DE69830193T2 - Eine methode zur herstellung von hydroxycarboxylsäuren durch selbstdegradation von polyhydroxyalkanoaten - Google Patents

Eine methode zur herstellung von hydroxycarboxylsäuren durch selbstdegradation von polyhydroxyalkanoaten Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxycarbonsäure-Monomeren (meist optisch aktiv in (R)-(-)-Konfiguration) durch Selbst-Abbau von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs). Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Hydroxycarbonsäure-Monomeren, das folgende Schritte umfasst: (a) Synthese und Akkumulation von PHAs durch Kultivierung verschiedener Mikroorganismen; und (b) Herstellung optisch aktiver (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren, welche Monomere von Polyhydroxyalkanoaten sind, durch Selbst-Abbau von PHAs, indem PHA enthaltende Zellen in eine Abbau-Lösung gegeben werden, wie zum Beispiel Wasser, Salzlösung, eine Mischung von Wasser und organischen Lösungsmitteln, und eine Pufferlösung. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst darüber hinaus das Abtrennungsverfahren für die Abtrennung der hergestellten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren, falls sie als eine Mischung zweier oder mehrerer (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren vorliegen, unter Verwendung von Flüssigkeits-Chromatographie (LC), oder Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), und umfasst darüber hinaus das Reinigungsverfahren für die Entfernung von Verunreinigungen aus den in reinem Zustand abgetrennten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und ein Verfahren zur Herstellung von Pulvern aus den gereinigten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren können in großem Umfang als ein chiraler Vorläufer aus verschiedenen Gründen wie folgt verwendet werden: Sie enthalten zwei funktionelle Gruppen, eine Hydroxyl-Gruppe und eine Carboxyl-Gruppe; die funktionellen Gruppen können in bequemer Weise modifiziert werden; und ein neues chirales Zentrum kann eingeführt werden. Und (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäure kann in großem Umfang als ein Vorläufer zur Synthese von Antibiotika, Vitaminen, Aromastoffen, Pheromonen und dergleichen verwendet werden; als ein Material zur Entwicklung von Nicht-Peptidliganden, die bei der Entwicklung von Arzneimitteln verwendet werden; als ein Vorläufer zur Entwicklung neuer Arzneimittel; und insbesondere als ein Vorläufer von Carbapenem-Antibiotika, welche kürzlich große Aufmerksamkeit auf sich gezogen haben, um die β-Lactam-Antibiotika, wie zum Beispiel Penicillin zu ersetzen (Scott, In: Asymmetric Synthesis, Morrison und Scott, Eds., Academic Press Inc., Orlando, FL, 1984). Darüber hinaus wurde berichtet, dass (+)-Thienamycin aus Methyl-(R)-(-)-3-hydroxybutyrat hergestellt werden konnte (Chiba und Nakai, Chem. Lett., 651-654, 1985; Seebach und Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65: 495-503, 1982).
  • Derzeit wird (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäure im wesentlichen durch die folgenden Verfahren hergestellt: Oxidation eines aliphatischen Glycols durch ein Fermentationsverfahren (Harada und Hirayashi, Agric. Biol. Chem., 32: 1175, 1968); R-(-)-β-Hydroxylierung von Carbonsäuren unter Verwensung von Mikroorganismen (Hasegawa et al., J. Ferment. Technol. 60: 501, 1982); und Hydrierung eines β-Diketons unter Verwendung eines chiralen Katalysators (Noyori et al., J. Am. Chem. Soc., 109: 5856, 1987; Brussel et al., WO97/14500A1, 1997).
  • Polyhydroxyalkanoate (PHAs) sind Kohlenstoff- und/oder Energie-Speichermaterialien, die in zahlreichen Mikroorganismen hergestellt und akkumuliert werden (Anderson und Dawes, Microbiol. Rev., 54: 450-472, 1990). Mehr als 120 Arten von Monomeren wurden als Bestandteile von PHAs gefunden, welche in Abhängigkeit von den kultivierten Mikroorganismen, dem verwendeten chemischen Substrat oder Cosubstrat, und den Kulturbedingungen variieren können (Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, 1996; Steinbuchel und Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-228, 1995). Optisch reine (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren können leicht aufgrund der optischen Spezifität der biosynthetischen Enzyme durch Abbau biosynthetisierter PHAs hergestellt werden, da die Monomer-Einheiten der biosynthetisierten PHAs aus Monomeren zusammengesetzt sind, welche alle eine (R)-(-)-Konfiguration aufweisen, falls das Monomer ein chirales Zentrum am Kohlenstoffatom besitzt, welches die Hydroxylgruppe trägt. Ein Verfahren zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure aus Poly-(R)-(-)-3-hydroxybutyrat (PHB) oder Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat-Co(R)-(-)-3-Hydroxyvalerat (PHB/V) durch chemischen Abbau wurde beschrieben (Seebach et al., Org. Synth. 71: 39-47, 1992; Seebach und Zuger, Helvetica Chim. Acta, 65: 495-503, 1982; Pennetreau, US005107016A, 1992; Pennetreau, EP0377260A1, 1989).
  • In dem vorstehenden Verfahren zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure durch chemischen Abbau wurden organische Lösungsmittel in großen Mengen verwendet, und die Effizienz der Produktion war aufgrund der komplizierten Verfahren ziemlich gering. Daher ist ein neues Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Hydroxy carbonsäuren, welche das vorstehende Problem lösen können, in hohem Maße auf diesem Gebiet erforderlich.
  • Jüngst wurde von einem Verfahren zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Mikroorganismen berichtet (Akira und Tatsuhiko, JP9-234091, 1997). Dieses Verfahren basiert auf der einfachen, offensichtlichen Annahme, dass manche Mikroorganismen, welche Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat (PHB) akkumulieren, ebenso im Stande sein würden, dessen Monomer, (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, herzustellen. Sie suchten nach Mikroorganismen, welche (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure herstellen, und fanden, dass Pseudomonas sp., Burkholderia sp. und Alcaligenes eutrophus imstande waren, (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure herzustellen. Hier sollte bemerkt werden, dass Alcaligenes eutrophus kürzlich als Ralstonia eutropha umbenannt wurde, und daher nicht länger zur Familie Alcaligenes gehört (Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 39: 897-904, 1995). Bei dem vorstehenden Verfahren wurden Mikroorganismen für einige Tage (4-7 Tage) kultiviert, und anschließend in eine Kaliumphosphat-Pufferlösung für die Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure überführt. Die Monomer-Ausbeuten waren sehr gering bei 2-8 %. Darüber hinaus wurde nur von der Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, nicht jedoch von anderen (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren berichtet. Da die Monomer-Ausbeuten äußerst gering waren und es einige Tage in Anspruch nahm, was zu einer geringen Produktivität führte (definiert als Gramm des Produktes, das pro Volumen-Einheit und pro Zeit-Einheit hergestellt wurde), ist das vorstehende Verfahren für industrielle Anwendungen nicht geeignet.
  • PHAs werden üblicherweise innerhalb der Zellen hergestellt und akkumuliert, wenn einer der Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel Stickstoff, Phosphor, Sauerstoff, Kalium und Schwefel begrenzend ist, während eine Kohlenstoffquelle im Überschuss vorliegt (Anderson und Dawes, Microbiol. Rev., 54: 450-472, 1990). Wenn somit der begrenzende Faktor erneut zugeführt wird, bauen die Zellen die akkumulierten PHAs ab und wachsen.
  • Alle Mikroorganismen, welche PHAs synthetisieren, enthalten intrazelluläre PHA-Depolymerase sowie PHA-Biosyntheseenzyme. Es ist bekannt, dass intrazelluläre PHA-Depolymerase in zwei Zuständen existiert, einer löslichen Form und einer Form, die an PHA-Körnern haftet (Merrick und Dourdoroff, J. Bacteriol., 88: 60-71, 1964; Merrick et al., J. Bacteriol., 89: 234-239, 1965; Merrick und Yu, Biochem., 5: 3563-3568, 1966; Griebel et al., Biochem., 7: 3676-3681, 1968; Griebel und Merrick, J. Bacteriol., 108: 782-789, 1971; Anderson und Dawes, Microbiol. Rev., 54: 450-472, 1990). Merrick und Doudoroff (J. Bacteriol. 88: 60-71, 1964) zeigten, dass native Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat (PHB)-Körner, jedoch nicht die mit Lösungsmitteln extrahierten PHB-Körner, durch ein intrazelluläres Depolymerase-System depolymerisiert werden können. Sie zeigten, dass die in Bacillus megaterium akkumulierten PHB-Körner zu (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch eine Fraktion des Rohenzyms aus PHB-abgereicherten Zellen von Rhodospirillum rubrum hydrolysiert werden können. Darüber hinaus berichteten Hippe und Schlegel (Arch. Mikrobiol. 56: 278-299, 1967), dass die lösliche Form der Depolymerase aus Alcaligenes (Hydrogenomonas) spp. native PHB abbauen kann, um (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure zu ergeben. Diese frühen Studien zeigten klar, dass Zellen intrazelluläre PHA-Depolymerasen besitzen, und PHA in Monomere abbauen kön nen. Jedoch ist die Isolierung von nativen (amorphen) PHA-Körnern nicht nur kompliziert, sondern auch in großem Maßstab teuer. Darüber hinaus ist die Isolierung von intrazellulärer Depolymerase für die Depolymerisation von PHAs ebenfalls beschwerlich und teuer. Falls ein Rohextrakt aus Zellen, der intrazelluläre PHA-Depolymerase enthält, für den Abbau von PHAs zu Monomeren verwendet wird, besteht ein signifikantes Problem der Produktreinigung aufgrund der Verunreinigung durch Bestandteile in den Rohextrakten der Zellen. Ein weiteres Problem, das der Herstellung von Monomeren durch Abbau von PHAs durch den Einsatz von Zellen im Wege steht, besteht darin, dass die abgebauten Produkte, die Monomere der PHAs, darüber hinaus durch die Zellen verstoffwechselt werden. Daher ist es unmöglich, Monomere durch Abbau von PHAs herzustellen, ohne die Stoffwechselwege, welche Hydroxycarbonsäure-Monomere darüber hinaus verstoffwechseln, zu inaktivieren oder zu blockieren. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Annahme, dass es möglich sein kann, die Stoffwechselwege, die zum Abbau der Hydroxycarbonsäure-Monomere führen, inaktiv zu machen, während die Aktivität der intrazellulären PHA-Depolymerasen durch Kontrolle der Umweltfaktoren aufrechterhalten wird. Diese Idee unterscheidet sich klar von dem Verfahren von Akira und Tatsuhiko (JP9-234091, 1997) in dem Sinn, dass das intrazelluläre PHA-Depolymerase-System für die Herstellung von (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, während das Verfahren von Akira und Tatsuhiko auf der Fähigkeit von 3 kürzlich isolierten Mikroorganismen (Pseudomonas sp., Burkholderia sp., Rlastonia eutropha (früher bekannt als Alcaligenes eutrophus; Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 39: 897-904, 1995)) beruht, die fähig sind, (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure herzustellen. Und daher beginnt die vorliegende Erfindung mit der Annahme, dass die hergestellten PHAs aus den unversehrten Zellen selbst-abgebaut werden können, und dass die Monomere in die extrazelluläre Umgebung durch Kontrolle der Umweltbedingungen freigesetzt werden können. Daher stellt die vorliegende Erfindung Verfahren bereit, um verschiedene optisch aktive (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomere effizient und wirtschaftlich mit hohen Ausbeuten herzustellen.
  • Müller und Seebach in Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 477-502, 1992 liefern eine Übersicht über Poly(hydroxyalkanoate). Insbesondere diskutiert dieser Übersichtsartikel die Depolymerisation von Poly[(R)-3-Hydroxybuttersäure] zu (R)-3-Hydroxybuttersäure sowie die Regulation des Poly[(R)-3-Hydroxybuttersäure]-Zyklus.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegenden Erfinder haben erfolgreich ein neues Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Hydroxycarbonsäure-Monomere aus PHAs entwickelt, die in Mikroorganismen akkumuliert werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst die Schritte: (a) Synthese und Akkumulation von PHAs durch Kultivierung verschiedener Mikroorganismen, welche eine intrazelluläre Polyhydroxyalkanoat-Depolymeraseaktivität besitzen, in einem Medium; und (b) Herstellung von Hydroxycarbonsäuren, welche Monomere von PHAs sind (meist optisch aktiv in (R)-(-)-Konfiguration) durch Selbst-Abbau von PHAs, indem die kultivierten Mikroorganismen in einer Abbau-Lösung gehalten werden, wie zum Beispiel Wasser, Salzlösung, einer Mischung von Wasser und organischen Lösungsmitteln, und einer Pufferlösung, wobei der pH der Abbau-Lösung so eingestellt wird, dass die Ausbeute der (R)-Hydroxycarbonsäure optimiert wird. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Trennverfahren der hergestellten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren, unter Verwendung einer Flüssigkeits-Chromatographie (LC) oder einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), und beeinhaltet ebenso ein Reinigungsverfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus den in reinem Zustand abgetrennten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln und ein Trocknungsverfahren zur Pulverherstellung aus den gereinigten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren.
  • Schließlich ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Herstellung von verschiedenen optisch aktiven (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren mit hohen Ausbeuten bereitzustellen, welches die Schritte umfasst: (a) Synthese und Akkumulation von PHAs durch Kultivierung verschiedener Mikroorganismen, einschließlich rekombinanter Stämme, welche PHAs akkumulieren und intrazellulär abbauen können; und (b) Herstellung von optisch aktiven (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren durch Selbst-Abbau von PHAs.
  • Es ist ebenso Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren bereitzustellen, welches darüber hinaus die Schritte der Abtrennung der hergestellten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren unter Verwendung einer Flüssigkeitsc-Chromatographie (LC) oder einer Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) umfasst.
  • Ebenso ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines pulverförmigen Endproduktes aus (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren bereitzustellen, welches darüber hinaus die Schritte der Reinigung der in reinem Zustand abgetrennten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln; und die Herstellung von Pulvern aus den gereinigten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren durch Trocknung umfasst.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Zeitprofile der Konzentration der freigesetzten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (dargestellt durch ausgefüllte Kreise; -⦁-) und den pH-Wert der Abbau-Lösung (dargestellt durch ausgefüllte Dreiecke; -
    Figure 00090001
    -) während des Selbst-Abbaus von PHB, die in Alcaligenes latus ohne pH-Kontrolle akkumuliert wurde (der anfängliche pH-Wert betrug 7,0).
  • 2 zeigt das Zeitprofil der Konzentration der freigesetzten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure während des Selbst-Abbaus der PHB, die in Alcaligenes latus mit pH-Kontrolle bei 7,0 akkumuliert wurde.
  • 3 zeigt die Zeitprofile der Konzentration der freigesetzten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure während des Selbst-Abbaus der PHB, die in Corynebacterium sp. akkumuliert wurde, wenn der anfängliche pH 4,0, 7,0 oder 10,0 betrug.
  • 4 zeigt die Zeitprofile der Konzentration der freigesetzten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure während des Selbst-Abbaus von PHB, die in Bacillus sp. akkumuliert wurde, wenn der anfängliche pH 4,0, 7,0 oder 10,0 betrug.
  • 5 zeigt das Standard-HPLC-Peakprofil einer im Handel er hältlichen 3-Hydroxybuttersäure (Sigma Chemical Co., USA).
  • 6 zeigt das Standard-HPLC-Peakprofil einer im Handel erhältlichen 4-Hydroxybuttersäure (Sigma Chemical Co., USA).
  • 7 zeigt das HPLC-Peakprofil von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, die durch Selbst-Abbau von PHB erhalten wurde, die in Alcaligenes latus akkumuliert wurde.
  • 8 zeigt das HPLC-Peakprofil von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure, die durch Selbst-Abbau von Poly-(R)-(-)-Hydroxybuttersäure-Co-4-Hydroxybutyrat-Copolymer erhalten wurde, das in Alcaligenes latus akkumuliert wurde.
  • 9 zeigt das 1H-NMR-Peakprofil einer gereinigten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Alcaligenes latus akkumuliert wurde.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In der vorliegenden Erfindung werden PHAs hergestellt und akkumuliert, indem verschiedene Mikroorganismen kultiviert werden, und ein großer Bereich von optisch aktiven (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren wird mit hohen Ausbeuten durch Selbst-Abbau von PHAs hergestellt, indem die Mikroorganismen in einer Abbau-Lösung gehalten werden, wie zum Beispiel Wasser, Salzlösung, einer Mischung von Wasser und organischen Lösungsmitteln, und einer Pufferlösung, welche auf einen geeigneten pH-Wert eingestellt wird. Dann werden die hergestellten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren, falls sie als eine Mischung von zwei oder mehreren (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren vorliegen, unter Verwendung von LC oder HPLC getrennt. Verschiedene Arten von Chromatographie- oder Ionenaustausch-Säulen, welche imstande sind, organische Säuren zu trennen, können in der LC oder HPLC verwendet werden.
  • Im Vorstehenden kann der Mikrooranismus ein beliebiger Wildtyp, eine Mutante, oder ein rekombinanter Mikroorganismus sein, der PHAs akkumuliert und eine intrazelluläre Depolymerase-Aktivität besitzt (Doi, Microbial Polyesters, VCH, New York, 1990; Steinbuechel, In: Biomaterials, Byrom, Eds., MacMillan Publishers, Busingstoke, 1991; Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, 1996), und es kann einer sein, der aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Mikroorganismen des Genus' Achromobacter einschließlich Achromobacter sp., Achromobacter xylosoxidans und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Acidovorax einschließlich Acidovorax delafieldii, Acidovorax facilis und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Acinetobacter einschließlich Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii und dergleichen; Actinobacillus sp.; Actinomyces sp.; Aeromonas caviae; Mikroorganismen des Genus' Alcaligenes einschließlich Alcaligenes aestus, Alcaligenes denitrificans, Alcaligenes faecalis, Alcaligenes latus, Alcaligenes pacificus, Alcaligenes paradoxus, Alcaligenes venustus und dergleichen; Alteromonas macleodii; Mikroorganismen des Genus' Amoebobacter einschließlich Amoebobacter roseu, Amoebobacter pendens und dergleichen, Aphanocapsa sp.; Aphanothece sp.; Aquaspirillum autotrophicum; Azorhizobium caulinodans; Mikroorganismen des Genus' Azospirillum einschließlich Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Azolobacter einschließlich Azotobacter agilis, Azotobacter beijerinckii, Azotobacter chroococcum, Azotobacter macrocytogenes, Azotobacter salinestris, Azotobacter vinelandii und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Bacillus einschließlich Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Beggiatoa einschließlich Beggiatoa alba und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Beijerinckia einschließlich Beijerinckia fluminensis, Beijerinckia mobilis und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Beneckea einschließlich Beneckea nereida, Beneckea pelagia und dergleichen; Bordetella pertussis; Bradyrhizobium japonicum; Caryophanon latum; Mikroorganismen des Genus' Caulobacter einschließlich Caulobacter bacteroides, Caulobacter crescentus und dergleichen; Chloroflexus aurantiacus; Mikroorganismen des Genus' Chlorogloea einschließlich Chlorogloea fritschii und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Chromatium einschließlich Chromatium minutissimum, Chromalium okenii, Chromatium purpuratum, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Chromobacterium einschließlich Chromobacterium violaceum und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Clostridium einschließlich Clostridium botulinum, Clostridium sphenoides und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Comamonas einschließlich Comamonas acidovorans, Comamonas testosteroni und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Corynebacterium einschließlich Corynebacterium autotrophicum, Corynebacterium hydrocarbooxydans und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Derxia einschließlich Derxia gummosa und dergleichen; Desuffiococcus multivorans; Mikroorganismen des Genus' Desulfonema einschließlich Desulfonema limicola, Desulfonema magnum und dergleichen; Desulfosarcina variabilis; Mikroorganismen des Genus' Desulfovibrio einschließlich Desulfovibrio carbinolicus, Desulfovibrio sapovorans und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Ectothiorhodospira einschließlich Ectothiorhodospira halochloris, Ectothiorhodospira mobilis, Ectothiorhodospira shaposhnikovii, Ectothiorhodospira vacuolata und dergleichen; Ferrobacillus ferrooxidans; Flavobacterium sp.; Haemophilus influenzae; Mikroorganismen des Genus' Halobacterium einschließlich Halobacterium gibbonsii, Halobacterium volcanii und dergleichen; Haloferax mediterranei; Hydroclathratus clathratus; Hydrogenomonas facilis; Mikroorganismen des Genus' Hydrogenophaga einschließlich Hydrogenophaga flava, Hydrogenophaga pseudoflava, Hydrogenophaga taeniospiralis und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Hyphomicrobium einschließlich Hyphomicrobium vulgare, Hyphomicrobium zavarzinii und dergleichen; Ilyobacter delafieldii; Labrys monachus; Mikroorganismen des Genus' Lactobacillus einschließlich Lactobacillus brevis, Lactobaciflus bulgaricus, Lactobacillus casei und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Lactococcus einschließlich Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis und dergleichen; Lamprocystis roseopersicina; Lampropedia hyalina; Legionella sp.; Leptothrix discophorus; Mikroorganismen des Genus' Methylobacterium einschließlich Methylobacterium extorquens, Methylobacterium organophilum, Methylobacterium rhodesianum und dergleichen; Methylococcus thermophilus; Methylocystis parvus; Methylomonas methanica; Mikroorganismen des Genus' Methylosinus einschließlich Methylosinus sporium, Methylosinus trichosporium und dergleichen; Methylovibrio soehngenii; Mikroorganismen des Genus' Micrococcus einschließlich Micrococcus denitrificans, Micrococcus halodenitrificans und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Microcoleus; Mikroorganismen des Genus' Microcystis; Mikroorganismen des Genus' Moraxella; Mikroorganismen des Genus' Mycobacterium einschließlich Mycobacterium album, Mycobacterium vaccae und dergleichen; Mycoplana rubra; Mikroorganismen des Genus' Nitrobacter einschließlich Nitrobacter agilis, Nitrobacter winogradskyi und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Nitrococcus; Mikroorganismen des Genus' Nocardia einschließlich Nocardia alba, Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia corallina, Nocardia petroleophila und dergleichen; Oscillatoria limosa. Paracoccus denitrificans; Pediococcus halophilus; Penicillium cyclopium; Mikroorganismen des Genus' Photobacterium einschließlich Photobacterium mandapamensis, Photobacterium phosphoreum und dergleichen; Physarum polycephalum; Protomonas extorquens; Mikroorganismen des Genus' Pseudomonas einschließlich Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas asplenii, Pseudomonas butanovora, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas citronellolis, Pseudomonas coronafaciens, Pseudomonas dacunhae, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas diminuta, Pseudomonas echinoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas glathei, Pseudomonas indigofera, Pseudomonas lemonnieri, Pseudomonas mallei, Pseudomonas marina, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas mixta, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas oxalaticus, Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas pseudoflava, Pseudomonas putida, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas syringae, Pseudomonas thermophilus, Pseudomonas viridiflava und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Ralstonia einschließlich Ralstonia eutropha (früher bekannt als Alcaligenes eutrophus; Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 39: 897 - 904, 1995); Mikroorganismen des Genus' Rhizobium einschließlich Rhizobium galega, Rhizobium hedysarum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium lupini, Rhizobium meliloti, Rhizobium phaseoli, Rhizobium trifoli und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Rhodobacillus; Mikroorganismen des Genus' Rhodobacter einschließ lich Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Rhodococcus einschließlich Rhodococcus opacus, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus ruber und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Rhodocyclus einschließlich Rhodocyclus gelatinosus, Rhodocyclus tennis und dergleichen; Rhodomicrobium vannielii; Mikroorganismen des Genus' Rhodopseudomonas einschließlich Rhodopseudomonas acidophila, Rhodopseudomonas capsulata, Rhodopseudomonas palustris und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Rhodospirillum einschließlich Rhodospirillum molischianum, Rhodospirillum rubrum und dergleichen; Sphaerotilus natans; Sphingomonas paucimobilis; Mikroorganismen des Genus' Spirillum einschließlich Spirillum itersonii, Spirillum lipoferum, Spirillum serpens und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Spirulina einschließlich Spirulina jenneri, Spirulina maxima, Spirulina platensis, Spirulina subsalsa und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Staphylococcus einschließlich Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus xylosus und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Stella einschließlich Stella humosa, Stella vacuolata und dergleichen; Streptococcus thermophilus; Mikroorganismen des Genus' Streptomyces einschließlich Streptomyces antibioticus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces venezuelae und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Synechococcus; Syntrophomonas wolfei; Mikroorganismen des Genus' Thiobacillus einschließlich Thiobacillus acidophilus, Thiobacillus versutus und dergleichen; Mikroorganismen des Genus' Thiocapsa einschließlich Thiocapsa pfennigii und dergleichen; Thiocystis violacea; Mikroorganismen des Genus' Thiodictyon; Thiosphaera pantotropha; Trichodesmimum thiebautii; Vibrio parahaemolyticus; Xanthobacter autotrophicus; Xanthomonas maltophilia; and Mikroorganismen des Genus' Zoogloea einschließlich Zoogloea ramigera.
  • (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomere, welche durch Selbst-Abbau von durch verschiedene Mikroorganismen synthetisierten PHAs hergestellt werden, können ein oder mehrere der folgenden sein, sowie beliebige andere Monomere, welche in PHAs eingebaut werden können, entsprechend einer Kohlenstoffquelle oder einer chemischen Verbindung, die während der Kultivierung der Mikroorganismen verwendet wird (Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, 1996; Steinbuchel und Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-228, 1995 und darin zitierte Literatur): (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure, 4-Hydroxybuttersäure, (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure-Monomere von mittlerer Kettenlänge mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen ((R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxynonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyundecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxytetradecansäure), 3-Hydroxypropionsäure, (R)-(-)-3-Hydroxyhexadecansäure, (R)-(-)-4-Hydroxyvaleriansäure, (R)-(-)-4-Hydroxy-hexansäure, (R)-(-)-4-Hydroxyheptansäure, (R)-(-)-4-Hydroxy-octansäure, (R)-(-)-4-Hydroxydecansäure, 5-Hydroxyvaleriansäure, (R)-(-)-5-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-6-Hydroxydodecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-pentensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-trans-hexensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-cis-hexensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-hexensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-trans-octensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-cis-octensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-octensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-nonensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-decensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-cisdodecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-cis-dodecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy- 7-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5,8-cis-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-methylhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-methylhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-methylheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-methyloctanoic acid, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-methylnonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methylnonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-methylnonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methyldecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-methyldecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methyl-6-octensäure, Äpfelsäure, (R)-(-)-3-Hydroxybernsteinsäure-methylester, (R)-(-)-3-Hydroxyadipinsäure-methylester, (R)-(-)-3-Hydroxysuberinsäure-methylester, (R)-(-)-3-Hydroxyazelainsäure-methylester, (R)-(-)-3-Hydroxy-sebacinsäure-methylester, (R)-(-)-3-Hydroxysuberinsäureethylester, (R)-(-)-3-Hydroxysebacinsäure-ethylester, (R)-(-)-3-Hydroxypimelinsäure-propylester, (R)-(-)-3-Hydroxysebacinsäure-benzylester, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-acetoxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-acetoxynonansäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxybuttersäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyvaleriansäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyheptansäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyoctansäure, para-Cyanphenoxy-(R)-(-)-3-hydroxybuttersäure, para-Cyanphenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyvaleriansäure, para-Cyanphenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyhexansäure, para-Nitrophenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-hydroxy-5-phenylvaleriansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-cyclohexylbuttersäure, (R)-(-)-3,12-Dihydroxydodecansäure, (R)-(-)-3,8-Dihydroxy-5-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4,5-epoxydecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6,7-epoxydodecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecansäure, 7-Cyan-(R)-(-)-3-hydroxyheptansäure, 9-Cyan-(R)-(-)-3-hydroxynonansäure, (R)-(-)- 3-Hydroxy-7-fluorheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-fluornonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-chlorhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-chloroctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-bromhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-bromoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-11-bromundecansäure, 3-Hydroxy-2-butensäure, (R)-(-)-6-Hydroxy-3-dodecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-2-methylbuttersäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-2-methylvaleriansäure und (R)-(-)-3-Hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptensäure.
  • In den vorstehenden Monomeren von PHAs, besitzen 3-Hydroxypropionsäure, 4-Hydroxybuttersäure, 5-Hydroxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-2-butensäure keine chiralen Zentren, und somit besitzen sie keine optische Isomerie. Die anderen Monomere, welche chirale Zentren besitzen, liegen alle in der (R)-(-)-Form vor.
  • In den vorstehenden zahlreichen Monomeren werden als bevorzugte Beispiele (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure / 4-Hydroxybuttersäure, (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäure-Monomere mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen und (R)-(-)-3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure mit hohen Ausbeuten durch Selbst-Abbau hergestellt. Bei näherer Betrachtung wurden PHB und andere PHAs durch Kultivierung von Alcaligenes latus DSM 1123, Ralstonia eutropha (früher bekannt als Alcaligenes eutrophus) NCIMB 11599, Ralstonia eutropha (früher bekannt als Alcaligenes eutrophus) H16 ATCC 17699, Corynebacterium sp. SS-15 (Hur et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 12: 554-559, 1997), Methylosinus trichosporium KCTC 2591, Rhodospirillum rubrum KCTC 1372, Pseudomonas oleovorans ATCC 29347, Pseudomonas aeruginosa PAO1 DSM 1707 oder rekombinante Ralstonia eutropha (Choi und Lee, Hwahak Konghak, 35: 684-689, 1997) mit erhöhten Enzymaktivitäten der PHA-Biosynthese in einem Medium, das eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält. Anschließend wurden die kultivierten Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in einer Abbau-Lösung dispergiert, und unter verschiedenen Bedingungen selbst-abgebaut. Schließlich wurden die Konzentrationen der hergestellten Monomere bestimmt.
  • Als ein Ergebnis wurde bewiesen, dass (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomere effizient durch Selbst-Abbau von PHAs hergestellt werden können, und eine geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau wurde bestimmt.
  • Die geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau zur Herstellung von (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren lautet: Für den Fall, dass der Mikroorganismus Alcaligenes latus DSM 1123 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-11, bevorzugt 2-5, am meisten bevorzugt 3-4, die Reaktionstemperatur beträgt 4-55 °C, bevorzugt 30-50 °C, am meisten bevorzugt 37 °C und die Reaktionszeit beträgt 30 Minuten - 10 Stunden; für den Fall, dass der Mikroorganismus Ralstonia eutropha NCIMB 11599 ist (ein Glucose-verwendender Mutantenstamm von Ralstonia eutropha H16 ATCC 17699), beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 20 Stunden oder mehr; für den Fall, dass der Mikroorganismus Corynebacterium sp. SS-15 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 5-9, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 2 - 30 Stunden; für den Fall, dass der Mikroorganismus Bacillus sp. SS-19 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 10 Stunden; für den Fall, dass der Mikroorganismus Methylosinus trichosporium KCTC 2591 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 20 Stunden oder mehr, für den Fall, dass der Mikroorganismus Rhodospirillum rubrum KCTC 1372 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 20 Stunden oder mehr; für den Fall, dass der Mikroorganismus Ralstonia eutropha H16 ATCC 17699 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 20 Stunden oder mehr; und für den Fall, dass der Mikroorganismus eine rekombinante Ralstonia eutropha mit einer amplifizierten Enzymaktivität der PHA-Biosynthese ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 20 Stunden oder mehr.
  • Die geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure / 4-Hydroxybuttersäure lautet: Für den Fall, dass der Mikroorganismus Alcaligenes latus DSM 1123 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung weniger als 7, bevorzugt 2-5, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C, bevorzugt 37 °C und die Reaktionszeit beträgt 30 Minuten bis 10 Stunden. Darüber hinaus lautet die geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure / (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure: Für den Fall, dass der Mikroorganismus Ralstonia eutropha NCIMB 11599 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit beträgt 20 Stunden oder mehr. Die geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau zur Herstellung von (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen lautet: Für den Fall, dass der Mikroorganismus Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 oder Pseudomonas aeruginosa PAO1 DSM 1707 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C und die Reaktionszeit be trägt 10 Stunden oder mehr.
  • Die geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure lautet: Für den Fall, dass der Mikroorganismus Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 ist, beträgt der pH der Abbau-Lösung 2-12, die Reaktionstemperatur beträgt 30-40 °C, und die Reaktionszeit beträgt 10 Stunden oder mehr.
  • Die anderen Monomere können ebenfalls einfach durch Verwendung verschiedener Mikroorganismen und Kohlenstoffquellen / chemischer Verbindungen hergestellt werden (Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, 1996; Steinbuchel und Valentin, FEMS Microbiol. Lett., 128: 219-228, 1995).
  • In der vorliegenden Erfindung werden PHAs bei hoher Konzentration ebenfalls selbst-abgebaut, um die entsprechenden Monomere mit hoher Konzentration zu bilden, und darüber hinaus kann die Effizienz der Herstellung der Monomere verbessert werden, indem die verbleibenden Dimere unter alkalischen Bedingungen mittels Wärme abgebaut werden, welche Nebenprodukte sind, die während des Selbst-Abbaus der PHAs entstehen.
  • Wasser, Mischungen von Wasser und organischen Lösungsmitteln, oder eine Puffer-Lösung mit oder ohne verschiedene Salze kann als eine Abbau-Lösung verwendet werden. Der Unterschied aufgrund der verwendeten Abbau-Lösung ist nicht vorhanden oder zu vernachlässigen, jedoch ist Wasser aufgrund der Leichtigkeit der nachfolgenden Abtrennung und der Reinigung der Monomere vorzuziehen.
  • Falls die abzubauenden PHAs Copolymere sind, sind die Produkte des Selbst-Abbaus unter der vorstehenden Bedingung Mischungen von Monomeren. Diese Monomere können leicht mittels verschiedener herkömmlicher Verfahren getrennt werden, wie zum Beispiel Ionenaustausch, Elektrodialyse, Extraktion, Destillation, Flüssigkeits-Chromatographie (LC) und Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und vorzugsweise durch LC oder HPLC.
  • Die in reinem Zustand abgetrennten (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren werden darüber hinaus mittels eines herkömmlichen Verfahrens gereinigt, wie zum Beispiel einer Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, und werden mittels eines herkömmlichen Verfahrens zu Pulver verarbeitet, wie zum Beispiel einem Trocknungsverfahren. Bei näherer Betrachtung wird starkes Alkali, wie zum Beispiel Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid zu der reinen (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Lösung gegeben, welche durch Selbst-Abbau hergestellt wurde, und der pH-Wert der Lösung wird auf mehr als 9 eingestellt. Anschließend werden Verunreinigungen, welche in die organische Phase extrahiert werden, entfernt, und die in der Wasserphase verbliebenen (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren werden getrocknet, um ein pulverförmiges Endprodukt mit einer Reinheit von 90 % oder höher zu ergeben.
  • Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus durch die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch nicht so aufzufassen sind, als seien sie in irgendeiner Weise beschränkend für den Umfang der Erfindung, wie sie beansprucht wird.
  • <Beispiel 1> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Alcaligenes latus synthetisiert und akkumuliert wird
  • Eine geeignete Bedingung für den Selbst-Abbau von PHB, die durch Alcaligenes latus DSM 1123 synthetisiert wurde, wurde bestimmt. Zuerst wurde der Mikroorganismus kultiviert, um PHB zu akkumulieren, in einem Batch-Verfahren in einem chemisch definierten Medium, das in Tabelle 1 gezeigt ist und das mit 30 g/L Saccharose ergänzt wurde, unter Stickstoff-begrenzender Bedingung, und die kultivierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt. Die in den Zellen akkumulierte PHB wurde durch das nachfolgend gezeigte Verfahren selbst-abgebaut. Anschließend wurden die Konzentrationen von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und ihres hergestellten Dimers unter verschiedenen Bedingungen bestimmt.
  • Einige Faktoren, die während des Selbst-Abbaus untersucht wurden, umfassen den pH-Wert der Abbau-Lösung (Tabelle 2), die Kohlenstoffquelle und das Rühren (Tabelle 3 und Tabelle 4) und die Temperatur des Selbst-Abbaus (Tabelle 5 und Tabelle 6). (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure wurde mit der größten Effizienz hergestellt, wenn der Selbst-Abbau bei pH 4,0 und 37 °C ohne Rühren (und ohne Sauerstoff) durchgeführt wurde.
  • Als eine Abbau-Lösung wurden Wasser und verschiedene Salzlösungen miteinander verglichen, die auf einem chemisch definierten Medium ohne Kohlenstoffquelle basierten, das auf einen pH-Wert mit verschiedenen Säuren (Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure) oder mit Alkalien (Natriumhydroxid, Ammoniakwasser) oder mit einer Pufferlösung (40 mM Phosphatpuffer-Lösung, 40 mM Acetatpuffer-Lösung, 40 mM Citratpuffer-Lösung, Tris- HCl-Pufferlösung, MOPS-Pufferlösung) eingestellt wurde. Unterschiede in den Ergebnissen, die mit verschiedenen Abbau-Lösungen erhalten wurden, waren nicht vorhanden oder zu vernachlässigen (der maximale Unterschied war geringer als 3 % in Bezug auf die Ausbeute), solange der pH-Wert derselbe war. Daher wurde Wasser, dessen pH-Wert eingestellt wurde, in Anbetracht seines günstigen Einflusses auf die nachfolgenden Trennungs- und Reinigungs-Verfahren als eine Abbau-Lösung in allen nachfolgenden Beispielen verwendet.
  • Tabelle 1
  • Zusammensetzung eines chemisch definierten Mediums
    Figure 00240001
  • Tabelle 2.
  • Die Konzentrationen der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (3HB) und des Dimers, die durch Variation des pH-Werts der Abbau-Lösung erhalten wurden (anfängliche PHB-Konzentration: 1,07 g/L, Reaktionstemperatur: 37 °C, Reaktionszeit: 30 Minuten).
  • Figure 00250001
  • Tabelle 3.
  • Konzentrationen der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (3HB) und des Dimers, Ausbeute und pH-Wert am Ende, die durch Variation der Saccharose-Konzentration mit und ohne Rühren erhalten wurden (anfängliche PHB-Konzentration: 1,01 g/L, anfänglicher pH-Wert: 7,0, Reaktionstemperatur: 37 °C, Reaktionszeit: 8 Stunden).
  • Figure 00250002
  • Tabelle 4.
  • Konzentrationen der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (3HB) und des Dimers, sowie der Ausbeute, die durch Variation der Saccharose-Konzentration mit oder ohne Rühren erhalten wurden (anfängliche PHB-Konzentration: 1,07 g/L, anfänglicher pH-Wert: 4,0, Reaktionstemperatur: 37 °C, Reaktionszeit: 30 Minuten).
  • Figure 00260001
  • Tabelle 5.
  • Zeitabhängige Veränderung der Konzentration der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (3HB), die durch Variation der Reaktionstemperatur erhalten wurde (anfängliche PHB-Konzentration: 10,9 g/L, anfänglicher pH-Wert: 7,0).
  • Figure 00260002
  • Tabelle 6.
  • Konzentration der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (3HB) und des Dimers, sowie der Ausbeute, die bei verschiedenen Reaktionstemperaturen erhalten wurden (anfängliche PHB-Konzentration: 1,07 g/L, anfänglicher pH-Wert: 4,0, Reaktionszeit: 30 Minuten).
  • Figure 00270001
  • Darüber hinaus wurde die hergestellte Menge an (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure entsprechend der pH-Veränderung mit der Reaktionszeit bestimmt, welche in einer Abbau-Lösung hergestellt wurde, die auf einen anfänglichen pH-Wert von 7,0 eingestellt war, um die Beziehung zwischen dem pH-Wert der Abbau-Lösung und der Selbst-Abbaureaktion im Detail zu erforschen (1). Wie in 1 gezeigt, war der Selbst-Abbau des PHB sehr empfindlich gegenüber dem pH-Wert der Abbau-Lösung. Ein Selbst-Abbau trat zunächst kaum auf, wenn der anfängliche pH-Wert auf 7 eingestellt wurde, jedoch wurde die Reaktion mit der Abnahme des pH-Werts beschleunigt (der pH-Wert nahm rasch ab, und (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure wurde rasch 6 Stunden nach Beginn der Reaktion gebildet).
  • Eine ähnliche Wirkung des pH-Werts wurde ebenso bei der Selbst-Abbaureaktion beobachtet, die in einem Fermenter durchgeführt wurde, welcher bei pH 7 arbeitete (2). Das heißt, PHB enthaltende Zellen (die PHB-Konzentration betrug 10,1 g/L) wurden in einen Fermenter überführt, und die Reaktion wurde unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Anschließend wurde der Selbst-Abbau bei pH 7,0 durchgeführt, der durch Zugabe von 4 N NaOH eingestellt wurde. Auch nach 30 Stunden wurden nur 16 % der PHB abgebaut, somit wurden lediglich 2 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure erhalten.
  • Somit war bewiesen, dass der pH der Abbau-Lösung der bedeutendste Faktor zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB ist, welches in Alcaligenes latus DSM 1123 synthetisiert wird, und es war ebenfalls bewiesen, dass eine Bedingung eines niedrigen pH-Werts den Selbst-Abbau der PHBs zu ihrem Monomer (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure beschleunigt.
  • Wie in dem Vorstehenden gezeigt, konnte (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure effizient durch Selbst-Abbau von PHB unter verschiedenen Bedingungen hergestellt werden. Wenn insbesondere der anfängliche pH-Wert 4 betrug und die Reaktionstemperatur 34-50 °C betrug, konnte die Monomer-Ausbeute von mehr als 90 % innerhalb von 30 Minuten erreicht werden. Diese Ergebnisse sind viel besser als die vorausgehenden Arbeiten, die von Akira und Tatsuhiko (JP9-234091, 1997) berichtet wurden, welche zeigten, dass die Ausbeute von lediglich 2-8 % nach einer langen Zeit von 6-8 Tagen erreicht werden konnte.
  • Darüber hinaus wurde die Verweilzeit des mittels HPLC analysierten Produkts mit jener einer racemischen Mischung von 3-Hydroxybuttersäure verglichen, das von Sigma Chemical Co. (USA) gekauft wurde, um zu verifizieren, dass das Produkt (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure war (5 und 7). Beide Proben wurden bei 12,9 Minuten unter denselben Arbeitsbedingungen nachgewiesen, was bewies, dass das Produkt 3-Hydroxybuttersäure war. Dies wurde später durch Kern-magnetische Resonanz (NMR) Analyse bestätigt (Vergleichsbeispiel 18).
  • In ähnlicher Weise konnte (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure mit der Ausbeute von 80-90 % durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden, welche in anderen Stämmen von Alcaligenes latus, einschließlich Alcaligenes latus DSM 1122 und Alcaligenes latus DSM 1124, akkumuliert wurde.
  • <Beispiel 2> Herstellung einer hoch-gereinigten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB bei hoher Konzentration, die in Alcaligenes latus synthetisiert und akkumuliert wird, und Abbau des als einem Nebenprodukt hergestellten Dimers
  • Beispiel 2-1
  • Wie in Beispiel 1 gezeigt, konnte PHB von geringer Konzentration (10 g/L) dazu verwendet werden, um (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure mit hoher Effizienz und innerhalb einer kurzen Zeit durch Selbst-Abbau herzustellen. Jedoch ist die Verwendung von PHA bei hoher Konzentration ökonomisch günstig, da das Herstellungsverfahren vereinfacht werden kann, und da die Menge des entbehrlichen Lösungsmittels und das Volumen der Reaktionsvorrichtung vermindert werden kann.
  • Somit wurde in diesem Beispiel Alcaligenes latus DSM 1123 in einem Zuführungs-Chargenverfahren (fed-batch mode) kultiviert, und eine hohe Konzentration an PHB wurde durch das Verfahren hergestellt, von dem wir früher berichteten (Wang und Lee, App. Anviron. Microbiol., 63: 3703-3706, 1997). Anschließend wurde die Konzentration an PHB auf eine hohe Konzentration von 115,3 g/L eingestellt und der Selbst-Abbau wurde bei pH 4 bei 37 °C für 1 Stunde durchgeführt.
  • Als ein Ergebnis wurden 117,8 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (mit einer Ausbeute von 84 %) und 15,2 g/L Dimer (mit einer Ausbeute von 12 %) erhalten. Somit war bewiesen, dass PHB bei hoher Konzentration auch dazu verwendet werden konnte, um (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure mit hoher Effizienz durch Selbst-Abbau herzustellen.
  • Beispiel 2-2
  • In Beispiel 2-1 wurden Dimere als ein Nebenprodukt der Reaktion aufgrund des unvollständigen Selbst-Abbaus von hochkonzentrierter PHB gebildet. In diesem Beispiel wurde der Versuch unternommen, die Ausbeute des Monomers durch vollständigen Abbau der Dimere zu erhöhen. Das bedeutet, eine 5 M Lösung von Natriumhydroxid wurde zu der Lösung gegeben, die 117,8 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 15,2 g/L Dimer enthielt, welche in Beispiel 2-1 hergestellt wurde, um den pH-Wert auf 11 einzustellen. Anschließend wurde die Lösung in ein Teströhrchen gegossen und verschlossen. Die Selbst-Abbaureaktion wurde bei 95 °C für 2 Stunden durchgeführt. Als ein Ergebnis erhöhte sich die Endkonzentration der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure auf 131,9 g/L (mit einer Ausbeute von 95 %), und die Dimere wurden nicht nachgewiesen, da sie vollständig zu Monomeren abgebaut wurden.
  • Wie in Beispiel 2-1 und Beispiel 2-2 gezeigt, kann daher (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure mit hoher Konzentration effizient aus hochkonzentrierter PHB hergestellt werden, und, falls notwen dig, kann die Ausbeute durch Abbau der Dimere unter alkalischen Bedingungen weiter gesteigert werden.
  • <Beispiel 3> Herstellung von Monomeren durch Selbst-Abbau von Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat-Co-4-Hydroxybutyrat-Copolymer, das in Alcaligenes latus synthetisiert und akkumuliert wird
  • Alcaligenes latus DSM 1123 wurde in einem chemisch definierten Medium kultiviert, das 10 g/L Saccharose und 3 g/L 4-Hydroxybuttersäure in einer Flasche enthält. Die Zellen akkumulierten Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat-Co-4-Hydroxybutyrat bis zu 70 % des Trockengewichts der Zellen, von denen 12 mol-% des Polymers 4-Hydroxybutyrat waren. Die kultivierten Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, bei einer Copolymer-Konzentration von 21 g/L in der Abbau-Lösung dispergiert und anschließend Selbst-abgebaut. Wenn der Selbst-Abbau bei dem anfänglichen pH-Wert von 4, bei 37 °C für 4 Stunden durchgeführt wurde, wurden 13,6 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 2,4 g/L 4-Hydroxybuttersäure erhalten. Die Ausbeuten betrugen 68 % bzw. 79 %. In ähnlicher Weise konnten zwei Monomere durch Selbst-Abbau von Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat-Co-4-Hydroxybutyrat durch Züchtung von Alcaligenes latus DSM 1123 auf Saccharose und γ-Butyrolacton durch das Verfahren erhalten werden, welches von Hiramitsu et al. (Biotechnol. Lett., 15: 461-464, 1993) beschrieben wurde.
  • Somit kann (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure effizient aus Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat-Co-4-Hydroxybutyrat durch Selbst-Abbau hergestellt werden, und sie konnten in reinem Zustand unter Verwendung von LC oder HPLC getrennt werden (Referenzbeispiel 16).
  • <Beispiel 4> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Ralstonia eutropha synthetisiert und akkumuliert wird.
  • Ralstonia eutropha (früher Alcaligenes eutrophus) NCIMB 11599 (Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol., 39: 897-904, 1995), ein Glukose-verwertender, mutierter Stamm von Ralstonia eutropha H16 ATCC 17699, wurde entsprechend dem früher beschriebenen Verfahren (Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 43: 892-898, 1994) unter Stickstoff-begrenzender Bedingung kultiviert, und Zellen, die bis zu 70 % des Trockengewichts der Zellen PHB enthielten, wurden erhalten. Die anfängliche Konzentration der PHB wurde auf 37 g/L eingestellt und der Selbst-Abbau wurde bei 30 °C und bei einem anfänglichen pH-Wert von 4,0 oder 7,0 für 34 Stunden durchgeführt. Wenn der anfängliche pH-Wert 4,0 betrug, wurden 5,2 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 0,4 g/L Dimer hergestellt. Wenn der pH 7,0 betrug, wurden 9,3 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 0,9 g/L Dimer hergestellt. Die Gesamtausbeuten betrugen 14 % bzw. 25 %. PHB wurde im Falle von Ralstonia eutropha nicht vollständig abgebaut, im Gegensatz zum Fall des Alcaligenes latus. Darüber hinaus war die optimale Bedingung für die Monomer-Herstellung ebenso verschieden von jener des Alcaligenes latus. Dennoch konnte (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden, welche in Ralstonia eutropha akkumuliert wurde, obwohl das Herstellungsverfahren unter Verwendung von Ralstonia eutropha weniger effizient war als jenes unter Verwendung von Alcaligenes latus.
  • <Beispiel 5> Herstellung von Monomeren durch Selbst-Abbau von Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat-Co-(R)-(-)-3-Hydroxyvalerat-Co-polymer, das in Ralstonia eutropha synthetisiert und akkumuliert wird
  • Ralstonia eutropha NCIMB 11599 wurde in einem Medium kultiviert, das 10 g/L Glukose und 1 g/L Propionsäure enthielt, entsprechend dem früher beschriebenen Verfahren (Kim et al., Enzyme Microbial. Technol., 16: 556-561, 1994). Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrate-Co-(R)-(-)-3-Hydroxyvalerat (PHB/V)-Copolymer (das 8 mol-% (R)-(-)-3-Hydroxyvalerat enthält) wurde bis zu einem Gehalt von 63 % des Trockengewichts der Zellen akkumuliert, welches selbst-abgebaut wurde, um (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure herzustellen. Die Zellen wurden in Wasser bei einer Copolymer-Konzentration von 27,4 g/L dispergiert. Die Selbst-Abbaureaktion wurde bei pH 7 und 30 °C für 35 Stunden durchgeführt. Als ein Ergebnis wurden 5,8 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 0,6 g/L (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure erhalten. Somit kann eine Mischung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure effizient aus dem akkumulierten PHB/V-Polymer durch Selbst-Abbau des Copolymers hergestellt werden, und sie können unter Verwendung von LC oder HPLC getrennt werden (Referenzbeispiel 16).
  • <Beispiel 6> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Corynebacterium sp. synthetisiert und akkumuliert wird
  • Corynebacterium sp. SS-15 [Hur et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 12: 554-559, 1997; dieser Stamm ist beim Department of Chemical Engineering of KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology in Korea) verfügbar], welches aus einer Erde isoliert wurde, wurde in einem chemisch definierten Medium in einer Flasche für 3 Tage kultiviert, das 20 g/L Xylose als eine Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen akkumulierten PHB bis zu einer Konzentration von 33 % des Trockengewichts der Zellen. Die durch Zentrifugation gesammelten Zellen wurden in Wasser dispergiert, welches auf einen pH-Wert von 4,0, 7,0 oder 10,0 eingestellt wurde, um eine anfängliche PHB-Konzentration von 3,4 g/L zu ergeben, und wurden bei 30 °C gehalten. Die Zeitprofile der Bildung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure wurden untersucht (3). Wenn der anfängliche pH-Wert 7,0 betrug, betrug die maximale Menge der erhaltenen (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure 3,42 g/L bei 41 Stunden nach Beginn der Reaktion, was zu einer Monomer-Ausbeute von 83 % führte. Daher kann (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure effizient durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden, die in Corynebacterium sp. akkumuliert wird, einem Gram-positiven Bakterium.
  • <Beispiel 7> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Bacillus sp. synthetisiert und akkumuliert wird
  • Bacillus sp. SS-19 [Hur et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 12: 554-559, 1997; dieser Stamm ist verfügbar beim Department of Chemical Engineering of KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology in Korea)], der aus einer Erde isoliert wurde, wurde in einer Flasche für 3 Tage in einem chemisch definierten Medium kultiviert, das 20 g/L Xylose als eine Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen akkumulierten PHB bis zu einem Grad von 15 % des Trockengewichts der Zellen. Die durch Zentrifugation gesammelten Zellen wurden in Wasser dispergiert, welches auf einen pH-Wert von 4,0, 7,0 oder 10,0 eingestellt wurde, um eine anfängliche PHB-Konzentration von 1,4 g/L zu ergeben, und sie wurden bei 30 °C gehalten. Die Zeitprofile der Konzentration von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure wurden untersucht (4). Wenn der anfängliche pH-Wert 7,0 betrug, betrug die maximale Menge an erhaltener (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure 0,96 g/L bei 20 Stunden nach Beginn der Reaktion, was zu einer Ausbeute von 57 % führte. Daher kann (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure effizient durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden, die in Corynebacterium sp., einem Gram-positiven Bakterium, akkumuliert wird.
  • <Beispiel 8> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Methylosinus trichosporium synthetisiert und akkumuliert wird
  • In den vorstehenden Beispielen waren die verwendeten Bakterien entweder aerob oder fakultativ aerob. In diesem Beispiel jedoch wurde Methylosinus trichosporium KCTC 2591; welches anaerob und ein Methan-verwertendes Bakterium ist, durch das Verfahren von Whang und Park kultiviert (Whang und Park, Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 11: 246-253, 1996), bis die Zellkonzentration 1,1 g Trockengewicht der Zellen pro Liter erreichte, in denen der Gehalt an PHB 10 % des Trockengewichts der Zellen betrug. Die PHB-Konzentration wurde auf 10,5 g/L vor dem Selbst-Abbau eingestellt, und anschließend wurde (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau der akkumulierten PHB hergestellt, unter Verwendung desselben Verfahrens wie in den vorstehenden Beispielen (Beispiele 1-7) bei pH 4 und 37 °C. Als ein Ergebnis wurden 1,15 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure nach 24 Stunden erhalten, was zu einer Ausbeute von 9 % führte. Daher wurde gezeigt, dass (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure auch durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden kann, die in Methan-verwertenden, anaeroben Mikroorganismen akkumuliert wurde (auch wenn die Effizienz gering war).
  • <Beispiel 9> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die im photosynthetischen Mikroorganismus Rhodospirillum rubrum synthetisiert und akkumuliert wird
  • Rhodospirillum rubrum KCTC 1372, welches ein anaerobes und photosynthetisches Bakterium ist, wurde durch das Verfahren von Hashimoto et al. kultiviert (Hashimoto et al., J. Chem. Eng. Japan, 26: 56-58, 1993). Nach 140 Stunden wurden 1,5 g Zellen als Trockengewicht pro Liter der Zellen erhalten, in denen der Gehalt an PHB 16 % der Trockenmasse der Zellen betrug. Der Selbst-Abbau wurde durch dasselbe Verfahren wie in den vorstehenden Beispielen (Beispiele 1-8) bei pH 4 und 37 °C durchgeführt, wobei PHB verwendet wurde, das auf 12 g/L konzentriert wurde. Als ein Ergebnis wurden 1,61 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure nach 24 Stunden erhalten, was zu einer Ausbeute von 11 % führte. Daher wurde gezeigt, dass (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure auch durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden kann, die in photosynthetischen Bakterien akkumuliert wurde.
  • <Beispiel 10> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in Ralstonia eutropha H16 (ATCC 17699), einem Fruktose-verwertendem Stamm, synthetisiert und akkumuliert wird
  • Ralstonia eutropha H16 (früher Alcaligenes eutrophus H16) ATCC 17699, welche Fruktose als eine Kohlenstoffquelle verwertet, wurde durch das Verfahren von Huges et al. kultiviert (Hughes et al., US-Patent 4,433,053, 1984). Nach 70 Stunden erreichten die Zellkonzentration und der Gehalt an PHB 42 g Zellen als Trockenmasse pro Liter bzw. 65 %. Der Selbst-Abbau wurde bei pH 7 und 30 °C unter Verwendung von PHB durchgeführt, die auf 42 g/L konzentriert wurde. Als ein Ergebnis wurden 11,7 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure nach 36 Stunden erhalten, was zu einer Ausbeute von 23 % führte. Daher wurde bewiesen, dass (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure auch durch Selbst-Abbau von PHB hergestellt werden kann, die durch Kultivierung des Wild-Typs von Ralstonia eutropha unter Verwertung von Fruktose als einer Kohlenstoffquelle akkumuliert wurde.
  • <Beispiel 11> Herstellung von optisch aktiven Hydroxycarbonsäuren mit mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau von PHAs, die in Pseudomonas oleovorans synthetisiert und akkumuliert werden
  • Es wurde berichtet, dass PHAs, welche aus Hydroxycarbonsäuren (HA)-Monomeren von einer mittleren Kettenlänge mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen bestehen, in Pseudomonas oleovorans synthetisiert und akkumuliert werden können, wenn sie auf Alkanoaten, Alkoholen, Alkanolen, Alkanen oder Alkenen als Kohlenstoffquellen kultiviert werden, und dass die Arten oder die Zusammensetzung der Monomere in dem PHA-Polymer in Abhängigkeit von der verwendeten Kohlenstoffquelle variieren kann (Brandl et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 1977-1982, 1988; Steinbuchel, In: Biomaterials, Byrom, Eds., MacMillan Publishers, Busingstoke, 1991; Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, 1996).
  • Wenn zum Beispiel Hexansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wird, bestehen die synthetisierten PHAs aus 3-Hydroxyhexansäure (C6); 3-Hydroxyheptansäure (C7); 3-Hydroxyoctansäure (C8); und 3-Hydroxydetansäure (C10), alle in (R)-(-)-Konfiguration. 3-Hydroxyoexansäure ist das Hauptmonomer unter den Vorstehenden, das mit etwa 82 mol-% vertreten ist. Der Anteil der 3-Hydroxyoctansäure beträgt 17 mol-% und der Anteil der 3- Hydroxyheptansäure und 3-Hydroxydecansäure ist sehr klein bei etwa 1 mol-%.
  • Falls Heptansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wird, bestehen die synthetisierten PHAs aus sechs Arten von Monomeren (3-Hydroxyhexansäure, 3-Hydroxyheptansäure, 3-Hydroxyoctansäure, 3-Hydroxynonansäure, 3-Hydroxydecansäure, 3-Hydroxyundecansäure), welche C6- bis C11-Verbindungen sind, alle in der (R)-(-)-Konfiguration. (R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure ist das Haupt-Monomer unter den Vorstehenden, und besitzt einen Anteil von 94 mol-%.
  • Falls Octansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wird, bestehen die synthetisierten PHAs aus geradzahligen Kohlenstoffverbindungen, nämlich (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure (C6), (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure (C8), und (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure (C10). (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure ist das Haupt-Monomer unter den vorstehenden und besitzt einen Anteil von 86 mol-%. Der Anteil der (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure beträgt 10 mol-% und der der (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure beträgt 4 mol-%. Insbesondere in diesem Fall wird das synthetisierte Polymer üblicherweise als Poly-(R)-(-)-3-Hydroxyhexanoat-Co-(R)-(-)-3-Hydroxyoctanoat bezeichnet, da die meisten der in den synthetisierten PHAs enthaltenen Monomere (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure und (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure sind.
  • Falls Nonansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wird, bestehen die synthetisierten PHAs aus sechs Arten von Monomeren, wie in dem Fall der Verwendung von Heptansäure. (R)-(-)-3-Hydroxynonansäure ist das Haupt-Monomer, und besitzt einen Anteil von 58 mol-%. Die Anteile der (R)-(-)-3-Hydroxy heptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure und der (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure betragen 31, bzw. 6, 3 und 1 mol-%. Und wenig (R)-(-)-3-Hydroxyundecansäure kommt ebenso vor.
  • Falls Decansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wird, bestehen die synthetisierten PHAs aus fünf Arten von Monomeren, welche C6, C8, C9, C10 und C11 sind. (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure ist das Haupt-Monomer, und besitzt einen Anteil von 63 mol-%. Die Anteile der (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyundecansäure und jener der (R)-(-)-3-Hydroxynonansäure betragen 20, bzw. 11, 3 und 1 mol-%.
  • Daher ist es vorzuziehen, dass (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure aus Hexansäure hergestellt wird; (R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure aus Heptansäure; (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure aus Octansäure; (R)-(-)-3-Hydroxynonansäure aus Nonansäure; und (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxyundecansäure aus Decansäure.
  • In diesem Beispiel wurden Natriumoctanoat und Nonansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet, um PHAs von mittlerer Kettenlänge und nachfolgend ihre Monomere durch Selbst-Abbau herzustellen. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 wurde in einem chemisch definierten Medium durch das früher beschriebene Verfahren (Lee, Biotechnol. Bioprocess Eng., 1. 51-53, 1996) kultiviert, das nur Natriumoctanoat oder Nonansäure als eine Kohlenstoffquelle enthielt. Die Zellen akkumulierten Copolymere bis zu einem Grad von 5 % bis 40 % des Trockengewichts der Zellen. Wenn Natriumoctanoat als eine Kohlenstoffquelle verwendet wurde, akkumulierten die Zellen PHA-Copolymere bis zu 20 % des Trockengewichts der Zellen. Wenn Nonansäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wurde, akkumulierten die Zellen PHA-Copolymere bis zu 18 % des Trockengewichts der Zellen. Die durch Zentrifugation gesammelten Zellen wurden in Wasser dispergiert, das auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde, bei einer Konzentration von 75 g des Trockengewichts der Zellen pro Liter, und die Selbst-Abbaureaktion wurde bei 30 °C für 4 Tage durchgeführt (Tabelle 7 und Tabelle 8).
  • Tabelle 7.
  • Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau von PHAs, die in Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 durch Kultivierung auf Natriumoctanoat als einer Kohlenstoffquelle hergestellt wurden (anfänglicher pH-Wert: 7,0, Reaktionstemperatur: 30 °C, Reaktionszeit: 4 Tage).
  • Figure 00400001
  • Tabelle 8.
  • Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau von PHAs, die in Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 durch Kultivierung auf Nonansäure als einer Kohlenstoffquelle hergestellt wurden (anfänglicher pH-Wert: 7,0, Reaktionstemperatur: 30 °C, Reaktionszeit: 4 Tage).
  • Figure 00410001
  • Wie in Tabelle 7 und Tabelle 8 gezeigt, betrugen die Ausbeuten der Haupt-Monomere, welche durch Selbst-Abbau hergestellt wurden, 8-:10 %.
  • Bis jetzt gab es keinen Bericht für ein Verfahren zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge. (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge konnten durch das Verfahren hergestellt werden, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, auch wenn die Effizienz etwas niedriger als für (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure lag. Darüber hinaus können (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäure-Monomere von mittlerer Kettenlänge ebenso hergestellt werden, indem eine Kohlenstoffquelle während der PHA-Akkumulation verändert wird.
  • <Beispiel 12> Herstellung von optisch aktiven Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau von PHAs, die in Pseudomonas aeruginosa synthetisiert und akkumuliert werden
  • Es wurde berichtet, dass, falls Pseudomonas aeruginosa AO232 unter Verwendung von Essigsäure als einer Kohlenstoffquelle kultiviert wird, PHAs, die aus C6-, C8-, C10- und C12-Verbindungen bestehen ((R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure), synthetisiert und akkumuliert werden; und dass, falls Propionsäure als eine Kohlenstoffquelle verwendet wird, PHAs, die aus sieben unterschiedlichen Monomeren von C6-C12-Verbindungen bestehen ((R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxynotansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyundecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure), synthetisiert und akkumuliert werden (Saito und Doi, Int. J. Biol. Macromol., 15: 287, 1993; Lee und Chang, Adv. Biochem. Eng., 52: 27-58, 1995).
  • Darüber hinaus wurde berichtet, dass Pseudomonas putida, das mit einem Plasmid transformiert wurde, welches die PHA-Synthase von Pseudomonas aeruginosa PAO1 enthält, PHAs synthetisieren konnte, die aus Monomeren, nämlich C6-, C8-, C10- und C12-Verbindungen bestehen ((R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure), wenn sie unter Verwendung von Glukonat als einer Kohlenstoffquelle kultiviert werden (Timm und Steinbuchel, Eur. J. Biochem., 209: 15-30, 1992).
  • Daher wurde überlegt, dass verschiedene (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa hergestellt werden können, und insbesondere (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure hergestellt werden kann.
  • In diesem Beispiel wurde Pseudomonas aeruginosa PAO1 DSM 1707 in einem chemisch definierten Medium kultiviert, das Glukonat als eine Kohlenstoffquelle enthielt, wie früher berichtet (Timm und Steinbuchel, Eur. J. Biochem., 209: 15-30, 1992), und anschließend wurden die kultivierten Zellen in Wasser dispergiert, das auf einen pH von 7,0 eingestellt wurde, um eine PHA-Konzentration von 15 g/L zu ergeben. Der Selbst-Abbau wurde bei 37 °C für 4 Tage ausgeführt, um Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge zu ergeben (Tabelle 9).
  • Tabelle 9.
  • Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau von PHAs, die in Pseudomonas aeruginosa PAO1 DSM 1707 durch Kultivierung auf Glukonat als einer Kohlenstoffquelle hergestellt wurden (anfänglicher pH: 7,0, Reaktionstemperatur 30 °C, Reaktionszeit: 4 Tage).
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Wie in Tabelle 9 gezeigt, konnten (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure mit einer Ausbeute von 6 bis 10 % hergestellt werden, und diese drei Verbindungen konnten durch LC oder HPLC getrennt werden.
  • Somit konnten (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren von mittlerer Kettenlänge durch Selbst-Abbau von PHAs hergestellt werden, die in Pseudomonas aeruginosa akkumuliert wurden. Und insbesondere wurde das Verfahren zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure und (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure durch dieses Beispiel bereitgestellt.
  • <Beispiel 13> Herstellung von optisch aktiven Hydroxyalkansäuren von mittlerer Kettenlänge und (R)-(-)-3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure durch Selbst-Abbau von PHAs, die in Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 5-Phenylvaleriansäure als Co-substrat mit Nonansäure synthetisiert und akkumuliert werden
  • In diesem Beispiel wurde untersucht, ob PHAs, welche unübliche Monomer-Bestandteile enthalten, selbst-abgebaut werden können, um die entsprechenden optisch aktiven Monomere zu ergeben.
  • Wie früher berichtet (Fritzsche et al., Makromol. Chem., 191: 1957, 1990; Kim et al., Macromol., 24: 5256, 1991), kann Pseudomonas oleovorans PHAs herstellen, welche eine optisch aktive 3-Hydroxy-2-phenylvaleriansäure-Monomereinheit enthalten, wenn man sie in Gegenwart von 5-Phenylvaleriansäure wachsen lässt. In diesem Beispiel ließ man Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 mit gemischen Substraten wachsen (10 mM insgesamt, mit einem molaren Verhältnis von 2:1 von 5-Phenylvaleriansäure zu Nonansäure). Der PHA-Gehalt am Ende betrug 22 % und der Anteil der 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure-Monomereinheit in der PHA betrug 35 mol-%. Die PHA-enthaltenden Zellen wurden geerntet und in Wasser (der pH wurde anfänglich auf 7,0 eingestellt) bei 20 g/L als der anfänglichen PHA-Konzentration resuspendiert, und dann bei 37 °C für 4 Tage inkubiert. Die erhaltenen Mengen der hergestellten (R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxynonansäure und (R)-(-)-3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure betrugen 0,18, bzw. 0,65 und 0,62 g/L, und die Ausbeuten betrugen 7,0 % bzw. 8,1 % und 8,0 %.
  • Dieses Beispiel zeigte, dass die Monomereinheit aus (R)-(-)-3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure, auch wenn diese Monomereinheit für mikrobielle PHA unüblich ist, durch Selbst-Abbau von PHA hergestellt werden kann, welche dieses Monomer enthalten. Von diesem Ergebnis ausgehend können unübliche PHAs, die in Mikroorganismen akkumuliert werden, abgebaut werden, um die entsprechenden optisch aktiven Monomere zu erhalten, indem ein Selbst-Abbauverfahren verwendet wird, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
  • Wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, können verschiedene (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren effizient durch Selbst-Abbau von PHAs hergestellt werden, die in verschiedenen Mikroorganismen akkumuliert werden. Die Monomer-Ausbeuten waren hoch, was dieses Verfahren wirtschaftlich attraktiv macht. Für den Fall der (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure kann die Effizienz der Monomer-Herstellung durch die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren mit jenen verglichen werden, die früher von Akira und Tatsuhiko beschrieben wurden (JP9-234091, 1997). Wie nachstehend zusammengefasst (Tabelle 10), war die Ausbeute an (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, welche durch das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren hergestellt wurde, bis zu 50 mal höher als jene, die in dem in JP9-234091 beschriebenen Verfahren erreicht wurde. Daher liefert das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren einen viel effizienteren und wirtschaftlicheren Weg zur Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure. Darüber hinaus ist das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Verfahren nicht auf die Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure beschränkt, und es kann verwendet werden, um eine Vielzahl von (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren herzustellen, wie in den vorstehenden Beispielen gezeigt. Es ist offensichtlich, dass beliebige Wild-Typen von Mikroorganismen, welche PHAs akkumulieren und intrazelluläre Depolymerase-Aktivität besitzen, für die Herstellung verschiedener (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren verwendet werden können. Darüber hinaus ist es offensichtlich, dass mutierte Stämme dieser vorstehenden Mikroorganismen ebenfalls für die Herstellung von (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren verwendet werden können, solange sie eine intrazelluläre PHA-Depolymerase-Aktivität besitzen.
  • Tabelle 10.
  • Zusammenfassung der Ausbeuten an (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, die durch Selbst-Abbau hergestellt wurde
    Figure 00470001
  • *'Vergleichsbeispiel 1' und 'Vergleichsbeispiel 2' sind die berechneten Ergebnisse, die in dem japanischen Patent JP9-234091 beschrieben werden, unter der Annahme, dass die PHB-Gehalte ca. 50-80 % betrugen, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen.
  • <Beispiel 14> Herstellung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHB, die in rekombinanter Ralstonia eutropha synthetisiert und akkumuliert wird
  • In den vorstehenden Beispielen (Beispiel 1 bis Beispiel 13) wurde beschrieben, wie (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren durch Selbst-Abbau von PHA-Polymeren herzustellen sind, welche in nicht-rekombinanten Mikroorganismen synthetisiert und akkumu liert wurden. Kürzlich gab es verschiedene Berichte über das Klonen der PHA-Biosynthesegene aus verschiedenen Mikroorganismen und über die Erhöhung der Polymerherstellung durch rekombinante Mikroorganismen, welche die amplifizierten Enzymaktivitäten der PHA-Biosynthese enthalten (Lee, Biotechnol. Bioeng., 49: 1-14, 1996; Lee, Trends Biotechnol., 14: 431-438, 1996; Steinbuchel et al., FEMS Microbiol. Rev., 103: 217-230, 1992 und darin zitierte Referenzen).
  • In diesem Beispiel wurde ein rekombinanter Mikroorganismus, welcher PHA synthetisieren und akkumulieren kann, verwendet, um (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren durch Selbst-Abbau herzustellen.
  • Ralstonia eutropha NCIMB 11599, die mit dem Plasmid pVK101, das für einen breiten Wirtsbereich gedacht ist (Knauf und Nester, Plasmid, 8: 45, 1982), und die PHA-Biosynthesegene von Ralstonia eutropha ATCC 17699 (Schubert et al., J. Bacteriol., 170: 5837-5847, 1988; Choi und Lee, Hwahak Konghak, 35: 684-689, 1997) enthält, durch das zuvor beschriebene Verfahren kultiviert (Kim et al., Biotechnol. Bioeng., 43: 892-898, 1994). Die Zellen akkumulierten PHB bis zu 66 % des Trockengewichts der Zellen. Die durch Zentrifugation gesammelten Zellen wurden in Wasser dispergiert, welches auf einen pH von 4,0 oder 7,0 eingestellt wurde, um eine anfängliche PHB-Konzentration von 30 g/L zu ergeben, und sie wurden bei 30 °C 35 Stunden gehalten.
  • Wenn der anfängliche pH 4,0 betrug, wurden 5 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 0,3 g/L Dimer erhalten, während 8,7 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 0,6 g/L Dimer erhalten wur den, wenn der pH 7,0 betrug. Die Ausbeuten waren 14,7 % bzw. 26,8 %. Es wurde somit bewiesen, dass rekombinante Mikroorganismen, solange sie eine intrazelluläre Depolymerase-Aktivität besitzen, dazu verwendet werden können, um (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure durch Selbst-Abbau von PHA herzustellen, das in dem rekombinanten Mikrooganismus akkumuliert wird.
  • <Beispiel 15> Selbst-Abbau von PHB, die in dem rekombinanten Escherichis coli synthetisiert und akkumuliert wird, welches heterologe PHA-Biosynthesegene trägt
  • Der Wirts-Mikroorganismus Ralstonia eutropha (früher Alcaligenes eutrophus) NCIMB 11599, der in Beispiel 14 verwendet wurde, besitzt eine natürliche Aktivität für die PHA-Biosynthese, auch vor der Transformation mit den PHA-Biosynthesegenen. In diesem Beispiel wurden zwei Stämme von Escherichia coli, welche von Natur aus keine PHA-Syntheseaktivität besitzen (und somit PHA nicht intrazellulär akkumulieren können), als Wirts-Mikroorganismen verwendet, und sie wurden mit einem Plasmid transformiert, das die Biosynthesegene aus Ralstonia eutropha H16 ATCC 17699 oder Alcaligenes latus DSM 1123 enthält.
  • Rekombinantes E. coli B ATCC 11303 und E. coli XL1-Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037) wurden in diesem Beispiel verwendet, welche mit dem Plasmid pSYL105, das in hoher Kopienzahl vorliegt und die PHA-Biosynthesegene aus Alcaligenes eutrophus enthält (Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994) oder dem Plasmid pJC4 (KCTC 0481BP), welches die PHA-Biosynthesegene aus Alcaligenes latus enthält (Choi et al., App. Environ. Microbiol., in press (Dezember, 1998); Lee et al., Korean Patent application No. 98-1423,- 1998), transformiert. Diese rekombinanten E. coli Stämme wurden in Flaschen in LB-Medium (pH 7,0), das 20 g/L Glukose als eine Kohlenstoffquelle enthält, durch das zuvor beschriebene Verfahren kultiviert (Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 44: 1337-1347, 1994). Die Zellen, welche PHB bis 75 % - 80 % des Trockengewichts der Zellen akkumulierten, wurden durch Zentrifugation gesammelt. Der Selbst-Abbau wurde bei verschiedenen anfänglichen pH-Werten (pH 4, 7 und 10) und verschiedenen Reaktionstemperaturen (20, 30,37 und 45 °C) durchgeführt. Unter beliebigen Bedingungen, bei denen verschiedene rekombinante E. coli Stämme verwendet wurden, wurde die Bildung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure auch nach 4 Tagen nicht nachgewiesen.
  • Wie in den vorstehenden Beispielen gezeigt (Beispiele 14 und 15), kann, falls der rekombinante Mikroorganismus eine natürliche PHA-Syntheseaktivität besitzt, eine (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure durch Selbst-Abbau aus dem Mikroorganismus hergestellt werden, da der Mikroorganismus ebenfalls eine intrazelluläre PHA-Depolymerase besitzt. Wenn jedoch dieser rekombinante Mikroorganismus von Natur aus keine PHA-Syntheseaktivität besitzt, wie E. coli, kann eine (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure nicht durch Selbst-Abbau aus dem Mikroorganismus hergestellt werden, da der Mikroorganismus keine intrazelluläre PHA-Depolymerase besitzt. Falls jedoch ein rekombinanter Mikroorganismus, welcher keine natürliche PHA-Syntheseaktivität besitzt, mit einem Plasmid transformiert wird, das ein kloniertes intrazelluläres PHA-Depolymerase-Gen sowie PHA-Biosynthesegene trägt, können die Monomere durch den transformierten Mikroorganismus durch das Selbst-Abbauverfahren hergestellt werden. Daher können rekombinante Mikroorganismen dazu verwendet wer den, (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomere durch Selbst-Abbau aus PHAs herzustellen, welche darin akkumuliert werden, solange sie die intrazelluläre PHA-Depolymerase-Aktivität von Natur aus besitzen, oder durch rekominante DNA-Technologien erworben haben.
  • <Beispiel 16> Abtrennung von optisch reinen Hydroxycarbonsäure-Monomeren unter Verwendung von HPLC
  • Die Mischung der Hydroxycarbonsäure-Monomere, welche durch Selbst-Abbau von PHA-Copolymeren hergestellt wurden, konnten leicht durch herkömmliche, gut bekannte Verfahren getrennt werden, wie zum Beispiel Ionenaustausch, Elektrodialyse, Extraktion, Destillation, Flüssigkeits-Chromatographie (LC) und Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC). Für ein bevorzugtes Beispiel wurden (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure, die in Beispiel 3 hergestellt wurden, unter Verwendung von HPLC getrennt (5, 6, und 8). Im Detail wurden die Hydroxycarbonsäure-Monomere getrennt und mittels HPLC gereinigt (Hitachi Co., Japan), die mit einer Hitachi L-6000 Pumpe, einem L-3300 RI Detektor und einer Säule zur Trennung organischer Säuren ausgestattet war, wie zum Beispiel Aminex® HPX-87H-Säule (Bio-Rad Lab. Co., USA) oder ORH-801-Säule (Rainin Co., USA). 0,01 N H2SO4-Lösung wurde als die mobile Phase verwendet. Wie aus den 5, 6 und 8 ersehen werden kann, wurden zwei Monomere in effizienter Weise getrennt. Die Aminex® HPX-87H-Säule ist eine der üblicherweise verwendeten Ionenaustausch-Säulen zur Trennung und Analyse von Zuckern und organischen Säuren. Daher kann eine LC oder HPLC, die mit einer Ionenaustausch-Säule ausgestattet ist, Hydroxycarbonsäure-Monomere in effizienter Weise trennen. Darüber hinaus besitzt die Verwendung von Ionenaustausch-Säulen einen großen Vorteil einer leichten Maßstabsvergrößerung. Für die Trennung von Monomeren mit längerer Kettenlänge, wie z.B. Hydroxycarbonsäuren mit mittlerer Kettenlänge, ist die Verwendung von Säulen, die auf hydrophober Wechselwirkung beruhen, ebenfalls möglich.
  • <Beispiel 17> Reinigung von (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren
  • Die Monomere, welche aus einem Homopolymer hergestellt wurden, wie z.B. Poly-(R)-(-)-3-Hydroxybutyrat und (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomere, welche nach Selbst-Abbau des Copolymers in reinem Zustand durch das in Beispiel 16 gezeigte Verfahren abgetrennt wurden, können darüber hinaus durch herkömmliche chemische Verfahren oder durch die nachstehend beschriebenen Verfahren gereinigt werden, um Endprodukte für eine geeignete Verwendung herzustellen.
  • In diesem Beispiel wurden zwei bevorzugte Verfahren für die Reinigung von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure, die in Beispiel 1 und Beispiel 2 hergestellt wurde, untersucht.
  • Das eine ist ein modifiziertes Verfahren von Seebach et al. (Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, 1992): 1 mL 0,1 N Natriumhydroxid wurde zu 10 mL (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure-Schwefelsäure-Lösung (200 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure) gegeben, um sie zu neutralisieren, und das Wasser wurde mittels eines Rotationsverdampfers entfernt. Anschließend wurden 20 mL Ether zugegeben, um die Mischung zu lösen, und wasserfreies Magnesiumsulfat wurde zugegeben, um die Lösung zu trocknen. Schließlich wurde die Mischung filtriert. Der zugegebene Ether wurde ebenso mittels eines Rotationsverdampfers verdampft, um die Lösung zu konzentrieren und unter verminder tem Druck bei 100 °C unter Verwendung eines Kugelrohrs (Aldrich Co., USA) destilliert. Als ein Ergebnis wurden etwa 1,58 g (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure (etwa 79 % Ausbeute) mit einer Reinheit von mehr als 90 % erhalten.
  • Bei dem vorstehenden Verfahren ist in dem Reinigungsverfahren viel Energie erforderlich, wie z.B. bei einer Destillation unter vermindertem Druck, welche die Herstellungskosten erhöhen würde. Daher wurden weitere Reinigungsverfahren entwickelt, wie nachfolgend gezeigt.
  • Zuerst wurden 10 mL (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure-Lösung (200 g/L (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure) auf einen pH-Wert von 11 durch Zugabe von Natriumhydroxid eingestellt. Anschließend werden Verunreinigungen durch Lösungsmittel-Extraktion mit 10 mL Chloroform oder Ether (Verunreinigungen werden in die organische Phase extrahiert) entfernt. Die wässrige Phase, welche das Produkt enthält, wurde in einem Trocknungsofen bei 95 °C getrocknet. Der erhaltene, trockene Stoff wurde in Ethanol gelöst und erneut getrocknet. Schließlich wurden etwa 1,97 g (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure-Natriumsalz in Pulverform (etwa 82 % Ausbeute) mit einer Reinheit von mehr als 90 % erhalten. Bei diesem Verfahren kann ein anderes starkes Alkali, wie z.B. Kaliumhydroxid zusätzlich zu Natriumhydroxid verwendet werden, um den pH-Wert auf einen alkalischen Bereich einzustellen, was das Verfahren nicht beeinflusst, mit der Ausnahme, dass die Art der Salzform am Ende verändert wird.
  • Darüber hinaus können Chloroform und Ether, welche in diesem Beispiel als Lösungsmittel für die Extraktion verwendet werden, um Verunreinigungen zu entfernen, durch beliebige andere organische Lösungsmittel ersetzt werden, welche mit Wasser nicht mischbar sind, ohne das Verfahren in großem Umfang zu beeinflussen.
  • Das Verfahren von Seebach et al. (Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, 1992) ist in der Praxis schwierig anzuwenden, da das Verfahren hohe Betriebskosten und eine komplizierte Ausstattung erfordert. Daher ist letzteres Verfahren, welches in der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde, für die praktische Verwendung besser anwendbar, und (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure kann gereinigt und effizient durch das Verfahren zu Pulver verarbeitet werden.
  • Lediglich (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure wurde in diesem Beispiel gereinigt, jedoch kann dieses Reinigungsverfahren für die Reinigung von beliebigen anderen (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure-Monomeren mit hoher Reinheit verwendet werden.
  • <Beispiel 18> Identifikation der gereinigten (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren und Untersuchung der optischen Reinheit
  • Das gereinigte Produkt wurde in CDCl3 gelöst und durch Protonen-NMR (Bruker, Germany) analysiert, um zu überprüfen, dass das gereinigte Produkt (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure war. Wie in 9 gezeigt, wurde es bewiesen, dass das gereinigte Produkt (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure war. PHAs, welche in einem Mikroorganismus akkumuliert wurden, bestehen nur aus optisch aktiven Monomereinheiten mit (R)-(-)-Konfiguration aufgrund der optischen Spezifität der Biosyntheseenzyme, falls die Monomereinheiten ein chirales Zentrum besitzen (keine Isomere für 3-Hydroxypropionsäure, 4-Hydroxybuttersäure, 5-Hydroxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-2-butensäure). Daher sind alle hergestellten Monomer-Einheiten theoretisch optisch rein. Um dies zu überprüfen, wurde das gereinigte Pulver in destilliertem Wasser gelöst, und die optische Drehung wurde unter Verwendung eines Polarimeters gemessen (Perkin-Elmer Co., USA). Die optische Drehung betrug –24,7°, was in guter Übereinstimmung mit den von Seebach et al. berichtetem Wert stand (Seebach et al., Org. Synth., 71: 39-47, 1992). Somit wurde bewiesen, dass die gereinigte (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure optisch rein war.
  • WIRKUNG DER ERFINDUNG
  • Wie klar im Vorstehenden beschrieben, können verschiedene optisch aktive Hydroxycarbonsäuren durch Selbst-Abbau von verschiedenen PHAs hergestellt werden, welche in verschiedenen Mikroorganismen synthetisiert und akkumuliert werden, und die hergestellten Monomere können leicht getrennt werden, falls sie als eine Mischung zweier oder mehrerer Monomere vorliegen. Zusätzlich können in reinem Zustand getrennte (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren darüber hinaus durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, welches Verunreinigungen entfernt, gereinigt und durch Trocknung pulverisiert werden. Das Verfahren für die Herstellung verschiedener (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren, welches in der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde, ist wirtschaftlich, da optisch aktive (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren effizient mit hoher Ausbeute und Reinheit durch ein einfaches Verfahren hergestellt werden können. Ebenso ist dieses Verfahren umweltfreundlich, da organische Lösungsmittel, welche bei herkömmlichen Verfahren in großen Mengen erforderlich sind, in der vorliegenden Erfindung nur in geringen Mengen verwendet werden.

Claims (22)

  1. Verfahren zum Erzeugen von verschiedenen optisch aktiven (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuren, umfassend die folgenden Schritte: (a) Synthetisieren und Akkumulieren von Polyhydroxyalkanoaten (PHAs) durch Kultivieren von Mikroorganismen, die intrazelluläre Polyhydroxyalkanoat-Depolymeraseaktivität in einem Medium haben; und (b) Herstellen von optisch aktiven (R)-(-)-Hydroxycarbonsäuremonomeren durch Autodegradation von PHAs, die in den obigen kultivierten Mikroorganismen in einer Degradationslösung akkumuliert wurden, wobei der pH-Wert der Degradationslösung so eingestellt wird, dass die Ausbeute an (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure optimiert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der genannte Mikroorganismus ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen des Genus Achromobacter, Mikroorganismen des Genus Acidovorax, Mikroorganismen des Genus Acinetobacter, Actinobacillus sp., Actinomyces sp., Aeromonas caviae, Mikroorganismen des Genus Alcaligenes, Alteromonas macleodii, Mikroorganismen des Genus Amoebobacter, Aphanocapsa sp., Aphanotece sp., Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Mikroorganismen des Genus Azospirillum, Mikroorganismen des Genus Azotobacter, Mikroorganismen des Genus Bacillus, Mikroorganismen des Genus Beggiatoa, Mikroorganismen des Genus Beijerinckia, Mikroorganismen des Genus Beneckea, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Caryophanon latum, Mikroorganismen des Genus Caulobacter, Chloroflexus aurantiacus, Mikroorganismen des Genus Chlorogloea, Mikroorganismen des Genus Chromatium, Mikroorganismen des Genus Chromobacterium, Mikroorganismen des Genus Clostridium, Mikroorganismen des Genus Comamonas, Mikroorganismen des Genus Corynebacterium, Mikroorganismen des Genus Derxia, Desulfococcus Multivorans, Mikroorganismen des Genus Desulfonema, Desulfosarcina variabilis, Mikroorganismen des Genus Desulfovibrio, Mikroorganismen des Genus Ectothiorhodospira, Ferrobacillus ferrooxidans, Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae, Mikroorganismen des Genus Halobacterium, Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus, Hydrogenomonas facilis, Mikroorganismen des Genus Hydrogenophaga, Mikroorganismen des Genus Hyphomicrobium, Ilyobacter delafieldii, Labrys monachus, Mikroorganismen des Genus Lactobacillus, Mikroorganismen des Genus Lactococcus, Lamprocystis roseopersicina, Lampropedia hyalina, Legionella sp., Leptothrix discophorus, Mikroorganismen des Genus Methylobacterium, Methylococcus thermophilus, Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Mikroorganismen des Genus Methylosinus, Methylovibrio soehngenii, Mikroorganismen des Genus Micrococcus, Mikroorganismen des Genus Microcoleus, Mikroorganismen des Genus Microcystis, Mikroorganismen des Genus Moraxella, Mikroorganismen des Genus Mycobacterium, Mycoplana rubra, Mikroorganismen des Genus Nitrobacter, Mikroorganismen des Genus Nitrococcus, Mikroorganismen des Genus Nocardia, Oscillatoria limosa, Paracoccus dentrificans, Pediococcus halophilus, Penicillium cyclopium, Mikroorganismen des Genus Photobacterium, Physarum polycephalum, Protomonas extorquens, Mikroorganismen des Genus Pseudomonas, Mikroorganismen des Genus Ralstonia, Mikroorganismen des Genus Rhizobium, Mikroorganismen des Genus Rhodobacillus, Mikroorganismen des Genus Rhodobacter, Mikroorganismen des Genus Rhodococcus, Mikroorganismen des Genus Rhodocyclus, Rhodomicrobium vannielii, Mikroorganismen des Genus Rhodopseudomonas, Mikroorganismen des Genus Rhodospirillum, Sphaerotilus natans, Sphingomonas paucimobilis, Mikroorganismen des Genus Spirillum, Mikroorganismen des Genus Spirulina, Mikroorganismen des Genus Staphylococcus, Mikroorganismen des Genus Stella, Streptococcus thermophilus, Mikroorganismen des Genus Streptomyces, Mikroorganismen des Genus Synechococcus, Syntrophomonas wolfei, Mikroorganismen des Genus Thiobacillus, Mikroorganismen des Genus Thiocapsa, Thiocystis violacea, Mikroorganismen des Genus Thiodictyon, Thiosphaera pantotropha, Trichodesmimum thiebautii, Vibrio parahaemolyticus, Xanthobacter autotrophicus, Xanthomonas maltophilia und Mikroorganismen des Genus Zoogloea.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte Monomer eines oder mehrere ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 3-Hydroxypropionsäure, (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxynonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyundecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxydodecansäure, (R)-(-)-3-xydroxytetradecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxyhexadecansäure, 4-Hydroxybuttersäure, (R)-(-)-4-Hydroxyvaleriansäure, (R)-(-)-4-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-4-Hydroxyheptansäure, (R)-(-)-4-Hydroxyoctansäure, (R)-(-)-4-Hydroxydecansäure, 5-Hydroxyvaleriansäure, (R)-(-)-5-Hydroxyhexansäure, (R)-(-)-6-Hydroxydodecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-Pentensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-trans-hexensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-cis-hexensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-hexensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-trans-octensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-cis-octensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-octensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-nonensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-decensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-cis-dodecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-cis-dodecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-cis- tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5,8-cis-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-methylvaleriansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-methylhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-methylhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-methylheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methyloctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-methylnonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methylnonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-methylnonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methyldecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-methyldecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-methyl-6-octensäure, Äpfelsäure, (R)-(-)-3-Hydroxybernsteinsäuremethylester, (R)-(-)-3-Hydroxyadipinsäuremethylester, (R)-(-)-3-Hydroxykorksäuremethylester, (R)-(-)-3-Hydroxyazelainsäuremethylester, (R)-(-)-3-Hydroxysebacinsäuremethylester, (R)-(-)-3-Hydroxykorksäureethylester, (R)-(-)-3-Hydroxysebacinsäureethylester, (R)-(-)-3-Hydroxypimelinsäurepropylester, (R)-(-)-3-Hydroxysebacinsäurebenzylester, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-acetoxyoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-acetoxynonansäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxybuttersäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyvaleriansäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyheptansäure, Phenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyoctansäure, Para-cyanophenoxy-(R)-(-)-3-hydroxybuttersäure, Para-cyanophenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyvaleriansäure, Para-cyanophenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyhexansäure, Para-nitrophenoxy-(R)-(-)-3-hydroxyhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-5-cyclohexylbuttersäure, (R)-(-)-3,12-Dihydroxydodecansäure, (R)-(-)-3,8-Dihydroxy-5-cis-tetradecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-4,5-epoxydecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6,7-epoxydodecansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecansäure, 7-Cyano-(R)-(-)-3-Hydroxyheptansäure, 9-Cyano-(R)-(-)-3-Hydroxynonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-7-fluorheptansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-9-fluornonansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-chlorhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-chloroctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-6-bromhexansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-8-bromoctansäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-11-bromundecansäure, 3-Hydroxy-2-butensäure, (R)-(-)-6-Hydroxy-3-dodecensäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-2-methylbuttersäure, (R)-(-)-3-Hydroxy-2-methylvaleriansäure und (R)-(-)-3-Hydroxy-2,6-dimethyl-5-heptensäure.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der genannte Mikroorganismus ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus den Mikroorganismen Alcaligenes latus, Corynebacterium sp., Bacillus sp., Methylosinus trichosporium, Rhodospirillum rubrum, Ralstonia eutropha, Pseudomonas aeruginosa und Pseudomonas oleovorans.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der genannte Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa oder Pseudomonas oleovorans ist und das genannte Monomer ein oder mehrere ist, die ausgewählt sind aus (R)-(-)-3-Hydroxycarbonsäuren, deren Kohlenstoffzahlen im Bereich von 6 bis 14 liegen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannte Degradationslösung eine Lösung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser, Salzlösung, einem Gemisch aus Wasser und organischen Lösungsmitteln und einer Pufferlösung.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der pH-Wert der genannten Degradationslösung im Bereich von 2 - 12 liegt, der Temperaturbereich 4 - 60°C und die Reaktionszeit länger als 0,5 Stunden ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt des Trennens der hergestellten optisch aktiven Hydroxycarbonsäuremonomere mit Flüssigchromatografie (LC) oder Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC).
  9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 8, ferner umfassend die Schritte des Reinigens und Herstellens von Pulvern aus den rein getrennten, optisch aktiven Hydroxycarbonsäuremonomeren.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine LC- oder HPLC-Säule eine Ionenaustauschsäule oder eine hydrophobe Interaktionssäule ist und die mobile Phase eine saure Lösung ist, deren pH-Wert im Bereich von 1 - 5 liegt.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Reinigungs- und Pulverherstellungsschritte die folgenden Schritten umfassen: (a) Zugeben eines starken Alkalis zu der optisch aktiven Hydroxycarbonsäurelösung und Einstellen des pH-Werts auf einen alkalischen Bereich über 7; und (b) Beseitigen von Verunreinigungen durch organische Lösungsmittelextraktion; und (c) Trocknen der gereinigten, optisch aktiven Hydroxycarbonsäuren.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Monomer (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure ist und der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen des Genus Achromobacter, Mikroorganismen des Genus Acidovorax, Mikroorganismen des Genus Acinetobacter, Actinobacillus sp., Actinomyces sp., Aeromonas caviae, Mikroorganismen des Genus Alcaligenes (anders als Ralstonia), Alteromonas macleodii, Mikroorganismen des Genus Amoebobacter, Aphanocapsa sp., Aphanothece sp., Aquaspirillum autotrophicum, Azorhizobium caulinodans, Mikroorganismen des Genus Azospirillum, Mikroorganismen des Genus Azotobacter, Mikroorganismen des Genus Bacillus, Mikroorganismen des Genus Beggioatoa, Mikroorganismen des Genus Beijerinckia, Mikroorganismen des Genus Beneckea, Bordetella pertussis, Bradyrhizobium japonicum, Caryophanon latum, Mikroorganismen des Genus Caulobacter, Chloroflexus aurantiacus, Mikroorganismen des Genus Chlorogloea, Mikroorganismen des Genus Chromatium, Mikroorganismen des Genus Chromobacterium, Mikroorganismen des Genus Clostridium, Mikroorganismen des Genus Comamonas, Mikroorganismen des Genus Corynebacterium, Mikroorganismen des Genus Derxia, Desulfococcus Multivorans, Mikroorganismen des Genus Desulfonema, Desulfosarcina variabilis, Mikroorganismen des Genus Desulfovibrio, Mikroorganismen des Genus Ectothiorhodospira, Ferrobacillus ferrooxidans, Flavobacterium sp., Haemophilus influenzae, Mikroorganismen des Genus Halobacterium, Haloferax mediterranei, Hydroclathratus clathratus, Hydrogenomonas facilis, Mikroorganismen des Genus Hydrogenophaga, Mikroorganismen des Genus Hyphomicrobium, Ilyobacter delafieldii, Labrys monachus, Mikroorganismen des Genus Lactobacillus, Mikroorganismen des Genus Lactococcus, Lamprocystis roseopersicina, Lampropedia hyalina, Legionella sp., Leptothrix discophorus, Mikroorganismen des Genus Methylobacterium, Methylococcus thermophilus, Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Mikroorganismen des Genus Methylosinus, Methylovibrio soehngenii, Mikroorganismen des Genus Micrococcus, Mikroorganismen des Genus Microcoleus, Mikroorganismen des Genus Microcystis, Mikroorganismen des Genus Moraxella, Mikroorganismen des Genus Mycobacterium, Mycoplana rubra, Mikroorganismen des Genus Nitrobacter, Mikroorganismen des Genus Nitrococcus, Mikroorganismen des Genus Nocardia, Oscillatoria limosa, Paracoccus dentrificans, Pediococcus halophilus, Penicillium cyclopium, Mikroorganismen des Genus Photobacterium, Physarum polycephalum, Protomonas extorquens, Ralstonia eutropha (früher, Alcaligenes eutrophus') H16, Mikroorganismen des Genus Rhizobium, Mikroorganismen des Genus Rhodobacillus, Mikroorganismen des Genus Rhodobacter, Mikroorganismen des Genus Rhodococcus, Mikroorganismen des Genus Rhodocyclus, Rhodomicrobium vannielii, Mikroorganismen des Genus Rhodopseudomonas, Mikroorganismen des Genus Rhodospirillum, Sphaerotilus natans, Sphingomonas paucimobilis, Mikroogranismen des Genus Spirillum, Mikroorganismen des Genus Spirulina, Mikroorganismen des Genus Staphylococcus, Mikroorganismen des Genus Stella, Streptococcus thermophilus, Mikroorganismen des Genus Streptomyces, Mikroorganismen des Genus Synechococcus, Syntrophomonas wolfei, Mikroorganismen des Genus Thiobacillus, Mikroorganismen des Genus Thiocapsa, Thiocystis violacea, Mikroorganismen des Genus Thiodictyon, Thiosphaera pantotropha, Trichodesmimum thiebautii, Vibrio parahaemolyticus, Xanthobacter autotrophicus, Xanthomonas maltophilia und Mikroorganismen des Genus Zoogloea.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikroorganismen von Alcaligenes latus, Bacillus sp., Corynebacterium sp., Methylosinus trichosporium, Rhodospirillum rubrum und Ralstonia eutropha (früher ,Alcaligenes eutrophus') H16.
  14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die genannte Degradationslösung eine Lösung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasser, Salzlösung, einem Gemisch aus Wasser und organischen Lösungsmitteln sowie einer Pufferlösung.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der pH-Wert der genannten Degradationslösung im Bereich 2 - 12 liegt, der Temperaturbereich 4 - 60°C und die Reaktionszeit länger als 0,5 Stunden ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend den Schritt des Trennens der hergestellten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure mit Flüssigchromatografie (LC) oder Hochleistungsflüssigchromatografie (HPLC).
  17. Verfahren nach Anspruch 12 oder 16, ferner umfassend die Schritte des Reinigens und Herstellens von Pulver aus der rein getrennten (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure.
  18. Verfahren zum Herstellen von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure, umfassend die folgenden Schritte: (a) Synthetisieren und Akkumulieren von Poly-3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxybutyrat durch Kultivieren von Mikroorganismen, die intrazelluläre Polyhydroxyalkanoat-Depolymeraseaktivität in einem Medium haben; und (b) Herstellen von (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und 4-Hydroxybuttersäure-Monomeren durch Autodegradation von Poly-3-hydroxybutyrat-co-4-hydroxybutyrat, akkumuliert in den oben kultivierten Mikroorganismen in einer Degradationslösung, wobei der pH-Wert der Degradationslösung so eingestellt wird, dass die Ausbeute an (R)-(-)-Hydroxycarbonsäure optimiert wird. 19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der genannte Mikroorganismus Alcaligenes latus ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Monomere (R)-(-)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-(-)-3-Hydroxyvaleriansäure ist und das Polyhydroxyalkanoat Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der genannte Mikroorganismus Ralstonia eutropha (früher Alicaligenes eutrophus) ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der genannte Mikroorganismus ein rekombinanter Mikroorganismus ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der genannte rekombinante Mikroorganismus Ralstonia eutropha (früher Alicaligenes eutrophus) ist, der das PHA-Biosynthesegen Ralstonia eutropha enthält.
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