DE69629176T2 - Verwendung von thiazoliumverbindungen zum verhindern und umkehren der bildung von endprodukten der fortgeschrittenen glykosylierung - Google Patents

Verwendung von thiazoliumverbindungen zum verhindern und umkehren der bildung von endprodukten der fortgeschrittenen glykosylierung Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Alterung von Proteinen, die aus ihrer Reaktion mit Glukose und anderen reduzierenden Zuckern resultiert, und insbesondere auf die Inhibierung der Reaktion von nicht-enzymatischen glykosylierten Proteinen und die Aufspaltung von Vernetzungen, die durch die anschließende Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung (Glykation) gebildet wurden.
  • Die Reaktion zwischen Glukose und Proteinen ist seit einiger Zeit bekannt. Ihre erste Manifestation bestand in dem Erscheinen von braunen Pigmenten während des Kochens von Lebensmitteln, was von Maillard 1912 nachgewiesen wurde, der beobachtete, daß Glukose oder andere reduzierende Zucker mit Aminosäuren reagieren, wodurch Addukte gebildet werden, die einer Reihe von Dehydratisierungen und Umlagerungen unterliegen, wodurch stabile braune Pigmente gebildet werden. Weitere Untersuchungen schlugen vor, daß gelagerte und wärmebehandelte Lebensmittet nicht-enzymatischer Bräunungsreaktion infolge der Reaktion zwischen Glukose und der Polypeptidkette unterliegen, und daß die Proteine folglich vernetzt werden und entsprechend verminderte Bioverfügbarkeit aufweisen.
  • Diese Reaktion zwischen reduzierenden Zuckern und Nahrungsmittelproteinen sollte ihre Parallele in vivo aufweisen. Daher ist gezeigt worden, daß die nichtenzymatische Reaktion zwischen Glukose und den freien Aminogruppen an Proteinen unter Bildung eines stabilen 1-Deoxyketosyl-Addukts, bekannt als Amadori-Produkt, mit Hämoglobin stattfindet, wobei eine Umlagerung des Aminoendes der beta-Kette von Hämoglobin durch die Reaktion mit Glukose das Addukt bildet, das als Hämoglobin A1c bekannt ist. Die Reaktion sollte ebenso mit einer Vielzahl an anderen Körperproteinen, wie Linsenkristallen, Kollagen und Nervenproteinen, stattfinden. Siehe Bucala et al., „Advanced Glycosylation; Chemistry, Biology, and Implications for Diabetes and Aging" in Advances in Pharmacology Vol. 23, S. 1–34, Academic Press (1992).
  • Außerdem sind braune Pigmente mit Spektral- und Fluoreszenz-Eigenschaften, die denjenigen von Maillard-Produkten im Spätstadium ähnlich sind, in Verbindung mit einigen langlebigen Proteinen, wie Linsenproteine und Kollagen von alten Individuen, in vivo beobachtet worden. Ein altersabhängiger linearer Zuwachs im Pigment wurde in menschlichem Dura-Kollagen zwischen dem Alter von 20 und 90 Jahren beobachtet. Interessanterweise kann die Alterung von Kollagen durch das Vernetzen, das durch Glukose induziert wird, in vitro imitiert werden; und das ebenso bemerkte Einfangen anderer Proteine und die Bildung von Addukten durch Kollagen tritt theoretisch durch eine Vernetzungsreaktion auf, und es wird angenommen, daß dies die Erklärung für die beobachtete Ansammlung von Albumin und Antikörpern in der Nierenbasalmembran ist.
  • In US-Patent 4,758,583 wurden ein Verfahren und die zugehörigen Mittel offenbart, die dazu dienten, die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung durch die Reaktion mit einem frühen Glykosylierungsprodukt, das aus der ursprünglichen Reaktion zwischen dem Zielprotein und Glukose resultiert, zu inhibieren. Folglich wurde postuliert, daß die Inhibierung als Reaktion zwischen dem Inhibitor und dem frühen Glykosylierungsprodukt stattfindet, was wahrscheinlich die nachfolgende Reaktion des glykosylierten Proteins mit zusätzlichem Proteinmaterial unterbricht, wodurch das vernetzte Produkt im Spätstadium gebildet wird. Eines der Mittel, das als Inhibitor nachgewiesen wurde, war Aminoguanidin, und die Ergebnisse des weiteren Testens bestätigten seine Wirksamkeit in dieser Hinsicht.
  • Während der Erfolg, der mit Aminoguanidin und ähnlichen Verbindungen erreicht worden ist, vielversprechend ist, besteht eine Notwendigkeit fort, zusätzliche Inhibitoren nachzuweisen und zu entwickeln, die die Verfügbarkeit und vielleicht den Umfang dieser potentiellen Wirksamkeit und seinen diagnostischen und therapeutischen Nutzen erweitern. Es besteht eine weitere Notwendigkeit, Mittel zu finden, die nicht nur diese Reaktion und ihre Folgen inhibiert, sondern auch Mittel, die in der Lage sind, die Vernetzungen, die infolge der zuvor existierenden Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung gebildet wurden, aufzuspalten, wodurch die resultierenden Wirkungen davon umgekehrt werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen, die Verwendung von Verbindungen und Zusammensetzungen für die Inhibierung der Bildung von Proteinen der fortgeschrittenen Glykosylierung (Proteinalterung) und für das Aufspalten der Vernetzungen offenbart, die sich zwischen Endprodukten (AGEs) der fortgeschrittenen Glykosylierung (Glykation) oder zwischen AGEs und anderen Proteinen bilden. Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung (Glykation) und Vernetzung, die durch reaktive Zucker, die in vivo oder in Nahrungsmitteln, einschließlich Ribose, Galaktose und Fruchtzucker, vorliegen, verursacht werden, würden ebenso durch die Verbindungen, die Verwendung der Verbindungen und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verhindert und umgekehrt werden.
  • Insbesondere umfassen die Zusammensetzungen Verbindungen zur Inhibierung der Bildung und Umkehrung der zuvor gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung (Glykation) und Aufspaltung der nachfolgenden Vernetzungen. Obwohl nicht gewünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie eingeschränkt zu sein, wird angenommen, daß die Aufspaltung der zuvor gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung (Glykation) und der Vernetzungen ein Ergebnis der Spaltung von α-Dicarbonyl-basierenden Proteinvernetzungen ist, die in den Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung vorliegen. Die Erfindung ist daher auf Verbindungen, die durch ihre Fähigkeit, eine derartige Spaltung durchzuführen, verwendet werden können, um das zuvor gebildete Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung und die Vernetzung aufzuspalten, und auf die resultierenden schädlichen Wirkungen davon sowohl in vitro als auch in vivo gerichtet.
  • Bestimmte Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind Mitglieder der Klasse von Verbindungen, die als Thiazoliumverbindungen bekannt sind.
  • Die Thiazoliumverbindungen weisen die folgende Strukturformel:
    Figure 00040001
    wie in Anspruch 1 definiert, auf.
  • Die Verbindungen und deren Zusammensetzungen, die in dieser Erfindung verwendet werden, scheinen mit einem frühen Glykosylierungsprodukt zu reagieren, wodurch verhindert wird, daß es später die Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung bildet, was zu Vernetzungen und dadurch zur Molekular- oder Proteinalterung und anderen nachteiligen molekularen Folgen führt. Außerdem reagieren sie mit bereits gebildeten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, wodurch die Menge derartiger Produkte vermindert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, die zur Inhibierung der Proteinalterung und anderen nachteiligen molekularen Folgen durch Kontaktieren der anfänglich glykosylierten Moleküle in der Phase des frühen Glykosylierungsproduktes mit einer Menge von ein oder mehreren der erfindungsgemäßen Mittel oder einer Zusammensetzung, enthaltend dasselbe, verwendet werden können, und bezieht sich auf ein Verfahren zur Aufspaltung der bereits gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung, um die Menge derartiger Produkte durch Spalten der α-Dicarbonyl-basierenden Vernetzungen, die in den Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung vorliegen, zu vermindern. Ein oder mehrere der Mittel können ohne Zweifel auf die Proteine beispielsweise entweder durch Einbringen in ein Gemisch derselben im Falle eines Proteinextraktes oder durch Auftragen auf oder Einbringen in Nahrungsmittel, die für fortgeschrittene Glykation und Vernetzung empfindlich sind, aufgetragen werden, alles um die vorzeitige Alterung und das Verder ben der Nahrungsmitel zu verhindern, und um die Wirkungen von bereits gebildeten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung umzukehren.
  • Die Fähigkeit, die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung zu inhibieren und die bereits gebildeten Produkte der fortgeschrittenen Glykosylierung in dem Körper umzukehren, trägt zu signifikanten Auswirkungen in allen Anwendungen, wo die fortgeschrittene Glykation und gleichzeitige molekulare Vernetzung ein ernsthafter Nachteil sind, bei. Daher würde im Bereich der Nahrungsmitteltechnik beispielsweise die Verzögerung des Nahrungsmittelverderbens einen deutlich wirtschaftlichen und sozialen Nutzen durch das Herstellen bestimmter Nahrungsmittel von geringfügiger Stabilität verleihen, die weniger verderben und daher für Verbraucher länger verfügbar sind. Das Verderben würde genauso wie der Prüfungsaufwand, die Beseitigung und das Ersetzen vermindern werden, und die verbreitete Verfügbarkeit der Nahrungsmittel könnte bei der Stabilisierung ihrer Preise auf dem Absatzmarkt nützlich ein. Ebenso würde in anderen industriellen Anwendungen, wo die Verderblichkeit von Proteinen ein Problem ist, das Beimischen der erfindungsgemäßen Mittel in Zusammensetzungen, die derartige Proteine enthalten, die ausgedehnte Nutzungsdauer dieser erleichtern. Derzeitig können verwendete Konservierungsmittel und Verfärbungsmittel, wie Schwefeldioxid, das bekannt ist, Toxizität einschließlich Allergien und Asthma bei Tieren zu verursachen, durch die hierin beschriebenen Verbindungen ersetzt werden.
  • Das Maillard-Verfahren beeinflußt stark einige der signifikanten Proteinmassen im Körper, darunter Kollagen, Elastin, Linsenproteine und die Nieren-Glumerulumbasalmembranen. Diese Proteine verschlechtern sich sowohl mit dem Alter (daher die Anwendung des Ausdruckes „Proteinalterung") als auch als Folge von Diabetes. Folglich verheißt die Fähigkeit, die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung entweder zu verzögern oder im wesentlichen zu inhibieren und die Menge von Vernetzungen, die zwischen Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung und anderen Proteinen im Körper gebildet werden, zu vermindern, Hoffnung für die Behandlung der Komplikationen von beispielsweise Diabetes und Alterung und dadurch Verbesserung der Qualität und vielleicht der Lebensdauer von Tier und Mensch.
  • Diese vorliegenden Mittel sind ebenfalls in dem Bereich des persönlichen Erscheinens und der Hygiene nützlich, das sie die Färbung von Zähnen durch kationische Antimikrobiotika mit Antiplaqueeigenschaften, wie Chlorhexidin, verhindert und umkehrt.
  • Folglich ist es ein Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von Verbindungen, wie sie in den Ansprüchen 1 und 15 definiert werden, bereitzustellen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine topische Zusammensetzung, wie sie in Anspruch 10 definiert wird, bereitzustellen.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, eine Verbindung, wie sie in den Ansprüchen 13 und 14 definiert wird, bereitzustellen.
  • Weitere Gegenstände und Vorteile werden dem Fachmann aus einer Betrachtung der darauf folgenden Beschreibung offensichtlich, die in Bezug auf die folgenden dargestellten Zeichnungen beginnt.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein SDS-PAGE-Gel, das die CNBrr-Peptid-Aufnahmen von Schwanzsehnen-Kollagen von normalen Ratten und welchen mit Diabetes, gefolgt von der Inkubation mit erfindungsgemäßem 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid (als ALT-766 bezeichnet) zeigt.
  • 2 ist ein SDS-PAGE-Gel, das den physikalischen Beweis für die Aufspaltung des vernetzten AGE-BSA durch 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, eine erfindungsgemäße Verbindung, zeigt.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, Zusammensetzungen einschließlich pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Verbindungen enthalten, und damit verbundene Verfahren entwickelt worden, von denen man annimmt, daß sie die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in einer Anzahl von Zielmolekülen, einschließlich insbesondere Proteinen, die sowohl bei Tieren als auch pflanzlichem Rohstoff existieren, inhibieren, und daß sie die bereits gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung umkehren. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Verbindungen, die die Fähigkeit aufweisen, die Spaltung von α-Dicarbonyl-basierenden molekularen Vernetzungen, die in den Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung vorliegen, zu bewirken, und die die Strukturformel:
    Figure 00070001
    wie in Anspruch 1 definiert, aufweisen.
  • Die Niederalkylgruppen, auf die man sich oben bezieht, enthalten 1 bis 6 Kohlenstoffatome und umfassen Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl und die entsprechenden verzweigtkettigen Isomere davon. Die Niederalkinylgruppen enthalten 2 bis 6 Kohlenstoffatome. Ebenso enthalten die Niederalkoxygruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome und umfassen Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Butoxy, Pentoxy und Hexoxy und die enfsprechenden verzweigtkettigen Isomere davon. Diese Gruppen sind gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogen-, Hydroxy-, Amino- oder Niederalkylaminogruppen substituiert.
  • Die Niederacyloxy(nieder)alkylgruppen, die durch die obige Formel erfaßt werden, umfassen die, worin der Acyloxyanteil 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und der Niederalkylanteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält. Typische Acyloxyanteile sind die, wie Acetoxy oder Ethanoyloxy, Propanoyloxy, Butanoyloxy, Pentanoyloxy, Hexanoyloxy und die entsprechenden verzweigtkettigen Isomere davon. Typische Niederalkylanteile werden hierin oben beschrieben.
  • Die Arylgruppen, die durch die obige Formel erfaßt werden, sind die, die 6 bis 10 Kohlenstoffatome enthalten, wie Naphthyl, Phenyl und Niederalkyl-substituiertes Phenyl, beispielsweise Tolyl und Xylyl, und sind gegebenenfalls durch 1 bis 2 Halogen-, Hydroxy-, Niederalkoxy- oder Di(nieder)alkylaminogruppen substituiert. Bevorzugte Arylgruppen sind Phenyl-, Methoxyphenyl- und 4-Bromphenylgruppen.
  • Die Halogenatome in der obigen Formel können Fluor, Chlor, Brom oder Jod sein.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung werden die Verbindungen von Formel (I) als biologisch und pharmazeutisch akzeptable Salze gebildet. Nützliche Salzformen sind die Halogenide, insbesondere die Bromid- und Chlorid-, Tosylat-, Methansulfonat- und Mesitylensulfonatsalze. Andere verwandte Salze können unter Verwendung von ebenso nicht-toxischen und biologisch und pharmazeutisch akzeptablen Anionen gebildet werden.
  • Von den Verbindungen, die durch Formel I erfaßt werden, werden bestimmte Substituenten bevorzugt. Beispielsweise werden die Verbindungen, worin R1 oder R2 Niederalkylgruppen sind, bevorzugt. Ebenso sehr bevorzugt werden die Verbindungen, worin Y eine Aminogruppe, eine 2-Amino-2-oxoethylgruppe, eine 2-Phenyl-2-oxoethyl- oder eine 2-[substituiertes Phenyl]-2-oxoethylgruppe ist.
  • Repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind:
    3-Aminothiazoliummesitylensulfonat;
    3-Amino-4,5-dimethylaminothiazoliummesitylensulfonat;
    2,3-Diaminothiazoliniummesitylensulfonat;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid;
    3-Amino-4-methylthiazoliummesitylensulfonat;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-5-methylthiazoliumbromid;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-5-methylthiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Bromphenyl)-2-oxoethyl]thiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Bromphenyl)-2-oxoethyl]-4-methylthiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Bromphenyl)-2-oxoethyl]-5-methylthiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Bromphenyl)-2-oxoethyl]-4,5-dimethylthiazoliumbromid;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Bromphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid;
    3,4-Dimethyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumiodid;
    3-Ethyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumbromid;
    3-Benzyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Bromphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid;

    3-(Carboxymethyl)benzothiazoliumbromid;
    2,3-(Diamino)benzothiazoliummesitylensulfonat;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)thiazoliumbromid;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-5-methylthiazoliumbromid;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl,5-dimethylthiazoliumbromid;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid;
    3-Amino-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliummesitylensulfonat;
    3-(2-Methyl-2-oxoethyl)thiazoliumchlorid;
    3-Amino-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliummesitylensulfonat;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid;
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliumbromid;
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliumbromid;
    2-Amino-3-(2-methoxy-2-oxoethyl)thiazoliumbromid;
    2-Amino-3-(2-methoxy-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid;
    2-Amino-3-(2-amino-2-oxoethyl)thiazoliumbromid;
    2-Amino-3-(2-amino-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid;
    3-[2-(2',4'-Dimethoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid;
    3-[2-(4'-Fluorphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid;
    3-[2-(2',4'-Difluorphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid;
    3-[2-(4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid;
    3-Propargyl-thiazoliniumbromid;
    3-Propargyl-4-methylthiazoliniumbromid;
    3-Propargyl-5-methylthiazoliniumbromid;
    3-Propargyl-4,5-dimethylthiazoliniumbromid;
    3-Propargyl-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliniumbromid;
    3-(2-[3'-Methoxyphenyl]-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid;
    3-(2-[3'-Methoxyphenyl]-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-(2-[3'-Methoxyphenyl]-2-oxoethyl)-benzothiazoliumbromid;
    2,3-Diamino-4-chlorbenzothiazoliummesitylensulfonat;
    2,3-Diamino-4-methyl-thiazoliummesitylensulfonat;
    3-Amino-4-methyl-5-vinyl-thiazoliummesitylen-sulfonat;
    2,3-Diamino-6-chlorbenzothiazoliummesitylensulfonat;
    2,6-Diamino-benzothiazoldihydrochlorid;
    2,6-Diamino-3[2-(4'-methoxyphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid;
    2,6-Diamino-3[2-(3'-methoxyphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid;
    2,6-Diamino-3[2-(4'-diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid;
    2,6-Diamino-3[2-(4'-bromphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid;
    2,6-Diamino-3-(2-phenyl-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid;
    2,6-Diamino-3[2-(4'-fluorphenyl-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid;
    3-Acetamido-4-methyl-5-thiazolyl-ethylacetatmesitylensulfonat;
    2,3-Diamino-5-methylthiazoliummesitylensulfonat;
    3-[2-(2'-Naphthyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-[2-(2',6'-Dichlorphenethylamino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazolium-bromid;
    3-[2-Dibutylamino-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-Carbethoxyanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-[2-(2',6'-Diisopropylanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-Amino-4-methyl-5-[2-(2',6'-dichlorbenzyloxy)ethyl]-thioazoliummesitylensulfonat;
    3-[2-(4'-Carbmethoxy-3'-hydroxyanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    2,3-Diamino-4,5-dimethylthiazoliummesitylensulfonat;
    2,3-Diamino-4-methyl-5-hydroxyethyl-thiazoliummesitylensulfonat;
    2,3-Diamino-5-(3',4'-trimethylendioxyphenyl)-thiazoliummesitylensulfonat;
    3(2-(1',4'-Benzodioxan-6-yl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',4'-Trimethylendioxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-(2-[1',4-Benzodioxan-6-yl]-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',4'-Trimethylendioxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-5-methyl-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4,5-dimethyl-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-benzothiazoliumbromid;
    3-[2-(4'-n-Pentylphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid;
    3-[2-(4'-n-Pentylphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliniumbromid;
    3-[2-(4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliniumbromid;
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid;
    3-[2-(3',5'-tert-Butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid;
    3-(2-tert-Butyl-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid;
    3-(2-tert-Butyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3-(3'-Methoxybenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumchlorid;
    3-(2',6'-Dichlorbenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumchlorid;
    3-(2'-Nitrobenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid;
    3[2-(4'-Chlorphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid;
    3[2-(4'-Chlorphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid; und
    3[2-(4'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl-thiazoliumbromid.
  • Bestimmte Verbindungen, die durch die Formel I dargestellt werden, sind neue Verbindungen, die eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform darstellen. Diese Verbindungen werden in den Ansprüchen 13 und 14 definiert.
  • Die obigen Verbindungen sind zum Inhibieren der Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung an Zielmolekülen, einschließlich beispielsweise Proteinen, sowie zum Aufspalten oder Umkehren der bereits gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung an derartigen Proteinen fähig. Die Vernetzung von Protein durch die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung trägt zum Einschluß anderer Proteine bei und führt zur in vivo Entwicklung von Zuständen, wie verminderte Elastizität und Faltenbildung der Haut, bestimmten Nierenkrankheiten, Atherosklerose, Osteoarthritis und dergleichen. Ebenso verschlechtert sich pflanzlicher Rohstoff, der der nicht-enzymatischen Bräunungsreaktion unterliegt, und Nahrungsmittel verderben und werden zäh und sind folglich nicht eßbar, ungenießbar oder nicht nahrhaft. Daher inhibieren die Verbindungen, die gemäß dieser Erfindung eingesetzt werden, diese Maillard-Wirkung im Spätstadium und greifen in die schädlichen oben beschriebenen Veränderungen ein und vermindern das Niveau der Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung, die bereits in dem Proteinmaterial vorliegen.
  • Die rationale Erklärung für die vorliegende Erfindung ist die Verwendung von Mitteln, die den Nach-Glykosylierungsschritt blockieren sowie umkehren, beispielsweise die Bildung von fluoreszierenden Chromophoren und Vernetzungen, deren Gegenwart mit nachteiligen Folgeerscheinungen von Diabetes und Alterung verbunden ist bzw. dazu führt. Ein ideales Mittel würde die Bildung solcher Chromophore und Vernetzungen zwischen Proteinsträngen und das Anlagern von Proteinen an andere Proteine, wie es in Arterien und in der Niere stattfindet, verhindern und das Niveau der bereits vorliegenden Bildung von Vernetzungen umkehren.
  • Die chemische Beschaffenheit der frühen Glykosylierungsprodukte, bei denen angenommen wird, daß sie mit den erfindungsgemäßen Verbindungen reagieren, kann variieren, und folglich beabsichtigt der Ausdruck „frühe Glykosylierungsprodukt(e)", wie hierin verwendet, jede und alle Veränderungen innerhalb seines Umfangs zu umfassen. Beispielsweise sind frühe Glykosylierungsprodukte mit Carbonylteilen, die bei der Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung beteiligt sind, und die durch die Reaktion mit den erfindungsgemäßen Verbindungen blockiert werden können, postuliert worden. In einer Ausführungsform wird vorgestellt, daß das frühe Glykosylierungsprodukt die reaktiven Carbonylteile von Amadori-Produkten oder deren weiteren Kondensations-, Dehydratisierungs- und/oder Umlagerungsprodukte, die kondensieren können, um Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung zu bilden, umfassen kann. In einem anderen Szenario können sich reaktive Carbonylverbindungen, die ein oder mehrere Carbonylteile (wie Glykolaldehyd, Glyceraldehyd oder 3-Deoxyglukoson) enthalten, aus der Spaltung von Amadori- oder anderen frühen Glykosylierungsendprodukten bilden, und durch nachfolgende Reaktionen mit einem Amin oder Amadori-Produkt kann sich Carbonyl, das Produkte der fortgeschrittenen Glykosylierung, wie Alkylformyl-glykosylpyrrole, enthält, bilden.
  • Einige Forscher haben den Mechanismus zur Bildung des Produktes der fortgeschrittenen Glykosylierung untersucht. in vitro-Untersuchungen von Eble et al., (1983), „Nonenzymatic Glucosylation and Glucose-dependent Cross-linking of Protein", J. Biol. Chem., 258: 9406–9412, befaßten sich mit der Vernetzung des glykosylierten Proteins mit dem nicht-glykosylierten Protein in Abwesenheit von Glukose. Eble et al. versuchten, den Mechanismus der Maillard-Reaktion zu erforschen und führten folglich die kontrollierte anfänglich Glykosylierung von RNase als ein Modellsystem durch, welches dann unter variierenden Bedingungen geprüft wurde. In einem Aspekt wurde das glykosylierte Proteinmaterial isoliert und in eine glukosefreie Umgebung gegeben und dabei beobachtet, um das Ausmaß der Vernetzung zu bestimmen.
  • Eble et al. beobachteten daher, daß sich die Vernetzung nicht nur mit dem glykosylierten Protein, sondern auch mit den nicht-glykosylierten Proteinen fortsetzte. Eine der durch Eble et al. bemerkten Beobachtungen war, daß die Reaktion zwischen dem glykosylierten Protein und dem Proteinmaterial an der Stelle auf der Aminosäure-Seitenkette des Proteins aufzutreten schien. Bestätigungsexperimente, die von Eble et al. in diesem Zusammenhang durchgeführt wurden, zeigten, daß freies Lysin mit dem Lysin an der RNase für das Binden von glykosyliertem Protein konkurrieren wird. Daher könnte aus diesen Daten geschlußfolgert werden, daß Lysin als ein Inhibitor der fortgeschrittenen Glykosylierung dienen kann; jedoch sollten diese Schlußfolgerung und die zugrunde liegenden Beobachtungen, die dazu führen, in dem relativ begrenzten Kontext des Modellsystems, welches von Eble et al. hergestellt und geprüft wurde, betrachtet werden. Offensichtlich schätzten Eble et al. die Entdekkungen, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegen, in Bezug auf die Inhibierung der fortgeschrittenen Glykosylierung von Proteinen sowohl in vitro als auch in vivo weder ein noch ist ein Vorschlag darin enthalten.
  • Die Experimente von Eble et al. schlugen keinen Mechanismus der reaktiven Spaltung von Produkten oder irgendeinen anderen Mechanismus der in vivo-Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, in denen Glukose stets vorliegt, vor. Tatsächlich stützten andere Forscher diesen Mechanismus, um die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in vivo zu erklären (siehe beispielsweise Hayase et al, J. Biol. Chem., 263: 3758–3764 (1989); Sell and Monnier, J. Biol. Chem., 264: 21597–21602 (1989); Oimomi et al., Agric. Biol. Chem., 53(6): 1727–1728 (1989); und Diabetes Research and Clinical Practice, 6: 311–313 (1989)). Folglich weist die Verwendung von Lysin als ein Inhibitor in dem Modellsystem von Eble et al. keinen Zusammenhang mit der Nutzung der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Inhibierung der Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung in Gegenwart von Glukose in vivo und der Verbesserung von Komplikationen von Diabetes und Alterung auf.
  • Obwohl nicht gewünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie eingeschränkt zu sein, wie den Mechanismus, durch den die Verbindungen dieser Erfindung bereits gebildete Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung umkehren, sind Untersuchungen strukturiert worden, um einen möglichen Mechanismus zu erklären. Frühere Untersuchungen, die das Schicksal des Amadori-Produktes (AP) in vivo prüften, haben einen wahrscheinlichen Weg nachgewiesen, der zur Bildung kovalenter, von Glukose stammender Proteinvernetzungen führen könnte. Dieser Weg verläuft durch die Dehydratisierung des AP mittels aufeinanderfolgenden beta-Eliminierungen, wie es nachstehend in Schema A gezeigt wird. Daher ergibt der Verlust von 4-Hydroxyl des AP (1) eine 1,4-Dideoxy-1-alkylamino-2,3-hexodiulose (AP-Dion) (2). Ein AP-Dion mit der Struktur eines Amino-1,4-dideoxyosons ist durch das Einfangen des Modell-APs mit dem AGE-Inhibitor Aminoguanidin isoliert worden. Die anschließende Eliminierung des 5-Hydroxyls ergibt ein 1,4,5-Trideoxy-1-alkylamino-2,3-hexulos-4-en (AP-en-dion) (3), das als ein Triacetylderivat seiner 1,2-Enolform isoliert worden ist. Von den Amadori-Dionen, insbesondere das AP-en-dion, wird erwartet, daß sie gegen Proteinvernetzungsreaktionen hochreaktiv sind, indem sie als Targets für die Addition der Amin-(Lys, His)- oder Sulfhydryl-(Cys)-basierenden Nucleophile dienen, die in Proteinen existieren, wodurch stabile Vernetzungen der Form (4) hergestellt werden.
  • Figure 00150001
  • Man beachte, daß das lineare AP-en-dion von (3) und die stabile Vernetzung von (4) cyclisieren können, um entweder 5- oder 6-gliedrige Lactolringe zu bilden, obwohl nur die 6-gliedrige Ringvariante in dem oben dargestellten Schema A gezeigt wird.
  • Die Möglichkeit, daß ein Hauptweg der von Glukose stammenden Vernetzungsbildung durch ein AP-en-dion-Zwischenprodukt verläuft, wurde durch Experimente überprüft, die so konstruiert sind, um das Auftreten dieses Weges in vivo zu testen sowie die spezifische Spaltung der resultierenden α-Dicarbonyl-basierenden Proteinvernetzungen zu bewirken. Von den erfindungsgemäßen Thiazoliumverbindungen wird daher angenommen, daß sie als neue „Bidentat"-Nucleophile fungieren, insbesondere konstruiert, um eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Aufspaltungsreaktion zwischen den zwei Carbonylen der Vernetzung zu bewirken, wie es nachstehend in Schema B unter physiologischen Bedingungen gezeigt wird. Dieses Schema zeigt die Reaktion eines prototypischen α-Dion-Aufspaltungsmittels der Formel I, N-Phenacylthiazoliumbromid, mit einer von AP-en-dion stammenden Vernetzung.
  • Figure 00160001
  • Ein anderes Experiment, um diese Reaktion zu erklären, beinhaltet die Reaktion einer Verbindung der Formel I, N-Phenacylthiazoliumbromid, mit 1-Phenyl-1,2-propandion, um das vorhergesehene Spaltprodukt, Benzoesäure, herzustellen. Die Reaktion zwischen N-Phenacylthiazoliumbromid und 1-Phenyl-1,2-propandion verlief schnell und ohne weiteres, was diesen möglichen Mechanismus bestätigt.
  • Wenn früh von Glukose stammende Additionsprodukte auf Proteinen gebildet werden, können sich weitere Reaktionen anschließen, die eine kovalente Protein-Protein-Vernetzungsreaktion bewirken. In dieser Hinsicht wurde es einer Verbindung der Formel I, N-Phenacylthiazoliumbromid, ermöglicht, mit den AGE-Vernetzungen zu reagieren, die gebildet werden, wenn es AGE-modifiziertem BSA (AGE-BSA) gestattet wird, mit nicht-modifiziertem, natürlichem Kollagen zu reagieren. Dies führte zu einer Konzentrations-abhängenden Freisetzung von BSA aus den zuvor gebildeten AGE-vermittelten Komplexen. Diese Untersuchung bestätigte erneut, daß ein signifikanter Anteil der AGE-Vernetzungen, die unter experimentellen Bedingungen gebildet werden, aus einem α-Diketon oder einer verwandten Struktur bestehen, die für die Spaltung durch die vorteilhaften Bidentatmoleküle der Verbindungen von Formel I unter physiologischen Bedingungen anfällig ist.
  • Um zu bestätigen, daß dieselbe Situation in vivo auftritt, wurde aus den Schwanzsehnen von Ratten isoliertes Kollagen, die für 32 Wochen diabetisch gewesen waren, mit einer Verbindung der Formel I, N-Phenacylthiazoliumbromid, vor der Cyanogenbromid-Digestion und Gelelektrophoreseanalyse behandelt. Die anschließende Elektrophorese offenbart, daß das behandelte Kollagen von dem nicht-behandelten, nicht-diabetischen (Kontroll-)kollagen im deutlichen Gegensatz zu dem AGE-modifizierten, hochvernetzten, Digestions-resistenten Kollagen, das typischerweise aus diabetischen Tieren isoliert wird, nicht unterscheidbar war.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf die Inhibierung der Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung und die Umkehrung des Niveaus von bereits gebildeten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung, was das Kontaktieren der Zielmoleküle mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung umfaßt. In dem Fall, wo die Zielproteine in Nahrungsmitteln enthalten sind, ob nun pflanzlicher oder tierischer Herkunft, könnten auf diese Nahrungsmittel durch verschiedene konventionelle Möglichkeiten eine Zusammensetzung, die die vorliegenden Mittel enthält, angewendet werden.
  • In der Nahrungsmittelindustrie wurde Jahre zuvor herausgefunden, daß Sulfite die Maillard-Reaktion inhibieren und allgemein in verarbeiteten und gelagerten Nahrungsmitteln verwendet werden. Jedoch sind Sulfite in Nahrungsmitteln kürzlich bei starken und sogar tödlichen Reaktionen bei Asthmatikern verwickelt gewesen. Infolgedessen ist die Sulfitbehandlung von frischem Obst und Gemüse verboten worden. Der Mechanismus für die allergische Reaktion ist nicht bekannt. Folglich bieten die vorliegenden Zusammensetzungen und Mittel eine nicht-toxische Alternative für Sulfite bei der Behandlung von Nahrungsmitteln auf diese Weise an.
  • Wie es aus einer Erörterung des Umfeldes der vorliegenden Erfindung ersichtlich ist, halten die vorliegenden Verbindungen und Zusammensetzungen das Versprechen hinsichtlich des Aufhaltens und in gewissem Maße des Umkehrens der Alterung von Schlüsselproteinen sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen und gleichzeitig des Verleihens von sowohl wirtschaftlichem als auch medizinischem Nutzen als Ergebnis davon. Bei den Nahrungsmitteln hält die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zu sammensetzung das Versprechen hinsichtlich des Verzögerns des Nahrungsmittelverderbs, wodurch Nahrungsmittel von erhöhter Lagerdauer und größerer Verfügbarkeit für den Verbraucher hergestellt werden. Der Ersatz von momentan verwendeten Konservierungsmitteln, wie Schwefeldioxid, die bekannt dafür sind, Allergien und Asthma bei Menschen zu verursachen, durch nicht-toxische, biokompatible Verbindungen ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung.
  • Die therapeutischen Auswirkungen der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf das Aufhalten und in gewissem Maße die Umkehr des Alterungsprozesses, was, wie vorher angegeben, bei der Alterung von Schlüsselproteinen durch fortgeschrittene Glykosylierung und Vernetzung nachgewiesen und veranschaulicht worden ist. Daher würden Körperproteine und insbesondere Strukturkörperproteine, wie Kollagen, Elastin, Linsenproteine, Nervenproteine, Nierenglumerulumbasalmembranen und andere extravaskuläre Matrixkomponenten, alle in ihrer Langlebigkeit und Arbeitsweise aus der Praxis der vorliegenden Erfindung Nutzen ziehen. Die vorliegende Erfindung vermindert daher die Häufigkeit von Krankheitserscheinungen, die den Einschluß von Proteinen durch vernetzte Zielproteine umfassen, wie Retinopathie, grauer Star, diabetischer Nierenerkrankung, Glomerulosklerose, periphere Gefäßkrankheit, Arteriosclerosis obliterans, periphere Neuropathie, Schock, Hypertonie, Atherosklerose, Osteoarthritis, periartikuläre Rigidität, Verlust der Hautelastizität und Faltenbildung der Haut, Versteifung der Gelenke, Glomerulonephritis usw. Ebenso werden alle diese Zustände in Erscheinung treten und treten gewöhnlich bei einer erhöhten Geschwindigkeit bei Patienten auf, die unter Diabetes mellitus infolge dieser Hyperglykämie leiden. Daher ist das vorliegende therapeutische Verfahren wichtig für die Behandlung dieser und verwandter Zustände bei Patienten von fortgeschrittenem Alter oder denen, die unter einer der genannten Krankheitserscheinungen leiden.
  • Die molekulare Vernetzung durch die Bildung des Produktes der fortgeschrittenen Glykosylierung kann die Löslichkeit von Strukturproteinen, wie Kollagen, in Gefäßwänden vermindern und kann ebenso Serumproteine, wie Lipoproteine, in das Kollagen einschließen. Ebenso kann dies zur erhöhten Durchlässigkeit des Endotheliums und folglich zum kovalenten Einschließen ausgetretener Plasmaproteine in die subendothelialen Matrix und zur Verminderung der Empfindlichkeit von sowohl Plasma- als auch Matrixproteinen gegen physiologischen Abbau durch Enzyme führen. Aus diesen Gründen ist angenommen worden, daß die fortgeschrittene Okklusion von diabetischen Gefäßen, die durch chronische Hyperglykämie induziert wird, von der übermäßigen Bildung von Zucker stammenden und insbesondere von Glukose stammenden Vernetzungen stammt. Derartige diabetische mikrovaskulären Veränderungen und mikrovaskuläre Okklusion können wirkungsvoll durch chemische Inhibierung und Umkehr der Bildung vom Produkt der fortgeschrittenen Glykosylierung unter Verwendung einer Zusammensetzung und den Verfahren der vorliegenden Erfindung verhindert und umgekehrt werden.
  • Untersuchungen zeigen, daß die Entwicklung von chronischen diabetischen Schäden bei Zielorganen in erster Linie mit der Hyperglykämie verbunden sind, so daß strenge Stoffwechselkontrolle die endgültige Schädigung des Organs verzögern oder sogar verhindern würde. Siehe Nicholls et al., Lab. Invest., 60, Nr. 4, S. 486 (1989), die die Wirkungen von Inselisotransplantation und Aminoguanidin bei diabetischem Nierenleiden von Ratten erörtern. Diese Untersuchungen beweisen ferner, daß Aminoguanidin die Aortenwand-Proteinvernetzung bei Ratten mit Diabetes vermindert, und bestätigen frühere Untersuchungen von Brownlee et al., Science, 232: 1629–1632 (1986) an diesem zusätzlichen Zielorgan hinsichtlich der Komplikation bei Diabetes. Ebenso zeigte eine zusätzliche Untersuchung die Verminderung vom Immunoglobulineinschluß in den Nieren durch Aminoguanidin (Brownlee et al., Diabetes, 35(1): 42A (1986)).
  • Ein weiterer Beweis in dem Streptozotocin-Diabetes-Rattenmodell, bei dem die Aminoguanidinverabreichung bei der Entwicklung von diabetischem Nierenleiden eingreift, wurde von Brownlee et al., 1988, wie zuvor angegeben, in bezug auf die morphologischen Veränderungen in den Nieren, die Anzeichen für die diabetische Nierenkrankheit sind, dargestellt. Diese Forscher berichteten, daß die erhöhte Glomerulumbasalmembrandicke, ein bedeutendes strukturelles Abnormitätsmerkmal von diabetischer Nierenkrankheit, mit Aminoguanidin verhindert wurde.
  • Zusammenfassend schlagen diese Daten stark vor, daß die Inhibierung und Umkehrung der Bildung von Endprodukten (AGEs) der fortgeschrittenen Glykosylierung durch die Lehre der vorliegenden Erfindung strukturelle Läsionen aufgrund von Diabetes, sowie Änderungen während des Alterns, die durch die Bildung von AGEs verursacht werden, verhindern sowie in gewissem Maße spät als auch früh umkehren können.
  • Diabetes induzierte Änderungen in der Verformbarkeit von roten Blutzellen, die zu rigideren Zellmembranen führen, ist eine weitere Erscheinung der Vernetzung, und es ist gezeigt worden, daß Aminoguanidin dies in vivo zu verhindert. Bei derartigen Untersuchungen werden weiße Neuseelandkaninchen mit induzierter Langzeitdiabetes verwendet, um die Wirkungen einer Testverbindung auf die Verformbarkeit (df) von roten Blutzellen (RBC) zu untersuchen. Die Testverbindung wird bei einer Menge von 100 mg/kg durch orale Zwangsernährung den Kaninchen mit Diabetes verabreicht.
  • Eine weitere Folge von Diabetes ist die Hyperglykämie-induzierte Matrixknochendifferenzierung, die zu verminderter Knochenbildung führt, was normalerweise mit chronischer Diabetes verbunden ist. In Tiermodellen vermindert Diabetes die Matrixinduzierte Knochendifferenzierung um 70%.
  • In dem Fall, wo die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in vivo oder zu therapeutischen Zwecken verwendet werden, kann angenommen werden, daß die darin verwendeten Verbindungen oder Mittel biokompatibel sind. Pharmazeutische Zusammensetzungen können mit einer therapeutisch wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Mittel oder Verbindungen hergestellt werden und können einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen, der aus bekannten Materialien, die für diesen Zweck verwendet werden, ausgewählt wird. Derartige Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Formen in Abhängigkeit des Verabreichungsverfahrens hergestellt werden. Ebenso können verschiedene pharmazeutisch akzeptable Additionssalze der Verbindungen von Formel I verwendet werden.
  • Eine flüssige Form würde in dem Fall verwendet werden, wo die Verabreichung durch intravenöse, intramuskuläre oder intraperitoneale Injektion erfolgt. Wenn geeignet, können feste Dosierungsformen, wie Tabletten und Kapseln, oder flüssige Dosierungsformulierungen, wie Lösungen und Suspensionen usw., für die orale Verabreichung hergestellt werden. Für topische oder dermale Anwendung auf der Haut oder im Auge kann eine Lösung, eine Lotion oder eine Salbe mit dem Mittel in einer entsprechenden Trägersubstanz, wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol, vielleicht einen Träger, um das Eindringen in die Haut oder das Auge zu fördern, formuliert werden. Beispielsweise könnte ein topisches Präparat bis zu etwa 10% der Verbindung von Formel I umfassen. Andere geeignete Formen zur Verabreichung auf andere Körpergewebe werden ebenso in Betracht gezogen.
  • In dem Fall, wo das vorliegende Verfahren eine therapeutische Anwendung aufweist, kann dem für die Behandlung beabsichtigten Tierwirt eine Menge eines oder mehrerer der Mittel in einer geeigneten pharmazeutischen Form verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch bekannte Techniken, wie orale, topische und parenterale Techniken, wie intradermale, subkutane, intravenöse oder intraperitoneale Injektion, sowie durch andere konventionelle Möglichkeiten erreicht werden. Die Verabreichung der Mittel kann über einen ausgedehnten Zeitraum bei einem Dosierungsniveau von beispielsweise bis zu etwa 30 mg/kg stattfinden.
  • Wie zuvor angemerkt, erstreckt sich die Erfindung ebenso auf ein Verfahren zur Inhibierung und Umkehrung der Verfärbung von Zähnen, die aus der nicht-enzymatischen Bräunungsreaktion in der Mundhöhle resultieren, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge einem Patienten, der eine derartige Therapie benötigt, um die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung einer Zusammensetzung, umfassend ein Mittel der Strukturformel I, zu inhibieren und umzukehren.
  • Die nicht-enzymatische Bräunungsreaktion, die in der Mundhöhle stattfindet, führt zur Verfärbung der Zähne. Derzeit beschleunigen die verwendeten Antiplaquemittel diese nicht-enzymatische Bräunungsreaktion und außerdem die Verfärbung der Zähne. Kürzlich ist eine Klasse an kationischen Antimikrobiotika mit bemerkens werten Antiplaqueeigenschaften in Mundspülungen zur regulären Verwendung formuliert worden, um Bakterien im Mund abzutöten. Diese Mittel, die kationischen Antiseptika, umfassen derartige Mittel wie Alexidin, Cetylpryidiniumchlorid, Chlorhexidingluconat, Hexetidin und Benzalkoniumchlorid.
  • Die Zahnverfärbung durch Chlorhexidin und anderen Antiplaquemitteln resultiert offensichtlich aus der Verstärkung der Maillard-Reaktion. Nordbo. J. Dent. Res., 58: 1429(1979) berichtete, daß Chlorhexidin und Benzalkoniumchlorid Bräunungsreaktionen in vitro katalysieren. Chlorhexidin, das zu Gemischen, enthaltend ein Zuckerderivat und eine Quelle an Aminogruppen, zugegeben wurde, unterlag erhöhter Farbbildung, was auf die Maillard-Reaktion zurückzuführen ist. Es ist ebenso bekannt, daß die Verwendung von Chlorhexidin zu einer erhöhten dentalen Pellikula führt. Nordbo schlug vor, daß Chlorhexidin in zwei Wegen zur Zahnverfärbung führt: erstens durch Erhöhung der Bildung von Pellikula, das mehr Aminogruppen enthält, und zweitens durch Katalyse der Maillard-Reaktion, was zu gefärbten Produkten führt.
  • Gemäß diesem Verfahren werden die Verbindungen von Formel I in Zusammensetzungen formuliert, die zur Verwendung in der Mundhöhle angepaßt werden. Besonders geeignete Formulierungen sind Mundspülungen und Zahnpasten, die das wirksame Mittel einschließen.
  • In der Praxis dieser Erfindung werden konventionelle Formulierungstechniken mit nicht-toxischen, pharmazeutisch akzeptablen Trägern verwendet, die typischerweise in den Mengen und Kombinationen verwendet werden, die für die Formulierung derartiger Mundspülungen und Zahnpasten allgemein bekannt sind.
  • Das Mittel von Formel I wird in Zusammensetzungen in einer Menge formuliert, die wirkungsvoll ist, um die Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung zu inhibieren und umzukehren. Diese Menge wird sich natürlich mit dem speziell verwendeten Mittel und der besonderen Dosierungsform verändern, aber liegt typischerweise zwischen 0,01 und 1,0 Gew.-% der speziellen Formulierung.
  • Die Verbindungen, die durch die Formel I erfaßt werden, werden durch chemische Synthesen, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, günstig hergestellt. Bestimmte Verbindungen, die durch die Formel I erfaßt werden, sind allgemein bekannte Verbindungen, die ohne weiteres von Chemielieferanten erhältlich sind und/oder durch Syntheseverfahren, die speziell dafür veröffentlicht wurden, hergestellt werden. Beispielsweise sind 3,4-Dimethyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumiodid; 3-Ethyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumbromid; 3-Benzyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid und 3-(Carboxymethyl)benzothiazoliumbromid von Aldrich Chem. Co. erhältlich.
  • Verbindungen, die durch die Chemie- und Patentliteratur beschrieben werden oder direkt durch hierin beschriebene Verfahren herstellbar und durch Formel I erfaßt sind, sind die, wie 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid und 3-Benzyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid [Potts et al., J. Org. Chem, 41: 187–191 (1976)].
  • Bestimmte Verbindungen von Formel (I) sind neue Verbindungen, die bisher im Stand der Technik nicht bekannt sind. Diese Verbindungen sind die, die durch die Formel Ia dargestellt werden,
    Figure 00230001
    worin R1 und R2 unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy(nieder)alkyl, Acetoxy(nieder)alkyl, Niederalkyl, Niederalkenyl, ausgewählt werden, oder R1 und R2 zusammen mit deren Ringkohlenstoffen ein aromatischer kondensierter Ring sein können, gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren Amino-, Halogen- oder Alkylendioxygruppen;
    Z Wasserstoff oder eine Aminogruppe ist;
    Y Amino, eine Gruppe der Formel
    Figure 00240001
    ist, worin R ein Niederalkyl, Alkoxy, Hydroxy, Amino oder eine Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einer oder mehreren Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halogen-, Dialkylamino-, Hydroxy-, Nitro- oder Alkylendioxygruppen substituiert ist;
    eine Gruppe der Formel
    -CH2R'
    worin R' Wasserstoff oder ein Niederalkyl, Niederalkinyl oder eine Arylgruppe ist;
    oder eine Gruppe der Formel
    Figure 00240002
    worin R'' Wasserstoff ist und R''' eine Niederalkylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit einer Arylgruppe, oder eine Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einer oder mehreren Niederalkyl-, Halogen- oder Alkoxylcarbonylgruppen substituiert ist; oder R'' und R''' beide Niederalkylgruppen sind;
    mit dem Vorbehalt, daß mindestens eines von Y und Z eine Aminogruppe ist, und dem weiteren Vorbehalt, daß, wenn Y Amino ist und R2 und Z beide Wasserstoff sind dann R1 anders als eine Niederalkylgruppe ist; und
    X ein Halogenid-, Tosylat-, Methansulfonat- oder Mesitylensulfonation ist.
  • Andere neue Verbindungen sind die von Formel I, worin Y eine Niederalkinylmethylgruppe oder eine Gruppe der Formel
    Figure 00240003
    ist, worin R'' Wasserstoff ist und R''' eine Niederalkylgruppe, gegebenenfalls substituiert mit einer Arylgruppe, oder eine Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebe nenfalls mit einer oder mehreren Niederalkyl-, Halogen- oder Alkoxylcarbonylgruppen substituiert ist; oder R'' und R''' beide Niederalkylgruppen sind.
  • Die Verbindungen von Formel I, worin Y eine Gruppe der Formel
    Figure 00250001
    ist, worin R ein Niederalkyl, Alkoxy, Hydroxy, Amino oder eine Arylgruppe ist;
    oder eine Gruppe der Formel
    -CH2R'
    worin R' Wasserstoff oder ein Niederalkyl, Niederalkinyl oder eine Arylgruppe ist;
    X ein Halogenid-, Tosylat-, Methansulfonat- oder Mesitylensulfonation ist; können gemäß den Verfahren, die in Potts et al., J. Org. Chem., 41: 187 (1976) und Potts et al., J. Org. Chem., 42: 1648 (1977) beschrieben werden, oder, wie in dem nachstehenden Schema I gezeigt, hergestellt werden. Schema I
    Figure 00250002
    worin R1, R2, Z und R wie oben definiert sind, und X ein Halogenatom ist.
  • In dem Reaktionsschema I wird die entsprechende substituierte Thiazolverbindung von Formel II, worin R1, R2 und Z wie zuvor definiert sind, mit der entsprechenden Halogenverbindung von Formel III, worin R und X wie zuvor definiert sind, umgesetzt, um die gewünschte Verbindung von Formel I, worin R1, R2, Z, R und X wie zuvor definiert sind, bereitzustellen.
  • Typischerweise wird diese Umsetzung bei Rückflußtemperaturen für Zeiten von etwa 1 bis 3 Stunden durchgeführt. Typischerweise wird das polare Lösungsmittel, wie Ethanol, zur Durchführung der Umsetzung verwendet.
  • Die Verbindungen von Formel I, worin Y eine Aminogruppe ist, können gemäß den Verfahren, die in Tamura et al., Synthesis, 1 (1977), oder, wie in dem nachstehenden Schema 11 gezeigt, hergestellt werden. Schema II
    Figure 00260001
    worin R1, R2 und Z wie oben definiert sind.
  • Bei der in Schema II gezeigten Umsetzung, die typischerweise in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel bei Raumtemperaturen durchgeführt wird, liegen typische Umsetzungstemperaturen zwischen Raumtemperatur und Rückfluß, und typische Zeiten variieren von 1 bis etwa 4 Stunden. Diese Umsetzung stellt das Mesitylensulfonat bereit, das dann gegebenenfalls in andere Thiazoliumsalze durch typische Austauschreaktionen umgewandelt werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenso einen neuen Sandwich-Enzym-Immunassay, der verwendet wird, um die Fähigkeit der Testverbindungen festzustellen, die bereits gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung durch Nachweis der Aufspaltung von AGE-Anteilen (Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung) aus AGE-vernetztem Protein „aufzuspalten" oder umzukehren. Diese Assay umfaßt:
    • a) Inkubation von AGE-modifiziertem Rinderserumalbumin (AGE-BSA) auf Kollagenbeschichteten Vertiefungen von Mikrotiterplatten für einen Zeitraum von 2 bis 6 Stunden bei einer Temperatur von 37°C;
    • b) Auswaschen der Vertiefungen mit PBS-Tween;
    • c) Auftragen der Testverbindungen auf die ausgewaschenen Vertiefungen von Schritt b;
    • d) Inkubation der Testverbindungen, die auf die ausgewaschenen Vertiefungen aufgetragen wurden, für zusätzliche 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37°C; und
    • e) Nachweis der AGE-Aufspaltung unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen AGE-Ribonuclease gerichtet ist, oder Vernetzungsaufspaltung mit einem Antikörper gegen BSA.
  • Die folgenden Beispiele werden die Erfindung erläutern.
  • Beispiel 1
  • 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid
  • Thiazol (850 mg, 10 mmol), Methylbromacetat (1,52, 10 mmol) und Absolutethanol (50 ml) wurden 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Beim Abkühlen wurde das Salz abgetrennt und aus Absolutethanol umkristallisiert, um die Titelverbindung (1,59 g), Schmelzpunkt 189–190°C (Zers.) zu ergeben.
  • Beispiel 2
  • 3-Amino-4,5-dimethylthiazoliummesitylensulfonat
  • Eine eiskalte Lösung des 4,5-Dimethylthiazols (2,26 g, 20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) wurde tropfenweise mit einer Lösung aus o-Mesitylensulfonylhydroxylamin (4,3 g, 20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) behandelt.
  • Nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde wasserfreier Ether (10 ml) zugegeben. Beim Abkühlen wurden farblose Nadeln des Titelproduktes, 3-Amino-4,5-dimethyl-thiazoliummesitylensulfonat, abgetrennt (3,48 g), Schmelzpunkt 165–168 °C.
  • Beispiel 3
  • Unter Verwendung der Verfahrensweisen, die oben in den Beispielen 1 und 2 beschrieben wurden, werden die folgenden Verbindungen hergestellt.
  • 3-Amino-thiazoliummesitylensulfonat,Smp. 102–104°C.
    2,3-Diamino-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 173–175°C (Zers.).
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid, Smp. 184–185°C (Zers.).
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid, Smp. 149–151°C (Zers.).
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid, Smp. 218–220°C (Zers.).
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid, Smp. 212–213°C (Zers.).
    3-Amino-4-methyl-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 143–144°C.
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-5-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 193–194°C (Zers.).
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-5-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 193–194°C.
    3-(2-[41-Bromphenyl]-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 269–270°C (Zers.).
    3-(2-[41-Bromphenyl]-2-oxoethyl)-4-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 248–249°C (Zers.).
    3-(2-[41-Bromphenyl]-2-oxoethyl)-5-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 216–217°C.
    3-(2-[41-Bromphenyl]-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid, Smp. 223–224°C (Zers.).
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 137–138°C.
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 180–181°C.
    3-(2-[41-Bromphenyl]-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid, Smp. 251–252°C (Zers.).
    3,4-Dimethyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliumiodid, Smp. 85–87°C.
    3-Ethyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumbromid, Smp. 84–85°C.
    3-Benzyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid, Smp. 144–146°C.
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-benzothiazoliumbromid, Smp. 144–145°C (Zers.).
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-benzothiazoliumbromid, Smp. 240–241°C (Zers.).
    3-(2-[41-Bromphenyl]-2-oxoethyl)-benzo-thiazoliumbromid, Smp. 261–262°C (Zers.).
    3-(Carboxymethyl)-benzothiazoliumbromid Smp. 250°C (Zers.).
    2,3-Diamino-benzothiazoliummesitylensulfonat, Smp. 212–214°C (Zers.).
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 205–206°C.
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 220–222°C.
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-5-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 179–180°C.
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4,5-dimethyl-thiazoliumbromid, Smp. 147–148°C.
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-benzothiazoliumbromid, Smp. 222–223°C.
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid, Smp. 182–183°C.
    3-Amino-5-(2-hydroxyethyl)-4-methyl-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 94–95°C (Zers.).
    3-(2-Methyl-2-oxoethyl)thiazoliumchlorid, Smp. 178–79°C.
    3-Amino-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 118–120°C.
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, Smp. 217–218°C.
    3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliumbromid, Smp. 217–18°C.
    3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliumbromid, Smp. 233–234°C.
    2-Amino-3-(2-methoxy-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, Smp. 191–192°C.
    2-Amino-3-(2-methoxy-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, Smp. 236–237°C.
    2-Amino-3-(2-amino-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, Smp. 209–210°C.
    2-Amino-3-(2-amino-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, Smp. 234–235°C.
    3-[2-(4'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, Smp. 248-249°C (Zers.);
    3-[2-(2',4'-Dimethoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, Smp. 214–216°C (Zers.);
    3-[2-(4'-Fluorphenyl-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, Smp. 209–210°C (Zers.);
    3-[2-(2',4'-Difluorphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, Smp. 226–228°C (Zers.);
    3-[2-(4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, Smp. 233–235°C (Zers.);
    3-Propargyl-thiazoliumbromid, Smp. 64–66°C;
    3-Propargyl-4-methylthiazoliumbromid, Smp. 213–215°C;
    3-Propargyl-5-methylthiazoliumbromid, Smp. 127–129°C;
    3-Propargyl-4,5-dimethylthiazoliumbromid, Smp. 198–200°C;
    3-Propargyl-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 132–134°C;
    3-(2-[3'-Methoxyphenyl]-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 224–225°C;
    3-(2-[3'-Methoxyphenyl]-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 164–165°C;
    3-(2-[3'-Methoxyphenyl]-2-oxoethyl)-benzothiazoliumbromid, Smp. 215–217°C;
    2,3-Diamino-4-chlorbenzothiazoliummesitylensulfonat, Smp. 228–230°C;
    2,3-Diamino-4-methyl-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 204–205°C;
    3-Amino-4-methyl-5-vinyl-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 145–147°C;
    2,3-Diamino-6-chlorbenzothiazoliummesitylensulfonat, Smp. 244–246°C;
    2,6-Diamino-benzothiazoldihydrochlorid, Smp. 318–320°C (Zers.);
    2,6-Diamino-3[2-(4'-methoxyphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, Smp. 243–245°C (Zers.);
    2,6-Diamino-3[2-(3'-methoxyphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, Smp. 217-218°C (Zers.);
    2,6-Diamino-3[2-(4'-diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, Smp. 223–225°C (Zers.);
    2,6-Diamino-3[2-(4'-bromphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, Smp. 258–259°C (Zers.);
    2,6-Diamino-3-(2-phenyl-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, Smp. 208–210°C (Zers.);
    2,6-Diamino-3[2-(4'-fluorphenyl-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, Smp. 251–252°C (Zers.);
    3-Acetamido-4-methyl-5-thiazolyl-ethylacetatmesitylensulfonat, Smp. Sirupmaterial;
    2,3-Diamino-5-methylthiazoliummesitylensulfonat, Smp. 149–152°C;
    3-[2-2'-Naphthyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 219–220°C;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 206–207°C;
    3-[2-(2',6'-Dichlorphenethylamino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazolium-bromid, Smp. 193–195°C;
    3-[2-Dibutylamino-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 78–80°C;
    3-[2-(4'-Carbethoxyanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 204–206°C;
    3-[2-(2',6'-Diisopropylanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 166–168°C;
    3-Amino-4-methyl-5-[2(2',6'-dichlorbenzyloxy)ethyl]-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 164–166°C;
    3-[2-(4'-Carbmethoxy-3'-hydroxyanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 222–223°C;
    2,3-Diamino-4,5-dimethylthiazoliummesitylensulfonat, Smp. 166–168°C;
    2,3-Diamino-4-methyl-5-hydroxyethyl-thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 132–134°C;
    2,3-Diamino-5-(3',4'-trimethylendioxyphenyl)thiazoliummesitylensulfonat, Smp. 224–226°C;
    3[2-(1',4'-Benzodioxan-6-yl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 196–198°C;
    3-[2-(3',4'-Trimethylendioxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 164–166°C;
    3-(2-[1',4-Benzodioxan-6-yl]-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 238–239°C;
    3-[2-(3',4'-Trimethylendioxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, Smp. 246–248°C (Zers.);
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, Smp.
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 226–228°C (Zers.);
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-5-methyl-thiazoliumbromid, Smp. 210–211°C;
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4,5-dimethyl-thiazoliumbromid, Smp. 243–244°C (Zers.);
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-benzothiazoliumbromid, Smp. 239–294°C (Zers.);
    1-Methyl-3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-imidazoliumbromid, Smp. 148–150°C;
    3-[2-(4'-n-Pentylphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, Smp. 218-220 °C (Zers.);
    3-[2-(4'-n-Pentylphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliniumbromid, Smp. 178–180°C (Zers.);
    3-[2-(4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliniumbromid, Smp. 184–186°C (Zers.);
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid, Smp. 176–177°C;
    3-[2-(3',5'-tert-Butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid, Smp. 208–209°C;
    3-(2-tert-Butyl-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 211–212°C;
    3-(2-tert-Butyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 186–187°C;
    3-(3'-Methoxybenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumchlorid, Smp. 135–136°C;
    3-(2',6'-Dichlorbenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumchlorid, Smp. 192–194°C;
    3-(2'-Nitrobenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 215–216°C;
    3[2-(4'-Chlorphenyl)2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, Smp. 239–241°C (Zers.);
    3[2-(4'-Chlorphenyl)2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 240–251°C (Zers.); und
    3[2-(4'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, Smp. 229–231°C (Zers.). Beispiel 4
    mg/Tablette
    Verbindung der Formel I 50
    Stärke 50
    Mannitol 75
    Magnesiumstearat 2
    Stearinsäure 5
  • Die Verbindung, ein Teil der Stärke und die Lactose werden vereinigt und mit Stärkepaste naßgranuliert. Die Naßgranulation wird auf Schalen plaziert und über Nacht bei einer Temperatur von 45°C getrocknet. Die getrocknete Granulation wird in einem Zerkleinerer auf eine Teilchengröße von ungefähr 20 Mesh zerkleinert. Magnesiumstearat, Stearinsäure und der Rest der Stärke werden zugegeben und das vollständige Gemisch vor dem Komprimieren auf einer geeigneten Tablettenpresse vermischt. Die Tabletten werden bei einem Gewicht von 232 mg unter Verwendung einer 11/32''-Stanze mit einer Härte von 4 kg komprimiert. Diese Tabletten lösen sich innerhalb einer halben Stunde gemäß dem in USP XVI beschriebenen Verfahren auf. Beispiel 5
    Lotion mg/g
    Verbindung der Formel I 1,0
    Ethylalkohol 400,0
    Polyethylenglykol 400 300,0
    Hydroxypropylcellulose 5,0
    Propylenglykol um 1,0 g herzustellen
    Beispiel 6
    Mundspülung
    Verbindung der Formel I 1,4%
    Chlorhexidingluconat 0,12%
    Ethanol 11,6%
    Natriumsaccharin 0,15%
    FD&C Blue Nr. 1 0,001%
    Pfefferminzöl 0,5%
    Glycerin 10,0%
    Tween 60 0,3%
    Wasser zu 100%
    Beispiel 7
    Zahnpasta
    Verbindung der Formel I 5,5%
    Sorbitol, 70% in Wasser 25%
    Natriumsaccharin 0,15%
    Natriumlaurylsulfat 1,75%
    Carbopol 934,6% in Dispersion 15%
    Öl von grüner Minze 1,0%
    Natriumhydroxid, 50% in Wasser 0,76%
    Zweiwertiges Calciumphosphatdihydrat 45%
    Wasser zu 100%
  • Beispiel 8
  • Vernetzungs-Inhibierungs-Assay
  • Das folgende Verfahren wurde verwendet, um die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Vernetzung von glykiertem Rinderserumalbumin (AGE-BSA) an der Rattenschwanzsehnenkollagen-beschichteten 96-Lochplatte zu inhibieren, zu bewerten.
  • Das AGE-BSA wurde durch Inkubieren von BSA bei einer Konzentration von 200 mg pro ml mit 200 mM Glukose in 0,4 M Natriumphosphatpuffer, einem pN-Wert von 7,4 bei 37°C 12 Wochen hergestellt. Das glykierte BSA wurde dann gegen Phosphatpufferlösung (PBS) 48 Stunden mit zusätzlich 5fachen Pufferaustauschen gründlich dialysiert. Die Rattenschwanzsehnenkollagen-beschichtete Platte wurde erst mit 300 μl superblockierten Blockierpuffer (Pierce #37515X) eine Stunde blockiert. Die Blockierlösung wurde aus den Vertiefungen durch das zweimalige Waschen der Platte mit PBS-Tween 20-Lösung (0,05% Tween 20) unter Verwendung eines NUNC-Multiprobe oder eines ELISA-Plattenwaschers von Dynatech entfernt. Die Vernetzung von AGE-BSA (1 bis 10 μg pro Vertiefung in Abhängigkeit der Charge von AGE-BSA) auf der Rattenschwanzsehnenkollagen-beschichteten Platte wurde mit und ohne der Testverbindung, die in PBS-Puffer bei pH 7,4 gelöst wurde, bei gewünschten Konzentrationen durch Zugabe von 50 μl von jeweils dem in PBS verdünnten AGE-BSA oder in die Lösung der Testverbindung bei 37°C 4 Stunden durchgeführt. Nicht gebräuntes BSA in PBS-Puffer mit oder ohne Testverbindung wurden zu separaten Vertiefungen als Blindprobe zugegeben. Das nicht-vernetzte AGE-BSA wurde dann durch dreimal Waschen der Vertiefungen mit PBS-Tweenpuffer entfernt. Die Menge an AGE-BSA, das an die Rattenschwanzsehnenkollagen-beschichtete Platte vernetzt wurde, wurde dann unter Verwendung ei nes polyklonalen Antikörpers, der gegen AGE-RNase gerichtet ist, quantitativ bestimmt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde wurde der AGE-Antikörper durch 4 mal Waschen mit PBS-Tween entfernt.
  • Der gebundene AGE-Antilkörper wurde dann mit der Zugabe von Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundärem Antikörper – Ziegen-Anti-Kaninchenimmunoglobulin und 30 Minuten Inkubation nachgewiesen. Das Substrat von 2,2-Azino-di(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) (ABTS-Chromogen) (Zymed #00-2011) wurde zugegeben. Die Reaktion wurde für zusätzliche 15 Minuten ermöglicht und die Absorbanz wurde bei 410 nm in einem Dynatech-Plattenleser abgelesen.
  • Die %-Inhibierung jeder Testverbindung wurde wie folgt berechnet.
  • %-Inhibierung =
    {[Optische Dichte (ohne Verbindung) – optische Dichte (mit Verbindung)]/optische Dichte (ohne Verbindung)} × 100%
    Die IC50-Werte oder die Inhibierung bei verschiedenen Konzentrationen durch Testverbindungen sind wie folgt:
    Figure 00360001
    Figure 00370001
    Figure 00380001
    Figure 00390001
  • Die obigen Experimente schlagen vor, daß diese Art von Arzneimittelbehandlung bei der Verminderung der Krankheitserscheinungen, die mit der fortgeschrittenen Glykosylierung von Proteinen und der Bildung von Vernetzungen zwischen Proteinen und anderen Makromolekülen verbunden sind, von Nutzen sein kann. Die Arzneimittelbehandlung kann verwendet werden, um das erhöhte Einschließen und Vernetzen von Proteinen, die bei Diabetes und Alterung auftreten, zu verhindern, was zu Folgeerscheinungen, wie Netzhautbeschädigung und extravaskuläre Beschädigung der Sehnen, Bänder und anderen Gelenken, führt. Diese Behandlung könnte Atherosklerose und Bindegewebsveränderungen, die mit Diabetes und Alterung auftreten, verzögern. Sowohl topische, orale als auch parenterale Möglichkeiten der Verabreichung, um lokale und systematische Behandlung bereitzustellen, werden in Betracht gezogen.
  • Beispiel 9
  • Vernetzung-Aufsgaltungs-Assay
  • Um die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindung, die bereits gebildeten Endprodukte der fortgeschrittenen Glykosylierung „aufzuspalten" oder umzukehren, festzustellen, wurde ein neuer Sandwich-Enzym-Immunassay entwickelt, der das Aufspalten von AGE-Anteilen (Endprodukt der fortgeschrittenen Glykosylierung) von AGE-vernetzten Protein nachweist. Der Assay verwendet Kollagen-beschichtete 96-Lochmikrotiterplatten, die kommerziell erhalten werden. Das AGE-modifizierte Protein (AGE-BSA), das beispielsweise wie in dem obigen Beispiel 8 hergestellt wird, wird auf den Kollagen-beschichteten Vertiefungen vier Stunden inkubiert, mit PBS-Tween aus den Vertiefungen ausgewaschen und Lösungen der Testverbindungen werden zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden (37°C) wird die Vernetzungsaufspaltung unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen AGE-Ribonuclease gerichtet ist, oder mit einem Antikörper gegen BSA nachgewiesen. Positive Ergebnisse in diesem Assay zeigen Verbindungen, die in der Lage sind, die Menge an AGE-BSA, das vorher mit Kollagen vernetzt wurde, indem die Vernetzungen aufgespalten werden und es dem freigesetzten Material gestattet wird, in an schließenden Waschschritten fortgespült zu werden, zu vermindern. Einzelheiten des Assays sind wie folgt:
  • Materialien
  • Immunchemikalien und Chemikalien
  • Rinderserumalbumin (Typ V), (BSA) Calbiochem
    Dextrose
    Superbloc, Pierce, Inc.
    Kaninchen-Anti-Rinderserumalbumin
    Meerrettichperoxidase (HRP)-Ziegen-Anti-Kaninchen), Zymed
    HRP-Substratpuffer, Zymed
    ABTS-Chromogen, Zymed
    Phosphatpuffer-Kochsalzlösung
    Tween 20, Sigma
  • Ausrüstung
  • ELISA-Plattenwascher, Dynatech
    ELISA-Plattenleser, Dynatech
    Präzisionswasserbad
    Corning Digital-pH-Messer
  • Glas- und Kunststoffartikel
  • Finneppette Multichannel Pipettor, Baxter
    Eppendorf-Pipetten, Baxter
    Eppendorf-Repeaterpipette, Baxter
    Pipettenspitzen für Finneppetter, Baxter
    Pipettenspitzen für Eppendorf, Baxter
    Glasteströhrchen, 13 × 100 mm; Baxter
    Mylar Sealing Tape für 96-Lochplatten, Corning
    Biocoat Cellware Rat Tail Collagen Type-1-beschichtete 96-Lochplatten, Collaborative Biomedical Products
  • Verfahren
  • Herstellung von Lösungen und Puffern
    • 1. AGE-BSA-Stammlösungen wurde wie folgt hergestellt. Natriumphosphatpuffer (0,4 M) wurde durch Lösen von 6 Gramm einwertigem Natriumphosphat in 100 ml destilliertem Wasser, 7 Gramm zweiwertigem Natriumphosphat (0,4 M) in 100 ml destilliertem Wasser und Einstellen des pH-Wertes der zweiwertigen Lösung auf 7,4 mit der einwertigen Lösung hergestellt. Natriumazid (0,02 Gramm) wurde pro 100 ml Volumen zugegeben, um das Bakterienwachstum zu inhibieren. Die BSA-Lösung wurde wie folgt hergestellt: 400 mg BSA (Rinderserumalbumin) vom Typ V wurden für jeden ml Natriumphophatpuffer (oben) zugegeben. Eine 400 mM Glukoselösung wurde durch Lösen von 7,2 Gramm Dextrose in 100 ml Natriumphosphatpuffer (oben) hergestellt. Die BSA- und Glukoselösungen wurden 1 : 1 gemischt und bei 37°C 12 Wochen inkubiert. Der pH-Wert des Inkubationsgemisches wurde wöchentlich beobachtet und wenn nötig auf den pH-Wert von 7,4 eingestellt. Nach 12 Wochen wurde die AGE-BSA-Lösung gegen PBS 48 Stunden mit vier Pufferänderungen jeweils bei einem 1 : 500-Verhältnis der Lösung zu dem Dialysepuffer dialysiert. Die Proteinkonzentration wurde durch das Mikro-Lowry-Verfahren bestimmt. Die AGE-BSA-Stammlösung wurde aliquotiert und bei –20°C gelagert. Verdünnte Lösungen von AGE-BSA wurden instabil, wenn sie bei –20°C gelagert wurden.
    • 2. Arbeitslösungen für Vernetzungs- und Aufspaltungsuntersuchungen wurden wie folgt hergestellt. Testverbindungen wurden in PBS gelöst und der pH-Wert wenn notwendig auf 7,4 eingestellt. Die AGE-BSA-Stammlösung wurde in PBS, um die maximale Vernetzung zu messen, und in der Inhibitorlösung zum Testen der inhibierenden Aktivität der Verbindungen verdünnt. Die notwendige Konzentration von AGE-BSA, um die optimale Empfindlichkeit zu erreichen, wurde durch anfängliche Titration jeder Reihe von AGE-BSA bestimmt.
    • 3. Waschpuffer („PBS-Tween") wurde wie folgt hergestellt. PBS wurde durch Lösen der folgenden Salze in einem Liter destillierten Wasser: NaCl, 8 Gramm; KCl, 0,2 Gramm; KH2PO4, 1,15 Gramm; NaN3, 0,2 Gramm, hergestellt. Tween-20 wurde auf eine Endkonzentration von 0,05% (Vol/Vol) zugegeben.
    • 4. Substrate zur Feststellung der sekundären Antikörperbindung wurden durch das 1 : 10 Verdünnen des HRP-Substratpuffers in destilliertem Wasser und das 1 : 50 Mischen mit ABTS-Chromogen noch vor der Verwendung hergestellt.
  • Assayverfahrensweisen
    • 1. Biocoat-Platten wurden mit 300 μl „Superbloc" blockiert. Die Platten wurden eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert und mit PBS-Tween dreimal mit dem Dynatech-Plattenwascher vor der Zugabe der Testreagenzien gewaschen.
    • 2. Jedes Experiment wurde in der folgenden Weise aufgebaut. Die ersten drei Vertiefungen der Biocoat-Platten wurden für den Reagenzienblindwert verwendet. Fünfzig Mikroliter der Lösungen von AGE-BSA wurden zugegeben, um Vertiefungen dreifach und nur PBS in Blindvertiefungen zu testen. Die Platte wurde bei 37°C vier Stunden inkubiert und mit PBS-Tween dreimal gewaschen. Fünfzig Mikroliter PBS wurden zu den Kontrollvertiefungen zugegeben und 50 μl der Test-„AGE-Vernetzungsaufspaltungs"-Verbindung wurden zu den Testvertiefungen und Blindproben zugegeben. Die Platte wurde über Nacht (ungefähr 16 Stunden) mit der Test "AGE-Vernetzungsaufspaltungs"-Verbindung inkubiert, gefolgt von Waschen in PBS vor der Zugabe von primärem Antikörper (nachstehend).
    • 3. Jede Reihe des primären Antikörpers, entweder Anti-BSA oder Anti-RNase, wurde hinsichtlich der optimalen Bindungsfähigkeit in diesem Assay durch Herstellen von Serienverdünnungen (1 : 500 bis 1 : 2000) und Plattieren von 50 μl jeder Verdünnung in den Vertiefungen der Biocoat-Platten getestet. Der optimale primäre Antikörper wurde aus der Sättigungskinetik bestimmt. Fünfzig Mikroliter des primären Antikörpers von geeigneter Verdünnung, die durch anfängliche Titration bestimmt wurde, wurden zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann mit PBS-Tween gewaschen.
    • 4. Die Platten wurden mit dem sekundären Antikörper, HRP-(Ziegen-Anti-Kaninchen), inkubiert, der 1 : 4000 in PBS verdünnt und als endgültiger sekundärer Antikörper verwendet wurde. Die Inkubation wurde bei Raumtemperatur dreißig Minuten durchgeführt.
    • 5. Die Feststellung der maximalen Vernetzung und Aufspaltung von AGE-Vernetzung wurde wie folgt durchgeführt. Das HRP-Substrat (100 μl) wurde zu jeder Vertiefung der Platte zugegeben und bei 37°C fünfzehn Minuten inkubiert. Ablesungen wurden in dem ELISA-Plattenleser von Dynatech durchgeführt. Der Probenfilter wurde auf „1" eingestellt und der Referenzfilter wurde auf „5" eingestellt.
  • Standardbetriebsverfahrensweisen
  • Vorbereitungsschritte
    • 1. Titrieren jeder neuen Reihe der AGE-BSA-Präparate, wie in Tabelle 4 beschrieben, und Bestimmen der optimalen AGE-BSA-Konzentration für den ELISA-Assay aus der Sättigungskinetik.
    • 2. Zu Beginn des Tages Ausspülen des Plattenwascherkopfes mit heißem Wasser, Abspülen mit destilliertem Wasser und 50% Ethanol. Füllen des Pufferbehälters des Plattenwaschers mit PBS-Tween (0,05%) und dreimal Reinigen des Systems vor der Verwendung.
    • 3. Herstellen einer Assaymatrize zum Aufbau des Experimentes, wie nachstehend unter „Assayaufbau", #2, beschrieben.
  • Assayaufbau
    • 1. Erwärmen des Superbloc-Reagens auf 37°C. Zugabe von 300 μl Superbloc zu jeder Vertiefung der Biocoat-Platte und Stehenlassen für sechzig Minuten bei 37°C. Dreimal Waschen der Vertiefungen mit PBS-Tween (0,05%). Drehen der Platte um 180 Grad und Wiederholen dieses Waschkreislaufes.
    • 2. Verdünnen des AGE-BSA in PBS, so daß 50 μl der verdünnten Probe die Menge an AGE-BSA enthalten wird, die zur minimalen Vernetzung und Inhibierung durch Pimagedin (Aminoguanidin) notwendig ist, wie durch die oben beschriebene anfängliche Titration bestimmt. Herstellen negativer Kontrollen durch Lösen nichtgebräunten BSA in PBS bei derselben Konzentration wie das AGE-BSA. Zugeben von 50 μl AGE-BSA oder BSA zu jeder Vertiefung, was den „AGE-BSA"- und „BSA"-Markierungen auf der Matrize entspricht.
    • 3. Lösen der Testverbindungen in PBS bei 30 mM Konzentration zur Vorbewertung. Der pH-Wert muß kontrolliert und wenn notwendig auf 7,4 eingestellt werden. Vorbehandeln der Kollagen-beschichteten Platten mit AGE-BSA, um maximale Vernetzung zu erhalten. Herstellen negativer Kontrollen für Inhibierungsexperimente durch Lösen von BSA in der Inhibierungslösung bei derselben Proteinkonzentration, wie sie für AGE-BSA verwendet wurde. Zugeben von 50 μl AGE-BSA oder BSA in den Inhibitorlösungen zu den Vertiefungen, die dem „ALT# + AGE-BSA" bzw. der „ALT# Blindprobe" auf der Matrize entsprechen. Inkubieren der Platte bei 37°C für vier Stunden. Nach der kovalenten Bindung von AGE-BSA an die Platten Waschen der Platten mit PBS-Tween bei der Herstellung der Nachweisreaktion (nachstehend).
    • 4. Das Binden des primären Antikörpers an die Biocoat-Platten wird wie folgt durchgeführt. Am Ende der Inkubation von vier Stunden werden die Vertiefungen mit PBS-Tween gewaschen. Geeignete Verdünnungen (wie durch die anfängliche Titration bestimmt) der Kaninchen-Anti-AGE-RNase oder Kaninchen-Anti-BSA-Antikörper wurden in PBS hergestellt, und 50 μl werden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Platte wird bei Raumtemperatur sechzig Minuten stehen gelasssen.
    • 5. Vertiefungen mit daran gebundenen sekundären Antikörper werden mit PBS-Tween gewaschen und 50 Mikroliter HRP (Meerrettichperoxidase) (Ziegen-Anti-Kaninchenserum), das auf 1–4000 in PBS verdünnt wurde, wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Der Platte wird bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen.
    • 6. Die Farbentwicklung wurde wie folgt durchgeführt. Die Platten werden wie im obigen Schritt 4 gewaschen. Verdünnen des HRP-Substratpuffers 1 : 10 in Wasser. Zugeben von 200 μl ABTS-Lösung, gründliches Mischen und Zugeben 100 μl dieses Reagens zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37°C für 15 Minuten. Ablesen der optischen Dichte bei 410 nm mit dem auf „1" eingestellten Probenfilter und dem auf „5" eingestellten Referenzfilter auf dem ELISA-Plattenleser von Dynatech.
  • Berechnen der prozentualen Inhibierung durch die oben beschriebene Verbindung. Verbindungen, bei denen festgestellt wurde, daß sie die Menge an Immunreaktivität vermindern, werden als therapeutisch nützlich betrachtet, insofern sie die Niveaus an Endprodukten der fortgeschrittenen Glykosylierung umkehren und vermindern.
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Beispiel 10
  • Um die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen ermitteln, die Menge an IgG, das mit zirkulierenden roten Blutzellen in Streptozotocin-induzierten diabetischen Ratten vernetzt ist, zu verringern, wurde durch den folgenden Assay gemessen. Die Testverbindungen werden den Versuchstieren entweder oral oder intraperitoneal verabreicht, und die Blutproben werden entnommen und zu verschiedenen Zeiten, beispielsweise 4,7 oder 19 Tagen, nach der Verabreichung getestet, um die Wirksamkeit zu beurteilen.
  • Protokoll für den RBC-IgG-Assay
  • A. Herstellung von roten Blutzellen
  • Das Blut wird den Ratten in heparinisierten Röhrchen entnommen und bei 2000 × g für 10 Minuten geschleudert, und das Plasma vorsichtig entfernt. Dann werden etwa 5 ml PBS pro ml Blut zugegeben, vorsichtig gemischt und dann erneut geschleudert. Der Überstand wird dann durch Absaugen entfernt. Das Waschen wird dann noch zweimal wiederholt. Dann werden 0,2 bis 0,3 ml gepackte RBC unter Verwendung einer Pipette von dem Boden des Röhrchens entnommen und zu dem PBS gegeben, um eine 1 : 10 Verdünnung herzustellen. Diese Verdünnung wird dann weiter 1 : 25 und 1 : 50 in PBS verdünnt.
  • B. Assayaufbau
    • 1. Erwärmen von Superbloc auf 37°C.
    • 2. Verwenden einer Platte vom Multiscreen-HA, 0,45 μ. Celluloseestermembranversiegelte 96-Lochplatte (Millipore MAHAS45).
    • 3. Benetzen der Vertiefungen mit 100 μl PBS.
    • 4. Zugeben von 300 μl Superbloc zu jeder Vertiefung und Inkubieren bei 37°C für eine Stunde.
    • 5. Plazieren der Platte auf dem Millititer-Vakuumhalter, Anlegen des Vakuums und einmal Herunterdrücken der Platte für festen Halt. Die Flüssigkeiten in den Vertiefungen werden angesaugt. Waschen der Vertiefungen mit 300 μl PBS-Tween 0,05%.
    • 6. Abstellen des Vakuums und Zugeben von 100 μl PBS zu jeder Vertiefung.
    • 7. Vorsichtiges Verwirbeln der RBC-Proben und Pipettieren von 50 μl in die Vertiefungen, wie pro Protokollbogen. Auslassen der ersten drei Vertiefungen für Reagenzblindwerte. Auslassen weiterer drei Vertiefungen für Antikörperblindproben.
    • 8. Ansaugen der Flüssigkeit wie oben und Waschen der RBCs zweimal mit PBS.
    • 9. Verdünnen von AB(Rb-Anti-Ratte) (Sigma A-6066) 1 : 25000 in PBS.
    • 10. Zugeben von 50 μl zu den Vertiefungen und Stehenlassen bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
    • 11. Ansaugen der Flüssigkeit wie oben und Waschen der RBCs zweimal mit PBS.
    • 12. Zugeben von pNPP-Substrat (1 mg/ml in DEA-Puffer). 100 μl pro Vertiefung.
    • 13. Farbentwicklung für zwei Stunden bei 37 °C.
    • 14. Plazieren einer 96-Lochmikrometerplatte von Corning in die Vakuumkammer.
    • 15. Plazieren der Probenplatte auf dem Vakuumverteiler. Gewährleisten, daß der Boden der Platte vollständig trocken ist.
    • 16. Anlegen von Vakuum für etwa 5 Minuten. Zugeben von 100 μl PBS zu allen Vertiefungen und erneutes Anlegen von Vakuum für 5 Minuten. Vorsichtiges Heben der Platte und Gewährleisten, daß keine Flüssigkeitstropfen am Boden der Platte hängen. Wenn notwendig, Anlegen von Vakuum für ein paar Minuten. Ablesen OD der in der Corning-Platte gesammelten Lösung auf dem Dynatech-Plattenleser Probenfilter 1 und Referenzfilter 4.
    • 17. Berechnen der prozentualen Aufspaltung: 100* (OD410-Kontrolle – OD410-behandelt)/OD410-Kontrolle.
  • Prozentuale Inhibierung bei Tieren, denen eine Menge von 10 mg/kg Körpergewicht oral verabreicht wurde, wird nachstehend aufgelistet:
    3-Amino-4-methyl-5-vinyl-thiazolium-mesitylensulfonat 11 ± 1 bei 19 Tagen
    3-[2-(2'-Naphthyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid 40 ± 24 bei 19 Tagen
    3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-5-methyl-thiazoliumbromid 65 ± 15 bei 19 Tagen
    3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid 58 ± 21 bei 19 Tagen
  • Der übermäßige Grad an Umkehrung der Vernetzung, der in diesen Untersuchungen beobachtet wurde, unterstreicht zwei wichtige Schlußfolgerungen durch die Anmelden. Erstens ist ein großer Prozentsatz an Vernetzungen, die in vivo gebildet wurden, anfällig für Anfall und Spaltung durch die dinucleophilen Thiazolium-basierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung, und daher wird geschlußfolgert, daß diese Vernetzungen ein α-Diketonsegment umfassen, das mit dem in den Schemen A und B gezeigten Modell übereinstimmt. Zweitens können die erfindungsgemäßen Vernetzungsaufspaltungsmittel in dem Sinne katalytisch fungieren, daß ein einzelnes, dinucleophiles Thiazolium-basierendes Molekül der vorliegenden Erfindung die Spaltung von mehr als einer Glykationsvernetzung angreifen und verursachen kann.
  • Beispiel 11
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von CNBr-Peptid-Aufnahmen von Rattenschwanzsehnen-Kollagen von normalen Ratten und welchen mit Diabetes, gefolgt von der Behandlung mit einer Verbindung der Formel I, d. h. 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid (ALT-766). Kollagenfasern (5 mg) aus Streptozotocindiabetischen Ratten und vom Alter aufeinander abgestimmten Kontrolltieren wurden in PBS bei 60°C für eine Stunde hydratisiert, das lösliche Kollagen wurde entfernt und die Pellets wurden einige male mit PBS gewaschen und dann mit 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid bei einer Konzentration von 30 mM 16 Stunden behandelt. Nach der Inkubation wurden die Pellets zentrifugiert, gewaschen und mit CNBr (40 mg/ml in Ameisensäure) bei 30 °C 48 Stunden behandelt. Die CNBr-Digests wurde mehrmals lyophilisiert, um CNBr und Säure zu entfernen, und dann der SDS-PAGE (20% Acrylamid) unter reduzierenden Bedingungen unterzogen (Spuren 1,2 und 9, MWS; Spur 3, 4 und 5, Schwanzsehnenkollagen von nicht-diabetischen Tieren, wobei 3 und 5 mit 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid behandelt wurden, 4 mit PBS behandelt wurde; Spuren 6, 7 und 8, Kollagen von diabetischen Tieren, wobei 6 und 8 mit 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid behandelt wurden, 7 mit PBS behandelt wurde). Die resultierenden Gele sind wie in 1 gezeigt.
  • Beispiel 12
  • Herstellung von AGE-BSA und vernetztem AGE-BSA:
  • Herstellen der folgenden Lösungen. 1. Puffer: 0,4 M Natriumphosphat pH 7,4.
    NaH2PO4 6 g/100 ml
    Na2HPO4 7 g/100 ml
    pH-Wert des einwertigen Natriumphosphats wurde auf 7,4 eingestellt, wobei 0,02 g zweiwertiges Natriumazid pro 100 ml Puffer zugegeben wurden.
  • 2. BSA-Lösung
  • BSA: Calbiochem Typ V; 400 mg/ml in Puffer 1. Hergestelltes Gesamtvolumen 50 g/125 ml. Filtriert durch einen 0,45 μ Filter in einen sterilen 1-Liter-Kolben von Corning.
  • 3. Glukoselösung, 400 mM
  • Glukose: 400 mM 9 g/125 ml Puffer. Filtriert durch einen 0,45 μ Filter in einen sterilen 1-Liter-Kolben von Corning.
  • Reaktionsaufbau:
  • BSA- und Glukoselösungen (jeweils 100 ml) wurden in einem sterilen 1-Liter-Kolben von Corning gemischt, fest verschraubt und bei 56°C ohne Schütteln inkubiert. Die Flasche wurde einmal die Woche geöffnet, um alipuote Teile zum Testen zu entfernen. Die Reaktion wurde für 9 Wochen fortgesetzt, wenn die AGE-BSA-Polymerbildung beobachtet wurde.
  • Aufspaltung des Polymers:
  • Teile des AGE-BSA-Gels wurden mit PBS gewaschen, bis kein Protein in dem Überstand mehr ausgewaschen wurde, und mit Papiertüchern trocken getupft. Etwa 50 mg des gewaschenen Gels wurde entweder mit PBS oder 10 ml 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid (ALT766) über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Überstände wurden durch SDS-PAGE analysiert und mit Agalmaschblau eingefärbt. Die resultierenden Gele werden in 2 gezeigt.
  • Beispiel 13
  • Um die Fähigkeit der AGE-Vernetzungsinhibierungs- und Umkehrungsmittel der vorliegenden Erfindung, die Verfärbung von Protein auf einer Oberfläche, so wie die, die auf der Zahnoberfläche auftritt, zu verhindern, weiter zu untersuchen, wird das folgende Oberflächenbräunungsexperiment durchgeführt. Als Ersatz für eine Pellikulabedeckte Zahnoberfläche wird unbelichtetes und entwickeltes Photopapier verwendet, um eine fixierte Proteinoberfläche (Gelatine, d. h. Kollagen) auf einer Papierunterlage bereitzustellen. Fünf Millimeter Ringe werden gestanzt und für eine Woche bei 50°C in eine Lösung aus 100 mM Glukose-6-phosphat in einen 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,4, enthaltend 3 mM Natriumazid, eingetaucht. Glukose-6-phosphat ist ein Zucker, der schneller an der nicht-enzymatischen Bräunungsreaktion als Glukose teilnimmt. Zusätzlich zu dem Glukose-6-phosphat werden Chlorhexidin und/oder eine Verbindung von Formel I eingeschlossen. Nach der Inkubation werden die Gelatine/Papier-Scheiben mit Wasser abgespült, hinsichtlich der braunen Farbe beobachtet und fotografiert.
  • Die Inkubation der Scheiben in Glukose-6-phosphat allein zeigt leicht braune Farbe gegen Scheiben, die in Puffer allein getränkt wurden. Der Einschluß von Chlorhexidin (in Form von Peridex® bei einer Endkonzentration von 0,04% Chlorhexidin) zeigt signifikantes Bräunen. Die Zugabe einer Verbindung von Formel I zu dem Chlorhexidin inhibiert vollständig das Bräunen der Gelatine, wie der Einschluß einer Verbindung von Formel I in Abwesenheit von Chlorhexidin.
  • Die leicht braune Farbe, die durch die Wirkung von Glukose-6-phosphat auf der Gelatineoberfläche allein und seine Verhinderung durch eine Verbindung von Formel I gebildet wird, zeigt den Nutzen der vorliegenden Erfindung beim Verhindern nichtenzymatischen Bräunens von Zahnoberflächen. Das verstärkte Bräunen in Gegenwart von Chlorhexidin und seine Verhinderung mit einer Verbindung von Formel I zeigt den Nutzen der vorliegenden Erfindung beim Verhindern des Antiplaquemittelverstärkten nicht-enzymatischen Bräunens, das mit Chlorhexidin auftritt.
  • Beispiel 14
  • Als Beweis der allgemeinen Nützlichkeit der erfindungsgemäße Verbindungen, unerwünschte Vernetzungen in medizinisch relevanten Biomolekülen aufzuspalten, führten die Anmelden das folgende Experiment mit dem Amyloidpeptid der Alzheimerkrankheit durch. Dieses 14 kDalton-Peptid umfaßt einen Hauptteil der großen, Plaque-ähnlichen Aggregate, die sich innerhalb des Hirnparenchyms von Patienten mit Alzheimerkrankheit bilden. Die allmähliche Anreicherung derartiger Amyloidplaques zusammen mit anderen abnormen Merkmalen, wie perivaskulären Amyloid und neurofibrilen Knäueln, hält man für die Erklärung bestimmter neurotoxischer und anderer pathogener Prozesse dieser Demenz, die immer tödlich und derzeit unheilbar ist. Das Alzheimer-Amyloidpeptid ist bekannt dafür, AGE-Modifikationen in vivo anzuhäufen, und wenn es physiologisch relevanten Konzentrationen von Glukose in vivo ausgesetzt wird, verstärkt diese Glykation die Bildung von nicht löslichen Aggregaten des Peptids, was an die Alzheimer-Amyloidplaques erinnert.
  • Das AGE-β-Peptid wurde hergestellt, indem ein Aliquot des löslichen β-Amyloidpeptids, das synthetisch hergestellt wurde und in der Sequenz dem β-Amyloidpeptid entspricht, das in den für die Alzheimerkrankheit typischen Plaques festgestellt wurde, in einer neutralen gepufferten Glukoselösung drei Monate inkubiert wurde, wie im allgemeinen für die Herstellung von AGE-BSA oben beschrieben, außer daß das β-Peptid durch BSA als Glykationssubstrat ausgetauscht wurde. Das AGE-β-Peptid, das nach diesem verlängerten Aussetzen der Glukose in vivo glykierte und vernetzte, wurde von Reagenzien mit niedrigem Molekulargewicht durch Größenausschlußchromatographie (beispielsweise über einer PFD-10-Säule) abgetrennt, und durch Standardverfahren iodiert, was das 125I-AGE-β-Peptid als das gewünschte radioaktiv markierte Reagenz ergab, das verwendbar ist, um Verbindungen für molekulare AGE-Aufspaltungsaktivität gemäß der folgenden Verfahrensweise zu testen oder zu screenen. Aliquote von 125I-AGE-β-Peptid wurden mit oder ohne zugegebenen erfindungsgemäßen Testverbindungen bei vorbestimmten Konzentrationen (beispielsweise k 10 mM Verbindung 766) für eine vorbestimmte Zeit (beispielsweise über Nacht) inkubiert, nach dem eine Probe des Inkubationsgemisches für denaturierende Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hergestellt und analysiert wurde, um das scheinbare Molekulargewicht gemäß allgemein bekannter Verfahrensweisen zu bestimmen.
  • Autoradiographische Aufnahmen, denen die resultierenden Elektrophoresegele ausgesetzt wurden, wurden in einem digitalen radiographischen Abbildungs- und Analysesystem gescannt, das verwendet wurde, um die Radioaktivität als Funktion des scheinbaren Molekulargewichtes (elektrophoretische Mobilität in SDS-enthaltende Puffer) aufzuzeichnen. Die Überprüfung der Ergebnisse dieses Experimentes zeigte, daß, wenn 125I-AGE-β-Peptid nicht einer erfindungsgemäßen „AGE Aufspaltungs"-Verbindung ausgesetzt wurde, eine hohe Molekulargewichtsbandbreite (>40kDalton) eluierte, was darauf schließen läßt, daß seine Glykation von der Aggregation und der Bildung stabiler kovalenter Vernetzungen begleitet wurde. Wenn jedoch 125I-AGEβ-Peptid zunächst in einer Lösung aus einem erfindungsgemäßen AGE-Vernetzungsaufspaltungsmittel inkubiert wurde, wurde das 125I-AGE-β-Peptid signifikant disaggregiert, wie durch das Auftreten des iodierten Materials mit niedrigem Molekulargewicht (>18 kDalton) in dem Endradiogramm gezeigt. Dieses Experiment läßt nicht nur darauf schließen, daß erfindungsgemäße dinucleophile Thiazolium-ähnliche Mittel verwendet werden können, um kovalente AGE-vermittelte Vernetzungen zwischen Proteinsträngen zu hydrolysieren, sondern daß ebenso derartige Inhibierung und Umkehrung von AGEs die nachteiligen molekularen Folgen der AGE-Anreicherung auf einem Protein, das für Krankheit beim Menschen ursächlich ist, umkehren kann.
  • Beispiel 15
  • Die Vernetzungsstruktur und verwandte Verbindungen der vorliegenden Erfindung finden ebenfalls Nutzen als Antigene oder Halbantigene, um Antikörper hervorzurufen, die speziell darauf gerichtet sind. Derartige Antikörper, auch die der vorliegenden Erfindung, sind wiederum nützlich, um die erfindungsgemäßen AAA-Strukturen nachzuweisen. Durch Konstruieren von Immunassays, die erfindungsgemäße Anti-Vernetzungsstruktur-Antikörper einsetzen, kann beispielsweise der Grad, bei dem Proteine durch derartige Vernetzungen modifiziert werden, gemessen werden. Wie oben erläutert und in Abhängigkeit der Lebensdauer des so modifizierten Proteins, stellt die immunchemische Messung der Vernetzungsepitope an einer Proteinprobe, wie Hämoglobin, einen Index der neuen AGE-Bildung bereit. Ebenso kann die immunchemische Detektion von Vernetzungsepitopen an zirkulie renden und/oder Gewebeproteinen verwendet werden, um den Verlauf der Therapie mit den erfindungsgemäßen Mitteln zu beobachten, wobei die Mittel gegen die Inhibierung und Aufspaltung der fortgeschrittenen Glykation gerichtet sind.
  • Vernetzungs-modifiziertes BSA zur Verwendung als Immunogen kann durch Verknüpfung einer Vernetzungsstruktur mit Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung einer Vielzahl von allgemein bekannten zweiwertigen Verknüpfungsreagenzien, wie ein Carbodimid-ähnliches EDC, hergestellt werden. Verschiedene andere Halbantigene, Antigene und konjugierte Immunogene, die den erfindungsgemäßen Vernetzungsstrukturen entsprechen, einschließlich ohne Einschränkung derer, die speziell hierin beschrieben werden, können entweder durch Isolation aus Inkubationsgemischen oder durch direkte synthetische Methoden günstig hergestellt werden. Diese Querstruktur kann dann als Immunogen verwendet werden, um eine Vielzahl an Antikörpern zu schaffen, die spezielle Epitope oder molekulare Merkmale davon erkennen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Vernetzungsstruktur selbst als ein Halbantigen betrachtet, das entsprechend mit irgendeinem der verschiedenen bevorzugten Trägerproteine verknüpft wird, einschließlich beispielsweise Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin (KLH), Thyroglobulin und am stärksten bevorzugt Rinderserumalbumin (BSA), unter Verwendung eines zweiwertigen Verknüpfungsreagens, wie EDC, gemäß den Protokollen, die in der Technik weit verbreitet sind.
  • Die Vernetzungsstruktur, ob allein oder an ein Trägerprotein gebunden, kann in jedem allgemein gültigen Immunisierungsprotokoll eingesetzt werden, um Antikörper und verwandte immunologische Reagenzien zu erzeugen, die bei einer Vielzahl von Anwendungen aufgrund der Spezifität der Antikörper für molekulare Merkmale der Vernetzungsstruktur verwendbar sind.
  • Nach einem bevorzugten Protokoll kann irgendeine von verschiedenen Tierarten immunisiert werden, um polyklonale Antiseren herzustellen, die gegen das Vernetzungsstruktur-Proteinkonjugat gerichtet sind, einschließlich beispielsweise Mäuse, Ratten, Hamster, Ziegen, Kaninchen und Hühner. Die ersten drei der zuvor ge nannten Tierarten sind eine besonders gewünschte Auswahl für die anschließende Herstellung von Hybridoma-absondernden Halbantigen-spezifischen monoklonalen Antikörpern. Die Herstellung dieser Hybridome aus Milzzellen von immunisierten Tieren kann durch mehrere Protokolle günstig erreicht werden, die in der Technik allgemein praktiziert werden, und die Bedingungen beschreiben, die zur Immortalisierung von immunisierten Milzzellen durch Verschmelzung mit einer entsprechenden Zelllinie, beispielsweise einer Myelomzelllinie, geeignet sind. Diese Protokolle zur Herstellung von Hybridomen stellen ebenso Verfahren zur Auswahl und Klonierung von Immunsplenocyt/Myelomzellhybridomen und zur Identifizierung von Hybridomklonen, die stetig Antikörper absondern, die gegen die erwünschten Epitope gerichtet sind, bereit. Tierarten, wie Kaninchen und Ziegen, werden für gewöhnlich für die Erzeugung von polyklonalen Antiseren eingesetzt, aber ungeachtet dessen, ob polyklonale Antiseren oder monoklonale Antikörper schließlich erwünscht sind, wird anfangs typischerweise das Halbantigen-modifizierte Trägerprotein zusammen mit einem Hilfsmittel, wie Complete Freund's Adjuvant, verabreicht. Immunisierungen können auf mehreren Wegen verabreicht werden, typischerweise intraperitoneal, intramuskulär oder intradermal; bestimmte Wege werden in der Technik gemäß der Arten, die zu immunisieren sind, und der Art des Antikörpers, der schließlich herzustellen ist, bevorzugt. Anschließend werden Booster-Immunisierungen im allgemeinen zusammen mit einem Hilfsmittel, wie Alaun oder Incomplete Freund's Adjuvant, verabreicht. Booster-Immunisierungen werden in Intervallen nach der anfänglichen Immunisierung verabreicht; im allgemeinen ist ein Monat ein geeignetes Intervall, wobei Blutproben zwischen einer und zwei Wochen nach jeder Booster-Immunisierung entnommen wurden. Alternativ wird manchmal eine Vielzahl an sogenannten Hyperimmunisierungsplänen, die im allgemeinen Booster-Immunisierungen charakterisieren, die in der Zeit enger beieinander liegen, bei dem Versuch, Anti-Halbantigen-Antikörper vorzugsweise über Anti-Trägerprotein-Antikörpern herzustellen, eingesetzt.
  • Die Antikörpertiter in Post-Boostblutproben können mit Halbantigen-spezifischen Immuntiter in mehreren günstigen Formaten, einschließlich beispielsweise Ouchterlony Diffusionsgelen und direkten ELISA-Protokollen, verglichen werden. In einem typischen direkten ELISA wird ein definiertes Antigen auf der Assayvertiefungs oberfläche, typischerweise in einem 96-Loch- oder Mikrotiterplattenformat, immobilisiert, gefolgt von einer Reihe von Inkubationen, die durch das Abspülen der Assayvertiefungsoberfläche voneinander getrennt sind, um nicht-gebunden Bindungspartner zu entfernen. Als nicht einschränkendes Beispiel können die Vertiefungen einer Assayplatte eine verdünnte, gepufferte wässerige Lösung des Halbantigen/Trägerkonjugats aufnehmen, wobei sich vorzugsweise das Trägerprotein von dem unterscheidet, das verwendet wurde, um das Antikörper-produzierende Tier, das zu testen ist, zu immunisieren; beispielsweise kann Serum aus dem AAA/KLH-Konjugat-immunisierten Tier gegen Assayvertiefungen, die mit immobilisierten AAA/BSA-Konjugat gefüllt sind, getestet werden. Alternativ kann die Assayoberfläche durch Inkubation mit dem Halbantigen allein gefüllt werden. Im allgemeinen wird die Oberfläche der Assayvertiefungen dann einer Lösung eines irrelevanten Proteins, wie Casein, ausgesetzt, um unbesetzte Stellen auf der Kunststoffoberfläche zu blockieren. Nach dem Abspülen mit einer neutralen gepufferten Lösung, die typischerweise Salze und einen Detergenten enthält, um nicht-spezielle Interaktionen zu minimieren, wird die Vertiefung dann mit einer Serienverdünnung des Serums, das aus der Blutprobe von Interesse (das primäre Antiserum) hergestellt wurde, in Kontakt gebracht. Nach dem erneuten Abspülen kann das Ausmaß an Testantikörpern, das auf den Assayvertiefungen durch Wechselwirkungen mit dem gewünschten Halbantigen oder Halbantigen/Trägerkonjugat immobilisiert wurde, durch Inkubation mit einem kommerziell erhältlichen Enzym-Antikörper-Konjugat eingeschätzt werden, wobei der Antiköperanteil dieses sekundären Konjugates gegen die Arten gerichtet ist, die verwendet werden, um das primäre Antiserum herzustellen; wenn beispielsweise das primäre Antiserum bei Kaninchen erhöht wurde, kann ein kommerzielles Präparat von Anti-Kaninchenantikörpern, die sich bei Ziegen erhöhten und an einem der verschiedenen Enzyme, wie Meerrettichperoxidase, konjugierten, als sekundärer Antikörper verwendet werden. Nach den Verfahrensweisen, die durch den Hersteller spezifiziert werden, kann dann die Menge dieses sekundären Antikörpers quantitativ durch die Wirkung des assoziierten Konjugatenzyms in einer kolorimetrischen Analyse eingeschätzt werden. Viele verwandte ELISA- oder radioimmunometrische Protokolle, wie kompetitive ELISAs oder Sandwich-ELISAs, wobei alle von denen im Stand der Technik allgemein bekannt sind, können gegebenenfalls substituiert werden, um das gewünschte Antiserum des hohen Titers nachzuweisen; d. h. ein be sonderes Antiserum, das ein wahres positives Ergebnis bei hoher Verdünnung ergibt (beispielsweise mehr als 1/1000 und stärker bevorzugt mehr als 1/10.000).
  • Ähnliche immunometrische Protokolle können verwendet werden, um den Titer von Antikörpern in Kulturüberständen von Hybridomen, die aus Milzzellen von immunisierten Tieren hergestellt wurden, einzuschätzen. In derart charakterisierten Antiseren oder Hybridomüberständen ist es wünschenswert, eine Vielzahl an Kontrollinkubationen, beispielsweise mit unterschiedlichen Trägerproteinen, verwandte, aber strukturell verschiedene Halbantigene oder Antigenen einzusetzen, und verschiedene Reagenzien bei der immunometrischen Verfahrensweise wegzulassen, um die nicht-spezifischen Signale in dem Assay zu minimieren und zuverlässige Bestimmungen der Antikörperspezifität und Titer von falschpositiven und falschnegativen Ergebnissen nachzuweisen. Die Arten der Kontrollinkubationen, die in dieser Hinsicht verwendet werden, sind allgemein bekannt. Ebenso können dieselben allgemeinen immunometrischen Protokolle später mit dem Antiserum eingesetzt werden, das durch die obigen Verfahrensweisen identifiziert wurde und einen hohen Titer aufweist und gegen spezifische Strukturbestimmungsgrößen bei den Vernetzungsstrukturen auf biologischen Proben, Lebensmitteln oder anderen Nahrungsmitteln, oder anderen Amin-tragenden Substanzen und Biomolekülen von Interesse gerichtet ist. Derartige letzte Anwendungen der gewünschten Anti-Aldehyd-modifizierten Amadori-Produkt-Antikörpern, ob polyklonal oder monoklonal, können zusammen mit Anweisungen und gegebenenfalls mit anderen nützlichen Reagenzien und Verdünnungsmitteln, einschließlich ohne Einschränkung, einer Reihe von molekularen Standards der Vernetzungsstruktur in Kitform für die Bequemlichkeit des Betreibers bereitgestellt werden.
  • Diese Erfindung kann in anderen Formen ausgeführt oder in anderen Wegen ohne Abweichung vom Geist oder den wesentlichen Merkmalen davon durchgeführt werden. Die vorliegende Offenbarung wird daher in jeder Hinsicht als erläuternd und nicht einschränkend betrachtet, wobei der Umfang der Erfindung durch die beiliegenden Ansprüche angegeben wird, und alle Veränderungen, die innerhalb der Bedeutung und dem Bereich der Äquivalenz liegen, werden als darin enthalten betrachtet.

Claims (15)

  1. Verwendung einer Verbindung mit der Strukturformel (I):
    Figure 00620001
    worin die Reste R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl, wobei der Acyloxyteil 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, oder die Reste R1 und R2 zusammen mit deren Ringkohlenstoffen einen C6-C10 kondensierten aromatischen Ring, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren Amino-, Halogen- oder Alkylendioxygruppen, bilden; Z Wasserstoff oder eine Aminogruppe ist; Y Amino, eine Gruppe der Formel CH2C(=O)R, worin R ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, Alkoxy, Hydroxy, Amino oder eine C6-C10 Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einer oder mehreren Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Dialkylaminogruppen, wobei der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, Hydroxy, Nitro oder Alkylendioxygruppen substituiert ist; eine Gruppe der Formel -CH2R', worin R' Wasserstoff oder ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder C6-C10 Arylrest ist, wobei der Arylrest gegebenenfalls mit einer oder zwei Gruppen sub stituiert ist, welche Halogen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Dialkylamingruppen sind, wobei der Alkylteil 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist; oder eine Gruppe der Formel -CH2C(=O)N(R'')R''' ist, worin R'' Wasserstoff ist und R''' ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit einer C6-C10-Arylgruppe, oder eine C6-C10-Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einer oder mehreren Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen oder Alkoxylcarbonylgruppen substituiert ist, oder R'' und R''' beide Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind; X ein pharmazeutisch verträgliches Anion ist, und jeder der Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen mit einem oder mehreren Halogen, Amino oder Alkylamino mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann; wobei jede Alkyl-, Alkinyl-, Alkoxy- und Acyloxyalkylgruppe gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogen-, Hydroxy-, Aminogruppen oder Alkylaminogruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann; zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von (i) Diabetes oder zum Behandeln oder Lindern von (ii) nachteiligen Folgeerscheinungen von Diabetes, (iii) Nierenschaden, (iv) Atherosklerose, (v) Hypertonie, (vi) Retinopathie, (vii) peripherer Neuropathie, (viii) grauem Star, (ix) Alzheimer'-Krankheit, (x) Gewebeschädigung, bewirkt durch den Kontakt mit erhöhten Spiegeln von reduzierenden Zuckern, (xi) reduzierter Hautelastizität oder Hautfalten, (xii) periartikulärer Rigidität oder (xiii) durch reduzierenden Zucker induzierte Änderungen in der Verformbarkeit von roten Blutzellen.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Reste R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl mit einem Acyloxyteil mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und einem Alkylteil mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen sind, oder die Reste R1 und R2 zusammen mit deren Ringkohlenstoffen einen C6-C10 kondensierten aromatischen Ring bilden, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Amino-, Halogen- oder Alkylendioxygruppen substituiert ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, worin Y eine Gruppe der Formel -CH2C(=O)R ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, worin R eine C6-C10-Arylgruppe ist.
  5. Verwendung nach Anspruch 2 oder 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes oder nachteiligen Folgeerscheinungen von Diabetes.
  6. Verwendung nach Anspruch 2 oder 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Nierenschaden.
  7. Verwendung nach Anspruch 2 oder 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Atherosklerose.
  8. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid oder ein biologisch oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 1 von einem der folgenden Verbindungen oder einem anderen biologisch und pharmazeutisch verträglichen Salz davon: 3-Aminothiazoliummesitylensulfonat, 3-Amino-4,5-dimethylaminothiazoliummesitylensulfonat, 2,3-Diaminothiazoliniummesitylensulfonat, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid, 3-Amino-4-methylthiazoliummesitylensulfonat, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-5-methylthiazoliumbromid, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-5-methylthiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Bromophenyl)-2-oxoethyl]thiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Bromophenyl)-2-oxoethyl]-4-methylthiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Bromophenyl)-2-oxoethyl]-5-methylthiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Bromophenyl)-2-oxoethyl]-4,5-dimethylthiazoliumbromid, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Bromophenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid, 3,4-Dimethyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumiodid, 3-Ethyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumbromid, 3-Benzyl-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliumchlorid, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Bromophenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, 3-(Carboxymethyl)benzothiazoliumbromid, 2,3-(Diamino)benzothiazoliummesitylensulfonat, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methylthiazoliumbromid, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)-5-methylthiazoliumbromid, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)thiazoliumbromid, 3-Amino-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliummesitylensulfonat, 3-(2-Methyl-2-oxoethyl)thiazoliumchlorid, 3-Amino-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliummesitylensulfonat, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, 3-(2-Methoxy-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliumbromid, 3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-acetoxyethyl)thiazoliumbromid, 2-Amino-3-(2-methoxy-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, 2-Amino-3-(2-methoxy-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, 2-Amino-3-(2-amino-2-oxoethyl)thiazoliumbromid, 2-Amino-3-(2-amino-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, 3-[2-(2',4'-Dimethoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, 3-[2-(4'-Fluorophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, 3-[2-(2',4'-Difluorophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, 3-[2-(4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, 3-Propargyl-thiazoliniumbromid, 3-Propargyl-4-methylthiazoliniumbromid, 3-Propargyl-5-methylthiazoliniumbromid, 3-Propargyl-4,5-dimethylthiazoliniumbromid, 3-Propargyl-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliniumbromid, 3-[2-(3'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, 3-[2-(3'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(3'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-benzothiazoliumbromid, 2,3-Diamino-4-chlorobenzothiazoliummesitylensulfonat, 2,3-Diamino-4-methyl-thiazoliummesitylensulfonat, 3-Amino-4-methyl-5-vinyl-thiazoliummesitylensulfonat, 2,3-Diamino-6-chlorobenzothiazoliummesitylensulfonat, 2,6-Diamino-benzothiazoldihydrochlorid, 2,6-Diamino-3-[2-(4'-methoxyphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, 2,6-Diamino-3-[2-(3'-methoxyphenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, 2,6-Diamino-3-[2-(4'-diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, 2,6-Diamino-3-[2-(4'-bromophenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, 2,6-Diamino-3-(2-phenyl-2-oxoethyl)benzothiazoliumbromid, 2,6-Diamino-3-[2-(4'-fluorophenyl)-2-oxoethyl]benzothiazoliumbromid, 3-Acetamido-4-methyl-5-thiazolyl-ethylacetatmesitylensulfonat, 2,3-Diamino-5-methylthiazoliummesitylensulfonat, 3-[2-(2'-Naphthyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'- hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(2',6'-Dichlorophenethylamino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-Dibutylamino-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Carbethoxyanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(2',6'-Diisopropylanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Carbmethoxy-3'-hydroxyanilino)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 2,3-Diamino-4,5-dimethylthiazoliummesitylensulfonat, 2,3-Diamino-4-methyl-5-hydroxyethyl-thiazoliummesitylensulfonat, 3-[2-(1',4'-Benzodioxan-6-yl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(3',4'-Trimethylendioxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(1',4-Benzodioxan-6-yl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, 3-[2-(3'-4'-Trimethylendioxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methylthiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-5-methylthiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]4,5-dimethylthiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-benzothiazoliumbromid, 3-[2-(4'-n-pentylphenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliniumbromid, 3-[2-(4'-n-pentylphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)thiazoliniumbromid, 3-[2-4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)thiazoliniumbromid, 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid, 3-[2-(3',5'-Tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-vinylthiazoliumbromid, 3-(2-Tert-butyl-2-oxoethyl)-thiazoliumbromid, 3-(2-Tert-butyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-(3'-Methoxybenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumchlorid, 3-(2',6'-Dichlorobenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumchlorid, 3-(2'-Nitrobenzyl)-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Chlorophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid, 3-[2-(4'-Chlorophenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid, oder 3-[2-(4'-Methoxyphenyl)-2-oxoethyl]-4-methyl-5-(2'-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid.
  10. Topische Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere Verbindungen, ausgewählt aus Verbindungen der Formel:
    Figure 00680001
    worin die Reste R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl mit einem Acyloxyteil mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und einem Alkylteil mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, C6-C10-Aryl (wobei Aryl gegebenenfalls mit einem oder zwei Gruppen substituiert ist, welche Halogen-, Hydroxy-, Alkoxy- mit 1 bis 6 Kohlenstoffatome, Alkylendioxy- oder Dialkylaminogruppen sind) sind oder die Reste R1 und R2 zusammen mit deren Ringkohlenstoffen einen kondensierten C6-C10 aromatischen Ring, gegebenenfalls substituiert mit einem oder mehreren Amino-, Halogen- oder Alkylendioxygruppen, bilden; Z Wasserstoff oder eine Aminogruppe ist; Y Amino, eine Gruppe der Formel CH2C(=O)R, worin R ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Amino oder eine C6-C10 Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einer oder mehreren Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogengruppen, Dialkylaminogruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxygruppen, Nitrogruppen oder Alkylendioxygruppen substituiert ist; eine Gruppe der Formel -CH2R', worin R' Wasserstoff oder ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder C6-C10 Arylrest ist, wobei der Arylrest gegebenenfalls mit einer oder zwei Gruppen substituiert ist, welche Halogen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Dialkylaminogruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind; oder eine Gruppe der Formel -CH2C(=O)N(R'')R''' ist, worin R'' Wasserstoff ist und R''' ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit einer C6-C10-Arylgruppe, oder eine C6-C10-Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einer oder mehreren Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen oder Alkoxylcarbonyl mit einem Alkoxyteil mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert ist, oder R'' und R''' beide Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind; X ein pharmazeutisch verträgliches Anion ist, und jeder der Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen mit einem oder mehreren Halogen-, Amino- oder Alkylaminogruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann; und einen pharmazeutisch verträglichen Träger dafür, geeignet zur topischen Verabreichung.
  11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, eingerichtet zur okularen Verabreichung.
  12. Topische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Verbindung ein 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazolium ist.
  13. Verbindung der Formel (I), wie in Anspruch 1 gezeigt, worin: (i) Y und Z beide Aminogruppen sind und R1 und R2 unabhängig voneinander Hydroxyalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl mit einem Acyloxyteil mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und einem Alkylteil mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind oder eines von R1 oder R2 Wasserstoff ist oder R1 oder R2 zusammen mit deren Ringkohlenstoffen einen aromatischen kondensierten Ring, substituiert mit einem oder mehreren Amino-, Halogen- oder Alkylendioxygruppen, bilden; oder (ii) R1, R2 und Z Wasserstoff sind; Y eine Gruppe der Formel -CH2C(=O)R, worin R ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy, Hydroxy, Amino oder ein Arylrest ist, wobei der Arylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen-, Dialkylamino-, Hydroxy-, Nitro- oder Alkylendioxygruppen substituiert ist, mit der Maßgabe, daß Y nicht 2-Phenyl-2-oxoethyl oder 2-(3'-Methoxyphenyl)-1-oxoethyl ist; eine Gruppe der Formel -CH2R', worin R' Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Arylrest ist; oder eine Gruppe der Formel -CH2C(=O)N(R'')R''' ist, worin R'' Wasserstoff ist und R''' ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit einem Arylrest, oder ein Arylrest ist, wobei der Arylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen- oder Alkoxylcarbonylgruppen substituiert ist; oder R'' und R''' beide Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind; oder (iii) R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxyalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acyloxyalkyl mit einem Acyloxyteil mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und einem Alkylteil mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen sind oder R1 und R2 mit deren Ringkohlenstoffen einen aromatischen kondensierten Ring bilden, gegebenenfalls substituiert mit einer oder mehreren Amino-, Halogen- oder Alkylendioxygruppen; Z Wasserstoff oder eine Aminogruppe ist; Y eine Alkinylmethylgruppe oder eine Gruppe der Formel -CH2C(=O)NHR ist, worin R ein Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, gegebenenfalls substituiert mit einer Arylgruppe, oder eine Arylgruppe ist, wobei die Arylgruppe gegebenenfalls mit einem oder mehreren Alkylresten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen- oder Alkoxylcarbonylgruppen substituiert ist; oder und X ist ein pharmazeutisch verträgliches Anion.
  14. Irgendeine der Verbindungen: 3-[2-(3',5'-Di-tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl]-5-methylthiazoliumbromid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; 3-[2-(3',5'-Tert-butyl-4'-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl)]-4-methyl-5-vinylthiazoliumbromid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4-methyl-5-vinyl-thiazoliumbromid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; 3-[2-(4'-Diethylaminophenyl)-2-oxoethyl]-thiazoliumbromid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; 3-(2-Phenyl-2-oxoethyl)-4,5-dimethylthiazoliumbromid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; 3-(2-Amino-2-oxoethyl)-4-methyl-5-(2-hydroxyethyl)-thiazoliumbromid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; 3-Amino-5-(2-hydroxyethyl)-4-methylthiazoliummesitylensulfonat oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon; oder 3-(2-Methyl-2-oxoethyl)-thiazoliumchlorid oder ein anderes biologisch verträgliches Salz davon.
  15. Verwendung von 3-Amino-4-methyl-5-[2-(2',6'-dichlorobenzyloxy)ethyl]thiazoliummesitylensulfonat oder 2,3-Diamino-5-(3',4'-trimethylendioxyphenyl)-thiazoliummesitylensulfonat zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von (i) Diabetes oder zum Behandeln oder Lindern von (ii) nachteiligen Folgeerscheinungen von Diabetes, (iii) Nierenschaden, (iv) Atherosklerose, (v) Hypertonie, (vi) Retinopathie, (vii) peripherer Neuropathie, (viii) grauem Star, (ix) Alzheimer'-Krankheit, (x) Gewebeschädigung, bewirkt durch den Kontakt mit erhöhten Spiegeln von reduzierenden Zuckern, (xi) reduzierter Hautelastizität oder Hautfalten, (xii) periartikulärer Rigidität oder (xiii) durch reduzierenden Zucker induzierte Änderungen in der Verformbarkeit von roten Blutzellen.
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