DE69727399T2

DE69727399T2 - Verwendung von neutralen Gallium Chelaten mit 3-Hydroxy-4-Pyrone Verbindungen zur Behandlung von Krankheiten die verbessert werden Können durch die Hemmung der Hyperproliferation von Keratinocyten

Info

Publication number: DE69727399T2
Application number: DE69727399T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Richard Bernstein
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: ES2214635T3; US5747482A; AU3726797A; EP0959889B1; DE69727399D1; EP0959889A1; EP0959889A4; WO1998004263A1; AU740198B2; WO1998004264A1; AU4044697A; ATE258440T1; JP2000516219A

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung richtet sich teilweise auf die Inhibierung der Hautzellproliferation in Säugern und im Besonderen auf die Inhibierung der humanen Keratinozytenproliferation. Es wurde gefunden, dass die topische Anwendung von neutralen Gallium-Komplexen oberhalb bestimmter Konzentrationen die Keratinozytenproliferation signifikant inhibiert. Diese Erfindung richtet sich teilweise auch auf die Verwendung von neutralen Gallium-Komplexen zur Behandlung oder Prävention von Krankheitszuständen, wie Psoriasis, die durch eine exzessive Keratinozytenproliferation gekennzeichnet sind.
Referenzen
Die folgenden Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden in dieser Anmeldung durch hochgestellte Zahlen zitiert.

¹ Warrell, Jr. et al., U.S. Pat. Nr. 4,529,593 über "Use of Gallium Salts to Treat Disorders of Calcium Homeostasis, erteilt Jul. 16, 1985
² Warrell, Jr. et al., "Gallium in the Treatment of Hypercalcemia and Bone Metastasis", in "Important Advances in. Oncology 1989", DeVita, Jr., Editor, J. P. Lippincott Company, Philadelphia, Pa.
³ Bockman, et al., U.S. Pat. Nr. 4,704,277 über "Methods for Treating Bone Disorders", erteilt Nov. 3, 1987
⁴ Collery, U.S. Pat. Nr. 4,596,710 über "Gallium Chloride as a New Anti-Cancer Drug", erteilt Jun. 24, 1986
⁵ Adamson, et al., "Studies on the Antitumor Activity of Gallium Nitrate (NSC-15200) and Other Group IIIa Metal Salts", Chemotherapy Reports, Part 1, 59: 599–610 (1975)
⁶ Bockman, et al., Internationale Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer: WO 91/10437, über "Methods of Enhancing Wound Healing and Tissue Repair", erteilt Jul. 25, 1991.
⁷ Whitacre, et al., "Suppression of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis by Gallium Nitrate", J. Neuroimmuno., 39: 175–182 (1992)
⁸ Matkovic, et al., U.S. Pat. Nr. 5,175,006 über "Method of Treating Arthritis Using Gallium Compounds", erteilt Dez. 29, 1992
⁹ Matkovic, et al., "Gallium Prevents Adjuvant Arthritis in Rats and Interteres with Macrophage/T-Cell Function in the Immune Response", Current Therap. Res., 50(2): 255–267 (1991)
¹⁰ Bernstein, U.S. Pat. Nr. 5,258,376 (1993) über "Pharmaceutical Compositions of Gallium Complexes of 3-Hydroxy-4-Pyrones", erteilt Nov. 2, 1993
¹¹ Wilkinson, et al., "Nerve Growth Factor Increases the Mitogenicity of Certain Growth Factors for Cultured Human Keratinocytes: A Comparison with Epidermal Growth Factor" Exper. Dermatol., 3: 239–245 (1994)
¹² Landegren, "Measurement of Cell Numbers by Means of the Endogenous Enzyme Hexosaminidase. Applications to Detection of Lymphokines and Cell Surface Antigens", J. Immunol. Methods, 67: 379–388 (1984)

Stand der Technik
Es ist bekannt, dass Galliumsalze für die Behandlung von vielen humanen und anderen Säugetier-Krankheiten von Nutzen sind, einschließlich Hyperkalzämie, Krebs und bestimmte degenerative oder Knochen-Metabolismus-Erkrankungen, wie Osteoporose und Paget's Krankheit^1–5. Es wurde auch beschrieben, dass Gallium die molekulare Wirkung des „Transforming growth factors" nachahmen kann, einschließlich, bei niedrigen Konzentrationen, der Stimulation von Keratinozyten der Haut, so dass Gallium sich auch als förderlich für die Wund- und Gewebeheilung erwiesen hat⁸. Andere beschriebene Verwendungen von Gallium schließen die Unterdrückung der experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis ein⁷, die Prävention von Rheumatoider Arthritis⁸ und das Eingreifen in die Makrophagen/T-Zell-Funktion in der Immunantwort⁹. In solchen Behandlungen scheint Gallium selbst das aktive Reagenz zu sein, die Form, in der Gallium angewendet wird (z. B. als Nitrat, Sulfat oder Chlorid), scheint dagegen die Aktivität nicht zu beeinflussen^{2, 5, 6}.
Die orale Anwendung von Galliumsalzen ist im Stand der Technik so beschrieben, dass hohe Dosen der Galliumsalze nötig sind, um die geforderten Gallium-Konzentrationen im Blut zu erreichen^1,
3. Bernstein¹⁰ beschrieb jedoch, dass Gallium 3-Hydroxy-4-Pyron-Komplexe eine gesteigerte Bioverfügbarkeit an Gallium ermöglichen, wenn sie oral angewendet werden.
Ungeachtet des oben Gesagten stellt die exzessive Keratinozytenproliferation die klinische Basis für bestimmte Säugetier-Krankheiten dar. In normaler Haut wird die kontinuierliche Regeneration der epidermalen Schicht durch die begrenzte Produktion an Keratinozyten kontrolliert, wobei ein Teil dieser Keratinozyten sich differenziert und an die Oberfläche der Haut wandert, wo sie verhornen und absterben. Diese Zellen werden letztlich von der Haut abgeworfen und der gesamte Prozeß findet über eine ungefähr 28–30 Tage andauernde Periode statt.
Die Psoriasis ist durch eine exzessive Proliferation der epidermalen Keratinozyten gekennzeichnet, einhergehend mit einer Reduktion in der Zelldifferenzierung. Die Zellen bewegen sich typischerweise in ungefähr drei bis sechs Tagen an die Oberfläche der Haut. Diese überschüssigen Hautzellen häufen sich an und bilden erhabene, rote und schuppige Läsionen, die charakteristisch für Psoriasis sind und meistens mit weißen, schuppigen Flecken abgestorbener Hautzellen bedeckt sind. Insgesamt führt die Erkrankung zu unansehnlichen bis entstellenden, schuppigen, manchmal juckenden Stellen am Körper, vorzugsweise am Rumpf, den Ellenbogen usw., aber prinzipiell können die Flecken an allen Stellen der Haut auftreten und in schweren Fällen große Gebiete des Körpers bedecken.
Die vorliegende Erfindung basiert auch darauf, dass neutrale Gallium-Chelate in genügend hohen Konzentrationen die Proliferation der Keratinozyten inhibieren können und daher vorteilhaft für die Behandlung oder Prävention von Krankheitszuständen sind, die mit einer Hyperproliferation von Hautzellen einhergehen, und im Besonderen nützlich für solche Krankheitszustände sind, die mit einer Hyperproliferation von Keratinozyten verbunden sind. Die Krankheitszustände, die mit einer Hyperproliferation von Keratinozyten verbunden und hier von besonderem Interesse sind, umfassen: Psoriasis, atopische Dermatitis, Kontaktdermitis, ekzematöse Dermatitis, seborrhoeische Dermatitis und Lichen Planus. Die topisch anwendbaren Zusammensetzungen dieser Erfindung sind auch nützlich, um anderen Erkrankungen der Haut, die mit einer Hyperproliferation der Keratinozyten assoziiert sind, vorzubeugen oder sie zu behandeln, einschließlich Hyperkeratose, Erythrokeratoderma, Ichthyose, aktinische Keratose, Akne, Basalzellkarzinom oder Schwammzellkarzinom.
Was die Ursache der Psoriasis betrifft, gibt es Hinweise, dass in einigen Fällen die Psoriasis eine Autoimmun-Krankheit ist, dementsprechend haben manche Forscher vermutet, dass Therapien, wie die Anwendung von Immunmodulatoren gegen T-Lymphozyten, nützlich sein könnten bei der Behandlung von Psoriasis. In dieser Hinsicht wurden Galliumsalze, wie Galliumnitrate beschrieben, die die experimentelle Autoimmun-Enzephalomyeletis⁷ inhibieren können und vorteilhaft bei der Prävention von Rheumatoider Arthritis sind⁸. Jedoch ist keine Korrelation zwischen der immunmodulatorischer Aktivität und der Inhibierung der Keratinozytenproliferation bekannt. Weiter zeigen die hier dargestellten Daten eine Hemmung der Keratinozytenproliferation durch neutrale Galliumchelate in der Abwesenheit von T-Lymphozyten, Makrophagen und anderen solchen Zellen des Immunsystems.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft den Befund, dass bestimmte neutrale Gallium-Chelate, wenn sie in ausreichend hohen Konzentrationen angewendet werden, die Proliferation der Keratinozyten inhibieren können. Dem entsprechend können solche Chelate verwendet werden, um Krankheitszustände zu behandeln, die durch eine exzessive Proliferation der Keratinozyten, wie Psoriasis, gekennzeichnet sind.
Auf überraschende Weise legen die nachstehenden Daten nahe, während sie nicht auf irgendeine Theorie begrenzt sind, dass die aktive Einheit der chelierte Gallium-Komplex ist und nicht das elementare Gallium und/oder ungebundener Chelator. Die folgenden Daten legen nahe, dass die neutralen Gallium-Chelate geeignet sind, die Keratinozytenproliferation zu hemmen, andere Gallium-Verbindungen, wie Galliumnitrate, aber nicht.
Hinsichtlich des oben Gesagten ist die Erfindung in einer Ausführungsform auf ein Verfahren gerichtet, das die Proliferation der Keratinozyten in der Haut von Säugetieren inhibieren kann, bestehend aus: (a) der Identifizierung von Stellen exzessiver Keratinozytenproliferation in der Haut von Säugern; und (b) dem Auftragen auf die in (a) identifizierten Hautstellen von einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneistoffträger enthält, der für eine topische Anwendung geeignet ist und, die eine wirksame Menge von 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1 enthält,
um die Proliferation der Keratinozyten zu inhibieren, wobei jedes R unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffen, ausgewählt ist.
Weiter können die neutralen Gallium-Chelate dieser Erfindung prophylaktisch eingesetzt werden. In solchen Verfahren wird die Haut, die empfänglich für Zustände ist, die mit einer Proliferation der Keratinozyten einhergehen, vor der Entstehung sichtbarer Läsionen in den Gebieten behandelt, von denen bekannt ist, dass die Haut, anfällig für Läsionen ist, was individuell verschieden ist. Wenn sie so angewendet werden, umfassen die Verfahren dieser Erfindung:

(a) die Identifizierung von Hautstellen, die frei von sichtbaren Läsionen sind, aber zu Läsionen neigen, die mit einer Hyperproliferation der Keratinozyten verbunden sind, und
(b) das Auftragen auf die in (a) identifizieren Hautstellen von einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Arzneistoffträger enthält, der für eine topische Anwendung geeignet ist und, die eine wirksame Menge von 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1, wie oben beschrieben, enthält.

In einer Ausführungsform der Zusammensetzungen ist die Erfindung auf eine topisch anwendbare pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, enthaltend einen für eine topische Anwendung geeigneten, pharmazeutisch akzeptablen Arzneistoffträger und eine wirksame Menge an 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1,
um die Proliferation der Keratinozyten zu inhibieren, wobei jedes R unabhängig aus einer Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffen, ausgewählt ist.
Vorzugsweise ist in der oben beschriebenen Formel jedes R unabhängig ein Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen und, noch mehr bevorzugt, ist jedes R unabhängig voneinander ein Wasserstoff- oder Methylrest.
Auf überraschende Weise zeigen die unten beschriebenen Daten, dass neutrale Gallium-Komplexe der oben beschriebenen Formel in hohen Konzentrationen auch die Differenzierung der Keratinozyten und die Apoptose fördern. Solche Eigenschaften lehren weiter die Verwendung solcher neutralen Gallium-Komplexe in der Behandlung von Psoriasis und anderen Krankheiten, die mit einer exzessiven Proliferation der Keratinozyten einhergehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt die Wirkungen unterschiedlicher Konzentrationen an Galliummaltol auf das Keratinozytenwachstum, wobei die Kristallviolett-Methode zur Bestimmung des Zellwachstums verwendet wurde.
2 zeigt die Wirkungen unterschiedlicher Konzentrationen an Galliummaltol auf das Keratinozytenwachstum, wobei die Hexosaminidase-Methode zur Bestimmung des Zellwachstums verwendet wurde.
3 zeigt die Wirkungen von 1 × 10^–4 M Galliummaltol (GaM), 1 × 10^–4 M Galliumnitrat (Ga) und 3 × 10^–4 M Maltol (M) auf das Keratinozytenwachstum.
4 zeigt den Prozentsatz an proliferativen (weiße Säulen), schwammigen, intrazelluläre Strukturen aufweisenden (Säulen mit Schatten) und klar schwammigen (schwarze Säulen) Keratinozyten in Kulturen an, die mit 5 × 10^–5 M Galliummaltol behandelt waren. Die Werte stellen Mittelwerte ± Standardabweichung von 3 Kulturflaschen pro Behandlung dar.
5 zeigt das Ausmaß der Apoptose in Keratinozyten, die vor der Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen an Galliummaltol für 3 Tage kultiviert worden sind; unterschiedliche CAM-Konzentrationen; eine ATA-Konzentration, 1 × 10^–4 M; eine ATA-Konzentration, 1 × 10^–4 M plus CAM, 1 × 10^–5 oder 1 × 10^–6 M; und eine ATA-Konzentration, 1 × 10^–4 M plus Galliummaltol, 1 × 10^–4 oder 2.5 × 10^–4 M.
6 zeigt das das Ausmaß der Apoptose in Keratinozyten, wie in 5, mit der Ausnahme, dass die Zellen für 6 Tage kultiviert wurden.
7 vergleicht das Ausmaß der Apoptose in Keratinozyten in der Anwesenheit von Galliummaltol, Galliumnitrat und Maltol.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie schon vorher angemerkt, richtet sich diese Erfindung teilweise auf eine Inhibierung der Keratinozytenproliferation in Säugern und im Besonderen auf die humane Keratinozytenproliferation durch die topische Anwendung neutraler Gallium-Komplexe der oben gezeigten Formel 1. Bevor jedoch die Erfindung in weiteren Details diskutiert wird, werden die folgenden Ausdrücke zuerst definiert:
Definitionen
So wie sie hier gebraucht werden, sind die nachstehenden Ausdrücke wie folgt definiert:
Der Ausdruck „Keratinozyte" bezieht sich auf Hautzellen, die die Fähigkeit aufweisen, Keratin zu produzieren und schließen z. B. ein: Zellen wie Basalzellen, Stachelzellen, Dornenzellen und granuläre Zellen sowie weniger differenzierte und stärker differenzierte Varianten der gleichen Zelllinien, sowohl normale als auch abnormale Typen.
Der Ausdruck „neutraler 3 : 1 Gallium-Komplex eines 3-Hydroxy-4-Pyrons" bezieht sich auf einen elektrostatisch neutralen Komplex vom Ga³⁺ und 3 Äquivalenten der anionischen Form von 3-Hydroxy-4-Pyron, dessen Komplex durch die Formel [Ga³⁺(py^–1)₃] dargestellt ist, wobei py^–1 der anionischen Form des 3-Hydroxy-4-Pyrons entspricht, welches unten definiert ist. Weil solche Komplexe nicht in einem signifikanten Ausmaß in wässrigen Zusammensetzungen, eingestellt bei einem pH-Wert von ungefähr 5 bis ungefähr 9, dissoziieren, bleiben diese Komplexe hauptsächlich elektrostatisch neutral in solchen Zusammensetzungen.
In dieser Hinsicht gelten die Komplexe als „elektrostatisch neutral", weil eine gleiche Anzahl positiver und negativer Ladungen vorhanden ist, die nur schwer in ihre anionischen und kationischen Komponenten dissoziieren können.
Auch ist ersichtlich, dass die anionische Form des 3-Hydroxy-4-Pyrons als ein chelierendes Reagenz gegenüber Gallium wirken kann, der Komplex wird hier manchmal als „neutrales Gallium-Chelat des 3-Hydroxy-4-Pyrons" bezeichnet. Es sollte verstanden werden, dass letzterer Ausdruck synonym zum Ausdruck „neutraler 3 : 1 Gallium-Komplex des 3-Hydroxy-4-Pyrons" ist.
Der Ausdruck „ein 3-Hydroxy-4-Pyron" bezieht sich auf eine Verbindung der Formel,
wobei keines bis zu drei Wasserstoffatome, die an dem Kohlenstoffring gebunden sind, durch eine Kohlenwasserstoffgruppe, bestehend aus 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, ersetzt werden kann.
Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabler Arzneistoffträger" schließt einen oder mehrere Arzneistoffträger ein, die für pharmazeutische Zusammensetzungen akzeptabel sind.
Besondere Verbindungen, die durch den Ausdruck „ein 3-Hydroxy-4-Pyron" umfaßt sind, werden durch die nachstehenden Formeln 3–6 wiedergegeben:

wobei jedes R unabhängig ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein kann.
Die unsubstituierte Form des 3-Hydroxy-4-Pyrons (Formel 3, auch Pyromekonsäure genannt) enthält drei Wasserstoffatome, die nur an Ringkohlenstoffatome gebunden sind. Wie oben bemerkt, kann irgendeine Kombination dieser drei Wasserstoffatome durch eine Kohlenwasserstoffgruppe ersetzt werden, und alle möglichen Kombinationen solcher Substitutionen sind durch diese Erfindung abgedeckt. Die Stellen einiger möglicher Substitutionen sind in den Formeln 4–6 angegeben, wobei R einer Kohlenwasserstoffgruppe entspricht (einschließlich Methyl, Äthyl, Isopropyl und N-Propyl). Die Kohlenwasserstoffgruppen sind vorzugsweise azyklisch und vorzugsweise unverzweigt.
Gruppen, die sechs oder weniger Kohlenstoffatome enthalten, besonders ein bis drei Kohlenstoffatome, insbesondere Methyl oder Äthyl, sind bevorzugt. Einzelsubstitutionen sind bevorzugt, Substitutionen an Position 6 oder besonders der Position 2 sind bevorzugt. Einige Beispiele spezifischer Verbindungen, deren Gallium-Komplexe Bestandteil von Zusammensetzungen dieser Erfindung sein können, sind: 3-Hydroxy-2-Methyl-4-Pyron (Formel 4, R = CH₃ – manchmal als Maltol oder Larixinsäure bezeichnet) und 3-Hydroxy-2-Äthyl-4-Pyron (Formel 4, R = C₂H₅ – manchmal als Äthyl-Maltol oder Äthylpyromekonsäure bezeichnet), beide sind besonders bevorzugt in dieser Erfindung, besonders 3-Hydroxy-2-Methyl-4-Pyron. Andere bevorzugte Verbindungen schließen 3-Hydroxy-4-Pyron (Formel 3 – manchmal als Pyromekonsäure bezeichnet) und 3-Hydroxy-6-Methyl-4-Pyron (Formel 5, R = -CH₃) ein.
Der Ausdruck „ein Anion von 3-Hydroxy-4-Pyron" bezieht sich auf eine Verbindung, die in den oben gezeigten Formeln 3–6 definiert ist, wobei das Hydroxyl-Proton entfernt wurde, um die anionisch geladene Form dieser Verbindungen zu liefern.
Der Ausdruck „Galliummaltol" bezieht sich auf den neutralen 3 : 1 Gallium-Komplex des Maltols.
Der Ausdruck „die Keratinozytenproliferation hemmen" meint, dass, im Vergleich zur Kontrolle, die Proliferation der Keratinozyten um mindestens 20% in dem in vitro Assay, wie unten in Beispiel 2 beschrieben und mit dem Kristallviolett-Färbeprotokoll getestet, vermindert ist. Vorzugsweise ist die Keratinozytenproliferation um mindestens 35% und noch bevorzugter um mehr als 50% im Vergleich zur Kontrolle reduziert.
Synthesen und Methodik
Die Methoden für die Herstellung neutraler 3 : 1 Gallium-Komplexe von 3-Hydroxy-4-Pyron oder 3-Hydroxy-4-Pyronen, wobei ein bis drei Wasserstoffatome, die an den Ringkohlenstoffatomen gebunden sind, durch eine Kohlenwasserstoffgruppe ersetzt sind, die ein bis sechs Kohlenstoffatome enthält, sind in Bernstein beschrieben¹⁰. Solche Methoden beinhalten die Reaktion von solchen Hydroxypyronen mit Galliumionen und die Isolation von zumindest Teilen des resultierenden Komplexes oder der Komplexe.
Im Besonderen wird der neutrale 3 : 1 Gallium-Komplex von 3-Hydroxypyron durch die Reaktion von Galliumionen und den 3-Hydroxy-4-Pyronen in Lösung hergestellt. Galliumionen können von Galliumsalzen stammen, wie Galliumhalid, insbesondere Galliumchlorid oder eine Galliumnitrat-Verbindung, besonders ein hydratisiertes Galliumnitrat. Die Galliumnitratverbindungn sind oft vorzuziehen, weil man mit ihnen leichter arbeiten kann als mit den Galliumhaliden, die sehr reizend sein können und heftig mit vielen Lösungsmitteln, einschließlich Wasser, reagieren. Bei Anwendung geeigneter Sicherheitsmaßnahmen, kann eine Vielzahl von Galliumsalzen verwendet werden. Die Reaktion wird in geeigneter Weise in gemeinsamen Lösungsmitteln bewirkt, einschließlich, aber nicht limitiert auf Mischungen, die Wasser, Äthanol, Methanol und Chloroform enthalten. Reines Wasser kann in vielen Fällen verwendet werden, obwohl die Reinigung der Gallium-Hydroxypyron-Komplexe schwierig sein kann, wenn Wasser verwendet wird. Eine bevorzugte Methode ist die Verwendung gleicher Teile an Äthanol und Chloroform mit einer Spur an Wasser, wenn es gewünscht ist, zumindest den Großteil der Reaktionsnebenprodukte abzutrennen, wie Natriumnitrate, Natriumchlorid und Natriumkarbonate. Die Nebenprodukte der oben erwähnten Reaktion haben sehr geringe Löslichkeiten in dieser Mischung und können einfach durch Filtrieren entfernt werden.
Um die bevorzugten, neutralen 3 : 1 Hydroxypyron : Gallium-Komplexe herzustellen, werden die Hydroxypyrone und die Galliumionen in einem molaren Verhältnis von 3 : 1 gemischt, bevorzugt mit einem leichten Überschuß an Hydroxypyron, um hauptsächlich den 3 : 1 Komplex gegenüber den 2 : 1 und 1 : 1 Komplexen entstehen zu lassen. Die Verhältnisse der jeweiligen gebildeten Komplexe sind vom pH-Wert der Lösung abhängig. Wenn ein Galliumsalz, wie ein Halid oder Nitrat gelöst wird, weist die resultierende Lösung im Allgemeinen einen niedrigen pH-Wert auf. Um den bevorzugten 3 : 1 Komplex im Überschuß entstehen zu lassen, wird ein pH-Wert von 5–9 und bevorzugt von 6–7 verwendet. Wenn saurere Lösungen verwendet werden, ist der neutrale 3 : 1 Komplex nicht so stabil, auch wenn ein großer Überschuß an Hydroxypyron vorliegt. Unter sehr basischen Bedingungen können schwer lösliche Galliumhydroxyde ausfallen. Es ist bevorzugt, den pH-Wert mit anderen Verbindungen als den Hydroxyden, wie z. B. Natriumhydroxyd, einzustellen, weil die Verwendung solcher Hydroxyde eine Präzipitierung der schwer löslichen Gallium-Hydroxyde zur Folge haben kann, was nicht gewünscht ist, und der pH-Wert kann dann auf einem niedrigen Wert durch die Präzipitierung gepuffert sein. Die Verwendung von Karbonaten, insbesondere von Natriumkarbonat zur Einstellung des pH-Wertes, ist bevorzugt. Die Verwendung von Natriumkarbonat in einer Lösungsmischung, die z. B. Äthanol und Chloroform enthält, kann in der Präzipitierung von Natriumnitraten resultieren, die sich sehr leicht in dieser Mischung lösen und die abfiltriert werden können, falls gewünscht, um die Lösung, die die gewünschte pharmazeutische Zusammensetzung enthält, zu reinigen.
Die Reaktion, bei der der Hydroxypyron-Gallium-Komplex in Lösung entsteht, ist im Allgemeinen in ungefähr 5 Minuten bei ungefähr 20°C komplett abgelaufen. Ein leichtes Rühren oder eine andere Bewegung der Lösung fördert eine gleichmäßige, schnelle Reaktion. Längere Reaktionszeiten können, wenn nötig, verwendet werden. Nach Abtrennung von Reaktionsnebenprodukten, wie Natriumnitraten, Natriumchlorid und Natriumkarbonaten (abhängig von den Lösungsmitteln und Reaktionspartnern), wird, falls gewünscht, die Reaktionsmischung in Luft verdampft oder, schneller, durch die Verwendung eines Rotationsverdampfers oder zum Beispiel durch Gefriertrocknen. Nach dem Trocknen bleiben der Gallium-Komplex oder die Komplexe in fester Form zurück. Eine Rekristallisation kann durchgeführt werden, falls gewünscht, unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Äthanol und Methanol, Äther, Wasser, Azeton und Mischungen, die solche Lösungsmittel enthalten. Ob die Lösungsmittel geeignet sind, hängt davon ab, welcher besondere Gallium-Komplex(e) und Verunreinigungen vorhanden sind; davon, ob die Verunreinigungen abgetrennt werden sollen und von der Temperatur und anderen physikalischen Gegebenheiten.
Es wird festgestellt, dass die erwähnten Methoden nicht die einzigen sind, die zur Herstellung von Hydroxypronen und Gallium-Komplexen mit Hydroxypyronen geeignet sind und, dass verschiedene alternative Methoden verwendet werden können, die dem Fachmann auf seinem Gebiet geläufig sind. Darüber hinaus kann bei der Herstellung der neutralen 3 : 1 Komplexe von Gallium mit 3-Hydroxy-4-Pyron ein einzelnes 3-Hydroxy-4-Pyron oder eine Mischung aus 3-Hydroxy-4-Pyronen verwendet werden. Bevorzugt ist jedoch die Verwendung eines einzelnen 3-Hydroxy-4-Pyrons.
Hinsichtlich der Herstellung von 3-Hydroxy-4-Pyronen, die als Ausgangsmaterial bei der Herstellung der neutralen 3 : 1 Komplexe von Gallium mit 3-Hydroxy-4-Pyronen verwendet werden, können bestimmte dieser Verbindungen natürlich vorkommen und können durch Extraktion natürlicher Quellen gewonnen werden. Maltol z. B., wird in der Rinde junger Lärchenbäume (Larix decidua Mill.) gefunden und in Kiefernnadeln, Zichorie, Holzteer und Ölen sowie geröstetem Malz¹². Bestimmte 3-Hydroxy-4-Pyrone sind kommerziell erhältlich, einschließlich Maltol und Äthylmaltol. Andere können aus Pyromekonsäure, die aus der Dekarboxylierung von Mekonsäure abgeleitet werden kann, als Ausgangsmaterial hergestellt werden. Methoden zur Herstellung solcher anderer 3-Hydroxy-4-Pyrone sind dem Fachmann gut bekannt. Zusätzlich wird festgehalten, dass Maltol oder Äthylmaltol eine breite Anwendung bei der Aromatisierung und Duftsteigerung von Lebensmitteln finden, und dass sie sehr niedrige Toxizitäten aufweisen, wenn sie oral appliziert werden.
Formulierungen
Die neutralen Gallium-Komplexe der 3-Hydroxy-4-Pyrone sind mittels im Stand der Technik gebräuchlicher Methoden als topisch anwendbare pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert. Solche topisch anwendbaren Zusammensetzungen enthalten Zusammensetzungen, die nur für die Applikation auf die Haut gedacht sind, im Gegensatz zu anderen Anwendungsmöglichkeiten, wie parenterale pharmazeutische Zusammensetzungen, oral verfügbare pharmazeutische Zusammensetzungen und Ähnliche. Bevorzugte topisch anwendbare pharmazeutische Zusammensetzungen schließen beispielhaft ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Arzneistoffträger ein, die für eine topische Anwendung geeignet sind sowie eine wirksame Menge an 3-Hydroxy-4-Pyron der oben gezeigten Formel. Geeignete Zusammensetzungen schließen beispielhaft Puder, Gele, Lotionen, Cremes, Salben, hydrophile Präparate, Shampoos etc. ein.
Puder wirken dem Juckreiz entgegen und haben eine kühlende Wirkung. Talkum, der Bestandteil vieler Puder ist, hat den größten glättenden Effekt, ist aber nicht-absorbierend. Getreidestärke hat einen geringeren glättenden Effekt, absorbiert aber. Lotionen sind Suspensionen von Pulver in Wasser, die einen schützenden Kühl- und Trocknungseffekt bewirken. Wenn das Wasser verdunstet, tritt der Kühl- und Trocknungseffekt auf, und ein Film von Puder bleibt übrig. Die Lotionen sind besonders nützlich für behaarte Hautstellen und in Hautfalten. Weichmacher sind Lotionen, die Fette und Öle enthalten, die die Haut einfetten und gereizte Haut beruhigen. Cremes sind Emulsionen von Öl in Wasser.
Cremes sind mit Wasser abwaschbar und werden von der Haut vollständig absorbiert. Wenn die Menge des Wassers reduziert wird und die Menge an Öl ansteigt, werden die Substanzen visköser und werden als Salben bezeichnet (sogenannte Öl-in-Wasser Emulsionen). Die drei Typen an Salben sind wasserlöslich, emulgierbar und Wasser abweisend. Salben können als Basis von glättenden Zusammensetzungen verwendet werden. Salben sind wirksamere glättende Mittel als Öl-in-Wasser Cremes. Salben schließen die Haut ab und sind nicht für nässende oder infizierte Gebiete zu empfehlen. Lotionen und Cremes sind für nässende Läsionen geeignet, Salben für trockene.
Hydrophile Präparate sind Präparate, die Wasser absorbieren und schließen beispielhaft kommerziell erhältliche Präparate, wie Eucerin^TM (Beiersdort, Inc., Norwalk, Conn., USA), Aquapor^TM (Beiersdort, Inc., Norwalk, Conn., USA), Lubriderm^TM (Warner Lambert Company, Morris Plains, N. J., USA) und wasserfreies Lanolin ein.
Shampoos sind wässrige Zusammensetzungen, die ein oder mehrere Fettsäuresalze (Seifen) und andere mögliche Additiva, wie Parfüme, Medikamente etc. enthalten können.
Auf jedem Fall entspricht die Menge an neutralem Gallium-Komplex, die in die pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht wird, einer ausreichenden Menge, um die Proliferation der Keratinozyten zu inhibieren. Vorzugsweise, wie unten gezeigt, ist eine Konzentration in der Lösung von mindestens 5 × 10^–5 M für den neutralen Gallium-Komplex in der Haut ausreichend, um eine ausreichende Hemmung der Keratinozytenproliferation zu erreichen. Vorzugsweise liefert die pharmazeutische Zusammensetzung eine Konzentration von mindestens 5 × 10^–5 M des neutralen Gallium-Komplexes der Haut. Um die erforderliche Konzentration an neutralem Gallium-Komplex in einer topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung, die benötigt wird, um eine solche Konzentration innerhalb der Haut erreichen, zu bestimmen, kann z. B. erstens das Volumen der zu behandelnden Haut abgeschätzt werden. Zum Beispiel ist die Dicke der Epidermis und der papillären Dermis typischerweise ungefähr 0,04 cm im Menschen (von ungefähr 0,01 cm beim Augenlid bis ungefähr 0,1 cm bei der Fußsohle reichend). Das Volumen der zu behandelnden Hautfläche läßt sich einfach dadurch ausrechnen, dass die geschätzte Dicke mit der Oberfläche der Haut, auf die die pharmazeutische Zusammensetzung aufgetragen wird, multipliziert wird. Wenn man den so berechneten Wert für das Volumen der zu behandelnden Haut verwendet, kann man die Konzentration an neutralem Gallium-Komplex in der topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung, die nötig ist, um jede gewünschte Konzentration an neutralem Gallium-Komplex freizusetzen, leicht ermitteln. Zum Beispiel werden ungefähr 0,13 mg von Galliummaltol (GaM) (Molekulargewicht 445,04) benötigt, um eine Konzentration von 10^–1 M des neutralen GaMs auf ein Hautgebiet mit einer Oberfläche von 75 cm² und einer Dicke von 0,04 cm (und somit einem Volumen von 3 cm³) freizusetzen (ungefähr 445,04 mg/cm³/Mole × 10^–4 Mole × 3 cm³). Wenn 0,13 mg GaM in 1 g einer topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen, dann beträgt die Konzentration von GaM ungefähr 0,013 Gewichtsprozent (w/w). Vorzugsweise macht das neutrale Gallium-Chelat von ungefähr 0,0001 bis ungefähr 5 Gewichtsprozent der topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzung aus, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung und besonders bevorzugt von ungefähr 0,005 bis ungefähr 0,5 Gewichtsprozent.
Anwendung
Die topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind nützlich, um Krankheitszustände zu behandeln, die durch eine überschießende Proliferation der Hautzellen vermittelt sind, besonders solche Krankheitszustände, die mit einer Hyperproliferation der Keratinozyten einhergehen. Solche Krankheitszustände, die mit einer Hyperproliferation der Keratinozyten einhergehen und hier besonders interessieren, sind Psoriasis, atopische Dermatitis, Kontakt-Dermatitis, ekzematöse Dermatitis, seborrhoeische Dermatitis und Lichen Planus.
Die topisch anwendbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind auch bei der Prävention oder der Behandlung von Hautzuständen nützlich, die mit einer Hyperproliferation von Keratinozyten einhergehen, beispielhaft einschließend: Hyperkeratose, Erythrokeratoderma, Ichthyose, aktinische Keratose, Akne, Basalzellkarzinom und Schwammzellkarzinom. Krankheiten, die mit einer Hyperproliferation von Zellen anderer Zelllinien einhergehen, wie z. B. Mastzellen, Melanozyten, Fibroblasten, Langerhans-Zellen, Endothelzellen, Epithelzellen, Nervenzellen, und Merkelzellen können auch durch Anwendung dieser Erfindung behandelt werden.
So verwendet, wird eine wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung auf das betroffene Gebiet appliziert, mindestens an einem Tag, bevorzugt ein bis dreimal täglich. Die spezifische, einzusetzende Dosis hängt von den besonderen Zuständen, die behandelt werden sollen, ab sowie von der Beurteilung des behandelnden Arztes und ist abhängig von bestimmten Faktoren, wie Schweregrad der Erkrankung, dem Alter und des Allgemeinzustandes des Patienten und Ähnlichem. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei der Behandlung von Psoriasis eine Konzentration des neutralen Gallium-Chelats von 3-Hydroxy-4-Pyron in der pharmazeutischen Zusammensetzung angewendet, die ausreichend ist, um eine Konzentration in Lösung von mindestens ungefähr 5 × 10^–5 M zu liefern.
Wie in den unten gezeigten Beispielen bemerkt, bewirken relativ hohe Konzentrationen des neutralen Gallium-Chelats in Zusammensetzungen dieser Erfindung eine Apoptose der Zellen, die mit dieser Zusammensetzung behandelt werden und, im Falle der Keratinozyten, fördern sie auch die Differenzierung. Beide Eigenschaften zeigen weiter den vorteilhaften Nutzen solcher Zusammensetzungen bei der Behandlung von Psorasis und anderen Krankheiten, die mit einer exzessiven Proliferation der Hautzellen einhergehen, besonders solche Krankheiten, die mit einer exzessiven Proliferation der Keratinozyten einhergehen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind gezeigt, um die beanspruchte Erfindung zu illustrieren. Wenn nicht anders beschrieben, sind alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben. Weiter haben die verwendeten Abkürzungen, wenn nicht anders beschrieben, folgende allgemein akzeptiere Bedeutung:
Å = Ångstrom
ATA = Aurintrikarbonsäure
CAM = Camptothecin
cm = Zentimeter
DDT = Dithiothreitol
HKGS = humanes Keratinozyten-Wachstumsfaktor-Supplement (erhältlich von Cascade Biologics, Portland, Oregon, USA)
M = molar
mg = Milligramm
ml = Milliliter
mM = millimolar
nm = Nanometer
PBS = Phosphat-gepufferte Salzlösung
SDS = Natriumdodezylsulfat
μl = Mikroliter
v/v = Volumen zu Volumen
w/v = Gewicht zu Volumen
w/w = Gewicht zu Gewicht
In den unten beschriebenen Beispielen bezieht sich das Kulturmedium 154 auf ein Kulturmedium, dass als eine Komponente der vollständigen Kulturbedingungen für das Wachstum von normalen, humanen, epidermalen Keratinozyten verwendet wurde und kommerziell von z. B. Cascade Biologics, Portland, Oreg., USA, Katalognummer M-154-100, erhältlich ist.
Beispiel 1: Herstellung von Galliummaltol
Maltol wird in Chloroform gelöst, so dass eine 0,75 M Lösung erhalten wird und Galliumnitrat-Monohydrat wird in Äthanol gelöst, so dass eine 0,5 M Lösung resultiert. Zu 20 ml der 0,75 M Maltol-Lösung werden langsam, unter andauerndem Rühren, 10 ml der 0,5 M Galliumnitrat-Monohydrat-Lösung zugefügt. Die resultierende Lösung wird für 5 Minuten bei 23°C gerührt. Ungefähr 5,5 g (in großem Überschuß) an pulvrigem Na₂CO₃ wird unter Rühren zugefügt, um den pH-Wert nah an 7 zu bringen. Wenn das Karbonat zugefügt wird, ist manchmal eine Spur an Wasser nötig, um die Reaktion zu erleichtern, was durch Überschäumen angezeigt wird. Anschließend wird weiter für 10 Minuten gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, um die festen Bestandteile zu entfernen, und das Filtrat wird in einem Rotationsverdampfer verdampft. Der feste, kristalline Rückstand entspricht der 3 : 1 Maltol-Gallium-Zusammensetzung. Diese Zusammensetzung wird mit Hilfe einer Hochleistungs-Röntgenstrahlbeugung analysiert und es wurde gefunden, dass sie aus orthothrombischen Kristallen mit einheitlichen Zell-Dimensionen von ungefähr a = 18.53(1) Å, c = 12,04(1) Å besteht. Die Kristallisation aus anderen Lösungsmitteln oder unter anderen Bedingungen kann andere kristalline Strukturen erzeugen. Auch amorphe Strukturen können in Methoden und Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden.
Unter einigen Bedingungen kann auch Wasser in die Struktur eingebracht werden. Die Löslichkeit dieser Zusammensetzung beträgt ungefähr 24 mM in distilliertem, deionisiertem Wasser bei 23°C. Der Komplex kann aus Äthanol und anderen Lösungsmitteln rekristallisiert werden, um die Reinheit zu erhöhen.
Der Galliummaltol-Komplex dieses Beispiels besteht aus einer kompletten Chelat-Struktur, die manchmal als neutrales Chelat bezeichnet wird, da die Ladung des Galliums durch die drei Maltol-Gruppen abgeschirmt wird.
Beispiel 2: Hemmung des Wachstums von kultivierten Keratinozyten durch Galliummaltol
Adulte, humane Keratinozyten, gewonnen aus zusammengemischten Spender-Hautproben, wurden aus kommerziellen Quellen erhalten (Cascade Biologics, Portland, Oreg., U.S.A.) und in 150 cm² große, flachbödige Kulturflaschen gefüllt mit Kulturmedium 154, angereichert mit HKGS (ungefähr 1%), ausgesät. Bei 80% Konfluenz wurden die Zellen mittels Trypsin geerntet und bis zum Zeitpunkt der Verwendung kryokonserviert.
Zu Beginn des Experiments wurde die erforderliche Anzahl an mit Keratinozyten gefüllten Röhrchen aufgetaut, und die Keratinozyten wurden dann in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen bei einer Zelldichte von ungefähr 2500 Zellen/cm² unter Verwendung des gleichen Mediums, wie oben beschrieben, ausgesät. Nach 24 Stunden (um eine Anheftung zu erlauben) wurde das Medium gegen frisches Medium 154 ausgetauscht, angereichert mit HKGS (ungefähr 1%) und Galliummaltol. Im Besonderen wurde das frische Medium durch Zufügen von einer ausreichenden Menge an Stamm-Lösung hergestellt, um für sechs verschiedene Zusammensetzungen eine Endkonzentration an Gallium von 10^–4, 10^–5, 10^–6, 10^–8, 10^–10 und 10^–12 M bereitzustellen. Die Stamm-Lösung wurde durch Zufügen von 22,25 mg Galliummaltol zu 50 ml Medium 154 hergestellt, durch einen 0,2 μm Filter steril filtriert und anschließend bei 4°C aufbewahrt.
Die Medien wurden alle 2–3 Tage erneuert. Kontroll-Zellen wurden nicht mit Galliummaltol behandelt.
Wenn die Kontroll-Zellen eine Konfluenz von ungefähr 40% erreicht hatten (im Allgemeinen nach 4–5 Tagen in Kultur), wurde das Medium komplett durch Absaugen entfernt, das Keratinozytenwachstum durch Färbung mit Kristallviolett verfolgt, und die Berechnung der Zellzahlen erfolgte dann nach Wilkinson et al.¹¹. Im Besonderen wurden die Zellschichten mit PBS gewaschen, das ebenfalls abgesaugt wurde und 4 Tropfen der Kristallviolett-Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Kristallviolett-Lösung wurde durch Lösen von Kristallviolett (Fisher Scientific) in PBS : Formaldehyd : Äthanol (67 : 3 : 30%) hergestellt, so dass eine 0,5% w/w Lösung entstand. Eine Vertiefung, die keine Zellen enthielt, wurde ähnlich behandelt.
Die Zellzahl wurde zur Bestätigung auch in weiteren, separaten Experimenten durch Bestimmung der Hexosaminidase-Aktivität, beschrieben bei Landegren¹², ermittelt.
Dazu wurden die Zellen wachsen gelassen und mit Galliummaltol behandelt, wie oben beschrieben, dann wurde die Hexosaminidase an Stelle des Kristallvioletts verwendet und ähnlich verfahren, wie oben beschrieben.
Das Keratinozytenwachstum in der Anwesenheit von Galliummaltol ist graphisch in 5 (Kristallviolett) und in 2 (Hexosaminidase) gezeigt. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Galliummaltol das Wachstum der Keratinozyten nur bei hohen Konzentrationen inhibiert, bei 10^–4 M Galliummaltol war das Keratinozytenwachstum um 60 bis 90% im Vergleich zur Kontrolle vermindert (c). Bei niedrigeren Konzentrationen legen die in 2 gezeigten Daten nahe, dass Galliummaltol das Wachstum der Keratinozyten tatsächlich leicht fördern kann.
Beispiel 3: Vergleich zwischen der Inhibierung des Keratinozytenwachstums mit Galliummaltol und Galliumnitrat
Die Keratinozyten wurden in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen für 9 Tage auf die oben in Beispiel 2 beschriebene Weise kultiviert. Nach den ersten 24 Stunden in Kultur wurde das Medium 154 durch ein stark Ca²⁺-haltiges Medium (1 mM Ca²⁺) ersetzt, das entweder keine weiteren Zusätze enthielt (Kontrolle „C") oder mit 1 × 10^–4 M Galliummaltol (GaM), 1 × 10^–4 M Galliumnitrat (Ga) oder mit 3 × 10^–4 M Maltol (M) versetzt wurde.
Die Zellen wurden anschließend kultiviert und nachfolgend auf eine Inhibierung des Keratinozytenwachstums hin untersucht, so wie oben beschrieben. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in 3 gezeigt, wo dargestellt ist, dass weder Galliumnitrat noch Maltol wirksam die Keratinozytenproliferation inhibieren können, aber Galliummaltol dieses Wachstum um ungefähr 94% reduzieren konnte. Diese Daten zeigen, dass weder elementares Gallium noch Maltol per se bei der Hemmung des Keratinozytenwachstums wirksam sind, trotz Verwendung der gleichen Konzentrationen an Gallium, im Vergleich zum neutralen Galliummaltol-Komplex.
Beispiel 4: Die Wirkung von Galliummaltol auf die Zell-Differenzierung
Die Keratinozyten wurden in einer Konzentration von ungefähr 2500 Zellen/cm², wie oben beschrieben, in Kulturflaschen (75 cm² Bodenfläche) ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das Medium in drei (3) Flaschen gegen Medium (154) mit einem steigendem Kalziumgehalt, ansteigend von normal 0.2 mM bis 1 mM („hohe Kalziumkonzentration"), zusammen mit Galliummaltol (GaM) in den folgenden Konzentrationen versetzt: 1 × 10^–5 M, 5 × 10^–5 M und 1 × 10^–4 M. Die Zellen wurden für 7 Tage weiter kultiviert, bis die Kontroll-Zellen (kein GaM) zu 75% konfluent waren. Die so angereicherten Medien wurden alle 2 Tage gewechselt, wie oben beschrieben. Letztlich wurden die Medien abgesaugt und die Zellen mit PBS gespült, bevor sie mit Trypsin (0,025%)/EDTA (0,01%) behandelt wurden. Sowie sich die Zellen vom Kulturboden ablösten, wurden sie in Zentrifugenröhrchen überführt, die Flaschen mit PBS : Tnpsin-Neutralisierungslösung (Clonetics, San Diego, Calif., USA; 1 : 1 v/v) gespült und die Lösung dann zur Zell-Suspension zugefügt. Das Gesamtvolumen der Suspensionen betrug ungefähr 8 bis 10 ml. Die Zahl an bestimmten Zelltypen wurde in Aliquots dieser Suspensionen mit dem Hämozytometer ermittelt. Es wurden gezählt:

(1) kleine, helle oder dunkle Keratinozyten, als „proliferierend" bezeichnet,
(2) größere, schwammige Keratinozyten mit intrazellulären Struktur-Elementen und
(3) klare, schwammige Zellen ohne Struktur-Elemente.

Nach dem Zählen wurde jede Suspension abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zell-Pellet in 0,5 bis 1,0 ml einer 1% SDS : 2.5 mM DTT-Lösung resuspendiert. Nach 15 min bei 37°C wurde an Aliquots dieser Lösungen gezählt, wie viele unlösliche, verhornte Zellhüllen vorhanden waren. Die Volumina wurden notiert.
In einem nachfolgendem Experiment wurden die Keratinozyten in den Flaschen für 4 Tage nach Aussaat in Medium 154 wachsen gelassen, bevor auf ein stark Kalziumhaltiges Medium ohne Galliummaltol-Zusatz (Kontrolle), beziehungsweise Galliummaltol in Endkonzentrationen von 5 × 10^–5, 1 × 10^–5 oder 1 × 10^–6 M enthaltend, umgestellt wurde. In jeder Gruppe gab es 2–3 Flaschen. Die Kulturen wurden für weitere 3 Tage wachsen gelassen, bevor die Keratinozyten dann geerntet wurden und, wie oben beschrieben, ausgezählt wurden.
Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in 4 gezeigt, die das relative Auftreten von proliferativen, schwammigen und klar schwammigen Zellen illustriert.
Die Daten, die in dieser Abbildung gezeigt werden, belegen, dass es eine moderate Abnahme im Verhältnis proliferativer Zellen gab, eine Zunahme in der Zahl schwammiger Zellen und ungefähr einen zehnfachen Anstieg in der Zahl verhornter Zellhüllen in den Kulturen, die mit 5 × 10^–5 M Galliummaltol behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrolle. Auch nahm die Gesamtzahl der Zellen in dieser Kultur um ungefähr 90% ab.
Diese Ergebnisse zeigen, dass höhere Konzentrationen an Galliummaltol als 1 × 10^–5 sich vorteilhaft auf eine Steigerung der Keratinozyten-Differenzierung auswirken. Weiter zeigen die Ergebnisse, dass bei einer Galliummaltolkonzentration, die höher als 1 × 10^–5 M ist und vorzugsweise mindestens 5 × 10^–5 M ist, eine Inhibierung der Keratinozytenproliferation erreicht wird.
Im Gegensatz dazu war die Zahl der proliferativen, schwammigen und verhornten Zellen in den Kulturen, die 1 × 10^–5 Galliummaltol enthielten, unverändert im Vergleich zur Kontrolle. Die unten aufgeführte Tabelle 1 zeigt diese Ergebnisse für 1 × 10^–5 M.
TABELLE 1
Bei einer Konzentration von 1 × 10^–4 M war die anti-proliferative Wirkung von Galliummaltol so groß, dass die Zahl der Zellen zu klein war, um sie genau zu zählen.
In dem Experiment, bei dem die Keratinozyten für 4 Tage in Kultur gehalten wurden, bevor Galliummaltol in Konzentrationen von 5 × 10^–5 M, 1 × 10^–5 M und 1 × 10^–6 M zugegeben wurde, und dann die Zellen für 3 weitere Tage kultiviert wurden, waren keine signifikanten Unterschiede in der Zell-Differenzierung zu beobachten, wenn das Verhältnis der verschiedenen Zelltypen bestimmt wurde. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2, unten, gezeigt. TABELLE 2

N/D: Nicht bestimmt

Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse wurden die Zellen, die mit Galliummaltol in einer Konzentration von 1 × 10^–6 M behandelt wurden, nicht ausgezählt.
Beispiel 5: Induktion der Apoptose durch Galliummaltol
Die Induktion der Apoptose ist eine kritische Eigenschaft beim programmierten Zelltod, die sich auf Krankheitszustände, wie Krebs, Psoriasis usw. bezieht, wo eine unkontrollierte Proliferation von „unsterblichen" Zellen, wie Keratinozyten, eine kausale Eigenschaft dieser Krankheiten sind. Dieses Beispiel vergleicht die Eigenschaft von Galliummaltol, die Apoptose zu induzieren, mit einer Negativ-Kontrolle (kein Galliummaltol) und einer Positiv-Kontrolle (CAM, ein Reagenz, von dem bekannt ist, dass es sehr stark die Apoptose induzieren kann). Die Eigenschaft von Galliummaltol, die Apoptose zu beeinflussen, wurde auch durch die inhibitorische Wirkung von ATA bestimmt.
Im Besonderen wurden die Keratinozytenzellen in Medium 154 in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 2500 Zellen/cm² ausgesät, wie oben beschrieben. Die Kulturen wurden kontinuierlich für 3–6 Tage wachsen gelassen, bis die Zellen eine Konfluenz von ungefähr 20–60% erreichten. Bei diesen Gegebenheiten wurden die Medien von Gruppen mit 3 oder 4 Vertiefungen abgesaugt und durch ein stark Ca²⁺-haltiges Medium, entweder ohne Zusatz oder mit folgenden Zusätzen, ausgetauscht:

1. Galliummaltol in einer Endkonzentration von einer der folgenden: (a) 5 × 10^–4 M, (b) 1 × 10^–4 M, (c) 5 × 10^–5 M, (d) 1 × 10^–5 M, (e) 1 × 10^–6 M
2. CAM bei 1 × 10^–5 M oder 1 × 10^–6 M
3. ATA bei 10^–4 M
4. wie in (3) plus CAM bei 1 × 10^–5 M oder 1 × 10^–6 M und
5. wie in (3) plus Galliummaltol bei 1 × 10^–4 M oder 2,5 × 10^–4 M

Die Medien wurden erneuert und die Zellen für weitere 24 h kultiviert. Dann wurden die Medien entfernt und verworfen, und die Zellen wurden mit 200 μl pro Vertiefung mit der Lösung, die Bestandteil des Zelltod-Detektionskits ELISA Plus (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Ind., USA, Katalognummer 1774425) ist, versetzt. Aliquots des Lysats (20 μl) von jeder der 2–3 Vertiefungen wurden dann nach Herstellerangaben auf eine Anreicherung von Nukleosomen hin untersucht.
Das Ausmaß der Apoptose, die in den Keratinozyten auftrat, die vor der Behandlung unter unterschiedlichen Bedingungen für 3 Tage kultiviert wurden, ist in 5 gezeigt.
In dieser Abbildung repräsentieren die Säulen die Absorption bei 405 nm (minus der Absorption bei 495 nm) der Substrat-Reaktionsmischungen aus dem Zelltod-Assay, erhalten von den Zellen, die, wie oben beschrieben, mit Medien behandelt wurden, die folgende Zusätze enthielten:

(a) Kontrolle, keine Zusätze
(b) Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M
(c) Galliummaltol in einer Konzentration von 1 × 10^–4 M
(d) Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–5 M
(e) Galliummaltol in einer Konzentration von 1 × 10^–5 M
(f) Galliummaltol in einer Konzentration von 1 × 10^–6 M
(g) 1 × 10^–4 M ATA
(h) 1 × 10^–4 M ATA plus Galliummaltol in einer Konzentration von 1 × 10^–4 M
(i) 1 × 10^–5 M CAM
(j) 1 × 10^–5 CAM plus ATA in einer Konzentration von 1 × 10^–4 M

In 5 stellen die Werte Mittelwerte ± Standardabweichung (N = 2) dar. Je höher die Absorptionsdifferenz zwischen 405 und 492 nm, desto größer war das Ausmaß der Apoptose.
Die in 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M eine 7-fache Steigerung der Apoptose im Vergleich zur Kontrolle induzierte, aber, dass niedrigere Konzentrationen an Galliummaltol keine signifikante Veränderung in der Apoptose bewirkten. Ferner zeigt 5, dass 1 × 10^–5 M CAM die Apoptose stark induzierte und durch 1 × 10^–4 M ATA auf die Hälfte vermindert werden konnte.
Das Ausmaß der auftretenden Apoptose in den Keratinozyten, die vor der Behandlung mit unterschiedlichen Bedingungen für 6 Tage kultiviert wurden, ist in 6 gezeigt. Die längere Kulturdauer wurde verwendet, um eine größere Anzahl an Zellen bereitzustellen. In dieser Abbildung repräsentieren die Säulen die Absorption bei 405 nm (minus der Absorption bei 495 nm) der Substrat-Reaktionsmischungen aus dem Zelltod-Assay, erhalten von den Zellen, die, wie oben beschrieben, mit Medien behandelt wurden, die folgende Zusätze enthielten:

(a) Kontrolle, keine Zusätze
(b) Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M
(c) Galliummaltol in einer Konzentration von 2,5 × 10^–4 M
(d) Galliummaltol in einer Konzentration von 1 × 10^–4 M
(e) Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–5 M
(f) Galliummaltol in einer Konzentration von 2,5 × 10^–4 M plus 1 × 10^–4 M ATA
(g) 1 × 10^–6 M CAM
(h) 1 × 10^–6 CAM plus ATA in einer Konzentration von 1 × 10^–4 M

In 6 stellen die Werte Mittelwerte ± Standardabweichung (N = 3) dar. Je höher die Absorptionsdifferenz zwischen 405 und 492 nm, desto größer war das Ausmaß der Apoptose.
Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M eine 10-fache Steigerung der Apoptose im Vergleich zur Kontrolle induzierte, und, dass niedrigere Konzentrationen an Galliummaltol eine geringere Zunahme an Apoptose bewirkten. Ferner zeigt 6, dass 1 × 10^–6 M CAM die Apoptose stark induzierte und durch 1 × 10^–4 M ATA auf die Hälfte vermindert werden konnte.
Beispiel 6: Vergleich der Apoptose der Keratinozyten durch Galliummaltol, Galliumnitrat und Maltol
Die Apoptose der Keratinozyten wurde bestimmt, um das relative Ausmaß der Apoptose festzustellen, die durch Galliummaltol, Galliumnitrat und Maltol induziert wurden. Im Besonderen wurden die Keratinozyten in Kulturplatten mit 12 Vertiefungen in Medium 154 ausgesät. Die Kulturen wurden dann kontinuierlich für 4 Tage wachsen gelassen und das Medium zu Medium 154 mit 1.2 mM Ca²⁺ gewechselt, entweder ohne Zusätze oder mit einem der folgenden Zusätze:

(a) Kontrolle, keine Zusätze
(b) Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M
(c) Galliumnitrat in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M
(d) Maltol in einer Konzentration von 15 × 10^–4 M
(e) CAM in einer Konzentration von 1 × 10^–6 M

Drei (3) Vertiefungen wurden in jeder Gruppe verwendet. Die Menge an Medium betrug letztlich 300 μl in jeder Vertiefung. Die Kulturen wurden für 2 weitere Tage wachsen gelassen. Dann wurde das Ausmaß der Apoptose ermittelt, wie oben beschrieben, und die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die Säulen zeigen die Absorption bei 405 nm minus der Absorption bei 492 nm. Die Ergebnisse in 7 zeigen, dass Galliummaltol in einer Konzentration von 5 × 10^–4 M eine ungefähr 19-fache Steigerung der Apoptose im Vergleich zur Kontrolle induzierte, aber die Verwendung von entweder Galliumnitrat oder Maltol keine signifikante Auswirkung auf die Apoptose hatte. Diese Ergebnisse passen zu der Schlußfolgerung, dass es das chelierte neutrale Gallium-Maltol, und nicht Gallium oder der Chelator Maltol ist, das die Apoptose in günstiger Weise beeinflußt.
Beispiel 7: Herstellung einer topisch anwendbaren, Galliummaltol enthaltenden, pharmazeutischen Zusammensetzung
Das folgende Beispiel beschreibt eine Methode, die man anwenden kann, um eine hydrophile, pharmazeutische Zusammensetzung, Galliummaltol enthaltend und für eine topische Anwendung geeignet, herzustellen. In diesem Beispiel wird kommerziell erhältliches Aquapor^TM (Beiersdorf, Inc., Norwalk, Conn. USA) als Grundlage der Formulierung verwendet. Diese Formulierung wird zu einer ausreichenden Menge an wässriger Galliummaltol-Lösung gegeben, so dass die Endkonzentration 0,05 Gewichtsprozent Gallium und 7,5 Gewichtsprozent Wasser enthält, basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung. Die Zusammensetzung wird dann bis zur Homogenität vermischt.
Obwohl die vorausgehende Erfindung in einigen Details beschrieben wurde, um sie zu illustrieren, und die Beispiele zum Zweck der Klarheit und des Verständnisses aufgeführt wurden, ist es offensichtlich, dass gewisse Veränderungen und Abweichungen in den Bereich der angehängten Ansprüche fallen.

Claims

Verwendung eines neutralen Galliumchelats von 3-Hydroxy-4-Pyron, das durch die Formel 1 dargestellt wird:
worin jedes R unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ausgewählt ist; zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch Hemmung der Keratinozytenhyperproliferation in Säugetierhaut gelindert werden kann, wobei die besagte Keratinozytenhyperproliferation mit Psoriasis, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis, ekzematöser Dermatitis, seborrhoeischer Dermatitis, Lichen Planus, Hyperkeratose, Erythrokeratoderma, Ichthyose, aktinische Keratose, Basalzellkarzinom oder Schwammzellkarzinom assoziiert ist.
Die Verwendung von Anspruch 1, worin jedes R unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
Die Verwendung von Anspruch 2, worin jedes R unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist.
Die Verwendung von Anspruch 2, worin besagtes 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1 einen einzelnen Alkylsubstituenten an entweder der 2- oder der 6- Position daran aufweist.
Die Verwendung von Anspruch 1, worin besagtes 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1 aus der Gruppe bestehend aus 3-Hydroxy-4-Pyron, 3-Hydroxy-2-Methyl-4-Pyron, 3-Hydroxy-2-Ethyl-4-Pyron und 3-Hydroxy-6-Methyl-4-Pyron ausgewählt ist.
Die Verwendung von Anspruch 5, worin besagtes 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1 3-Hydroxy-2-Methyl-4-Pyron ist.
Die Verwendung von Anspruch 5, worin besagtes 3-Hydroxy-4-Pyron der Formel 1 3-Hydroxy-2-Methyl-4-Pyron ist.
Die Verwendung von Anspruch 1, worin besagtes Galliumchelat von 3-Hydroxy-4-Pyron Galliummaltol ist und in dem Medikament in einer Konzentration von mindestens 10^–4 M vorhanden ist.
Die Verwendung von Anspruch 1, worin besagtes Galliumchelat von 3-Hydroxy-4-Pyron Galliummaltol ist und in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um eine Konzentration von mindestens 10^–4 M von besagtem Galliumchelat in der Haut zu erreichen.
Die Verwendung von Galliummaltol zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch die Hemmung der Keratinozytenhyperproliferation in Säugetierhaut gelindert werden kann.
Die Verwendung von Anspruch 10, worin besagtes Galliummaltol in dem Medikament in einer Konzentration von mindestens 5 × 10^–5 M vorhanden ist.
Die Verwendung von Anspruch 10, worin besagtes Galliummaltol in dem Medikament in einer Menge vorhanden ist, die ausreicht, um eine Konzentration von mindestens 5 × 10^–5 M von besagtem Galliummaltol in der Haut zu erreichen.
Die Verwendung von Anspruch 12, worin besagte Keratinozytenhyperproliferation in Säugetierhaut mit Psoriasis assoziiert ist.
Verwendung eines 3-Hydroxy-4-Pyrons der in Anspruch 1 identifizierten Formel 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die durch die Hemmung der Hyperproliferation von Keratinozyten in Säugetierhaut vor der Entwicklung sichtbarer Läsionen, die mit besagter Hyperproliferation auf Hautflächen assoziiert ist, von denen bekannt ist, dass sie für solche Läsionen anfällig sind, gelindert werden kann.