JPS59220184A - 新規アルカリゲネス・フエ−カリス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野： 本発明は新規な微生物アルカリゲネス・７エーカリｘ　
（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）に関す
る。

従来技術： 従来から知られてイルＡＩｃａ目ｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃ
ａｌｉｓは。

１グラム陰性であシ運動性を有し０分裂によシ増殖する
好気性の短桿菌であり光合成によっては増殖せずガス状
窒素を固定しない」などのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属と
しての一般的性質の他に、単一炭素源・エネルギー源と
してプロピオン酸や酪酸を資化するという顛独特の性質
を有することが「Ｂｅｒｇｅ３’ｓＭａｎｕａｌ　ｏｒ
　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ　、　Ｂｔｈｅｄｉｔｏｒ、　　１９７４　Ｊなど
の細菌分類書にも示されている。

本発明の目的は、新規なＡｌｃａｌｉｇｅｔｉｅｓ　ｆ
ａｅｃａｌｉｓを提供することにある。本発明の他の目
的は、工業的に極めて有用な新規なＡｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓを提供することにある。

本発明の新規Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉ
ｓ　　は１０ピオン酸および酪酸の黄化性能を欠き、そ
のことによシ上記目的が達成される。本発明の新規微生
物は、化学工業原料を扱っている工場などの土壌（茨木
市、豊橋市）から分離・採集されたもので。

よシ具体的にはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌ
ｉｓ　ＴＨ８３６株（受託番号：微工研菌寄第７０８３
号（ＦＥＲＭＰ−７０８３））およびＡｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　ＴＫ４９３５株（受託番号
：微工研菌寄第７０８４号（ＦＥＲＭＰ−７０８４））
である。この新菌株は、後述する菌学的性状をもとにｔ
ｉ”　Ｂ’ｅｒｇｅｙ′ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＤｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
Ｂｔｈ　ｅｄｋｔｏｒ、１９７４　Ｊの細菌分類書を参
考にして同定された。

菌学的性質 本発明ノＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　
ＴＨ８３６株とＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｏｃａｌ
ｉｓ　ＴＫ４９３５株の菌学的性質を第１表に示す。

以下余白 １１１１１１１１１１１ １１１１１１１１１１１ □−ト１訃−−□□−雫□□−−―訃−→丙株の同定 次に本発明の菌株をＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属に属する
菌株であると同定した根拠を以下に示す。

本菌株Ｔｌ１８３６株およびＴＫ４９３５株はいづれも
上記試験結果よシ「ダラム陰性であり１分裂により増殖
する好気性細菌であり光合成によっては増殖しない」と
いう特徴を有する。このような細菌は、　Ｂｅｒｇｅｙ
’ｓ　Ｍａｎｕａ　ｌによれば第７部に分類されている
。ここに属する科および属は次のようになる。

１、Ｐｓｅｕｄｏ＋ｎｏｎａｄａｃｅａｏ科２、Ａｚｏ
ｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科３、Ｒｈ１ｚｏｂｉａｃ
ｅａｅ科 ４、　　Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科５．１
（ａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科６、Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ　＋１ ７、　　Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属 ８、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属 ９、　　ｎｏｒｄｅｌ；ｅｌｌａ　１ｇ１０、Ｆｒａｎ
ｃｉｓｅｌｌａ属 Ｕ乃 １１１Ｉ　Ｔｈｅｒｍｕｓ　属 これら１１の科と屑の性状と１本閑抹ＴＨＩＩＩ！３６
株およびＴＫ４９３５株の性状とを以下に比較する。

本菌株はいづれもＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属を除＜１０
の科・＋７１とは第２表に示すΩｊ学的訃質において全
く異なる。

以下余白 笛　　　　２　　　　表 他方１車間株（・Ｊ、いずれも、第３表に示すように。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｓ属と多くの点で性質が共通ずる
。

第　　３　　表 ２　グラム陰性 ３　醗酵的でない ４　運動性有、鞭毛（１〜８本） ５　大きさ　０．５−１．２　ｐｍ　ＩＩＪ　０．５−
２，６１１ｍ６　通常単独で仔在 ７　色素を作らない ８　オキシグーセ二陽性 ９　寒天を分解しない １０　　カゼイン・セフチンを分解しない１１　　生付
の適温２０〜３７°Ｃ １２ＰＨ７，０ですばやく生首する 以上の結果から２本発明の菌株ＴＨ８３６株およびＴＫ
４９３５株はＡｌｃａｌｉｇｅｎａｓ　ｌｊ４に１＾す
る＠ｕｉであると同定される。仄に９本発明の菌株の柚
を決定・するためにこの属の既知の４種と比較した結果
を第４表に示す。

第　　４　　表 種名　　　性質　　　　　　・ＴＫ４９３５との比較 １、Ａ、ｆａｅａａｌｉｓ 単一炭素源・エネルギー源として次の化合物を資化する ａｃｅｔａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　±
ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　
−ｂｕ＄ｙｒａｔｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
　−ａｓｐａｒ＊１ｃａｃｉｄ　十 ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　＋ｈ
ｉｓｔｉｄｉｎｅ　　　　　　　　　　　　　　＋ｇｌ
ｕｔａｔｈｉｏｎｅ　＋ 炭水化物を利用しない　　　　　　　　　　　　　　同
じ２、Ａ＋ａｑｕａｍａｒｉｎｕｓ グルコース、フラクトース、マｖドース。

他の炭水化物を酸化する　　　　　　　　　　　　酸化
しないデン７゛ンを加水分解する　　　　　　　　　　
　　　加水外界しないアンモニウム塩と硝酸塩を利用し
ない　　　　　　利用する３、Ａ、ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ グルコース、フラクトース、テストステロンフェノール
、ベンゾエートを利用できる　　　　　利用できない本
発明の菌株は、いづれもＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａ
ｅｃａｌｉｓとは、プロピオン酸と醋酸の質化性能を欠
く点が異なるにすぎず、他の特徴はすべてこれと一致す
る。よって２本菌株をＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅ
ｃａｌｉｓ　　にきわめて近緑の菌株であＩ）　Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓと同定した。

培養条件 培地としては格別である必要はなく、肉エキス。

酵母エキス、麦芽エキス、ペフ“トンなどの有機栄養源
、およびリン酸、マグネシウム、ナトリウム。

カリウム、マンガン、鉄などの無機栄養源等を適宜含有
する通常の培地でよい。

炭素源としては、炭ｇ源貸化性試験において基質となっ
た各種アミノ酸、ＴＣＡ＋ｊイクルメンバーの有機酸な
どが用いられる。窒紮源としては。

機窒素やアミ７基の有機屋紮などが用いられる。

培養温度は２０°Ｃ〜３５°Ｃ好ましくは２５８Ｃ〜３
０゜Ｃである。培養ｐＨは５〜８好ましくは６．５〜７
．５であり、１日〜３日間好気的に攪拌又は振盪しなが
ら培養を行なう。

用　　途 本発明の新規法Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌ
ｉ８　ＴＨ８３６株およびＴＫ４９３５株の用途の一例
を挙げれば、これら菌株はいずれも、アクリル酸と一般
式ＲＯＨ（ただし、Ｒは炭素数１〜８の直鎖のアルキル
基）で表わされるアルコールおよびアクリル酸と一般式
ＨＯＲＯＨ（ただしＲは炭素数２〜６の直鎖のアルキレ
ン基）で表わされる二価アルコールからアクリル酸ニス
７−／Ｌ／を生産しうる。

アクリル酸エステルは、ビニル基をｎするため。

種々の工業材料となシ得る重合体原料として極めて有用
である。例えば、このアクリル酸ニス７−／Ｉ／を他の
単量体と共重合して得られる高分子は、粘着剤、接着剤
、およびフィルムなどとして用いられる。きらに、また
、このアクリル酸エステルが水酸基を有する場合（上記
ＨＯＲＯＨを用いたとき）には、親水性を持ち官能基と
しても作用するため、それによυ得られる重自体は易架
橋性ポリマーとなシ、接着剤、塗料、その他の多くの用
途を有しかつ新規な用途開発も期待される。このような
アクリル酸エステルの合成は、化学合成によシ可能では
ある。しかし、化学合成によると９反応条件が過酷であ
るため、そのだめの付帯設備とスペースと費用がかさむ
。しかも作業環境が汚染されやすく環境公害の原因にも
なる。このエステル合成を微生物を用いた生物学的反応
により行うと。

低温・低圧という温和な条件下で反応できしかも基質特
異性を有するだめ、環境汚染のおそれがないうえに設＠
背なども安くつく。

本発明の新規アルカリゲネス・フエーカリスは。

既述のように、アクリル酸と一般式ＲＯＨ（ただし。

Ｒは炭素数１〜８の直鎮のアルキル基）で表わされるア
ルコ−μとからアクリル酸エステルを生産する。アルカ
リゲネス・７エーカリスはアルカリゲネス・７工−カリ
スＴＨ８３６株およびアルカリゲネス・フエーカリスＴ
Ｋ４９３５体のうちの少なくとも一方である。ア！レコ
ールとしては炭素数１〜８の直鎮状アルコールであり、
それはメチルアルコール、エチルアルコール、プロピル
アルコール。

フチルアルコール、ペンチルアルコール、ヘキシルアル
コール、ヘプチルアルコールおよびオクチルアルコール
である。本発明によシ生産されるアクリル酸エステルは
原料として用いるアＩレコールにより規定され、上記各
アルコールに対応して。

アクリル酸メチル、アクリル酸ブチル、アクリル酸プロ
ピル、アクリル酸ブチル、アクリμ酸ヘンチル、アクリ
ル酸ヘキシル、アクリ／Ｉ／酸へブチルおよびアクリル
酸オクチルが生産される。

本発明におけるエステル反応は、既述の培養条件のもと
て本発明菌株を培養しその休止菌体、菌体抽出液（粗酵
素液）、精製酵素、固定化菌体および固定化酵素状態の
うちの少なくとも一つを適当に選Ａ、で用いる。本発明
のアクリル酸エステルの合成に必要な反応系の基本組成
は第５表に示される。なお２合成に当って、媒体として
は水媒体で行なうのが一般的である。

第５表 リン酸パンファー（ＰＨ８，０）　　　　　０．２Ｍア
クリル酸　　　　　　　　　　　　１％（ｖ／ｖ　）各
種アルコール　　　　　　　　　１％ＣＶＡυ水 菌体および抽出液の添加量は、固体懸濁液として最終１
ＪｔＪ１．が６６　Ｑ　ｎｍの吸光度（０Ｄ６６０　）
で０．１以上９通常は１．０〜２０　　の範囲にある。

菌体抽出液は、菌体を超音波破砕機やフレンチプレスで
処理して得られ、２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）が０
．１以上２通常は０．５〜２０．０　　の範囲で用いら
れる。

反応ｐＨは５〜９の範囲にあればよい。好ましくは６〜
８の範囲に調整される。

酸成分はアクリル酸である。メタクリル酸は使用できな
い。アクリル酸の便用可１ｊピな濃度は、最終濃度が０
．１％（■／ｖ）〜５％（Ｖ／Ｖ）−ｔ’あり、好まし
くは０．５％（ｖ／ｖ）〜２％（Ｖ／Ｖ）ノ範囲に選ば
れる。アクリル酸の使用によシ反応系組成のＩ）Ｈが低
下しアクｌ）　ｗ酸の消°ａと共にｐＨが上昇する。

このようなｐＨ変動を極小にし反応系のｐＨが常時７前
後になるようにするために本基本組成ではパンファーと
して０．２Ｍのリン１竣パンフアーが用いられる。リン
酸パン７アーに代えて重炭酸−炭酸Ｎａバッファー、ト
リス塩酸バッファーなどを用いることもできる。パン７
ア一濃度も０．２Ｍに限定されるこ七はなく、使用され
るアクリル酸量や反応速度などに応じて適宜選択される
。

アルコール（ＲＯＨ）の使用量は、アクリル１峻１モル
当シ１通常、　０．１〜１０モル程度とされるが。

過剰モ／ｌ／量使用するのが好ましく、アクリル酸１モ
ル当９，１〜５モル使用するのが望ましい。しかし、ア
ルコールをあまシ多く使用すると酵素失活のおそれがあ
るので１通常、最終濃度で０４％（Ｖ／Ｖ　）〜１０％
（Ｖ／Ｖ　）　、好ましくは０．５％（Ｖ／Ｖ　）〜反
応温度は通常２０°Ｃ〜４０’Ｃの範囲内でろｉシば良
い。好ましくは２５°Ｃ〜３５°Ｃである。

反応時間は基質添加量により幾分穴なるが約１０分以上
であれば生成物の検出が可能である。

反応は均−系で行うことが好゛ましい。アルコールがブ
クノールの場合にはその（吏用量が多くなると水と１ざ
Ｄ　ｌ／Ｃ＜　くなるため、撹拌して系を均一ンｉエマ
ルジョンとすることが好ましい。炭素数が５以上のア／
Ｉ／コールについても同様な理由から（ｊｆｆｉ拌など
の手段によシ均−系にすることが好ましい。

一般的に２反応終了後は系から１体を遠心分離によシ除
く。その上澄液を直接ガスクロマドグラスあるいは液体
クロマトグラフにかけ生成物質の検出定量を行なうか、
もしくはその上澄液を必要に応じてさらに熱処理（例え
ば１００’、Ｃにて１分間）を行い夾雑する蛋白を除去
してからガスクロマトグラフもしくは液体クロマトグラ
フにかけ生成物質の検出定量を行なう。

生成物質の確認は仄のようにして行なつ／ζ。

１、　アクリル酸、アルコールおよびＮＩＡの３者が同
時に存在したときだけ、生成物のピークが見られ（ン戊
体クロマトグラフにて）、そのピークが時間とともに増
加する。

２、　ガスクロマトグラフおよび／もしくはｉｒＮ体ク
ロマトグラフによシ既知物質と同じリテンションタイム
を示した。（既知物質は化学合成にて入手した） ３、　　ＧＣ−Ｍａｓｓ　（日立製）によるＣＩ法にょ
シ生成物質が既知物質と同じ分子量であることを確認し
た。

生成されたアクリル酸ニス７−Ａ／を採取するには常法
の蒸留あるいは溶剤抽出が用いられる。

アクリル酸と０Ｈ−Ｒ−ＯＨの反応 本発明の新規アルカリゲネス・７エーカリスは。

既述のように、アクリ／ｌ／酸と一般弐ＨＯＲＯＨ（た
だし、Ｒは炭素数２〜６の直鎖のアルキレン基）で表わ
される二価アルコールとから水酸基を有するアクリル酸
エステルを生匹する。

これを反応式で表わすと。

Ｃ０ＯＨＣｏ・０ＲＯＨ の反応が行われる。

アルカリゲネス・７エーカリスはアルカリゲネス・フエ
ーカリスＴ８８３６株υよびアルカリゲネス・フエーカ
リスＴＫ４９３５株のうちの少なくとも一方である。二
価アルコールとしては両末端に水り試基を・「１する炭
素数２〜６のｕ￥＜　、’ｉ；Ｍ状アルコールでアシ、
それはエチレン″グリコール、ｌ・３ジヒドロキシフ”
ロバ〉、ｌ・４ジヒドロキジグタン、１・５ジヒドロキ
シペンクンおよび１＃６ジヒドロキシヘキプシである。

本発明に？けるエステル反応は、既述のＪＦｆ銚条目−
のもとて本発明ｊ″Ａ株を１．舌、ｉ」シその休止１体
、（！１体抽出液（粗Ｍ素液）、清ｉ！Ａ酵累、固定化
閑雌およびｋａｌ定化酵巣状態のうちの少なくとも一つ
をス！肩当に迫Ａで用いる。本発明の水１β＾〜を有す
るアクリルｉ貢エステルの合成に必ｚ１１反応系の基本
７岨成は第６表に示される。なお、この合成に当って媒
体を用いる場合には水媒体とするのが一般的である０ 第６表 組　成　　　　　　　最終濃度 り〉・酸バッファー（１）Ｈ８，０）　　　　０．２　
Ｍアクリル酸　　　　　　　　　　　　１％（Ｖ／Ｖ　
）ジヒドロキシアルコール　　　　　１０％（Ｖ／Ｖ　
）水 菌体もしくは菌体抽出液 菌体および抽出液のンへ加量は、菌体懸濁液として最終
濃度が６６０　ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０）で０．１以
上２通′ｉシは１．０〜２０の範囲にある。自体抽出液
は、菌体を超音波破砕軸やフレンチプレスで処理して得
られｐ２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）が０．１以上１
通常は０．５〜２０．０の範囲で用いられる。

反応ｐＨは５〜りの範囲にあればよい。好ましくは６．
５〜７．５である。

アクリルｒＩ！２の使用可能な濃度は、０．１％（Ｖ／
Ｖ　）〜５％（Ｖ／Ｖ）　ｆあシ、好マシくは０．５％
（Ｖ／Ｖ）〜２％（Ｖ／Ｖ）の範囲に選ばれる。アクリ
ル酸の使用によシ反応系組成のｐＨが低下しアクリルｉ
浚の消費と共にｐＨが上昇する。このようなｐＨ変動を
極小にし反応系のｐＨが％　ｎｌ　７前後になるように
するために本基本組成ではパンファーきして０．２Ｍの
リン潴パンファーが用いられる。リン゛故ハンフア−に
代えて重灰酸−炭酸Ｎａパンファー、トリス塩酸パンフ
ァーなどを用いることもできる。バッファー濃度も０．
２Ｍに限定さ不むることはなく。

使用されるアクリル酸遣や反応速度などに応じて適宜選
択される。

前記二価アルコールは、酵素の安定化に悪影響を与える
ことがないだめｊＬ的なｔｌｒｌ限は特にない。

しかし、アクリル酸１モル当り、少なくとも０．５モル
の二価アルコールが用いられる。上記アルコールの使用
量の上限は前記のようにいくら多くてヨイが９通常０．
５％（■／ｖ）〜１０％（’Ｖ／Ｖ　）で用いられる。

モル比ではアクリル酸１モル当シ通常０．５〜５０モル
、好寸しくは１〜２０モルの二価アル’：Ｉ−Ｎ　カ用
イラれる。ジヒドロキシアルコールの添力旧ｄに応じて
生成する水酸基を有するアクリル酸エステルの量も多く
なる。反応温度は２００Ｃ〜４０°Ｃの範囲内であれば
良い。好ましくは２５°Ｃ〜３５°Ｃである。反応時間
は基質添加量によシ幾分異なるが約１０分以上であれば
検出可能である。

反応終了後の系から菌体を遠心分離によシ除く。

その上澄液を直接ガスクロマトグラフあるいは液体クロ
マトグラフにかけ生成物質の検出定量を行なうか、もし
くはその上澄液を必要に応じてさらに熱処理（例えば１
００’　Ｃにて１分間）し夾雑する蛋白を除去してから
ガスクロマトグラフもしくは液体クロマトグラフにかけ
生成物質の検出定量を行なう。検出は次のような条件で
行なわれる。

（Ｏガスクロマトグラフ 機　ｆｊＴｌ　　　　　　　日立１６３型ガスクロマト
グラフ検出方法　　　ＦＩＤ カラム　　　　７ｅｎａｚ　ＧＣ（１ｍ）カラム温度　
　２３０’Ｃ キャリアガス　　窒素 流ｆｆｉ　　　３０　ｍｌ！／ｍｉｎ。

■　液体クロマトグラス 機　種　　　　　ｙａｒｉａｎモデルｓｏｏ。

カラム　　　　ＭＣＨ１０ 溶＃ＩＩｌ　　　　　　　　水：アセトントリル−５０
：　　５０流量　　１．０　ｍｌ／ｍｉｎ。

波長　　２００ｎｍ 例えば、アクリル酸とｌ・４ブタンジオールとの反応で
生成するヒドロキシブチルアクリレートについてはガス
クロマトグラフでは約５分後、液体クロマトグラフでは
約４分後にピークが現われる。

二価アルコールがエチレングリコールであればヒドロキ
シエチルアクリレートが生成され、液体クロマトグラフ
では３．２分にピークが見られる。

生成物質の確認は次のようにして行なった。

１、　アクリル酸、二価アルコールおよヒ酵素の３者が
同時に存在したときだけ、生成物のピークが見られ（２
体クロマトグラフにて）、そのピークが時間とともに増
加する。

２、　カスクロマトグラフおよび／もしくは液体クロマ
トグラフによりｉ（も知物質と同じリテンションタイム
を示した。（既知物質は化学合成にて入手した） ３、ＧＣ−Ｍａｓｓ　　（日立製）によるＣＩ法により
生成ワ質が既知物質と同じ分子量であることを確認した
。

生成されたアクリル酸エステルを採取するには常法の蒸
留もしくは溶剤抽出が用いられる。

Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｏｃａｌｉｓ　ＴＨ８３
６株のエステル化能を有する酵素の安定性について、超
音波破砕時（海上電気（株）のＴＡ４２８０振動子４２
８０Ｓ、ｉ２〜４Ａにて使用）の酵素の安定性を第１図
に示す。

図ハソニック処理１侍間とヒドロキシブチルアクリレー
トの生成反応活性との開係を示している。活ｔｘは、を
分間にヒドロキシブチルアクリレ−１−ヲ１μｍ０７？
　　生成したとき１ユニツトとした。第１図から車間株
ＴＨ８３６株のエステル化酵素は比較的安定であること
がわかる。

りるｐＨ 反応系組成とそこに用いる各イノロバソファ−を下記の
ようにａｉ、・Ｊ　整し９車重株ＴＨ８３６抹を用いた
ヒドロキシグチルアクリレートの生成に及ぼすｐＨの影
響を調べた。その結果を雨２図に示す。図から酵素活性
はＰ　Ｈ５〜ｌＯ付近捷でであることがわ反応組成 各種パン７アー　　　　　１ｒＥ１１ １Ｏ％アクリル酸　　　　　０．５　ｔｎｌｌＯ％１−
４ブタンジオール　　０．５ｍｌ！酵素Ａ２８０＝１４
．０　　３，０ｍｌ以下・Ｊζ臼 緩砺波 ５　　　　　　　３．５ リン酸カリウム　　　　６　　　　　　　４．１（ＬＭ
）　　　　　　　７　　　　　　　　５．４８　　　　
　　　６．３ ９　　　　　　　７．１ 屯炭酸−炭１２ｉ２Ｎａ　　　１０　　　　　　　８，
１（ＩＭ）　　　　　　１１　　　　　　　　９．３実
施例 仄に実施例を例示して本発明を具体的に説明する。

実施例１ （菌体懸濁液の調製） 丙エキスｌＯｇ、ポリペ７”）：／１０　ｇ　、　Ｎａ
Ｃ１５ｇ、蒸留水ＩＩ！、そして１）Ｈ７，Ｑの組成の
肉汁液体培地１００ｍ１を調製した。これを５００　＋
ｎｌ！容坂ロフラスコに入れ殺菌後、これにＡｌｃａ目
ｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　ＴＨ８３６株を植菌した
。これを３０°Ｃにて２４時時間上う培養した。この培
養液を遠心分離（ｉｏ、ｏｏＯｒｐｌｎ　、　ｌｏ　ｍ
ｉｎ、）（、、沈澱した菌体をｐＨ７，０のリン酸バッ
ファー０．０５Ｍにて１回洗浄した。この洗浄菌体を同
バンファにて０Ｄ６６０＝ｌＯ００になるように希釈し
、菌体懸司液とした。

（反応系） 次の反応ね成にて３０６Ｃで１時間反応させた。

反応組成　　　　　　　　添加量 リン酸バフ７アー　ＩＭ（ｐＨ８，０）　　　　０，２
ｎｌｌアクリ／ｌ／酸ｌ／形水溶液（Ｖ／Ｖ）　　　’
０．１　ｓｎｌ各種アルコール　　ｌＯ％水溶Ｍ　（Ｖ
／Ｖ　）　　　ｏ、１　ｍｌ菌体懸濁液　　　　０Ｄ６
６０＝１０　　　　　０．６　ｍｌ！アルコ−μ成分と
してメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルア
ルコール、グチルアルコール、ペンチル７ｙコール、ヘ
キシルアルコール、オクチルアルコールが用いられた。

（分析） 反応終了後、速心分離によシ菌体を除去し、その上澄液
をガスクロマトグラフもしくは液体クロマトグラフによ
り分析し生成物の収量を定量した。

（結果） その結果を第７表に示す。

以ト余白 天Ｖ也例２ 実ｈｌＩＩ汐１］ｌと同様にして調製したＡｌｃａｌ　
ｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　　１”Ｈ８３６株の菌
体部１ｉｔｔｌ？ｆｆｌ　２０　ｍｌをｌ　Ｕ　ＯＩｎ
／容のカラス製ビーカに入れ、氷冷水で冷却しながら海
上電気（抹）製の超音波破砕機にて１０分間国体を破砕
した。得られた破砕物を１５．００Ｏｒｐｍで２０分間
遠心分離し、得られた上澄液を租醇素故とした。この租
酵ｇ液を菌体懸濁液の代シに用いたこ七以外、実施例１
と同じ反応系にてエステル反応を行なった。その結果を
船８表に示す。

以下余白 実施例３ （粗ｌ！ｉ１：累液の調製） 実施例１に示し／こ肉汁液体培地にてＡｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　　ＴＫ４９３５を３０°Ｃで
２４時間培養し／こ。培養ｉ反を遠心分離（ｔｏｏ、ｏ
ｏ　ｒｐｍ　、　１ｏ　ｍｉｎ、＞し、染めた菌体をｐ
Ｈ７，０のリン酸バッファー０．０５　Ｍ　で１回θｄ
浄した。この洗浄菌体を同バッファーに°Ｃ，０Ｄ６６
０＝１０．０になるように希釈して菌体懸濁液を調製し
た。この菌体懸濁（夜２０ｍ１を１００ｍ１容のガラス
製ビー力に入れ、氷冷水で冷却しながら、海上電機（味
）製の超音波破砕機にて、１０分間菌体を破砕した。得
られた破砕物を１５．０００　ｒ　ｐａｎ　で２０分間
遠心分離し、得られた上な液を粗酵ｔＡ液とし７た。

（反応系） リン酸パンファー　Ｉ　Ｍ　（ｐＨ８，０）　　　０．
２　ｍ１７９　’）　Ｗ％　　　　　１０％水溶故（Ｖ
／Ｖ　）　　”　ｒ１１ｅエチルアルコール　２ｏ％沙
溶液（ｖハυ０．１　ｎ１Ｊｌ’粗酵素液　　　　　Ａ
２８０＝１４．０　　０．６　ｍｌさらに、上記エチル
アルコールの代りに、ブチルアルコ−Ｉし、ヘキシルア
ルコールモｌ、　＜　ｉｌ：オクチルアルコールをそれ
ぞれ最ｉｉａ及が１％（Ｖ／Ｖ　）になるように用いた
。また、各種アルコールに対し、アクリル酸に代えてメ
タクリル１投を用いた反応も行なった。反応はｌ０００
Ｇの水浴水に１分間＆演することによシ停止させた。沈
澱した蛋白質は５０００ｒｐｍで１０分［−の遠心分に
進にて除去し。

その上澄液を液体クロマトグラフにて分析し、生成エス
テルの収Ｉ食を定量した。

（結果） その結果を第９表に示１”。

以ド余白 第　　９　　表 実施例４ （１１体懸濁液の調製） 肉エキスｌｏｇ、ポリペグト：／　ｌ　Ｏｇ　、　Ｎａ
Ｃ１５ｇ、蒸留水１１．そしてｐ１１７．０　の組成の
肉汁液体培地１００ｍ１をｆｉ’７Ｊ袈した。これを５
００　ｍｌ谷汲ロフラスコに入れ殺菌して後、これにＡ
Ｉ　Ｏａ　Ｉ　ｉｇｅｎｃｓｆａｅｅａｌｉｓ　　′ｒ
Ｈ８３６株を植１油した。これを３０°Ｃにて２４時間
振とう培養した。この培養液を遠心分離（１０，００Ｏ
ｒｐｍ　、　ｌ□　ｍｉｎ、　）し、沈澱した菌体を）
Ｉｎ２，０のリン酸バッファー０．０５　Ｍにて１回６
Ｌａ　ｔ’Ｊｒした。この菌体を同じパンファーにて０
Ｄ６（５０＝ＩＯ，０になるように希釈し、これを菌体
懸濁液とした。

（粗酵素液の調製） 得られた菌体懸濁液を尋上電気製超音波破砕機にて氷冷
水で冷却しつつ２０分間破砕した。これを遠心分離（１
５，０００ｒｌ’ｍ　、　３０分間）Ｌ−１その上ａｌ
ｅ！、を粗酵素液とし、た。

（反応組成） 次の反応組成にて３０°Ｃで反応し、得られた生成物を
ガスクロマトグラフを用いて分析した。

リン酸パン７７−　　ｌＭＣＰＨ８，０）　　　　０．
２ｍｌアクリル酸　　　　１０％水宕液（Ｖハυ　Ｑ、
ｌ　ＩＩＩＪｌ・４ブタンジオ−ｐ　各拙ａ度　　　　
　　０．１ｍ１１・４ブタンジオ−μの濃度は最終濃度
でｌＯ００％（Ｖ／Ｖ）、５．ＯＬ；？７　（ＶＡυ　
、３．０％（Ｖ／ｖ）、１．０％（Ｖ／Ｖ）、　０．５
　’ｊｉｒ　（Ｖ／Ｖ）　　（！：　Ｌり。

（結果） ■・４グタンジオ一／ｌ／Ω度のエステル生成におよぼ
す影響を調べた。その結果を第３図に示す。エステル生
成量は苅γクリル酸収率（モル％）で表示される。１・
４ブタンジオール垣が多くなるにつれ生成するヒドロキ
シグチルアクリレートのｆｆｉ％多くなることがわかる
。また、アクリル酸ｌｏ％（最終濃度）と１・４ブタン
ジオ一ル１ｏ％（最終濃度）との（１：１の）反応でも
ジアクリレートの生成は生成アクリ７し酸エステルの１
％以下であった。しかし、アクリル酸と二価アルコール
との比が１＝２以上になると、ジアクリレートはまった
く生成しなかった。化学合成においてはアクリル酸と二
価アルコールとをｌ：ｌで反応させると。

生成したアクリル酸エステルに対し５〜１５％のジアク
リレートが生成する。ジアクリレートは重合時の反応系
をゲル化させるため、それが生成しないようにするとと
が必要である。化学合成ではぞれはｔｉＫめてなつかし
い。そイｔゆ７え、重合１寺の１１込み濃度を低くおさ
えね（、まならンよいという欠点があった。本発明のエ
ステル反応においてはジアクリレートの生成は微量もし
くは皆無であるため。

このような問題はない。

実施例５ 実施例４で示しだ培地にて目印にＡｌ　ｃａ　Ｉ　ｉｇ
ｅ口ｅｓｆａｅｃａｌｉｓ　　ＴＨ８３６株とＡｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＴＫ４９３５株をそ
れぞれ培養した。得だ各菌体を０Ｄ６６０＝１０．０に
なるように０．０５　Ｍのリン酸パンファー（ｐＨ７，
０）にて、菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を実
施例４と同様に処理して４且酵索存支をｉ報製した。こ
の菌体シ咥濶ン夜もしくは市販の酵！７（ｆを用いて次
の反応組成にて３０°Ｃで２時間反応を行った。市販の
リパーセとしては。

Ａｓ　ｐｅｒｇｉ　Ｉ　ｌｕｓに属する糸状菌から生産
されたりパーーレ（リパーゼＡＰ二天￥ｆ製薬（株））
およびＭｕｃｏｒに属する糸状菌から生産されたリパー
セ（リパーセＭ−ＡＰ：天野製薬（株））を用いた。

リンｒ＝バフ７７−　　　ＩＭ（ｐＨ８，０）　　　　
　　０．２ｒｎｌアクリル般１ｏ％水溶液　（Ｖ／Ｖ）
　　　０．１　ｍｌｘ　チＬ／ツクリコールＩ７とは１
・４グタンシオールまノこはｌ・６ヘキツーシジオール
　１ｏ（２）０．１　ｍｌ市販リパーセの醇素溶液濃度
は３　ｍｇ　／ｍｌであった。ｌ・６ヘキサンジオール
の使用量は０．１ｇであった。この場介には反応系の固
形一度を調整する意味で水０．１ｍｌ！を系にさらに添
加した。生成物質を液体クロマトグラフもし−くはガス
クロマトグラフで確認し−た。いずれの反応系において
もジアクリレート生成は演出されなかった。結果を第１
０表に示す。

以下求白 実施例６ 実施例４と同様にして得たＴＨ８３６抹およびＴＫ４９
３５株の培養菌体を遠心分離後、　０．０５Ｍ　（ｐＨ
７，０）のリン酸パンファーにて０Ｄ６６０が１０．０
の菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液に３倍ｊｄの
アセトン＜−２ｏ’Ｃ＞を加え、１０分間攪拌した後遠
心分離＜　ｉｏ、ｏｏｏ　ｒｐｍ　、　ｉ　ｏ分）した
。沈澱した菌体をさらにアセトンにて２回洗浄した。

これを吸引式デシケータ中にて完全に乾燥し１．アセト
ンドライ菌体を得た。この菌体を用いて反応を行なった
。

リン酸パフ７アー　ＩＭ（ｐＨ８，０）　　　　　　０
．２ｍｆアクリル酸　　　１０％水溶液（Ｖ／Ｖ）　　
　　０．１　ｍ１１−４ブタンジオ一ルｉｏｏ％　　　
　　　　　　　　　０．１１ｎｌ水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．６　ｍｌ！アセトン・ド
ライ菌体　　　　　　　　　　　　　２０ｍｇ反応は３
０°Ｃにて２時間行なった。その結果。

対アクリル酸収率（七ル％）はＴＨ８３６株では４．２
％、そしてＴＫ４９３５株では４，５％であった。

実施例７ 実施例４と同様にして得たＴＨ８３６株の粗酵素液を第
１１表に示したように常法に従って清製し。

比活性が４０倍になった８１３分精製酵素を得た。

以下余白 この活性は、アクリル０と１・４ブタンジオールとの反
応におけるヒドロキシグチルアクリレートの生成によっ
て評価された。

次にこの卸に精製酵素をセファロース４ＢにｃＮＢｒ　
　Ｈ性化法（Ｒ，Ａｘｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２１４゜１
３０２（１９６７）で固定化した。得られた固定化酵素
を内径１２ｍｍ長さ３０ＣＩＩＩのカラムに詰め、上部
から下記の組成の反応液を１０ｔ７Ｒ７１時間の流速で
流した。その結果、対アクリル酸当１モル％の収率でヒ
ドロキシブチルアクリレートが生成された。

反応液組成　　　　　　　　添加量 リン酸パン７アー　ＩＭ（ｐＨ８，０）　　　　　１０
０　ｍ１７９　ＩＪ　ｔｖ酸　　　　１０％水溶液（Ｖ
／Ｖ）　　　　５０　ｍＩ！１　”　４７”夕＞ジオー
ル　１００％　　　　　　　　　　　５０　　ｍｌ水　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　ｍ
／実施例８ 実施例４と同様にして得たＴＨ８３６株およびＴＫ４９
３５株の菌体懸濁液お上び粗酵素液をそれぞれ用い９次
の反Ｊ芯系のもとてジアクリレートの加水分解ｒｊ目を
調べた。

反応組成　　　　　　　　　　添〃ロ量リン酸パン７ア
ー　Ｉ　Ｍ　ＣｐＨ８，０）　　　　　　０．２　ｍｌ
ジヒドロキシアクリレート　０．２％　　　　　　　　
０，２１ｎｌ菌体懸濁液　　　　　０Ｄ６６０＝ＩＯ０
ＯＱ、（３ｍｌもしくは粗酵県液　　０Ｄ２８０＝１５
．ＯＣ０，６ｍ１）上記反応系を３０ｃ′Ｇにインキュ
ベートするとジヒドロシキアクリレートは５〜１０時間
のうちに消失し１．それに対応するアクリル酸エステル
とアクリル酸とが生成した。

本発明の新菌株はプロピオン酸および酪酸の資化性能ヲ
欠（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ　　Ｔ
Ｈ８３６およびＴＫ４９３５であり、これらはアクリル
酸とアルコール類とからアクリル酸エステルを生産する
Ｆｊ目力を有する。この菌株を用いることによジアクリ
ル酸と二価アルコールとを含有する反応系から水酸基を
有するアクリル酸ニス７−／Ｉ／を製造するととができ
る。エステル化に弘要なｉｊＩ禦は、培地の柚頓に無関
係に、菌体増殖に比例して土圧される。

この生成物は工業月利となシうる重合体原料として宵月
である。この生成物を他の既知単量体と共重合し−て得
られる高分子は粘着剤、接着剤、フィルムなどとして用
いられうる。しかも、この生成物は水酸基を有するため
、親水性をもぢしかも官能基とじても作用するので、他
の多くの用途に利用されうる。

さらに１車間株を用いたエステル反応においてジアクリ
レートがほとＡ、ど生成をれない。ジアクリル酸　トが
系内に生成されなければ２重合反応中にゲル化が起こら
ず、したがってエステル反応出発物質の高濃度仕込みが
可能となる。その結果。

新規な特徴をもつ高分子を得ることも可能である。

微琺ながらジアクリレートが系内に生成でれても。

本菌株はいずれもこれに対応するアクリル酸エステルと
アクリル酸とに加水分解する詣力を有するという利点が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ｔｖｍ抹Ａｌｅａｌｉｇｅｒｔｅｓ　ｆ
ａｅｅａｌｉｓＴＨ８３６のエステル化酵素の安定性を
示す図、第２図は同じ（１’Ｈ８３６抹のエステル化酵
素のＰｆＩによる影響を示す図、第３図は同じ（ＴＨ８
３６株のエステル生成能の１・４グクンジオ一ル譲度に
よる影響をホず図である。 以　　上 代理人　　弁理士　山　本　秀　策 第１　図 蓼 Ｈ 第３１図 反点吟間（ｑｎｉ、）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１０ピオン酸および酪酸の資化性能を欠くアルカリ
   ゲネス・フエーカリス。 ２、　アルカリゲネス・７工−カリスＴＨ８３６株もし
   くはアルカリゲネス・７エーカリｘ　ＴＫ４９３５株で
   ある前記特許請求の範囲第１項に記載のアルカリゲネス
   ・７エーカリス。