JPS59220196A - アクリル酸エステル生産菌 - Google Patents
アクリル酸エステル生産菌Info
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- JPS59220196A JPS59220196A JP9525083A JP9525083A JPS59220196A JP S59220196 A JPS59220196 A JP S59220196A JP 9525083 A JP9525083 A JP 9525083A JP 9525083 A JP9525083 A JP 9525083A JP S59220196 A JPS59220196 A JP S59220196A
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- Japan
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- acrylic acid
- strain
- acid ester
- alcaligenes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野:
本発明はアクリル酸エステル生産菌、特に水酸基を有す
るアクリル酸エステルの生産菌およびその菌を用いたア
クリル酸エステルの製法に関する。
るアクリル酸エステルの生産菌およびその菌を用いたア
クリル酸エステルの製法に関する。
従来技術:
エスflv合成をエステラーゼの逆反応で行なう研究は
、古くから行なわれている。その一つに。
、古くから行なわれている。その一つに。
リパーゼを用いる反応において、酸成分とアルコール成
分を変えたときの研究報告がある(辻阪。
分を変えたときの研究報告がある(辻阪。
岩井、奥付ら、 Biochemica et Bio
physica Acta 。
physica Acta 。
575(1979)9156−165)。そこでは、酸
成分として酢酸、プロピオン酸、酪酸をはじめヌテアリ
ン酸、オレイン酸、リンゴ酸、コハク酸などが検討され
、アルコ−μ成分としては1級アルコール、1級ジオー
ル、フェノール類、2級アルコール、2級ジオール、8
級アルコール、糖フルコーμなどのあらゆるアルコール
類が検討されている。
成分として酢酸、プロピオン酸、酪酸をはじめヌテアリ
ン酸、オレイン酸、リンゴ酸、コハク酸などが検討され
、アルコ−μ成分としては1級アルコール、1級ジオー
ル、フェノール類、2級アルコール、2級ジオール、8
級アルコール、糖フルコーμなどのあらゆるアルコール
類が検討されている。
そこに使用されているリパーゼ類は4種であシ。
それぞれの起源はAspergillus niger
、 Rh1zopus delemx。
、 Rh1zopus delemx。
Geotrichum candidum、 Peni
cillium cyclopium である。
cillium cyclopium である。
そのうちの前二者が特に低分子量の酸に対してもエステ
μ合成能を有することが示されている。しかし、いづれ
にしろ、この研究には酸成分として。
μ合成能を有することが示されている。しかし、いづれ
にしろ、この研究には酸成分として。
アクリル酸が用いられていない。本発明者は上記報告に
開示されたリパーゼ(天野製薬■製および生化学工業■
製)を用い検討したが、アクリル酸はいかなるアルコー
ル類ともエヌテμ合成し得ないことを確認した。その他
の従来のエステル合成に関する報告においても酸成分に
アクリル酸を用いた反応は報告されていない。
開示されたリパーゼ(天野製薬■製および生化学工業■
製)を用い検討したが、アクリル酸はいかなるアルコー
ル類ともエヌテμ合成し得ないことを確認した。その他
の従来のエステル合成に関する報告においても酸成分に
アクリル酸を用いた反応は報告されていない。
アクリル酸とアルコールとのエステル合成によシ得られ
るアクリル酸エステルは、ビニル基を有するため1種々
の工業材料となシ得る重合体原料として極めて有用であ
る。例えば、このアクリル酸エステμを他の単量体と共
重合して得られる高分子は、粘着剤、接着剤、およびフ
ィルムなどとして用いられる。さらに、また、このアク
リル酸エステルが水酸基を有するので親水性を持ち官能
基としても作用し、それよシ得られる重合体は易架橋性
ポリマーとなシ、接着剤、塗料、その他の多くの用途を
有しかつ新規な用途開発も期待される。このようなアク
リル酸エステルの合成は、化学合成によシ可能ではある
。しかし、化学合成によると9反応条件が過酷であるた
め、そのための付帯設備とスペースと費用がかさむ。し
かも9作業環境が汚染されやすく環境公害の原因にもな
る。
るアクリル酸エステルは、ビニル基を有するため1種々
の工業材料となシ得る重合体原料として極めて有用であ
る。例えば、このアクリル酸エステμを他の単量体と共
重合して得られる高分子は、粘着剤、接着剤、およびフ
ィルムなどとして用いられる。さらに、また、このアク
リル酸エステルが水酸基を有するので親水性を持ち官能
基としても作用し、それよシ得られる重合体は易架橋性
ポリマーとなシ、接着剤、塗料、その他の多くの用途を
有しかつ新規な用途開発も期待される。このようなアク
リル酸エステルの合成は、化学合成によシ可能ではある
。しかし、化学合成によると9反応条件が過酷であるた
め、そのための付帯設備とスペースと費用がかさむ。し
かも9作業環境が汚染されやすく環境公害の原因にもな
る。
このエステル合成を微生物を用いた生物学的反応によシ
行うと、低温・低圧という温和な条件下で反応できしか
も基質特異性を有するため、環境汚染のおそれがないう
えに設備費なども安くつく。
行うと、低温・低圧という温和な条件下で反応できしか
も基質特異性を有するため、環境汚染のおそれがないう
えに設備費なども安くつく。
発明の目的:
本発明の目的は、アクリル酸と二価アルコールとによシ
水酸基を有するアクリル酸エステルを生産する新規な微
生物およびそれを用いた生物学的反応によるアクリル酸
エステμの製法を提供することにある。本発明の他の目
的は、生物学的反応により安全かつ安価にアクリル酸エ
ステルを製造する方法を提供することにある。本発明の
さらに他の目的は、工業材料となシ得る有用な重合体原
料としてのアクリル酸エステ〃を生産する菌およびそれ
を用いたアクリル酸エステルの製法を提供することにあ
る。
水酸基を有するアクリル酸エステルを生産する新規な微
生物およびそれを用いた生物学的反応によるアクリル酸
エステμの製法を提供することにある。本発明の他の目
的は、生物学的反応により安全かつ安価にアクリル酸エ
ステルを製造する方法を提供することにある。本発明の
さらに他の目的は、工業材料となシ得る有用な重合体原
料としてのアクリル酸エステ〃を生産する菌およびそれ
を用いたアクリル酸エステルの製法を提供することにあ
る。
発明の要旨:
本発明のアクリル酸エステル生産菌は、アルカリ土類金
属に属しアクリ、V酸と一般式HOROH(ただし、B
−は炭素数2〜6の直鎖のアルキレン基で表わされる二
価アルコールとから水酸基を有するアクリル酸エステル
を生産する。そのことにより上記目的が達成される。ア
ルカリ土類金属菌はアルカリゲネス・フエーカリスTH
836株およびアルカリゲネス・フエーカリスTK49
B5株のうちの少なくとも一方である。二価アルコール
としては両末端に水酸基を有する炭素数2〜6の直鎖状
アルコールであシ、それはエチレングリコール。
属に属しアクリ、V酸と一般式HOROH(ただし、B
−は炭素数2〜6の直鎖のアルキレン基で表わされる二
価アルコールとから水酸基を有するアクリル酸エステル
を生産する。そのことにより上記目的が達成される。ア
ルカリ土類金属菌はアルカリゲネス・フエーカリスTH
836株およびアルカリゲネス・フエーカリスTK49
B5株のうちの少なくとも一方である。二価アルコール
としては両末端に水酸基を有する炭素数2〜6の直鎖状
アルコールであシ、それはエチレングリコール。
1・8ジヒドロキシプロパン、1・4ジヒドロキシブタ
ン、1・5ジヒドロキシペンタンおよびl・6ジヒドロ
キシヘキサンである。
ン、1・5ジヒドロキシペンタンおよびl・6ジヒドロ
キシヘキサンである。
また2本発明のアクリル酸エステ/L’製造法は。
上記微生物を用いてアクリル酸と一般弐〇〇ROH(た
だし、Rは炭素数2〜6の直鎖のアルキレン基で表わさ
れる上記二価アルコールとから水酸基を有するアクリル
酸エステルを生産するもので。
だし、Rは炭素数2〜6の直鎖のアルキレン基で表わさ
れる上記二価アルコールとから水酸基を有するアクリル
酸エステルを生産するもので。
そのことによシ上記目的が達成される。反応式で表わす
と。
と。
の反応が行なわれる。
本発明の微生物は、化学工業原料を扱っている工場など
の土壌(茨木市、豊橋市)から分離・採集した新菌株で
ある。この新菌株は、後述する菌学的性状をもとに[B
ergey’s Manual of Determi
nativeBacteriology 8th ed
itor 、 1974 J (D細菌分類書を参考に
して同定され、アルカリ土類金属に属する細菌であると
ころから、それぞれ、アルカリゲネス・フエーカリス(
Alcaligenes faecalis ) Ti
1336株(受託番号:微工研菌寄第7083号(FE
RMP−7088))およびアルカリゲネス−7x−カ
リス(Alcaligenesfaecal is )
TK4935 (受託番号:微工研菌寄第7084号
(FERM P−7084)ンと命名された。
の土壌(茨木市、豊橋市)から分離・採集した新菌株で
ある。この新菌株は、後述する菌学的性状をもとに[B
ergey’s Manual of Determi
nativeBacteriology 8th ed
itor 、 1974 J (D細菌分類書を参考に
して同定され、アルカリ土類金属に属する細菌であると
ころから、それぞれ、アルカリゲネス・フエーカリス(
Alcaligenes faecalis ) Ti
1336株(受託番号:微工研菌寄第7083号(FE
RMP−7088))およびアルカリゲネス−7x−カ
リス(Alcaligenesfaecal is )
TK4935 (受託番号:微工研菌寄第7084号
(FERM P−7084)ンと命名された。
菌学的性質
本発明のAlcaligenes faecalis
TH3j313株とAlcaligenes faec
alis TK4935株の菌学的性質を第1表に示す
。
TH3j313株とAlcaligenes faec
alis TK4935株の菌学的性質を第1表に示す
。
以下余白
州 州 州 褐
O 東 j 想 胡 胡胡 文 佃 瑞 (り@(El@ ■ ■◎OO■[株]
■@ @■ 十千 1111111111111++ ++ ++ 1111111111111++ ++ 他方1水閘株はいずれも、第8表に示すように。
O 東 j 想 胡 胡胡 文 佃 瑞 (り@(El@ ■ ■◎OO■[株]
■@ @■ 十千 1111111111111++ ++ ++ 1111111111111++ ++ 他方1水閘株はいずれも、第8表に示すように。
Alcal igenes属と多くの点で性質が共通す
る。
る。
第 8 表
1、好気性
2、ダラム陰性
3、醗酵的でない
4、運動性有 鞭毛(1〜8本)
5、大きさ 0.5−1.2μm by 0.5−2.
6μm6、通常 単独で存在 7、色素を作らない 8、オキシダーゼ : 陽性 9、寒天を分解しない 10、カゼイン・ゼラチンを分解しない11、 生育
の適温 20〜87℃ 12、 pH7,Qですばやく生育する186 ガ
ス状N2を固定しない 以上の結果から1本発明の菌株TH8B6株およびTK
49B5株はAlcaligenea 属K Q f
ル1f51 fa テ1) 7)と同定される。次に本
発明の菌株の種を決定するためにこの属の既知の4種と
比較した結果を第本表に示す。
6μm6、通常 単独で存在 7、色素を作らない 8、オキシダーゼ : 陽性 9、寒天を分解しない 10、カゼイン・ゼラチンを分解しない11、 生育
の適温 20〜87℃ 12、 pH7,Qですばやく生育する186 ガ
ス状N2を固定しない 以上の結果から1本発明の菌株TH8B6株およびTK
49B5株はAlcaligenea 属K Q f
ル1f51 fa テ1) 7)と同定される。次に本
発明の菌株の種を決定するためにこの属の既知の4種と
比較した結果を第本表に示す。
第 4 表
本発明の菌株は、いずれもAlcaligenes f
aecalisとは、プロピオン酸と酪酸の資化性能を
欠く点が異なるにすぎず、他の特徴はすべてこれと一致
する。
aecalisとは、プロピオン酸と酪酸の資化性能を
欠く点が異なるにすぎず、他の特徴はすべてこれと一致
する。
よって1水閘株をAlcaligenes faeca
lisにきわめて近緑の菌株であl) Alcalig
enes faecalisと同定した。
lisにきわめて近緑の菌株であl) Alcalig
enes faecalisと同定した。
培養条件
培地としては格別である必要はなく、肉エキス。
酵母エキス、麦芽エキス、ペプトンなどの有機栄養源、
およびリン酸塩、マグネシウム、ナトリウム、カリウム
、マンガン、鉄などの無機栄養源等を適宜含有する通常
の検知でよい。
およびリン酸塩、マグネシウム、ナトリウム、カリウム
、マンガン、鉄などの無機栄養源等を適宜含有する通常
の検知でよい。
炭素源としては、炭素源資化性試験において基質となっ
た各種アミノ酸、TCAサイクルメンバーの有機酸など
が用いられる。窒素源としては。
た各種アミノ酸、TCAサイクルメンバーの有機酸など
が用いられる。窒素源としては。
硝酸塩、亜硝酸塩およびアンモニウム塩などの無機窒素
やアミノ基の有機窒素などが用いられる。
やアミノ基の有機窒素などが用いられる。
培養温度は20°C〜85°C好ましくは25°C〜8
0°Cである。培養PHは5〜8好ましくは6.5〜7
.6であシ、1日〜8日間好気的に攪拌又は振とうしな
がら培養を行なう。
0°Cである。培養PHは5〜8好ましくは6.5〜7
.6であシ、1日〜8日間好気的に攪拌又は振とうしな
がら培養を行なう。
反応組成
本発明のエステル反応は、このような培養条件のもとて
本発明菌株を培養し、その休止菌体、菌体抽出液(粗酵
素液)、精製酵素、固定化菌体および固定化酵素状態の
うちの少なくとも一つを適当に選んで用いる。本発明の
水酸基を有するアクviv酸エスデμの合成に必要な反
応系の基本組成は第5表に示される。なお、この合成に
当って媒体を用いる場合には水媒体とするのが一般的で
ある。
本発明菌株を培養し、その休止菌体、菌体抽出液(粗酵
素液)、精製酵素、固定化菌体および固定化酵素状態の
うちの少なくとも一つを適当に選んで用いる。本発明の
水酸基を有するアクviv酸エスデμの合成に必要な反
応系の基本組成は第5表に示される。なお、この合成に
当って媒体を用いる場合には水媒体とするのが一般的で
ある。
第 5 表
リン酸バッファー(pH8,0) 0.2M
アクリル酸 1%(y/v)
ジヒドロキシアルコ−tv 10%(’
Pv)水 菌体もしくは菌体抽出液 菌体および抽出液の添加量は、菌体懸濁液として最終濃
度がe6onmの吸光度(00660)でo、 i以上
0通常は1.0〜20の範囲にある。菌体抽出液は。
アクリル酸 1%(y/v)
ジヒドロキシアルコ−tv 10%(’
Pv)水 菌体もしくは菌体抽出液 菌体および抽出液の添加量は、菌体懸濁液として最終濃
度がe6onmの吸光度(00660)でo、 i以上
0通常は1.0〜20の範囲にある。菌体抽出液は。
菌体を超音波破砕機やフレンチプレスで処理して得られ
、 28Or1mの吸光度(A280)が0.1以上・
通常は0.5〜20.0の範囲で用いられる。
、 28Or1mの吸光度(A280)が0.1以上・
通常は0.5〜20.0の範囲で用いられる。
反応PHは5〜9の範囲にあればよい。好ましくは6.
5〜7.5である。
5〜7.5である。
アクリル酸量の使用可能な濃度は、0.1%0’v)〜
5%(”’v)でアシ、好ましくは0.5%(!v)〜
2%(Y’v)の範囲に選ばれる。アクリル酸の使用に
よシ反応系組成のpHが低下しアクリル酸の消費と共に
piが上昇する。このようなpH変動を極小にし反応系
のpHが常時7前後になるようにするために本基本組成
ではバッファーとして0.2Mのリン酸バッファーが用
いられる。リン酸バッファーに代えて重伏酸−次酸Na
バッファー、トリス塩酸バッファーなどを用いることも
できる。バッファー濃度も0.2Mに限定されることは
なく、使用されるアクリル酸量や反応速度などに応じて
適宜選択される。
5%(”’v)でアシ、好ましくは0.5%(!v)〜
2%(Y’v)の範囲に選ばれる。アクリル酸の使用に
よシ反応系組成のpHが低下しアクリル酸の消費と共に
piが上昇する。このようなpH変動を極小にし反応系
のpHが常時7前後になるようにするために本基本組成
ではバッファーとして0.2Mのリン酸バッファーが用
いられる。リン酸バッファーに代えて重伏酸−次酸Na
バッファー、トリス塩酸バッファーなどを用いることも
できる。バッファー濃度も0.2Mに限定されることは
なく、使用されるアクリル酸量や反応速度などに応じて
適宜選択される。
前記二価アルコールは、酵素の安定化に悪影響を与える
ことがないため量的な制限は特にない。
ことがないため量的な制限は特にない。
しかし、アクリル酸1七p当シ、少なくとも0.5七p
の二価アルコールが用いられる。上記アルコールの使用
量の上限は前記のようにいくら多くてもよいが9通常0
.5%(Y’v) 〜10%(Y’v)で用いられる。
の二価アルコールが用いられる。上記アルコールの使用
量の上限は前記のようにいくら多くてもよいが9通常0
.5%(Y’v) 〜10%(Y’v)で用いられる。
モル比ではアクリル酸1モル当り通常0.5〜5oモl
、好tしくけ1〜20モルの二価アルコールが用いられ
る。ジヒドロキシアルコールの添加量に応じて生成する
水酸基を有するアクリy酸エステルの量も多くなる。反
応温度は20゛C〜40°Cの範囲内であれば良い。好
ましくば25゛C〜35°Cである。反応時間は基質添
加量によシ幾分異なるが約10分以上であれば検出可能
である。
、好tしくけ1〜20モルの二価アルコールが用いられ
る。ジヒドロキシアルコールの添加量に応じて生成する
水酸基を有するアクリy酸エステルの量も多くなる。反
応温度は20゛C〜40°Cの範囲内であれば良い。好
ましくば25゛C〜35°Cである。反応時間は基質添
加量によシ幾分異なるが約10分以上であれば検出可能
である。
生成物の検出
反応終了後の系から菌体を遠心分離によシ除く。
その上澄液を直接ガスクロマトグラフあるいは液体クロ
マトグラフにかけ生成物質の検出定量を行なうか、もし
くはその上澄液を必要に応じてさらに熱処理(例えば1
00°Cにて1分間)し夾雑する蛋白を除去してからガ
スクロマトグラフもしくは液体クロマトグラフにかけ生
成物質の検出定量を行なう。検出は次のような条件で行
なわれる。
マトグラフにかけ生成物質の検出定量を行なうか、もし
くはその上澄液を必要に応じてさらに熱処理(例えば1
00°Cにて1分間)し夾雑する蛋白を除去してからガ
スクロマトグラフもしくは液体クロマトグラフにかけ生
成物質の検出定量を行なう。検出は次のような条件で行
なわれる。
■ ガスクロマトグラフ
機種 日立168型ガスクロマトグラフ
検出方法 FID カラムTenax GC(l m )カラム温度
230°C キャリアガス 窒 素 流量 39 m l / m i n■ 液
体クロマトグラフ 機種 Varian モデ/l’ 500
0カラム MCH10 溶離液 水:アセトントリμ= 50 :
50流量 1.Qml/min。
検出方法 FID カラムTenax GC(l m )カラム温度
230°C キャリアガス 窒 素 流量 39 m l / m i n■ 液
体クロマトグラフ 機種 Varian モデ/l’ 500
0カラム MCH10 溶離液 水:アセトントリμ= 50 :
50流量 1.Qml/min。
波長 200nm
例えば、アクリル酸と1・4ブタンジオールとの反応で
生成するヒドロキシブチルアクリV−Fについてはガス
クロマトグラフでは約5分後、液体クロマトグラフでは
約4分後にピークが現われる。
生成するヒドロキシブチルアクリV−Fについてはガス
クロマトグラフでは約5分後、液体クロマトグラフでは
約4分後にピークが現われる。
二価アルコ−μがエチレングリコ−pであればヒドロキ
シブチルアクリレートが生成され、液体クロマトグラフ
では8.2分にピークが見られる。
シブチルアクリレートが生成され、液体クロマトグラフ
では8.2分にピークが見られる。
生成物質の確認は次のようにして行なった。
1、 アクリル酸、二価アルコールおよび酵素の8者が
同時に存在したときだけ、生成物のピークが見られ(液
体クロマトグラフにて)、そのピークが時間とともに増
加する。
同時に存在したときだけ、生成物のピークが見られ(液
体クロマトグラフにて)、そのピークが時間とともに増
加する。
2、 ガスクロマトグラフおよび/もしくは液体クロマ
トグラフによシ既知物質と同じリテンションタイムを示
した。(既知物質は化学合成にて入手した) 3、 GC−Mass(日立製)によるCI法によシ
生成物質が既知物質と同じ分子量であることを確認した
。
トグラフによシ既知物質と同じリテンションタイムを示
した。(既知物質は化学合成にて入手した) 3、 GC−Mass(日立製)によるCI法によシ
生成物質が既知物質と同じ分子量であることを確認した
。
生成されたアクリル酸エステルを採取するには常法の蒸
留もしくは溶剤抽出が用いられる。
留もしくは溶剤抽出が用いられる。
Alcal igenes faecalis TH8
35株のエステル化能を有する酵素の安定性について、
超音波破砕時(海゛上電気■のTA4280振動子42
80S 、2〜4Aにて使用)の酵素の安定性を第1図
に示す。図はソニック処理時間とヒドロキシブチルアク
リレートの生成反応活性との関係を示している。活性は
、1分間にヒドロキシブチルアクリレート1μmol
生成したとき1ユニツトとした。第1図から本閑株TH
886株のエステル化醇素は比較的安定であることがわ
かる。
35株のエステル化能を有する酵素の安定性について、
超音波破砕時(海゛上電気■のTA4280振動子42
80S 、2〜4Aにて使用)の酵素の安定性を第1図
に示す。図はソニック処理時間とヒドロキシブチルアク
リレートの生成反応活性との関係を示している。活性は
、1分間にヒドロキシブチルアクリレート1μmol
生成したとき1ユニツトとした。第1図から本閑株TH
886株のエステル化醇素は比較的安定であることがわ
かる。
反応系組成とそこに用いる各種バッファーを下記のよう
に調整し9水閘株TH886株を用いたヒドロキシブチ
ルアクリレートの生成に及ばずpHの影響を調べた。そ
の結果を第2図に示す。図から酵素活性はp H5〜1
0付近までであることがわが各種バッファー
1m110%アクリル酸 Q、5
m110%1・4ブタンジオ−IV Q、5ml酵
素 A280 = 140 8,9m153
.5 リン酸カリウム 64.1 (Itvl) 7 5.49
7.1 重炭酸一度酸Na 10 8.1(I
M) 11 9.8実施例: 以下に本発明を実施例にょシ具体的に説明する。
に調整し9水閘株TH886株を用いたヒドロキシブチ
ルアクリレートの生成に及ばずpHの影響を調べた。そ
の結果を第2図に示す。図から酵素活性はp H5〜1
0付近までであることがわが各種バッファー
1m110%アクリル酸 Q、5
m110%1・4ブタンジオ−IV Q、5ml酵
素 A280 = 140 8,9m153
.5 リン酸カリウム 64.1 (Itvl) 7 5.49
7.1 重炭酸一度酸Na 10 8.1(I
M) 11 9.8実施例: 以下に本発明を実施例にょシ具体的に説明する。
実施例1
(菌体懸濁液の調製)
肉エキス10g、ポリヘプ) 710g、 NaC15
g 。
g 。
蒸留水III、そしてI)H?、0の組成の肉汁液体培
地100m1を調製した。これを500m1容坂ロフラ
スコに入れ殺菌して後、これにAlcaligenes
faecalisTH8B6株を植菌した。これを8
0”Cにて24時間振とり培養した。この培養液を遠心
分M(IQ oo。
地100m1を調製した。これを500m1容坂ロフラ
スコに入れ殺菌して後、これにAlcaligenes
faecalisTH8B6株を植菌した。これを8
0”Cにて24時間振とり培養した。この培養液を遠心
分M(IQ oo。
rpm、 lQmin、 ) L、沈澱した菌体をpH
7,0のリン酸バッファー0.05Mにて1回洗浄した
。この菌体を同じバッファーにて0D660=10.0
になるように希釈し、これを菌体懸濁液とした。
7,0のリン酸バッファー0.05Mにて1回洗浄した
。この菌体を同じバッファーにて0D660=10.0
になるように希釈し、これを菌体懸濁液とした。
(粗酵素液の調製)
得られた菌体懸濁液を海上電気製超音波破砕機にて氷冷
水で冷却しつつ20分間破砕した。これを遠心分離(1
5,00Orpm 、 80分間)シ、その上澄液を粗
酵素液とした。
水で冷却しつつ20分間破砕した。これを遠心分離(1
5,00Orpm 、 80分間)シ、その上澄液を粗
酵素液とした。
(反応組成)
次の反応組成にて30″Cで反応し、得られた生成物を
ガスクロマトグラフを用いて分析した。
ガスクロマトグラフを用いて分析した。
組成 添加量
リン酸バッファー IM(pH8,0) 9
.2mlアクリル酸 10%水溶液(%)
0.1 mtI・4 ブタンジオ−μ 各種濃度
Q、1ml粗酵素液 A28
0 = 14.0 0.6 m11・4ブタンジオ
−〃の濃度は最終濃度でio、o%(/v) 、 5.
0%(/v)、 8.0%(v/v)、 1.0%(/
v) 、 0.5%(/v)とした。
.2mlアクリル酸 10%水溶液(%)
0.1 mtI・4 ブタンジオ−μ 各種濃度
Q、1ml粗酵素液 A28
0 = 14.0 0.6 m11・4ブタンジオ
−〃の濃度は最終濃度でio、o%(/v) 、 5.
0%(/v)、 8.0%(v/v)、 1.0%(/
v) 、 0.5%(/v)とした。
(結果)
l・4 ブタンジオール濃度のエステμ生成におよぼす
影響を調べた。その結果を第3図に示す。
影響を調べた。その結果を第3図に示す。
エステル生成量は対アクリル酸収率(モル%)で表示さ
れる。1・4ブタンジオ−Iv量が多くなるにつれ生成
するヒドロキシグチルアクリレートの量も多くなること
がわかる。まだ、アクリル酸10%(最終濃度)と1・
4グタンジオ一ρ1o% (最終濃度)との(l:1の
)反応でもジアクリレートの生成は生成アクリル酸エス
テルの1%以下であった。しかし、アクリル酸と二価ア
ルコールとの比が1=2以上になるとジアクリレートは
まったく生成しなかった。化学合成においてはアクリル
酸と二価アルコールとを1=1で反応させると。
れる。1・4ブタンジオ−Iv量が多くなるにつれ生成
するヒドロキシグチルアクリレートの量も多くなること
がわかる。まだ、アクリル酸10%(最終濃度)と1・
4グタンジオ一ρ1o% (最終濃度)との(l:1の
)反応でもジアクリレートの生成は生成アクリル酸エス
テルの1%以下であった。しかし、アクリル酸と二価ア
ルコールとの比が1=2以上になるとジアクリレートは
まったく生成しなかった。化学合成においてはアクリル
酸と二価アルコールとを1=1で反応させると。
生成したアクリル酸エステルに対し5〜15%のジアク
リレートが生成する。ジアクリレートは重合時の反応系
をゲル化させるため、それが生成しないようにすること
が必要である。化学合成ではそれは極めてむつかしい。
リレートが生成する。ジアクリレートは重合時の反応系
をゲル化させるため、それが生成しないようにすること
が必要である。化学合成ではそれは極めてむつかしい。
それゆえ1重合時の仕 ゛込み濃度を低くおさえね
ばならないという欠点があった。本発明のエステル反応
においてはジアクリレートの生成は微量もしくは皆無で
あるため。
ばならないという欠点があった。本発明のエステル反応
においてはジアクリレートの生成は微量もしくは皆無で
あるため。
このような問題はない。
実施例2
実施例1で示した培地にて同様にAlcal igen
esfaecal ia T H895株とAlca
ligenes faecalis TK4985株を
それぞれ培養した。得た各菌体を0D660 m10.
0になるように0.05Mのリン酸バッファー(pH7
,0)にて、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を
実施例1と同様に処理して粗酵素液を調製した。この菌
体懸濁液もしくは市販の酵素液を用いて次の反応組成に
て30°Cで2時間反応を行った。市販のリパーゼとし
ては、 Aspergillusに属する糸状菌から生
産されたリパーゼ(リパーゼAP:天野製薬■ンおよび
Mucor に属する糸状菌から生産されたリパーゼ
(リパーゼM−AP;天野製楽■)を出いた。
esfaecal ia T H895株とAlca
ligenes faecalis TK4985株を
それぞれ培養した。得た各菌体を0D660 m10.
0になるように0.05Mのリン酸バッファー(pH7
,0)にて、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を
実施例1と同様に処理して粗酵素液を調製した。この菌
体懸濁液もしくは市販の酵素液を用いて次の反応組成に
て30°Cで2時間反応を行った。市販のリパーゼとし
ては、 Aspergillusに属する糸状菌から生
産されたリパーゼ(リパーゼAP:天野製薬■ンおよび
Mucor に属する糸状菌から生産されたリパーゼ
(リパーゼM−AP;天野製楽■)を出いた。
以下余白
リン酸パyフy−IM(pi−18,0)
0.2mlアクリル酸 io%水溶液(”
l’v) 0.1mlエチレングリコ−)V
またはl・4ブタンジオールまたは1・6ヘキサンジオ
一/’100% Q、1ml閑体懸濁液または
粗酵素溶液 9.6ml市販リパー
ゼの酵素溶液濃度は3 m g 7m 1であった。1
・6 ヘキサンジオールの使用景は0.1gであった。
0.2mlアクリル酸 io%水溶液(”
l’v) 0.1mlエチレングリコ−)V
またはl・4ブタンジオールまたは1・6ヘキサンジオ
一/’100% Q、1ml閑体懸濁液または
粗酵素溶液 9.6ml市販リパー
ゼの酵素溶液濃度は3 m g 7m 1であった。1
・6 ヘキサンジオールの使用景は0.1gであった。
この場合には反応系の固形濃度を調整する意味で水Q、
1mlを糸にさらに添加した。生成物質を液体クロマト
グラフもしくはガスクロマトグラフで確脈した。いずれ
の反応系においてもジアクリレート生成は検出されなか
った。結果を第6表に示す。
1mlを糸にさらに添加した。生成物質を液体クロマト
グラフもしくはガスクロマトグラフで確脈した。いずれ
の反応系においてもジアクリレート生成は検出されなか
った。結果を第6表に示す。
以下余白
第 6 表
実施例8
実施例1と同様にして得たrtt636株および’rK
49B5株ノ培fff+7i体ヲi4心+[m、 0.
05M (p117.0)のリン酸バッファーにて0
0660が10.0の菌体懸濁液を調製した。この菌体
懸濁液に8倍斌のアセトン(−20’C)を加え、10
分間攪拌した後遠心分瀧(1α000rpm、 10分
)した。沈澱した菌体をさらにアセトンにて2回洗浄し
た。これを吸引式デシケータ中にて完全に乾燥し、アセ
トンドライ菌体を得た。この菌体を用いて反応を行なっ
た。
49B5株ノ培fff+7i体ヲi4心+[m、 0.
05M (p117.0)のリン酸バッファーにて0
0660が10.0の菌体懸濁液を調製した。この菌体
懸濁液に8倍斌のアセトン(−20’C)を加え、10
分間攪拌した後遠心分瀧(1α000rpm、 10分
)した。沈澱した菌体をさらにアセトンにて2回洗浄し
た。これを吸引式デシケータ中にて完全に乾燥し、アセ
トンドライ菌体を得た。この菌体を用いて反応を行なっ
た。
反応組成 添加量
リン酸バッフy−IM(pH8,0) 0
.2mlアクリル酸 10%水溶液(y/v)
0.1 m 11・4ブタンジオ−/L’1
00% Q、 l m 1水
Q、5ml
アセトンドライ菌体 20
mg反応は80°Cにて2時間行なった。その結果。
.2mlアクリル酸 10%水溶液(y/v)
0.1 m 11・4ブタンジオ−/L’1
00% Q、 l m 1水
Q、5ml
アセトンドライ菌体 20
mg反応は80°Cにて2時間行なった。その結果。
対アクリル酸収率(モp%)はTH8B6株では4.2
%、そしてTK49B5株では4,5%であった。
%、そしてTK49B5株では4,5%であった。
実施例4
実施例1と同様にして得たTH886株の粗酵素液を第
7表に示したように常法に従って精製し。
7表に示したように常法に従って精製し。
比活性が40倍になった訃ケ精製酵素を得た。
以下余白
この活性は、アクリル酸と1・4ブタンジオールとの反
応におけるヒドロキシブチルアクリレートの生成によっ
て評価された。
応におけるヒドロキシブチルアクリレートの生成によっ
て評価された。
次にこの伸勿精製酵素をセファロース4BにCNBr活
性化法(RoAxen、Nature、 214. 1
802(1967))で固定化した。得られた固定化酵
素を内径12fl長さ80cIMのカラムに詰め、上部
から下記の組成の反応液をlOa*/1時間の流速で流
した。
性化法(RoAxen、Nature、 214. 1
802(1967))で固定化した。得られた固定化酵
素を内径12fl長さ80cIMのカラムに詰め、上部
から下記の組成の反応液をlOa*/1時間の流速で流
した。
その結果、対アクリル酸当シ1七ρ%の収率でヒドロキ
シブチルアクリレートが生成された。
シブチルアクリレートが生成された。
反応液組成 添加量リン酸
バツyy−LM(PH8,0) 100m1アク
リル酸 10%水溶液(/v) 50
m 11・4グタンジオ一/L/100%
50m1水
800m1実施例5 実施例1と同様にして得たTH886株およびTK49
B5株の菌体懸濁液および粗酵素液をそれぞれ用い1次
の反応系のもとてジアクリレートの加水分解能を調べた
。
バツyy−LM(PH8,0) 100m1アク
リル酸 10%水溶液(/v) 50
m 11・4グタンジオ一/L/100%
50m1水
800m1実施例5 実施例1と同様にして得たTH886株およびTK49
B5株の菌体懸濁液および粗酵素液をそれぞれ用い1次
の反応系のもとてジアクリレートの加水分解能を調べた
。
反応組成 添加量リン酸パ”/
77− IM(pI(8,Q ) Q
、2m lジヒドロキシアクリレート 0.2%
Q、2ml菌体懸澗液 0D6
60= 10.0 0.6m lもしくは粗酵素液
OD280=11M) (0,6m1)上
記反応系を30°Cにインキュベートするとジヒドロシ
キアクリレートは5〜10時間のうちに消失し、それに
対応するアクリル酸エステルとアクリル酸とが生成した
。
77− IM(pI(8,Q ) Q
、2m lジヒドロキシアクリレート 0.2%
Q、2ml菌体懸澗液 0D6
60= 10.0 0.6m lもしくは粗酵素液
OD280=11M) (0,6m1)上
記反応系を30°Cにインキュベートするとジヒドロシ
キアクリレートは5〜10時間のうちに消失し、それに
対応するアクリル酸エステルとアクリル酸とが生成した
。
発明の効果:
本発明の新菌株Alcajignes faecali
s ’rH83G オヨびTK4985はアクリル酸と
二価アルコールとから水酸基を有するアクリル酸エヌテ
pを生産する能力を有する。この菌株を用いることによ
シアクリμ酸と二価アルコールとを含有する反応系から
水酸基を有するアクリル酸エヌテ〜を製造することがで
きる。エステル化に必要な酵素は、培地の種類に無関係
に、菌体増殖に比例して生産される。
s ’rH83G オヨびTK4985はアクリル酸と
二価アルコールとから水酸基を有するアクリル酸エヌテ
pを生産する能力を有する。この菌株を用いることによ
シアクリμ酸と二価アルコールとを含有する反応系から
水酸基を有するアクリル酸エヌテ〜を製造することがで
きる。エステル化に必要な酵素は、培地の種類に無関係
に、菌体増殖に比例して生産される。
このエステル生成物は工業材料となシうる重合体原料と
して有用である。この生成物を他の既知単量体と共重合
して得られる高分子は粘着剤、接着剤、フイリムなどと
して用いられうる。しかも。
して有用である。この生成物を他の既知単量体と共重合
して得られる高分子は粘着剤、接着剤、フイリムなどと
して用いられうる。しかも。
この生成物は水酸基を有するため、親水性をもちしかも
官能基としても作用するので、他の多くの用途に利用さ
れうる。
官能基としても作用するので、他の多くの用途に利用さ
れうる。
さらに2水閘株を用いたエステル反応においてジアクリ
レートがほとんど生成されない。ジアクリレートが系内
に生成されなければ1重合反応中にゲル化が起こらず、
したがってエステル反応出発物質の高濃度仕込みが可能
となる。その結果。
レートがほとんど生成されない。ジアクリレートが系内
に生成されなければ1重合反応中にゲル化が起こらず、
したがってエステル反応出発物質の高濃度仕込みが可能
となる。その結果。
新規な特徴をもつ高分子を得ることも可能である。
微量ながらジアクリレートが系内に生成されても。
本菌株はいずれもこれに対応するアクI))し酸エステ
ルとアクリル酸とに加水分解する能力を有するという利
点がある。
ルとアクリル酸とに加水分解する能力を有するという利
点がある。
第1図は本発明の菌株Alcaligenes fae
calis TH886のエステル化酵素の安定性を示
す図2第2図は同じ<TH836株のエステル化酵素の
pHによる影響を示す図、第3図は同じ(TH836株
のエステル生成能の1・ 4グタンジオ一ル濃度による
影響を示す図である。 以 上 代理人 弁理士 山 本 秀 策 第1図 に Φ J 第2図 健 H
calis TH886のエステル化酵素の安定性を示
す図2第2図は同じ<TH836株のエステル化酵素の
pHによる影響を示す図、第3図は同じ(TH836株
のエステル生成能の1・ 4グタンジオ一ル濃度による
影響を示す図である。 以 上 代理人 弁理士 山 本 秀 策 第1図 に Φ J 第2図 健 H
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、7μカリゲネス属に属し、アクリル酸と一般式HO
ROH(ただし、Rは次素数2〜6の直鎖のアルキレン
基)で表わされる二価アルコールとからアクリμ酸エス
テμを生産する菌。 2、 前記アルカリゲネス属菌が7μカリゲネス・フエ
ーカリスである特許請求の範囲第1項に記載の菌。 8、 前記アルカリゲネス争フェーカリスカ7〃カリゲ
ネス・フエーカリスTH8B6株およびアルカリゲネス
・フエーカリ7.TK4985株のうちの少なくとも一
方である前記特許請求の範囲第2項に記載の菌。 4、 アルカリ土類金属に属する菌にょシ、アクリ〜酸
と一般式HOROH(ただし、Rは次素数2〜6の直鎖
のアルキレン基)で表わされる二価アルコールとからア
クリル酸エステルを生産する。 微生物によるアクリル酸エステルの製法。 5、前記アルカリゲネス属菌がアルカリゲネス・フエー
カリスである特許請求の範囲第4項に記載の製法。 6、 前記アルカリゲネス・フエーカリスがアルカリゲ
ネス・フエーカリスTH886株およびアルカリゲネス
・フェカリスTK49B5株のうちの少なくとも一方で
ある前記特許請求の範囲第5項に記載の製法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9525083A JPS59220196A (ja) | 1983-05-30 | 1983-05-30 | アクリル酸エステル生産菌 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9525083A JPS59220196A (ja) | 1983-05-30 | 1983-05-30 | アクリル酸エステル生産菌 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7303885A Division JPS60227689A (ja) | 1985-04-05 | 1985-04-05 | アクリル酸エステル生産菌によるアクリル酸エステルの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59220196A true JPS59220196A (ja) | 1984-12-11 |
JPS6329996B2 JPS6329996B2 (ja) | 1988-06-16 |
Family
ID=14132506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9525083A Granted JPS59220196A (ja) | 1983-05-30 | 1983-05-30 | アクリル酸エステル生産菌 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59220196A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0999229A1 (de) * | 1998-11-03 | 2000-05-10 | Goldschmidt AG | Verfahren zur Herstellung von Acrylsäuereestern und/oder Methacrylsäureestern von Polyoxyalkylenen und deren Verwendung |
WO2004048585A2 (de) | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Basf Aktiengesellschaft | Enzymatische synthese von polyolacrylaten |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5895249A (ja) * | 1981-12-02 | 1983-06-06 | Ushio Inc | 螢光分析装置 |
-
1983
- 1983-05-30 JP JP9525083A patent/JPS59220196A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5895249A (ja) * | 1981-12-02 | 1983-06-06 | Ushio Inc | 螢光分析装置 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0999229A1 (de) * | 1998-11-03 | 2000-05-10 | Goldschmidt AG | Verfahren zur Herstellung von Acrylsäuereestern und/oder Methacrylsäureestern von Polyoxyalkylenen und deren Verwendung |
WO2004048585A2 (de) | 2002-11-22 | 2004-06-10 | Basf Aktiengesellschaft | Enzymatische synthese von polyolacrylaten |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6329996B2 (ja) | 1988-06-16 |
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