DE69911237T3 - Selektion und verwendung von milchsäurebakterienstämmen, die die nicht-spezifische immunität modulieren können - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Milchsäurebakterien als Regulationsmittel für die Entzündung der Darmschleimhaut.
  • Milchsäurebakterien werden traditionell verwendet, um fermentierte Lebensmittel herzustellen, insbesondere Milchprodukte.
  • Es wurde beschrieben, dass einige dieser Lebensmittel außer ihren Nährstoffqualitäten auch gesundheitsfördernde Effekte besaßen. Diese Eigenschaften waren seit einigen Jahrzehnten Gegenstand von besonderem Interesse und es wurden zahlreiche Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, sie zu bestätigen und die Rolle, die die Milchsäurefermente spielen, genauer zu bestimmen.
  • Es wurde daher gezeigt, dass einige Milchsäurebakterien, insbesondere unter den Laktobazillen, und Bifidobakterien, die Immunität gegen infektiöse Agenzien verbesserten [PAUBERT-BRAQUET et al., Int. J. Immunother. 11, 153–161 (1995); KAILA et al., Dis. Child. 72, 51–53 (1995); HUDAULT et al., Appl. Environ. Microbiol. 63, 513–518 (1997)] und auch eine Antitumoraktivität besaßen [HAYATSU et al., Cancer Lett. 73, 173–179 (1993); HOSONO et al., Agric, Biol. Chem. 54, 1639–1643 (1990); HOSODA et al., J. Dairy Sci. 75, 976–981 (1992)].
  • Diese Effekte wurden insbesondere einer Wirkung auf die Zusammensetzung der Mikroflora des Darms, auf die Schädigung pathogener Mikroorganismen und/oder auf eine direktere Wirkung auf das Immunsystem zugeschrieben, die sich besonders in einem erhöhten Spiegel von Cytokinen, die das Immunsystem aktivieren, wie IFN-γ oder Interleukinen, sowie einer erhöhten Zahl aktivierter Zellen, die in die spezifische oder unspezifische Immunreaktion eingreifen, wie Lymphozyten oder Makrophagen, und einer vermehrten Sekretion von Immunglobulinen manifestiert [PERDIGON et al., Int. J. Immunother. 9, 29–52 (1993); PORTIER et al., Int. J. Immunother. 9, 217–224 (1993); SOLIS PEREYRA und LEMONNIER, Nutr. Research 13, 1127–1140 (1993); DE SIMONE et al., Int. J. Immunother. 9, 23–28 20 (1993); PERDIGON et al., J. Dairy Res. 61, 553–562 (1994); SCHIFFRIN et al., J. Dairy Sci. 78, 491–497 (1995)].
  • Es zeigt sich jedoch, dass die von den Milchsäurebakterien induzierten förderlichen Effekte je nach der Ursache der betroffenen Pathologie, der verwendeten Bakterienspezies und/oder dem verwendeten Bakterienstamm und den Verabreichungsbedingungen variieren können. Um die Verwendung dieser Bakterien oder der Produkte, die sie enthalten, im Zusammenhang mit der Behandlung oder der Vorbeugung von spezifischen Pathologien besser anzupassen und um die für die gewünschte Verwendung am besten geeigneten Bakterien auswählen zu können, ist es daher notwendig, die Mechanismen, durch die sich ihre Effekte auswirken, besser kennen zu lernen.
  • Die Erfinder haben den Effekt von Milchsäurebakterien der Gruppe Lactobacillus casei auf die Darmschleimhaut untersucht; sie haben zu diesem Zweck den Stamm L. casei DN 114001 gewählt. Dieser Stamm wird in der PCT-Anmeldung WO 96/20607 im Namen der COMPAGNIE GERVAIS DANONE beschrieben und wurde am 30. Dezember 1994 bei der CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes) des Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, in Paris unter der Nummer I-1518 hinterlegt, und seine günstigen Eigenschaften im Zusammenhang mit der Behandlung von Diarrhöen wurden gezeigt.
  • Die Erfinder haben den in vitro-Effekt dieses L. casei-Stamms auf die Produktion von Mediatoren für die unspezifische Immunität (proinflammatorische Cytokine und Stickstoffmonoxid) durch Enterozyten in Kultur untersucht.
  • Diese Zelllinien, die von humanem Darmepithel stammen, stellen ein Untersuchungsmodell für dessen Reaktion auf eine infektiöse oder sonstige Aggression dar. Diese Reaktion manifestiert sich besonders in der Produktion von proinflammatorischen Cytokinen (hauptsächlich IL-1, IL-6, TNF-α) und Stickstoffmonoxid (NO), das durch eine induzierbare Isoform der NO-Synthase (iNOS) erzeugt wird. Das Stickstoffmonoxid ist wegen seiner antimikrobiellen Eigenschaften an der Abwehr gegen pathogene Mikroorganismen beteiligt, und wenn es in geringer Menge produziert wird am Schutz der Darmschleimhaut. In hoher Dosis vermindert es jedoch die Lebensfähigkeit der Epithelzellen und trägt zur Entstehung und Aufrechterhaltung eines chronischen entzündlichen Zustands bei [ALICAN und KUBES, Am. J. Physiol. 270, G225–237 (1996); TEPPERMAN et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 271, 1477–1482 (1994)]. Die NO-Produktion durch Enterozyten in Kultur kann durch proinflammatorische Cytokine [VALETTE et al., Br. J. Pharmacol., 121, 187–182 (1997); KOLIOS et al., Br. J. Pharmacol., 116, 2866–2872 (1995)] sowie durch Lipopolysaccharid(LPS)-Toxine bestimmter gram-negativer Bakterien (TEPPERMAN et al., 1994, a. a. O) induziert werden. Jüngere Arbeiten [SALZMAN et al., Gastroenterology, 114, 93–102 (1998); WITTHOFT et al., Am. J. Physiol., 275, G564–571 (1998)] zeigen, dass die enteropathogenen Bakterien Escherichia coli, Salmonella dublin, Shigella flexneri die Expression von iNOS und die NO-Produktion in durch proinflammatorische Cytokine voraktivierten oder nicht voraktivierten Enterozytenkulturen induzieren.
  • Die Erfinder haben nun bei ihren Versuchen mit L. casei festgestellt, dass die Wirkung auf die Produktion von proinflammatorischen Cytokinen und von NO je nach Aktivierungszustand der Enterozyten variierte. Wenn sich die Zellen in ihrem Grundzustand befinden, beobachtet man tatsächlich keinen Effekt von L. casei; wenn sie durch die Zugabe von proinflammatorischen Cytokinen (was die Bedingungen einer infektiösen oder sonstigen Aggression reproduziert) aktiviert sind, beobachtet man eine schwache Produktion von NO und TNF; diese Reaktion auf die Aggression wird durch Zugabe von L. casei sehr signifikant erhöht. Im Fall von durch Zugabe von inflammatorischen Cytokinen und LPS hyperaktivierten Zellen (was die Bedingungen eines pathogenen entzündlichen Zustands reproduziert) beobachtet man dagegen eine Abnahme der Produktuion von NO und TNF, die auf ein optimale Niveau zurückgeführt ist.
  • Es zeigt sich also, dass dieser L. casei-Stamm über die Modulation von Faktoren, die in die unspezifische Immunität eingreifen, eine adaptive Reaktion der Zellen auf die Aggression fördert.
  • Der Nachweis dieser Eigenschaften erlaubt es, die Verwendung des L. casei-Stamms CNCM I-1518 zur Herstellung von Zusammensetzungen vorzuschlagen, die eine pathogene entzündliche Reaktion inhibieren, zur Vorbeugung oder Behandlung akuter oder chronischer entzündlicher Darmpathologien (Colitis, Enteritis, Morbus Crohn, hämorrhagische Rectocolitis), sei es dass diese Pathologien infektiöse Ursachen haben (induziert durch Bakterien, Viren, Hefen usw.) oder nicht; sie eignen sich insbesondere im Zusammenhang mit der Behandlung chronischer entzündlicher Zustände.
  • Vorteilhaft verwendet man einen Stamm, der außerdem befähigt ist, die NO-Produktion durch Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Cytokine voraktiviert sind, zu erhöhen.
  • Erfindungsgemäß können die Milchsäurebakterien in Form von ganzen lebenden oder nicht-lebenden Bakterien, in Form von Bakterienlysat oder in Form von Bakterienfraktionen verwendet werden; die Bakterienfraktionen, die für diese Verwendung geeignet sind, können ausgewählt werden, indem man ihre Eigenschaften testet, die NO-Produktion durch Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Cytokine voraktiviert sind, zu erhöhen und die NO-Produktion durch Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Cytokine und bakterielle LPS voraktiviert sind, zu vermindern.
  • Vorzugsweise können die Zusammensetzungen in Form von Nahrungsergänzungsmitteln verabreicht werden. Es kann sich insbesondere um fermentierte Milchprodukte handeln; in diesem Fall können die erfindungsgemäß zur Herstellung dieser Zusammensetzung verwendeten Milchsäurebakterien Teil des zur Herstellung dieser Milchprodukte eingesetzten Ferments bilden.
  • Es wird der Stamm CNCM I-1518 verwendet.
  • Weitere neue Milchsäurebakterienstämme, die mit die unspezifische Immunität modulierenden Eigenschaften ausgestattet sind und insbesondere zur Herstellung von Zusammensetzungen verwendet werden können, die die entzündliche Reaktion der Enterozyten regulieren, können mit einem Screeningverfahren erhalten werden, das die Selektion von Milchsäurebakterienstämmen umfasst, die befähigt sind, die NO-Produktion durch Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Cytokine und bakterielle LPS voraktiviert sind, zu vermindern.
  • Vorteilhaft umfasst das Verfahren außerdem einen Selektionsschritt auf Stämme, die befähigt sind, die NO-Produktion durch Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Cytokine voraktiviert sind, zu erhöhen, und gegebenenfalls einen Selektionsschritt auf Stämme, die keinen Effekt auf die NO-Produktion von nichtaktivierten Enterozyten ausüben.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden diese Stämme aus Milchsäurebakterienkulturen gescreent, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Laktobazillen, Laktokokken, Streptokokken und Bifidobakterien besteht.
  • Die Erfindung umfasst ferner Nahrungsmittel und Nahrungsergänzungsmittel, insbesondere fermentierte Milchprodukte, die diese neuen Stämme oder insbesondere durch Lyse oder Zellfraktionierung davon abgeleitete Produkte enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgende genauere Beschreibung besser verständlich, die nicht-beschränkende Beispiele betrifft, die den Nachweis der Eigenschaften des Stamms CNCM I-1518 veranschaulichen.
  • ALLGEMEINE VERSUCHSVORSCHRIFTEN
  • Die eingesetzten rekombinanten humanen Cytokine (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, 10 U/mg) stammen von der Firma IMMUGENEX (Los Angeles, CA); PDTC (Inhibitor für die Bildung des Transkriptionsfaktors NFκB), L-NAME (Inhibitor für die NO-Synthasen) und Lipopolysaccharid von Escherichia coli stammen von der Firma SIGMA (St. Louis, MO).
  • ELISA-Testkits für die Cytokine IL-1β und TNF-α stammen von der Firma BIOSOURCE.
  • Die bei den Versuchen eingesetzten Gesamtextrakte von L. casei werden durch 10-minütige Ultraschallbehandlung von Suspensionen des Stamms CNCM I-1518 zum Aufbrechen der Bakterien erhalten.
  • Kultivierung und Stimulierung der Enterozyten
  • Es wurden die 2 Colonkarzinomzelllinien HT29 und Caco-2 verwendet.
  • Die ursprünglich von FOGH und TREMPE isolierte Linie HT29 (Human Tumor Cells In Vitro, 115–156, J. FOGH, Hrsg., Plenum Press, New York, 1975) ist von der ATCC-Sammlung (Rockville USA) unter der Nummer ATCC HTB-38 erhältlich.
  • Die ursprünglich von FOGH isolierte Linie Caca-2 (J. Natl. Cancer Inst. 58, 209–214, 1977) ist von der ATCC-Sammlung (Rockville USA) unter der Nummer ATCC HTB-37 erhältlich.
  • Legenden zu den Figuren:
  • 1 zeigt die NO-Produktion durch Caco-2-Zellen, die mit CYTOMIX voraktiviert
    Figure 00070001
    oder nicht voraktiviert (O) waren, oder durch HT-29-Zellen, die mit CYTOMIX voraktiviert (∎) oder nicht voraktiviert (☐) waren, in Gegenwart zunehmender Mengen Gesamtextrakt des Stamms CNCM I-1518.
  • 2 zeigt den Effekt von L-NAME auf die NO-Produktion durch Caco-2-Zellen oder durch HT-29-Zellen, die mit CYTOMIX voraktiviert waren, in Gegenwart oder Abwesenheit von Gesamtextrakt (3% v/v) des Stamms CNCM I-1518.
    Figure 00070002
    + L-NAME
    (∎) Kontrolle
  • 3 zeigt den Effekt von L-NAME und von PDTC auf die Produktion von TNF durch Caco-2-Zellen oder durch HT-29-Zellen, die mit CYTOMIX voraktiviert waren, in Gegenwart oder Abwesenheit von Gesamtextrakt (3% v/v) des Stamms CNCM I-1518.
    Figure 00070003
    + L-NAME
    (∎) Kontrolle
    Figure 00070004
    PDTC
  • 4 zeigt die NO-Produktion durch Caco-2-Zellen, die mit CYTOMIX allein (O) oder mit CYTOMIX + LPS
    Figure 00070005
    voraktiviert waren, oder durch HT-29-Zellen, die mit CYTOMIX allein (☐) oder mit CYTOMIX + LPS (∎) voraktiviert waren, in Gegenwart zunehmender Mengen Gesamtextrakt des Stamms CNCM I-1518.
  • BEISPIEL 1: EFFEKT VON L. CASEI AUF DIE PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID DURCH DIE COLONEPITHELZELLLINIEN
  • Jede der 2 Linien wurde mit 2 × 105 Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in DMEM-Medium, das mit 5% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin supplementiert war, angesät.
  • Die Zellen werden 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2, in Gegenwart von CYTOMIX (Mischung aus IL-1β: 10 ng/ml, TNF-α: 25 ng/ml, IFN-γ: 103 U/ml) inkubiert. Anschließend werden die Zellen weitere 24 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit zunehmender Mengen Gesamtextrakt von L. casei (in % Vol/Vol) inkubiert.
  • Nach der Inkubation werden die Kulturüberstände zurückgewonnen und vor der Bestimmung der Nitritkonzentration eingefroren. Bei einigen Versuchen wurde L-NAME (1 mM), das ein L-Argininanaloges ist und einen spezifischen kompetitiven Inhibitor der NO-Synthasen darstellt, gleichzeitig mit den L. casei-Extrakten zugegeben.
  • Die produzierte NO-Menge wird in den Kulturüberständen durch Analyse der stabilen Derivate dieses Radikals nach dessen Umsetzung in wässrigem Milieu festgestellt: der Nitrite und Nitrate. Die Nitrate werden zuerst durch Bakterien, die Nitrat-Reduktase exprimieren, zu Nitriten reduziert, und die Nitrite werden dann nach der GRIESS-Methode analysiert. Zu 100 μl Überstand werden 100 μl einer Lösung gegeben, die aus 1 Volumenteil einer 1%igen Sulfanilamid-Lösung in 30%iger Essigsäure und aus 1 Volumenteil einer 1%igen Lösung von N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin-Dihydrochlorid in 60%iger Essigsäure besteht. Mit verschiedenen Konzentrationen von in Kulturmedium (DMEM 5% FCS) gelöstem Natriumnitrit wird eine Standardeichkurve erstellt. Dann wird die Extinktion bei 540 nm mit einem MULTISCAN MCC340-Reader (LABSYSTEM) bestimmt.
  • 1 zeigt, dass man in Gegenwart von CYTOMIX allein nur eine begrenzte NO-Produktion durch die Linien HT-29 und Caco-2 beobachtet; diese Produktion wird durch die Zugabe von L. casei-Extrakt dosisabhängig erhöht. Ein maximaler Effekt wird bei einer Konzentration von etwa 3% (v/v) L. casei-Extrakt beobachtet. In Abwesenheit von CYTOMIX hat L. casei keinen Effekt auf die NO-Produktion durch die beiden Linien.
  • 2 zeigt, dass diese durch CYTOMIX induzierte Produktion durch Zugabe von L-NAME in Gegenwart oder Abwesenheit von Gesamtextrakt von L. casei (3% v/v) inhibiert wird.
  • BEISPIEL 2: EFFEKT VON L. CASEI AUF DIE PRODUKTION VON TNF-α DURCH DIE COLONEPITHELZELLINIEN
  • Jede der 2 Linien wurde mit 2 × 106 Zellen/Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen in DMEM-Medium, das mit 5% FCS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin supplementiert war, angesät. Dann werden die Zellen 24 Stunden in Gegenwart von CYTOMIX und anschließend weitere 24 Stunden in Gegenwart von Gesamtextrakten von L. casei inkubiert. Bei einigen Versuchen werden L-NAME (1 mM) oder ein Inhibitor des NFκB-Transduktionswegs (PDFC: 10 pM) gleichzeitig mit den Bakterienextrakten zugegeben.
  • Dann werden die Kulturüberstände zurückgewonnen und ihre Cytokinkonzentration mittels ELISA bestimmt.
  • 3 zeigt, dass es in Gegenwart von CYTOMIX allein nur eine schwache Produktion von TNF-α durch die Linie Caco-2 und keine Produktion dieses Cytokins durch die Linie HT-29 gibt. Diese Produktion wird durch die Zugabe von L. casei-Gesamtextrakt stark erhöht; sie wird durch Zugabe von L-NAME oder von PDTC inhibiert, was zeigt, dass die Aktivierung der Produktion von proinflammatorischen Cytokinen durch L. casei in die NO-Produktion und die Aktivierung von NFκB eingreift.
  • Die in der nachfolgenden Tabelle I dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von L. casei zu mit CYTOMIX voraktivierten Zellen auch die Produktion von IL-1β aktiviert. Tabelle I
    Zelle Voraktivierung Stimulierung IL1-β (pg/ml) TNF-α (pg/ml)
    Caco-2 keine keine ND ND
    Caco-2 CYTOMIX keine 150 ± 15 75 ± 11
    Caco-2 keine CNCM I-1518 95 ± 8 ND
    Caco-2 CYTOMIX CNCM-I-1518 1254 ± 55 975 ± 85
    HT-29 keine keine ND ND
    HT-29 CYTOMIX keine ND ND
    HT-29 keine CNCM I-1518 ND ND
    HT-29 CYTOMIX CNCM-I-1518 908 ± 63 789 ± 45
    ND: Nicht bestimmt
  • BEISPIEL 3: EFFEKT VON L. CASEI AUF DIE PRODUKTION VON STICKSTOFFMONOXID DURCH DIE MIT PROINFLAMATORISCHEN CYTOKINEN VORAKTIVIERTEN COLONEPITHELZELLLINIEN IN GEGENWART VON LPS VON GRAM– BAKTERIEN
  • Das Versuchsprotokoll ist mit dem des obigen Beispiels 1 identisch, außer dass bei der Inkubation mit dem Gesamtextrakt von L. casei 10 μg/ml LPS von E. coli zugegeben werden.
  • Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, die in Abwesenheit. von L. casei eine starke NO-Produktion zeigt (mit CYTOMIX + LPS stimulierte Zellen), die in Gegenwart zunehmender Mengen von L. casei abnimmt, bis sie auf das Niveau der Zellen zurückgeht, die durch Cytokine allein aktiviert wurden.

Claims (6)

  1. Verwendung von Milchsäurebakterien des L. casei-Stammes CNCM I-1518 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Behandlung von chronischen inflammatorischen Darmpathologien.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in Form eines Nahrungsergänzungsmittels vorliegt.
  3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in Form eines fermentierten Milchprodukts vorliegt.
  4. Screeningverfahren auf neue Milchsäurenbakterienstämme, die Eigenschaften zur Modulation unspezifischer Immunität besitzen, dadurch gekennzeichnet, dass es die Selektion von Milchsäurebakterienstämmen umfasst, die befähigt sind, die NO-Produktion von Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Zytokine und bakterielle LPS präaktiviert sind, zu inhibieren.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem einen Selektionsschritt auf Stämme umfasst, die befähigt sind, die NO-Produktion von Enterozytenkulturen, die durch proinflammatorische Zytokine präaktiviert sind, zu erhöhen, und gegebenenfalls einen Selektionsschritt auf Stämme, die keinen Effekt auf die NO-Produktion von nichtaktivierten Enterozyten ausüben.
  6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stämme ausgehend von Milchsäurebakterienkulturen gescreent werden, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Laktobazillen, Laktokokken, Streptokokken und Bifidobakterien besteht.
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