DE69736280T2

DE69736280T2 - Gen fuer selektive proliferation

Info

Publication number: DE69736280T2
Application number: DE69736280T
Authority: DE
Inventors: Keiya Kawachi-gun OZAWA; Katsuhisa Tsukuba-shi ITOH; Tsuneaki Tsukuba-shi SAKATA; Yasuji Tsukuba-shi UEDA; Mamoru Tsukuba-shi HASEGAWA
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2017-03-06
Also published as: DE69736280D1

Description

Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik, insbesondere den Bereich der Gentherapie.
Hintergrund des Fachgebietes
Zur Behandlung von Erkrankungen, die durch angeborene oder erworbene genetische Defekte, nämlich Genstörungen, verursacht werden, wurden bisher verschiedene Verfahren entwickelt. In der Gentherapie besteht eine solche Methode darin, ein defektes Gen selbst durch ein normales Gen zu ersetzen oder zu ergänzen, um Genstörungen grundlegend zu heilen. Für den Erfolg der Gentherapie ist es wichtig, ein normales Gen präzise in die Zielzellen einzuführen und das eingeführte Gen fehlerfrei zu exprimieren. Die üblicherweise zur Einführung eines normalen Genes in Zielzellen verwendeten Vektoren sind virale Vektoren wie Retrovirus-Vektoren, Adenovirus-Vektoren und Adenovirus-assoziierte Vektoren und nicht-virale Vektoren wie Liposome. Alle haben jedoch Unzulänglichkeiten wie eine geringe Effizienz, Gene in Zielzellen einzuführen. Außerdem sind sie oft zur Behandlung unangemessen wegen zusätzlicher Nachteile wie schwache Expressionseffizienz eines eingeführten Genes. Bei Adenosin-Desaminase (ADA) Mangel wird von den Zellen, in die das normale ADA-Gen eingeführt wurde, erwartet, dass sie einen Überlebens-oder Wachstumsvorteil erlangen und als Ergebnis einer in vivo-Selektion allmählich dominant werden. In solch einem Fall kann es möglich sein, allmähliche Behandlungseffekte zu erhalten, trotz der schwachen Geneinführungs-Effizienz. Es ist jedoch oft notwendig, ein Gen zur Behandlung einzuführen, dass nicht in vivo selektiert werden kann. Es war deshalb wünschenswert, ein System zu etablieren, das eine selektive Amplifikation von Zellen, die ein eingeführtes Gen enthalten, ermöglicht.
Obwohl G-CSF traditionell als Cytokin (hämatopoetischer Faktor) betrachtet wurde, das selektiv neutrophile Zellen proliferiert, wurde kürzlich berichtet, dass die Verabreichung von G-CSF nicht nur die neutrophilen Zellen, sondern auch den hämatopoetischen Stammzell/Vorläufer-Zellpool im Körper vermehrt (Rinsho Ketsueki (Clinical Blood), 35, 1080 (1994)). Über den Mechanismus der Manifestation der G-CSF Tätigkeit wurde berichtet, dass es sich um eine Dimerisierung eines G-CSF-Rezeptors handelt, die auf Aktivierung des G-CSF-Rezeptors durch Stimulierung mit G-CSF hin stattfindet (Proc. Growth Factor Res., 3 (2), 131-141 (1991)). Es wurde auch berichtet, dass der G-CSF-Rezeptor eine Proliferations-induzierende Domäne und eine Differenzierungs-induzierende Domäne besitzt (Cell, 74, 1079-1087 (1993)). Außerdem ist ein Östrogenrezeptor bekannt, der, wie der G-CSF-Rezeptor, durch Dimerisierung aktiviert wird (J. Biol. Chem., 264, 2397-2400 (1989)) und es existiert ein Bericht, dass die Expression eines Fusionsproteins zwischen dem Östrogen-Rezeptor und der c-AbI-Tyrosinkinase in der Zelle in einer Aktivierung der c-AbI-Tyrosinkinase resultiert (The EMBO Journal, 12, 2809-2819 (1993)).
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung versucht, das Problem schwacher Einführungs-Effizienz von Genen durch selektive ex vivo-Amplifikation von hämatopoetischen Stammzellen, in die ein Gen zur Behandlung eingeführt wurde, zu überwinden. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines grundlegenden Verfahrens für eine auf hämatopoetische Stammzellen zielgerichtete Gentherapie.
Im Fachgebiet der heutigen Gentherapie bestehen zahlreiche zu überwindende Probleme, die die Effizienz der Geneinführung in die Zielzellen und die Expressionseffizienz der eingeführten Gene betreffen. Es ist deshalb offensichtlich, dass die Etablierung eines Systems zur selektiven Amplifikation lediglich der das eingeführte Gen enthaltenden Zielzellen einen großen Durchbruch erzielen wird. Es würde insbesondere maßgeblich zum Fachgebiet der Gentherapie beitragen, wenn solch ein System für hämatopoetische Stammzellen etabliert wird, die der Ursprung vieler Blutzellen wie roter oder weißer Blutzellen sind und die als die am meisten bevorzugten Zielzellen für Gentherapie angesehen werden.
G-CSF, der traditionell als Cytokin (ein hämatopoetischer Faktor) angesehen wurde, das selektiv neutrophile Zellen proliferiert, kann auch hämatopoetische Stammzellen proliferieren. Der G-CSF-Rezeptor dimerisiert, selbst wenn er aktiviert wird. Unter Betrachtung dieser Faktoren haben die Erfinder an ein System zur Amplifizierung hämatopoetischer Stammzellen durch Dimerisierung eines gentechnischen G-CSF-Rezeptors gedacht. Auch basierend auf der Tatsache, dass der Östrogen Rezeptor auf Stimulation mit Östrogen hin selbst dimerisiert, haben die Erfinder an die Konstruktion eines chimären Genes zwischen dem G-CSF-Rezeptor-Gen und dem Östrogen Rezeptor-Gen, die Einführung des chimären Gens in Zellen und die externe Stimulation der Zellen durch Östrogen gedacht, um den G-CSF-Rezeptor-Anteil des chimären Genproduktes zwingend zu dimerisieren.
Daher wurde die vorliegende Erfindung durch die Entwicklung eines neuen Systems zur selektiven Amplifizierung hämatopoetischer Stammzellen, in die ein Gen eingeführt wurde durch Aktivierung des G-CSF-Rezeptor-Anteils des chimären Genprodukts durch externe Stimulation mit Östrogen, vervollständigt, um dieses System auf dem Gebiet der Gentherapie anzuwenden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, wie nachstehend definiert; einen Vektor, der ein das Fusionsprotein codierende Gen umfasst; eine Zelle, die den Vektor enthält; und ein Verfahren zur selektiven Proliferation der Zelle ex vivo, indem die Zellen einem Steroidhormon ausgesetzt werden. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung, wenn der Vektor ein exogenes Gen enthält, ein Verfahren zur selektiven Proliferation einer Zelle, in die ein exogenes Gen eingeführt wurde.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung:

1) Fusionsprotein, umfassend
a) ein erstes Polypeptid und
b) ein zweites Polypeptid wobei das erste Polypeptid eine Ligandenbindungsdomäne eines Steroidhormonrezeptors umfasst, der bei Ligandenbindung selbstassoziiert, und wobei das zweite Polypeptid einen Cytokinrezeptor oder einen Proliferations-induzierdenden Teil davon umfasst, der bei der Selbst-Assoziierung des ersten Polypeptids einer Zelle Proliferationsaktivität verleiht.
2) Fusionsprotein nach (1), wobei der Steroidhormonrezeptor ein Östrogenrezeptor ist.
3) Fusionsprotein nach (1), wobei der Cytokinrezeptor ein G-CSF-Rezeptor ist.
4) Vektor, der ein Gen umfasst, das das Fusionsprotein nach (1) codiert.
5) Zelle, die den Vektor nach (4) enthält.
6) In vitro-Verfahren zur selektiven Proliferierung der Zelle nach (5), umfassend das Aussetzen der Zelle nach (5) einem Liganden, der in der Lage ist, auf die „Ligandenbindungsdomäne" des Fusionsprotein nach (1) zu wirken.
7) Vektor, der ein gewünschtes exogenes Gen und ein das Fusionsprotein nach (1) codierendes Gen umfasst.
8) Vektor nach (7), wobei der Steroidhormonrezeptor ein Östrogenrezeptor ist.
9) Vektor nach (7), wobei der Cytokinrepzeptor ein G-CSF-Rezeptor ist.
10) Vektor nach (7), wobei das „Gen, das ein Fusionsprotein codiert" und das „exogene Gen" auf dem selben Molekül lokalisiert sind.
11) Vektor nach (7), wobei das „Gen, das ein Fusionsprotein codiert" und das „exogene Gen" auf separaten Molekülen lokalisiert sind.
12) Zelle, die den Vektor nach einem von 7 bis 11 enthält.
13) In vitro-Verfahren zur selektiven Proliferierung der Zelle nach (12), umfassend das Aussetzen der Zelle nach (12) einem Liganden, der in der Lage ist, auf die „Ligandenbindungsdomäne" des Fusionsproteins zu wirken, das von dem Gen codiert wird, das in dem Vektor nach (7) enthalten ist.
14) Kit, umfassend (a) den Vektor nach (4) oder (7) und (b) einen Liganden, der in der Lage ist, auf die „Ligandenbindungsdomäne" des Fusionsproteins zu wirken, das von dem Gen codiert wird, das auf dem Vektor enthalten ist.

In der vorliegenden Erfindung kann jeder Ligand verwendet werden, solange er auf ein spezifisches Protein wirkt, um eine Assoziierung des Proteins herbeizuführen, bevorzugt ist jedoch ein Steroidhormon. Beispiele für das Steroidhormon umfassen Östrogene, Androgene, Progesterone, Glukocorticoide und mineralische Corticoide. Sie werden in Kombination mit ihren jeweiligen Rezeptorproteinen verwendet. In der vorliegenden Erfindung kann auch jeder Cytokinrezeptor verwendet werden, solange er einer Zelle nach Assoziation Proliferationsaktivität verleiht. Beispiele für Cytokin-Rezeptoren sind die zur Cytokin-Rezeptor-Familie gehörenden, einschließlich G-CSF, und die, die zur Tyrosinkinase-Rezeptor-Familie gehören, einschließlich c-kit und flk2/flt3.
Als die „einer Zelle Proliferationsaktivität verleihende Domäne" eines Fusionsproteins gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Molekül, das das intrazelluläre Proliferationssignal übermittelt, zum Beispiel ein vollständiges Molekül eines Cytokinrezeptors, verwendet werden. Es ist auch möglich, nur eine Domäne in dem Molekül, die einer Zelle Proliferationsaktivität verleiht, zu verwenden. Der zweite Ansatz ist vorteilhaft, um die Zelle, so wie sie ist, zu proliferieren, weil die Domäne die Zelle, in die das Fusionsprotein codierende Gen eingeführt wurde, proliferiert, ohne sie zu differenzieren. Außerdem umfasst der in der vorliegenden Erfindung verwendete Vektor nicht nur ein einziges Vektormolekül, das das Fusionsprotein codierende Gen enthält, und ein einziges Vektormolekül, das das Fusionsprotein codierende Gen und das exogene Gen enthält, sondern auch ein Vektorsystem von multiplen Vektormolekülen, das eine Kombination eines Vektors, der das Fusionsprotein codierende Gen enthält, und eines Vektors, der das exogene Gen enthält, umfasst, ein binäres Vektorsystem. Solch ein Vektorsystem multipler Vektormoleküle wird üblicherweise mittels Kotransformation in eine Zelle eingeführt. Wenn ein das Fusionsprotein codierendes und ein exogenes Gen in denselben Vektor inseriert werden, können sie in eine dicistronische, eine interne Ribosomen-Eintritts-Stelle (IRES) enthaltende Form gebracht werden (veröffentlichte PCT-Anmeldung in Japan Nr. Hei 6-509713). Es ist z.B. möglich, einen Vektor zu verwenden, der eine Struktur aufweist, die von 5' zu 3' einen Promotor, ein exogenes Gen, IRES und ein das Fusionsprotein codierendes Gen beinhaltet, oder einen Vektor, der eine von 5' zu 3' einen Promotor, ein das Fusionsprotein codierendes Gen, IRES und ein exogenes Gen umfassende Struktur besitzt. Der erstgenannte Typ wird im Allgemeinen verwendet, um den meisten, das Fusionsprotein exprimierenden Zellen zu erlauben, das exogene Gen zu exprimieren.
Außerdem schließt in der vorliegenden Erfindung die Zelle, in die der Vektor eingeführt wird, hämatopoetische Stammzellen, lymphatische Zellen und andere Zellen als Blutzellen ein. In der vorliegenden Erfindung werden insbesondere hämatopoetische Stammzellen, die selbst proliferieren können, bevorzugt. Obwohl das exogene Gen, das in die Zelle eingeführt werden soll, in der vorliegenden Erfindung nicht besonders limitiert ist, wird auf dem Gebiet der Gentherapie im Allgemeinen ein normales Gen, das einem defekten Gen entspricht, verwendet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1(A) zeigt ein chimäres Molekül zwischen dem G-CSF-Rezeptor und dem Östrogenrezeptor (GCRER). (B) zeigt eine Mutante des chimären Moleküls zwischen dem G-CSF-Rezeptor und dem Östrogenrezeptor, wobei die in den Aminosäuren 5 bis 195 des G-CSF-Rezeptors fehlen (GCR Δ (5-195)/ER). (C) zeigt eine Mutante des chimären Moleküls zwischen dem G-CSF-Rezeptor und dem Östrogenrezeptor, wobei die Aminosäuren 5 bis 195 und 725 bis 756 des G-CSF-Rezeptors fehlen (GCR Δ(5-195, 725-756)/ER).
2 zeigt einen Retrovirus-Vektor „pMX", in den ein chimäres Gen zwischen dem G-CSF-Rezeptor und dem Östrogenrezeptor inkorporiert wurde.
3 zeigt die Proliferation der mit „pCMX-GCRER" transformierten Ba/F3-Zellen im zeitlichen Verlauf.
4 zeigt die Proliferation von mit „pCMX-GCRER" transformierten Ba/F3-Zellen im zeitlichen Verlauf; die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Östradiol stimuliert.
5 zeigt die Proliferation der mit „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" transformierten Ba/F3-Zellen im zeitlichen Verlauf.
6 zeigt das Plasmid „pCMX-GCRER-IRES-CD24".
7 zeigt das Plasmid „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24".
8 zeigt das Plasmid „pCMX-GCRΔ(5-195, 725-756)/ER-IRES-CD24".
9 zeigt die Expression von CD24 in den Ba/F3-Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24" eingeführt wurde, detektiert durch Durchfluss-Cytometrie. Der obere Abschnitt zeigt. die Ergebnisse der Ba/F3-Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24" eingeführt wurde; das untere Bild zeigt die Ergebnisse der Ba/F3-Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" eingeführt wurde als Kontrolle. (Man beachte, dass die Daten auch das Signal von Propidiumjodid, das verwendet wurde, um tote Zellen nachzuweisen, enthält.
10 ist eine mikroskopische Aufnahme, die, von Knochenmarkszellen stammende Kolonien des Ganulocyten-Makrophagen-Stammbaums zeigt, in die „vMXGCRER" eingeführt wurde.
11 ist eine mikroskopische Aufnahme erythroblastischer Kolonien der Knochenmarkszellen, in die „vMXGCRΔ(5-195)/ER" eingeführt wurde.
12 ist eine mikroskopische Aufnahme, die die Wright-Giemsa-gefärbten Makrophagen zeigt, die sich aus den Knochenmarkszellen, in die „vMXGCRER" eingeführt wurde, differenziert haben.
13 ist eine mikroskopische Aufnahme, die die Wright-Giemsa-gefärbten Erythroblasten zeigt, die sich aus den Knochenmarkszellen, in die „vMXGCRΔ(5-195)/ER" eingeführt wurde, differenziert haben.
Die beste Ausführungsform der Erfindung
Beispiel 1
Konstruktion des chimären G-CSF-Rezeptor/Östrogenrezeptor-Gens (ein selektives Amplifizierungsgen)
Um ein chimäres Protein herzustellen, das den gesamten G-CSF-Rezeptor und die Liganden(Östrogen)bindungsdomäne des Östrogenrezeptors (nachher einfach als „GCRER" bezeichnet) beinhaltet, wurden die das Fusionsgen besitzenden cDNAs, die die entsprechenden Proteine codieren (1(A), konstruiert. Dann wurde eine Mutante des Fusionsproteins, „GCRER", der der 5. Rest, Glu, bis zum 195. Rest, Leu, der extrazellulären Domäne des G-CSF-Rezeptors fehlt (nachher einfach als „GCRΔ(5-195)/ER" bezeichnet), konstruiert, um ein chimäres Protein herzustellen, dem eine Reaktivität gegenüber G-CSF fehlt (1(B)). Außerdem wurde eine Mutante durch Deletion eines Anteils des G-CSF-Rezeptors, der die Differenzierung induzierende Domäne enthält (725-756), von der Mutante (nachher einfach als „GCRΔ(5-195, 725-756)/ER" bezeichnet) (1(C)) konstruiert.
Beispiel 2
Isolierung von Ba/F3-Zellen, in die das chimäre G-CSF-Rezeptor/Östrogen-Rezeptorgen eingeführt wurde, das ein selektives Amplifizierungsgen ist
Die drei Arten der in Beispiel 1 hergestellten selektiven Amplifizierungsgene wurden in das Plasmid „pCMX" (Cancer Res. 56:4164 (1996)) eingeführt. Je 10 μg des resultierenden Plasmids wurden zusammen mit 1 μg des ScaI-linearisierten, ein Blasticidin-Resistenzgen tragenden „pSV2bsr" (Kaken Pharmaceuticals) durch Elektroporation in die Ba/F3-Zelle eingeführt, eine IL-3-abhängige Zell-Linie. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen mit 5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung verteilt und in einem 10 μg/ml Blasticidin enthaltendem Medium kultiviert. Bei 11 von 17 Vertiefungen, wo „pCMX-GCRER" eingeführt wurde, bei 3 von 29 Vertiefungen, wo „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" eingeführt wurde, und bei 52 von 52 Vertiefungen, wo „pCMX-GCRΔ(5-195, 725-756)/ER" eingeführt wurde, wurde eine Proliferation von Blasticidin-resistenten Zellen beobachtet. Nachdem diese Blasticidin-resistenten Zellen in Einzelvertiefungen mit IL-3 proliferiert hatten, wurden die Zellen mit 10^–7M Östradiol anstatt IL-3 kultiviert. Bei 7 von 11 Vertiefungen, wo „pCMX-GCRER" eingeführt wurde, bei 3 von 3 Vertiefungen, wo „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" eingeführt wurde, und bei 13 von 16 Vertiefungen, wo „pCMGCRΔ(5-195, 725-756)/ER" eingeführt wurde, wurde Proliferation von IL-3 unabhängigen und Östrogen-abhängigen Zellen beobachtet. Wenn ein ähnliches Experiment unter der Verwendung eines Retrovirus-Vektors „pMX",(Exp. Hematol. 24: 324 (1996)), in den „GCRER" inseriert wurde (nachher einfach als „pMX-GCRER bezeichnet) (2) anstatt „pCMX-GCRER", durchgeführt wurde, wurde bei 2 von 24 je eine Zelle enthaltenen Vertiefungen Proliferation von IL-3-unabhängigen und Östrogen-abhängigen Zellen beobachtet. Auch wenn 1 nM G-CSF statt Östradiol zu den Zellen, in die „pCMX-GCRER" eingeführt wurde, gegeben wurde, waren diese Vertiefungen, die G-CSF-abhängige Proliferation zeigten, die gleichen, wie die, die Östradiol-abhängige Proliferation zeigten. Außerdem wurde, wenn die Ba/F3-Zellen, die kein Plasmid enthielten, als Kontrolle verwendet wurden, weder eine G-CSF-abhängige, noch eine Östradiol-abhängige Proliferation beobachtet. Die Herstellung des gewünschten Fusionsproteins in den Zellen wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-G-CSF-Rezeptor-Antikörpers oder eines anti-Östrogen-Rezeptor-Antikörpers bestätigt.
Beispiel 3
Analyse der Zell-Proliferation durch Östradiol
Unter den Clonen, die durch limitierte Verdünnung in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden die, die eine gute Antwort auf Östradiol zeigten, ausgewählt und im folgenden Experiment verwendet (XTT-Test).
Es wurden die Ba/F3-Zellen, in die „pCMX-GCRER" eingeführt worden war, untersucht. Es gab IL-3-unabhängige Zellen, die durch Stimulation mit G-CSF oder Östradiol proliferierten (3). Außerdem wurde, wenn das gleiche Experiment mit variierenden Östradiol-Konzentrationen zwischen 10^–4 und 10^–7 M durchgeführt wurde, Zellproliferation im Bereich von 10^–9 bis 10^–7 M beobachtet (4). Dieses Ergebnis legt nahe, dass Östradiol das Signal zur Zellproliferation bei Konzentrationen zwischen 10^–9 und 10^–7 M überträgt.
Die Ba/F3-Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" eingeführt wurde, wurden untersucht. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Zellproliferation durch G-CSF-Stimulierung blockiert wurde und dass allein die Östradiol-Stimulierung die Zellproliferation verursachte (5).
Gleichermaßen wurde für die Ba/F3-Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195, 725-756)/ER" eingeführt wurde, durch Östradiol-Stimulierung Zellproliferation hervorgerufen, aber keine Antwort auf G-CSF beobachtet.
Beispiel 4
Konstruktion des IRES-CD24-Expressions-Plasmids
„PCMX-GCRER" wurde mit HindIII und EcoRI verdaut und das Vektorfragment („Fragment 1 ") wurde gewonnen. Ebenso wurden von „pCMX-GCRER" und „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" das „HindIII-Fragment („Fragment 2", 1672 Bp) und das KpnI-Fragment („Fragment 3", 1099 Bp) und das EcoRI-Fragment (Fragment 4", 1888 Bp) und das KpnI-Fragment (Fragment 5", 1792 Bp) gewonnen. PBCEC (pBluescript II KS, Ligierung mit IRES und CD24, von EMCV stammend; Migita, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:12075 (1995)) wurde mit ApoI verdaut und das das IRES-CD24 enthaltende Fragment ("Fragment 6", 950 Bp) wurde gewonnen. „pCMX-GCRER-IRES-CD24" (6) wurde durch Ligierung von „Fragment 1", „Fragment 2", „Fragment 4" und „Fragment 6" konstruiert. „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24" (7) wurde durch Ligierung von „Fragment 1 ", „Fragment 3", „Fragment 4" und „Fragment 6" konstruiert. „pCMX-GCRΔ(5-195, 725-756)/ER-IRES-CD24" (8) wurde durch Ligierung von „Fragment 1 ", „Fragment 3", „Fragment 5" und „Fragment 6" konstruiert.
Beispiel 5
Intrazelluläre Expression von CD24
Nach zweimaligem Waschen von 10⁷ Ba/F3-Zellen mit PBS und einmaligem Waschen mit „OPTI-MEM1" (Gibco-BRL) wurden die Zellen in 0,2 ml „OPTI-MEM1" resuspendiert. Je 10 mg von „pCMX-GCRER-IRES-CD24", „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24" und „pCMX-GCRΔ(5-195, 725-756)/ER-IRES-CD24" wurden zu den Zellen gegeben und die Transformation wurde unter Verwendung eines „Gene Pulser" (BioRad) bei 290 V, 960 mF, durchgeführt. Nach der Transformation wurden die Zellen für zwei Tage in dem 10 % FKS und 10 U/ml mIL-3 (R&D SYSTEMS) enthaltenden RPMI-Medium kultiviert. Nachdem 10⁶ Zellen mit 5% FKS/PBS gewaschen worden waren, wurden die Zellen mit 1 mg/ml des anti-CD24-Antikörpers (Pharmingen) für 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Zellen wurden dann zweimal mit 5% FKS/PBS gewaschen und mit einer 1:20-Verdünnung des PE-markierten anti-Maus-Antikörpers (DAKO) für 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt und wieder zweimal mit 5% FKS/PBS gewaschen. Die Zellen wurden in 1 ml 5 mg/ml Propidiumjodid/PBS resuspendiert und die CD24-Expression wurde mittels Durchfluss-Cytometrie (Becton Dickinson) unter Verwendung eines 585 nm-Detektors analysiert. Die CD24-Expression wurde von einer Anzahl der Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24" eingeführt wurde, detektiert. In diesem Experiment wurden die Zellen, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER" eingeführt worden war, als Kontrolle gegenüber den Zellen verwendet, in die „pCMX-GCRΔ(5-195)/ER-IRES-CD24" eingeführt wurde. Die Ergebnisse werden in 9 und Tabelle 1 gezeigt. Man beachte, dass die Daten das Signal vom Propidiumjodid, das verwendet wurde, um tote Zellen zu detektieren, enthalten. Tabelle 1
Beispiel 6
Vorläufer-Tests
5-Fluoruracil (5FU:Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in physiologischer Kochsalzlösung (10 mg/ml) wurde intravenös in vier, sechs Wochen alte C57BL-Mäuse bei einer Dosis von 330 ml/Maus injiziert. Zwei Tage nach Injektion wurde Knochenmark von den Oberschenkelknochen gesammelt, auf „Lymphocyte-M" (Cederlane) zentrifugiert (1500 UpM, 25°C, 22 Min.), um mononukleäre Zellen zu isolieren. Die mononukleären Zellen wurden für zwei Tage in dem Iscove modifizierten Dulbecco-Medium (IMDM; Gibco), ergänzt mit 20 % FKS, 100 U/ml IL6 und 100 mg/ml Ratten-SCF, kultiviert. 10⁶ mit IL6 und SCF vorbehandelte Knochenmarkszellen wurden auf einer CH296- (Takara Shuzo; Hanenberg, H. et al., Nature Med, 2:876 (1996)) beschichteten Platte (1146:Falcon) in einem Kultur-Überstand resuspendiert, der entweder 10⁸ Retrovirus „VMXGCRER" (enthalten im Kultur-Überstand einer ecotropischen Verpackungszell-Linie „GP+E-86 (J. Virol. 62: 1120 (1988)) mit darin eingebautem „pMX-GCRER") oder Retrovirus „VMXGCRΔ(5-195)/ER" (enthalten im Kultur-Überstand einer ecotropischen Verpackungszell-Linie „GP+E-86" mit darin eingeführtem „pMX-GCRΔ(5-195)/ER") enthielt. Die Zellen wurden in Anwesenheit von IL6 uns SCF kultiviert. Die viralen Überstände wurden nach 2, 24, 26, 36 und 38 Stunden ersetzt. 24 Stunden nach dem sechsten Ersetzen viralen Überstandes wurden die Zellen in ein Methylcellulose enthaltendes Kulturmedium (IMDM, 1,2 % Methylcellulose 1500 Cp; Wako, 20 % FKS, 1 deionisiertes BSA, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 10^–7 M b-Östradiol) zu 10⁴/Vertiefung überführt. Nach 10 Tagen Kultivierung wurden Kolonien unter dem Mikroskop beobachtet. Es wurden Schmierpräparate hergestellt und einer Wright-Giemsa-Färbung unterworfen, um die Zellen zu identifizieren.
Unter den mit „vMXGCRER"- oder „vMXGCRΔ(5-195)/ER"-infizierten Knochenmarkszellen wurden Kolonien des Granulocyten-Makrophagen-Stammbaums und Erythroblasten-Stammbaums, die sich durch die Östradiol-Stimulation aus den Knochenmarkszellen differenziert hatten, beobachtet. 10 zeigt die Kolonien des Granulocyten-Makrophagen-Stammbaums, die von den mit „vMXGCRER"-infizierten Knochenmarkszellen durch die Östradiol-Stimulation herrührten; 11 zeigt die Kolonien des Erythroblasten-Stammbaums, die von den mit „vMXGCRΔ(5-195)/ER"-infizierten Knochenmarkszellen bei der Östradiol-Stimulation zurückzuführen waren. Wenn aus den die Kolonien bildenden Zellen Schmier-Proben gemacht wurden und sie einer Wright-Giemsa-Färbung unterzogen wurden, wurden Bilder ausdifferenzierter Blutzellen erhalten. 12 zeigt das Wright-Giemsa gefärbte Bild der in den Schmierproben der Kolonien des Granulocyten-Makrophagen-Stammbaums, die von den „vMXGRER"-infizierten Knochenmarkszellen stammten, beobachteten Makrophagen; 13 zeigt das Wright-Giemsa gefärbte Bild der Erythroblasten, die in den Schmierproben der Kolonien des Erythoblasten-Stammbaums beobachtet wurden, die von den „vMXGCRΔ(5-195)/ER"-infizierten Knochenmarkszellen stammten.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung hat es möglich gemacht, eine Zelle, in die ein exogenes Gen eingeführt wurde, als Antwort auf einen externen Stimulus selektiv zu amplifizieren und dadurch eine wirksame Gentherapie zu ermöglichen, sogar wenn die Einführungs-Effizienz des Gens in die Zielzelle niedrig ist. Außerdem wurde, da das System der selektiven Zell-Amplifizierung der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Blutzellen angewendet werden kann, der Bereich der Zielzellen in der Gentherapie erweitert. Daher stellt die vorliegende Erfindung eine wichtige Basis-Technik, insbesondere im Bereich der Gentherapie, bereit.

Claims

Fusionsprotein umfassend (a) ein erstes Polypeptid und (b) ein zweites Polypeptid, wobei das erste Polypeptid eine Ligandenbindungsdomäne eines Steroidhormonrezeptors umfasst, der bei Ligandenbindung selbstassoziiert und wobei das zweite Polypeptid einen Cytokinrezeptor oder einen proliferations-induzierenden Teil davon umfasst, der bei der Selbst-Assoziierung des ersten Polypeptids einer Zelle Proliferationsaktivität verleiht.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei der Steroidhormonrezeptor ein Östrogenrezeptor ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei der Cytokinrezeptor ein G-CSF-Rezeptor ist.
Vektor, der ein Gen umfasst, das das Fusionsprotein nach Anspruch 1 codiert.
Zelle, die den Vektor nach Anspruch 4 enthält.
In vitro-Verfahren zur selektiven Proliferierung der Zelle nach Anspruch 5, umfassend das Aussetzen der Zelle nach Anspruch 5 einem Liganden, der in der Lage ist, auf die „Ligandenbindungsdomäne" des Fusionsprotein nach Anspruch 1 zu wirken.
Vektor, der ein gewünschtes exogenes Gen und ein das Fusionsprotein nach Anspruch 1 codierendes Gen umfasst.
Vektor nach Anspruch 7, wobei der Steroidhormonrezeptor ein Östrogenrezeptor ist.
Vektor nach Anspruch 7, wobei der Cytokinrezeptor ein G-CSF-Rezeptor ist.
Vektor nach Anspruch 7, wobei das „Gen, das ein Fusionsprotein codiert" und das „exogene Gen" auf dem selben Molekül lokalisiert sind.
Vektor nach Anspruch 7, wobei das „Gen, das ein Fusionsprotein codiert" und das „exogene Gen" auf separaten Molekülen lokalisiert sind.
Zelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 7 bis 11 enthält.
In vitro-Verfahren zur selektiven Proliferierung der Zelle nach Anspruch 12, umfassend das Aussetzen der Zelle nach Anspruch 12 einem Liganden, der in der Lage ist, auf die „Ligandenbindungsdomäne" des Fusionsproteins zu wirken, das von dem Gen codiert wird, das in dem Vektor nach Anspruch 7 enthalten ist.
Kit umfassend (a) den Vektor nach Anspruch 4 oder 7 und (b) einen Liganden, der in der Lage ist, auf die „Ligandenbindungsdomäne" des Fusionsproteins zu wirken, das von dem Gen codiert wird, das auf dem Vektor enthalten ist.