ES2214635T3 - Uso de compuestos de quelatos de 3-hidroxi-4-pirona para el tratamiento de enfermedades que pueden mejorar inhibiendo la hiperproliferacion de queratinocitos. - Google Patents
Uso de compuestos de quelatos de 3-hidroxi-4-pirona para el tratamiento de enfermedades que pueden mejorar inhibiendo la hiperproliferacion de queratinocitos.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS PARA INHIBIR LA PROLIFERACION DE CELULAS CUTANEAS DE MAMIFEROS, Y EN PARTICULAR LA PROLIFERACION DE QUERATINOCITOS HUMANOS MEDIANTE LA ADMINISTRACION TOPICA DE COMPLEJOS DE GALIO NEUTROS.
Description
Uso de compuestos de quelatos de
3-hidroxi-4-pirona
para el tratamiento de enfermedades que pueden mejorar inhibiendo la
hiperproliferación de queratinocitos.
La invención se refiere, en parte, a la
inhibición de la proliferación celular de la piel de los mamíferos
y, en particular, a la proliferación de los queratinocitos humanos.
Se ha encontrado que la administración tópica de complejos neutros
de galio, cuando se emplea por encima de determinadas
concentraciones, inhibe significativamente la proliferación de los
queratinocitos.
La invención está dirigida también, en parte, al
uso de complejos de galio neutros para el tratamiento o la
prevención de afecciones de enfermedades, tal como la psoriasis, que
se caracterizan por una proliferación excesiva de
queratinocitos.
Las publicaciones, patentes y solicitudes de
patentes que siguen, son citadas en esta descripción como números en
superíndice:
^{1}Warrell, Jr. y cols., Patente de
Estados Unidos núm. 4.529.593 por "Utilización e Sales de Galio
para Tratar Desórdenes de Homeostasis de Calcio", concedida el 16
de Julio de 1985.
^{2}Warrell, Jr. y cols., "El Galio
en el Tratamiento de la Hipercalcemia y de la Metástasis Ósea",
en "Avances Importantes en oncología 1989", DeVita, Jr.,
Editor, J.P. Lippincott Company, Philadelphia, PA.
^{3}Bockman, y cols., Patente de
Estados Unidos núm. 4.704.277 por "Métodos para el Tratamiento de
Desórdenes Óseos", concedida el 3 de Noviembre de
1987.
^{4}Colley, Patente de Estados Unidos
núm. 4.596.710 por "El Cloruro de Galio como Nuevo Medicamento
Anti-Cáncer", concedida el 24 de Junio de
1986.
^{5}Adamson, y cols., "Estudios sobre
la Actividad Antitumoral del Nitrato de Galio
(NSC-15200) y de Otras Sales de Metales del Grupo
IIIa", Apuntes de Quimioterapia, Parte 1,
59:599-610 (1975)
^{6}Bockman, y cols., Publicación de
Solicitud de Patente Internacional núm. WO 91/10437, por "Métodos
de Incremento de la Curación de Heridas y de Reparación Tisular",
publicada el 25 de Julio de 1991.
^{7}Whitacre, y cols., "Supresión de
Encefalomielitis Autoinmune Experimental mediante Nitrato de
Galio", J. Neuroimmuno., 39:175-182
(1992).
^{8}Matkovic, y cols., Patente de
Estados Unidos núm. 5.175.006 por "Método de Tratamiento de la
Artritis con la Utilización de Compuestos de Galio", concedida el
29 de Diciembre de 1992.
^{9}Matkovic, y cols., "El Galio
Evita Artritis Adyuvante en Ratas e Interfiere con la Función
Macrófaga/Células-T en la Respuesta Inmune",
Current Therap. Res., 50(2):255-267
(1991).
^{10}Bernstein, Patente de Estados
Unidos núm. 5.258.376 (1993) por "Composiciones Farmacéuticas de
Complejos de Galio de
3-Hidroxi-4-Pironas",
concedida el 2 de Noviembre de 1993.
^{11}Wilkinson, y cols., "El Factor
de Crecimiento de Nervios Incrementa la Mitogenicidad de
Determinados Factores de Crecimiento para los Queratinocitos
Cultivados Humanos: Una Comparación con el Factor de Crecimiento
epidérmico", Exper. Dermatol.,
3:239-245 (1994).
^{12}Landegren, "Medición del Número
de Células por medio de la Hexosaminidasa de Enzima Endógena.
Aplicaciones a la Detección de Linfocinos y de Antígenos
Superficiales de la Célula", J. Immunol. Methods,
67:379-388 (1984).
Se ha descrito en el estado de la técnica que las
sales de galio son útiles para el tratamiento de muchas enfermedades
del ser humano y de otros mamíferos, incluyendo la hipercalcemia, el
cáncer y determinadas enfermedades degenerativas o metabólicas de
los huesos tales como la osteoporosis y la enfermedad de Paget.
También se ha descrito el Galio^{1-5} para imitar
la acción molecular de transformación del
factor-\beta del crecimiento, incluyendo la
estimulación del crecimiento de queratinocitos en la piel en bajas
concentraciones, encontrando con ello utilidad en la promoción de la
curación de heridas y en la reparación del tejido^{6}. Otros usos
del galio sobre los que se ha informado, incluyen la supresión de la
encefalomielitis experimental autoinmune^{7}; la prevención de la
artritis reumatoide^{8}; y la interferencia con la función
macrófaga/células T en la respuesta inmune^{9}.
En tales tratamientos, parece que el galio en sí
mismo es el agente activo; la forma en que se administra el galio
(por ejemplo, como nitrato, sulfato, o cloruro), no parece afectar a
su actividad^{2, 5, 6}.
La administración oral de sales de galio se
encuentra descrita en el estado de la técnica de modo que se
requieren altas dosis de la sal de galio para alcanzar los niveles
requeridos de galio en sangre. ^{1,3} Bernstein^{10}, sin
embargo, describe que los complejos neutros de galio
3-hidroxi-4-pirona
proporcionan una biodisponibilidad de galio incrementada cuando se
administran por vía oral.
El documento WO 9110437 describe compuestos de
galio, incluyendo complejos de coordinación de galio y de pironas,
incluyendo el maltol galio, los cuales se ha descubierto que ejercen
efectos beneficiosos sobre los osteoblastos, los fibroblastos y los
queratinocitos. Este documento pone de manifiesto el hecho de que
los compuestos de galio son útiles para el tratamiento de desórdenes
dermatológicos (por ejemplo, heridas, acné, envejecimiento, daños
por UV y quemaduras), de modo que pueden acelerar la reparación y
curación de heridas y ayudar así a mantener la suavidad y plenitud
del tejido. También muestra el hecho de que el nitrato de galio
puede incrementar la proliferación de queratinocitos y acelerar con
ello la curación de la herida.
No obstante lo anterior, una base clínica de
determinadas enfermedades de los mamíferos consiste en la
proliferación excesiva de queratinocitos. En la piel normal, la
regeneración continua de la capa epidérmica está controlada por la
producción limitada de queratinocitos en la que una parte de estos
queratinocitos se diferencian después y se mueven hasta la parte
superior de la piel, donde resultan cornificados y mueren. Estas
células muertas se desprenden eventualmente de la piel y el proceso
completo se produce en un período de aproximadamente 28 a 30
días.
Sin embargo, la psoriasis está caracterizada por
una proliferación excesiva de queratinocitos epidérmicos con una
reducción correspondiente de diferenciación celular. Las células
típicamente se mueven hasta la parte superior de la piel en
solamente alrededor de tres a seis días. Esta acumulación excesiva
de células de la piel, que forman lesiones escamosas elevadas rojas
características de la psoriasis, están habitualmente cubiertas por
parches escamosos blancos de células de piel muertas. El efecto
global de esta afección consiste en una desfiguración y escamosidad
antiestética, y a veces crea zonas de picazón en el cuerpo que se
localizan principalmente en el torso, los codos, etc, pero que
pueden aparecer en cualquier otra zona de la piel y que pueden, en
casos graves, cubrir amplias zonas corporales.
La presente invención está basada en el
descubrimiento de que los quelatos de galio neutros, a
concentraciones suficientemente altas, inhiben la proliferación de
los queratinocitos y por lo tanto son útiles para el tratamiento o
prevención de las afecciones de enfermedad asociadas a la
hiperproliferación de células de la piel, en particular en aquella
afección de enfermedades asociadas a la hiperproliferación de
queratinocitos. Tal afección de enfermedades asociadas a la
hiperproliferación de queratinocitos, de particular interés en este
caso, son la psoriasis, la dermatitis atópica, la dermatitis de
contacto, la dermatitis eccematosa, la dermatitis seborreica, y el
planus de Lichen. Las composiciones farmacéuticas tópicas de la
invención son también útiles para la prevención o el tratamiento de
otras afecciones de la piel asociadas a la hiperproliferación de
queratinocitos, incluyendo por ejemplo: la hiperqueratosis, la
eritroqueratoderma, la ictiosis, la queratosis actínica, el acné, el
carcinoma celular basal, y el carcinoma celular escamoso.
Con relación a la afección psoriática, la
evidencia sugiere que, en algunos casos, la psoriasis es una
enfermedad autoinmune y, en consecuencia, algunos investigadores han
sugerido que podrían resultar útiles terapias tales como la
administración de inmunomoduladores hacia los macrófagos y los
linfocitos T. A este respecto, las sales de galio tales como el
nitrato de galio, han sido descritas como útiles en la inhibición de
la encefalomielitis^{7} autoinmune experimental, y en la
prevención de artritis reumatoide^{8}. Sin embargo, no existe
correlación reconocida entre la actividad inmunomoduladora y la
inhibición de la proliferación de queratinocitos. Además, los datos
que aquí se presentan demuestran la inhibición de la proliferación
de queratinocitos mediante quelatos neutros de galio en ausencia de
linfocitos T, macrófagos, y otras células de este tipo del sistema
inmune.
Esta invención está dirigida al descubrimiento de
que ciertos quelatos neutros de galio, cuando se utilizan a
concentración suficiente, inhiben la proliferación de
queratinocitos. En consecuencia, dichos quelatos pueden ser
utilizados para tratar afecciones de enfermedades caracterizadas por
una proliferación excesiva de queratinocitos, tal como la
psoriasis.
Sorprendentemente, aunque no estando limitados a
ninguna teoría, los datos que siguen sugieren que la porción activa
es el complejo de galio quelatado en vez del galio elemental y/o el
quelador no enlazado. Los datos que siguen sugieren además que
mientras los quelatos neutros de galio están capacitados para
inhibir la proliferación de queratinocitos, otros compuestos de
galio, tal como el nitrato de galio, no lo están.
En vista de lo anterior, en uno de sus aspectos
de método, la invención está dirigida a un método para inhibir la
proliferación de queratinocitos en la piel de los mamíferos, cuyo
método comprende:
(a) identificar lugares de proliferación excesiva
de queratinocitos en la piel del mamífero, y
(b) aplicar a los lugares identificados en (a),
una composición farmacéutica tópica que comprende un excipiente
farmacéuticamente aceptable que sea adecuado para aplicación tópica,
y una cantidad efectiva de una
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula:
para inhibir la proliferación de queratinocitos,
y
donde cada R se elige independientemente del
grupo consistente en hidrógeno y alquilo de 1 a 6 átomos de
carbono.
Adicionalmente, los quelatos de galio neutros de
esta invención pueden ser utilizados profilácticamente. En tales
métodos, la piel susceptible a afecciones asociadas a la
hiperproliferación de queratinocitos se trata con anterioridad a
cualquier lesión visible sobre áreas que se sabe que son
susceptibles a tales lesiones en un individuo en particular. Cuando
se emplean de ese modo, los métodos de la invención comprenden:
- (a)
- identificar los lugares de la piel que están exentos de lesiones visibles, pero que son propensos a lesiones asociadas a la proliferación de queratinocitos, y
- (b)
- aplicar a los lugares de la piel identificados en (a), una composición tópica farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, adecuado para aplicación tópica, y una cantidad efectiva de 3-hidroxi-4-pirona de fórmula 1 según se ha identificado en lo que antecede.
En uno de sus aspectos de composición, esta
invención está dirigida a una composición farmacéutica tópica que
comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para
aplicación tópica, y una cantidad efectiva de una
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula 1:
para inhibir la proliferación de queratinocitos,
y
en la que cada R se elige independientemente del
grupo consistente en hidrógeno y alquil de entre 1 y 6 átomos de
carbono.
Con preferencia, en el compuesto de fórmula 1 que
antecede, cada R es, independientemente, hidrógeno o alquil de 1 a 2
átomos de carbono, e incluso de manera más preferible, cada R es
independientemente hidrógeno o metilo.
Sorprendentemente, los datos que siguen
demuestran que, a concentraciones altas, los complejos de galio
neutros de fórmula 1 que antecede, promueven también la
diferenciación de queratinocitos y la apóptosis. Tales propiedades
conducen además a la enseñanza de tales complejos neutros de galio
en el tratamiento de la psoriasis y de otros desórdenes asociados a
una proliferación excesiva de células de la piel, en particular a
los desórdenes asociados a una proliferación excesiva de
queratinocitos.
La Figura 1 ilustra los efectos sobre el
crecimiento de queratinocitos de diferentes concentraciones de
maltol galio utilizando el método violeta de cristal para determinar
el crecimiento celular;
La Figura 2 ilustra los efectos sobre el
crecimiento de los queratinocitos, en presencia de diferentes
concentraciones de maltol galio, al utilizar el método de
hexosaminidasa para determinar el crecimiento celular;
La Figura 3 ilustra el efecto sobre la
proliferación de queratinocitos mediante concentraciones de 1 x
10^{-4} M de maltol galio (GaM) y de nitrato de galio (Ga), y de 3
x 10^{-4} M de maltol (M);
La Figura 4 ilustra el porcentaje de ocurrencia
de queratinocitos proliferativos (barras blancas), escamosos con
estructura intracelular (barras sombreadas), y escamosos claros
(barras negras), en el crecimiento de cultivos en presencia de
maltol galio (5 x 10^{-5} M). Los valores significan \pm
desviaciones estándar de 3 frascos en cada caso;
La Figura 5 ilustra la cantidad de apóptosis en
queratinocitos cultivados durante 3 días con anterioridad a su
exposición a diferentes concentraciones de maltol galio; diferentes
concentraciones de CAM; una concentración de ATA de 1 x 10^{-4} M;
una concentración de ATA de 1 x 10^{-4} M más CAM a 1 x 10^{-5}
o 1 x 10^{-6} M; y una concentración de ATA de 1 x 10^{-4} más
maltol galio a 1 x 10^{-4} ó 2,5 x 10^{-4} M;
La Figura 6 ilustra la cantidad de apóptosis en
queratinocitos como en la Figura 5, salvo en que las células fueron
cultivadas durante 6 días, y
La Figura 7 compara la cantidad de apóptosis en
queratinocitos en presencia de maltol galio, nitrato de galio o
maltol.
Según se indicó anteriormente, esta invención
está dirigida, en parte, a la inhibición de la proliferación de
queratinocitos en mamíferos y, en particular, a la proliferación de
queratinocitos humanos por la administración tópica de complejos
neutros de Galio de la fórmula I anterior. No obstante, con
anterioridad a discutir esta invención en más detalle, se definirán
primero lo siguientes términos:
Según se utiliza aquí, los términos que siguen
tienen las siguientes definiciones:
El término "queratinocitos" se refiere a
células de la piel que tienen la capacidad de producir queratina,
incluyendo, por ejemplo, células conocidas como células basales,
células espinales, células espinosas, y células granulares, así como
también todas las variantes menos diferenciadas y más diferenciadas
de la misma línea celular, tanto normales como anormales.
El término "complejo de galio 3:1 neutro de
3-hidoxi-4-pirona"
se refiere a un complejo electrostáticamente neutro de Ga^{+3} y 3
equivalentes de la forma aniónica de la
3-hidroxi-4-pirona
cuyo complejo está representado por la fórmula
[Ga^{+3}(py^{-1})_{3}], en la que py^{-1}
representa la forma aniónica de la
3-hidroxi-4-pirona
que se define más adelante. Puesto que tales complejos no se
disocian en una cantidad significativa en composiciones acuosas
mantenidas a un pH desde alrededor de 5 hasta alrededor de 9, estos
complejos se mantienen principalmente de forma electrostáticamente
neutra en tales composiciones.
A este respecto, estos complejos se estima que
son "electrostáticamente neutros" debido a que existe igual
número de cargas positivas y negativas en el complejo, los cuales no
se disocian fácilmente en sus componentes aniónico y catiónico.
También, resulta evidente que la forma aniónica
del
3-hidroxi-4-pirona
actúa como agente quelante para el galio, y como tal, el complejo se
cita aquí a veces como "quelatos de galio neutros de
3-hidroxi-4-pironas".
Se entiende que este último término es sinónimo del término
"complejo de galio 3:1 neutro de una
3-hidoxi-4-pirona".
El término "una
3-hidroxi-4-pirona"
se refiere a un compuesto de fórmula 2:
en la que, de ninguno a tres de los átomos de
carbono unidos a los átomos de carbono del anillo, son sustituidos
por un grupo hidrocarburo de uno a seis átomos de
carbono.
El término "excipiente farmacéuticamente
aceptable" incluye uno o más excipientes aceptables para su uso
en la composición farmacéutica.
Los compuestos específicos abarcados por el
término "una
3-hidroxi-4-pirona"
están representados por las fórmulas 3-6 que
siguen:
en las que cada R es, independientemente, un
hidrocarburo de 1 a 6 átomos de
carbono.
La forma no sustituida de la
3-hidroxi-4-pirona
(Fórmula 3, también llamada ácido piromecónico), contiene tres
átomos de hidrógeno que están enlazados solamente a los átomos de
carbono del anillo. Según se ha indicado en lo que antecede,
cualquier combinación de estos tres átomos de hidrógeno puede ser
sustituida por un grupo hidrocarburo, y todas las combinaciones
posibles de tales sustituciones están abarcadas por esta invención.
Las posiciones de unas pocas sustituciones posibles han sido
presentadas mediante las fórmulas 4 - 6, en las que R es un grupo
hidrocarburo (incluyendo metil, etil, isopropil, y
n-propil). Los grupos hidrocarburo son con
preferencia acíclicos, y con preferencia no ramificados. Los grupos
que contienen seis o menos átomos de carbono, en particular de uno a
tres átomos de carbono, especialmente metil o etil, son los
preferidos. Se prefiere la sustitución simple; se prefiere una
sustitución en la posición 6, o especialmente en la posición 2.
Algunos ejemplos de compuestos específicos cuyos complejos de galio
pueden ser utilizados en las composiciones comprendidas por la
invención, son:
3-hidroxi-2-metil-4-pirona
(Fórmula 4, R = -CH_{3} - - citada a veces como maltol o ácido
larixínico) y
3-hidroxi-2-etil-4-pirona
(Fórmula 4, R = -C_{2}H_{5} - - citada a veces como etil maltol
o ácido etilpiromecónico), siendo ambas las preferidas para su uso
en esta invención, especialmente la
3-hidoxi-2-metil-4-pirona.
Otros compuestos preferidos incluyen la
3-hidroxi-4-pirona
(Fórmula
3 - - citada a veces como ácido piromecónico); y la 3-hidroxi-6-metil-4-pirona (Fórmula 5, R = -CH_{3}).
3 - - citada a veces como ácido piromecónico); y la 3-hidroxi-6-metil-4-pirona (Fórmula 5, R = -CH_{3}).
El término "un anión de una
3-hidroxi-4-pirona"
se refiere a un compuesto definido en las fórmulas 3 - 6 que
anteceden, en las que el protón hidroxil ha sido eliminado con el
fin de proporcionar una forma de estos compuestos cargada
aniónicamente.
El término "maltol galio" se refiere a un
complejo de galio 3:1 neutro de maltol.
El término "inhibir la proliferación de
queratinocitos" significa que, en comparación con el control, la
proliferación de queratinocitos se reduce al menos en el 20% en el
ensayo in vitro que sigue cuando el ensayo se realiza
mediante protocolo de coloración violeta de cristal. Con
preferencia, la proliferación de queratinocitos se reduce al menos
en un 35%, y más preferiblemente al menos en un 50% en comparación
con el control.
Los métodos para la preparación de los complejos
de galio 3:1 neutros de
3-hidroxi-4-pirona o
3-hidroxi-4-pironas,
en las que entre uno y tres átomos de hidrógeno enlazados a los
átomos de carbono del anillo se sustituyen por un grupo hidrocarburo
que contiene de uno a seis átomos de carbono, se encuentran
expuestos en Bernstein^{10}. Tales métodos comprenden hacer
reaccionar tales hidroxipironas con iones de galio y aislar, al
menos en parte, el complejo o complejos resultante(s).
Específicamente, el complejo de galio 3:1 neutro
de 3-hidoxi-4-pirona
se prepara mediante la reacción de iones de galio con las
3-hidoxi-4-pironas
en solución. Los iones de galio pueden ser obtenidos a partir de una
sal de galio, tal como un haluro de galio, en particular cloruro de
galio, o un compuesto de nitrato de galio, especialmente un nitrato
de galio hidratado. Los compuestos de nitrato de galio son
frecuentemente los más preferidos, puesto que es más fácil trabajar
con ellos que con los haluros de galio, los cuales pueden ser
altamente irritantes y pueden reaccionar violentamente con muchos
disolventes, incluyendo el agua. Utilizando las protecciones
apropiadas, se pueden utilizar una diversidad de sales de galio. La
reacción se efectúa ventajosamente en un disolvente mutuo, que
incluye, aunque sin limitación, mezclas que contienen agua, etanol,
metanol, y cloroformo. Se puede utilizar agua pura en muchos casos,
aunque la purificación de los complejos de hidroxipirona de galio
puede resultar muy difícil, en caso de que se utilice. Un método
preferido, si se desea separar al menos una parte importante de los
subproductos de reacción tales como el nitrato de sodio, el cloruro
de sodio, y los carbonatos de sodio, consiste en utilizar una mezcla
que contiene partes aproximadamente iguales de etanol y de
cloroformo, con algo de agua. Los subproductos de reacción
mencionados anteriormente tienen solubilidades muy bajas en esta
mezcla, y pueden ser eliminados fácilmente mediante filtrado.
Para producir el complejo neutro de
hidroxipirona: galio 3:1, la hidroxipirona y los iones de galio se
mezclan en proporciones molares de 3:1, con preferencia con un
ligero exceso de hidroxipirona para asegurar una gran preponderancia
del complejo 3:1 sobre los complejos 2:1 y 1:1. Las proporciones de
los complejos particulares formados, dependen del pH de la solución.
Cuando una sal de galio, tal como un haluro o un nitrato, se
disuelve, la solución resultante tendrá, por lo general, un pH bajo.
Para formar una preponderancia del complejo 3:1 neutro preferido, se
utiliza un pH de 5 a 9, con preferencia de 6 a 7. Si se utiliza una
solución más acídica, el complejo neutro 3:1 no puede ser estable,
incluso aunque se encuentre presente un exceso grande de
hidroxipirona. Bajo afecciones altamente básicas, los hidróxidos de
galio pobremente solubles pueden precipitar. Es preferible regular
el pH con materiales distintos de hidróxidos tales como el hidróxido
de sodio, puesto que el uso de tales hidróxidos puede ocasionar la
precipitación de hidróxidos de galio pobremente solubles, que no se
desea, y el pH puede ser realmente amortiguado a bajo nivel mediante
esta precipitación. El uso de un carbonato, especialmente carbonato
de sodio, se prefiere para regular el pH. El uso de carbonato de
sodio en una mezcla de disolvente que contenga etanol y cloroformo,
por ejemplo, puede dar como resultado la precipitación de nitratos
de sodio que son muy ligeramente solubles en esta mezcla, y que
pueden ser filtrados si se desea ayudar a purificar la solución que
contiene las composiciones farmacéuticas deseadas.
La reacción para formar el complejo de
hidroxipirona-galio en solución, se completa por lo
general en alrededor de cinco minutos a alrededor de 20ºC. La
agitación suave u otro tipo de agitación de la solución, promueve
una reacción rápida, uniforme. Se puede hacer uso de tiempos de
reacción más largos si se estima necesario. A continuación de la
separación, si se desea, de los sub-productos de
reacción tales como el nitrato de sodio, cloruro de sodio, y
carbonatos de sodio (dependiendo de los disolventes y de los
reactivos utilizados), la mezcla de reacción puede ser evaporada
lentamente en aire, o de forma más rápida, mediante el uso de un
evaporador giratorio o mediante secado por congelación, por citar
algunos ejemplos. Tras el secado, el complejo o los complejos de
galio, permanecerá(n) en forma sólida. La recristalización puede ser
llevada a cabo, si se desea, utilizando un disolvente adecuado,
incluyendo aunque sin limitación alguna, el cloroformo, alcoholes
tales como etanol y metanol, éter, agua, acetona y mezclas que
contienen a tales disolventes. Los disolventes adecuados dependerán
de qué complejo(s) particular(es) e impurezas esté(n)
presente(s), de las impurezas que hayan de ser separadas, y
de la temperatura y de otras afecciones físicas.
Se aprecia que los métodos mencionados no son los
únicos que pueden producir hidroxipironas y complejos de galio con
hidroxipironas, y que se pueden utilizar diversos métodos
alternativos, como resultará evidente para los expertos en la
materia. Adicionalmente, para la preparación de complejos neutros
3:1 de galio con
3-hidroxi-4-pirona,
se puede utilizar una
3-hidroxi-4-pirona
simple o una mezcla de
3-hidroxi-4-pironas.
Sin embargo, con preferencia, solamente se emplea una única
3-hidroxi-4-pirona.
Con relación a la preparación de las
3-hidroxi-4-pironas
que se utilizan como materiales de partida en la preparación de
complejos neutros 3:1 de galio con
3-hidroxi-4-pironas,
algunos de estos compuestos se producen de forma natural y pueden
ser obtenidos por extracción a partir de fuentes naturales. Por
ejemplo, el maltol se encuentra en la corteza del alerce joven
(Larix decidua Mill.), y en las agujas del pino, la achicoria, los
aceites y alquitranes de madera, y la malta asada^{12}. Algunas de
las
3-hidroxi-4-pironas
se encuentran disponibles comercialmente, incluyendo el maltol y el
etil maltol. Se pueden realizar otras a partir del ácido
piromecónico como material de partida, el cual puede ser extraído a
partir de la descarboxilación del ácido mecónico. Los métodos de
preparación de dichas
3-hidroxi-4-pironas
son bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, se aprecia que el
maltol y el etil maltol son de amplio uso como agentes saborizantes
y de incremento de la fragancia para los productos comestibles, y
tienen toxicidades muy bajas cuando se toman oralmente.
Los complejos neutros de galio de la
3-hidroxi-4-pirona
se formulan en composiciones farmacéuticas tópicas mediante métodos
convencionales bien conocidos en la técnica. Tales composiciones
tópicas comprenden composiciones que están previstas solamente para
su aplicación sobre la piel, contrariamente a otros medios de
suministro tales como las composiciones farmacéuticas parenterales,
las composiciones farmacéuticas suministrables oralmente, y
similares. Las composiciones farmacéuticas tópicas preferidas
incluyen, a título de ejemplo, uno o más excipientes
farmacéuticamente aceptables que son adecuados para aplicación
tópica, y una cantidad efectiva de
3-hidroxi-4-pirona
de la fórmula I que antecede. Las composiciones adecuadas incluyen,
a título de ejemplo, polvos, geles, lociones, cremas, ungüentos,
preparaciones hidrofílicas, champúes, etc.
Los polvos son antipruríticos y tienen un efecto
refrigerante. El talco, que se encuentra en muchos polvos, es el más
lubricante, pero no es absorbente. El almidón de maíz es menos
lubricante, pero es absorbente.
Las lociones son suspensiones de un polvo en agua
que proporcionan un secado protector y un efecto refrigerante. Según
se evapora el agua, se produce el secado y la refrigeración, y se
deja una película de polvo. Las lociones son especialmente útiles en
las zonas con cabello y con pliegues en la piel. Los emolientes son
lociones que contienen grasas y aceites que lubrican y suavizan la
piel irritada.
Cremas y emulsiones de aceite en agua. Las cremas
son lavables en agua y absorbidas completamente por la piel. Según
se reduce la cantidad de agua y se incrementa la cantidad de aceite,
las sustancias se hacen más viscosas y son clasificadas como
ungüentos (es decir, emulsiones de
aceite-en-agua). Los tres tipos de
ungüentos son solubles en agua, emulsificables y repelentes del
agua. Los ungüentos pueden ser utilizados como bases o lubricantes.
Los ungüentos son lubricantes más efectivos que el aceite en las
cremas acuosas. Sin embargo, los ungüentos son oclusivos y no están
recomendados para las zonas sudorosas o infectadas. Las lociones y
las cremas son apropiadas para lesiones goteantes, y los ungüentos
son apropiados para las lesiones secas.
Las preparaciones hidrofílicas son preparaciones
que absorben el agua e incluyen, a título de ejemplo, preparaciones
disponibles comercialmente tales como Eucerin® (Beiersdorf, Inc.,
Norwalk, Connecticut, USA), Aquaphor® (Beiersdorf, Inc., Norwalk,
Connecticut, USA), Lubridem® (Warner Lambert Company, Morris Plains,
NJ), y lanolina anhidra.
Los champúes son composiciones acuosas que
comprenden una o más sales de ácido graso (jabón) y otros aditivos
opcionales tales como perfumes, medicamentos, etc.
En cualquier caso, la cantidad de complejo neutro
de galio incorporado en la composición farmacéutica es una cantidad
suficiente como para inhibir la proliferación de queratinocitos. Con
preferencia, según se muestra en lo que sigue, una concentración de
al menos 5 x 10^{-5} M para el complejo de galio neutro en la
piel, es suficiente para proporcionar inhibición de proliferación de
queratinocitos. Con preferencia, la composición farmacéutica
proporciona una concentración de al menos 5 x 10^{-5} M del
complejo neutro de galio a la piel. Un medio para estimar la
concentración requerida del complejo neutro de galio en la
formulación farmacéutica tópica que se necesita para alcanzar tal
concentración en la piel, consiste en estimar primero el volumen de
piel que se ha de tratar. Por ejemplo, el espesor de la epidermis y
de la dermis papilar es típicamente de alrededor de 0,04 cm en los
humanos (está comprendido en la gama de alrededor de 0,01 cm en el
párpado hasta alrededor de 0,1 cm en la planta del pie). El volumen
de piel en la zona de tratamiento, se calcula fácilmente,
multiplicando el espesor estimado por el área superficial de la piel
que ha de recibir la composición farmacéutica tópica. Utilizando
este valor para el volumen de piel que ha de ser tratada, la
concentración de complejo neutro de galio en la composición
farmacéutica tópica requerida para suministrar cualquier
concentración deseada de complejo de galio neutro, se calcula
fácilmente. Por ejemplo, para suministrar una concentración de
10^{-4} M de maltol galio de complejo neutro de galio (GaM) a un
parche de piel que tenga un área superficial de 75 cm^{2} y un
espesor de 0,04 cm (y por tanto un volumen de 3 cm^{3}), alrededor
de 0,13 mg de GaM (peso molecular: 445,03) es lo que se necesita
(aprox. 445,03 mg/cm^{3}/mol x 10^{-4} moles x 3 cm^{3}). Si
en 1 g de composición farmacéutica tópica se encuentra presente 0,13
mg de GaM, entonces la concentración de GaM es de alrededor de 0,013
en porcentaje en peso (p/p). Con preferencia, los quelatos de galio
neutros comprenderán entre alrededor de 0,0001 y alrededor de 5 por
ciento en peso de la composición farmacéutica tópica en base al peso
total de la composición, y más preferiblemente entre alrededor de
0,005 y alrededor de 0,5 por ciento en peso.
Las composiciones farmacéuticas tópicas de esta
invención son útiles para el tratamiento de afecciones de
enfermedades provocadas por una proliferación excesiva de células de
la piel, en particular aquellas afecciones de enfermedades asociadas
a la hiperproliferación de queratinocitos. Tales afecciones de
enfermedades asociadas a la hiperproliferación de queratinocitos que
aquí son de interés particular, son la psoriais, la dermatitis
atópica, la dermatitis de contacto, la dermatitis eccematosa, la
dermatitis seborreica, y el Lichen planus.
Las composiciones farmacéuticas tópicas de la
invención son también útiles para evitar o tratar otras afecciones
de la piel asociadas a la hiperproliferación de queratinocitos,
incluyendo como ejemplos: la hiperqueratosis, eritroqueratoderma,
ictiosis, queratosis actínica, acné, carcinoma celular basal, y
carcinoma celular escamoso. Las enfermedades asociadas a la
hiperproliferación de células de otras líneas celulares, tal como,
por ejemplo, los mastocitos, melanocitos, fibroblastos, células de
Langerhans, células endoteliales, células epiteliales, células
nerviosas, y células de Markel, pueden ser también tratadas mediante
la presente invención.
Cuando se emplea de este modo, una cantidad
efectiva de la composición farmacéutica se aplica a la zona afectada
al menos una vez al día, y con preferencia de 1 a 3 veces al día. La
dosis específica empleada está regulada por la afección particular
que ha de ser tratada, así como también por el juicio del
facultativo que presta la atención dependiendo de factores tales
como la gravedad de la afección, la edad y la condición general del
paciente, y similares. En una realización preferida, el tratamiento
de la psoriasis emplea una concentración de quelato de galio neutro
de
3-hidroxi-4-pirona
en la composición farmacéutica suficiente para proporcionar una
concentración en la disolución de al menos alrededor de 5 x
10^{-5} M.
Según se aprecia en los ejemplos que siguen, las
concentraciones relativamente altas de quelatos de galio neutros en
las composiciones de esta invención, imparten también apóptosis a
las células y, en el caso de los queratinocitos, facilitan la
diferenciación celular. Ambas propiedades ilustran además el uso
beneficioso de tales composiciones en el tratamiento de la psoriasis
y otros desórdenes asociados a la excesiva proliferación de células
de la piel, en particular los desórdenes asociados a una
proliferación excesiva de queratinocitos.
Los ejemplos que siguen se exponen para ilustrar
la invención reivindicada.
A menos que se indique otra cosa, todas las
temperaturas son en grados Celsius. También, en estos ejemplos, a
menos que se indique después otra cosa, las abreviaciones que se
utilizan tienen los significados propios aceptados en general:
| A | = | angstroms |
| ATA | = | ácido aurin tricarboxílico |
| CAM | = | camptotecina |
| cm | = | centímetros |
| DDT | = | ditiotreitol |
| HKGS | = | suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (disponible en Cascade Biologics, |
| Portland, Oregón, USA) | ||
| M | = | Molar |
| mg | = | miligramos |
| ml | = | mililitro |
| mM | = | milimolar |
| nm | = | nanometros |
| PBS | = | fosfato amortiguado salino |
| SDS | = | dodecil sulfato de sodio |
| \mul | = | microlitros |
| \mum | = | micra |
| v/v | = | volumen sobre volumen |
| p/v | = | peso sobre volumen |
| p/p | = | peso sobre peso |
En los ejemplos que siguen, el medio 154 de
cultivo se refiere a un medio de cultivo utilizado como componente
de un entorno de cultivo completo para el crecimiento de
queratinocitos epidérmicos humanos normales, que se encuentra
comercialmente disponible en, por ejemplo, Cascade Biologics,
Portland, Oregón, USA, con el número de catálogo
M-154-100.
El maltol se disuelve en cloroformo para formar
una disolución 0,75 M, y el nitrato de galio nonohidrato se disuelve
en etanol para formar una disolución 0,5 M. A 20 ml de la solución
de maltol 0,75 M, se añaden lentamente, con agitación continua, 10
ml de la disolución de nitrato de galio nonohidrato 0,5 M. La
solución resultante se agita durante 5 minutos a 23ºC. Se añaden
aproximadamente 5,5 g (un gran exceso) de Na_{2}CO_{3} en polvo
con agitación para elevar el pH hasta cerca de 7. Cuando se añade el
carbonato de sodio, puede ser necesario a veces añadir algo de agua
para facilitar la reacción, lo que se evidencia mediante algo de
efervescencia. La agitación continúa después durante diez minutos
adicionales. La mezcla se filtra para eliminar todos los sólidos, y
el filtrado se evapora en un evaporador giratorio. El sólido
cristalino restante es la composición de maltol: galio 3:1. Esta
composición se analiza utilizando difracción de rayos X con polvo, y
se ha encontrado que consiste en cristales ortorrómbicos con unas
dimensiones celulares unitarias de alrededor de a = 18,53(1)
A, b = 16,96(1) A, c = 12,05(1) A. La cristalización a
partir de otros disolventes o bajo otras afecciones, puede producir
otras estructuras cristalinas. Se contempla el hecho de que las
estructuras amorfas pueden ser utilizadas también en los métodos y
composiciones de esta invención.
Bajo ciertas afecciones, se puede incorporar
también agua a la estructura. La solubilidad de esta composición se
mide como de aproximadamente 24 milimolar en agua destilada
desionizada a 23ºC. El complejo puede ser recristalizado a partir de
etanol o de otros disolventes para incrementar la pureza.
El complejo de maltol galio de este ejemplo es
una estructura completamente quelatada que a veces se cita como
quelato neutro puesto que la carga de galio está apantallada por
tres grupos maltol.
Se obtuvieron queratinocitos de adulto humano a
partir de la piel de un donante a partir de fuentes comerciales
(Cascade Biologics, Portland, Oregón, USA), y se colocaron en la
zona inferior de frascos de cultivo con la utilización de un medio
154 de cultivo suplementado con HKGS (alrededor del 1%). A una
confluencia del 80%, las células fueron recogidas con tripsina y
crio-conservadas hasta que se necesitaron.
Al comienzo de los experimentos, se desheló el
número de viales de queratinocitos requeridos, y los queratinocitos
se pusieron en cultivo en 24 placas de crisol a razón de alrededor
de 2.500 células/cm^{2} utilizando el mismo medio de cultivo que
se ha descrito anteriormente. Después de 24 horas (para permitir la
fijación), el medio se cambió a uno nuevo 154 suplementado con HKGS
(alrededor del 1%) y maltol galio. Específicamente, el nuevo medio
fue preparado con la adición de una cantidad suficiente de solución
patrón para proporcionar seis composiciones diferentes que tenían
una concentración final de galio de 10^{-4} M, 10^{-5} M,
10^{-6} M, 10^{-8} M, 10^{-10} M y 10^{-12} M. La solución
patrón fue preparada mediante la adición de 22,25 mg de maltol galio
a 50 ml de medio 154, y haciendo pasar después la solución a través
de un filtro de 0,2 \mum y almacenándola a 4ºC.
Los medios fueron sustituidos cada 2 ó 3 días.
Las células de control no recibieron nada de maltol galio.
Cuando las células de control fueron
aproximadamente un 40% confluentes (por lo general, en
4-5 días de cultivo), fueron retirados todos los
medios por aspiración, se ensayó el crecimiento de queratinocitos
por tintado g violeta de cristal, y la conversión en números de
células se hizo como se encuentra descrito en Wilkinson, y
cols.^{11}. Específicamente, las capas de células se lavaron en
PBS, las cuales fueron también aspiradas, y se añadieron 4 gotas de
disolución violeta de cristal a cada crisol. La disolución violeta
de cristal fue preparada disolviendo violeta de cristal en PBS
(Fisher Scientific) en PBS: formaldehido: etanol (67:3:30%) para
proporcionar una solución 0,5 p/v. Una placa ciega de
crisol-24, fue tratada de manera similar.
El número de células fue también sometido a
ensayo en un experimento confirmatorio, separado, mediante actividad
de hexosaminidasa como ha sido descrito por Landegren.^{12}
Específicamente, las células se hicieron crecer y
se trataron con maltol galio como se ha descrito anteriormente, y
después se empleó hexosaminidasa en lugar de violeta cristal, y el
procesamiento continuó como en lo que antecede.
El crecimiento de queratinocitos en presencia de
maltol galio, ha sido ilustrado gráficamente en la Figura 1 (violeta
cristal) y en la Figura 2 hexosaminidasa. Los resultados aquí
expuestos ilustran que el maltol galio solamente inhibe el
crecimiento de queratinocitos a altas concentraciones en las que, a
una concentración de 10^{-4} M de maltol galio, el crecimiento de
queratinocitos se redujo en un 60 a 90 por ciento en comparación con
el control (c). A concentraciones más bajas, los datos de la Figura
2 sugieren que el maltol galio puede, de hecho, promover ligeramente
el crecimiento de queratinocitos.
Se cultivaron queratinocitos en 24 placas de
crisol durante 9 días, de la manera que se ha descrito en el Ejemplo
2 que antecede. Tras las primeras 24 horas de cultivo, el medio 154
fue cambiado a un medio alto en Ca^{+2} (Ca^{+2}1M), ya sea sin
ninguna afección (control "C") o ya sea suplementado con 1 x
10^{-4} M de maltol galio (GaM) o con 1 x 10^{-4} M de nitrato
de galio (Ga) o con 3 x 10^{-4} M de maltol (M).
Las células fueron cultivadas a continuación y
evaluadas posteriormente en cuanto a inhibición de proliferación de
queratinocitos de la manera que se ha descrito anteriormente. Los
resultados de esta evaluación se encuentran expuestos en la Figura
3, la cual ilustra que ni el nitrato de galio ni el maltol tuvieron
efecto alguno sobre la proliferación de queratinocitos, pero el
maltol galio inhibió esa proliferación en alrededor del 94%. Estos
datos demuestran que ni el galio elemental ni el maltol son, en sí
mismos, efectivos para reducir la proliferación de queratinocitos a
pesar del uso de la misma concentración tanto de galio como de
maltol que la encontrada en el complejo neutro de maltol galio.
Los frascos de cultivo (área inferior de 75
cm^{2}) fueron inseminados con queratinocitos a alrededor de 2.500
células por cm^{2} como anteriormente. Después de 24 horas, el
medio de tres (3) frascos fue cambiado a medios (154) con un
contenido de calcio incrementado a partir de 0,2 mM normal hasta 1,0
mM ("alto en calcio"), más maltol galio (GaM), en las
concentraciones siguientes: 1 x 10^{-5} M, 5 x 10^{-5}.
M, y 1 x 10^{-4} M. El cultivo continúo durante
7 días cuando las células eran confluentes al 75% en los controles
(sin GaM). Los medios suplementados según lo que antecede, fueron
cambiados cada 2 días. Finalmente, los medios fueron aspirados y las
células enjuagadas con PBS con anterioridad a la exposición a
tripsina (0,025%)/EDTA (0,01%). Cuando fueron extraídas, se
recogieron en tubos centrífugos, y los frascos se enjuagaron con
solución neutralizante de PBS: tripsina (Clonetics, San Diego,
California, USA; 1:1 v/v), y se añadieron a la suspensión celular.
El volumen total de suspensiones fue de aproximadamente 8 a 10 ml.
Porciones alíquotas de estas suspensiones fueron contadas en el
hemocitómetro, en términos de:
(1) queratinocitos pequeños, ligeros u oscuros,
citados como "proliferativos";
(2) queratinocitos escamosos, más grandes, con
elementos estructurales intracelulares, y
(3) células escamosas claras sin elementos
estructurales.
Tras el conteo, cada suspensión fue centrifugada,
se desechó el sobrenadante, y la masa celular fue resuspendida en
0,5 a 1,0 ml de SDS al 1%: 2,5 mM de DTT. Después de 15 minutos a
37ºC, las porciones alíquotas de estas suspensiones fueron contadas
en cuanto a envolventes insolubles cornificadas. Se tomó nota de los
volúmenes.
En un experimento posterior, los frascos de
queratinocitos se sometieron a crecimiento en un medio 154 durante 4
días tras la inseminación, con anterioridad al cambio al medio alto
en calcio sin maltol galio (control) o con maltol galio a las
concentraciones finales de 5 x 10^{-5}, 1 x 10^{-5} ó 1 x
10^{-6} M. Había 2 ó 3 frascos en cada grupo. El cultivo continuó
durante otros 3 días, cuando los queratinocitos fueron recolectados
y contados como en lo que antecede.
Los resultados de este ejemplo se proporcionan en
la Figura 4, la cual ilustra la ocurrencia relativa de células
proliferativas, escamosas y escamosas claras. Los datos encontrados
en esta Figura demuestran que hubo un descenso moderado en la
proporción de células proliferativas, un incremento en el número de
células escamosas, y un incremento de alrededor de diez veces en el
número de envolventes cornificadas para el cultivo que contenía 5 x
10^{-5} M de maltol galio en comparación con el control. También,
el número total de células de este cultivo disminuyó alrededor de un
90%.
Estos resultados demuestran que las
concentraciones de maltol galio mayores de 1 x 10^{-5} M
incrementan ventajosamente la diferenciación celular de
queratinocitos. Estos resultados también demuestran que a una
concentración de maltol galio mayor de 1 x 10^{-5} M, y con
preferencia a una concentración de al menos 5 x 10^{-5} M, se
consigue la inhibición de proliferación de queratinocitos.
Contrariamente a lo anterior, el número de
células proliferativas, escamosas y cornificadas en el cultivo que
contiene 1 x 10^{-5} M de maltol galio, respecto a todas las
previsiones y propósitos, no cambió en comparación con el control.
La Tabla I que sigue ilustra estos resultados a 1 x 10^{-5} M.
\newpage
A una concentración de 1 x 10^{-4} M, el efecto
anti-proliferativo del maltol galio fue tan grande
que el número de células fue demasiado pequeño para asegurar su
conteo.
En el experimento, en el que se permitió crecer a
los queratinocitos en cultivo durante 4 días con anterioridad a la
adición de maltol galio a concentraciones de 5 x 10^{-5} M, 1 x
10^{-5} M y 1 x 10^{-6} M, y después se dejó continuar el
cultivo durante 3 días más, no se observaron diferencias
significativas en la diferenciación celular según se determinó
mediante la proporción de células. Estos resultados se muestran en
la Tabla II que sigue:
En vista de estos resultados, no fueron contadas
las células tratadas con maltol galio a una concentración de 1 x
10^{-6} M.
La inducción de apóptosis es una característica
crítica en la muerte celular programada puesto que se refiere a
afecciones de enfermedades tales como el cáncer, la psoriasis, etc.,
donde la proliferación descontrolada de células "inmortales"
tales como los queratinocitos, es una característica de causa de la
enfermedad. Este ejemplo compara la capacidad del maltol galio para
inducir apóptosis en comparación con el control negativo (nada de
maltol galio), y con el control positivo (CAM - un agente conocido
por inducir fuertemente la apóptosis). La capacidad del maltol galio
para efectuar apóptosis fue también medida mediante el efecto
inhibitorio del ATA.
Específicamente, las células de queratinocitos se
hicieron crecer con la utilización de un medio 154 en 24 placas de
crisol inseminadas con 2.500 células/cm^{2} como se ha descrito en
lo que antecede. Los cultivos continuaron durante 3 ó 6 días cuando
las células habían adquirido una confluencia de alrededor del 20 o
del 60%, respectivamente. En estas dos ocasiones, los medios fueron
aspirados a partir de grupos de 3 ó 4 crisoles y sustituidos por un
medio alto en Ca^{+2}, ya sea sin suplemento o con uno de los
siguientes suplementos:
- 1.
- Maltol galio a una concentración final correspondiente a una de las siguientes: (a) 5 x 10^{-4} M, (b) 1 x 10^{-4} M, (c) 5 x 10^{-5} M, (d) 1 x 10^{-5} M, y (e) 1 x 10^{-6} M;
- 2.
- CAM a 1 x 10^{-5} ó 1 x 10^{-6} M;
- 3.
- ATA a 1 x 10^{-4} M;
- 4.
- Igual que en (3) más CAM a 1 x 10^{-5} ó 1 x 10^{-6}, y
- 5.
- igual que en (3) más maltol galio a 1 x 10^{-4} ó 2,5 x 10^{-4} M.
El cultivo fue renovado durante 24 horas
adicionales. En este tiempo, los medios fueron extraídos y
desechados, y las células sometidas a lisis con 200 \mul/crisol
de la disolución proporcionada por en el kit ELISA Plus de Detección
de Mortandad Celular(Boehriner Mannheim Biochemicals,
Indianapolis, Indiana, USA, número de catálogo 1774425). Porciones
alíquotas del lisado (20 \mul) de cada uno de 2 ó 3 crisoles,
fueron sometidas a ensayo respecto a enriquecimiento nucleosómico
siguiendo las instrucciones del kit.
La cantidad de ocurrencia de apóptosis en los
queratinocitos cultivados durante 3 días con anterioridad al
tratamiento bajo diversas afecciones, ha sido indicada en la Figura
5. En esta Figura, las barras representan la absorbencia a 405 nm
(menos absorbencia a 492 nm) de las mezclas de reacción de substrato
en el ensayo de muerte celular de células tratadas como en lo que
antecede con medios que contienen:
a) control, nada de aditivos
b) maltol galio a una concentración de 5 x
10^{-4} M
c) maltol galio a una concentración de 1 x
10^{-4} M
d) maltol galio a una concentración de 5 x
10^{-5} M
e) maltol galio a una concentración de 1 x
10^{-5} M
f) maltol galio a una concentración de 1 x
10^{-6} M
g) 1 x 10^{-4} M ATA
h) 1 x 10^{-4} ATA + maltol galio a una
concentración de 1 x 10^{-4} M
i) 1 x 10^{-5} M de CAM
j) 1 x 10^{-5} M de CAM + ATA a una
concentración de 1 x 10^{-4} M.
En la Figura 5, los valores son medios \pm
desviaciones estándar (N = 2). Cuanto más alto sea el diferencial de
absorbencia entre la absorbencia a 405 nm menos la absorbencia a 492
nm, corresponde un grado más alto de apóptosis.
Los resultados de la Figura 5 demuestran que el
maltol galio, cuando se empleó a una concentración de 5 x 10^{-4}
M, proporcionó un incremento de apóptosis de alrededor de 7 veces en
comparación con el control, pero que el uso de concentraciones más
bajas de maltol galio falló en la provisión de un incremento
significativo de apóptosis de este tipo. La Figura 5 ilustra también
que 1 x 10^{-5} M de CAM indujo también una fuerte apóptosis que
fue reducida a la mitad mediante 1 x 10^{-4} M de ATA.
La cantidad de ocurrencia de apóptosis en los
queratinocitos cultivados durante 6 días con anterioridad al
tratamiento bajo diversas afecciones, ha sido indicada en la Figura
6. Se empleó el tiempo de cultivo más largo para permitir que
creciera un mayor número de células. En esta Figura, las barras
representan la absorbencia a 405 nm (menos la absorbencia a 492 nm)
de las mezclas de reacción del substrato en ensayo de muerte celular
de células tratadas con medios que contienen:
a) control, nada de aditivos
b) maltol galio a una concentración de 5 x
10^{-4} M
c) maltol galio a una concentración de 2,5 x
10^{-4} M
d) maltol galio a una concentración de 1 x
10^{-4} M
e) maltol galio a una concentración de 5 x
10^{-5} M
f) maltol galio a una concentración de 2,5 x
10^{-4} M + 1 x 10^{-4} M de ATA
g) 1 x 10^{-6} M de CAM
h) 1 x 10^{-6} M de CAM + 1 x 10^{-4} M de
ATA.
En la Figura 6, los valores son medios \pm
desviaciones estándar (N = 3). Cuanto más alta sea el diferencial de
absorbencia entre la absorbencia a 405 nm menos la absorbencia a 492
nm, corresponde un grado más alto de apóptosis.
Los resultados de la Figura 6 demuestran que el
maltol galio, cuando se empleó a una concentración de 5 x 10^{-4}
M, proporcionó un incremento de apóptosis de alrededor de 10 veces
en comparación con el control, con menores incrementos de apóptosis
a concentraciones más bajas de maltol galio. La Figura 6 ilustra
además que 1 x 10^{-6} M de CAM indujo fuertemente apóptosis, lo
que se redujo a la mitad con 1 x 10^{-4} M de ATA.
Se realizó una evaluación de apóptosis de
queratinocitos para determinar el efecto relativo sobre la apóptosis
conseguido por el maltol galio, el nitrato de galio y el maltol.
Específicamente, las células de queratinocitos fueron cultivadas en
12 placas de crisol con la utilización del medio de cultivo 154. Los
cultivos continuaron durante 4 días y el medio fue cambiado por un
medio 154 con 1,2 nM de Ca^{+2}, sin suplemento o con uno de los
siguientes suplementos:
1. maltol galio a una concentración final de 5 x
10^{-4} M;
2. nitrato de galio a una concentración final de
5 x 10^{-4} M;
3. maltol a una concentración de 15 x 10^{-4}
M, y
4. CAM a una concentración de 1 x 10^{-5} M
Se utilizaron tres (3) crisoles en cada grupo. La
cantidad final de medio fue de 300 \mul en cada crisol. El cultivo
continuó durante 2 días. En ese momento, se determinó la cantidad de
apóptosis como en lo que antecede, y los resultados se han mostrado
en la Figura 7. Las barras 7 representan la absorbencia a 405 nm
menos la absorbencia a 492 nm. Los resultados de la Figura 7
demuestran que el maltol galio, cuando se empleó a una concentración
de 5 x 10^{-4} M, proporcionó un incremento de la apóptosis de
alrededor de 19 veces en comparación con el control, pero que el uso
de nitrato de galio o de maltol no tuvo efecto significativo alguno
sobre la apóptosis. Estos resultados son consistentes con la
conclusión de que es el maltol galio neutro quelatado, y no el galio
elemental o el maltol quelator, lo que imparte beneficiosamente la
apóptosis.
El ejemplo que sigue ilustra un método que puede
ser empleado para preparar una composición farmacéutica hidrofílica
que comprende maltol galio, cuya composición es adecuada para
aplicación tópica. En este ejemplo, se empleó Aquaphor® disponible
comercialmente (Beiersdorf, Inc., Norwalk, Connecticut, USA) como
formulación base. A esta formulación se añadió una cantidad
suficiente de una disolución acuosa de maltol galio de tal modo que
la composición final comprende un 0,05 por ciento en peso de galio y
se añadió el 7,5 por ciento en peso de agua en base al peso total de
la composición. La composición se mezcló a continuación hasta que
fue homogénea.
Aunque la invención que antecede ha sido descrita
con algún detalle a título de ilustración y ejemplo por motivos de
claridad y comprensión, se comprenderá de forma evidente que se
pueden realizar determinados cambios y modificaciones dentro del
alcance de las reivindicaciones anexas.
Claims (14)
1. Uso de un quelato de galio neutro de
3-hidroxi-4-pirona,
representado por la fórmula 1:
en la que cada R se elige independientemente del
grupo consistente en hidrógeno y alquil de 1 a 6 átomos de carbono,
para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad que puede ser mejorada inhibiendo la hiperproliferación
de queratinocitos en la piel de un mamífero, en la que dicha
hiperproliferación de queratinocitos está asociada a la psoriasis,
dermatitis atópica, dermatitis de contacto, dermatitis eccematosa,
dermatitis seborreica, Lichen planus, hiperqueratosis,
eritroqueratoderma, ictiosis, queratosis actínica, carcinoma celular
basal, o carcinoma celular
escamosa.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que cada
R es independientemente hidrógeno o un grupo alquil no ramificado de
1 a 3 átomos de carbono.
3. El uso de la reivindicación 2, en el que cada
R es independientemente hidrógeno, metil o etil.
4. El uso de la reivindicación 2, en el que dicha
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula 1 posee un único sustituyente alquil en la posición 2 o
en la posición 6 de la misma.
5. El uso de la reivindicación 1, en el que dicha
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula 1 se elige en el grupo consistente en
3-hidroxi-4-pirona,
3-hidroxi-2-metil-4-pirona,
3-hidroxi-2-etil-4-pirona,
y
3-hidroxi-6-metil-4-pirona.
6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicha
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula 1 es
3-hidroxi-2-metil-4-pirona.
7. El uso de la reivindicación 5, en el que dicha
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula 1 es
3-hidroxi-2-etil-4-pirona.
8. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho
quelato de galio de
3-hidroxi-4-pirona,
es maltol galio, y está presente en el medicamento en una
concentración de al menos 10^{-4} M.
9. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho
quelato de galio de
3-hidroxi-4-pirona
es maltol galio, y está presente en la composición farmacéutica en
una cantidad suficiente para alcanzar una concentración de al menos
10^{-4} M de dicho quelato de galio en la piel.
10. Reivindicar el uso de maltol galio para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
que puede ser mejorada mediante la inhibición de la
hiperproliferación de queratinocitos en la piel de un mamífero.
11. El uso de la reivindicación 10, en el que
dicho maltol galio está presente en el medicamento a una
concentración de al menos 5 x 10^{-5} M.
12. El uso de la reivindicación 10, en el que
dicho maltol galio está presente en el medicamento en una cantidad
suficiente para alcanzar una concentración de al menos 5 x 10^{-5}
M de dicho maltol galio en la piel.
13. El uso de la reivindicación 12, en el que
dicha hiperproliferación de queratinocitos en la piel del mamífero
está asociada a la psoriasis.
14. Uso de una
3-hidroxi-4-pirona
de fórmula 1, según se encuentra identificada en la reivindicación
1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una
enfermedad que puede ser mejorada por inhibición de la
hiperproliferación de queratinocitos en la piel de un mamífero con
anterioridad al desarrollo de lesiones visibles asociadas a dicha
hiperproliferación en áreas de piel conocidas como susceptibles a
tales lesiones.
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