISPIEL 7 Typische experimentelle Vorgehensweise für die Syntheseverbindungen mit der folgenden allgemeinen Formel:
Einer Lösung des Anhydrids YPX-2-21 (32 mg, 0,05834 mmol) in DMF (1,8 ml) wurde das geeignete Hydrazid oder Amin [0,5834 mmol] zugesetzt (siehe Tabelle 1). Die Reaktion wurde unter eine Stickstoff-Atmosphäre bei 95°C für 2 Stunden gestellt. Das Gemisch wurde mit Wasser (12 ml) verdünnt und bei 0°C für zwei Stunden gerührt. Das Präzipitat wurde filtriert und mit Wasser und Ethylether gewaschen, um das Produkt zu erhalten (siehe Tabelle 1 für Ausbeuten).
Tabelle 1
BEISPIEL 8
Biologische Auswertung

a) Topoisomerase-I-Assay. Reaktionspuffer (10,3 μl H₂O, 2,0 μl 10 × Puffer, 1,5 μl an 100 μM MgCl₂ und 3,2 μl an 500 mM KCl) wurde zubereitet und auf Eis gehalten. 10 × Puffer wurde durch Mischen von 2 ml an 2 M Tris pH 7,5, 15,3 μl an 10% DTT, 100 μl an 0,5 M EDTA, 75 μl an 20 mg/ml BSA und 7,935 μl H₂O hergestellt. Test hemmer wurden in DMSO bei solchen Konzentrationen präpariert, dass das endgültige Inkubationsgemisch 5% DMSO war. Das DNA-Gemisch wurde durch Lösen von 55 ml an pHOT1-DNA-Lösung (0,25 μg/μl) mit 715 μl Reaktionspuffer hergestellt. Topo-I-Gemisch wurde durch Mischen von 14 μl der Topo-I-Lösung (2 Einheiten/μl) mit 266 μl des Reaktionspuffers hergestellt. Proteinase-K-Lösung wurde als 10 mg/ml in 1% SDS frisch zubereitet. Der Gelbeladungspuffer wurde durch Lösen von 1 mg Bromphenol-Blau in 100 μl H₂O und dann Zugeben von 900 μl an 50% Glycenol hergestellt. Topotecan (Camptosar) und 3,9-Dihydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13-tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion¹¹ (ALS-007) wurden als positive Kontrollen verwendet. Der Assay wurde wie folgt durchgeführt. Das DNA-Gemisch (14 μl) wurde Probenröhrchen zugegeben, die 1 μl der Testhemmerlösung enthielten, und auf Eis gelagert. Als nächstes wurden 5 μl Topo-I-Gemisch zugegeben, die Lösung wurde mit dem Pipettor gemischt, dann unter sanftem Rütteln in einem 37°C-Wasserbad für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden über Zugabe von 2 μl Proteinase-K-Lösung gestoppt, die Inkubation für weitere 30 Minuten fortgesetzt, dann auf Eis platziert. 2,2 μl an 5 M NaCl und 75 μl EtOH wurde den Röhrchen zugegeben, die Röhrchen wurden kurz gevortext, dann auf Trockeneis für 1 Stunde platziert. Die DNA wurde durch Zentrifugieren bei 16.000 × g für 10 Minuten bei 4°C pelletiert. EtOH wurde aus jedem Röhrchen unter Verwendung einer Gelbeladungs-Pipettenspitze entfernt, und das DNA-Pellet wurde in 18 μl Reaktionspuffer und 2 μl Gelbeladungspuffer resuspendiert. Die Proben wurden kurz gevortext, dann für 15 Sekunden in einer Mikrozentrifuge verwirbelt, um die gesamte Flüssigkeit auf den Boden der Röhrchen zu drängen. Die Proben wurden auf 1% Agarosegel aufgebracht, das mit 1 × TBE, enthaltend 2 μg/ml Chlorochin, zubereitet war. Die Gele wurden bei 35 V für 15 Stunden in 1 × TBE laufen gelassen. Die Gele wurden mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid in 1 × TBE für 1 Stunde angefärbt, dann für 30 Minuten in H₂O entfärbt. Die Gele wurden mit einer Digitalkamera fotografiert und die digitalisierten Bilder unter Verwendung einer NIH-Software analysiert. Die IC₅₀-Werte wurden durch Vergleichen der superverdrillten DNA-Bandendichte (negative Kontrollen, enthaltend 5 μl Reaktionspuffer anstelle von Topo-I-Gemisch) mit den superverdrillten DNA-Banden, die in den Testproben verblieben waren, bestimmt. Tabelle 2. Hemmung der humanen Topoisomerase I durch Indolcarbazol-Analoga
b.) in vitro-Cytotoxizitäts-Assay. 96-Well-Gewebekultur-Clusterplatten wurden mit 100 μl der Zellsuspension (5 × 10³ Zellen/ml) besät und über Nacht für die Zellverankerung und Akklimatisation inkubiert. Die Zellen wurden unter sterilen Bedingungen in RPMI 1640 oder DMEM mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Natriumbicarbonat (komplettes Medium) vermehrt und bei 37°C inkubiert. Die Testverbindungen wurden in DMSO zubereitet und dann in komplettem Medium verdünnt. Ein Bereich von acht Konzentrationen wurde für jeden Testwirkstoff angewendet, um die Cytotoxizität festzustellen, bei acht Replikaten für jede Konzentration. Die gesamte Dosierung wurde unter Verwendung eines Biomek 2000 Roboter-basierten Liquid Handlers vorgenommen. Die Platten wurden bei 37°C mit 5% CO₂ und 95% relativer Feuchtigkeit inkubiert. Die Daten wurden auf die Cytotoxizität unter Verwendung des MTS-Assays 3–5 Tage (in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Zelllinien) nach Beginn der Behandlung analysiert. MTS (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) ist durch lebensfähige Zellen zu einem löslichen Formazan bioreduziert, das bei 490 nm absorbiert, was eine einfache spektrophotometrische Messung der lebensfähigen Zellen erlaubt. Topotecan (Camptosar) und 3,9-Dihydroxy-12-(β-D-glucopyranosyl)-6,7,12,13- tetrahydroindolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazol-5,7-dion¹¹ (ALS-007) wurden als positive Kontrollen verwendet.
c) MTS-Assay. Eine Lösung von 40 μl MTS/PES-Lösung (bezogen von Promega Corporation) wurde jedem Well zugegeben und für ein bis vier Stunden inkubiert. Die Absorbanz des Formazan in jeder Monoschicht wurde bei 490 nm auf einem Coulter-Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Die Daten wurden in einem Spreadsheet-Programm verarbeitet, um eine Dosis-Reaktions-Kurve zu erhalten, die die Bestimmung der IC₅₀ erlaubt. Tabelle 2. Wachstums-inhibitorische Aktivität gegen verschiedene humane Tumorzelllinien.

Wie durch die Ergebnisse in Tabelle 3 veranschaulicht, erbringen die in dieser Erfindung beschriebenen Verbindungen bei einem Seite-an-Seite-Vergleich eine stärker hemmende Wirkung gegen humane Topo I als die Kontrollverbindungen Topotecan (ein klinisch eingesetzter Topo-I-Hemmer/Antitumormittel) und ALS-007, ein zuvor beschriebenes experimentelles Indolcarbazol¹¹. Außerdem zeigen die in dieser Erfindung beschriebenen Verbindungen bei einem Seite-an-Seite-Vergleich in vitro Cytotoxizitätsprofile gegen eine Reihe von drei humanen Tumorzelllinien, die den beiden Kontrollverbindungen ähnlich sind (Tabelle 2).
ZITIERTE LITERATURSTELLEN

(1) Champoux, J. J. Adv. Pharmacol. 1994, 29A, 71–82.
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(3) Pommier, Y.; Tanizawa, A.; Kohn, K. W. Adv. Pharmacol. 1994, 29B, 73–92.
(4) Kojiri, K.; Kondo, H.; Arakawa, H.; Ohkubo, M.; Suda, H. U.S. Patent 5,591,842 Jan. 7, 1997.
(5) Kojiri, K.; Kondo, H.; Arakawa, H.; Ohkubo, M.; Suda, H. U.S. Patent 5,922,860 Jul. 13, 1999.
(6) Kojiri, K.; Kondo, H.; Arakawa, H.; Ohkubo, M.; Suda, H. U.S. Patent 5,668,271 Sep. 16, 1997.
(7) Kojiri, K.; Kondo, H.; Arakawa, H.; Ohkubo, M.; Suda, H. U.S. Patent 5,804,564 Sep. 8, 1998.
(8) Arakawa, H.; Iguchi, T.; Yoshinari, K.; Kojiri, K.; Suda, H.; Okura, A. Jpn. J. Cancer Res. 1993, 84, 574–581.
(9) Arakawa, H.; Tomoko, I.; Masashi, M.; Yoshinari, T.; Katsuhisa, K.; Hiroyuki, S.; Okura, A.; Nishimura, S. Cancer Res. 1995, 55, 1316–1320.
(10) Yoshinari, T.; Ohkubo, M.; Fukasawa, K.; Egashira, S.; Hara, Y.; Matsumoto, M.; Nakai, K.; Arakawa, H.; Morishima, H.; Nishimura, S. Cancer Res 1999, 59, 4271–4275.
(11) Zembower, D. E.; Zhang, H.; Lineswala, J. P.; Kuffel, M. J.; Aytes, S. A.; Ames, M. M. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 145–150.
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(13) Kaneko, T.; Wong, H.; Okamoto, K. T.; Clardy, J. Tetrahedron Lett. 1985, 26, 4015–4018.
(14) Ohkubo, M.; Nishimura, T.; Jona, H.; Honma, T.; Ito, S.; Morishima, H. Tetrahedron 1997, 53, 5937–5950.

Claims

Eine Verbindung der allgemeinen Formel I:
oder der allgemeinen Formel II:
worin R₁ und R₂ unabhängig voneinander aus H, C_1-6Alkyl, Aryl-C_1-6Alkyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-6Alkyl, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Al kyl)amino-C_1-8Alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl, Aryl, oder einem Heterocyclus bzw. einer heterocyclischen Verbindung bestehen, wobei Aryl oder der Heterocyclus jeweils unsubstituiert oder substituiert sein kann mit einem oder mehr von C_1-6Alkyl, C_1-6Alkoxy, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Alkyl)amino-C_1-8Alkyl oder R₁ und R₂ kombinieren um eine Methylendioxy-, Ethylendioxy-, Propylendioxy- oder eine Butylendioxy-Gruppe zu bilden, wobei eines oder mehrere der Kohlenstoffatome mit F, Cl, Br, I, C_1-6Alkyl, Aryl-C_1-6Alkyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-6 Alkyl, C_1-6Alkoxy, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8 Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Alkyl)amino-C_1-8Alkyl, Cyclo(C_3-6)Alkyl, Aryl oder einem Heterocyclus bzw. einer heterocyclischen Verbindung substituiert sein können; R₃ aus X oder CO-X oder (CH₂)_1-6-X oder NHX oder NX₂ oder NH(CH₂)_1-6-X oder NHCOX oder NHCO(CH₂)_1-6-X besteht, worin X besteht aus H, OH, NH₂, CN, CHO, 2-Hydroxybutyl, 3-Sulfon, 2-Hydroxymethyl-3-Hydroxypropyl, Sulfonyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-8Alkyl, (C_1-8)Alkyl, C_1-8Alkoxy, Cyclo(C_3-6)Alkyl, Hydroxy (C_1-6)Alkyl, Hydroxy(C_1-6)Alkoxy, Dihydroxy(C_1-6)Alkyl, Aryloxy, Aryl, einem Heterocyclus, Gluconyl, Mannonyl, Gulonyl, Glucuronyl, Guluronyl, Mannuronyl, Ethylmorpholinyl; R₄ aus H, OH, NH₂, C_1-6Alkyl, Aryl-C_1-6Alkyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-6Alkyl, C_1-6Alkoxy, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Alkyl)amino-C_1-8Alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl, Aryl oder einem Heterocyclus besteht, oder einem pharmazeutisch zulässigen Salz davon.
Eine Verbindung nach Anspruch 1, worin R₄ aus H, NH₂, C_1-6Alkyl, Aryl-C_1-6Alkyl, mono- oder polyfluoriertem C_1-6Alkyl, C_1-6Alkoxy, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Alkyl)amino-C_1-8Alkyl, Cyclo(C_3-6)alkyl, Aryl oder einem Heterocyclus bzw. einer heterocyclischen Verbindung besteht, oder worin R₁ und R₂ kombinieren um einen Methylendioxyring, einen Ethylendioxyring oder einen Isopropylendioxyring zu bilden, und R₃ H ist und R₄ OH ist; oder worin R₁ und R₂ beide CH₃ sind, R₃ H ist und R₄ OH ist; oder worin R₁ und R₂ beide H sind, R₃ H ist und R₄ OH ist; oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Die Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ und R₂ sich verbinden um einen Methylendioxyring zu bilden, R₃ H ist und R₄ OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ und R₂ kombinieren bzw. sich verbinden um einen Ehtylendioxyring zu bilden, R₃ H ist und R₄ OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ und R₂ kombinieren bzw. sich verbinden um einen Isopropylendioxyring zu bilden, R₃ H und R₄ OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ und R₂ beide CH₃ sind, R₃ H ist und R₄ OH ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ und R₂ beide H sind, R₃ H ist und R₄ OH ist.
Eine Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Aryl aus Phenyl, Naphthyl, Phenanthracenyl, oder Inda nyl besteht, wobei jedes unsubstituiert oder mit einem oder mehreren von OH, CN, NO₂, NH₂, C_1-6Alkyl, C_1-6Alkoxy, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Alkyl)amino-C_1-8Alkyl substituiert sein kann.
Eine Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Heterocyclus aus Pyridyl, Diazinyl, Pyrimidinyl, Pyrrolidinyl, Piperazinyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Imidazolidinyl, Imidazolenyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Thiazolyl, Thiazolidinyl, Thiazolinyl, Isothiazolyl, Isothiazolidinyl, Isothiazolinyl, Furanyl, Thiophenyl, Indolyl, Benzthiopheneyl, Benzofuranyl, 4-Methyl 2,3 Dihydro Isocytosin, Benzimidazolyl, Benzothiozolyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin; 4-Methyl 2,3 Dihydro Isocytosin, 1,4-Dimethylpiperazin-2-Formyl, Piperidin, Morpholin, Isoindolyl, Isobenzothiophenyl oder Isobenzofuranyl, 5-Methoxy Pyrimidinyl, (1,2,4)Triazin-3,5-Dion-6-yl, 6-Mercaptopyrimidin-4yl, 4-Methyl Piperazinyl, Pyranyl, 1-Methyl Pyrrol-2-yl, 2-Methyl Thiazol-4-yl, Furan-2-yl, Thiophen-2-yl, Thiophen-3-yl oder 3'-Methoxy Thiophen-3-yl, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin, Piperidin, 4-Methyl 2,3 Dihydro Isocytosin, -(1H-1,2,4-Triazol-1yl), 1,4-Dimethylpiperazin, 4-Methyl Piperazinyl, Morpholinyl besteht, wobei jedes unsubstituiert oder mit einem oder mehreren von OH, CN, NO₂, NH₂, C_1-6Alkyl, C_1-6Alkoxy, C_1-6Alkylamino, Di(C_1-6Alkyl)amino, C_1-8Alkylamino-C_1-8Alkyl, Di(C_1-6Alkyl)amino-C_1-8Alkyl substituiert sein kann.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, allein oder in Verbindung mit einem Träger, bei der Herstellung eines Medikaments, um Topoisomerase I Aktivität zu hemmen bzw. zu verhindern.
Eine Zusammensetzung zum Verhindern von Topoisomerase I Aktivität mit einer wirksamen Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Verbindung mit einem Träger oder einem pharmazeutischen Hilfsmittel oder einer additiven Substanz.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9.