DE60312494T2

DE60312494T2 - Optisch aktives pyridinderivat und medikament, das dieses enthält

Info

Publication number: DE60312494T2
Application number: DE60312494T
Authority: DE
Inventors: Toshiki Ikoma-shi MURATA; Sachiko Aichi-ken SAKAKIBARA; Takashi Nara-shi YOSHINO; Hiroki Nara-shi SATO; Yuji Kusatsu-shi KORIYAMA; Noriko Nara-shi NUNAMI; Megumi Nara-shi YAMAUCHI; Keiko Nara-shi FUKUSHIMA; Rolf Grosser; Kinji Soraku-gun FUCHIKAMI; Kevin San Diego BACON; Timothy Guilford LOWINGER
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2003-03-03
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2023-03-04
Also published as: TW200403247A; JP2003277383A; PE20040242A1; JP2005526074A; CA2478942A1; UY27719A1; US20050215547A1; ES2283795T3; DE60312494D1; AU2003215624A1; WO2003076447A1; AR038950A1; EP1487842A1; HN2003000098A; US20090054424A1; EP1487842B1; US7375103B2

Description

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on, ein Salz davon sowie pharmazeutische Präparate, die diese enthalten. Das (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on der vorliegenden Erfindung hemmt IκB-Kinase-β-(IKK-β-)Aktivität und demnach die Kernfaktor-κB-(NF-κB-)Aktivität und kann für die Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit NF-κB-Aktivität in Zusammenhang stehen, insbesondere für die Behandlung von Entzündungserkrankungen.
Stand der Technik
Kernfaktor κB (NF-κB) gehört zu einer Familie von miteinander eng verwandten homo- und heterodimeren Transkriptionsfaktorkomplexen, die aus verschiedenen Kombinationen der ReI/NF-κB-Familie der Polypeptide bestehen. NF-κB und verwandte Elemente der Familie sind an der Regulierung von mehr als 50 Genen beteiligt, die mit Immun- und Entzündungsreaktionen in Zusammenhang stehen (P.J. Barnes, M. Karin, N. Engl. J. Med. 336, 1066–1071 (1997), und P.A. Baeuerle, V.R. Baichwal, Adv. Immunol. 65, 111–137 (1997)). In den meisten Zelltypen ist NF-κB als Heterodimer vorhanden und umfasst eine 50-kDa- und eine 65-kDa-Untereinheit (p50/ReIA). Das Heterodimer ist im Cytoplasma gemeinsam mit dem Inhibitor der NF-κB-(Iκ-B-)Familie der Proteine maskiert, um in einem inaktiven Zustand gehalten zu werden. Proteine der 1κB-Familie maskieren das Kerntranslokationssignal von NF-κB. Bei der Stimulierung von Zellen mit verschiedenen Cytokinen (z.B. TNF-α, IL-1), einem CD40-Ligand, Lipopolysaccarid (LPS), Oxidationsmitteln, Mitogenen (z.B. Phorbolester), Viren oder vielen anderen werden 1κB-Proteine an bestimmten Serinresten phosphoryliert, poly-ubiquitiniert und dann über einen Proteasom-abhängigen Weg abgebaut. Von IκB befreit, ist das aktive NF-κB in der Lage, zu dem Kern zu translozieren, wo es selektiv an bevorzugte genspezifische Enhancer-Sequenzen bindet. Zu den Genen, die durch NF-κB reguliert werden, gehören viele, die für Pro-Entzündungsmediatoren, Cytokine, Zelladhäsionsmoleküle und Akutphasenproteine kodieren. Das Exprimieren von mehreren dieser Cytokine und Mediatoren kann wiederum zu einer weiteren Aktivierung von NF-κB durch autokrine und parakrine Mechanismen führen.
Es bestehen Hinweise darauf, dass NF-κB eine zentrale Rolle bei vielen Entzündungserkrankungen; wie z.B. Atemwegsentzündungen und Asthma, spielt (L. Yang et al., J. Exp. Med. 188, 1739–1750 (1998), L.A. Hart et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 1585–1592 (1998), M.A. Stacey et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 522–526 (1997), P. Barnes und I.M. Adcock, Trends Pharmacol. Sci. 18, 46–50 (1997)).
Außerdem wurde gezeigt, dass Glucocorticoide, die für die Behandlung von Asthma bei weitem am wirksamsten sind, Atemwegsentzündungen dadurch verhindern, dass sie direkt mit den Transkriptionsfaktoren NF-κB und dem aktivierenden Peptid-1 (AP-1) in Wechselwirkung treten und deren Aktivität hemmen (P. Barnes, Pulmon. Pharmacol. Therapeut. 10, 3–19 (1997), und A. Dumont et al., Trends Biochem. Sci. 23, 233–235 (1998)).
Im Allgemeinen ruft die Hemmung von NF-κB-Aktivierung starke Antientzündungswirkungen hervor, die den durch Steroide verursachten ähnlich oder sogar stärker als diese sind. In der Folge sollte NF-κB-Hemmung die Entzündungssymptome von Asthma; allergischer Rhinitis; atopischer Dermatitis; Urtikaria; Konjunktivitis; Frühjahrskatarrh; rheumatoider Arthritis; systemischem Lupus erythematodes; Psoriasis; diabrotischer Kolitis; systemischem inflammatorischem Reaktionssyndrom; Sepsis; Polymyositis; Dermatomyositis; Polyarteriitis nodosa; dem Sharp-Syndrom; dem Sjögren-Syndrom; und Gicht und dergleichen verbessern.
Außerdem deuten verschiedene Studien darauf hin, dass NF-κB eine grundlegende Rolle bei der neoplastischen Transformation spielt. NF-κB steht beispielsweise mit der In-vitro- oder In-vivo-Zelltransformation als Folge von Gen-Überexpression, -Amplifikation, -Neuordnung oder -Translokation in Zusammenhang (F. Mercurio und A.M. Manning, Oncogene 18, 6163–6171 (1999)). Bei bestimmten menschlichen Lymphtumorzellen werden die Gene von Elementen der NF-κB-Familie neu angeordnet oder amplifiziert. Seine mögliche Rolle in der Krebspathologie wird in M.W. Mayo, A.S. Baldwin, Biochemica et Biophysica Acta 1470, M55–M62 (2000), offenbart. M.W. Mayo et al. offenbaren, dass das Hemmen von NF-κB zur Blockierung der Initiation und/oder des Fortschreitens von bestimmten Krebsarten, insbesondere von kolorektalem Krebs, führt.
NF-κB kann schließlich auch an der Steuerung des Nervenzelltodes beteiligt sein. Es wurde gezeigt, dass NF-κB bei fokaler Hirnischämie aktiviert wird und den Zelltod fördert (Nature medicine, Band 5, Nr. 5 (Mai 1999)).
Umfassende Forschung in den letzten Jahren führte dazu, dass ein IκB-Kinase-(IKK-)Komplex als für die signal-induzierte IκB-Phosphorylierung verantwortlich identifiziert wurde (F. Mercurio und A.M. Manning, Current Opinion in Cell Biology 11, 226–232 (1999), F. Mercurio und A.M. Manning, Oncogene 18, 6163–6171 (1999), M. Barnkett und T.D. Gilmore, Oncogene 18, 6910–6924 (1999), E. Zandi und M. Karin, 19, 4547–4551 (1999), A. Israel, Trends in Cell Biology 10, 129–133 (2000), und E.N. Hatada et al., Current Opinion in Immunology 12, 52–58 (2000)). Es ist sehr wahrscheinlich, dass dieser Komplex die Integrationsstelle für die verschiedenen Stimuli ist, die zu NF-κB-Aktivierung führen. Der IKK-Komplex (Molekulargewicht: 700–900 kDa) besteht aus verschiedenen Proteinen, umfassend zwei homologe IκB-Kinasen, als IKK-α und IKK-β bezeichnet, eine Stromauf-Kinase, NIK, die NF-κB induziert, ein als IKAP bezeichnetes Gerüstprotein, das die drei Kinasen bindet, und eine Regulator-Untereinheit IKK-γ, die vorzugsweise mit IKK-β wechselwirkt.
IKK-β ist eine Serin-Threonin-Kinase mit 756 Aminosäuren, die zu 52 % mit IKK-α ident ist und dieselbe Struktur wie dieses aufweist (F. Mercurio et al., Science 278, 860–866 (1997), J.D. Woronicz et al., Science 278, 866–869 (1997), E. Zandi et al., Cell 91, 243–252 (1997)). IKK-β bildet mit IKK-α in vitro und in Zellen Homodimere bzw. Heterodimere. IKK-β wechselwirkt auch mit IKK-γ, IKAP, NIK und IκBα. Rekombinantes IKK-β phosphoryliert IκBα und IκBβ bei bestimmten Serinresten mit gleicher Wirksamkeit (J. Li et al., J. Biol. Chem. 273, 30736–30741 (1998), E. Zandi, Y. Chen, M. Karin, Science 281, 1360–1363 (1998)). IKK-β weist im Vergleich mit IKK-α eine höhere konstitutive Kinase-Aktivität auf. Das stimmt mit Daten überein, die darauf hindeuten, dass eine Überexpression von IKK-β die Transkription von einem NF-κB-abhängigen Reportergen mit einer höheren Wirksamkeit als IKK-α aktiviert. Es wurde gezeigt, dass IKK-β in verschiedenen Zelllinien oder frischen menschlichen Zellen in Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie z.B. TNF-α, IL-1β, LPS, Anti-CD3/Anti-CD28-Co-Stimulierung, Protein-Kinase C und Calcineurin, B-Zellen-Rezeptor/CD40-Ligandenstimulation und Vanadat, aktiviert wird. IKK-β ist in den Fibroblastenähnlichen Synoviozyten (FLS), die aus der Synovialis von Patienten, die an chronischer Polyarthritis oder Osteoarthritis leiden, isoliert wurden, aktiviert (E. Zandi et al., Cell 91, 243–252 (1997), M.A. O'Connell et al., J. Biol. Chem. 273, 30410–30414 (1998), S.J. Kempiak et al., J. Immunol. 162, 3176–3187 (1999)). Außerdem kann IKK-β durch die strukturell verwandten Stromauf-Kinasen MEKK-1 und NIK aktiviert werden, sehr wahrscheinlich durch die Phoyphorylierung von bestimmten Serinresten innerhalb der T-Schleife (Aktivierungsschleife) und durch bestimmte Protein-Kinase-C-Isoformen (H. Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3537–3542 (1998), F.S. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9319–9324 (1998), S. Nemoto et al., Mol. Cell. Biol. 18, 7336–7343 (1998), M.J. Lallena et al., Mol. Cell. Biol. 19, 2180–2188)). Es wurde gezeigt, dass ein katalytisch inaktiver Mutant von IKK-β die Aktivierung von NF-κB durch Stimulierung durch TNF-α, IL-1β, LPS, Anti-CD3/Anti-CD28 hemmt (F. Mercurio et al., Science 278, 860–866 (1997), J.D. Woronicz et al., Science 278, 866–869 (1997)). Dieselbe Wirkung wurde beobachtet, wenn MEKK1 oder NIK überexprimiert werden. Zusätzlich dazu hemmten IKK-β-Mutationen in der Aktivierungsschleife IL-1- und TNF-α-Signalgebung (M. Delhase et al., Science 284, 309–313 (1999)). Basierend auf den oben beschriebenen Experimentergebnissen gibt es deutliche Hinweise darauf, dass IKK-β auf verschiedenen Wegen, die zur Aktivierung von NF-κB führen, eine zentrale Rolle spielt.
Zusammenfassend sollte die spezifische Hemmung von IKK-β in vivo zu einer starken Anti-Entzündungswirkung und einer starken immunmodulierenden Wirkung führen, die das Potential aufweist, die Asthma und anderen Krankheiten zugrundeliegenden Ursachen zu verbessern. Zusätzlich dazu sind Anti-Tumor- und Anti-Ischämie-Wirkungen eines 1KK-β-Hemmers zu erwarten.
Manna et al. offenbaren 4,6-disubstituierte 3-Cyano-2-aminopyridine der allgemeinen Formel:
worin (R', R'') (OCH₃, OCH₃), (Cl, Cl), (H, Cl), (H, Br), (H, CH₃), (H, OCH₃), (H, NO₂) oder (H, N(CH₃)₂) ist,
oder
als allgemeinen, anti-entzündlichen, schmerzlindernden und antipyretischen Wirkstoff darstellen (Eur. J. Med. Chem. 34, 245–254 (1999)).
Manna et al. offenbaren weder Pyridinderivate mit aliphatischen Gruppen an Position 4 des Pyridinrings, noch schlagen sie IKK-β-Kinase oder NF-κB-hemmende Aktivität in Bezug auf die oben genannten Pyridinderivate vor.
Die Entwicklung einer neuen Verbindung mit einer wirksamen Anti-Entzündungs-Wirkung basierend auf der spezifischen und selektiven hemmenden Aktivität auf IKK-β-Kinase war wünschenwert.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach umfassenden Studien in Bezug auf die chemische Modifikation von Pyridinderivaten haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die Verbindungen mit einer neuen chemischen Struktur der vorliegenden Erfindung eine unerwartet ausgezeichnete hemmende Aktivität in Bezug auf IKK-β-Kinase aufweisen. Diese Erfindung soll (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on der Formel (I):
und Salze davon bereitstellen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist optisch aktiv und weist überraschenderweise in vivo eine IKK-β-Kinase-hemmende Aktivität, eine Cytokin-hemmende Aktivität und eine Anti-Entzündungsaktivität auf, die sogar stärker ist als die entsprechende racemische Modifikation oder das Enantiomer (+)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3R)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on. Deshalb ist es speziell als Reagens für das Hemmen der Aktivierung von NF-κB geeignet und insbesondere für die Herstellung eines Medikaments oder einer medizinischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von NF-κB-abhängigen Erkrankungen wirksam sein kann.
Genauer gesagt ist das (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido(2,3-d][1,3]oxazin-2-on der vorliegenden Erfindung aufgrund der Tatsache, dass es die IKK-β-Kinase-Aktivität hemmt, für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die eine NF-κB-Aktivität umfassen, wirksam: Entzündungssymptome, einschließlich Asthma; allergische Rhinitis; atopische Dermatitis; Urtikaria; Konjunktivitis; Frühjahrskatarrh; chronischer Gelenksrheumatismus; systemischer Lupus erythematodes; Psoriasis; diabrotische Kolitis; systemisches inflammatorisches Reaktionssyndrom (SIRS); Sepsis; Polymyositis; Dermatomyositis (DM); Polyarteriitis nodosa (PN); das Sharp-Syndrom (MCTD); das Sjögren-Syndrom; Gicht und dergleichen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls für die Behandlung und die Prophylaxe von Erkrankungen wie Ischämie und Tumoren wirksam, da diese Erkrankungen ebenfalls mit IKK-β-Kinase- und NF-κB-Aktivität in Verbindung stehen.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung kann durch die Kombination von verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt werden. In manchen Ausführungsformen wird einer oder werden mehrere Substituenten, wie z.B. Aminogruppe, Carboxylgruppe und Hydroxylgruppe, der als Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte eingesetzten Verbindungen vorteilhafterweise durch eine Schutzgruppe, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, geschützt. Beispiele für die Schutz gruppen werden in Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Aufl., beschrieben.
Die Verbindung der Formel (II):
(worin -OX eine Hydroxylgruppe oder eine durch eine geeignete Schutzgruppe (z.B. Benzyl, Methoxybenzl und Silyl) geschützte Hydroxygruppe darstellt) wird mit einem Aldehyd der Formel (III):
(worin X' H oder eine Schutzgruppe darstellt, die z.B. Alkoxycarbonyl, wie z.B. Ethoxycarbonyl, tertiäres Butoxycarbonyl oder dergleichen, umfasst; oder andere Substituenten darstellt, die leicht durch herkömmliche Verfahren in H umgewandelt werden können) CNCH₂COOR¹ (IV)(worin R¹-CR¹¹R¹²R¹³ ist, worin R¹¹, R¹² und R¹³ jeweils unabhängig voneinander C_1-6-Alkyl oder Aryl sind)
und einem Ammoniumsalz, wie z.B. Ammoniumacetat, umgesetzt, um die Verbindung der Formel (V) zu erhalten:
worin X, X' und R¹ wie oben definiert sind.
Die Reaktion kann ohne Lösungsmittel oder in einem Lösungsmittel, beispielsweise Ethern, wie z.B. Dioxan und Tetrahydrofuran; aromatischen Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Benzol, Toluol und Xylol; Nitrilen, wie z.B. Acetonitril; Amiden, wie z.B. Dimethylformamid (DMF) und Dimethlyacetamid; Sulfoxiden, wie z.B. Diemethylsulfoxid; und anderen, durchgeführt werden. Die Reaktionstemperatur beträgt gewöhnlich etwa 50 °C bis 200 °C, ist aber nicht auf diese Werte beschränkt. Die Reaktion erfolgt gewöhnlicherweise 30 min bis 48 h lang, vorzugsweise 1 bis 24 h lang. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II), (III) und (IV) und ein Ammoniumsalz, wie z.B. Ammoniumacetat, können käuflich erworben werden oder unter Anwendung von bekannten Verfahren hergestellt werden.
Dann wird eine -COO-R¹-Gruppierung der Verbindung (V) unter Einsatz eines herkömmlichen Esterreduktionsverfahren unter Verwendung eines Reduktionsmittels, wie z.B. Lithiumaluminiumhydrid, Lithiumborhydrid und Natrium-bis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid, in -CH₂-OH übergeführt (Schritt 1). Dann wird die Verbindung (VI) unter Einsatz von herkömmlichen Zirkularisierungsverfahren unter Verwendung von beispielsweise Phosgen, Diphosgen und Triphosgen in die Verbindung (VII) übergeführt (Schritt 2). Die Schutzgruppen in -OX und -NX' in der Verbin dung (VII) können durch herkömmliche Verfahren, wie z.B. Säurebehandlung, entfernt werden, um die Verbindung (VIII) zu erhalten (Schritt 3). Die Trennung der chiralen Isomere der Verbindung (VIII) lieferte die Verbindung (I). Diese Trennung der chiralen Isomere erfolgt beispielsweise durch eine Flüssigchromatographie unter Einsatz einer Chiralitätssäule, die aus optisch aktiven Aminosäuren, Zucker und dergleichen besteht, vorzugsweise durch HPLC oder das Umkristallisierungsverfahren unter Einsatz einer optisch aktiven organischen Säure, wie z.B. (–)-Di-p-toluoyl-L-weinsäure.
Die Verbindung (I) kann auch erhalten werden, wenn der Schritt der chiralen Trennung vor Schritt 1, Schritt 2 oder Schritt 3 erfolgt.
Typische Salze der durch Formel (I) dargestellten Verbindung umfassen Salze, die durch die Reaktion der erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Mineral- oder organischen Säure oder einer organischen oder anorganischen Base hergestellt werden. Solche Salze sind jeweils als Säureadditions- bzw. Basenadditionssalze bekannt.
Säuren zur Bildung von Säureadditionssalzen umfassen anorganische Säuren, wie z.B., ohne Beschränkung, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure und dergleichen, und organische Säuren, wie z.B., ohne Beschränkung, p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen.
Basenadditionssalze umfassen die von anorganischen Basen abgeleiteten, wie z.B., ohne Beschränkung, von Ammoniumhydroxid, Alkalimetallhydroxid, Erdalkalimetallhydroxiden, Carbonaten, Bicarbonaten und dergleichen, und von orgnaischen Basen, wie z.B., ohne Beschränkung, von Ethanolamin, Triethylamin, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und dergleichen. Beispiele für anorganische Basen umfassen Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumbicarbonat, Calciumhydroxid, Calciumcarbonat und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Verbindung oder ein Salz davon kann modifiziert werden, um Niederalkylester oder andere bekannte Ester; und/oder Hydrate oder andere Solvate zu bilden. Diese Ester, Hydrate und Solvate sind Teil des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in oraler Form verabreicht werden, z.B., ohne Beschränkung, in der Form von normal und enterisch beschichteten Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulvern, Körnern, Elixieren, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupen, festen und flüssigen Aerosolen und Emulsionen. Sie können ebenfalls in parenteralen Formen verabreicht werden, wie z.B., ohne Beschränkung, intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär und in ähnlichen Formen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Pharmazeutik bekannt sind. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch intranasal durch die topische Anwendung von geeigneten intranasalen Trägern oder über transdermale Wege unter Einsatz von transdermalen Zufuhrsystemen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verabreicht werden.
Die Dosierung bei Einsatz der erfindungsgemäßen Verbindung wird durch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung in Anbetracht von verschiedenen Faktoren, wie, ohne Beschränkung, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischer Zustand des Empfängers, der Schwere der zu behandelnden Erkrankung, des Verabreichungsweges, des Ausmaßes der Stoffwechsel- und Ausscheidungsfunktionen des Empfängers, der verwendeten Dosierungsform, der speziellen verwendeten Verbindung und des Salzes davon, bestimmt.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise vor der Verabreichung gemeinsam mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten formuliert. Exzipienten sind inerte Substanzen, wie z.B., ohne Beschränkung, Träger, Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe Süßstoffe, Gleitmittel, Lösungsvermittler, Suspensionsmittel, Bindemittel, tablettenzersetzende Stoffe und verkapselndes Material.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, die die erfindungsgemäße Verbindung und einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten umfasst, die mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger der Formulierung nicht schädlich sind. Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen werden durch die Kombination einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten für diese hergestellt. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann der Wirkbestandteil mit einem Verdünnungsmittel gemischt oder in einem Träger, der die Form einer Kapsel, eines Säckchens, eines Papiers oder eines anderen Behälters aufweist, eingeschlossen werden. Der Träger kann als Verdünnungsmittel dienen, das fest, halb-fest oder flüssiges Material sein kann, das als Träger dient, oder die Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Pastillen, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen, Salben, die beispielsweise bis zu 10 Gew.-% Wirkstoff enthalten, weichen und harten Gelatinekapseln, Suppositorien, sterilen injizierbaren Lösungen und sterilen verpackten Pulvern aufweisen.
Für die orale Verabreichung kann der Wirkbestandteil mit einem oralen, nichttoxischen, pharmazeutisch annehmbaren Träger kombiniert werden, wie z.B., ohne Beschränkung, Lactose, Stärke, Saccharose, Glucose, Natriumcarbonat, Mannit, Sorbit, Calciumcarbonat, Calciumphosphat, Calciumsulfat, Methylcellulose und dergleichen; fakultativ gemeinsam mit zersetzenden Mitteln, wie z.B., ohne Beschränkung, Maisstärke, Methylcellulose, Agarbentonit, Xanthangummi, Alginsäure und dergleichen; und fakultativ mit Bindemitteln, wie z.B., ohne Beschränkung, Gelatine, Akaziengummi, natürlichen Zuckern, β-Lactose, Maissüßstoffe, natürlichem und synthetischem Gummi, Akaziengummi, Tragant, Natriumalginat, Carboxymethylcellulose, Polyethylenglykol, Wachsen und dergleichen; und fakultativ mit Gleitmitteln, wie z.B., ohne Beschränkung, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Stearinsäure, Natriumoleat, Natriumbenzoat, Natriumacetat, Natriumchlorid, Talk und dergleichen.
In Pulverform kann der Träger ein fein zerteilter Feststoff sein, dem der fein zerteilte Wirkbestandteil beigemischt ist. Der Wirkbestandteil kann mit einem Träger mit Bindungseigenschaften in geeigneten Anteilen gemischt werden und in gewünschter Form und Größe komprimiert werden, um Tabletten herzustellen. Die Pulver und Tabletten umfassen vorzugsweise etwa 1 bis etwa 99 Gew.-% des Wirkbestandteils, der die neue Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist. Geeignete feste Träger sind Magnesiumcarboxymethylcellulose, niederschmelzende Wachse und Kakaobutter.
Sterile flüssige Formulierungen umfassen Suspensionen, Emulsionen, Sirupe und Elixiere. Der Wirkbestandteil kann in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie z.B. sterilem Wasser, einem sterilen organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch aus sterilem Wasser und sterilem organischem Lösungsmittel, gelöst oder suspendiert werden.
Der Wirkbestandteil kann auch in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst werden, z.B. in wässrigem Propylenglykol. Andere Zusammensetzungen können durch die Dispersion des fein zerteiltem Wirkbestandteils in wässriger Stärke oder Natriumcarboxymethylcellulose-Lösung oder einem geeigneten Öl hergestellt werden.
Die Formulierung kann in Form einer Dosierungseinheit erfolgen, welche eine physikalisch diskrete Einheit ist, die eine Dosierungseinheit enthält und für die Verabreichung an Menschen oder andere Säugetiere geeignet ist. Eine Dosierungseinheit kann die Form einer Kapsel oder einer Tablette, von mehreren Kapseln oder Tabletten aufweisen. Eine "Dosierungseinheit" ist eine vorbestimmte Menge der aktiven Verbindung der vorliegenden Erfindung, die so berechnet ist, dass sie in Verbindung mit einem oder mehreren Exzipienten den gewünschten therapeutischen Effekt hervorruft. Die Menge des Wirkbestandteils in einer Dosierungseinheit kann in Abhängigkeit von der jeweils angewandten Behandlung von etwa 0,1 bis etwa 1000 mg oder mehr variieren oder angepasst werden.
Typische orale Dosierungen der vorliegenden Erfindung liegen, wenn sie für die angesprochenen Wirkungen eingesetzt wird, in einem Bereich von etwa 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 100 mg/kg/Tag, vorzugsweise von 0,1 mg/kg/Tag bis 30 mg/kg/Tag und besonders bevorzugt von 0,5 mg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag. Bei parenteraler Verabreichung hat es sich im Allgemeinen als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwa 0,001 bis 100 mg/kg/Tag, vorzugsweise von 0,01 m/kg/Tag bis 1 mg/kg/Tag, zu verabreichen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in einer einzigen Dosis/Tag verabreicht werden, oder die tägliche Gesamtdosis kann aufgeteilt zweimal, dreimal oder öfter pro Tag verabreicht werden. Wenn die Zufuhr transdermal erfolgt, erfolgt die Verabreichung selbstverständlich fortlaufend.
Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung wurde durch die folgenden Tests und pharmakologischen Tests untersucht.
[IKK-β-Kinase-Hemmtest]
(1) Herstellung von IKK-β-Kinase-Protein
Ein c-DNA-Fragment, das für einen offenen Leserahmen eines menschlichen IKK-β kodiert, wurde durch PCR unter Einsatz eines Primer-Paares hergestellt, das gemäß der veröffentlichten Sequenz (J.D. Woronicz et al., Science 278, 866–869 (1997)) hergestellt wurde. Eine Matrix wurde von Quickclone-cDNA (Clontech) unter Einsatz eines Elongase^TM-Amplifikations-Sets (Life Technologies) erhalten. Die durch PCR hergestellten DNA-Fragmente wurden gel-gereinigt und in pBluescript subkloniert. Das in pBluescript klonierte cDNA-Fragment wurde in pcDNA3.1/His-C-KpnI/NotI insertiert und in pVL1393-SmaI/XbaI (Pharmingen) transferiert, um einen Baculovirus-Transfervektor herzustellen. Dann wurde der Vektor gemeinsam mit dem linearisierten Beculovirus (BaculoGold^TM, Pharmingen) eingesetzt, um Sf21-Zellen (Invitrogen, San Diego, Calif.) zu transfizieren. Das so hergestellte, rekombinante Baculovirus wurde kloniert und in Sf21-Zellen amplifiziert, in mit 10 % FCS, 50 g/ml Gentamycin, 0,1 % Pluronic F-68 (Life Technologies, Inc.) ergänztem TNM-FH-Insektenzell-Medium (Life Technologies, Inc.) in Form einer Suspensionskultur (200 ml in 1-I-Erlenmeyer-Kolben, 27 °C, 130 U/min) kultiviert. Sf21-Zellen wurden mit diesem amplifizierten Virus mit einer Infektionsmultiplizität von 5 gemäß Standardprotokollen (R. Crossen, S. Gruenwald, Baculovirus Expression Vector System Instruction Manual, Pharmingen Corporation (1997)) infiziert und 48 h später geerntet. Die Zellen wurden lysiert, um das hergestellte chimäre Protein von durch Histidin fusionierter IKK-β-Kinase (His-markierte IKK-β) zu erhalten.
(2) Herstellung von gereinigten GST-IκBα-Fusionsproteinen
Ein Expressionsvektor, der die Nucleotidsequenz, die für das Fusionsprotein von GST mit den Aminosäureresten 1 bis 54 von IκBα unter der Steuerung eines IPTG-induzierbaren Promotors kodiert, umfasst, wurde konstruiert. Der Expressionsvektor wurde in E. coli eingeführt, und der Transformant wurde kultiviert und lysiert, um ein GST-IκBα-Fusionsprotein zu erhalten. Das resultierende GST-IκBα-Fusionsprotein wurde dann gereinigt und für den Kinase-Test biotinyliert.
(3) Messung der IKK-β-Kinase-Aktivität
Der 96-Well-Format-Kinasetest von IKK-β wurde durchgeführt, um die Hemmaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen zu testen. Zunächst wurden 5 μl einer Testverbindung in Gegenwart von 2,5 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in jeden Well in einer 96-Well-Platte mit U-förmigem Boden (Falcon) gefüllt. In Kontrollwells für Hintergrund (BG) und Gesamtphosphorylierung (TP) wurden 5 μl 2,5 %iges DMSO gefüllt. Rekombinante IKK-β (Endkonzentration: 0,6 μg/ml) und Bio-GST-IκBα (1–54) (Endkonzentration 0,2 μM) wurden in 25 μl 2 × Kinasepuffer-β (40 mM Tris-HCl, pH 7,6, 40 mM MgCl₂, 40 mM β-Glycerophosphat, 40 mM p-Nitrophenylphosphat, 2 mM EDTA, 40 mM Creatinphosphat, 2 mM DTT, 2 mM Na₃VO₄, 0,2 mg/ml BSA und 0,8 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) verdünnt und auf die 96-Well-Platte transferiert. Bio-GST-IκBα (1–54) in 25 μl 2 × Kinasepuffer-β ohne IKK-β wurde auf die BG-Wells transferiert. Dann wurden 20 μl 12,5 μM ATP, 62,5 μCi/ml [γ-³³P]ATP (Amersham Pharmacia Biotech) zugesetzt, und das resultierende Gemisch wurde 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kinase-Reaktionen wurden durch die Zugabe von 150 μl Terminationspuffer (100 mM EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,2 mg NaN₃) beendet. 150 μl der Probe wurden auf eine Streptavidin-beschichtete, weiße MTP (Steffens Biotechnische Analysen GmbH Nr. 08114E14.FWD) transferiert, um die biotinylierten Substrate einzufangen. Nach einer einstündigen Inkubation wurde nicht-gebundene Radioaktivität durch das fünfmalige Waschen der Wells mit 300 μl Waschpuffer, umfassend 0,9 % NaCl und 0,1 % (Gew./Vol.) Tween-20, unter Einsatz eines MW-96-Platten-Waschers (BioTec) entfernt. Die gebundene Radioaktivität wurde nach der Zugabe von 170 μl MicroScint-PS-Szintillationscocktail (Packard) unter Einsatz eines TopCount-Szintillationszählers bestimmt.
[Syk-Tyrosin-Kinase-Hemmtest in Bezug auf Selektivität]
(1) Herstellung von Syk-Protein
Ein cDNA-Fragment, das für einen offenen Leseraster von menschlichem Syk kodiert, wurde von der Gesamt-RNA einer menschlichen Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie (American Type Culture Collection) unter Einsatz eines RT-PCR-Verfahrens kloniert. Das cDNA-Fragement wurde in pAcG2T (Pharmingen, San Diego, Calif.) insertiert, um einen Buculovirus-Transfervektor zu konstruieren. Dann wurde der Vektor gemeinsam mit dem linearisierten Baculovirus (BaculoGoldTM, Pharmingen) eingesetzt, um Sf21-Zellen (Invitrogen, San Diego, Calif.) zu transfizieren.
Das hergestellte rekombinante Baculovirus wurde kloniert und in Sf21-Zellen amplifiziert. Sf21-Zellen wurden mit diesem amplifizierten Virus mit hohem Titer infiziert, um ein chimäres Protein von durch Glutathion-S-Transferase (GST) fusionierter Syk-Kinase herzustellen. Das resultierende GST-Syk wurde unter Einsatz einer Glutathion-Säule (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) gemäß den Herstellerhinweisen gereinigt. Mittels SDS-PAGE wurde bestätigt, dass die Reinheit des Proteins mehr als 90 % betrug.
(2) Synthese eines Peptids
Dann wurde ein Peptidfragment aus 30 Resten, umfassend 2 Tyrosinreste, KISDFGLSKALRADENYYKAQTHGKWPVKW, durch ein Peptidsynthesegerät her gestellt. Das N-terminale Ende des Fragments wurde dann biotinyliert, um ein biotinyliertes Aktivierungsschleifen-Peptid (AL) zu erhalten.
(3) Messung der Syk-Tyrosin-Kinase-Aktivität
Alle Reagenzien wurden in dem Syk-Kinase-Testpuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 0,1 mM Na₃VO₄, 0,1 % BAS, 1 mM DTT) verdünnt. Zunächst wurde ein Gemisch (35 μl), das 3,2 μg GST-Syk und 0,5 μg AL umfasste, in jeden Well der 96-Well-Platte gefüllt. Dann wurden 5 μl eines Testgemischs in der Gegenwart von 2,5 Dimethylsulfoxid (DMSO) zu jedem Well zugesetzt. Zu diesem Gemisch wurden 300 μM ATP (10 μl) zugesetzt, um die Kinase-Reaktion zu initiieren. Das Endreaktionsgemisch (50 μl) besteht aus 0,65 nM GST-Syk, 3 μM AL, 30 μM ATP, einer Testverbindung, 0,25 % DMSO und einem Syk-Kinase-Testpuffer.
Das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 120 μl Terminationspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 500 mM NaCl, 0,1 % BSA) beendet. Das Gemisch wurde auf Streptavidin-beschichtete Platten übertragen und 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, um Biotin-AL mit den Platten zu kombinieren. Nach dem dreimaligen Waschen der Platten mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl), die 0,05 % Tween-20 enthielt, wurden 100 μl einer Antikörperlösung, bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 % BSA, 60 ng/ml monoklonalen Antiphosphotyrosin-Antikörpern, 4G10 (Upstate Biotechnology), das zuvor mit dem Amersham-Pharmacia-Set mit Europium markiert worden war, zugesetzt und 60 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden 100 μl Enhancement-Lösung (Amersham Pharmacia Biotech) zugesetzt, und dann wurde die zeitaufgelöste Fluoreszenz mittels „Multi-Label-Counter" ARVO (Wallac Oy, Finnland) bei 340 nm in Bezug auf Anregung und bei 615 nm in Bezug auf Emission mit 400 ms Verzögerung und einem 400-ms-Fenster gemessen.
[Die Messung der RANTES-Produktion in Reaktion auf TNF-α aus A549-Zellen]
(1) Herstellung von A549-Zellen
Die menschliche A549-Lungenepithelzelllinie (ATCC Nr. CCL-885) wurde in mit 10 FCS (Gibco), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin (Kulturmedium) ergänztem „Dulbecco's modified Eagle's Medium" (D-MEM, Nikken Biomedical Institute) gehalten. 40.000 (4 × 10⁴) Zellen (80 μl/Well) wurden in jeden Well einer 96-Well-Gewebekultur-Platte mit flachem Boden (Falcon Nr. 3072) geimpft. Die Platte wurde 2 h lang stehen gelassen, so dass die Zellen an dem Boden jedes Wells hafteten. Zu jedem Well wurden 10 μl Träger (1 % DMSO), eine Verdünnungsreihe von Testverbindungen in 1 % DMSO oder 5 nM Dexamethason in 1 % DMSO als Referenz zugesetzt. Das Gemisch (90 μl/Well) wurde 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Nach 1 h wurde 1 μg/ml TNF-α (10 μl) in Kulturmedium zu dem Gemisch zugesetzt, um 100 μl Reaktionsgemisch zu erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde 24 h lang inkubiert, um die Zellen mit 100 ng/ml TNF-α zu stimulieren. Zellen mit Träger ohne TNF-α-Stimulation wurden ebenfalls hergestellt.
(2) Messung der RANTES-Produktion
Dann wurde die RANTES-Konzentration, die von den Zellen in den Überständen jedes Wells freigesetzt wurde, unter Einsatz einer quantitativen Sandwich-Enzym-Immuntesttechnik bestimmt. Zunächst wurden 2 μg/ml Maus-Anti-huRANTES-mAb (R&D Systems, Nr. mAb678) in PBS-Puffer (pH 7,4, 100 μl) in jeden Well einer 96-Well-NUNC-Fluor-Platte (Nalge Nunc, New York, USA) gefüllt (Endkonzentration 200 ng/Well), und die Platte wurde über Nacht bei 4 °C stehen gelassen, um durch den Antikörper beschichtet zu werden. Jeder Well der Platte wurde dann mit 350 μl Waschpuffer (0,05 % Tween-20, 0,85 % NaCl und 25 mM Tris/HCl, pH 7,4) 3-mal gewaschen. Blockierpuffer, der 1 % BSA (Sigma, 99 % rein, 100 g), 5 % Saccharose (Nacalai tesque, 99 % rein, 500 g) und 0,02 % Azid (Nacalai tesque, 100 %, 500 g) umfasste, wurde zu jedem Well zugesetzt (200 μl), und dann wurde die Platte 4 h lang stehen gelassen, um den beschichteten Antikörper zu stabilisieren. Dann wurden 50 μl Überstände der oben in (1) hergestellten Zellkultur in jeden Well der 96-Well-NUNC-Fluor-Platte mit beschichtetem Antikörper gefüllt. Rekombinantes menschliches RANTES (Pepro Tech, Inc. Nr. 300-06) wurde als Standard für die Bestimmung der RANTES-Produktion eingesetzt (linearer Bereich zwischen 1 und 10 ng/ml). Eu-markiertes Maus-Anti-huRANES-mAb (60 ng/ml: R&D Systems, Nr. mAb278) in mit 1 % BSA und 0,05 % Tween-20 ergänztem PBS wurden zu jedem Well zugesetzt (50 μl). Die Reaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur 4 h lang inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit Waschpuffer (0,05 % Tween-20, 0,85 % NaCl und 25 mM Tris/HCl, pH 7,4, 350 μl/Well) unter Einsatz eines Sera-Waschers (Bio-Tech, Nr. MW-96R) wurde die Enhancement-Lösung (DELFIA, Nr. 1244–405, 100 μl/Well) zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wurde 10 min lang bei Raumtemperatur unter mäßigem Schütteln inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde unter Einsatz eines DELFIA-Fluorimeters (Wallac) gemessen. Die Anregung erfolgte bei 340 nm, und die Emission wurde bei 615 nm gemessen.
[Messung der TNF-α-Produktion in Reaktion auf LPS aus peripheren Blutmononuklearzellen (PBMC)]
(1) Herstellung von PBMC
Menschliche PBMC wurden hergestellt, indem zunächst Blut von gesunden Spendern erhalten wurde und die Zellen aus dem Blut isoliert wurden. Die Isolation erfolgte durch ein Ficoll-Gradienten-Zentrifugationsverfahren unter Einsatz von „Ficoll Pacque" (Pharmacia Nr. 17-1440-02). Innerhalb von 3 h nach der Spende wurden die isolierten PBMC verwendet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die PBMC erneut in mit 10 % FCS (Gibco), 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin ergänztem RPMI 1640 (Nikken BioMedical Institute) (Kulturmedium) suspendiert. Die Zellen (1 × 10⁵ in 150 μl/Well) wurden in jeden Well einer 96-Well-Gewebekultur-Platte mit flachem Boden (Falcon Nr. 3072) geimpft. Zu jedem Well wurden 20 μl Träger (1 % DMSO), Verdünnungsreihen von Testverbindungen in 1 % DMSO oder 250 nM Dexamethason in 1 % DMSO als Referenz zugesetzt. Das Gemisch (170 μl/Well) wurde 1 h lang bei 37 °C inkubiert. Nach 1 h wurden 20 ng/ml LPS (30 μl) in Kulturmedium zum Gemisch zugesetzt, um 200 μl Reaktionsgemisch zu erhalten. Das Reaktionsgemisch wurde 7 h lang kultiviert, um die Zellen mit 3 ng/ml LPS zu stimulieren. Zellen mit Träger ohne LPS-Stimulation wurden ebenfalls hergestellt. Die Überstände des Reaktionsgemischs wurden dann gesammelt.
(2) Messung der TNF-α-Produktion
Die TNF-α-Konzentration in den Überständen wurde unter Einsatz eines DuoSet^TM-ELISA-Entwicklungssets (GenzymeTechne, Minneapolis, USA) gemäß den Herstellerhinweisen bestimmt. Zunächst wurden 4 μg/ml Maus-Anti-Human-TNF-α-Ab in PBS-Puffer (100 μl) in jeden Well einer 96-Well-Platte (NUNC, Maxisorp^TM) gefüllt, und die Platte wurde über Nacht bei 4 °C stehen gelassen, um mit dem Antikörper beschichtet zu werden. Jeder Well der Platte wurde dann unter Einsatz eines Sera-Waschers (Bio-Tech, Nr. MW-96R) 5-mal mit 350 μl Waschpuffer gewaschen, der PBS und 0,05 % Tween-20 (Nakalai tesque) umfasste. Zu jedem Well wurden 300 μl 1 % BSA (Sigma), 5 % Saccharose in PBS zugesetzt. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Puffer verworfen, und 50 μl Nährmedium wurden zugesetzt. Dann wurden 50 μl Überstand der oben (in 1) hergestellten stimulierten Zellkultur in jeden Well der 96-Well-Platte gefüllt. Rekombinanter menschlicher TNF-α (Genzyme Techne) wurde als Standard für die Bestimmung der TNF-α-Produktion herangezogen (linearer Bereich zwischen 30 und 2.000 pg/ml). Die Reaktionsgemische wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden 100 μl biotinylierter Ziegen-Anti-Human-TNF-α-Antikörper (Genzyme Techne, 300 ng/ml) in 0,1 % BSA, 0,05 % Tween in PBS (Reaktionsmittelverdünner) zu jedem Well zugesetzt und bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden 100 μl Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase (Genzyme Teche, 1/100 in Reaktionsmittelverdünner) zu jedem Well zugesetzt. Nach 20 min wurde jeder Well der Platte 5-mal mit Waschpuffer (350 μl/Well) gewaschen. Das Substrat aus Meerrettichperoxidase und H₂O₂ (TMBZ-Peroxidase-Detektionsset, SUMILON Nr. ML-1120T) wurde zu dem Gemisch zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde nach 10 min durch die Zugabe von 2 N H₂SO₄ beendet. Die optische Dichte bei 450 nm wurde unter Einsatz eines Mikroplatten-Lesegeräts (Labosystems, Multiscan Multisoft) bestimmt. Die Quantifizierung der TNF-α-Produktion in jeder Probe erfolgte durch den Vergleich der optischen Dichten der Proben und der Standardkurve.
[Die Messung der IL-2-Produktion in Jurkat-T-Zellen in Reaktion auf Antikörperstimulation]
Die IL-2-Produktion wurde in Jurkat-T-Zellen (E6-1-Klon; ATCC Nr. TIB-152) in Reaktion auf die Stimulation mit Anti-CD3/Anti-CD28-Antikörpern gemessen.
(1) Herstellung der immobilisierten Antikörper
Zunächst wurden Anti-CD3-Antikörper (400 ng/Well, Nichirei, NU-T3 4 μg/ml in 100 μl Dulbecco-PBS) in jeden Well einer 96-Well-Platte (Falcon Nr. 3072) gefüllt, und die Platte wurden 2 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, um mit dem Antikörper beschichtet zu werden. Jeder Well der Platte wurden dann 3-mal mit 250 μl PBS gewaschen.
(2) Herstellung einer Jurkat-Zellkultur
Jurkat-T-Zellen wurden in mit 10 % hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin G und 100 μg/ml Stretomycin ergänztem RPMI-1640-Medium (Nährmedium) kultiviert. 200.000 (2 × 10⁵) Zellen (190 μl/Well) wurden in jeden Well von 96-Well-Gewebekulturplatten mit U-förmigem Boden (Falcon Nr. 3077) geimpft. Zu jedem Well wurden 10 μl Träger (0,2 % DMSO), eine Verdünnungsreihe der Verbindungen in 0,2 % DMSO oder 25 nM Cyclosporin A als Referenz in 0,2 % DMSO zugesetzt. Das Gemisch (200 μl) wurde 1 h lang bei 37 °C in einer befeuchteten Umgebung mit 5 % CO₂ inkubiert.
(3) Stimulation der Zelle
Das in (2) erhaltene Reaktionsgemisch (100 μl) wurde in jeden Well einer in (1) hergestellten Antikörper-immobilisierten Platte gefüllt. Zu diesem Well wurden Anti-CD28-Antikörper (Nichirei, KOLT-2, 6 μg/ml in Zellnährmedium, 50 μl/Well) und 2,5 μg/ml Ziegen-Anti-Maus-κ-Ketten-Antikörper (Bethyl Laboratories (Katalognr. A90-119A), 10 μg/ml in Nährmedium, 50 μl/Well) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch in jedem Well wurde 24 h lang bei 37 °C inkubiert, um die Zellen mit immobilisierten Anti-CD3-Antikörpern (400 μg/Well) und Anti-CD28-Antikörpern (1,5 μg/ml) zu stimulieren und dann Rezeptoren an den Zellen mit den Anti-Maus-κ-Ketten-Antikörpern (2,5 μg/ml) zu vernetzen.
(4) Messung der IL-2 Produktion
Die Überstände des Reaktionsgemischs wurden dann gesammelt. Die IL-2-Konzentration in den Überständen wurde unter Einsatz eines DuoSet^TM-ELISA-Entwicklungssets (GenzymeTechne, Minneapolis, USA) gemäß den Herstellerhinweisen bestimmt. Zunächst wurden 2 μg/ml Maus-Anti-HuIL-2-Antikörper in PBS-Puffer (100 μl) zu jedem Well einer 96-Well-Platte (NUNC, Maxisorp^TM) zugesetzt, und die Platte wurde über Nacht bei 4 °C stehen gelassen, um mit dem Antikörper beschichtet zu werden. Jeder Well der Platte wurden dann 5-mal mit 350 μl Waschpuffer, der PBS, 0,05 % Tween-20 (Nakalai tesque) umfasste, unter Einsatz eines Sera-Waschers (Bio-Tech, Nr. MW-96R) gewaschen. Zu jedem Well wurden 250 μl 1 % BSA (Sigma) in PBS, 0,05 % Tween-20 (Verdünnungspuffer) zugesetzt. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Puffer verworfen, und 50 μl Nährmedium wurden zugesetzt. Dann wurden 50 μl Überstand der in (3) hergestellten stimulierten Zellkultur in jeden Well der mit Maus-Anti-hulL-2-Antikörper beschichteten 96-Well-Platte gefüllt. Rekombinantes menschliches IL-2 (Genzyme Techne) wurde als Standard zur Bestimmung der IL-2-Produktion herangezogen (linearer Bereich zwischen 200 und 5.400 pg/ml). Die Reaktionsgemische wurden 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden zu jedem Well 100 μl biotinylierter Kaninchen-Anti-hulL-2-Antikörper (Genzyme Techne, 1,25 μg/ml) in Verdünnungspuffer zugesetzt und 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurden 100 μl Streptavidin-konjugierte Meerrettichperoxidase (Genzyme Techne, 1/1000 in Verdünnungspuffer) zu jedem Well zugesetzt. Nach 20 min wurde jeder Well der Platte 5-mal mit Waschpuffer (350 μl/Well) gewaschen. Substrat und H₂O₂ (TMBZ-Peroxidase-Detektionsset, SUMILON Nr. ML-1120T) wurden zu dem Gemisch zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktion wurde nach 10 min durch die Zugabe von 2 N H₂SO₄ beendet. Die optische Dichte bei 450 nm wurde unter Einsatz eines Mikroplatten-Lesegeräts (Labosystems, Multiscan, Multisoft) gemessen. Die Quantifizierung der IL-2-Produktion in jeder Probe erfolgte durch den Vergleich der optischen Dichte der Proben und der Standardkurve.
[Maus-LPS-induzierte TNF-α-Produktion]
8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden in zwei Gruppen eingeteilt, eine Kontrollgruppe und eine behandelte Gruppe. Eine Lösung, die 200 μg/Maus LPS in 0,9 % physiologischer Salzlösung umfasste, wurde den Kontrollmäusen mittels intraperitonealer (ip) Injektion verabreicht. Den Mäusen in der behandelten Gruppe wurden zunächst erfindungsgemäße Verbindungen 30 min vor der LPS-Injektion ip injiziert. Unter Pentobarbital-Anästhesie (80 mg/kg, ip) wurde Blut aus der hinteren Venenhöhle der behandelten Mäuse und der Kontrollmäuse 90 min nach der LPS-Injektion entnommen und in eine 96-Well-Platte mit 2 % EDTA-Lösung gefüllt. Das Plasma wurde mittels zehnminütigen Zentrifugierens bei 1800 U/min und 4 °C getrennt und dann mit dem vierfachen Volumen Phosphatpuffer-Salzlösung (pH 7,4), die 1 % Rinderserumalbumin umfasste, verdünnt. Die TNF-α-Konzentration in der Probe wurde unter Einsatz eines ELISA-Sets (Pharmingen, San Diego, Calif.) bestimmt.
Der mittlere TNF-α-Spiegel in 5 Mäusen aus jeder Gruppe wurde bestimmt, und der Prozentsatz der Senkung der TNF-α-Spiegel wurde berechnet. Die behandelten Mäuse wiesen im Vergleich mit den Kontrollmäusen eine signifikante Abnahme des TNF-α-Spiegels auf. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die LPS-induzierte Cytokin-Aktivität unterdrücken können.
[Ratten-LPS-induzierte TNF-α-Produktion]
Es wurden 7 Wochen alte weibliche Wistar-Ratten eingesetzt. 1 mg LPS (Lypopolysaccharid) gelöst in Phosphatpuffer-Salzlösung (pH 7,4) wurde intraperitoneal (ip) den Ratten verabreicht. Verbindungen wurden 60 min vor der LPS-Injektion oral verabreicht. Unter Pentobarbital-Anästhesie (80 mg/kg, ip) wurde Blut aus der hinteren Venenhöhle der Ratten 120 min nach der LPS-Injektion entnommen und in eine 96-Well-Platte mit 2 % EDTA-Lösung gefüllt. Das Plasma wurde mittels zehnminütigen Zentrifugierens bei 1800 U/min und 4 °C getrennt und dann mit dem vierfachen Volumen Phosphatpuffer-Salzlösung (pH 7,4), die 1 % Rinderserumalbumin umfasste, verdünnt. Die TNF-α-Konzentration in der Probe wurde unter Einsatz eines ELISA-Sets (Endogen, Boston, Mass.) bestimmt.
Der mittlere TNF-α-Spiegel in 7–8 Ratten aus jeder Gruppe wurde bestimmt, und der Prozentsatz der Senkung der TNF-α-Spiegel wurde berechnet. Die behandelten Ratten, denen die Verbindungen verabreicht worden waren, wiesen im Vergleich mit den Kontrollratten eine signifikante Abnahme des TNF-α-Spiegels auf. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die LPS-induzierte Cytokin-Aktivität unterdrücken können.
Die Ergebnisse der In-vitro-Tests werden untenstehend in den Beispielen angeführt. Die Daten entsprechen den in Festphasensynthese erhaltenen Verbindungen und weisen damit eine Reinheit von etwa 40 bis 90 % auf. Die erfindungsgemäße Verbindung weist ebenfalls eine ausgezeichnete Selektivität und eine starke Aktivität in Zelltests und In-vivo-Tests auf. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung weist genauer gesagt eine doppelt so starke Aktivität wie die entsprechende racemische Modifikation auf. Die erfindungsgemäße Verbindung weist auch eine doppelt so starke Anti-Entzündungsaktivität wie die entsprechende racemische Modifikation in Ratten auf. Außerdem wurde bestätigt, dass die Verbindung gemäß einem Ames-Test-Screening nicht mutagen ist.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird untenstehend in Form der Beispiele detailliert beschrieben, wobei diese keinesfalls zur Definition der Grenzen und Beschränkungen der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden sollten. In den untenstehenden Beispielen beziehen sich alle quantitativen Daten, wenn nicht anders angegeben, auf Gewichtsprozent. Massenspektren wurden unter Einsatz von Elektrospray-(ES-)Ionisierungstechniken (Micromass Platform LC) erhalten. Die Schmelzpunkte wurden nicht korrigiert. Flüssigchromatographie-Massenspektroskopie-(LC-MS-)Daten wurden auf einer Micromass-Platform-LC mit einer ODS-Säule von Shimadzu Phenomenex (4,6 mm × 30 mm) aufgezeichnet, wobei mit einem Gemisch aus Acetonitril-Wasser (9:1 bis 1:9) bei 1 ml/min Durchflussgeschwindigkeit gespült wurde. Die DC wurde auf einer vorbeschichteten Silicagel-Platte (Merck Silicagel 60 F-254) durchgeführt. Silicagel (WAKO-Gel C-200 (75–150 μm)) wurde für alle Säulenchromatographie-Trennungen eingesetzt. Alle Chemikalien waren analyserein und wurden bei Sigma-Aldrich, Wako pure chemical industries, Ltd., Tokyo kasei kogyo co., Ltd., erworben.
Protonnuklearmagnetresonanz-(1H-NMR-)Spektren wurden bei 300 oder 500 MHz mittels Bruker DRX-300, 500 Bruker-UltraShield^TM aufgezeichnet, und chemische Verschiebungen sind in ppm in Bezug auf Tetramethylsilan (TMS) angegeben.
Beispiel 1 1-{2-[(Cyclopropylmethyl)oxy]-6-hydroxyphenyl}ethanon
Zu einer gerührten Lösung aus 1-(2,6-Dihydroxyphenyl)ethanon (50,0 g, 328 mmol) in Aceton (1000 ml) wurden Kaliumcarbonat (227 g, 1643 mmol) und (Brommethyl)cyclopropan (35,1 ml, 361 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 50 °C 2 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Celite^® filtriert, und dann wurde das Filtrat unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die getrennte organische Phase wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Hexan suspendiert. Dann wurde die Suspension 30 min lang bei 80 °C gerührt. Die Lösung wurde filtriert, und das Filtrat wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Der resultierende weiße Feststoff wurde abfiltriert, mit Hexan gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um 1-{2-[(Cyclopropylmethyl)oxy]-6-hydroxyphenyl}ethanon als hellgelben Feststoff zu erhalten (56,3 g, Ausbeute: 83 %).
1-{2-(Cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}ethanon
Zu einer gerührten Lösung aus 1-{2-[(Cyclopropylmethl)oxy]-6-hydroxyphenyl}ethanon (56,3 g, 272 mmol) in Aceton (1000 ml) wurden Kaliumcarbonat (188 g, 1364 mmol), 4-Methoxybenzylchlorid (40,9 ml, 300 mmol) und Tetrabutylammoniumiodid (20,2 g, 54,6 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rückfluss über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, und es wurde auf Celite^® filtriert, und dann wurde das Filtrat unter reduziertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die getrennte organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingeengt. Der resultierende weiße Feststoff wurde aus Ethanol umkristallisiert, abfiltriert, mit Ethanol gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet, um 1-{2-(Cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}ethanon als weißen Feststoff zu erhalten (79,2 g, Ausbeute: 89 %).
tert-Butyl-2-amino-4-[1-(tert-butoxycarbonyl)-3-piperidinyl]-6-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}nicotinat
Ein Gemisch aus 1-{2-(Cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}ethanon (10,00 g, 30,638 mmol), tert-Butyl-3-formyl-1-peridincarboxylat (13,069 g, 61,275 mmol), tert-Butylcyanoacetat (8,650 g, 61,275 mmol) und Ammoniumacetat (6,902 g, 91,913 mmol) in Dioxan (10 ml) wurde über Nacht bei 90 °C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt. Zu dem Gemisch wurde Chloranil (1,507 g, 6,128 mmol) zugesetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Nach 1,5 h wurde Ascorbinsäure (1.079 g, 6,128 mmol) zu dem Gemisch zugesetzt. Nach Rühren für 1,5 h wurde das Gemisch zwischen Ethylacetat und Wasser getrennt. Die organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und dann unter reduziertem Druck eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde durch Säulenchromatographie auf Silicagel (Hexan/Ethylacetat = 2/1) gereinigt, um tert-Butyl-2-amino-4-[1-(tert-butoxycarbonyl)-3-piperidinyl]-6-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}nicotinat in hellbrauner Form zu erhalten (4,9 g, 24 %).
tert-Butyl-3-[2-amino-6-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-3-(hydroxymethyl)-4-pyridinyl]-1-piperidincarboxylat
Zu einer gekühlten Lösung aus tert-Butyl-2-amino-4-[1-(tert-butoxycarbonyl)-3-piperidinyl]-6-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}nicotinat (4,9 g, 7,426 mmol) in Tetrahydrofuran (60 ml) wurde Vitrid^® (10 ml) unter einer Argonatmosphäre zugetropft. Das Rühren wurde bei 0 °C 1 h lang fortgesetzt. Nach dem Quenchen mit gesättigter wässriger NH₄Cl-Lösung wurde gesättigtes wässriges Kaliumnatriumtartrat zu dem Gemisch zugesetzt, und dann wurde das Gemisch stark gerührt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat extrahiert, mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingeengt, um tert-Butyl-3-[2-amino-6-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-3-(hydroxymethyl)-4-pyridinyl]-1-piperidincarboxylat zu erhalten, das für den nächsten Schritt ohne eine weitere Reinigung eingesetzt wurde (4,38 g, Ausbeute: quant.).
tert-Butyl-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat
Zu einer gekühlten (0 °C) Lösung aus tert-Butyl-3-[2-amino-6-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-3-(hydroxymethyl)-4-pyridinyl]-1-piperidincarboxylat (5,0 g, 8,478 mmol), das in Schritt (2) von Beispiel 17-1 erhalten wurde, und Diisopropylethylamin (4,12 ml, 25,435 mmol) in Tetrahydrofuran (200 ml) wurde unter einer Argonatmosphäre eine Lösung aus Triphosgen (1,258 g, 4,239 mmol) in Tetrahydrofuran (100 ml) zugetropft. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und das Rühren wurde 3 h lang fortgesetzt. Nach dem Quenchen mit Wasser wurde das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die getrennte organische Phase wurde mit Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingeengt. Der resultierende Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie auf Silicagel (Hexan/Ethylacetat = 1/1) gereinigt, um tert-Butyl-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat in weißer Form zu erhalten (3,2 g, Ausbeute: 61 %).
7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-(3-piperidinyl)-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-onhydrochlorid
Zu einer Lösung aus tert-Butyl-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat (2,0 g, 3,248 mmol) in Dioxan (15 ml) wurde 4 N HCl in Dioxan (30 ml) bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Rühren wurde 3 h lang fortgesetzt. Nachdem das Lösungsmittel durch Ausdampfen entfernt worden war, wurde der resultierende Feststoff mit Acetonitril pulverisiert, abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Der Feststoff wurde unter reduziertem Druck getrocknet, um 7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-(3-piperidinyl)-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-onhydrochlorid als weißen Feststoff zu erhalten (0,865 g, Ausbeute: 62 %).
(–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on-(–)-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz
Ein Gemisch aus 7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-(3-piperidinyl)-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on (0,700 g, 1,770 mmol) und (–)-Di-p-toluoyl-L-weinsäure (0,684 g, 0,214 mmol) wurde in einem Gemisch aus Ethanol (30 ml) und Wasser (3,0 ml) durch Erhitzen gelöst. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und über Nacht stehen gelassen. Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert und mit Ethanol gewaschen (85 % ee). Das Produkt wurde erneut aus demselben Lösungsmittel (10 % Wasser/Ethanol) umkristallisiert und unter reduziertem Druck getrocknet, um (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on-(–)-di-p-toluoyl-L-weinsäuresalz zu erhalten (0,115 g, > 98 % ee, Ausbeute: 8 %).
Beispiel 2 tert-Butyl-(3S)-(–)-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d[1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat
Die chirale Trennung von tert-Butyl-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat erfolgte unter Einsatz von HPLC unter den folgenden Bedingungen:
Säule: Daisel CHIRALPAK OD (Daicel Chemical Industries, Ltd.)
Säulengröße: 250 × 20 mm Innendurchmesser
Eluent: Hexan/Isopropanol, 60/40 (Vol./Vol.)
Durchflussgeschwindigkeit: 20 ml/min
Retentionszeit: 31 min [(+)-Isomer], 45 min [(–)-Isomer]
Das getrennte (–)-Isomer, tert-Butyl-(3S)-(–)-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat, wurde in farbloser Form erhalten.
Molekulargewicht: 615,73
Massenspektrometrie: 616
[α]_D = –23,8 ° (CHCl₃, c = 1,035; 23 °C)
Das getrennte (+)-Isomer, tert-Butyl-(3R)-(+)-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat, wurde in farbloser Form erhalten.
Molekulargewicht: 615,73
Massenspektrometrie: 616
[α]_D = +22,5 ° (CHCl₃, C = 1,012; 22 °C)
(–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-onhydrochlorid
Zu einer Lösung aus tert-Butyl-(3S)-(–)-3-(7-{2-(cyclopropylmethoxy)-6-[(4-methoxybenzyl)oxy]phenyl}-2-oxo-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-5-yl)-1-piperidincarboxylat (1,0 g, 1,624 mmol) in Dioxan (15 ml) wurde 4 N HCl in Dioxan (30 ml) bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Rühren wurde 3 h lang fortgesetzt. Nachdem das Lösungsmittel abgedampft worden war, wurde der resultierende Feststoff mit Acetonitril pulverisiert, abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Der Feststoff wurde aus Methanol umkristallisiert, um (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-onhydrochlorid als weißen Feststoff zu erhalten (0,502 g, Ausbeute: 71 %). Die absolute Konfiguration für das chirale Atom wurde mit (S) mittels Röntgenanalyse bestimmt.
Molekulargewicht: 431,92
Massenspektrometrie: 396
Schmelzpunkt: 260 °C
[α]_D = –21,1 ° (DMF, c = 0,908; 23 °C)
¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 0,26–0,37 (2 H, m); 0,51–0,63 (2 H, m); 1,20–1,31(1 H, m); 1,72–1,95 (4 H, m); 2,80–2,96 (2 H, m); 3,17–3,37 (3 H, m); 3,79–3,88 (2 H, m); 5,48 (1 H, d, J = 14,2 Hz); 5,53 (1 H, d, J = 14,2 Hz); 6,54 (2 H, d, J = 8,2 Hz); 7,17 (1 H, t, J = 8,2 Hz); 7,77 (1 H, s); 8,91 (1 H, br); 9,11 (1 H, br); 10,96 (1 H, s); 11,62 (1 H, s).
IKK-β-3-Kinase-Hemmaktivität: IC₅₀= 4 nM
(+)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3R)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-onhydrochlorid
Gemäß dem oben beschriebenen, ähnlichen synthetischen Verfahren wurde (+)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3R)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-onhydrochlorid als weißer Feststoff erhalten.
Molekulargewicht: 431,92
Massenspektrometrie: 396
Schmelzpunkt: 260 °C
[α]_D = +21,5 ° (DMF, c = 0,920; 25 °C)
1KK-β-Kinase-Hemmaktivität: IC₅₀ = 59 nM

Claims

Optisch aktives (–)-7-[2-(Cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl]-5-[(3S)-3-piperidinyl]-1,4-dihydro-2H-pyrido[2,3-d][1,3]oxazin-2-on der Formel (I):
oder ein Salz davon.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 1 mit einer optischen Reinheit von zumindest 90 % Enantiomerenüberschuss.
Verbindung oder Salz nach Anspruch 1 mit einer optischen Reinheit von zumindest 95 % Enantiomerenüberschuss.
Medikament, das eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1, 2 oder 3 als Wirkbestandteil umfasst.
Medikament, das eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1, 2 oder 3 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten umfasst.
IκB-Kinase-Inhibitor, eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1 als Wirkbestandteil umfassend.
Entzündungshemmendes Mittel, eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1, 2 oder 3 als Wirkbestandteil umfassend.
Entzündungshemmendes Mittel nach Anspruch 7, worin das Mittel wirksam zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten ist, die aus der aus Asthma; allergischer Rhinitis; atopischer Dermatitis; Urtikaria; Konjunktivitis; Frühjahrskatarrh; chronischem Gelenksrheumatismus; systemischem Lupus erythematodes; Psoriasis; diabrotischer Kolitis; SIRS (systemisches inflammatorisches Reaktionssyndrom); Sepsis; Polymyositis; Dermatomyositis (DM); Polyarteriitis nodosa (PN); dem Sharp-Syndrom (MCTD); dem Sjögren-Syndrom; und Gicht bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Immunsuppressivum, eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1, 2 oder 3 als Wirkbestandteil umfassend.
Mittel zur Behandlung von Ischämie, eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1, 2 oder 3 als Wirkbestandteil umfassend.
Antitumormittel, eine Verbindung oder ein Salz davon nach Anspruch 1, 2 oder 3 als Wirkbestandteil umfassend.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungserkrankungen.