TW200403247A - An optically active pyridine derivative and a medicament containing the same - Google Patents

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200403247 A7 B7 五、發明說明（1 ) 技術領域 本發明係有關㈠-7-[2-(環丙基甲氧基）-6-羥苯基]-5-[(3S)_3_哌啶基]·〗，4-二氫-2尺』比啶[2,3-d]n，3]畤畊_2_酮、 其鹽、及含彼等之醫藥製劑。本發明之(-)-7-[2-(環丙基甲 5 氧基）-6-羥苯基]-5-[(35>3-哌啶基]-1，4-二氫-2//』比啶[2,3_ 4[1，3]啐畊-2-酮抑制I/cB激酶yS(IKK_yg)活性，因此抑 制核因子/c B (NF- /c B)活性，而可用於預防及治療NF· /c B相關病症，特別是用於治療炎性疾病。 背景技藝 10 核因子/c B (NF- /c B)屬於由Rel/NF- /c B族多肽組合 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 構成的密切相關之同源及異源二聚物轉錄因子複合物家 族。NF-zcB與相關家族成員涉及調控與免疫及炎性反應 相關的 50 種以上基因[Barnes PJ，Karin Μ (1997) N Engl J Med 336，1066-1071 及 Baeuerle PA，Baichwal VR (1997) 15 Adv Immunol 65，111-137]。於多數細胞類型中，NF-/c B 呈包含50 kDa與65 kDa次單元(p50/RelA)之異質二聚物 存在。異質二聚物與NF-/cB (I/cB)族蛋白質抑制劑相關 連地在細胞質中被隔離，維持失活狀態。I/cB族蛋白質 遮蔽NF- /c B之核移位訊息。在以多種細胞激肽（例如 20 TNF-α：、IL)、CD40配位體、脂多醣(LPS)、氧化劑、有 絲分裂原（例如巴豆毒醇酯）、病毒等刺激細胞時，I/cB蛋 白於專一絲胺酸殘基被磷酸化、多-泛素化，然後經由蛋 白酶體依賴性途徑被降解。無I/cB之攙雜，活性NF-zcB 即可移位至核中，以選擇性方式結合於較佳之基因專一性 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（Ο 促進子序列。由NF-/C Β調控的基因中，有許多為編碼初 炎性介質、細胞激肽、細胞黏著分子、及急性期蛋白 (acute phase proteins)者。數種彼等細胞激肽與介質之表現 接著經由自體調控(autocrine)及鄰近調控(Paracrine)機制導 5 致NF-/c B之進一步活化。 從文獻上可得到暗示NF-/CB在包括呼吸道發炎與氣 喘的許多炎性病症中扮演中心角色之廣泛證據[Yang L et

al·，J Exp Med 188 (1998)，1739-1750 ; Hart LA et al·，Am J Respir Crit Care Med 158 (1998)，1585-1592 ; Stacey MA et 10 al., Biochem Biophys Res Commun 236 (1997), 522-526 ； Barnes P and Adcock IM，Trends Pharmacol Sci 18 (1997)， 46-50] 〇 再者，頃已證實治療氣喘顯然最有效的糖皮質激素， 係利用直接與轉錄因子NF-/C B作用並抑制其活性及活化 15 胜肽-l(AP-l)而抑制吸呼道發炎[Barnes p (1997) Pulmon

Pharmacol Therapeut 10, 3_19 及 Dumont A et al. (1998) Trends Biochem Sci 23, 233-235] 〇 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 一般而言，抑制NF-/cB活性會產生類似於或優於類 固醇所產生之強抗發炎效果，抑制NF-/cB可增進下述疾 20病之典型發炎症狀··氣喘、過敏性鼻炎、異位性皮膚炎、 蓴麻療、結膜炎、春季黏膜炎、類風濕關節炎、紅斑性狼 瘡、牛皮癬、腐蝕性結腸炎、全身性發炎反應症候群、敗 血症、多發性肌炎、皮肌炎、結節性多動脈炎、混合性結 締組織症、修格連氏症候群、痛風等。 •4- $紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公爱） --- 200403247 A7 B7

五、發明說明（3 ) 進一步地，數項研究暗示，NF-/c B在腫瘤變性中扮 演重要角色。例如，由於基因大量表現、擴增、重排、或 移位的結果，NF-/cB與細胞轉形相關連[Mercurio, f，and

Manning，Α·Μ· (1999) Oncogene，18:6163-6171]。於特定 5 人類淋巴樣腫瘤細胞中，NF-/cB家族成員的基因進行重 排或擴增。於 Mayo M.W.，Baldwin A.S. (2000) Biochmica et Biophysica Acta 1470 M55-M62 中，亦揭示 NF-/cB 在 癌症病理上之可能關連。Mayo M.W·等揭示，抑制NF-/c B的結果，將封阻特定癌症（特別是結腸直腸癌）的起始及/ 10 或進展。 最後，NF-/CB亦可能涉及調控神經元細胞死亡。文 獻上已證實，於病f性大腦局部缺血中，NF-zcB被活化 並促進細胞死亡（Nature medicine Vol. 5 No. 5，May 1999) 〇 15 已往數年之精究研究導向確認I/cB激酶(IKK)複合物 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 負責由訊息誘發之I /c B石舞酸化作用[Mercurio，F.，and Manning，Α·Μ. (1999) Current Opinion in Cell Biology， 11:226-232 ; Mercurio，F·，and Manning，Α·Μ· (1999) Oncogene, 18:6163-6171 ； Barnkett, M.? and Gilmore T.D. 20 (1999) Oncogene 18, 6910-6924 ; Zandi，E.，and Karin，M·，

(1999) 19:4547-4551 ； Israel, A.? (2000) trends in CELL BIOLOGY 10:129-133 ;及 Hatada，Ε·Ν，et al. (2000) Current Opinion in Immunology, 12:52-58]。此化合物最可 能為整合導致NF-/cB活化的所有不同刺激之部位。IKK 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（4 ) 複合物（分子量700 - 900 kDa)由多種蛋白質組成，包括兩 種同源T/c B激酶(稱為IKK-α與IKK-召）、上游激酶(誘 發NF-zcB之NTK)、稱為IKAP之染色體支架蛋白（將三 種激酶鏈栓在一起）、及優先與IKK-作用之調控次單元 5 IKK- r 〇 IKK-/3為具756個胺基酸之絲胺酸-蘇胺酸激酶，與 IKK- α具有52%同一性及相同的功能部位結構[Mercurio F et al. (1997) Science 278, 860-866 ； Woronicz JD et al. (1997) Science 278, 866-869 ； Zandi E et aL (1997) Cell 91, 10 243-252]。IKK-沒與IKK-α於試管内及活體内分別形成 同源二聚物及異源二聚物。IKK-/S亦與IKK-r、ikap、 NIK及I /c B a相互作用。重組IKK-冷以同等效力使I /c B a及I/cB泠之專一絲胺酸殘基磷酸化[Li J以a/ (1998) J Biol Chem 273, 30736-30741 ; Zandi E，Chen Y，Karin M 15 (1998) Science 281，1360-1363]。與 IKK-α 相較下，IKK- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 召顯示較高的組成激酶活性，此與IKK-泠之大量表現於 與IKK-a相較下，以較高效力活化NF-/CB依賴性通訊 基因轉錄作用之數據相符合。IKK-冷已被證實在反應包 括 TNF-a、IL-1；S、LPS、抗_CD3/抗-CD28 共同刺激、 20 蛋白激酶C及calcineurin(—種蛋白磷酸酶）、B細胞受體 /CD40配位體刺激、及釩酸鹽之多種刺激下，於多種細胞 株或新鮮人類細胞中被活化。在從罹患風濕性關節炎或骨 關節炎病患的滑膜單離出之似纖維母細胞之滑膜細胞中， IKK-泠被活化[Zandi E 以 α/· (1997) Cell 91，243-252 ; -6- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（5) OXonnell MA et aL (1998) J Biol Chem 273, 30410-30414 i Kempiak SJ et al. (1999) J Immunol 162 3176-3187]。再者，IKK·召可被結構相關的上游激酶MEKK-1 與NIK-很可能係經由T環（活化環）内專一絲胺酸殘基之 5 鱗酸化及被特定蛋白激酶C同功型-活化[Nakano H d α/. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95? 3537-3542 ； Lee FS et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 9319-9324 ； Nemoto S et al. (1998) Mol Cell Biol 18, 7336-7343 ； Lallena MJ et a/· (1999) Mol Cell Biol 19, 2180-2188]。IKK·沒之催化性 10 失活突變種被證實利用TNF-α、IL-1泠、LPS、抗-CD3/ 抗-CD28 刺激，抑制 NF-/cB 之活化[Mercurio F ei α/. (1997) Science 278? 860-866 ； Woronicz JD et al. (1997) Science 278，866-869]。當 MEKK1 或 NIK 大量表現時， 亦觀察到相同效應。此外，活化環申之IKK-万突變抑制 15 IL-1 及 TNF-α 傳訊[Delhase M ei α/· (1999) Science 284, 309-313]。根據上述實驗結果，有明顯證據證實ΙΚκ-泠 與導使NF-zcB活化的多個途徑有重要關連。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 概言之，ΙΚΚ-/3之專一抑制會在活體内產生強抗發 炎性及免疫調節性效應，而可能改善氣喘及其他疾病的根 20 本病因。此外，IKK-抑制劑之抗腫瘤及抗絕血效應可 被預期。

Manna等揭示下式所示之4,6-二取代之3-氰基-2-胺 基111比咬化合物： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200403247 A7 B7 五、發明說明（6)

式中 (R，，R”)代表（OCH3，OCH3)、（α，C1)、（H，C1)、（H， Br)、（Η，CH3)、（Η，OCH3)、（Η，Ν02)、或（Η， 5 N(CH3)2); 或

該等化合物為一般抗發炎、鎮痛、及解熱劑[Eur. J. Med. Chem· 34, 245-254(1999)]。 10 Manna等既未揭示於吡啶環位置4具有脂族基團之口比 唆衍生物，亦未提示對於上述已知批咬衍生物之IKK-泠 激酶或NF- /c B抑制活性。 業界對於具有以對IKK-泠激酶之專一性及選擇性抑 制活性為基礎之有效抗發炎作用的新穎化合物之開發一直 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

200403247 A7 B7 五、發明說明（7) 有所需求。 發明概述 本發明人針對吡啶衍生物之化學修飾進行精深研究的 結果，發現與本發明相關之具新穎化學結構之化合物具有 5 預料之外之極佳IKK-激酶抑制活性。因此本發明係提 供具下式⑴之㈠-7-[2-(環丙基甲氧基)-6-羥苯基]-5-[(3S)-3-哌啶基]_1，4-二氫-2//_吼啶[2,3_J][1，3]呤畊-2-酮或其 鹽：

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 本發明化合物具有光活性，並令人驚奇地顯示甚至比 對應之消旋修飾物或其鏡像異構物（+)_7-[2-(環丙基甲氧 基）_6_羥苯基]-5-[(3i?)-3-哌啶基]-1，4-二氫-27^吼啶[2,3_ θ[1，3]崎畊-2-酮更強之極佳活體内IKK-yS激酶抑制活 性、細胞激肽抑制活性、及抗發炎活性，因此，尤其適於 15 作為抑制NF-zcB活性之試劑用，特別是製造可用於治療 NF-zcB依賴性病症之藥劑或醫藥組成物。 詳言之’由於本發明之（-)-7-[2-(環丙基甲氧基）-6-經 苯基]_5_[(3S)_3-哌啶基]_1，4_ 二氫-2//-吼啶[2,3_d][l，3]啐 畊-2-酮抑制IKK-万激酶活性，因此可用於治療及預防涉 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（8) 及NF-zcB活性之下述疾病之典型發炎症狀：氣喘、過敏 性鼻炎、異位性皮膚炎、蓴麻療、結膜炎、春李黏膜炎、 慢性關節風濕病、紅斑性狼瘡、牛皮癬、腐蝕性結腸炎、 全身性發炎反應症候群(SIRS)、敗应症、多發性肌炎、皮 5 肌炎（DM)、結節性多動脈炎（PN)、混合性結缔組織症 (MCTD)、修格連氏症候群、痛風等。 本發明化合物亦可用於治療及預防像局部缺血及腫瘤 之疾病，因為該等疾病亦與IKK-召激酶及NF-/cB活性 相關。 10 本發明化合物可利用組合多種已知方法予以製備。於 一些具體實例中’作為起始物質或中間產物用的化合物之 一或多個取代基，例如胺基、羧基、及羥基，係利用熟習 此項技藝者已知之保護基有利地予以保護。該等取代基之 實例敘述於 Greene 與 Wuts 之 ’’Protective Groups in 15 Organic Synthesis (2nd Edition)’’。 使具式（Π)之化合物：

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 [式中-OX代表羥基或被適當保護基(例如，苄基、甲氧苄 基、及矽烷基)保護之羥基]與式（III)之醛： -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7

五、發明說明（9 )

(式中X’代表Η或保護基包括，舉例而言，燒氧幾基例如 乙氧羰基、第三丁氧羰基等；或以習知方法可容易地轉化 成Η之其他取代基） CNCH2COOR1 (IV) (式中R1為-CRnR12R13，其中R11、R12、與R13各自獨立 地為基或芳基）、 及銨鹽例如乙酸銨反應，得到下式（V)所示之化合物：

10 式中 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 X、X，、及R1與上述界定相同。 反應可不需溶劑或於溶劑中進行，其中溶劑包括，舉 例而言，醚例如二畤烷與四氫呋喃；芳族烴例如苯、甲苯 與二甲苯；腈例如乙腈；醯胺例如二甲基甲醯胺①“巧與 15 二曱基乙醯胺；亞砜例如二甲亞颯等。反應溫度通常為， 惟不限於，約50°C至200°C。反應可進行通常為30分鐘 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 10 五、發明說明 至48小時 及銨鹽（例，較佳1至24小時。式(II)、（m)、（IV)化合物 二:如乙酸銨）為市售可得’或可以已知技術製備。 鋁雙(2-甲 用還原劑例如氫化鋁鋰、硼氫化鋁、及氫化 COO-H1氣乙氧基）鈉，以習知酯還原法將化合物（V)之-氣、二光基圏轉化成-CH2_0H(步驟D。然後使用例如光 化合物（Vl氣及三光氣，以習知環化法將化合物（VI)轉化成 可利用步驟2)。化合物(VII)中-〇X及·"NX，之保護基 (VIII)(步"知方法（例如酸處理法）去除，得到化合物 化合物3)。由化合物（vm)之對掌異構物分離，得到 用:光活此對掌異構物分離之進行係利用，例如，使 法，較f性胺基酸、糖等組成的對掌性管柱之液相層析 / ^走為使用HPLC或使用光活性有機酸例如㈠_二_對 土-L'•酒石酸之再結晶法。

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 步驟3

(VIII) 對掌性分離

12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247

'發明說明（11 於步驟1、步驟2或步驟3任何一者之前進行對掌分 離步驟，亦可獲得化合物（T)。 對掌性分離 步琢，

步驊1 對掌性分雄 (V) 步驊1 步驟2 步驊2 步驟3 或 或

10 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 20 式（I)所示化合物之典型鹽類包含由本發明化合物與 無機或有機酸、或有機或無機鹼反應製備之鹽。該等鹽分 別為所謂酸加成鹽及鹼加成鹽。 形成酸加成鹽之酸包含無機酸例如，惟不限於，硫 酸'碟酸、鹽酸、氫溴酸、氫峨酸等，及有機酸例如，惟 不限於，對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基磺酸、碳 酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等。 鹼加成鹽包含衍生自無機鹼例如，惟不限於，氫氧化 銨、鹼金屬氫氧化物、鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸 氫鹽等，及有機鹼例如，惟不限於，乙醇胺、三乙胺、參 (羥甲基)胺基甲烷等者。無機鹼之實例包含氫氧化鈉、氫 氧化鉀、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化 鈣、碳酸鈣等。 本發明化合物或其鹽可修飾形成低級烷酯類或已知之 其他酯類；及/或水合物或其他溶劑合物。彼等酯類、水 合物、及溶劑合物均涵蓋於本發明範圍之内。 本發明化合物可呈經口形式（例如，惟不限於，一般 13- 度剌 + 國 H (&(CNS)A4 規格（21G X 297 公釐 f 裝 訂 200403247 Α7 ---—---Β7 五、發明說明（ι〇 及腸衣疑劑、膠囊、丸劑、粉劑、粒劑、_ n溶 5 液^浮液糖聚、固體與液體氣溶膠及乳液)投與；可 呈非經腸形式（例如，惟不限於，_般熟習醫藥技藝人士 心知n靜脈内、腹膜内、皮下、肌内等形式）投與；亦 可經由局部使用適當鼻内載劑呈經鼻内形式，或使用一般 ’’、、習此項技“人士悉知之經皮遞送系統經由經皮途徑投 與。 使用^發月化合物之劑量療程係由一般熟習此項技藝 人士根據^種因素（包含，惟不限於，年齡、體重、性 10 又者的醫學狀況、欲處理狀況的嚴重性，投與途 也接又者的代衝與分泌功能層次、所用劑量形式、所用 特定化合物及其鹽）予以選定。 15

心本發匕σ物牵父好於投與之前與-或多種醫藥上可接 受之賦形劑-起調配。賦形劑為惰性物質例如，惟不限於 載體、稀釋劑、調味劑、甜味劑、潤滑劑、增溶劑、懸浮 劑、黏合劑、錠劑崩解劑及包覆材料。 U 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 又，本發明之另一具體實例為醫藥組成物，其包含本 發明化合物及與調配物其他成分相容且對接受者無害之一 或夕種醫藥上可接受之賦形劑。本發明醫藥組成物係利用 組合治療有效量之本發明化合物與其一或多種醫藥上可接 受之賦形劑而製備。製造本發明組成物時，活性成分可與 稀釋劑混合，或包埋於載體中，該載體可呈膠囊、藥囊、 紙、或其他容器等形式。載體亦可為稀釋劑（其可為具有 載劑作用之固體、半固體、或液體物質），或呈錠劑、丸 14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4視格（210x297公釐） 200403247 A7 _ B7 五、發明說明（1〇 劑、粉劑、片劑、酏劑、懸浮劑 '乳液、溶液、糖震、氣 溶膠、軟膏（含有例如多達〗0重量％活性化合物）、軟與硬 明膠膠囊、栓劑、無菌注射液及無菌包裝粉劑。 供經口投與時，活性成分可組合經口、無毒、醫藥上 5 可接受之載體（例如，惟不限於，乳糖、殿粉、嚴糖、葡 萄糖、碳酸鈉、甘露糖醇、山梨糖醇、碳酸妈、麟酸妈、 石’tL酸妈、甲基纖維素等），及視需要地，將崩解劑（例如， 惟不限於，玉米澱粉、甲基纖維素、洋菜、膨潤土、黃原 糖膠等）、黏合劑（例如，惟不限於，明膠、阿拉伯膠、天 10然糖類、沒-乳糖、玉米甜味劑、天然及合成膠類、黃耆 膠、海藻酸鈉、叛甲基纖維素、聚乙二醇、躐等）、及满 滑劑（例如，惟不限於，硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、硬脂酸、 油酸鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氣化鈉、滑石粉等）一併組 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 於私劑形式中’載體可為微細分割之固體，將其摻合 微細分割之活性成分。活性成分可與具黏合性質之載體以 適當比例混合，使其緊岔結合成為所需形狀及大小，以製 造錠劑。該等粉劑及錠劑含有約丨至約99重量％為本發 明新穎組成物之活性成分。適當固體載體為羧甲基纖維素 鎂、低溫熔融蠟、及可可脂。 無菌液體調配物包含懸浮液、乳液、糖聚及聞。可 使活性成分溶解或懸浮於醫藥上可接受之載體(例如無菌 水、無菌有機溶劑、或無菌水與無菌溶劑之混合物）中。 亦可使活性成分溶於適當有機溶劑（例如，丙二醇水 -15. 200403247 A7 B7 五、發明說明（Η 溶液）中。其他組成物可利用分散微細切 水性澱粉或羧甲基纖維素溶液 、活性成义於 ，配物，用於投與人類二=二 形式，其為含單位劑量之物理分 1里 為-膠囊或錠劑，或許多膠囊或鏡^ 計算欲產生所需治療效果之結合一或多 2里」為經 活性化合物之量。根據相關之特定治療方法; I:成分之量可為約❻·1至約10❹。毫克或画毫; 10 使用於所示效果時，本發明之典型口 毫克/公斤/日至約1〇〇毫克/公斤/日，較佳qi*二= 曰至30 $克/公斤/日’最佳約〇 5毫克/公斤/日至約古 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 克/公斤/日，之範_。於非經腸投與情形下，已概括： 證實有利之投與量為約0_至刚毫克/公斤/日較佳 為〇.〇1毫克/公斤/曰至1毫克/公斤/曰。本發明化合物可 呈單一日劑量投與，或可將全日劑量分成每曰投與二、 三、或三次以上。若係經由經皮形式遞送時，當然，可為 連續投與。 本發明化合物之效力可利用下文之測定法及藥理試驗 20 進行檢測。 [IKK-yS激酶抑制分析】 (1)IKK_沒激酶蛋白之製備 使用以已公告序列[Woronicz JD et al· (1997) Science 278，866-869]設計的一對引子，利用PCR製造編碼人類 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（I5) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 IKK·冷開放譯讀架構之cDNA片段。使用m〇ngase™擴 增套組（Life Technologies)，由 Quickclone cDNA (Clontech)製得模板。將PCR製造之DNA片段進行凝膠 純化’並將其次轉殖至pBluescript中。將轉殖於 5 pBluescript 中之 cDNA 片段嵌入 pcDNA3.1/His C KpnI/Notl 内，並轉移入 pVL1393 Smal/Xbal (Pharmingen) 中’以構築桿狀病毒轉移載體。然後將載體與線型化之桿 狀病毒(BaculoGold™，Pharmingen)—起用來轉染 Sf21 細 胞(Invitrogen，San Diego, CA)。將製造的重組桿狀病毒轉 10 殖及於Sf21細胞中擴增，Sf21細胞係生長於補充10% FCS、50 克/毫升健大黴素(6€1^1!1)^11)、0.1%?1111*〇11化卩-68 (Life Technologies，Inc·)之 TNM-FH 昆蟲細胞培養基 (Life Technologies，Inc·)中，呈懸浮培養(200 毫升，於 1 升錐形瓶中；27 °C ; 130卬m)。根據標準實驗流程 15 [Crossen R5 Gruenwald S (1997) Baculovirus Expression Vector System Instruction Manual， Pharmingen Corporation]，使用感染倍率5，以此擴增病毒感染sf21 細胞，48小時後，予以收集。使細胞溶解，獲得所製造 之以組織胺融合之IKK-yS激酶之嵌合蛋白（His標記之 20 IKK-点）。 (2)純化GST-1/cBa融合蛋白之製備 構築含有於IPTG誘發的啟動子之控制下，編碼具有 I/cBa胺基酸殘基1至54之GST融合蛋白的核苷酸序列 之表現載體。將此表現載體引入大腸桿菌中，培養該轉形 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 __ B7 16 五、發明說明 株’使其溶解，獲得GST-1/cBa融合蛋白。然後純化所 得GST-1/cBa融合蛋白，並予以生物素化，以供激酶分 析之用。 (3) IKK-点激酶活性之測定 5 10 15 進行IKK-之96槽版式激酶分析，以測試本發明化 合物之抑制活性。首先，於U形底之96槽培養盤(Falcon) 中，2.5%二曱亞砜(DMSO)存在下，放置5微升測試化合 物於各槽。背景（BG)及全磷酸化(TP)之對照槽亦均置入5 微升2.5% DMSO。以25微升2 X激酶緩衝液(40 mM Tris_HCl、pH 7·6、40 mM MgCl2、40 mM 冷-磷酸甘油 酯、40 mM對硝苯基磷酸酯、2 mM EDTA、40 mM磷酸 肌酸酯、2 mM DTT、2mM Na3V04、0·2 毫克/毫升 BSA 及〇·8 mM苯基甲基磺醯氟)稀釋重組IKK-冷（最終濃度 0.6微克/毫升）與生物-GST-I/cBa(l_54)(最終濃度0.2// M)，並移入96槽盤中。將不含IKK-召之以25微升2 X 激酶緩衝液点稀釋之生物-GST-I/cBa(l-54)移入BG槽 中。接著添加20微升12.5//M ATP、62.5//Ci/毫升[r- 33 經濟部智慧財產局員工消費合作社印數 P]ATP (Amersham Pharmacia Biotech)，所得混合物於室

溫培育2小時。藉添加150微升終止緩衝液（100 mM 20 EDTA、1毫克/毫升BSA、0.2毫克NaN3)終止激酶反 應。將150微升試樣移至被覆抗生物素鏈菌素之白色

MTP(Steffens Biotechniche Analysen GmbH #08114E14.FWD)，以抓住生物素化之基質。培育1小時 後，使用MW-96培養盤洗滌器（BioTec)，以300微升含 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（I7) 0.9% NaCl及0.1% (w/v) Tween_20之洗滌緩衝液洗滌各 槽五次，以除去未結合之放射活性。添加Π0微升 MicroScint_PS 閃爍雞尾酒（Packard)後，使用 TopCount 閃 爍計數器測定結合放射活性。 5丨Syk酪胺酸激酶選擇性抑制分析1 (1) Syk蛋白之製備 裝 使用RT-PCR方法，以人類伯奇氏淋巴瘤B細胞株 Raji(美國菌種保存中心)之全RNA轉殖編碼人類Syk開放 譯讀架構之cDNA片段。將該cDNA片段嵌入pAcG2T 10 (Pharmingen，San Diego，CA)中，以構築桿狀病毒轉移載 體。然後將載體與線型化之桿狀病毒（BaculoGold™, Pharmingen)—起用來轉染 Sf21 細胞(Invitrogen，San Diego, CA) 〇 將製造的重組桿狀病毒轉殖及於Sf21細胞中擴增。 15 以此擴增之高力價病毒感染Sf21細胞，製造以麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合之Syk激酶之嵌合蛋白。 根據廠商之操作指南，使用麵胱甘肽管柱(Amersham 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Pharmacia Biotech AB, Uppsala，Sweden)純化所得之 GST-Syk，由SDS_PAGE證實其純度在90%以上。 20 (2)胜肽之合成 接著’使用胜肽合成儀合成含有兩個酪胺酸殘基的 3〇 個 殘基胜 肽片段 ， KISDFGLSKALRADENYYKAQTHGKWPVKW 〇 然後將 此片段之N端生物素化，獲得生物素化之活化環胜肽 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公爱) "" 200403247 A7 B7 五、發明說明（l8 ) (AL)〇 (3) Syk酪胺酸激酶活性之測定 所有試劑均以Syk激酶分析緩衝液丨知爪…”卜 HCl(pH 8·0)、10 mM MgCl2、0.1 mM Na3V〇4、0.1%

5 BSA、1 mM DTT]稀釋。首先，於96槽培養盤中，放置 含3·2微克GST-Syk及0.5微克AL之混合物於各槽。然 後’於2.5%二甲亞硪(DMSO)存在下，添加5微升測試化 合物於各槽。於此混合物中添加300 // Μ ΑΤΡ(1〇微升）， 以引發激酶反應。最終反應混合物（50微升）由0 65 nM 10 GST-Syk、3yM AL、30/zM ATP、測試化合物、0 25% DMSO、及Syk激酶分析緩衝液組成。 於室溫(RT)，培育該混合液1小時，藉添加12〇微升 終止緩衝液[50 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1〇 mM EDTA、500 mM NaC卜0.1% BSA]終止反應。將混合液移至被覆抗生 15 物素鏈菌素之培養盤，於室溫培育30分鐘，使生物素_ AL與培養盤結合。以含0.05% Tween-20之Tris-緩衝鹽 液（TBS)[50 mM Tris-HCl (pH 8·0)、138 mM NaC卜 2·7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

mM KC1]洗務培養盤3次後，添加loo微升由5〇 mM

Tris-HCl (pH 8·0)、138 mM NaCl、2·7 mM KC1、1〇/〇 20 BSA、60奈克/毫升抗磷酸酪胺酸單株抗體、先行利用

Amersham Pharmacia 套組以銪標記之 4G10 (Upstate

Biotechnology)組成之抗體溶液，於室溫培育60分鐘。洗 滌之後’添加1〇〇微升增強溶液（Amersham Pharmacia

Biotech)，接著以多重標記計數器ARVO(Wallac Oy， -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 χ 297公釐) 200403247 A7

五、發明說明（19)

Fmland)進行時間解析螢光測量，測定4〇〇毫秒延遲及 400毫秒視窗下340奈米波長之激發及6〗5奈米波長之發 射。 [對得自A549細胞的TNF-α反應所製造RANTES之測 5 量1 (1) A549細胞之製備 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將A549人類肺上皮細胞株(ATCC #CCL_885)保存於 補充10% FCS (Gibco)、1〇〇單位/毫升青黴素、1〇〇微克/ 毫升鏈黴素、及2 mM麵胺醯胺(培養物培養基)之杜貝可 10 氏改良伊果培養基(D_MEM，Nikken Biomedical Institute) 中。接種四萬（4 x l〇4)個細胞於96槽平底組織培養盤 (Falcon #3072)之各槽（80微升/槽）。令培養盤靜置2小 時，因而使細胞黏附於各個槽底。於各槽添加1〇微升載 劑（1% DMSO)、測試化合物於i〇/〇 DMSO中之系列稀釋 15液、或於1 A DMSO中之5 nM地塞米松(Dexamethasone) 作為對照。於37°C培育此混合物(90微升/槽）1小時。其 後，在混合物中添加10微升含1微克/毫升TNF-α之培 養物培養基，獲得100微升反應混合物。培育此反應混合 物24小時，俾使以1〇〇奈克/毫升TNF-α刺激細胞。同 20 時製備具有載劑惟無TNF-α刺激之細胞。 (2) RANTES產量之測定

接著使用定量三明治酵素免疫分析技術測定各槽上澄 液中從細胞釋放之RANTES濃度。首先，於96槽NUNC 螢光培養盤(Nalge Nunc，New York USA)各槽中放置1〇〇 -21- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（2〇 ) 微升含2微克/毫升小鼠抗·ν人類RENTES單株抗體(R&D System，#mAb678)之PBS緩衝液(pH 7句(最終2〇0奈克/ 槽），於4°C令培養盤靜置隔夜，以被抗體被覆。然後以 350 微升洗務緩衝液（0.05% Tween-20、0.85% NaCl、及 5 25 Tns-HCl pH 7.4)洗滌培養盤各槽三次。添加2〇〇 微升含1% BSA (Sigma，純度99%，1〇〇克）、5%嚴糖 (Nacalai tesque，純度 99%，500 克）與 〇·〇2%疊氮化物 (Nacalai tesque，純度99%，500克）之封阻緩衝液於各 槽，然後令培養盤靜置4小時，使經被覆之抗體穩定下 10 來。接著，於具有被覆抗體之該96槽NUNC螢光培養盤 各槽置入50微升上述（1)製備之細胞培養上澄液。以重組 人類 RANTES (Pepro Tech，Inc· #300-06)作為 RANTES 產 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 量之測定標準（線性範圍介於1與10奈克/毫升之間）。各 槽中添加50微升溶於補充1% BSA及0.05% Tween 20的 15 PBS中之以Eu標記之小鼠抗-人類RANTES單株抗體(60 奈克/毫升：R&D Systems，#mAb278)。於室溫培育此反應 混合物 4 小時。使用 Sera Washer (Bio_Tech，#MW-96R)， 以洗滌緩衝液(〇·〇5% Tween-20、0.85% NaCl、及 25 mM Tds_HCl pH 7·4，350微升/槽)洗滌5次後，於各槽添加 20 增強溶液（DELFIA，#1244-405，100微升/槽）。適度振盈 下，於室溫培育培養盤10分鐘。使用DELFIA螢光計 (Wallac)測量螢光強度。於34〇奈米波長進行激發，於 615奈米波長測定發射光譜。 [對得自末梢金液單核細胞(PBMC)的LPS反應所製造 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200403247 A7 B7 五、發明說明（21) TNF-cr之測量】 (1)PBMC之製備 人類PBMC之製備係先自健康供血者獲得血液，然 後從血液中單離細胞。單離係使用Fic〇u paCque 5 (PhaTmacia #17-1440-02)，以 Ficoll 梯度-離心法進行。單 離之PBMC於離開供血者三小時之内使用。以pBS洗滌 三次後，使PBMC再懸浮於補充10% FCS (Gibco)、100 單位/毫升青黴素、1〇〇微克/毫升鏈黴素、及2 mM麩胺 醯胺（培養物培養基）之RPMI 1640 (Nikken Biomedical 10 Institute)中。將細胞(每槽150微升中有1 χ ι〇5個細胞)接 種於96槽平底組織培養盤(Falcon #3072)之各槽。於各槽 添加20微升載劑（1% DMSO)、測試化合物於1% DMSO 中之系列稀釋液、或於1% DMSO中之250 nM地塞米松 作為對照。於37°C培育此混合物（170微升/槽）1小時。 15 其後，在混合物中添加30微升含20奈克/毫升LPS之培 養物培養基，獲得200微升反應混合物。培育此反應混合 物7小時，俾使以3奈克/毫升LPS刺激細胞。同時製備 具有載劑惟無LPS刺激之細胞。然後收集該反應混合物 之上澄液。 20 (2) TNF-α產量之測定 根據廠商推薦，使用DuoSet™ ELISA Development

Kit (Genzyme Techne，Minneapolis，USA)，測定上澄液中 之TNF_ α濃度。首先，在96槽培養盤（NUNC，

Maxisorp™)各槽中放置100微升溶於PBS緩衝液中之4 -23· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

200403247 A7 B7 五、發明說明（22 ) 微克/毫升小鼠抗"·人類TNF-α抗體，於4°C令培養盤靜置 隔夜，以被抗體被覆。然後使用Sera Washer (BioTech， #MW-96R)，以 350 微升含 PBS、0.05% Tween-20(Nalcalai tesque)之洗滌緩衝液洗滌培養盤各槽5次。添加300微升 5 於PBS中之1% BSA (Sigma)、5%蔬糖於各槽。於室溫培 育2小時後，取棄緩衝液，添加50微升培養物培養基。 接著，於該96槽培養盤各槽置入50微升上述（1)製備的 刺激細胞培養物之上澄液。以重組人類TNF-a(Genzyme Techne)作為TNF_a產量之測定標準（線性範圍介於3〇與 10 2,000微微克/毫升之間）。於室溫培育該反應混合物1小 時。經5次洗滌後，在各槽中添加1〇〇微升於補充〇 1% BSA、0·05% Tween 20的PBS(試劑稀釋液）中之生物素化 之山羊抗-人類TNF-a抗體(Genzyme Techne，300奈克/ 毫升），於室溫培育1小時。經5次洗滌後，於各槽添加 15 微升結合抗生物素鍵囷素之辣根過氧化酶（Genzyme 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Techne，1/100，於試劑稀釋液中）。20分鐘後，以洗滌緩 衝液(350微升/槽）洗滌培養盤各槽5次。於混合物中添加 辣根過氧化酶基質及出〇2 (TMBZ過氧化酶檢測套組， SUMILON #ML-1120T)，令該混合物於室溫靜置。1〇分 20 鐘後，藉添加2N HbSO4終止反應。使用微量培養盤讀取 計(Labosystems，Multiscan Multisoft)測定 450 奈米波長之 光密度。利用比較各試樣與標準曲線間之光密度進行各試 樣TNF_ α產量之定量。 [對抗艘刺激反應之Jurkat Τ細跑中製造IL-2之測量】 -24· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 x 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（23 ) 測量 Jurkat T 細胞（E6-1 轉殖株;ATCC # TIB_152) 中，反應抗_CD3/抗_CD28抗體刺激之]^2產量。 (1) 固定化抗體之製備 首先，於96槽培養盤(Falcon #3072)各槽置入抗-CD3 5 抗體(400奈克/槽，Nichirei，NU-T3 4微克/毫升，於100 微升杜貝可氏PBS中），於室溫靜置2小時，使培養盤為 抗體所被覆。然後以250微升PBS洗滌培養盤各槽3 次。 (2) Jurkat細胞培養液之製備 10 於補充加熱失活之胎牛血清、2 mM L-糙胺醯 胺、100單位/毫升青黴素G、及100微克/毫升鏈黴素(培 養物培養基）之RPMI 1640培養基中培養jurkat τ細胞。 將一十萬個（2 X 10個）細胞（190微升/槽)接種於96槽u 形底組織培養盤(Falcon #3077)之各槽。於各槽添加1〇微 15 升載劑(〇·2% DMSO)、化合物於0.2% DMSO中之系列稀 釋液、或於0.2% DMSO中之25 πΜ環孢靈A作為對照。 於37 C、潮滿之5% C〇2 %境中培育此混合物(2qq微升） 1小時。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (3) 刺激細胞 20 將(2)中獲得之反應混合物（1〇〇微升）置入（1)中製備之 抗體固定化培養盤各槽。於該槽中添加抗_CD28抗體 (Nichkd，KOLT-2，6微克/毫升，於細胞培養物培養其 中，50微升/槽）及2.5微克/毫升山羊抗-小鼠κ ^抗二 (Bethyl Laboratories，Cat#A90-119A，1〇 微克/奢并 ,I 於 -25-

200403247 A7 B7 五、發明說明（24 ) 培養物培養基中，50微升/槽）。於37°c培育各槽中之反 應混合物24小時，俾使以固定化之抗-CD3抗體(400奈 克/槽）及抗-CD28抗體（1,5微克/毫升）刺激細胞，然後以 抗小鼠κ鍵抗體(2 · 5微克/毫升）交聯於細胞上之受體。 5 (4) IL-2產量之測定 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 收集反應混合物之上澄液。根據廠商推薦，使用 DuoSet™ ELISA Development Kit (Genzyme Techne, Minneapolis，USA)，測定上澄液中之IL-2濃度。首先， 在96槽培養盤(NUNC，Maxisorp™)各槽中放置100微升 10 溶於PBS緩衝液中之2微克/毫升小鼠抗·人類IL-2抗 體，於4°C令培養盤靜置隔夜，以為抗體所被覆。然後使 用 Sera Washer (Bio-Tech，#MW-96R)，以 350 微升含 PBS、0.05% Tween-20(Nakalai tesque)之洗滌緩衝液洗滌 培養盤各槽5次。添加250微升於PBS中之1% BSA 15 (Sigma)、0.05% Tween 20 (稀釋緩衝液)於各槽。於室溫 培育2小時後，取棄緩衝液，添加50微升培養物培養 基。接著，於被覆小鼠抗-人類IL-2抗體之該96槽培養 盤各槽置入50微升上述(3)製備的刺激細胞培養物之上澄 液。以重組人類IL-2(Genzyme Techne)作為IL-2產量之 20測定標準（線性範圍介於200與5,400微微克/毫升之間）。 於室溫培育該反應混合物1小時。經5次洗滌後，在各槽 中添加100微升於稀釋緩衝液中之生物素化之兔抗_人類 IL_2抗體（Genzyme Techne，1.25微克/毫升），於室溫培 育1小時。經5次洗滌後，於各槽添加1〇〇微升結合抗生 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 x 297公釐） 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200403247 A7 B7 、發明說明（25 ) 物素鏈?素之辣根過氧化酶(Genzyme Techne，1/1000， &稀釋緩衝液中）° 2G分鐘後，以絲緩衝液(35G微升/槽) 洗滌培養盤各槽5次。於混合物中添加基質及H2〇2 (TMBZ過氡化酶檢測套組，sum〗l〇n #mL_112〇t)，令 5該，把合物於室溫靜置。1〇分鐘後，藉添加2N H2S04終止 反應使用微置培養盤讀取計（Labosystems，Multiscan Multisoft)測& 45〇奈米波長之光密度。利用比較各試樣 與標準曲線間之光密度進行各試樣IL-2產量之定量。 [小鼠LPS誘發之TNF-a製造】 10 將八週齡之BALB/c母小鼠分成兩組，對照組及處理 組。經由腹膜内（ip)注射，將含Lps(2〇〇微克/小鼠）之 0.9%生理鹽液投與對照組小鼠。處理組小鼠於Lps注射 30分鐘之前，先以本發明化合物進行中注射。於以戊巴 比妥(80毫克/公斤，ip )麻醉下，Lps注射9〇分鐘後， 15從處理組及對照組小鼠背部靜脈腔收集血液並置入至含 2% EDTA溶液之96槽培養盤中。代下，於1800 Γρπι離 心10分鐘分離血漿，然後以四倍容積含1%牛血清白蛋 白之磷酸鹽緩衝鹽液（pH 7.4)稀釋。使用ELISA套組 (Pharmingen，San Diego, CA)測定試樣中之 TNF-α 濃度。 20 測定各組5隻小鼠之平均TNF-a含量，並計算TNF- a含量之減少百分比。與對照組小鼠相較下，處理組小鼠 之TNF-a含量顯著減少。此結果表示本發明化合物可抑 制LPS誘發之細胞激肽活性。 [大鼠LPS誘發之TNF_a製造] -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

200403247 A7 B7 五、發明說明（26 5 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 20 使用七週齡之Wistar母大鼠。經腹膜内（i.p·)投與大 鼠溶於磷酸鹽緩衝鹽液(pH 7·4)之1毫克LPS(脂多醣）。 LPS注射60分鐘之前，經口投與本發明化合物。以戊巴 比妥(80毫克/公斤，i.p·)麻醉下，LPS注射120分鐘後， 從大鼠背部靜脈腔收集血液並添加於含2% EDTA溶液之 96槽培養盤中。4°C下，於1800 rpm離心10分鐘分離血 漿，然後以四倍容積含1%牛血清白蛋白之磷酸鹽緩衝鹽 液(口117.4)稀釋。使用£1^18八套組(？1^11110^611，8311〇168〇, CA)測定試樣中之TNF-α濃度。 測定各組7-8隻大鼠之平均TNF-a含量，並計算 TNF-a含量之減少百分比。與對照組大鼠相較下，給與本 發明化合物之處理組大鼠，其TNF-a含量顯著減少。此 結果表示本發明化合物可抑制LPS誘發之細胞激肽活 性。 下文實例示出試管内試驗結果。本發明化合物之數據 與利用固相合成法製得者相符合，其純度為約40至 90%。於細胞分析及活體内分析中，本發明化合物亦具有 極佳選擇性及強活性。更具體地，本發明化合物具有對應 消旋性修飾物兩倍強之細胞活性。同時，於大鼠中，本發 明化合物具有對應消旋性修飾物兩倍強之抗發炎活性。再 者，根據Ames-Test師選法’證實本發明化合物不具誘變 性〇 28· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（

iM 下文以實例形式詳細說明本發明，惟彼等實例決不 擬對本發明之界限與範圍構成侷限。於下文之實例中，所 有定量數量，若未另行陳述，則為重量百分比。質譜光譜 5係使用電麗(ES)電離技術(Micromass Platform LC)獲得。 懷點未經校正。於具有Shimadzu Phenomenex ODS 管柱 (4.6宅米X 30毫米）之MiCr〇maSs Platform LC上記錄液 相層析-質譜分析(LC-MS)數據，該管柱以乙腈-水(9:1至 1:9)沖洗’流速為1毫升/分鐘。於預敷之矽膠板(Merck 10 矽膠60F_254)上進行TLC。所有管枉層析分離均使用矽 膠[WAKO-gel C-200 (75-150微米）]。所有化學藥品均為 試条級’係購自 Sigma-Aldrich、Wako Pure Chemical Industries，Ltd.、Tokyo Kasei Kogyo Co· Ltd·。 質子核磁共振（1H NMR)光譜係以Bruker DRX-300於 15 300或500 MHz記錄。以相對於四甲基石夕烷(TMS)之ppm 為單位，記述500 Bruker UltraShieldTM及化學位移。 實例1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1-{2-[(環丙基甲基）氧基卜6_羥苯基}乙酮

-29- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（28 -------- 10 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15 於含1-(2,6·二羥苯基）乙酮（50.0克，328毫莫耳）之丙 酮（1000毫升)攪拌溶液中，添加碳酸鉀(227克，1643毫 莫耳）與（溴甲基)環丙烷(35.1毫升，36〗毫莫耳）。於5〇°C 攪拌此反應混合物2天。於Celite®上過濾反應混合物， 然後減壓濃縮濾液。其殘留物以水稀釋，並以乙酸乙酯萃 取。分離之有機相以水及鹽液洗滌，以MgS04脫水，過 濾及減壓濃縮。使殘留物懸浮於己烷中，接著於8〇。(3攪 拌該懸浮液30分鐘。過渡此溶液，令濾液冷卻至室溫。 過濾收集所得白色固體，以己烷洗滌，減壓乾燥，得到呈 淡黃色固體之1-{2-[(環丙基甲基）氧基]-6-羥苯基}乙酮 (56.3 克，產率：83%)。 1-{2-(環丙基甲氧基)-6-丨(4_甲氧苄基）氧基】笨基}乙酮

於含1_{2-[(環丙基甲基）氧基]_6_經苯基}乙酮（56 3 克，272毫莫耳）之丙酮（100〇毫升）攪拌溶液中，添加碳 酸鉀（188克，1364毫莫耳）、4-甲氧苄基氣(4〇 9毫升， 300毫莫耳)及填化四丁基敍(20.2毫克，54.6毫莫耳）。回 •30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（29) 流加熱此混合物隔夜。令反應混合物冷卻至室溫，於 Celite®上過濾，然後減壓濃縮濾液。其殘留物以水稀釋， 並以乙酸乙酯萃取。分離之有機相以鹽液洗滌，以 MgS〇4脫水，過濾及減壓濃縮。然後以乙醇將所得白色 5 固體再結晶，過渡收集之，以乙醇洗滌，減壓乾燥，得到 呈白色固體之1-{2-(環丙基甲氧基)-6-[(4-甲氡苄基）氧基] 苯基}乙_(79.2克，產率：89%)。 2-胺基-4-[1-(第三丁氧羰基)-3-哌啶基】·6-{2-(環丙基甲氧 基)·6-【(4·甲氧苄基）氧基】苯基}菸鹼酸第三丁輯

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於9(TC，攪拌含1-{2-(環丙基甲氧基)_6_[…甲氧节 基）氧基]苯基}乙酮（10.00克，30·638毫莫耳）、3·甲醯基· 1-哌啶曱酸第三丁酯（13·069克，61 275毫莫耳）、氰基乙 酸第三丁酯（8.650克，61.275毫莫耳）、及乙酸銨（69〇2 克91.913笔莫耳）之二u亏烧（1〇亳升）混合物隔夜。冷卻 至室溫後，以乙酸乙酯（100毫升）稀釋反應混合物。於混 合物中添加氣酿（1.507克，6.128毫莫耳），並於室溫授 -31- 本紙張尺度適家標準(CNS)A4規格G χ 297公爱 -- 200403247 A7 B7 五、發明說明（3〇 ) 拌。1.5小時後，於混合物中添加抗壞血酸（1.079克， 6.128毫莫耳）。攪拌1.5小時後，將該混合物分配於乙酸 乙酯與水之間。其有機相以鹽液洗滌，以MgS04脫水， 過濾，然後減壓濃縮。所得殘留物於矽膠上利用管柱層析 5 法（己烷/乙酸乙酯二2/1)予以純化，得到呈淡褐色形式之2- 胺基-4-[1-(第三丁氧獄基）-3-派咬基]-6-{2-(環丙基甲氧 基)-6-[(4-甲氧苄基）氧基]苯基}菸鹼酸第三丁酯（4·9克， 24%) 〇 3-丨2-胺基_6-{2-(環丙基甲氧基)-6_【(4_甲氧苄基）氧基]苯 10 基卜3-(羥甲基)-4-吡啶基】-1-派啶甲酸第三丁酯

氬氣氛圍下，於含2-胺基-4-[1-(第三丁氧羰基)-3-哌 啶基]_6_{2_(環丙基甲氧基)-6-[(4-甲氧苄基）氧基]苯基}菸 鹼酸第三丁酯（4.9克，7.426毫莫耳）之四氫呋喃（60毫升) 15 冷卻溶液中，逐滴添加Vitride®(10毫升）。於0°C持續攪 拌1小時。以飽和NH4C1水溶液終止反應後，於混合物 中添加飽和酒石酸納钟水溶液，然後急劇授拌。以乙酸乙 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200403247 A7 B7 五、發明說明（Μ 酯萃取該混合物，以水及鹽液洗滌，以MgS04脫水，過 濾，及減壓濃縮，得到3-[2-胺基-6-{2-(環丙基甲氧基)-6-[(4-甲氧苄基）氧基]苯基}-3-(羥曱基)-4-吼啶基]-1-哌啶甲 酸第三丁酯，不需進一步純化，直接於下一步驟使用 (4.38克，產率：定量）。 3-(7_{2-(環丙基甲氧基)-6- [(4-甲氧节基）氧基】苯基}·2-酮 基·1，4-二氩_2Η·吡啶[2,3-d】[l，3】哼畊_5_基)-1-旅啶甲酸第 三丁酯

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 氬氣氛圍下，於含實例17-1步驟(2)製得的3-[2_胺 基-6-{2-(環丙基甲氧基)-6-[(4-曱氧苄基）氧基]苯基卜3·(羥 曱基)-4-吡啶基]-1-哌啶甲酸第三丁酯（5.0克，8.478毫莫 耳），與二異丙基乙胺(4.12毫升，25.435毫莫耳）之四氫 呋喃（200毫升）冷卻（0°C)溶液中，逐滴添加含三光氣 15 (1.258克，4.239毫莫耳）之四氫呋喃（100亳升）溶液。令 此混合物加溫至室溫，持續攪拌3小時。以水終止反應 後，以乙酸乙酯萃取該混合物。分離之有機相以鹽液洗 滌，以MgS04脫水，過濾，及減壓濃縮。所得殘留物於 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（32) 矽膠上利用管柱層析法（己烷/乙酸乙酯=1/1)予以純化，得 到呈白色形式之3-(7_{2-(環丙基甲氧基)-6-[(4-甲氧苄基） 氧基]笨基卜2-酮基-1，4-二氫-2H-吼啶[2,3_d][1，3】呤畊_5-基)-1-哌啶甲酸第三丁酯（3.2克，產率：61%)。 5 7-丨2-(環丙基甲氧基)-6-羥苯基卜5-(3-哌啶基)-1，4-二氫-2H- 咐啶[2,3-d】[1，3]畤啡-2-酮盥酸鹽

X

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於室溫，在含3-(7-{2-(環丙基甲氧基)_6-[(4-甲氧苄 基）氧基]苯基}-2-酮基-1，4·二氫-2H』比啶[2,3-(1][1，3】畤畊-10 5-基）-1-哌啶甲酸第三丁酯（2.0克，3.248毫莫耳）之二畤 烷（15毫升）溶液中，添加4N HC1之二崎烷溶液(30毫 升）。持續攪拌3小時。蒸發去除溶劑後，所得固體以乙 腈研製，過濾收集之，並以乙腈洗滌。減壓乾燥固體，得 到呈白色固體之7-[2-(環丙基甲氧基)-6-經苯基]-5-(3-旅唆 15 基）_1，4_二氫 _2H_吡啶[2,3-d][l，3]哼啡-2-酮鹽酸鹽（0.865 克，產率：62%)。 _34_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（33) (-)-7-[2-(環丙基甲氧基)_6_羥笨基]·5-[(3Λ>3-哌啶基】-1，4-二氩_2及-nb啶丨2,3-妁丨1，3】畤畊-2-酮（_)_二-對甲苯醢基-1^ 酒石酸鹽

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 於乙醇(30毫升）與水(3.0毫升）之混合液中，加熱溶 解含7-[2-(環丙基甲氧基)-6-經苯基]-5·(3-旅咬基)-1，4-二 氫-2Η』比啶[2,3-d][l，3]畤畊-2-酮（0.700克，1.770毫莫耳） 與(-)-二-對甲苯醯基-L-酒石酸(0.684克，0.213毫莫耳）之 混合物。令此混合物冷卻至室溫，靜置隔夜。過濾收集所 10 得沉澱，以乙醇洗滌[85% ee(容許誤差）]。以相同溶劑 (10%水/乙醇）將產物再結晶，減壓乾燥，得到（-)-7-[2-(環 丙基甲氧基)-6-羥苯基]-5-[(35>3-哌啶基]-1，4-二氫-2//-。比 啶[2,3d][l，3] 口号畊-2_酮㈠-二-對甲苯醯基-L-酒石酸鹽 (0·115 克，>98% ee，產率：8%)。 15 實例2 (35)·(·)-3-(7-{2-(環丙基甲氧基)-6_[(4-甲氧苄基）氧基I苯 基卜2-酮基-1，4-二氩-2及-nb啶[2,3-妁[1，3】呤畊-5-基)-1-哌 啶甲酸第三丁酯 •35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（34

於下述條件下，使用HPLC進行3-(7-{2-(環丙基曱氧 基)-6-[(4-甲氧苄基）氧基]苯基}-2-酮基二氫比啶 [2,3W][1，3]呤畊-5-基）-1-派啶甲酸第三丁酯之對掌性分 離： 管柱：Daisel CHIRALPAK OD (Daicel Chemical Industries,

Ltd.) 管柱大小：250 * 20毫米ID 溶洗液：己烷/異丙醇，60/40 (容積/容積） 10 流速：20毫升/分鐘 滯留時間：31分鐘[(+)-異構物]，45分鐘[(-)-異構物] 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 獲得呈無色形式經分離之㈠·異構物，（35>(-)_3_(7_ {2-(環丙基甲氧基)-6-[(4-甲氧苄基）氧基]苯基}_2-_基_ M-二氫吼啶[2,3-d][l，3]呤畊-5-基）·1_哌啶甲酸第三 15 丁酯。 分子量：615.73 質譜分析：616 [a]D= _23.8。（CHC13，c = 1.035，230〇 獲得呈無色形式經分離之(+)-異構物，（3/^)-(+)-3-(7- -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（35 ) {2-(環丙基甲氧基）-6-[(4-甲氧苄基）氧基]苯基}-2-酮基_ 1，4_二氫-2/7-口比啶[2,3-4[〗，3]呤畊_5-基）-1_哌啶甲酸第三 丁酯。 分子量：615.73 5 質譜分析：616 [a]D= +22.5。（CHC13，c = 1.012，22〇C) (-)-7-[2-(環丙基甲氧基)-6-羥苯基]-5-[(35>3-哌啶基】-1，4-二氩-2及-吡啶丨2,3_«f】[1，3】呤畊-2·網鹽酸盥

X

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 10 於室溫，在（3S)-(-)-3-(7-{2-(環丙基甲氧基）-6·[(4-甲 氧苄基）氧基]苯基}-2-酮基-1，4·二氫-27/•吼啶[2,3-刃[1，3] 哼畊-5-基)-1-哌啶曱酸第三丁酯（1.0克，1.624毫莫耳）之 二噚烷（15亳升）溶液中，添加4N HC1之二啐烷溶液(30 毫升）。持續攪拌3小時。蒸發去除溶劑後，所得固體以 15 乙腈研製，過濾收集之，並以乙腈洗滌。此固體以甲醇再 結晶，得到呈白色固體之(-)-7-[2-(環丙基甲氧基)-6-羥苯 基]-5-[(3S)-3-哌啶基]-1，4-二氫-2//-口比啶[2,3W][1,3]4 畊- -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（36) 2-酮鹽酸鹽(0.502克，產率：71%)。利用X射線分析， 確定對掌原子之絕對組態為(S)。

分子量：431.92 質譜分析：396 5 熔點：260°C

[α]〇 = -21.1° (DMF, c = 0.908,23°C) ^-NMR (500 MHz, DMSO-d6): 0.26 ~ 0.37 (2H, m), 0.51 - 0.63 (2H, m), 1.20 ~ 1·31 (1H，m)，1.72 - 1.95 (4H，m)，2·80 - 2·96 (2H，m)，3.17 - 3.37 (3H，m)，3.79 -3.88 (2H, m), 5.48 (1H, d, J = 14.2 Hz), 5.53 (1H, d, J = 14.2 Hz), 6.54 (2H, d, J -8.2 Hz), 7.17 (1H, t, J = 8.2 Hz), 7.77 (1H, s)5 8.91 (1H, br), 9.11 (1H, br), 10.96 (1H, s), 11.62 (lH,s).

ΙΚΚ-β激酶抑制活性：IC5〇 = 4 nM (+)-7-[2-(環丙基甲氧基)-6·羥苯基1-5-丨(31?)·3-哌啶基】-1，4-二氫_2及-啦啶[2,3-rf】[l，3]«f啡-2-酮鹽酸盥

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 根據上述類似合成途徑，製得呈白色固體之(+)-7-[2-(環丙基甲氧基）-6-沒苯基]_5_[(3及)-3 -派淀基]-1，4-二氮_ 2//-吡啶[2,3·^/][1,3]畤畊-2-酮鹽酸鹽。 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 A7 B7 五、發明說明（37)

分子量：431.92 質譜分析：396 熔點：260°C

[a]D = +21.5。（DMF，c = 0.920，25〇C) 5 ΙΚΚ-β激酶抑制活性：IC5G = 59 nM

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 200403247 Α8 Β8 C8 D8 六、申請專利範圍 1. 一種具下式(I)之光活性(-)-7-[2-(環丙基甲氧基)-6-羥苯 基]-5-[(3S)-3-哌啶基]-1，4-二氫比啶[2,3-d][i，3] 口号 畊-2-酮或其鹽：

   5 2.如申請專利範圍第1項之化合物或其鹽，其具有至少 90%鏡像性過量之光純度。 3. 如申請專利範圍第1項之化合物或其鹽，其具有至少 95%鏡像性過量之光純度。 4. 一種藥劑，其包含如申請專利範圍第1、2或3項之化 10 合物或其鹽作為活性成分。 5. —種藥劑，其包含如申請專利範圍第1、2或3項之化 合物或其鹽以及一或多種醫藥上可接受之賦形劑。 6. —種ΙκΒ激酶抑制劑，其包含如申請專利範圍第1項 之化合物或其鹽作為活性成分。 15 7. —種抗發炎劑，其包含如申請專利範圍第1、2或3項 之化合物或其鹽作為活性成分。 8.如申請專利範圍第7項之抗發炎劑，其中該製劑可有 效地治療或預防下述疾病：氣喘、過敏性鼻炎、異位 性皮膚炎、蓴麻疹、結膜炎、春李黏膜炎、慢性關節 -40 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）

   經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 200403247 A8 B8 C8 D8 10 15 經濟部智慧財產局員工消費合作社印M 六、申請專利範圍 風濕病、紅斑性狼瘡 '牛皮廯、腐蝕性結腸炎、全身 性發炎反應症候群（SIRS)、敗血症、多發性肌炎、皮 肌炎(DM)、結節性多動脈炎(PN)、混合性結締組織症 (MCTD)、修格連氏症候群(Sjoegren’s syndrome)、及 痛風。 9，一種免疫抑制劑，其包含如申請專利範圍第1、2或3 項之化合物或其鹽作為活性成分。 10·—種局部缺血治療劑，其包含如申請專利範圍第^、2 或3項之化合物或其鹽作為活性成分。 11· 一種抗腫瘤劑，其包含如申請專利範圍第i、2或3項 之化合物或其鹽作為活性成分。 12.—種治療疾病之方法，該方法包括投與有其需要之對 象有效量之根據申請專利範圍第！、2或3項之化合 物。 13· —種使用根據申請專利範圍第丨、2或3項之化合物製 備用於治療炎性病症之藥劑之用途。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 200403247 (一） 、本案指定代表圖爲：第_圖無 (二） 、本代表圖之元件代表符號簡單說明： Μ j\ w

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