DE69723843T2

DE69723843T2 - Verwendung von clotrimazol und verwandte verbindungen zur behandlung von diarrhöe

Info

Publication number: DE69723843T2
Application number: DE69723843T
Authority: DE
Inventors: I. Wayne LENCER; Carlo Brugnara; Seth Alper
Original assignee: Childrens Medical Center Corp
Current assignee: Childrens Medical Center Corp
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-20
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2017-03-21
Also published as: US20030119784A1; EP0910376B1; JP2000506895A; US6495567B1; DE69723843D1; JP2009007368A; US5889038A; WO1997034599A3; ES2199358T3; WO1997034599A2; DK0910376T3; ATE245981T1; EP0910376A2; PT910376E

Description

Hintergrund der Erfindung
Akute und chronische Diarrhoen stellen in vielen Gebieten der Welt ein großes medizinisches Problem dar. Diarrhoe ist sowohl ein bedeutender Faktor bei Unterernährung als auch die wichtigste Todesursache (5.000.000 Tote/Jahr) bei Kindern unter fünf Jahren. Sekretorische Diarrhoen sind auch ein gefährlicher Zustand bei Patienten mit Erworbene-Immunschwäche-Syndrom (acquired immunodeficiency syndrom, AIDS) und chronischer entzündlicher Darmerkrankung (inflammatory bowel disease, IBD). 16 Millionen Reisende aus Industrieländern in Entwicklungsländer entwickeln Diarrhoe, wobei die Schwere und Zahl der Fälle von Diarrhoe in Abhängigkeit von Land und Reisegebiet variiert. Zu den wichtigsten medizinischen Folgen von Diarrhoe-Erkrankungen zählen Dehydrierung, Azidose, Tod und beeinträchtigtes Wachstum.
Diarrhoe bei Stall- und Haustieren wie Kühen, Schweinen und Pferden, Schafen, Ziegen, Katzen und Hunden, auch bekannt als Ruhr, ist eine wichtige Todesursache bei diesen Tieren. Diarrhoe kann durch jede größere Veränderung, beispielsweise Entwöhnung oder physische Bewegung verursacht werden. Eine Form der Diarrhoe ist gekennzeichnet durch Diarrhoe als Reaktion auf eine bakterielle oder virale Infektion und tritt im allgemeinen innerhalb der ersten Lebensstunden eines Tieres auf.
Obwohl die wichtigsten Folgen von Diarrhoe-Erkrankungen sehr ähnlich sind, gibt es zahlreiche Ursachen für Diarrhoe. Sekretorische und Diarrhoe werden primär durch bakterielle oder virale Infektionen verursacht. Das verbreitetste Diarrhoe verursachende Bakterium ist enterotoxinbildendes E. coli (ETEC) mit dem K99-Pilus-Antigen. Verbreitete virale Ursachen von Diarrhoe sind beispielsweise Rotavirus und Coronavirus. Andere infektiöse Agenzien schließen unter anderem Cryptosporidium, Giardia lamblia und Salmonella ein.
Die Behandlung von Diarrhoe hängt vom Patienten und der Infektionsquelle ab. Diarrhoe, wie sie bei Reisenden (Reise-Diarrhoe), die in Industrieländer reisen, gefunden wird, wird häufig durch bakterielle Pathogene verursacht, die durch Aufnahme von mit Fäkalien kontaminierter Nahrung und/oder Wasser erworben wurden. Ungefähr 50–75% dieser Fälle werden auf ETEC zurückgeführt. Obwohl Reise-Diarrhoe schmerzhaft ist, ist sie im allgemeinen nicht lebensbedrohlich und die Symptome dauern nur 3–5 Tage an. Die Symptome umfassen akuten Durchfall, Unterleibskrämpfe, Übelkeit und Fieber. Die effektivste Behandlung der Reise-Diarrhoe besteht in der Verabreichung von Antibiotika zusammen mit oraler Rehydrierung. Es hat sich gezeigt, daß vorbeugende Verabreichung von Antibiotika die Zahl der Reisenden, die Diarrhoe-Symptome entwickeln, drastisch reduziert. Regelmäßige Verabreichung von Antibiotika ist jedoch nicht angezeigt, da es die Entwicklung resistenter Bakterienstämme verursachen kann. Andere Behandlungsmethoden schließen die Verabreichung von Wismut-Subsalicylat, oftmals in der Form von Pepto-Bismal, Diphenoxylat und Loperamid, ein.
Diarrhoe bei AIDS-Patienten ist ein sehr schwerwiegender Zustand, der Auszehrung verursacht und einen wichtigen Faktor für den Verfall dieser Patienten darstellen kann. AIDS-Patienten entwickeln häufig Diarrhoe als Folge von Darminfektionen, die ihr Immunsystem nicht bekämpfen kann, aber AIDS-Patienten können auch Diarrhoe durch AIDS-Enteropathie entwickeln. AIDS-Enteropathie ist eine Funktionsstörung, die durch Diarrhoe ohne Beteiligung von Sekundärinfektionen gekennzeichnet ist. Sie wird durch Human-Immundefizienzvirus(human immunodeficiency virus, HIV)-Infektion der Dünndarmmukosazellen und Dickdarmmukosazellen verursacht. Das am meisten verbreitete infektiöse Agens, das Diarrhoe als Folge von Darminfektionen bei AIDS-Patienten verursacht, ist Cryptosporidium. Die Verfahren zur Behandlung von Diarrhoe bei AIDS-Patienten umfassen die Verabreichung von Antibiotika und die Verabreichung von Immunglobulinen oder einer immunglobulinangereicherten Fraktion von Rinder-Colostrum. Colostrum, das die erste Milch ist, die von Säugetieren nach dem Gebären, produziert wird, ist mit Antikörpern angereichert.
Akute Diarrhoe oder Ruhr ist eine Hauptursache für den Tod von vielen neugeborenen Nutztieren wie Kälbern und Schweinen. Ruhr wird häufig von ETEC mit einem K99-Pilus-Antigen verursacht. Infektionen mit ETEC verursacht Hypersekretion von Flüssigkeit und Elektrolyt. Hypersekretion wiederum verursacht Dehydrierung und pH-Ungleichgewicht, was zum Tod des neugeborenen Kalbs oder Schweins führen kann.
Neugeborene Nutztiere sind ebenfalls empfindlich gegenüber viralen infektiösen Agenzien, die Ruhr verursachen. Infektionen mit Rotaviren und Coronaviren sind verbreitet bei neugeborenen Kälbern und Schweinen. Rotaviren-Infektionen treten oft innerhalb von 12 Stunden nach der Geburt auf. Zu den Symptomen von Rotaviren-Infektionen gehört die Exkretion von wäßrigen Fäzes, Dehydrierung und Schwäche. Das Coronavirus, das eine schwerere Erkrankung bei neugeborenen Tieren verursacht, hat eine höhere Sterblichkeitsrate als Rotavireninfektionen. Oftmals kann ein junges Tier jedoch mit mehr als einem Virus oder einer Kombination von viralen und bakteriellen Mikroorganismen gleichzeitig infiziert sein. Dies erhöht die Schwere der Krankheit dramatisch.
Im allgemeinen besteht der beste Schutz vor viraler oder bakterieller Infektion für ein neugeborenes Nutztier im Konsum von Colostrum. Wenn das Muttertier diesen infektiösen Agenzien ausgesetzt war, wird das Colostrum Antikörper enthalten, die häufig ausreichen, um das Neugeborene vor dem Erwerb dieser Krankheiten zu schützen. Manchmal ist dies jedoch nicht ausreichend und das Tier benötigt weiteren Schutz. Eine verbreitete Behandlungsmethode umfaßt die Verabreichung einer konzentrierten Colostrumlösung oder einer Immunglobulinfrak tion, die aus einer Colostrumlösung isoliert wurde. Diese orale Behandlung kann mit rehydrierenden Salzen kombiniert werden. Obwohl diese Verfahren die Erkrankungs- und Sterblichkeitsrate von neugeborenen Tieren mit Ruhr verbessert hat, besteht weiterhin ein Bedürfnis nach wirksamen Behandlungen.
Bestimmte Imidazole wie Clotrimazol sind Mittel, die sowohl topisch als auch systemisch als Antipilzmittel verwendet wurden. Kürzlich haben Studien andere Verwendungen für solche Imidazole identifiziert. U.S.-Patent Nr. 5,273,992 offenbart, daß diese Imidazole Ca⁺⁺-aktivierte K⁺-Kanäle in Erythrozyten regulieren und daher bei der Behandlung von Sichelzellenanämie von Nutzen sind, bei der der Kaliumtransport gehemmt ist. Es ist ebenfalls festgestellt worden, daß diese Imidazole die Proliferation von Endothel- und/oder glatten Gefäßmuskelzellen wirksam hemmen. Diese Ergebnisse werden in U.S.-Patent Nr. 5,358,959 und der U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/018,840 beschrieben, die die Verwendung von Clotrimazol zur Behandlung von atherosklerotischen bzw. angiogenen Zuständen offenbart. Nicht-Imidazolmetaboliten und Analoga der vorgenannten Verbindungen wurden ebenfalls als bei der Behandlung der vorgenannten Zustände verwendbar beschrieben (siehe U.S.-Serien-Nr. 08/307,874 und 08/307,887).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Produkte zur Behandlung von Diarrhoe und Ruhr bereit. Es wurde gefunden, daß aromatische Verbindungen bei der Behandlung von Patienten mit Diarrhoe wirksam sind. Die Verbindungen sind wirksame In hibitoren der sekretagog-stimulierten transepithelialen elektrogenen Chloridsekretion durch Darmzellen.
Nach einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Diarrhoe verschiedener Etiologie bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer erfindungsgemäßen aromatischen Verbindung an ein Subjekt, welches einer solchen Behandlung bedarf, in einer Menge, die wirksam ist, um die Diarrhoe zu hemmen. Bevorzugt wird die Verbindung oral in Verbindung mit oralen Rehydrierungsflüssigkeiten verabreicht. Die aromatischen Verbindungen, die für die Erfindung von Nutzen sind, weisen die folgende Formel auf:
wobei n = 0–3 ist; wobei p = 0 oder 1 ist; wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH₂)_{m(m=0,1,2oder3)}, CH=CH, C=C, SCH₂, OCH₂ und NOCH₂; wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH, SH, NO₂, CN, CHO, ONH₂, COR'', CO₂H, CO₂R'',OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', Furanyl, Pyridinyl, Thiophenyl, Indolyl, Quinolyl und CONR''(OCH₃); wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl und Heteroaryl; wobei Ar² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl und substituiertem Phenyl; und wobei Ar³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Biphenyl, Bibenzyl und Naphthyl; wobei der Phenyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO₂, CN, CF₃, NR''R'', und CO₂R; wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem Alkyl C_z _(z=1–5) substituiertem geradkettigen Alkyl C_z(z=1–5), verzweigtem Alkyl C_z(z=1–5) und substituiertem verzweigtem Alkyl C_z(z=1–5); wobei der Alkyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, Br, F, I, OH, OCH_S, SH, SCH₃, NH₂, NHCH₃ und N(CH₃); und wobei R'' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und R.
Eine Heteroarylgruppe schließt Furanyl, Imidazol, Pyridinyl, Thiophenyl, Indolyl, Imidazolyl und Quinolyl ein, ist aber nicht auf diese beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die aromatische Verbindung ein Metabolit von Clotrimazol.
In einer Ausführungsform der Erfindung können die vorgenannten aromatischen Verbindungen in Kombination mit anderen Anti-Diarrhoemitteln verabreicht werden. In einer weiteren Ausführungsform können die aromatischen Verbindungen in Kombination mit anderen Anti-Ruhrmitteln verabreicht werden.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist das Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf, ein Subjekt, das Symptome von Diarrhoe oder Ruhr aufweist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf, ein Subjekt, das einem Risiko ausgesetzt ist, Diarrhoe oder Ruhr zu entwickeln.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Zubereitungen bereitgestellt. Diese pharmazeutische Zu bereitungen enthalten die erfindungsgemäßen aromatischen Verbindungen zusammen mit einem Anti-Diarrhoemittel. In einer Ausführungsform weisen die erfindungsgemäß verwendbaren aromatischen Verbindungen die allgemeine Formel auf, die oben wiedergegeben ist. In noch einer weiteren Ausführungsform weisen die erfindungsgemäß verwendbaren aromatischen Verbindungen die oben angegebene allgemeine Formel auf, wobei aber R' und Ar¹ kein Imidazol beinhalten. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung oral verabreicht.
Nach einem anderen Aspekt der Erfindung werden tierarzneiliche Zubereitungen bereitgestellt. Diese tierarzneilichen Zubereitungen enthalten die erfindungsgemäß verwendbaren aromatischen Verbindungen zusammen mit einem Anti-Ruhrmittel. In einer Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen aromatischen Verbindungen die oben angegebene allgemeine Formel auf. In noch einer anderen Ausführungsform weisen die erfindungsgemäß verwendbaren aromatischen Verbindungen die oben angegebene allgemeine Formel auf, wobei jedoch R' und Ar¹ kein Imidazol beinhalten.
Die Erfindung stellt die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diarrhoe bereit. In einer Ausführungsform weisen die aromatischen Verbindungen gemäß der Erfindung die oben angegebene allgemeine Formel auf, enthalten aber kein Clotrimazol. In einer anderen Ausführungsform weisen die erfindungsgemäß zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Diarrhoe verwendbaren aromatischen Verbindungen die oben offenbarte allgemeine Formel auf, wobei R' und Ar¹ aber kein Imidazol beinhalten.
Die Erfindung stellt die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Ruhr bereit. In einer Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen aromatischen Verbindungen die oben offenbarte allgemeine Formel auf, enthalten aber kein Clotrimazol.
In einer anderen Ausführungsform weisen die erfindungsgemäß zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Ruhr verwendbaren aromatischen Verbindungen die oben offenbarte allgemeine Formel auf, wobei R' und Ar¹ aber kein Imidazol beinhalten.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine Balkengraphik, die die Wirkung von Clotrimazol bei der Hemmung von cAMP- und Ca⁺⁺-abhängiger Cl^–-Sekretion in T84-Zellen darstellt.
2 zeigt die Wirkung von Clotrimazol auf die Hemmung des Grund- und Ca⁺⁺-stimulierten ⁸⁶Rb-Efflux aus T84-Monolayern.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung umfaßt eine Verwendung von und ein Produkt für die Reduzierung der Symptome von Diarrhoe oder zur Verhinderung von Diarrhoe in einem Subjekt mit einem Risiko, Diarrhoe zu entwickeln. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind aromatische Verbindungen. Die aromatischen Verbindungen, die gemäß der Erfindung von Nutzen sind, werden in einer pharmazeutischen Zubereitung und einer tierarzneilichen Zubereitung bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen aromatischen Verbindungen sind auch in einem Verfahren zur Behandlung von Diarrhoe und Ruhr verwendbar, ebenso wie in einem Verfahren zur Verhinderung von Diarrhoe und Ruhr.
Die erfindungsgemäß verwendbaren aromatischen Verbindungen haben die Formel:
wobei n = 0–3 ist; wobei p = 0 oder 1 ist; wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH₂)_{m(m=0,1,2oder3)}, oder CH=CH, C=C, SCH₂, OCH₂ und NOCH₂; wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH, SH, NO₂, CN, CHO, ONH₂, COR'', CO₂H, CO₂R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', Furanyl, Pyridinyl, Thiophenyl, Indolyl, Quinolyl und CONR''(OCH₃); wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl und Heteroaryl; wobei Ar² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl und substituiertem Phenyl; und wobei Ar³ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Biphenyl, Bibenzyl und Naphthyl; wobei der Phenyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO₂, CN, CF₃, NR''R'' und CO₂R; wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem Alkyl C_z(z=1–5), substituiertem geradkettigen Alkyl C_z(z=1–5), verzweigtem Alkyl C_z(z=1–5) und substituiertem verzweigten Alkyl C_z(z=1–5); wobei der Alkyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, OH, OCH₃, SH, SCH₃, NH₂, NHCH₃ und N(CH₃); und wobei R'' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und R.
Eine Heteroarylgruppe schließt Furanyl, Imidazol, Pyridinyl, Thiophenyl, Indolyl, Imidazolyl und Quinolyl ein, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Verbindungen, die als erfindungsgemäß verwendbar angesehen werden, sind Clotrimazol-Metaboliten, die die folgende chemische Struktur aufweisen:
Die erfindungsgemäßen aromatischen Verbindungen sind kommerziell erhältliche Verbindungen, sind von kommerziell erhältlichen Verbindungen ableitbar oder können nach chemischen Standard-Syntheseverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, neu synthetisiert werden.
Der hier verwendete Begriff Diarrhoe bezeichnet ein medizinisches Syndrom, das durch Symptome von Diarrhoe oder Ruhr gekennzeichnet ist. Diarrhoe kann nach dem zugrundeliegenden Mechanismus in drei Gruppen eingeteilt werden: exsudative, malassimilatorische und sekretorische Diarrhoe. Exsudative Diarrhoen resultieren aus entzündlichen Vorgängen, die zu einer beeinträchtigten Absorption im Darm, und zum Verlust von Zellen und Kolloiden, verursacht durch Funktionsstörungen wie ulcerativer Kolitis, Shigellose, und Amöbiose, führen.
Malabsorptions-Funktionsstörungen beinhalten osmotische, anatomische Störungen und Motilitätsstörungen. Osmotische Diarrhoe kann als Folge von Verdauungsanomalien wie Laktoseintoleranz auftreten. Anatomische Störungen führen zu einer verminderten Absorptionsoberfläche, verursacht durch Maßnahmen wie teilweiser Kolektomie und gastrokolische Fistel. Motilitätsstörungen werden verursacht durch reduzierte Kontaktzeit, wie sie durch solche Erkrankungen wie Hyperthyreoidismus und Reizdarm-Syndrom verursacht werden. Sekretorische Diarrhoe ist gekennzeichnet durch die Hypersekretion von Flüssigkeit und Elektrolyten aus den Zellen der Darmwand. Hypersekretion in klassischer Form wird auf Veränderungen zurückgeführt, die unabhängig von der Permeabilität, Absorptionskapazität und exogen erzeugte osmotische Gradienten innerhalb des Darmes sind. Alle Formen von Diarrhoe können jedoch eine sekretorische Komponenten ausbilden.
Die Verfahren und Produkte gemäß der Erfindung sind besonders vorteilhaft bei der Behandlung von sekretorischer Diarrhoe. Die Verfahren und Produkte gemäß der Erfindung können jedoch auch in Kombination mit anderen Behandlungsmethoden, die in der Fachwelt bekannt sind, zur Behandlung von Diarrhoe, verursacht durch Malabsorption oder Entzündung, eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bei der Regulation der Cl^–-Sekretion beteiligt und können allein oder bei Verwendung in Kombination mit anderen Behandlungsmethoden zur Herabsetzung der Netto-Flüssigkeitssekretion dienen, auch wenn diese primär auf Störungen bei der Absorption oder auf Entzündung zurückzuführen ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Produkte sind von Nutzen bei der Verhinderung von Diarrhoe und Ruhr bei Subjekten, die einem Risiko ausgesetzt sind, diese Funktionsstörung zu entwickeln. Subjekte, die einem Risiko ausgesetzt sind, Diarrhoe oder Ruhr zu entwickeln, sind solche Subjekte, bei denen eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, den bakteriellen oder viralen Mikroorganismen, die diese Symptome verursachen, ausgesetzt zu werden. Beispielsweise werden ungefähr 1/3 der Reisenden in Entwicklungsländer Diarrhoe bekommen; Infektion mit Rotaviren ist eine der Haupttodesursachen bei Kleinkindern in Entwicklungsländern; Patienten mit HIV haben eine mehr als 50%ige Wahrscheinlichkeit, Diarrhoe zu entwickeln, und viele neugeborene Kälber und Schweine entwickeln Ruhr. Patienten mit entzündlicher Darmerkrankung entwickeln wiederkehrende Diarrhoe.
Die Verfahren und Produkte gemäß der Erfindung sind von Nutzen bei der Behandlung von Subjekten, die bereits Symptome von Diarrhoe und Ruhr zeigen. Wenn ein Subjekt einem Mikroorganismus, der die Symptome verursacht, ausgesetzt worden ist, kann das Subjekt mit den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung behandelt werden, um die Symptome zu reduzieren. Die Symptome von Diarrhoe beinhalten Darmunregelmäßigkeiten, natrium- oder kaliumreiche Stuhlflüssigkeit, flüssigen Stuhl, Dehydrierung, Fieber, Verlust von Körpergewicht, Kopfschmerzen, Anorexie, Erbrechen, Unwohlsein und Myalgie. Die Symptome von Ruhr beinhalten Verlust von Körpergewicht oder fehlendes Wachstum, Dehydrierung, übelriechenden Stuhl, flüssigen Stuhl, Stücke von teilweise verdauter Milch oder halbfesten Materials im Stuhl und Stuhl mit gelb-weißer oder grauer Farbe.
Ein erfindungsgemäßes Produkt ist eine tierarzneiliche Zubereitung einer aromatischen Verbindung gemäß der Erfindung, die allein oder in Kombination mit einem Anti-Ruhrmittel verwendet wird. Ein Anti-Ruhrmittel ist eine Zusammensetzung, die bekanntermaßen bei der Prävention oder Hemmung der Symptome von Ruhr von Nutzen ist. Bekannte Verbindungen umfassen beispielsweise Colostrumextrakte wie solche, die in U.S.-Patent Nr. 4,377,569 und im Kanadischen Patent Nr. 1,175,352 beschrieben und kommerziell gut erhältlich sind (z. B. lösliches Colostrum-Pulver von VedCo Inc., St. Joseph MO, Calstrum Bolus II von RX Veterinary Products, Kansas City MO etc.); eine immunologische Zubereitung von Colostrum, das aus milchproduzierenden Säugetieren isoliert wurde, die gegen bestimmte Diarrhoe verursachende Mikroorganismen immunisiert wurden, wie sie beispielsweise in U.S.-Patent Nr. 4,834,974, dem australischen Patent Nr. 39340/89, australischen Patent Nr. 52547/90 und dem deutschen Patent Nr. 1560344 beschrieben sind; Mikroorganismenspezifische immunologische Zubereitungen, enthaltend mikroorganismenspezifische hybridomabgeleitete monoklonale Antikörper, wie sie in Sherman et al., Infection and Immunity, V. 42 (2), S. 653–658 (1983) beschrieben sind, und eine Rinder-Immunglobulinfraktion, zubereitet aus Rinderplasma oder klarem Rinderserum wie die Fraktion, die in US.-Patent Nr. 3,984,539 beschreiben ist; Orale Rehydrierungsfluide und/oder Elektrolytersatz-Zusammensetzungen, die kommerziell gut in Form von Trockenzusammensetzungen oder flüssigen Lösungen, zubereitet für orale oder intravenöse Verabreichung, erhältlich sind (z. B. Electrolyte H von Agri-Pet Inc., Aubrey TX; Elektrolyt Pulver 8x von Phoenix Pharmaceutical Inc., St. Joseph MO; Elektrolytlösung Rx von Lextron Inc., Geeley CO, ProLabs LTD, St. Joseph MO und VetTek Inc., Blue Springs MO, Kälber-Rehydrat von Durvet Inc., Blue Springs MO etc.) und kommerziell erhältliche antibiotische Zusammensetzungen (z. B. BIOSOL^®-Flüssigkeit von The UpJohn Company Animal Health Division, Kalamazoo MI; AMOXIBOL^® von SmithKline-Beecham Animal Health, Exton PA; 5-WAY CALF SCOUR BOLUS^TM von Agri Laboratories LTD, St. Joseph MO; 1-A-DAY CALF SCOUR BOLUS von A.H.A.; GARACIN^® PIG PUMP von Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth NJ etc.).
In einer Ausführungsform beinhalten die für die tierarzneiliche Zubereitung verwendbaren aromatischen Verbindungen die aromatischen Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel.
In einer anderen Ausführungsform beinhalten die für die tierarzneiliche Zubereitung verwendbaren aromatischen Verbindungen die aromatischen Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel, wobei aber Ar¹ kein Imidazol beinhaltet.
In einer Ausführungsform ist die tierarzneiliche Zubereitung eine Trockenzubereitung aus der erfindungsgemäßen aromatischen Verbindung und einem Anti-Ruhrmittel. Die Trockenzubereitung kann direkt verabreicht werden oder vor der Verabreichung hydratisiert und/oder in einer flüssigen Lösung verdünnt werden. In einer anderen Ausführungsform ist die tierarzneiliche Zubereitung eine flüssige Lösung aus der erfindungsgemäßen Verbindung und einem Anti-Ruhrmittel.
Ein anderes erfindungsgemäßes Produkt ist eine pharmazeutische Zubereitung aus einer erfindungsgemäßen aromatischen Verbindung und einem Anti-Diarrhoemittel. Ein Anti-Diarrhoemittel beinhaltet beispielsweise eine Immunglobulinzubereitung aus Rinder-Colostrum; Lomotil, ein intravenöses oder orales Rehydrierungsfluid; ein Salz einer Trocken-Rehydrierungszusammensetzung; eine Elektrolytersatz-Zusammensetzung (in trockener oder flüssiger Form); eine orale oder intravenöse Zuckerelektrolyt-Lösung oder – Trockenformulierung; ein Antibiotikum wie Tetracyclin, Trimethoprim oder Sulfamethoxazol; ein Quinolon-Arzneimittel wie Norfloxacin oder Ciprofloxacin, Wismut-Subsalicylat, Diphenoxylat und Loperamid.
In einer Ausführungsform beinhalten die für die pharmazeutische Zubereitung verwendbaren aromatischen Verbindungen die aromatischen Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel.
In einer anderen Ausführungsform beinhalten die für die pharmazeutische Zubereitung verwendbaren aromatischen Verbindungen die aromatischen Verbindungen der oben angegebenen allgemeinen Formel, wobei Ar¹ aber kein Imidazol beinhaltet.
In einer Ausführungsform ist die pharmazeutische Zubereitung eine Trocken-Zubereitung aus der erfindungsgemäßen aromatischen Verbindung und einem Anti-Diarrhoemittel. Die Trocken-Formulierung kann direkt verabreicht werden oder vor der Verabreichung hydratisiert und/oder in einer flüssigen Lösung verdünnt werden. In einer anderen Ausführungsform ist die pharmazeutische Zubereitung eine flüssige Lösung aus der erfindungsgemäßen Verbindung und einem Anti-Ruhrmittel.
Der hier verwendete Begriff Subjekt bedeutet Menschen, Primaten, Pferde, Kühe, Schafe, Schweine, Ziegen, Katzen und Hunde.
Die Verabreichungszeit der erfindungsgemäß verwendbaren aromatischen Verbindungen variiert in Abhängigkeit vom Zweck der Verabreichung. Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen verabreicht werden, um die Entwicklung von Diarrhoe bei Subjekten, die in Gebiete mit hohem Risiko reisen, infektiösen Agenzien ausgesetzt zu sein, oder um bei Subjekten, die auf andere Weise Diarrhoe verursachenden Agenzien ausgesetzt sind, zu verhindern, sollten die Verbindungen etwa zu der Zeit verabreicht werden, in der das Subjekt dem Risiko oder dem Hochrisikogebiet ausgesetzt ist. Wenn die Verbindungen an Subjekte verabreicht werden, um die Entwicklung von Ruhr zu verhindern, sollte die tierarzneiliche Zubereitung innerhalb der ersten 12 Stunden nach der Geburt, bevorzugt innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Geburt, verabreicht werden. Wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um Subjekte mit Symptomen von Diarrhoe oder Ruhr zu behandeln, können die Verbindungen zu jeder Zeit, während der das Subjekt unter den Symptomen leidet, verabreicht werden, bevorzugt sobald die Symptome sich entwickeln.
Bei der Verabreichung werden die erfindungsgemäßen Formulierungen in pharmazeutisch annehmbaren Mengen und in pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen eingesetzt. Solche Zubereitungen können regelmäßig Salze, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, kompatible Träger und optional andere therapeutische Bestandteil enthalten. Bei Verwendung in der Medizin sollten die Salze pharmazeutisch annehmbar sein. Nicht pharmazeutisch annehmbare Salze können jedoch in geeigneter Weise verwendet werden, um pharmazeutisch annehmbare Salze daraus herzustellen und sind daher nicht aus dem Geltungsbereich der Erfindung ausgeschlossen. Zu den pharmakologisch und pharmazeutisch annehmbaren Salze gehören die aus den folgenden Säuren hergestellte Salze, sind aber nicht auf diese beschränkt: Salz-, Hydrobrom-, Schwefel, Salpeter-, Phosphor, Malein-, Essig-, Salicyl-, p-Toluol-sulfon-, Wein-, Zitronen-, Methansulfon-, Ameisen-, Malon-, Bernstein-, Naphthalin-2-sulfon-, und Benzylsulfonsäure. Pharmazeutisch annehmbare Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze hergestellt werden, wie Natrium-, Kalium- oder Kalziumsalze der Carboxylsäuregruppe.
Geeignete Puffersubstanzen beinhalten: Essigsäure und ein Salz (1–2% Gew/Vol); Zitronensäure und ein Salz (1–3% Gew/Vol); Borsäure und ein Salz (0,5–2,5% Gew/Vol); und Phosphorsäure und ein Salz (0,8–2% Gew/Vol).
Geeignete Konservierungsmittel beinhalten Benzalkoniumchlorid (0,003–0,03% Gew/Vol); Chlorobutanol (0,3–0,9% Gew/Vol); Parabene (0,01–0,25% Gew/Vol) und Thimerosal (0,004–0,02% Gew/Vol).
Die wirksamen Verbindungen der vorliegenden Erfindung können pharmazeutische Zusammensetzungen mit einer therapeutisch wirksamen Menge von einer aromatischen Verbindung gemäß der oben angegebenen allgemeinen Formel in Kombination mit einem Anti-Diarrhoemittel sein, optional enthalten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger. Die erfindungsgemäßen wirksamen Verbindungen können auch tierarzneiliche Zusammensetzungen mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer aromatischen Verbindung gemäß der oben angegebenen Formel in Kombination mit einem Anti-Ruhrmittel sein, optional enthalten in einem pharmazeutische annehmbaren Träger. Der hier verwendete Begriff "pharmazeutisch annehmbarer Träger" bedeutet ein oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllmittel, Verdünnungsmittel oder einschließende Substanzen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier geeignet sind. Der Begriff "Träger" bezeichnet einen organischen oder anorganischen, natürlichen oder synthetischen, Bestandteil, mit dem der wirksame Bestandteil kombiniert wird, um die Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch mit der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung, mit dem Anti-Diarrhoemittel oder Anti-Ruhrmittel und untereinander in einer Weise zusammengemischt werden, daß keine Wechselwirkung erfolgt, die die gewünschte pharmazeutische Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigen würde.
Ein verbreitetes Verabreichungsvehikel (z. B. Pille, Tablette, Bolus, Pulver oder Verdünnungslösung, Dosierpumpe ("Pig Pump"), Implantat, injizierbare Lösung usw.) würde sowohl die erfindungsgemäß verwendbaren Verbindungen als auch das Anti-Diarrhoe- oder Anti-Ruhrmittel enthalten. Daher stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische oder tierarzneiliche Zusammensetzungen für die medizinische oder veterinärmedizinische Verwendung bereit, die die erfindungsgemäße wirksame Verbindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern derselben und andere therapeutische Bestandteile umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine wirksame Menge ist eine Menge, die ausreicht, um die Cl^–-Sekretion von Darmepithelzellen zu hemmen, wodurch die sekretorische Reaktion wirksam vermindert wird und eine Verminderung der Diarrhoe oder Ruhr, und/oder von deren Symptomen eintritt. Wirksame Mengen hängen natürlich von dem jeweils behandelten Zustand ab; der Schwere des Zustands; individuellen Parametern des Patienten einschließlich Alter, körperlichem Zustand, Größe und Gewicht; Parallelbehandlung; Häufigkeit der Behandlung; und der Verabreichungsart. Dieser Faktoren sind dem Fachmann wohlbekannt und können durch Routineuntersuchungen berücksichtigt werden. Im allgemeinen wird bevorzugt eine Maximaldosis verwendet, d. h. die höchste sichere Dosis gemäß fundierter medizinischer Beurteilung, insbesondere, wenn akute Diarrhoe oder Ruhr die dominanten klinischen Manifestationen darstellen.
Die Dosierung kann entsprechend angepaßt werden, um die gewünschten Plasmaspiegel des Arzneimittels zu erhalten. Im allgemeinen reichen tägliche orale Dosen von wirksamen Verbindungen von etwa 0,01 Milligramm/kg pro Tag bis 1000 Milligramm/kg pro Tag. Es wird angenommen, daß orale Dosen im Bereich von 50 bis 500 Milligramm/kg, in einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag, das gewünschte Ergebnis erzielen. Für den Fall, daß die Antwort bei einem Subjekt bei solchen Dosen unzureichend ist, können auch höhere Dosen (oder wirksame höhere Dosen durch einen anderen, gezielteren Zuführweg) eingesetzt werden, soweit es die Toleranz des Patienten erlaubt. Mehrfache Dosen pro Tag können ins Auge gefaßt werden, um ein angemessenes systemisches Niveau der Verbindung zu erzielen.
Eine Vielzahl Verabreichungsarten ist verfügbar. Der jeweils gewählte Modus hängt natürlich von dem jeweiligen gewählten Arzneimittel, der Schwere der behandelten Diarrhoe oder Ruhr und der erforderlichen Dosierung für eine therapeutische Wirksamkeit ab. Die erfindungsgemäßen Verfahren können allgemein gesagt werden unter Anwendung jeder Verabreichungsart ausgeführt, die medizinisch annehmbar ist, somit jede Art, die ein wirksames Niveau der wirksamen Verbindung erzeugt, ohne klinisch nicht akzeptable unerwünschte Wirkungen zu verursachen. Zu solchen Verabreichungsarten gehören orale, rektale, topische, nasale, transdermale oder parenterale Wege. Der Begriff "parenteral" schließt subkutane, intravenöse, intramuskuläre oder Infusion ein. Intravenöse und intramuskuläre Wege sind nicht besonders gut für Langzeittherapien und Prophylaxe geeignet. Sie könnten jedoch in Notsituationen bevorzugt sein. Orale Verabreichung ist für die prophylaktische Behandlung wegen der Annehmlichkeit für das Subjekt sowie für den Dosierungsplan bevorzugt.
Die Zusammensetzungen können in geeigneter Weise in Einheitsdosierform bereitgestellt werden und können mit Hilfe jeder der in der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schließen den Schritt ein, die wirksame Verbindung in Verbindung mit einem Träger zu bringen, der eine oder mehr Nebenbestandteile bildet. Im allgemeinen werden die Zusammensetzungen zubereitet, indem die wirksamen Verbindungen gleichmäßig und gründlich mit einem flüssigen Träger, einem fein verteilten festen Träger oder beidem zusammengebracht wird und dann, falls erforderlich, das Produkt in Form gebracht wird.
Für die orale Verabreichung geeignete Zusammensetzungen können als getrennte Einheiten wie Kapseln, Oblatenkapseln, Tabletten oder Pastillen bereitgestellt werden, die jeweils eine vorbestimmte Menge der wirksamen Verbindung enthalten. An dere Zusammensetzungen beinhalten Suspensionen in wäßrigen Flüssigkeiten oder nicht-wäßrigen Flüssigkeiten wie einen Sirup, ein Elixier oder eine Emulsion. Wirksame Bestandteile, die oral verabreicht werden, können in jeder für die orale Verabreichung geeigneten Form vorliegen, z. B. als Pille, Tablette, Bolus, Trinkflüssigkeit, mit Nahrung oder Dosierpumpe zu verdünnende oder zu mischende flüssige oder pulverförmige Zusammensetzung, usw.
Zusammensetzungen, die für parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen vorzugsweise eine sterile wäßrige Zubereitung der wirksamen Verbindung, die bevorzugt isotonisch mit dem Blut des Empfängers ist. Die wäßrige Zubereitung kann nach bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendierungsmittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nichttoxischen parenteral annehmbaren Diluens oder Lösemittel sein, beispielsweise eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den annehmbaren Vehikeln und Lösemitteln, die eingesetzt werden können, sind Wasser, Ringerlösung und isotonische Natriumchloridlösung. Darüber hinaus werden sterile fette Öle üblicherweise als Lösemittel oder Suspendierungsmedium eingesetzt. Für diesen Zweck kann jedes milde Fettöl, einschließlich synthetischen Mono- oder Diglyceriden, eingesetzt werden. Darüber hinaus können Fettsäuren wie Oleinsäure bei der Zubereitung von Injektionszubereitungen Einsatz finden. Für orale, subkutane, intravenöse, intramuskuläre etc. geeignete Trägerformulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, zu finden.
Andere Zuführsysteme können Systeme mit zeitabhängiger, verzögerter oder anhaltender Abgabe sein. Solche Systeme können wiederholte Verabreichungen des erfindungsgemäßen wirksamen Mittels vermeiden, wodurch sich die Annehmlichkeit für das Subjekt und den Arzt erhöhen. Viele Typen von Abgabezufuhrsystemen sind verfügbar und dem Fachmann bekannt. Sie beinhalten polymerbasierte Systeme wie Polymilchsäure und Polyglykolsäure, Polyanhydride und Polycaprolactone; nicht-polymere Systeme, die Lipide sind, einschließlich Sterolen wie Cholesterin, Cholesterinestern und Fettsäuren oder Neutralfetten wie Mono-, Di und Triglyceriden; Hydrogel-Abgabesysteme; Silastic-Systeme; peptidbasierte Systeme; Wachsüberzüge, komprimierte Tabletten unter Verwendung konventioneller Bindemittel und Arzneiträger, partiell fusionierte Implantate und dergleichen. Beispiele schließen ein: (a) Erosionssysteme, bei denen das Polysaccharid in einer Form innerhalb einer Matrix enthalten ist, beschrieben in U.S.-Patent Nr. 4,452,775 (Kent); 4,667,014 (Nestor et al.); und 4,748,034 und 5,239,660 (Leonard) und (b) Diffusionssysteme, bei denen ein wirksamer Bestandteil in kontrollierter Rate durch ein Polymer permeiert, gefunden in U.S.-Patent Nr. 3,832,253 (Higuchi et al.) und 3,854,480 (Zaffaroni). Darüber hinaus kann ein pumpenbasiertes Gerätesystem verwendet werden, von denen einige für eine Implantation ausgelegt sind.
Die Verwendung eines Implantats mit anhaltender Langzeitabgabe kann besonders geeignet für die Behandlung von Diarrhoe bei immungeschwächten Patienten sein, die eine kontinuierliche Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen benötigen. Der hier verwendete Begriff "Langzeitabgabe" bedeutet, daß das Implantat dazu konstruiert und dafür ausgelegt ist, therapeutische Niveaus des wirksamen Bestandteils für mindestens 30 Tage, bevorzugt 60 Tage, abzugeben. Implantate mit anhaltender Langzeitabgabe sind dem Fachmann wohlbekannt und schließen einige der oben beschriebenen Abgabesysteme ein.
Beispiele
Beispiel 1: Clotrimazol hemmt die Wasser- und Elektralytsekretion bei Darmepithelzellen
Die biochemische Basis sekretorischer Diarrhoe umfaßt die Darm-Cl^–-Sekretion durch Darmkryptazellen. Unter normalen Bedingungen verbleiben Cl^–-Ionen durch primäre und sekundäre aktive Transportmechanismen wie die Na/K-ATPase-Pumpen und Na/K/2Cl-Cotransporter innerhalb der Darmkryptazellen bei einem Niveau über deren elektrochemischem Potential. Cl^– wird durch apikale Cl^–-Kanäle aus den Darmkryptazellen in das Lumen transportiert. Intrazelluläre Niveaus von K⁺, cAMP, cGMP und Ca⁺⁺ sind an der Regulation der sekretorischen Reaktion beteiligt.
T84-Zellen wurden verwendet, um zu bestimmen, ob Clotrimazol die Cl^–-Sekretion bei Darmkryptazellen reguliert. T84-Zellen bilden konfluente Monolayer von Säulenepithelien, die hohe transepitheliale Widerstände, polarisierte apikale und basolaterale Membranen sowie cAMP- und Ca⁺⁺-regulierte sekretorische Wege analog denen bei nativem Darm zeigen.
Methoden:
Anzucht von T84-Zellen: T84-Zellen, erhalten von der ATCC, wurden kultiviert und überimpft in gleichen Teilen Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 1 g/1D-Glukose und Ham's F-12-Nährmedium, versetzt mit 5% Neugeborenen-Kälberserum, 15 mM HEPES, 14 mM NaHCO₃, 40 mg/l Penicillin, 8 mg/l Ampicillin, 0,90 mg/l Streptomycin. Zellen wurden bei konfluenter Dichte auf 0,33 cm² oder 5 cm² Transwell-Einsätzen (Costar, Cambridge, MA), beschichtet mit verdünnter Rattenkollagen-Suspension, wie an anderer Stelle beschrieben (Lencer et al., J. Clin. Invest. 92: 2941–2951 (1993); Lencer et al., J. Cell Biol. 117: 1197–1209 (1992)), sedimentiert. Transepitheliale Widerstände erlangten nach 7 Tagen stabile Werte (>1000 Ohm·cm²). Die Entwicklung von hohen transepithelialen Widerständen korrelierte mit der Bildung von konfluenten Monolayern mit gut ausgebildeten "tight-junctions", wie durch morphologische Analyse ermittelt wurde, und mit der Fähigkeit der Monolayer, Cl^– zu sekretieren (Madara et al., Gastro 92: 1133–1145 (1987).
Elektrophysiologie (Messung elektrogener Cl^–-Sekretion): Konfluente Monolayer wurden zu Hanks gepufferter Salzlösung (Hanks Buffered Salt Solution, HBSS), enthaltend 0,185 g/l CaCl₂, 0,098 g/l MgSO₄, 0,4 g/KCl, 0,06 g/l KHP₂O₄, 8 g/l NaCl, 0,048 g/l NaHP₂O₄, 1 g/l Glukose und 10 nM HEPES, pH 7,4, transferiert. Serosale und mukosale Reservoire wurden mit Kalomel- und Ag-AgCl-Elektroden via 5-%-Agarbrücken mit Ringerpuffer ausgestattet. Der transepitheliale Widerstand wurde mit Hilfe einer dualen Spannungsklammer("voltage clamp")-Vorrichtung zum Anlegen von 25- oder 50 μA-Strompulsen gemessen. Der Kurzschlußstrom (I_SC) wurde unter Anwendung des Ohmschen Gesetzes, wie an anderer Stelle beschrieben (Lencer et al., J. Clin. Invest. 92: 2941–2951 (1993); Lencer et al., J. Cell Biol. 117: 1197–1209 (1992)), berechnet.
Ergebnisse:
Clotrimazol hemmt die durch Ca⁺⁺ oder cAMP-abhängige Agonisten hervorgerufene Cl^–-Sekretion in T84-Zellen reversibel:
Vorhergehende Studien haben gezeigt, daß die Cl^–-Sekretion in T84-Zellen durch K⁺-Efflux-Wege, die biophysikalisch und pharmakologisch verschieden sind, kontrolliert wird. Ein Weg nimmt an der sekretorischen Reaktion auf cAMP-abhängige Agonisten teil und zeigt Sensitivität gegenüber Ba⁺⁺-Salzen (McRoberts et al., J. Biol. Chem. 260: 14163–14172 (1985); Reenstra, Am J. Physiol. 264: C161–168 (1993)). Der andere vermittelt die Reaktion auf Ca⁺⁺-abhängige Agonisten und ist Ba⁺⁺-unempfindlich. Mehrere Weg-spezifische Agonisten von K⁺-Kanälen sind verwendbar zur Bestimmung, ob eine bestimmte Verbindung über einen cAMP- oder Ca⁺⁺-spezifischen Weg fungiert. Beispielsweise sind vasoaktives Darmpeptid (Vasoactive intestinal peptide, VIP) und Choleratoxin cAMP-vermittelte Agonisten des K⁺-Kanals, während Carbachol ein Ca⁺⁺-abhängiger Agonist der Ca⁺⁺-regulierten K⁺-Kanäle ist. Die Wege, über die ein bestimmter Inhibitor der Cl^–-Sekretion bei T84-Zellen fungiert, kann durch Messung der Fähigkeit des Inhibitors, die transepithelialen Widerstände bei T84-Zellen zu modifizieren, die mit VIP oder Carbachol zur Stimulierung der Cl^–-Sekretion behandelt wurden, identifiziert werden.
T84-Zellen wurden wie oben beschrieben angezogen und die Cl^–-Sekretion wurde durch Zugabe von Carbachol (100 μM) oder VIP (5 nM) zum Medium stimuliert. Die Zellen wurden dann mit BaCl (3 mM), Charybdotoxin (100 nM) oder Clotrimazol (33 μM) behandelt. Der Kurzschlußstrom (I_SC) wurde für die verschiedenen Inhibitor-Behandlungen als Prozentanteil der Kontrolle in Abwesenheit von Inhibitor bestimmt. BaCl hemmte die sekretorische Reaktion auf den cAMP-vermittelte Agonisten VIP stark, hatte aber keinen sichtbaren Effekt auf die sekretorische Reaktion, die durch den Ca⁺⁺-abhängigen Agonisten Carbachol hervorgerufen wurde. Im Gegensatz dazu, hemmte das Skorpiongift Charybdotoxin die sekretorische Reaktion, ausgelöst durch Carbachol, stark, hatte aber nur minimale Effekte auf die Cl^–-Sekretion, die durch VIP hervorgerufen wurde. Clotrimazol hemmte jedoch die Cl^–-Sekretionsreaktion auf beide Agonisten. Die Hemmung der Cl^–-Sekretion durch Clotrimazol war vollständig reversibel (96 ± 2%, n = 4) nach 60 Min. Erhalungsphase in der Gegenwart von 0,01 mg/ml Rinderserumalbumin.
Zur Untersuchung der Wirkung von Clotrimazol auf die Synergie zwischen cAMP und Ca⁺⁺-vermittelten Agonisten, wurden zunächst mit VIP stiumulierte Monolayer, die Gleichgeoaichts-Sekretionsniveaus aufwiesen, zusätzlich Carbachol (100 μM) ausgesetzt. Clotrimazol war bei der Hemmung der sekretorischen Reaktion auf Carbachol geringfügig wirksamer als auf cAMP mit IC50-Werten von 3 bzw. 8 μM. Als die Wirkungen von Clotrimazol auf cAMP- und Ca⁺⁺-abhängige sekretorische Wege bei denselben Monolayern untersucht wurden, wurde gefunden, daß die Hemmung der synergistischen Reaktion auf VIP plus Carbachol der Hemmung der Sekretion, die durch Ca⁺⁺-Agonisten allein bewirkt wurde, entsprach. In niedrigen Dosen (= 10^–7 oder weniger) erhöhte Clotrimazol die Cl^–-Sekretionsreaktionen auf die beiden Agonisten leicht (um 5– 10%). Clotrimazol hemmte wirksam die sekretorische Reaktion auf Choleratoxin (20 nM, ein cAMP-abhängiger Agonist) und E.coli-hitzestabiles Toxin (100 nm, ein cGMP-Agonist) (IC50-Werte von 10 μM bzw. 15 μM).
Die Wirkung von Clotrimazol auf die K⁺-Leitfähigkeiten wurde auch mittels isotopischer Flux-Studien unter Verwendung von ⁸⁶RB untersucht. T84-Zellen wurden in der Gegenwart eines cAMP-Agonisten, VIP, oder einem Ca⁺⁺-vermittelten Agonisten (Thapsigargin) angezogen. Clotrimazol wurde hinzugefügt und der ⁸⁶RB-Efflux wurde gemessen. Clotrimazol hemmte den Grund- und den Ca⁺⁺-stimulierten ⁸⁶RB-Efflux in Gegenwart sowohl von cAMP als auch Ca⁺⁺-vermittelten Agonisten im Vergleich zu Zellen, die nicht mit Clotrimazol behandelt wurden, signifikant.
Andere erfindungsgemäße aromatische Verbindungen hemmten die Chloridsekretion. Obwohl Clotrimazol der wirksamste Inhibitor der cAMP- und Ca⁺⁺-erzeugten Cl^–-Sekretion war, waren Ketoconazol, Econazol, Miconazol und 2-Chlorphenyl-bis-phenylmethanol ebenfalls bei der Hemmung der Chloridsekretion wirksam.
Zusammengenommen zeigen diese Studien, daß Clotrimazol die Cl^–-Sekretion, hervorgerufen durch cAMP oder Ca⁺⁺-vermittelte K-Kanäle bei T84-Zellen hemmt.
Beispiel 2: Clotrimazol wirkt auf Endschritte von cAMP- und Ca⁺⁺-abhängigen Signaltransduktionswegen
Zur Feststellung der Stelle, an der Clotrimazol eingreift, wurden die Wirkungen der Clotrimazol-Vorbehandlung auf Monolayer untersucht, die mit Agonisten stimuliert wurden, die die Cl^–-Sekretion an sequentiellen Schritten in der cAMP-Signalkaskade initiieren. T84-Monolayer wurden in HBSS in Gegenwart oder Abwesenheit von Clotrimazol (33 μM) vorinkubiert und dann entweder mit 5 nM VIP (welches die Adenylatcyclase durch heterotrimere GTPase-gekoppelte Zelloberflächenrezeptoren aktiviert), 10 μM Forskolin (das die Adenylatcyclase direkt aktiviert) oder 3 mM 8Br-cAMP (ein direkter Stimulator von Proteinkinase A) stimuliert. Clotrimazol hemmte die sekretorische Reaktion auf jeden dieser Agonisten. Diese Daten stellen einen Hinweis dar, daß Clotrimazol auf einen Schritt einwirkt, die auf die Aktivierung von Proteinkinase A folgen.
Ca⁺⁺-abhängige zelluläre Signalgebung in T84-Zellen und anderen nicht-erregbaren Zellen beinhaltet die Rekrutierung von Inositol-Triphosphat-(IP3)-abhängigen intrazellulären Ca⁺⁺-Speichern (Halm und Frizell, Textbook of Secretory Diarrhea, Rauen Press, 47–58 (1990); Mandel et al.. J. Biol. Chem. 267: 704–712 (1986); Halm et al., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 23) 254: C505–C511 (1988)), und anschließende Aktivierung von Plasmamembran-Ca⁺⁺-Influx-Wegen (Barrett, Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 34): C859–C868 (1993)). Ereignisse stromabwärts können durch [Ca⁺⁺]_i, IP₃, Diacylglycerol oder durch noch nicht identifizierte diffusible Faktoren (Putney and Bird, Cell 75: 199–201 (1993) vermittelt werden. Zur Untersuchung der Stelle, an der Clotrimazol allein bei dieser Signalkaskade ansetzt, wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Clotrimazol (33 μM) vorbehandelte T84-Monolayer mit dem Ca⁺⁺-abhängigen Agonisten Carbachol (100 μM, das sowohl Ca⁺⁺ als auch IP₃-Signale hervorruft), Thapsigargin (5 μM, welches cytoplasmatisches Ca⁺⁺ durch Inhibition von ER-Ca⁺⁺-ATPase erhöht) (Vandorpe et al., Biophys. J. 66: 46–58 (1994)) oder dem Ca⁺⁺-Ionophor Ionomycin (10 μM) stimuliert. Clotrimazol hemmte die Cl^–-Sekretionsreaktion auf jedes dieser Reagenzien stark. Diese Daten deuten darauf hin, daß Clotrimazol auf Schritte einwirkt, die auf die Freigabe intrazellulärer Ca⁺⁺-Speicher folgen.
Beispiel 3: Clotrimazol beeinflußt nicht die Apikalmembran-Anionen-Leitfähigkeit oder basolaterale NaK2Cl-Cotransporter
Methoden:
¹²⁵I-Efflux-Studien
Konfluente Monolayer auf 5 cm² Transwell-Einsätzen wurden 10– 14 Tage nach dem Ausplattieren verwendet. ¹²⁵I wurde als Indikator für die apikale C1^–-Kanal- und basolaterale K⁺-Kanal-Aktivität, wie an anderer Stelle beschrieben (Venglarik et al., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358–C364 (1990), gemessen. Monolayer wurden bei 37°C mit 4 μCi/ml ¹²⁵I in HBSS für 90 Minuten in Anwesenheit oder Abwesenheit von 33 μM Clotrimazol während der letzten 30 Minuten dieser 90-minütigen Vorinkubationsperiode vorinkubiert. Clotrimazol-Vorbehandlung veränderte die Beladung der Zellen mit ¹²⁵I nicht. Nach zweimaligem Waschen in frischem HBSS wurden alle zwei Minuten 0,5 ml Probe aus dem apikalen Reservoir entnommen und durch frisches HBSS ersetzt. Nach vier Basislinienproben wurden die Zellen mit vasoaktivem Darmpeptid (VIP, 5 nM) oder Thapsigargin (5 μM) zur Stimulation der Cl^–-Sekretion behandelt (bei t = 8 Minuten) und zusätzliche 15 Proben in zeitlichem Abstand genommen. Schließlich wurde der Zellmonolayer abgespült, mit seiner Auflage vom Polystyrolring abgetrennt, und die restlichen zellassoziierte Radioaktivität wurde bestimmt. Die Monolayer wurden während der Studien bei 37°C in Raumluft gehalten. ¹²⁵I wurde durch Gammazählung gezählt und auf Prozent Gesamtaufnahme, wie an anderer Stelle beschrieben (Venglarik et al., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358–C364 (1990)), normalisiert.
⁸⁶Rb-Aufnahme-Studien
Konfluente Monolayer auf 5 cm² Transwell-Einsätzen wurden für 30 Minuten in HBSS bei 37°C inkubiert. Eine Gruppe von Kontroll- und CLT-behandelten (33 μM, für 30 Min.) Monolayern wurden mit Bumetanid (10 μM für 12 min) behandelt. Alle Monolayer wurden dann mit VIP (5 nM) behandelt und für 3 Minuten in HBSS bei 37°C, enthaltend 1 μCi/ml ⁸⁶Rb, transferiert.
Ergebnisse:
Untersuchungen wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Hemmung der elektrogenen Cl^–-Sekretion durch Blockade der – C1^–-Kanäle der apikalen Membran oder Blockade der basolateral angeordneten NaK2Cl-Cotransporter geschieht. Zur Feststellung, ob Clotrimazol die Ionenleitfähigkeit durch Cl^–-Kanäle der apikalen Membran beeinflußt, untersuchten wir den Zeitverlauf des ¹²⁵I-Efflux aus T84-Monolayern, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Clotrimazol vorbehandelt wurden (Venglarik et al., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358–C364 (1990)). Clotrimazol hatte nur geringen bis gar keinen Effekt auf den zeitlichen Verlauf des ¹²⁵I-Efflux aus mit VIP behandelten Monolayern. Die Geschwindigkeitskonstanten für den ¹²⁵I-Efflux aus mit Clotrimazol behandelten oder nicht behandelten Monolayern waren nicht unterscheidbar (0,0637 gegenüber 0,0645% Aufnahme/Minute, n = 2, zweifach). Clotrimazol zeigte ähnliches Fehlen eines Effektes auf den ¹²⁵I-Efflux bei Stimulation durch Thapsigargin.
Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von Clotrimazol auf basolaterale NaK2Cl-Cotransporter, bestimmt durch bumetanid sensitive ⁸⁶RB-Aufnahme (Matthews et al., J. Biol. Chem. 269: 15703–15709 (1994)). Clotrimazolbehandlung reduzierte die Gesamtmenge der ⁸⁶Rb-Aufnahme um 53,6 ± 5,8% (Mittelwert ± Standardabweichung SEM, n = 6), hatte aber keinen Effekt auf die Fraktionskomponente, die bumetanidsensitiv war (58 ± 3,2% gegenüber 75,2 ± 12,7% Gesamtaufnahme, Mittelwert ± SEM). Insgesamt legen diese Werte den Schluß nahe, daß Clotrimazol die Cl^–-Sekretion in T84-Zellen nicht über die Hemmung entweder der Cl^–-Kanäle der apikalen Membran oder der Basolateralmembran-NaK2Cl-Cotransporter beeinflußt.
Beispiel 4: Clotrimazol hemmt die Chloridsekretion bei T84-Zellen durch Hemmung des K⁺-Efflux durch basolaterale K⁺-Kanäle
Methoden:
1. Clotrimazol hemmt die Chloridsekretion durch Blockade des K⁺-Transports durch Ba⁺⁺-sensitive und charybdotoxinsensitive Kanäle.
⁸⁶Rb-Efflux-Studien
Konfluente Monolayer auf 5 cm² Transwell-Einsätzen wurden 10– 14 Tage nach dem Ausplattieren verwendet. ⁸⁶Rb-Flux wurde als Indikator für die apikale Cl^–-Kanal und basolaterale K⁺-Kanal-Aktivität, wie an anderer Stelle beschrieben (Venglarik et al., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358–C364 (1990), gemessen. Monolayer wurden bei 37°C mit 4 μCi/ml ⁸⁶Rb in HBSS für 90 Minuten in Anwesenheit oder Abwesenheit von 33 μM Clotrimazol während der letzten 30 Minuten dieser 90-minütigen Vorinkubationsperiode vorinkubiert. Clotrimazol- Vorbehandlung veränderte die Beladung der Zellen mit ⁸⁶Rb nicht. 1-ml-Proben wurden aus dem basolateralen Reservoir entnommen und ersetzt. Nach vier Basislinienproben wurden die Zellen mit vasoaktivem Darmpeptid (VIP, 5 nM) oder Thapsigargin (5 μM) zur Stimulation der Cl^–-Sekretion behandelt (bei t = 8 Minuten) und zusätzliche 15 Proben in zeitlichem Abstand genommen. Schließlich wurde der Zellmonolayer abgespült, mit seiner Auflage vom Polystyrolring abgetrennt, und die restliche zellassoziierte Radioaktivität wurde bestimmt. Die Monolayer wurden während der Studien bei 37°C in Raumluft gehalten. ⁸⁶Rb wurde durch Szintillationszählung gezählt und auf Prozent Gesamtaufnahme, wie an anderer Stelle beschrieben (Venglarik et al., Am. J. Physiol. (Cell Physiol. 28): C358– C364 (1990)), normalisiert.
Ergebnisse:
Die K⁺-Kannal-Aktivität wurde durch Messung des ⁸⁶Rb-Efflux abgeschätzt. Clotrimazol hemmte die Rate des ⁸⁶Rb-Efflux nach Behandlung mit dem cAMP-Agonisten VIP (5 nM) signifikant. Die Geschwindigkeitskonstante für VIP-stimulierten ⁸⁶Rb-Efflux wurde in Monolayern, die mit Clotrimazol behandelt wurden, um 87% reduziert (0,0062 gegenüber 0,0465% Aufnahme/Minute, n = 2, dreifach). Clotrimazol hemmte in gleichem Maß den ⁸⁶Rb-Efflux aus Monolayern, die mit Thapsigargin stimuliert wurden (Feld B, Geschwindigkeitskonstante 0,011 gegen 0,048% Aufnahme/Minute, n = 2), was darauf hinweist, daß Clotrimazol die Cl^– -Sekretion durch Blockade des K⁺-Transports durch Ba⁺⁺-sensitive und charybdotoxinsensitive Kanäle hemmt.
2. Clotrimazol hemmt die Chlorid-Sekretion durch bestimmte cAMP und Ca⁺⁺-sensitive basolaterale K⁺-Kanäle.
Selektive Membran-Permeabilisierung und Messung der Kalium-Leitfähigkeit der Basolateralmembran: Die basolaterale Kalium-Leitfähigkeit wurde durch die von Dawson und Mitarbeitern entwickelte Technik bestimmt. Ein Kaliumgradient (mukasal zu serosal) wurde zunächst über den Monolayer unter Verwendung asymmetrischer mukosaler und serosaler Puffer, die K⁺ als einziges permeierendes Ion enthielten, etabliert. Die Addition von Amphotericin B (20 μM) zu dem mukosalen Reservoir bildet leitfähige Poren in der apikalen Membran und entfernt auf diese Weise jeden Widerstand gegenüber transepithelialer Kaliumbewegung über diese Membran. Dadurch wird, unter den Versuchsbedingungen, bei denen der Monolayer kurzgeschlossen (d. h. Spannungsschluß bei Nullpotential) und der transepitheliale Kaliumgradient konstant ist, der amphotericinabhängige I_SC ein Maß für die Rate des transepithelialen Kaliumflux über basolaterale Membranen. Änderungen im Kurzschlußstrom (I_SC) repräsentieren dann Änderungen in der basolateralen K⁺-Leitfähigkeit (gK). I_SC und K⁺-Leitfähigkeit wurden unter Verwendung von Kalomel-Elektroden, 3 M KCl-Agar-Brücken, und einer Spannungsklammer (University of Iowa, Iowa City) gemessen. Um eine Spannungs-Strom-Kanal-Beziehung herzustellen, wurden Ströme durch 1 sek. Testpotentiale von –80 bis +80 in 10 mV-Schritten in der asymmetrischen Glukonatlösung mit hoher K⁺-Konzentration erzeugt.
Berechnung der Basolateralmembran-K⁺-Permeabilität: Die Membranpermeabilität wurde nach folgender Formel berechnet: PK = (cm/s) = JK(mM/cm2·s)/Δ[K+](mM/cm3) wobei Δ[K⁺] gleich der Differenz in der K⁺-Konzentration (135 mM) zwischen der asymmetrischen apikalen und basolateralen Inkubationslösung ist. Maximale I_SC-Werte wurden durch Teilung durch die Faraday-Konstante F (96500 Coulomb/mol), wie an anderer Stelle beschrieben (Huflejt et al., J. Clin. Invest. 93: 1900–1910 (1994)), in K⁺-Flüsse konvertiert.
Ergebnisse:
Der basolaterale K⁺-Transport wurde in T84-Monolayern untersucht, die apikal durch Vorbehandlung mit Amphotericin B permeabilisiert wurden. Apikale und basolaterale Puffer enthielten K⁺ als einziges permeierendes Ion. Alle Studien wurden mit einem 135 mM basolateral gerichteten K⁺-Gradienten durchgeführt. Diese Methode ist bereits angewendet worden, um den Cl^–- und K⁺-Transport bei T84-Zellen und HT29-Cl.16E-Zellen zu untersuchen. Die Ionenleitfähigkeit in den luminalen oder basolateralen Membranen konfluenter T84-Zell-Monolayer kann durch selektive Permeabilisierung der apikalen oder basolateralen Membran unter Verwendung des Ionophors Amphotericin B getrennt abgeschätzt werden. Dies entfernt künstlich jeden elektrischen Widerstand gegenüber einem Ionentransport über die Plasmamembran durch Poren, die mit Hilfe von Amphotericin B gebildet wurden. Im Ergebnis wird die kontralaterale Plasmamembran geschwindigkeitsbegrenzend für den transepithelialen Ionentransport. Agonistabhängige Änderungen in der Ionen-Leitfähigkeit können direkt entweder als transepithelialer Kurzschlußstrom (I_SC) in Gegenwart eines Ionengradienten oder als transepitheliale Leitfähigkeit (G) in Gegenwart eines transepithelialen Potentials abgeschätzt werden.
Der K⁺-Transport wurde an der Basislinie und nach Zugabe von cAMP- und Ca⁺⁺-Agonisten gemessen. Die anfängliche Permeabilisierung mit Amphotericin B war verbunden mit einem 49 ± 19%igen Anstieg in der Leitfähigkeit. Durch Amphotericin 8 gebildete Poren zeigten Selektivität für monovalente Kationen. Ca⁺⁺ blieb vergleichsweise impermeierend, wie durch den geringen Gleichgewichts-Anstieg von I_SC und G_K, verursacht durch die apikale Permeabilisierung mit Amphotericin B, gezeigt wurde. Bei dieser geringen Basislinien-I_SC und -G_K, waren sowohl die cAMP- als auch Ca⁺⁺-Permeabilitäten (PK) unmittelbar sichtbar nach Agonistenstimulation. Behandlung mit dem cAMP-Agonisten Forskolin (10 μM) verursachte einen raschen Anstieg im K⁺-Transport durch augenscheinlich niedrigleitfähige Wege, wie der symmetrische Anstieg des I_SC und G zeigt. Carbachol erhöhte ebenfalls die K⁺-Ströme. Die Größenordnung des Carbachol-induzierten I_SCK war jedoch gleich, wenn Carbachol allein oder nach Forskolin zugefügt wurde (111,7 ± 7,4 gegen 180,7 ± 15,7 μA/cm²) wurde. Daher ergab sich kein klarer Nachweis für eine Synergie zwischen cAMP- und Ca⁺⁺-vermittelten K⁺-Wegen, wie in einem apikal permeabilisierten Zellsystem erwartet würde. Analog zu unseren vorherigen Befunden für intakte T84-Monolayer hielten die forskolininduzierten Änderungen im I_SC an, während der Effekt von Carbachol kurzlebig war. Sowohl I_SCK als auch G_K kehrten innerhalb von 5 Minuten nach Zugabe von Carbachol zu Basislinienwerten zurück.
Formale Strom/Spannungs(I/V)-Verhältnisse wurden vor und nach der Agonistenstimulation definiert, um sicherzustellen, daß die cAMP- und Ca⁺⁺-abhängigen Ströme bei physiologischen Membranpotentialen hervorgerufen wurden. Thapsigargin wurde anstatt Carbachol als Ca⁺⁺-Agonist bei diesen Studien verwen det, weil die K⁺-Übergänge, die durch Thapsigargin hervorgerufen wurden, Gleichgewichtsleitfähigkeiten von weit längerer Dauer als bei intakten Monolayern erreichten. Unter Bedingungen basolateral gerichteter K⁺-Gradienten aktivierten sowohl Forskolin als auch Thapsigargin makroskopisch nach außen gerichtete (mukosale zu serosal) Ströme bei positiven transepithelialen Spannungen. Experimentelle I/V-Verhältnisse, die nach Zugabe von Foskolin und Thapsigargin erhalten wurden, zeigten umgekehrte Potentiale (–40 mV), die dem kalkulierten Nernst-Potential nahekamen (–85 mV berechnet als RT/zQo log[Na]_aus/[Na]_ein). Diese Ergebnisse stimmen mit der Aktivierung von bestimmten cAMP- und Ca⁺⁺-sensitiven Basolateralmembran-K⁺-Leitfähigkeiten in Zusammenhang mit einem oder mehreren nichtspezifischen transepithelialen Ionen-Nebenschlüssen, möglicherweise auftretend durch interzelluläre "tightjunctions" oder Balsolateralmembran-"Lecks", überein.
Um die beobachteten Änderungen des I_SC- und G-repräsentierten K⁺-Transport durch K⁺-selektive Wege zu bestätigen, wurde der Effekt von Forskolin und Carbachol auf die T84-Monalayer-Leitfähigkeiten unter Verwendung von Puffern mit Na⁺ als einzigem permeierendem Kation untersucht. Diese Studien wurden unter Verwendung eines analogen 135 mM basolateral gerichteten Kationen(Na⁺-)-Gradienten durchgeführt. Anstiege in ISC und G waren in Abwesenheit von K⁺ nicht feststellbar. Daher sind die Anstiege bei Kationen-Leitfähigkeiten, die durch Agonisten-Stimulation induziert wurden, spezifisch für den K⁺-Transport.
Zwei verschiedene K⁺-Efflux-Wege sind bereits in T84-Zellen identifiziert worden. Ein Weg, ist an der sekretorischen Reaktion auf cAMP-abhängige Agonisten beteiligt und zeigt Sensi tivität gegenüber Ba⁺⁺-Salzen. Der andere K⁺-Efflux Weg vermittelt die Reaktion auf Ca⁺⁺-abhängige Agonisten und ist Ba⁺⁺-unempfindlich. Diese Erkenntnisse wurden mit dem permeabilisierten Zell-Model bestätigt. Der cAMP-sensitive I_K (hervorgerufen durch Forskolin, 10 μM) wurde zu über 70% durch Zugabe von BaCl₂ (3 mM) zu basolateralen Reservoiren gehemmt. Ba⁺⁺ hatte jedoch keinen messbaren Effekt auf den K⁺-Transport, der durch die nachfolgende Zugabe von Carbachol (100 μM) zu denselben Monolayern ausgelöst wurde. Im Gegensatz dazu wurde der Ca⁺⁺-induzierte I_K zu 50% durch Vorbehandlung mit dem Skorpiongift Charybdotoxin (100 nM) inhibiert, wenn permeabilisierte Monolayer zunächst mit Carbachol behandelt wurden. Charybdotoxin hatte jedoch keinen messbaren Effekt auf den K⁺-Transport, der durch anschließende Zugabe von Forskolin ausgelöst wurde. Daher entsprach die differentielle Sensitivität des K⁺-Transports bei permeabilisierten Zellen gegenüber Hemmung durch die K⁺-Kanalblocker BaCl₂ und Charybdotoxin exakt dem Effekt dieser kanalspezifischen Inhibitoren auf den K⁺-Transport bei intakten Zellen (indirekt bestimmt als Cl^–-Strom).
Insgesamt definieren diese Studien das permeabilisierte T84-Modell und stellen starke Hinweise bereit, daß unter den vorgegebenen Bedingungen sowohl I_SC als auch G den K⁺-Transport durch bestimmte cAMP- und Ca⁺⁺-sensitive basolaterale K⁺-Kanäle repräsentieren.
3. Clotrimazol und 2-Chlorphenyl-bis-phenyl-methanol, ein strukturell verwandter stabiler Metabolit, hemmen den K⁺-Transport durch cAMP- und Ca⁺⁺-abhängige K⁺-Kanäle
Als nächstes untersuchten wir die Hypothese, daß Clotrimazol direkt die Basolateralmembran-K⁺-Kanäle bei menschlichen T84-Darmzellen hemmt, wie es dies bei roten Blutkörperchen tut. Clotrimazol hemmt den Zeitverlauf des K⁺-Transports nach Behandlung mit dem cAMP-Agonisten Forskolin (10 μM) und dem Ca⁺⁺-Agonisten Carbachol (100 μM) signifikant. Formale I/V-Verhältnisse, bestimmt im Gleichgewichtszustand nach cAMP- oder Ca⁺⁺-Stimulation, bestätigten, daß Clotrimazol sowohl cAMP- als auch Ca⁺⁺-sensitive Kanäle beeinflußt. Nahezu identische Ergebnisse wurden erhalten mit 2-Chlorphenyl-bis-phenyl-methanol. Clotrimazol und sein Metabolit 2-Chlorphenyl-bis-phenyl-methanol hemmen die cAMP- und Ca⁺⁺-sensitiven Darm-K⁺-Kanäle direkt, was darauf hindeutet, daß die Ringstruktur in Abwesenheit des Imidazolrings für diese biologische Aktivität ausreicht (und möglicherweise erforderlich ist).
4. Clotrimazol zielt auf die basolaterale anstatt auf die apikale Oberfläche von T84-Zellen.
Methoden:
Messung der Cl^–-Leitfähigkeit der apikalen Plasmamembran: Zur Untersuchung der apikalen Cl^–-Leitfähigkeit wurde Cl^– als einziges permeierendes Ion in identischen apikalen und basolateralen Pufferlösungen verwendet. Monolayer wurden basolateral durch Zugabe von 100 μM Amphotericin B zum serosalen Reservoir permeabilisiert. Die Generierung von Spannungs-Strom-Kurven der Kanalströme wurde durch 1 sek. Testpotentiale von –80 bis +80 mV in 10-mV-Schritten in symmetrischen Cl^– -Puffer mit hohem Cholingehalt hervorgerufen.
Ergebnisse:
Es wurden Studien dazu durchgeführt, ob das primäre Ziel von Clotrimazol auf der basolateralen oder apikalen Oberfläche der Zelle lokalisiert war. Die schnellste Hemmung wurde durch Inkubation mit Clotrimazol auf beiden Seiten des Monolayers erreicht. Basolaterale Applikation allein war jedoch nahezu genauso effektiv wie Inkubation auf beiden Seiten. Zusätzlich erwies sich die augenscheinliche Inhibitionsstärke von Clotrimazol zu einem gegebenen Zeitpunkt bei basolateraler gegenüber apikaler Anwendung als größer. Die bevorzugte Wirkung von Clotrimazol an der basolateralen Oberfläche der Zelle stimmt mit der Hypothese überein, daß sein grundsätzliches Ziel die basolateralen K⁺-Kanäle sind.
Um diese Befunde zu bestätigen, untersuchten wir den Cl^–-Transport bei T84-Zell-Monolayern, die basolateral mit durch Amphothericin B gebildeten Poren permeabilisiert waren. Diese Untersuchungen wurde mit Cl^– als einzigem permeierendem Anion und mit symmetrischen apikalen und basolateralen Cl^–-Konzentrationen (142 mM) durchgeführt. Bei Monolayern, die nicht mit Clotrimazol behandelt wurden, erhöhte die Zugabe von Forskolin (10 μM) zu basolateralen Reservoiren die Cl^–-Leitfähigkeit signifikant auf Werte über der Basislinie, vermutlich durch Aktivierung des Zystische-Fibrose-Transmembran-Regulator(Cystic Fibrosis Transmembran Regulator, CFTR)-Cl^–-Kanals. Im Gegensatz zu dem eindeutigen hemmenden Effekt von Clotrimazol auf die basolaterale K⁺-Leitfähigkeit hatte Clotrimazol jedoch keinen messbaren Effekt auf foskolin- oder thapsigarginstimulierte Cl^–-Leitfähigkeit. I/V-Verhältnisse für den Cl^–-Transport waren bei Monolayern, die mit Clotrimazol behandelt oder nicht behandelt wurden, nahezu identisch.
Diese Daten liefern weitere Hinweise, daß Clotrimazol die Cl^– -Sekretion bei intakten T84-Zellmonolayern durch spezifische Beeinflussung basolateraler K⁺-Kanäle hemmt. Cl^–-Kanäle in der apikalen Membran wurden nicht gehemmt.
Beispiel 5: Clotrimazol hemmt die Cl^–-Sekretion in vivo.
1. Ussing-Kammerstudien unter Verwendung von Kaninchen-Dickdarmmukose:
Methoden:
4 männliche Neuseeland-Kaninchen (2,5 kg) wurden durch intravenöse Injektion von Pentobarbital (0,5 ml/kg) anästhesiert. Ein 15 cm langes Ende des Dickdarms wurde entfernt und der Länge nach geöffnet. Externe Muskelschichten wurden durch stumpfe Dissektion entfernt und Darmmukosapräparate wurden in eine Ussing-Kammer (DCTSYS; Precision Instrument Design, DA; 10,3 cm³ Oberfläche) plaziert und mit einer Pufferlösung inkubiert, die folgende Bestandteile enthielt (in mM): NaCl 122,0; CaCl₂, 2,0; MgSO₄, 1,3; KCl, 5,0; Glukose, 20; NaHCO₃, 25,0 (pH bei Begasung mit 95% O₂/5%CO₂; die Temperatur wurde auf 37°C gehalten) mit oder ohne Clotrimazol (30 μM). Das Volumen auf jeder Seite der Mukosa betrug 7 ml.
Potentialdifferenz und I_SC wurden kontinuierlich überwacht und alle 10 Minuten aufgezeichnet. Luminale und serosale Pufferlösungen wurden mit Ag-AgCl-Elektroden (Spannungs-/Strom-Klammer, Modell VCC600, Physiologic Instruments Inc., San Diegeo, CA, USA) und Ringer/Agar-Brücke zur Spannungsklammervorrichtung (Model DVC-1000; Spannungs-/Strom-Klammer World Precision Instruments Inc.) ausgestattet. Der Widerstand (R) wurde mit Hilfe des Ohmschen Gesetzes berechnet und der I_SC wird in Ω × cm² angegeben. Nachdem stabile Basiswiderstands- und -I_SC-Werte erhalten worden waren, wurden die Mukosapräparate in Gegenwart oder Abwesenheit von serosalem Clotrimazol (30 μM) für 30 Minuten inkubiert und dann durch Zugabe von Forskolin (10 μM) oder Carbachol (10 μM) zum serosalen Reservoir stimuliert.
Ergebnisse:
Um die Fähigkeit von Clotrimazol zu untersuchen, die K⁺-Kanäle und auf diese Weise die Cl^–-Sekretion bei nativem Darmgewebe zu blockieren, plazierten wir isolierte Präparate von Kaninchen-Dickdarmmukosa in Ussing-Kammern, die modifizierte Ringerlösung mit oder ohne Clotrimazol enthielten. Nachdem der I_SC stabil war, wurde Forskolin (10 μM) und dann Carbachol (100 μM) aufeinanderfolgend zu serosalen Reservoiren zugefügt, und I_SC und G wurden kontinuierlich gemessen. Clotrimazol hemmte den zeitlichen Verlauf des forskolininduzierten I_SC stark. Carbachol hatte keinen weiteren Effekt auf den I_SC in diesem System.
2. Mausmodell für sekretorische Diarrhoe:
Methoden:
An behandelte und unbehandelte (Kontroll-) Mäuse wurde über Sonden Clotrimazol (150 mg/kg/Tag, aufgeteilt in zwei gleiche Dosen, gelöst in Erdnußöl bei einer Konzentration von 20 mg/ml) oder die Vehikelkontrolle über eine Zeitdauer von 7 Tagen verfüttert. Die Mäuse wurden über Sonden mit 25 μg gereinigtem Choleratoxin (Calbiochem, San Diego, CA) in PBS oder Vehikelkontrolle allein (PBS ohne Choleratoxin) oder Choleratoxin in PBS mit 30 μM Clotrimazol konfrontiert. Die Tiere wurden getötet, nachdem sie 5 Stunden in einer nicht beengten CO₂-Kammer waren.
Die Kadaver wurden gewogen, das Abdomen eröffnet und Ligaturen wurden am proximalen Duodenum und distalen Rektum abgebunden. Der Darmbereich wurde von stützenden Strukturen befreit und als eine Einheit entnommen und gewogen. Kleine und große Darmsegmente wurden in Bezug auf das Körpergewicht (Darmgewicht/Kadavergewicht) für jedes Tier normalisiert.
Ergebnisse:
Zur Untersuchung, ob Clotrimazol die Darmsekretion in vivo hemmt, verwendeten wir ein Mausmodell der sekretorischen Diarrhoe. Balb/C-Mäuse wurden über Sonden mit 150 mg/kg/Tag Clotrimazol, aufgeteilt in zwei gleiche Dosen, oder mit einer Vehikelkontrolle alle 12 h über 7 Tage gefüttert und anschließend oral gereinigtem Choleratoxin (25 μg) ausgesetzt. Fünf Stunden nach der Behandlung mit Choleratoxin wurden die Mäuse getötet und die Darmflüssigkeitsekretion gravimetrisch bestimmt. Vorbehandlung mit Clotrimazol reduzierte die durch Choleratoxin verursachte Darmflüssigkeitsekretion um 86%. Clotrimazol hatte keinen Effekt auf die Darmsekretion in Abwesenheit des Choleratoxins. Daher behandelt Clotrimazol wirksam sekretorische Diarrhoe in vivo, vermutlich durch Hemmung basolateraler K⁺-Kanäle der Kryptaepithelzellen.
Nach der Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen versteht es sich von selbst, daß die vorliegende Erfindung nur durch die angefügten Ansprüche limitiert ist.

Claims

Verwendung einer aromatischen Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diarrhoe oder Ruhr, wobei die aromatische Verbindung die allgemeine Formel
aufweist; wobei n = 0–3 ist; wobei p = 0 oder 1 ist; wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH₂)_{m(m=0,1,2oder3)}, CH=CH, C=C, SCH₂, OCH₂ und NOCH₂; wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH, SH, NO₂, CN, CHO, ONH₂, COR'', CO₂H, CO₂R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', Furanyl, Pyridinyl, Thiophenyl, Indolyl, Quinolyl und CONR''(OCH₃); wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl und Heteroaryl; wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl und substituiertem Phenyl; und wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Biphenyl, Bibenzyl und Naphthyl; wobei der Phenyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO₂, CN, CF₃, NR''R'' und CO₂R; wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem Alkyl C_z(z=1–5) substituiertem geradkettigen Alkyl C_z(z=1–5), verzweigtem Alkyl C_z(z=1–5) und substituiertem Alkyl C_z(z=1–5); wobei der Alkyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, OH, OCH₃, SH, SCH₃, NH, NHCH₃ und N(CH₃); und wobei R'' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und R.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die aromatische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die aromatische Verbindung oral verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Diarrhoe bei einem Menschen vorgesehen ist, oder wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Ruhr bei einem Pferd, einer Kuh, einem Schwein oder einer Ziege vorgesehen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Diarrhoe vorgesehen ist und ein Anti-Diarrhoe-Mittel, bevorzugt ein orales Rehydrierungsfluid umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Ruhr vorgesehen ist und ein Anti-Ruhr-Mittel umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die aromatische Verbindung 2-Chlorphenyl-bis-phenyl-methanol ist und die folgende Formel aufweist:
Verwendung einer aromatischen Verbindung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diarrhoe oder Ruhr, wobei die aromatische Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Miconazol und Econazol.
Tierarzneiliche Zubereitung umfassend: eine aromatische Verbindung in einer Menge, die ausreicht, um Ruhr bei einem Tier zu hemmen, wobei die aromatische Verbindung die allgemeine Formel
aufweist; wobei n = 0–3 ist; wobei p = 0 oder 1 ist; wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH₂)_{m(m=0,1,2oder3)}, CH=CH, C=C, SCH₂, OCH₂ und NOCH₂; wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH, SH, NO₂, CN, CHO, ONH₂, COR'', CO₂H, CO₂R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', Furanyl, Pyridinyl, Thiophenyl, Indolyl, Quinolyl und CONR''(OCH₃); wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl und Heteroaryl; wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl und substituiertem Phenyl; und wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Biphenyl, Bibenzyl und Naphthyl; wobei der Phenyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, R, OR'', SR'', NO₂, CN, CF₃, NR''R'' und CO₂R; wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem Alkyl C_z(_z=1–5) substituiertem geradkettigen Alkyl C_z(z=1–5) verzweigtem Alkyl C_z(z=1–5) und substituiertem verzweigten Alkyl C_z(z=1– ₅₎; wobei der Alkyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, OH, OCH₃, SH, SCH₃, NH₂, NHCH₃ und N(CH₃); und wobei R'' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und R; und ein Anti-Ruhr-Mittel.
Tierarzneiliche Zubereitung nach Anspruch 9, wobei das Anti-Ruhr-Mittel ein Colostrum-Extrakt, eine immunologische Colostrum-Zubereitung, eine mikroorganismusspezifische immunologische Zubereitung, ein orales Rehydrierungsfluid, eine Elekrolytersatz-Zusammensetzung oder eine antibiotische Zusammensetzung ist.
Tierarzneiliche Zubereitung nach Anspruch 9, wobei die tierarzneiliche Zubereitung ein Trockenpräparat ist.
Pharmazeutische Zubereitung umfassend: eine aromatische Verbindung in einer Menge, die ausreicht, um Diarrhoe zu hemmen, wobei die aromatische Verbindung die allgemeine Formel
aufweist; wobei n = 0–3 ist; wobei p = 0 oder 1 ist; wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (CH₂)_m(m=0,1,2,3), CH=CH, C=C, SCH₂, OCH₂ und NOCH₂; wobei R' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus H, OH, SH, NO₂, CN, CHO, ONH₂, COR'', CO₂H, CO₂R'', OR'', SR'', NR''R'', CONR''R'', Furanyl, Pyridinyl, Thiophenyl, Indo- lyl, Quinolyl und CONR''(OCH₃); wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl und Heteroaryl; wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl und substituiertem Phenyl; und wobei Ar¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenyl, substituiertem Phenyl, Biphenyl, Bibenzyl und Naphthyl; wobei der Phenyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, R, R'', SR'', NO₂, CN, CF₃, NR''R'' und CO₂R; wobei R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus geradkettigem Alkyl C_z(z=1–5) substituiertem geradkettigem Alkyl C_z(z=1–5) verzweigtem Alkyl C_z(z=1–5), und substituiertem verzweigten Alkyl C_z(z=1– ₅₎; wobei der Alkyl-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cl, F, Br, I, OH, OCH₃, SH, SCH₃, NH₂, NHCH₃ und N(CH₃); und wobei R'' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff und R; und ein Anti-Diarrhoe-Mittel.
Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 12, wobei das Anti-Diarrhoe-Mittel ein orales Rehydrierungsfluid, ein Antibiotikum, eine Elektrolytzusammensetzung, eine Immunglobulin-Zubereitung aus Rinder-Colostrum oder eine orale Zucker-Elekrolyt-Lösung ist.
Pharmazeutische Zubereitung nach einem der Ansprüche 9 oder 12, wobei die aromatische Verbindung 2-Chlorphenylbis-phenyl-methanol ist und die folgende Formel aufweist: