DE69627722T2

DE69627722T2 - Hydrophobische Taxan Derivate

Info

Publication number: DE69627722T2
Application number: DE69627722T
Authority: DE
Inventors: Suresh Bhatia; J. Craig Franklin; Paul A. Harmon; Andrew S. Janoff; Eric Mayhew
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Cephalon Ltd
Priority date: 1995-01-09
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2016-01-12
Also published as: EP1063234A2; AU4752296A; ES2163613T3; PT802911E; AU691401B2; US5580899A; US6291690B1; WO1996021658A1; US6118011A; EP0802911A1; CA2209001C; DE69617203D1; EP0802911B1; DK1063234T3; ATE238290T1; DE69627722D1; EP1063234B1; JPH11500712A; EP1063234A3; DE1063234T1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Taxanderivat, umfassend einen an ein Taxan gebundenen hydrophoben organischen Anteil, Zusammensetzungen umfassend diese Verbindungen, was Lipidträger-enthaltende Zusammensetzungen beinhaltet, und Verfahren zur Verabreichung solcher Zusammensetzungen an Tiere, was an Krebs erkrankte Tiere beinhaltet.
Taxane können Antikrebsmittel sein, die das Zellwachstum durch Blockieren der Zellteilung beeinflussen. Paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) ist beispielsweise ein Antimitotikum, das an Tubulin bindet und dadurch den Abbau der Mikrotubuli blockiert und folglich die Zellteilung inhibiert (Schiff et al., Nature 277: 665 (1979)). Die optimale Wirkung von Paclitaxel auf die Polymerisation und die Stabilisierung von Mikrotobuli wird bei Konzentrationen beobachtet, die nahezu stöchiometrisch zu der Konzentration der Tubulindimere sind (Schiff und Horowitz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(3): 1561-1565 (1980)). Paclitaxel zeigt eine Wirksamkeit gegen Ovarialkarzinom und Brustkrebs sowie gegen malignes Melanom, Dickdarmkrebs, Leukämie und Lungenkrebs (siehe z. B. Borman, Chemical & Engineering News, 2. September 1991, S. 11-18; The Parmacological Basis of Therapeutics (Goodman Gilman et al., Eds.), Pergamon Press, New York (1990), S. 1239; Suffness, Antitumor Alkaloids, in: "The Alkaloids, Band XXV", Academic Press, Inc. (1985), Kapitel 1, S. 6-18; Rizzo et al., J. Pharm & Biomed. Anal. 8(2): 159-164 (1990); und Biotechnology 9: 933- 938 (Oktober 1991)).
Paclitaxel kann aus natürlichen Ausgangsstoffen isoliert werden oder kann synthetisch aus natürlich vorkommenden Vorläufersubstanzen, wie z. B. Baccatin, hergestellt werden, indem Schutzgruppen an die Hydroxylgruppen solcher Vorläufersubstanzen, welche die Hydroxylgruppen des Paclitaxels darstellen sollen, angefügt, die Vorläufersubstanzen umgesetzt, und dann die Schutzgruppen von den Hydroxylgruppen entfernt werden, um Paclitaxel zu erhalten (siehe z. B. WO 93/10076, intern. Veröffentlichungsdatum 27105/93; K. V. Rao, U.S. Patent Nr. 5,200,534; R. A. Holton, U.S. Patent Nr. 5,015,744; PCT/US92/07990; V. J. Stella und A. E. Mathew, U.S. Patent Nr. 4,960,790; K. C. Nicolau, Nature 364 11993), S. 464-466; Nicolau, K. C. et al., Nature 3.67 (1994), Seiten 630-634; Holton, R. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 116 (1994), Seiten 1597-1600; WO93/16059, intern. Veröffentlichungsdatum 19/08/93; EP 528,729, veröffentlicht am 24102/93; EP 522,958, veröffentlicht am 13/01/93; WO91/13053, intern. Veröffentlichungsdatum 05/09/91; EP 414,610, intern. Veröffentlichungsdatum 27/02/91). Die in einigen dieser Syntheseverfahren verwendeten Schutzgruppen sind kurzkettige aliphatische Alkylgruppen oder hydrophile Phosphonooxyanteile, wie beispielsweise durch Y. Uedai et al., EP-A-0 558 959, intern. Veröffentlichungsdatum 08/09/93, offenbart, sind jedoch keine hydrophoben organischen Anteile im Sinne der vorliegenden Erfindung.
Paclitaxel ist in Wasser und wässrigen Lösungsmitteln extrem unlöslich und wird momentan in Form einer Emulsion in einem polyoxyethylierten Derivat von Castoröl und Ethanol, CremophorEL®, vertrieben. Die Verabreichung dieser Formulierung erfordert im Allgemeinen jedoch die Prämedikation mit anderen Arzneimitteln sowie eine langsame Infusion eines großen Volumens, um die dem Chremophor-Träger innewohnende Giftigkeit zu vermeiden. Es ist deshalb im Allgemeinen erforderlich, dass die Patienten über Nacht im Krankenhaus bleiben. Die hierin bereitgestellten Zusammensetzungen, welche ein an einen Lipidträger gebundenes Taxanderivat umfassen, können dieses Problem durch Bereitstellung einer Formulierung, bei der das Taxan während der Verabreichung stabil an den Lipidträger gebunden bleibt, lösen. Solch eine stabile Bindung an einen Lipidträger Umgeht im Allgemeinen die Toxizitätsprobleme, welche mit den momentan verwendeten Transportsystemen verbunden sind, als auch die Notwendigkeit für eine langsame Verabreichung durch Infusion.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung stellt ein Taxanderivat der Formel:
bereit, wobei A¹ H oder eine Gruppe mit der Formel Q- C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- ist. Q ist C&sub6;-H&sub5;-, (CH&sub3;)&sub3;CO- oder (CH&sub3;)CH=C(CH&sub3;)-. A² ist H oder CH&sub3;C(O)-. A³ ist H oder OH. Vorzugsweise ist A¹ (C&sub6;H&sub5;)(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)-. Vorzugsweise ist A² CH&sub3;C(O)- und A³ H, d. h. das Taxanderivat ist vorzugsweise Paclitaxel.
R und R¹ sind unabhängig voneinander entweder H oder hydrophobe organische Anteile ausgewählt aus gesättigten oder ungesättigten oder verzweigten Fettsäuren, wobei wenigstens einer der R und R¹ nicht H ist. Ist R¹ H, dann ist A¹ eine Gruppe mit der Formel Q- C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)-; und R ist dann nicht H, sondern vielmehr eine Gruppe die vorzugsweise die Formel Y¹ aufweist. Ist A¹ H oder eine Gruppe mit der Formel Q-C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- und ist R H, dann ist R¹ nicht H sondern vielmehr eine Gruppe mit der Formel Y². Dementsprechend ist wenigstens ein hydrophober organischer Anteil an das Taxan gebunden. Des Weiteren können zwei hydrophobe organische Anteile an das Taxan gebunden sein, wenn R vorzugsweise eine Gruppe mit der Formel Y¹ und R¹ vorzugsweise eine Gruppe mit der Formel Y² ist.
Jedes Y¹ und Y² ist unabhängig voneinander eine Gruppe mit der Formel: - C(O)(CH&sub2;)a(CH=CH)b(CH&sub2;)c(CH=CH)d(CH&sub2;)e(CH=CH)f(CH&sub2;)g(CH=CH)h(CH&sub2;)i CH&sub3;. Die Summe von a + 2b + c + 2d + e + 2f + g + 2h + i ist eine ganze Zahl von 7 bis 22 (was der Anzahl von Kohlenstoffatomen entspricht); a ist null oder eine ganze Zahl von 1 bis 22; jedes der b, d, f und h ist unabhängig voneinander Null oder 1; c ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20; e ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17; g ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14; i ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 und a bis i können bei jedem Vorkommen gleich oder unterschiedlich sein.
Ist R¹ nicht H, dann ist es vorzugsweise Y², mehr bevorzugt eine Gruppe mit der Formel -C(O)(CH&sub2;)aCH&sub3; und mehr bevorzugt -C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub0;CH&sub3; oder - C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3;.
Hydrophobe organische Anteile können sowohl an der 2'-Position als auch an der 7-Position an das gleiche Taxan gebunden werden; weder R noch R' sind dann H. R und R¹ können beide den gleichen Anteil darstellen, wie beispielsweise die Gruppen mit der Formel -C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub0;CH&sub3; oder - C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3; oder können unterschiedliche Anteile darstellen. Vorzugsweise stellen sie dieselben Anteile dar.
Des Weiteren wird hierin auch eine Zusammensetzung umfassend ein pharmazeutisch verträgliches Medium und das erfindungsgemäße Taxanderivat bereitgestellt. Vorzugsweise umfasst das Medium einen Lipidträger, beispielsweise eine Fettsäure, ein Lipid, eine Micelle, ein Aggregat, ein Lipoprotein oder Liposom, der mit dem Taxan verbunden ist. Vorzugsweise ist der Lipidträger ein Liposom. Der Lipidträger kann ein zusätzliches bioaktives Mittel umfassen, d. h. ein bioaktives Mittel zusätzlich zu dem Taxanderivat. Lipidträger können auch ein Kopfgruppen-modifiziertes Lipid umfassen.
Des Weiteren wird hierin ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Verabreichung eines Taxanderivats an ein Tier, vorzugsweise an den Menschen, bereitgestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um ein an Krebs erkranktes Tier zu behandeln, indem eine Antikrebs-wirksame Menge des Derivats an das Tier verabreicht wird. "Antikrebs-wirksame" Mengen eines Taxanderivats liegen üblicherweise bei wenigstens 0,1 mg des Derivats pro kg des Körpergewichts des Tieres, an welches das Derivat verabreicht wird. Üblicherweise liegt die Antikrebs- wirksame Menge des Taxans im Bereich von etwa 0,1 mg pro kg Körpergewicht bis etwa 1000 mg/kg. Vorzugsweise ist das verabreichte Antikrebstaxanderivat ein Paclitaxelderivat.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 zeigt Histogramme, welche die Bindung von Paclitaxel und Konjugaten aus Paclitaxel und einem hydrophoben organischen Anteil mit Palmitoyloleoyl-(POPC)-Liposomen zeigen. X-Achse: Paclitaxel; 2'-C12- Paclitaxel (-C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CHa an der 2'-Position an Paclitaxel gebunden); 7- C12-Paclitaxel (-C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3; an der Position 7 an Paclitaxel gebunden) und 2x-C12-Paclitaxel (-C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub2;CH&sub3; an den Positionen 2' und 7 an Paclitaxel gebunden). Y-Achse: Prozentanteil des an die Liposomen gebundenen Paclitaxels.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft ein Taxanderivat der Formel:
das einen an das Taxan gebundenen hydrophoben organischen Anteil umfasst. A¹ ist H oder eine Gruppe mit der Formel Q- C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)-. Q ist C&sub6;H&sub5;-, (CH&sub3;)&sub3;CO- oder CH&sub3;CH=C(CH&sub3;)-. A² ist H oder CH&sub3;C(O)-. A³ ist H oder OH.
Ist A¹ vorzugsweise eine Gruppe mit der Formel Q- C(O)NHCH(C&sub6;H5)CH(OR)C(O)- dann ist Q vorzugsweise C&sub6;H&sub5;, A² vorzugsweise CH&sub3;C(O)- und A³ vorzugsweise H. Vorzugsweise ist hierin Paclitaxel ([Verbindung I]; TAXOL® (C&sub4;&sub7;H&sub5;&sub1;NO&sub1;&sub4;), Bristol-Myers Squibb) bevorzugt. Taxoter (II), welches sich von Paclitaxel dadurch unterscheidet, dass es eine tert-Butoxycarbonylgruppe anstelle einer Benzoylgruppe an Position C-13 und eine Hydroxylgruppe anstelle einer Acetyloxygruppe an Position C-10 aufweist, ist jedoch auch geeignet. Folglich ist für Taxoter A¹ (CH&sub3;)&sub3;COC(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)(O)-, A² H und A³ H. Cephalomannin (III) unterscheidet sich von Paclitaxel durch die an dem distalen Ende des Esters an Position C-13 angeordnete Amidgruppe. A¹ ist dann (CH&sub3;)CH=C(CH&sub3;)C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)-, A² ist CH&sub3;C(O)- und A³ ist H. Zusätzliche Taxane, welche gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen 19-Hydroxybaccatin III [IV], Baccatin V [V], 10- Deacetylcephalomannin [VI], 10-Deacetylpaclitaxel [VII], 7-Epi-10- deacetylpaclitaxel [VIII], 7-Epi-10-deacetylcephalomannin [IX] und 10- Deacetylbaccatin III [X], die in der folgenden Tabelle zusätzlich zu Paclitaxel, Taxoter und Cephalomannin beschrieben sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die aufgelisteten Verbindungsnamen stellen unsubstituierte oder "freie" Taxane dar, d. h. Taxane, an welche hydrophobe organische Anteile nicht gebunden sind.
R und R¹ können jeweils unabhängig voneinander H oder ein hydrophober organischer Anteil sein, solange wenigstens einer der R und R¹ nicht H ist. Der Begriff "hydrophober organischer Anteil" bezeichnet Kohlenstoff- basierte molekulare Gruppen, die an Taxane gebunden sein können. Hydrophobe organische Anteile umfassen gesättigte oder ungesättigte aliphatische oder verzweigte Fettsäuren. Freie Taxane können von den Lipiden, mit denen sie im Plasma von Tieren, an welche die Taxan/Lipid- Verbindungen verabreicht wurden, assoziiert vorliegen, getrennt werden. Die Bindung eines hydrophoben organischen Anteils an ein freies Taxan, um ein Taxanderivat zu erhalten, kann die Wechselwirkung zwischen dem Derivat und einem Lipid stabilisieren.
Der Begriff "Bindung" bedeutet eine Konjugation, eine kovalente Bindung, eine Bindung, eine Konjugation oder eine andere Bildung einer chemischen Bindung zwischen einem Taxan und einem hydrophoben organischen Anteil. Der Anteil ist an eine oder mehrere aktive Gruppen, üblicherweise Hydroxygruppen des Taxans gebunden. Paclitaxel, weist beispielsweise drei Hydroxylgruppen auf, an welche die hydrophoben organischen Anteile gebunden werden können. Sie sind an den Positionen 2', 7 und 1 lokalisiert, wobei man annimmt, dass die relative Reihenfolge ihrer Reaktivitäten 2'> 7 > > 1 (von am meisten reaktiv bis am wenigsten reaktiv) ist. Die hydrophoben organischen Anteile können an die primäre reaktive Gruppe eines Taxans, z. B. die 2'-OH-Gruppe von Paclitaxel gebunden werden, indem stöchiometrische Mengen des zu bindenden Anteils, z. B. von Fettsäurechloriden oder -anhydriden, verwendet werden. Die Reaktionen werden üblicherweise in Gegenwart einer Base, wie Pyridin, Dimethylaminopyridin, Triethylamin oder anderen Basen, und in herkömmlich verwendeten polaren, aprotischen organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Der Verlauf der Reaktion kann bei Raumtemperatur mit Hilfe verschiedener gut bekannter Chromatographieverfahren, wie beispielsweise der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines 3% Methanol-in- Chloroform-Lösungsmittelsystems verfolgt werden. Die Identität der Verbindung kann durch Spektroskopie und andere analytische Verfahren, wie beispielsweise NMR-Spektroskopie, bestätigt werden.
Spezifische Reaktions- und Reinigungsbedingungen hängen im allgemeinen von einer Vielzahl von Faktoren, was die verwendeten Ausgangsmaterialien und Reaktanten einschließt, jedoch nicht darauf beschränkt ist, ab, und können leicht durch einen Fachmann bestimmt und anhand der Lehre der vorliegenden Erfindung gesteuert werden. Für die Bindung von Laurinsäure (C12) an Paclitaxel werden beispielsweise 9 mg (0,074 mmol) Dimethylaminopyridin (DMAP), 50 mg (0,059 mmol) Paclitaxel und 15 mg (0,068 mmol) Lauroylchlorid mit 50 ml Chloroform vereinigt.
Die Bindung von hydrophoben organischen Anteilen an weniger reaktiver Gruppen des Taxans erfordert üblicherweise eine Menge einer aktiven Form des Anteils, welcher im Überschuss zu der stöchiometrischen Menge eingesetzt wird. Die Hydroxylgruppe an Position 7 des Paclitaxels kann beispielsweise modifiziert werden, indem ein hydrophober organischer Anteil sowohl an die 2'- und 7-OH-Gruppen gebunden wird und dann selektiv der 2'-Anteil entfernt wird, sodass der Anteil an die Position 7 des Paclitaxels gebunden bleibt. Solche Reaktionen können unter Verwendung der gleichen Verfahren, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Die selektive Entfernung der 2'-Modifikation kann unter Verwendung einer stöchiometrischen Menge einer milden Base, wie beispielsweise Natriumbicarbonat, durchgeführt werden.
Die 7-OH-Gruppe von Paclitaxel kann zusätzlich auch modifiziert werden, indem die 2'-OH-Gruppe geschützt wird, bevor der Wirkstoff mit dem hydrophoben organischen Anteil kovalent verknüpft wird. Die 2'-OH-Gruppe kann auch durch Gruppen, wie beispielsweise Triphenylmethyl-, Methoxytriphenylmethyl-, Trifluoracetyl- und Hexanoylgruppen unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren geschützt werden. Das geschützte Paclitaxel wird dann mit einer aktiven Form des Anteils, z. B. mit Fettsäureanhydriden oder -chloriden, in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel in Gegenwart von Basen, wie DMAP und Pyridin, umgesetzt. Die Schutzgruppe kann von der 2'-Position durch gut bekannte und einfach durchführbare Verfahren unter milden sauren oder basischen Bedingungen entfernt werden. Laurinsäure kann beispielsweise an die 7-OH-Gruppe von Paclitaxel gebunden werden, indem 54 mg (0,44 mmol) DMAP, 50 mg (0,059 mmol) Paclitaxel und 77 mg (0,35 mmol) Lauroylchlorid mit 5 ml Chloroform vereinigt werden und die Reaktion bei Raumtemperatur gehalten wird, sodass sich 2',7-Dilauroylpaclitaxel bildet. Dann können 3,0 mg NaCl in 75 Mikroliter Wasser zu einer Lösung aus Chloroform/Methanol (1 : 1), welche 58 mg (0,048 mmol) 2',7-Dilauroylpaclitaxel enthält, zugegeben werden, um die an die 2'-OH-Gruppe gebundene Laurinsäure zu entfernen. Die Reaktion kann bei 30ºC inkubiert und durch Dünnschichtchromatographie (TLC) genau verfolgt werden. Die Bindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Mengen beschränkt, vielmehr kann der Fachmann aus bestimmten Gründen und innerhalb der in der vorliegenden Anmeldung genannten Bereiche die Mengen variieren.
R kann H oder eine Gruppe mit der Formel Y¹ sein; R¹ kann H oder eine Gruppe mit der Formel Y² sein. Wenigstens eine der R und R¹ ist nicht H.
Jedes der Y¹ und Y² ist unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel: - C(O)(CH&sub2;)a(CH=CH)b(CH&sub2;)c(CH=CH)d(CH&sub2;)e(CH=CH)r(CH&sub2;)s(CH=CH)n(CH&sub2;)i CH&sub3;. Die Summe aus a + 2b + c + 2d + e + 2f + g + Zh + i ist eine ganze Zahl von 7 bis 22 (was sich auf die Anzahl der Kohlenstoffatome bezieht); a ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 22; jedes der b, d, f und h ist unabhängig voneinander Null oder 1; c ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20; e ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17; g ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14; i ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11 und a bis i können bei jedem Vorkommen gleich oder unterschiedlich sein. Vorzugsweise ist jedes der Y¹ und Y² unabhängig voneinander gesättigt, d. h. es existieren keine Doppelbindungen zwischen benachbarten Kohlenstoffatomen. Dementsprechend sind b, d, f und h vorzugsweise null, c, e, g und i sind jeweils auch Null und Y¹ und Y² sind jeweils unabhängig voneinander Gruppen mit der Formel -C(O)(CH&sub2;)aCH&sub3;, wobei a eine ganze Zahl von 7 bis 22 ist. Mehr bevorzugt ist jedes der Y¹ und Y² unabhängig voneinander -C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub0;CH&sub3; oder -C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3;. Alternativ dazu können Y¹ und Y² auch ungesättigt sein, d. h. sie können ein oder mehrere CH=CH- Gruppen aufweisen. In diesem Fall ist wenigstens einer der b, d, f oder h nicht Null. Weist der ungesättigte Kohlenwasserstoff beispielsweise eine Doppelbindung auf, so ist b 1, d, f und h sind Null; jedes Y¹ und Y² sind dann unabhängig voneinander eine Gruppe mit der Formel - C(O)(CH&sub2;)a(CH=CH)(CH&sub2;)cCH&sub3;; wobei a Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist; c auch Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 18 ist, wenigstens eine der a oder c nicht Null ist und die Summe von a und c einer ganzen Zahl von 5 bis 20 entspricht.
Ist R¹ H, dann ist A¹ eine Gruppe mit der Formel Q- C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- und R ist nicht H. R ist dann eine oben definierte hydrophobe Gruppe und das Taxanderivat umfasst einen hydrophoben organischen Anteil, der an die 2'-Position des Taxans gebunden ist. Ist A¹ H oder eine Gruppe mit der Formel Q- C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- und ist R H, dann ist R¹ nicht H. R¹ ist dann eine oben definierte hydrophobe Gruppe und das Taxanderivat weist einen hydrophoben organischen Anteil auf, der an dessen 7-Position gebunden ist. Alternativ dazu kann das Taxanderivat einen sowohl an die 2'- als auch an die 7-Position des Taxans gebundenen hydrophoben organischen Anteil aufweisen. Diese Anteile können bei jedem Vorkommen gleich oder unterschiedlich sein, sie sind jedoch vorzugsweise gleich. Ist R¹ eine Gruppe mit der Formel Y², dann kann R eine Gruppe mit der Formel Y¹ sein.
Des Weiteren wird hierin auch eine Zusammensetzung umfassend das erfindungsgemäße Taxanderivat und ein pharmazeutisch verträgliches Medium bereitgestellt, wobei das Medium vorzugsweise einen an das Taxanderivat gebundenen Lipidträger umfasst. Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Medium" wird in Zusammenhang mit der Verabreichung von Wirkstoffen an Tiere, wie beispielweise Menschen, verwendet und umfasst Feststoffe, wie Pillen, Kapseln und Tabletten, Gele, Arzneimittelträger oder wässrige oder nicht wässrige Lösungen. Der Wirkstoff kann beispielsweise in gelöster, suspendierter oder emulgierter Form in oder mit diesen Medien vorliegen. Die pharmazeutisch wirksamen Medien werden im Allgemeinen unter Berücksichtigung einer Anzahl von Faktoren, die dem Fachmann gut bekannt sind, wie z. B. der speziell verwendete Wirkstoff, seine Konzentration, Stabilität und gewünschte Bioverfügbarkeit; die Krankheit, die Erkrankung oder der Zustand, welche durch die Zusammensetzung behandelt werden; der Patient, sein Alter, seine Größe und sein Allgemeinzustand, die gewünschte Art der Verabreichung der Zusammensetzung, wie beispielsweise nasal, oral, ophthalmisch, topisch, transdermal, vaginal, subkutan, intramammär, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär, wobei die Erfindung nicht darauf beschränkt ist, formuliert (siehe beispielsweise J. G. Naim, in: Remington's Pharmaceutical Science (A. Gennaro, Ed.), Mack Publishing Co., Easton, PA (1985), S. 1492-1517). Typische pharmazeutisch verträgliche Medien, welche bei der parenteralen Verabreichung von Arzneimitteln verwendet werden, umfassen beispielsweise DSW, eine wässrige Lösung, die 5 Volumen-% Dextrose enthält, und physiologische Kochsalzlösung. Pharmazeutisch verträgliche Medien können zusätzliche Bestandteile enthalten, welche die Stabilität des Wirkstoffs verbessern, was Konservierungsmittel und Antioxidantien einschließt.
Ein "Lipidträger" ist eine hydrophobe Substanz oder eine amphipathische Substanz mit einer hydrophoben Domäne, mit der das erfindungsgemäße Taxanderivat eine stabile Verbindung eingehen kann und die geeignet für eine therapeutische Verabreichung an Tiere ist. "Verbindung" bedeutet im Allgemeinen, wie hierin verwendet, eine Assoziation zwischen dem an das Taxan gebundenen hydrophoben organischen Anteil und dem hydrophoben Bereich des Lipidträgers. Die hydrophoben organischen Anteile und hydrophoben Lipiddomänen assoziieren im Allgemeinen über die Wirkung einer Vielzahl von Kräften, wie beispielsweise Van der Waal's-Kräfte, die im Allgemeinen dafür bekannt sind, dass sie zwischen hydrophoben Molekülen in einer wässrigen Umgebung wirken. Mittel zur Bestimmung der Stabilität solcher Verbindungen, wie beispielsweise durch Bestimmen des Prozentanteils des Taxanderivats, das mit Phosphor rückgewonnen werden kann, wenn der Lipidträger ein Phospholipid umfasst, sind gut bekannt und können durch den Fachmann unter Zuhilfenahme der Lehre der vorliegenden Erfindung leicht durchgeführt werden. Der Fachmann kann anhand der Lehre der vorliegenden Erfindung geeignete Lipidträger auswählen. Diese umfassen Fettsäuren, amphipathische Lipide, liposomale oder nicht liposomale, Lipoproteine und andere, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist der Lipidträger, mit dem das erfindungsgemäße Taxanderivat verbunden ist, ein Liposom.
Liposomen umfassen ein oder mehrere molekulare Doppelschichten aus Lipidmolekülen, wobei jedoch molekulare Doppelschicht ein wässriges Kompartiment einschließt. Unilamillare Liposomen weisen eine einzige molekulare Lipiddoppelschicht auf und multilamillare Liposomen weisen mehr als eine molekulare Doppelschicht auf (für einen Übersichtsartikel, siehe beispielsweise Chapman, "Physicochemical Properties of Phospholipids and Lipid-Water Systems", in: Liposome Technology, Band I: Preparation of Liposomes (G. Gregoriadis, Ed.). CRC Press, Boca Raton, FL (1984), S. 1-18, auf dessen Inhalt hierin Bezug genommen wird). Die amphipatischen Lipidmoleküle, welche die molekularen Lipiddoppelschichten bilden, umfassen eine polare (hydrophile) Kopfgruppe und ein oder zwei Acylketten. Die polaren Gruppen können Phosphat-, Sulfat- oder Stickstoff- basierte Gruppen sein, sind jedoch vorzugsweise Phosphatgruppen, wie Phosphorylcholin, Phosphorylethanolamin, Phosphorylserin, Phosphorylglycerin oder Phosphorylinositol. Die Fettsäuren umfassen im Allgemeinen 4 bis 24 Kohlenstoffatome und können gesättigt (z. B. Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure oder Stearinsäure) oder ungesättigt (z. B. Ölsäure, Linolensäure, Linolsäure und Arachidonsäure) sein. Des Weiteren können die Liposomen auch Sterole, wie Cholesterin, und andere Lipide umfassen.
Liposomen können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden, umfassend: Bangham's Verfahren zur Herstellung von multilamellaren Liposomen (MLVs); Lenk's, Fountain's und Cullis Verfahren zur Herstellung von MLVs mit einer im Wesentlichen gleichen interlamellaren Verteilung der gelösten Stoffe; Extrusion, Beschallung oder Homogenisierung von MLVs, um unimlamellare Liposomen herzustellen, und Ether- oder Ethanolinjektionsverfahren (siehe z. B. U.S. Patent Nrs. 4,522,803, 4,588,578, 5,030,453, 5,169,637 und 4,975,282 und R. Deamer and P. Uster, "Liposome Preparation: Methods and Mechanisms", in Liposomes (M. Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York (1983), S. 27-52, auf deren Inhalte hierin Bezug genommen wird).
An das erfindungsgemäße Taxanderivat gebundene Lipidträger, wie beispielsweise Liposomen, können ein zusätzliches bioaktives Mittel, d. h. ein bioaktives Mittel zusätzlich zu dem Taxanderivat, umfassen. Liposomen können beispielsweise mit biologisch wirksamen Mitteln beladen werden, indem das Mittel in dem Lipid oder der wässrigen Phase, die verwendet wird, um das Liposom herzustellen, solubilisiert wird. Alternativ dazu können ionisierbare bioaktive Mittel in die Liposomen eingebracht werden, indem zunächst die Liposomen gebildet werden, ein elektrochemisches Potenzial über die äußerste liposomale molekulare Doppelschicht aufgebaut wird, z. B. mittels eines pH-Gradienten, und dann das ionisierbare Mittel zu dem wässrigen Medium außerhalb des Liposoms zugegeben wird (siehe Bally et al., U.S. Patent Nr. 5,077,056 und U.S. Seriennr. 08/112,875, auf deren Inhalte hierin Bezug genommen wird).
Formulierungen aus Lipidträger und bioaktivem Mittel können den therapeutischen Index des bioaktiven Mittels erhöhen, beispielsweise indem die Toxizität des Mittels abgepuffert wird und die Rate, bei welcher das Mittel aus dem Blutkreislauf des Tieres verschwindet, verringert wird, was bedeutet, dass weniger Mittel verabreicht werden muss, um die gewünschte therapeutische Wirkung zu erzielen. In dieser Hinsicht können Lipidträger, wie beispielsweise Liposomen, ein oder mehrere Kopfgruppen- modifizierte Lipide umfassen, die amphipathische Lipide sind, deren polare Kopfgruppen durch Bindung an einen chemischen Anteil, wie beispielsweise Polyethylenglykol, einen Polyalkylether, ein Gangliosid, eine organische Dicarbonsäure o. dgl., welcher die Bindung von Serumproteinen an Lipidträger inhibieren kann, sodass das pharmakokinetische Verhalten des Trägers im Blutkreislaufsystem des Tieres verändert wird, derivatisiert wurden (siehe z. B. Blume et al., Biochim. Biophys. Acta. 114: 180 (1993); Gabizon et al., Pharm. Res. 10(5): 703 (1993); Park et al., Biochim. Biophys. Acta 1108: 257 (1992); Woodle et al., U.S. Patent Nr. 5,013,556; Allen et al., U.S. Patente Nrs. 4,837,028 und 4,920,016; U.S. Seriennr. 142,691, eingereicht am 25. Oktober 1993). Lipidträger werden üblicherweise aus dem Blutkreislauf des Tieres durch deren Retikuloendothelialssystem (RES) entfernt. Die Vermeidung einer Entfernung durch das RES kann dazu führen, dass der Träger länger in dem Blutkreislauf verbleibt, was dazu führt, dass eine geringere Menge des gebundenen Arzneimittels verabreicht werden muss, um die gewünschten Serumlevel zu erzielen. Eine erhöhte Blutzirkulationszeit ermöglicht auch das Einbringen von Liposomen in nicht-RES-enthaltendes Gewebe. Der an das Taxan gebundene hydrophobe organische Anteil kann auch ein Kopfgruppen- modifiziertes Lipid sein.
Die Menge des in den Träger eingebrachten Kopfgruppen-modifizierten Lipids hängt von mehreren Faktoren ab, die dem Fachmann gut bekannt sind oder von ihm ohne übermäßigen Aufwand bestimmt werden können. Diese umfassen die Art des Lipids und die Art der Kopfgruppenmodifikation, die Art und die Größe des Trägers und die beabsichtigte therapeutische Verwendung der Formulierung, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Die Konzentration des Kopfgruppen-modifizierten Lipids in dem Träger ist im Allgemeinen ausreichend, um die Zirkulationshalbwertszeit des Trägers in dem Tier zu verlängern, ist jedoch nicht so groß, um unerwünschte Nebeneffekte in dem Tier zu erzeugen und beträgt üblicherweise wenigstens etwa 5 Mol-% bezogen auf das in dem Träger vorliegenden Lipids. Das bevorzugte Kopfgruppen-modifizierte Lipid ist Dipalmitoylphosphatidylethanolaminglutarsäure (DPPE-GA), die üblicherweise bei einer Konzentration von etwa 10 Mol-% bezogen auf das vorliegende Lipid verwendet wird.
"Bioaktives Mittel" bezeichnet, wie hierin verwendet, jede Verbindung oder Zusammensetzung der Wahl, die an Tiere verabreicht werden kann und die an diesen eine biologische oder diagnostische Wirkung zeigt. Bioaktive Mittel umfassen antivirale Mittel, wie Acyclovir, Zidovudin und Interferone; antibakterielle Mittel, wie Aminoglycoside, Cephalosporine und Tetracycline, fungizide Mittel, wie Polyen-Antibiotika, Imidazole und Triazole, antimetabolische Mittel, wie Folsäure, Purin- und Pyrimidinanaloga, Antikrebsmittel, wie Anthracyclin-Antibiotika und Pflanzenalkaloide, wie Cholesterin, Kohlenhydrate, z. B. Zucker und Stärken, Aminosäuren, Peptide, Proteine als auch Zellrezeptorproteine, Immunoglobuline, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und Glycoproteine, Farbstoffe, Radiomarkierungen, wie Radioisotope und Radioisotop-markierte Taxane, radiopaque Taxane, fluoreszierende Taxane, Pupillen-erweiterende Taxane, Bronchidilatoren, Lokalanästhetika u. dgl., sind jedoch nicht darauf beschränkt. Das hierin verwendete zusätzliche bioaktive Mittel ist vorzugsweise ein antimikrobielles Mittel oder ein Antikrebsmittel. Das zusätzliche bioaktive Mittel kann ein therapeutisches Lipid, wie ein Ceramid, sein. Das zusätzliche Mittel kann auch ein zweites Taxanderivat sein.
Des Weiteren wird hierin ein Verfahren zur Verabreichung eines Taxanderivats an ein Tier, z. B. einen Menschen, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend das Derivat und ein pharmazeutisches Medium, an das Tier. Das Medium umfasst vorzugsweise einen Lipidträger, mehr bevorzugt ein Liposom, das an das Taxanderivat gebunden ist. Das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Taxanderivat umfasst einen an ein Taxan gebundenen hydrophoben organischen Anteil, und weist die Formel auf:
A¹ ist H oder eine Gruppe mit der Formel Q-C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)-; O ist C&sub6;H&sub5;-, (CH&sub3;)sC-O- oder (CH&sub3;)CH=C(CH&sub3;)-; A² ist H oder CH&sub3;C(O)-; A³ ist H oder OH. R und R¹ sind unabhängig voneinander entweder H oder ein hydrophober organischer Anteil ausgewählt aus gesättigten oder ungesättigten oder verzweigten Fettsäuren, wobei wenigstens einer der R und R¹ nicht H ist.
R kann eine Gruppe mit der Formel Y¹ sein und R² kann eine Gruppe mit der Formel Y² sein. Jedes der Y¹ und Y² ist unabhängig voneinander eine Gruppe mit der Formel C(O)(CH&sub2;)a(CH=CH)b(CH&sub2;)c(CH=CH)d(CH&sub2;)e(CH=CH)f(CH&sub2;)g (CH =CH)h(CH&sub2;)iCH&sub3;. Die Summe von a + 2b + c + 2d + e + 2f + g + 2h + i ist eine ganze Zahl von 2 bis 22; a ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 22, jedes b, d, f und h ist unabhängig voneinander Null oder 1; c ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 20; e ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 17; g ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 14; i ist Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 11; und a bis i können bei jedem Vorkommen gleich oder unterschiedlich sein. Jedes der Y¹ und Y² ist vorzugsweise und unabhängig voneinander eine Gruppe mit der Formel -C(O)(CH&sub2;)aCH&sub3;. Ist R eine Gruppe mit der Formel Y¹ und ist R¹ eine Gruppe mit der Formel Y², dann sind beide unabhängig voneinander vorzugsweise C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub0;CH&sub3; oder C(O)(CH&sub2;)&sub1;&sub6;CH&sub3;.
An Krebs erkrankte Tiere können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt werden, indem eine Antikrebs-wirksame Menge eines hierin bereitgestellten Taxanderivats verabreicht wird. Paclitaxelderivate sind hierin bevorzugt. Im Allgemeinen sind die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelbaren Krebsarten diejenigen Krebsarten, die mit dem entsprechenden freien, d. h. nicht gebundenen Taxan, behandelt werden können und umfassen Karzinome, Myelome, Neuroblastome oder Sarcome des Gehirns, der Brust, der Lunge, des Dickdarms, der Prostata oder der Eierstöcke als auch Leukämien oder Lymphome.
Die Antikrebswirkung der Taxanderivate kann in vitro beispielsweise durch Inkubieren einer Krebszellkultur mit dem Derivat und anschließendes Bestimmen der Inhibierung des Zellwachstums in der Kultur bestimmt werden. Geeignete Zellen für solche Versuche umfassen Maus-P388 Leukämie-, B16 Melanom- und Lewis-Lungenkrebszellen als auch humane Mamma-MCF7-, Ovarial-OVCA-3- und A549 Lungenkrebszellen. Die GI&sub5;&sub0;- Werte, d. h. die Konzentration des Taxanderivats, die benötigt wird, um eine 50%-ige Inhibierung des Zellwachstums in einer Kultur zu erzielen, können für ein Derivat bestimmt und verglichen werden. Je niedriger der GI&sub5;&sub0;-Wert eines Taxanderivats ist, desto niedriger ist die Menge des Derivats, die benötigt wird, um das Krebszellwachstum zu inhibieren. Dementsprechend können Verbindungen mit niedrigen Glso-Werten bessere therapeutische Indizes aufweisen.
Alternativ dazu kann ein Taxanderivat in vivo auf seine Antitumorwirksamkeit hin untersucht werden, beispielsweise, indem zunächst Tumore in geeigneten Testtieren, wie z. B. nackten Mäusen, etabliert werden. Zellen, die für die Etablierung eines Tumors geeignet sind, umfassen die oben für das in vitro-Testverfahren beschriebenen Zellen als auch andere Zellen, die im Stand der Technik für die Etablierung von Tumoren verwendet werden. Danach wird das Taxanderivat an das Tier verabreicht, und die ED&sub5;&sub0;-Werte, d. h. die Menge des Derivats, die benötigt wird, um eine 50%-ige Inhibierung des Tumorwachstums in dem Tier zu erzeugen, werden bestimmt als auch die Überlebensraten. Der Fachmann kann basierend auf der Lehre der vorliegenden Erfindung spezielle Taxanderivate für eine Verwendung gegen bestimmte Krebsarten auf Basis dieser Faktoren, wie die GI&sub5;&sub0;-, ED&sub5;&sub0;- und Überlebenswerte, auswählen.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine "Antikrebs-wirksame Menge" eines Taxanderivats jede Menge des Taxanderivats, die wirksam ist, die Ausbildung, das Wachstum, die Metastasierung, die Invasion oder Ausbreitung eines Krebses einzuschränken, zu lindern, zu inhibieren oder zu verhindern. Eine Antikrebs-wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Taxanderivats kann der gleichen Menge entsprechen, wie die therapeutischen Dosierungen für die entsprechenden freien Taxane. Die Bindung eines hydrophoben organischen Anteils an das Taxan, um ein Taxanderivat zu erhalten und die Bindung dieses Derivats an ein Lipid, z. B. ein Liposom, in einem Träger kann den therapeutischen Index des Wirkstoffs erhöhen. Dementsprechend bedeutet dies, dass im Vergleich zu freiem Taxan eine geringere Menge des Taxanderivats benötigt wird, um den gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen und dass die Antikrebs- wirksamen Mengen des Derivats geringer sind als die Antikrebs-wirksamen Mengen des freien Taxans.
Die Antikrebs-wirksamen Mengen der Taxanderivate können unter Berücksichtigung mehrerer Faktoren, z. B. dem Alter, der Größe und dem Allgemeinzustand des Patienten, dem zu behandelnden Krebs und die gewünschte Art der Verabreichung des Derivats, ausgewählt werden und können durch verschiedene Mittel, wie beispielsweise Versuche, betreffend die Menge der Dosierung, die gut bekannt sind und durch einen Fachmann zusammen mit der Lehre der vorliegenden Erfindung einfach durchgeführt werden können, bestimmt werden. Im Allgemeinen beträgt die Antikrebs- wirksame Menge des erfindungsgemäßen Taxanderivats wenigstens etwa 0,1 mg des Derivats pro kg Körpergewicht des Tieres, an welches die Zusammensetzung verabreicht wird. Vorzugweise beträgt die Antikrebs- wirksame Menge des Taxanderivats etwa 0,1 mg pro kg bis etwa 1000 mg pro kg.
Des Weiteren kann das hierin bereitgestellte Verfahren das Verabreichen eines zusätzlichen bioaktiven Mittels, üblicherweise eines Antineoplastikums, an ein Tier umfassen. Das zusätzliche bioaktive Mittel kann vor, zusammen mit oder nach der Verabreichung des erfindungsgemäßen Taxanderivats an das Tier verabreicht werden. Das zusätzliche Mittel kann in einem Liposom, beispielsweise dem gleichen Liposom mit dem das erfindungsgemäße Taxanderivat verbunden ist, eingeschlossen vorliegen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. Der Fachmann wird jedoch verstehen, dass diese Beispiele lediglich zur Illustration der in den nach den Beispielen folgenden Ansprüchen definierten Erfindung dienen.

BEISPIELE

Synthese der Taxane

2'-Caproyl-paclitaxel

Paclitaxel (100 mg, 0,1 17 mmol), Dimethylaminopyridin (DMAP) (18 mg, 0,133 mmol) und 10 ml Chloroform wurden in einem ofengetrockneten, 50 ml Rundkolben mit 80 mg (0,147 mmol) Caproylchlorid vereinigt und bei Raumtemperatur inkubiert. Der Reaktionsverlauf wurde durch Silika-basierte Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung eines 3%-Methanol- in-Chloroform-Lösungsmittelsystems aufgezeichnet. Nach 4 Stunden war der dem Paclitaxel entsprechende Punkt (Rf = 0,3) nicht mehr vorhanden; ein Punkt, der bei der Analyse der Anfangsreaktionsmischung nicht vorlag (Rf = 0,5) war anwesend.
Wasser (25 ml) wurde zu der Reaktion gegeben und dann wurde mit Chloroform extrahiert, um einen Großteil des DMAP zu entfernen. Nach dem Trocknen über Magnesiumsulfat wurde das Material aus der Chloroformphase in Chloroform, das 1% Methanol enthielt, gelöst. Das gelöste Material wurde dann durch einen Silikagel 60 (Fluka Fine Chemicals)-Kern, 4 cm hoch · 4 cm Durchmesser, gegeben und 300 ml einer 1%-Methanol-in-Chloroform-Mischung wurde durch den Kern durchgeleitet.
Die resultierende Verbindung wurde mit Hilfe von NMR-Spektroskopie als 2'- Caproyl-paclitaxel (Paclitaxel, bei dem CH&sub3;(CH&sub2;)&sub4;C(O)- an die 2'-OH-Gruppe des Paclitaxels gebunden ist) identifiziert (siehe unten).

7-Lauroyl-paclitaxel

Paclitaxel (50 mg, 0,059 mmol), DMAP (54 mg, 0,44 mmol), Lauroylchlorid (77 mg, 0,35 mmol) und 5 ml Chloroform wurden in einem 50 ml Rundkolben vereinigt und bei Raumtemperatur inkubiert. Der Reaktionsverlauf wurde wie oben beschrieben verfolgt. Bei einer Inkubation von 4 Stunden war der Punkt, welcher dem Paclitaxel entsprach nicht mehr sichtbar, der Punkt, welcher dem 2'-Lauroyl-paclitaxel (Rf = 0,5) entsprach war der größte und ein anderer Punkt (Rf = 0,7) zeichnete sich ab. Nach 24 Stunden war der Punkt, welcher dem 2'-Lauroyl-paclitaxel entsprach verschwunden und der Punkt (Rf = 0,7), welcher dem Paclitaxel, das sowohl an der 2'- als auch an der 7-Position acetyliert war, war größer geworden.
Die Reaktion wurde dann extrahiert und durch einen Silikakern, wie oben beschrieben, geschickt. Flash-Chromatographie wurde unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems umfassend Chloroform, das 1,5% Methanol enthielt, verwendet, um das Material bei dem Punkt Rf = 0,7 von dem mit der Lösungsmittelfront laufenden Material abzutrennen. Die Verbindung wurde mit Hilfe von NMR-Spektroskopie als 2',7-Di-caprolylpaclitaxel identifiziert.
48 mg (0,048 mmol) diacetyliertes Material wurden mit 4,2 mg Natriumbicarbonat, welches in 75 ul Wasser gelöst war, und 30 ml Chloroform/Methanol (1 : 1) vereinigt. Der Reaktionsverlauf wurde häufig untersucht, um die Hydrolyse anderer Esterverbindungen in dem Molekül während der Hydrolyse des 12 Kohlenstoffatome langen Restes, der an der 2'-Position vorliegt, zu reduzieren. Nach 8 Stunden konnten ein Hauptpeak (Rf = 0,5) und zwei Nebenpeaks (Rf = 0,55 und 0,45) beobachtet werden; jedoch konnte gezeigt werden, dass ein Großteil des Materials in der Reaktionsmischung das Ausgangsmaterial war. Eine weitere Inkubation verstärkte den Hauptpeak (Rf = 0,5) nicht wesentlich. Folglich wurden 25 ml Wasser zu der Reaktionsmischung gegeben und dann wurde mit Chloroform extrahiert. Eine präparative TLC-Chromatographie (Whatman 20 x 20c, fluoreszierend bei 254 nm, 1000 Mikrometer Platte) wurde verwendet, um die Verbindungen aufzureinigen. Die Verbindung wurde mit Hilfe von NMR-Spektroskopie als 7-Caproyl-paclitaxel identifiziert.

NMR-Spektroskopie

¹H- und Protonen-entkoppelte ¹³C-Spektren wurden von Paclitaxel, das mit 6-, 12- und 18-Kohlenstoffatom enthaltenden Fettsäuren umgesetzt worden war, aufgenommen. Resonanzshifts, welche Protonen in Alpha-Stellung zu den Hydroxylgruppen zugeordnet wurden, zeigen die Acylierung der entsprechenden Hydroxylgruppen an (siehe beispielsweise Kingston, Pharm. Ther. 52 (1991), S. 1-34). Die Reaktionen mit dem 2'-OH-Gruppenproton sind durch ein Verschwinden der Resonanz bei 3,6 ppm und einen Shift des Protons in der Alpha-Position zu der Hydroxylgruppe von 4,8 ppm zu 5,6 ppm gekennzeichnet. Ähnliche Veränderungen wurden durch Kingston nach Acetylierung der 2'-OH-Gruppe (Kingston, David G. I., Pharmac. Ther. (1991) 52: 1-34) beschrieben.
Paclitaxel, das mit Fettsäuren an der 2'- und der 7-Position derivatisiert ist, zeigt die gleichen Veränderungen, wie sie bei der 2'-Derivatisierung auftreten, als auch ein Resonanzverlust bei 2,5 ppm (7-OH-Gruppenproton) und einen Resonanzshift von 4,5 ppm bis 5,65 ppm. Die Reaktionen mit dem 7-Hydroxyproton sind durch ein Verschwinden der Resonanz bei 2,5 ppm und einen Shift des Protons in Alpha-Stellung zu der OH-Gruppe von 4,5 zu 5,65 ppm gekennzeichnet. Ähnliche Veränderungen wurden durch Kingston bei der Acetylierung der 7-OH-Gruppe (Kingston, David G. I., Pharmac. Ther. (1991) 52: 1-34) beobachtet. Kohlenstoffspektren von Paclitaxel, das an eine Fettsäure gebunden ist, weisen eine zusätzliche Resonanz bei Frequenzen, die mit der funktionellen Carbonylgruppe (165 bis 200 ppm) verbunden sind, als auch bei Frequenzen, die mit aliphatischen Kohlenstoffatomen (10 bis 60 ppm) verbunden sind, auf.

Beispiel 2

Bindungsassays

Liposomen wurden unter Verwendung der in der unten stehenden Tabelle angezeigten Lipidkonzentrationen ("DSPC" = Distearoylphosphatidylcholin; "EPC" = Eiphosphatidylcholin; "GA" = Dipalmitoylphosphatidylethanolamin/Glutarsäure; "Chol" = Cholesterin; "Arzneimittel" = Taxanderivat) und unter Verwendung von Standardverfahren zur Herstellung von multilamellaren Liposomen hergestellt. Diese wurden dann zehnmal durch ein Filter mit 100 nm großen Poren extrudiert, um unilamellare Liposomen zu erhalten (siehe Cullis et al., U.S. Pat. Nr. 5,008,050).
Paclitaxel und hydrophobe Paclitaxelderivate wurden in Liposomen, bestehend aus POPC formuliert. 54,6 Nanomol der liposomalen Formulierung jedes Arzneimittels wurde durch eine 55 cm · 3 cm Säule, welche mit BioGel A-15 m, Bio-Rad Agarosebeads mit einer Maschenzahl von 200 bis 400, gefüllt war, bei einer Flussrate von 6 cm/min geschickt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 gezeigt. Im Falle von Paclitaxel verblieben etwa 20% des Arzneimittels nach dem Durchlauf durch die Säule mit den Liposomen verbunden. Im Falle von 7-Caprolylpaclitaxel verblieben jedoch etwa 90% des Arzneimittels in einer Liposomen-gebundenen Form.
Die unten dargestellte Tabelle 1, die "Zusammenfassung der Tabelle über die Formulierungsstudie" zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse verschiedener Studien über die Wirkung der liposomalen Zusammensetzung aus 7-Caproyl-paclitaxel und 7-Stearoly-paclitaxel. Insbesondere wurden die Effekte der Sättigung, des Cholesterin- und PE-GA-Einschlusses untersucht. Spalte 1 beschreibt die untersuchte liposomale Formulierung, Spalte 2 die nach dem Durchlauf durch die Gelfiltrationssäulen (wie oben beschrieben) an die Liposomen verbundene Menge des Arzneimittels, Spalte 3 einen qualitativen Index der Liposomenaggregation (beobachtet durch Mikroskopie) und Spalte 4 den Molprozentanteil des nach der Liposomenbildung und Extrusion durch 100 nm Filter an das Lipid gebundenen Taxans. Wenn nicht anders angedeutet, betrug die anfängliche Paclitaxelkonzentration 5 Mol-%. Tabelle 1 Zusammenfassung der Formulierungsstudie

Beispiel 3

Charakterisierung der Taxan-enthaltenden POPC-Liposomen

Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC)-Liposomen, welche entweder Paclitaxel selbst oder ein Konjugat aus Taxan und hydrophoben organischen Anteilen enthielten, wurden gemäß dem oben beschriebenen Verfahren bei einem Molverhältnis von 95 : 5 des Lipids zu dem Wirkstoff hergestellt. Die Lipid-, Konjugat- und Paclitaxel-Konzentrationen wurden nach der Liposomenherstellung als auch vor und nach dem Durchgang durch eine Größenausschlusssäule (Bio-Rad Agarosebeads mit einer Siebgröße von 200 bis 400) bestimmt. Die Abnahme der Bindung des Paclitaxels oder des Konjugats mit dem POPC wurde berechnet, wenn eine Abnahme vorhanden war und als Maß für die Bindung an die Liposomen verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2, unten, beschrieben.

Tabelle 2

Liposomenbindungsstudien

Verbindung %-Anteil des an die Liposomen gebundenen Taxans
2'-Caproyl-Paclitaxel 40,8
2'-Lauroyl-Paclitaxel 50,9
2'-Stearoyl-Paclitaxel 65,7
7-Caproyl-Paclitaxel 63,2
7-Lauroyl-Paclitaxel 72,6
7-Stearoyl-Paclitaxel 89,5
Paclitaxel 21,7

Beispiel 4

In vivo-Studien

Liposomen wurden mit Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Distearoylphosphatidylethanolamin-Glutarsäure (DPPE-GA) und 7-Caproyl- Paclitaxel (7-C6) nach den oben beschriebenen bekannten Verfahren bei einem Mol-Verhältnis von DSPC : DPPE-GA : 7-C6 von 8 : 1 : 0,6 hergestellt.

P-388-Studien

1 · 10&sup5; P388-Zellen wurden in mehrere Gruppen von Mäusen injiziert und dann wurde 24 Stunden später entweder Taxol® (Cremophor-basierte Paclitaxelsuspension) oder ein Taxan-enthaltendes Liposom injiziert. "Reine", d. h. nicht-Taxan-enthaltende Liposomen wurden mit einer Menge von 512 mg/kg Körpergewicht verabreicht, was einer 50 mg/kg Körpergewichtdosis der Taxan-enthaltenden Liposomen entspricht. Die Liposomen- oder Taxol®-Verabreichung wurde am Tag 2, 3, 4 und 5 nach der Zellverabreichung wiederholt. Die Todestage wurden dann beobachtet und mittlere Überlebenszeiten wurden berechnet. Diese Daten sind unten in Tabelle 3 beschrieben. Tabelle 3 Überleben der P388-Tumor-tragenden Mäuse
1: "ILS" = verbesserte Lebensspanne = ((mittlere Überlebenszeit (MST) der behandelten Gruppe/MTS der Kontrollgruppe) · 100) - 100;
2: Phosphat gepufferte Salzlösung.

B-16-Studien

1 · 10&sup5; B-16-Zellen wurden in mehrere Gruppen von Mäusen injiziert (intravenös) und dann wurden einen Tag später entweder PBS, reine Liposomen, Taxol® oder 7-C6-Liposomen injiziert. Die Behandlung wurde an Tag 3, 5, 7 und 9 nach der Zellverabreichung wiederholt. Am Tag 21 wurden die Tiere getötet und ihre Lungen wurden entfernt und in Formalin fixiert. Die Anzahl der melanotischen Lungenknötchen wurde "blind" unter Verwendung eines Mikroskops gezählt; die Daten sind unten in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Wirkung auf die Entwicklung von B16 melanotischen Lungentumoren

Beispiel 5

Wachstumsinhibitionsstudien

Zellen (A549, MCF7 oder Lewis-Lungenzellen) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Paclitaxel inkubiert; die Zellwachstumsinhibierung wurde durch Standardverfahren bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in den Tabellen 5 und 6 (unten) beschrieben, wobei die Daten, die mikromolare Konzentration (GI&sub5;&sub0;) entweder des freien Paclitaxels oder eines freien Paclitaxelderivats (Tabelle 5) oder eines liposomalen Paclitaxels oder Derivats (Tabelle 6) aufzeigen, d. h. die Konzentration, bei der etwa 50% des Wachstums der angegebenen Zelllinien inhibiert ist. Tabelle 5 Wachstumsinhibierung durch Paclitaxel und seine Derivate
* Nicht löslich in DMSO oder EtOH. Tabelle 6 Wachstumsinhibierung durch liposomales (POPC) Paclitaxel

Claims

1. Taxanderivat, das die Formel:

besitzt,

wobei:

A¹ H oder eine Gruppe ist, die die Formel

Q-C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- besitzt;

Q C&sub6;H&sub5;-, (CH&sub3;)&sub3;C-O- oder (CH&sub3;)CH=C(CH&sub3;)- ist;

A² H oder CH&sub3;C(O)- ist;

A³ H oder OH ist;

R und R¹ jedes unabhängig entweder H oder hydrophobe organische Komponenten ausgewählt aus gesättigten oder ungesättigten aliphatischen oder verzweigten Fettsäuren ist und wobei wenigstens ein R oder R¹ nicht H ist, wobei wenn R¹ H ist, ist A¹ eine Gruppe, die die Formel Q-C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- besitzt und R ist nicht H;

wobei wenn A¹ H ist oder wenn A¹ eine Gruppe ist, die die Formel Q-C(O)NHCH(C&sub6;H&sub5;)CH(OR)C(O)- besitzt und R H ist, ist R¹ nicht H.

2. Taxanderivat nach Anspruch 1, wobei R und R¹ ungesättigte aliphatische Fettsäuren sind.

3. Taxanderivat nach Anspruch 1, wobei das Taxanderivat mit einem Lipid verbunden ist und die Verbindung zwischen dem Taxan und dem Lipid durch die Anwesenheit der hydrophoben Fettsäuregruppen stabilisiert ist.