DE69618377T2 - Verfahren zur Bestimmung von Milchsäure in organischen Materialien von nahrungsmässigem Interesse und Biosensor zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von Milchsäure in organischen Materialien von nahrungsmässigem Interesse und Biosensor zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Ermittlung und Bestimmung von Milchsäure in organischen Materialien von ernährungsmäßigem Interesse.
- Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein enzymatisches Verfahren zum gleichzeitigen Bestimmen von L(+)-Milchsäure und D(-)-Milchsäure in organischen Materialien von industriellem Interesse auf dem Agronahrungsgebiet.
- Die Erfindung betrifft auch einen Biosensor, der zum Ausführen des obigen Verfahrens verwendet werden kann.
- Es ist wohlbekannt, dass viele organische Materialien von ernährungsmäßigem Interesse Abbauprozesse durchmachen, von denen die meisten durch verschiedenartige Mikroorganismen verursacht werden, die nicht notwendigerweise pathogen sein müssen und in der Umgebung vorkommen.
- Diese Abbauprozesse können zur Bildung von Milchsäure in einer optisch aktiven Form führen.
- Insbesondere wird, wenn der Abbau durch Mikroorganismen und Algen verursacht wird, generell die D(-)-Milchsäure gebildet. Es gibt aber auch Mikroorganismen, wie beispielsweise die Lactobazillen, die die Bildung von beiden Enantiomeren von Milchsäure in einer razemischen Mischung bewirken.
- Der Grad an in Nährstoffen vorhandener Milchsäure kann daher als Indikator für die Frische und Qualität dieser Stoffe verwendet werden.
- Insbesondere ist das D(-)-Enantiomer von Milchsäure ein Indikator für die reduzierte Frische von vakuumverpackten oder abgepackten Produkten auf Fleischbasis, während die razemische Mischung ein Indikator für eine bakterielle Kontamination von Nahrungsmitteln pflanzlichen Ursprungs, wie beispielsweise Saft und Fleisch von Tomaten oder anderen Arten von Gemüsen oder Früchten, darstellt.
- Wenn die Konzentration von Milchsäure in diesen Nahrungsmitteln Werte im Bereich von 300 mg/kg erreicht, hat die bakterielle Kontamination bereits einen Grad erreicht, der die organoleptischen Eigenschaften der Nahrungsmittel ändert.
- Die Konzentration von Milchsäure in Nahrungsmittelmatrices kann durch verschiedene klassische Verfahren der chemischen und instrumentellen Analyse, die sehr empfindlich sind und äußerst genaue Ergebnisse liefern, bestimmt werden. Allerdings haben diese den Nachteil, dass sie eine sehr teure Apparatur erfordern und von speziell ausgebildetem Personal durchgeführt werden müssen. Darüber hinaus können diese Tests nur in chemischen Laboratorien durchgeführt werden und sind nicht dazu geeignet, am Ort der Probenahme verwendet zu werden. All dies führt zu hohen Betriebskosten, und die Verwendung dieser Tests ist daher notwendigerweise auf eine kleine Anzahl an Proben beschränkt.
- Schließlich ist die Zeit, die benötigt wird, um mit den oben beschriebenen Verfahren eine Analyse durchzuführen, ziemlich lang, im allgemeinen in der Größenordnung von mehreren Stunden, da schwierige Vorbereitungsverfahren und eine Vorbehandlung der Proben notwendig sind.
- Kürzlich sind verschiedene analytische auf der Verwendung von Enzymen basierende Verfahren entwickelt worden.
- Diese Verfahren basieren im allgemeinen auf Monoenzymsystemen; einige von ihnen verwenden Enzyme, die die Oxidation von L(+)-Milchsäure katalysieren (siehe beispielsweise M. Mascini u. a. (1987) "Lactic acid and pyruvate electrochemical biosensors for whole blood in ex vivo experiments with an endocrine artifical pancreas", Clin. Chem., 33, 591-593, und F. Mizutani u. a. (1985) "An Enzyme Electrode for L-lactic acid with a Chemically Amplified Response", Anal. Chim. Acta, 177, 153-166), während andere auf der Bestimmung der Konzentration von NADH, das zur gleichen Zeit wie Pyruvinsäure als Ergebnis der Oxidation von Milchsäure gebildet wird, basieren (siehe zum Beispiel H. Durliat, M. Comtat (1980), "Adsorption of L(+) Lactic acid Dehydrogenase from Aerobic Yeast on a Platinum Electrode", J. Electroanal. Chem. Interfacial. Electrochem., 89, 221-229; H. Durliat u. a. (1990) "Bienzyme Amperometric Lactic Acid-Specific Electrode", Anal. Chim. Acta, 231, 309-311; L. Gorton, A. Hedlund (1988), "A flowinjection method for the amperometric determination of Llactic acid with immobilized enzymes and a chemically modified electrode", Anal. Chim. Acta, 213, 91-100).
- Die obigen Verfahren erlauben die Bestimmung von beiden Enantiomeren von Milchsäure und gehen mit der Verwendung von D(-)- und L(+)-Lactatdehydrogenase einher, die in Gegenwart des Coenzyms NAD die Oxidation des Lactats zu Pyruvat und die gleichzeitige Reduktion von NAD zu NADH bewirkt. Die Konzentration von Milchsäure in der Nahrungsmittelmatrix wird von der Konzentration von NADH hergeleitet.
- NADH wird wiederum bestimmt mittels dessen direkter Oxidation an einer festen Elektrodenoberfläche, die allgemein aus Platin oder Graphit hergestellt ist (siehe J. Moiroux, P. J. Elving (1979), "Optimization of the analytical oxidation of dihydronicotinamide Adenine Dinucleotide at carbon and platinum electrodes", Anal. Chem., 51, 346-350).
- Allerdings hat dieses Verfahren verschiedene Nachteile aufgrund des großen Unterschieds des beteiligten Entladungspotentials (+800 mv). Unter diesen Umständen ist es möglich, dass fremde Stoffe, die die Messung beeinträchtigen könnten, an der Elektrode entladen werden.
- Als Alternative ist vorgeschlagen worden, NADH dadurch zu bestimmen, dass es mit Hexacyanoferrat(III) in Anwesenheit von Enzymdiaphorase reagiert wird, um Hexacyanoferrat(II) zu erhalten, dessen Konzentration amperometrisch durch seine Entladung an einer Platinelektrode mit einem Potential von +400 mV im Vergleich mit einer geeigneten Referenzelektrode, im allgemeinen Ag/AgCl, bestimmt werden kann (M. Montagne, H. Durliat, M. Comtat (1993) "Simultaneous use of dehydrogenases and hexacyanoferrate(III) ion in electrochemical biosensors for L-lactic acid, D-lactic acid and L-glutamate ions", Anal. Chim. Acta, 278, 25-33).
- Selbst dieses letzte Verfahren ist wegen seiner Komplexität und Schwerfälligkeit nicht völlig zufriedenstellend.
- Die JP-A-07092138, Patent Abstract of Japan, Bd. 095, Nr. 007, beschreibt ein Verfahren zum Bestimmen der Menge an L- und D-Lactat in einer Probe, das auf der Verwendung eines elektrochemischen Biosensors basiert, wobei die Elektrode mit einem Gemisch aus Oxdiase und Lactatrazemase modifiziert ist. Das Verfahren beruht auf der Oxidation von einem der beiden Lactatenantiomeren durch Lactatoxidase und der allmählichen Umwandlung des anderen Enantiomers in ein razemisches Gemisch durch Lactatrazemase. Dieses Verfahren basiert auf der progressiven Transformation der ursprünglichen Probe, enthaltend razemisches Lactat, in eine Probe, die nur dieses Enantiomer, das durch Lactatoxidase oxidierbar ist, enthält.
- Das Problem, das zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung geführt hat, war die Notwendigkeit, ein Verfahren zum Bestimmen von beiden Enantiomeren von Milchsäure, die in organischen Materialien von ernährungsmäßigem Interesse anwesend ist, zur Verfügung zu stellen, das die Nachteile der bekannten Verfahren überwindet, die auf der getrennten Bestimmung der beiden Enantiomeren beruhen, das einfach durchzuführen ist, sogar für Personal, das nicht speziell ausgebildet ist, und das auch zur Verwendung "im Feld", d. h. an dem Ort, an dem die organischen zu analysierenden Materialien lokalisiert sind, geeignet ist.
- Dieses Problem ist durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst, gelöst worden:
- - Reaktion einer Probe von organischem Material von ernährungsmäßigem Interesse oder einer Lösung, die durch Extraktion dieses Materials mit einem Lösungsmittel erhalten worden ist, mit einem Enzymsystem enthaltend L(+)-Lactatoxidase (LOD), D(-)- Lactatdehydrogenase (D-LDH) und Merrettichperoxidase (HPO) in Anwesenheit von NAD und Mn&spplus;&spplus;, in einem gepufferten wässrigen Medium,
- - Messung der Konzentration von jeglichem Sauerstoff, der als Ergebnis der Oxidation von Milchsäure, die in der Probe oder der Lösung enthalten war, gebildet worden ist, mit Hilfe einer amperometrischen Elektrode, die selektiv für Sauerstoff ist.
- Die Enzyme LOD, D-LDH und HPO sind vorzugsweise auf mindestens einem geeigneten Träger immobilisiert.
- Vorteilhafterweise können diese Enzyme auf einem einzelnen Träger bestehend aus einer Membran immobilisiert sein.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die für die Messung verwendete amperometrische Elektrode von dem gepufferten wässrigen Medium durch eine erste, gaspermeable Membran, die in direktem Kontakt mit der Elektrode steht, getrennt. Eine zweite Membran, die die obigen immobilisierten Enzyme trägt, wird dann über der ersten Membran angebracht.
- Die obige erste Membran ist vorteilhafterweise aus Teflon hergestellt.
- Eine weitere Membran bestehend aus einer Dialysemembran wird vorzugsweise extern über der zweiten Membran angebracht.
- Die obige zweite Membran besteht vorzugsweise aus einer Membran aus Nylon 6,6 mit Carboxylgruppen an ihrer Oberfläche.
- Die Lösungsmittel, die dazu verwendet werden können, die Milchsäure aus den organischen Materialien von ernährungsgemäßem Interesse zu extrahieren, sind Wasser und polare mit Wasser mischbare Lösungsmittel.
- Der pH-Wert des gepufferten wässrigen Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von 8,0 bis 8,5.
- Die Konzentration von NAD liegt vorzugsweise zwischen 1 und 2 mM und die von Mn&spplus;&spplus; zwischen 1 und 2 mM.
- Die obigen amperometrischen Elektroden, die an Enzymsysteme tragende Membranen angebracht sind, gehören zu der Klasse der "Biosensoren".
- Das Verfahren gemäß der Erfindung wird nun in näheren Einzelheiten mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben:
- Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der amperometrischen Elektrode des elektrochemischen Biosensors;
- Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des elektrochemischen Biosensors;
- Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung der Apparatur zum Ausführen des Verfahrens gemäß der Erfindung;
- Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer Variante der Apparatur zum Ausführen des Verfahrens gemäß der Erfindung.
- Mit Bezug auf die Fig. 1 umfasst eine amperometrische Elektrode zum Ausführen des Verfahrens gemäß der Erfindung einen kommerziellen Sensor 1 für Sauerstoff, der beispielsweise aus einer Platindrahtelektrode 2, die mit einer Schicht 2a eines Epoxyharzes beschichtet ist, besteht, welche sie von einer Referenzelektrode 3 (Ag/AgCl) trennt und isoliert, wobei diese koaxial um sie herum angebracht ist. Die Elektroden 2 und 3 sind innerhalb eines zylindrischen Behälters 4, der mit einer Elektrolytlösung oder einem Elektrolytgel mit einer geeigneten dazwischengesetzten Beschichtung 3a gefüllt ist, fixiert. Allerdings ist ein Ende der Platinelektrode 2 freigelegt, um zu ermöglichen, dass sie als Indikatorelektrode für den in dem gepufferten wässrigen Medium vorhandenen Sauerstoff wirkt. Diese Elektrode 2 wird auf einem Potential von ungefähr -650 mv im Vergleich mit der Referenzelektrode 3 gehalten. Eine Kappe 5, die auch zylindrisch ist, wird auf den zylindrischen Behälter 4 über das freigelegte Ende der Platinelektrode 2 geschraubt. Der Grundkörper dieser zylindrischen Kappe 5 besteht aus einer gaspermeablen Membran 6, die im allgemeinen aus Teflon hergestellt ist.
- Mit Bezug auf die Fig. 2 werden eine Membran 7, auf der L(+)-Lactatoxidase (LOD), D(-)- Lactatdehydrogenase (D-LDH) und Meerrettichperoxidase (HPO) immobilisiert sind, und eine Dialysemembran 8 in dieser Reihenfolge über der Membran 6 eines Biosensors B gemäß der Erfindung angebracht. Die Membranen 7 und 8 werden mittels eines elastischen Rings 9 fest an ihrem Platz gehalten.
- Mit Bezug auf die Fig. 3 wird der obige Biosensor B in eine Zelle 10 eingefügt, die mittels eines Thermostaten 11 auf einer konstanten Temperatur gehalten wird und eine gepufferte wässrige Lösung mit einem pH-Wert von 8,0 bis 8,5 enthält, in die der Biosensor B teilweise eingetaucht ist. Letzterer wird mit einer amperometrischen Meßvorrichtung 12 verbunden, dessen Ausgang mit einem Bandschreiber 13 oder irgendeinem anderen Datenaufzeichnungssystem verbunden ist.
- Vorteilhafterweise ist die Zelle 10 auf einem magnetischen Rührer 1 plaziert und mit dem relevanten Magnetstab 15 ausgerüstet.
- Das Verfahren gemäß der Erfindung wird weiter mit Bezug auf ein Beispiel beschrieben, das den Umfang der Erfindung nicht beschränkt und nur zur Veranschaulichung angeführt wird.
- Eine Tomatensaftprobe wurde mit dem Verfahren gemäß der Erfindung unter Verwendung einer schematisch in der Fig. 3 gezeigten Apparatur auf ihren Milchsäuregehalt getestet.
- Die Membran 7 des Biosensors, die immobilisierte LOD, D-LDH und HPO enthielt, war wie folgt hergestellt worden:
- Eine gleichförmige Schicht von 0,25 mg Lactatoxidase (20 U/mg Feststoff von Pedicoccus sp.), 0,5 mg D(-)- Lactatdehydrogenase (10 U/mg Feststoff von Staphylococcus epidermidis) und 0,25 mg Meerrettichperoxidase (300 U/mg Feststoff von Armoracia rusticana), aufgelöst in 20 ul einer 12%igen Lösung von Polyazetidin-Prepolymer (PAP) in Wasser, wurde auf eine Biodyne Transfermembran aus Nylon 6,6 mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Porengröße von 0,2 mm, die mit Carboxylgruppen funktionstüchtig gemacht worden war, aufgebracht.
- Nach 24 Stunden bei 4ºC wurde die Membran mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,00 gewaschen und dann im Trockenen bei 4ºC gelagert.
- Der multienzymatische Biosensor für die Bestimmung der Milchsäure wurde dann bereitgestellt, indem in der folgenden Reihenfolge über der Teflonmembran 6 des Sauerstoffsensors die wie oben beschrieben hergestellte Membran 7 und eine Dialysemembran 8 angebracht wurden, wobei die obigen Membranen dann mit Hilfe eines elastischen Rings 9 an dem Sensor angebracht wurden.
- Der vorbereitete Biosensor wurde in die Zelle 10 eingetaucht, die wie weiter oben beschrieben thermostatisch bei 37ºC gehalten wurde und 4,5 ml Puffer, umfassend 0,1 M Glycin, pH 8,0, und 0,5 ml von 2,0 mM NAD + Mn&spplus;&spplus;, enthielt, und mit der amperometrischen Meßvorrichtung 12 verbunden.
- Eine 0,1 ml Tomatensaftprobe, die auf Filterpapier gefiltert worden war, wurde zu der gepufferten Lösung in der thermostatisch gesteuerten Zelle 10, die mit dem Magnetrührer 14 gerührt wurde, gegeben.
- Die Änderung der Stromintensität, die nach der Zugabe der Testprobe registriert wurde, war proportional zu der Sauerstoffkonzentration, die wiederum proportional zu der Menge an D(-)- und L(+)-Milchsäure in der Probe ist.
- Diese Menge konnte mit Bezug auf die Eichkurve, die vorher mit Standardlösungen von Milchsäure, enthaltend 90 oder 180 ppm Milchsäure, erhalten worden war, quantitativ bestimmt werden.
- In dem fraglichen Fall wurde eine Gesamtmenge an Milchsäure (D(-)- und L(+)-enantiomere Formen) gefunden, die äquivalent zu 58,5 ppm war (Mittel von zehn Bestimmungen).
- Eine Teilmenge derselben Probe Tomatensaft wurde mittels dem enzymatischen spektrophotometrischen Verfahren analysiert, das auf dem enzymatischen Kit von Boehringer Mannheim, Katalognummer 1112821 beruht, um ihren Gesamtmilchsäuregehalt (D(-) + L(+)) zu bestimmen.
- Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass der Milchsäuregehalt 59,4 ppm war.
- Dies bestätigt die Zuverlässigkeit des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.
- Die oben beschriebene Methode wurde mit 9 weiteren Proben Tomatensaft aus verschiedenen Quellen wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle I unten zusammengefasst (die Werte sind in ppm ausgedrückt), die auch die Ergebnisse der Analyse zeigt, die bei denselben Proben mit dem oben beschriebenen enzymatischen spektrophotometrischen Verfahren durchgeführt wurde. Tabelle 1
- Die Haupteigenschaften des in dem oben beschriebenen Verfahren verwendeten Biosensors sind in der Tabelle II unten zusammengefasst.
- Temperatur der Analyse 37ºC
- PH 8,0
- Puffer 0,1 M Glycin
- Reaktionszeit 2 Minuten
- Lebensdauer (ausgedrückt als Anzahl von Tests) 180-200
- Gleichung von Eichkurve: Y = Δi(nA); X = [Milchsäure] in ppm Y = 2,6 + 0,12X
- Linearitätsbereich 5-300 ppm
- Korrelationskoeffizient 0,9990
- Mindesterfassungsgrenze 2.5 ppm
- Reproduzierbarkeit von Messungen (ausgedrückt als "gepoolte Standardabweichung" in dem Linearirätsbereich) 2,8%
- Mit Bezug auf die Fig. 4 besteht die alternative Apparatur zur Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung aus einem Biosensor B, der mit dem oben beschriebenen identisch ist und in eine Durchflußzelle 16 eingesetzt wird, in die die Flüssigkeit für die Analyse eingespeist wird. Die Durchflußzelle 16 wird durch den Thermostaten 17 bei einer konstanten Temperatur gehalten und steht in Flüssigkeitskontakt mit einer peristaltischen Pumpe 18, die mit einem Ausgang 19 für die Flüssigkeit, die der Messung unterzogen wurde, verbunden ist. Die Elektrode des Biosensors B ist mit einer amperometrischen Meßvorrichtung 20 verbunden, dessen Auslaß mit einem Bandschreiber 21 verbunden ist.
- Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren unter Verwendung der oben mit Bezug auf die Fig. 4 beschriebenen Apparatur durchgeführt werden.
- Gemäß dieser Ausführungsform wird die Probe für die Analyse oder der daraus erhaltene konzentrierte wässrige Extrakt in die Durchflußzelle 16 gegeben, die durch den Thermostaten 17 bei einer konstanten Temperatur gehalten wird und in der die immobilisierte LOD, D-LDH und HPO enthaltende Biosensor B angeordnet ist. Als Ergebnis der durch diese Enzyme katalysierten Reaktionen wird Sauerstoff erzeugt, der durch den Biosensor B erfasst wird, welcher ein elektrisches Signal erzeugt, das an die amperometrische Meßvorrichtung 20 weitergeleitet wird und auf dem Bandschreiber 21 registriert wird.
- Die aus der Durchflußzelle 16 austretende Flüssigkeit wird mittels einer peristaltischen Pumpe 18 durch den Auslaß 19 ausströmen gelassen.
- Die Verwendung der Ausführungsform der oben beschriebenen Erfindung ermöglicht es, das analytische Verfahren zu automatisieren, wodurch die Analysezeiten verkürzt werden und das Verfahren vereinfacht wird, während eine mehr als zufriedenstellende Reproduzierbarkeit erhalten wird, wie durch die experimentellen, in der Tabelle III unten gezeigten Ergebnisse belegt ist, die die Mittel von mindestens zehn Bestimmungen sind, die bei Tomatensaftproben durchgeführt wurden. Tabelle III
- Die Haupteigenschaften des Biosensors gemäß der Erfindung, der in dem Verfahren gemäß der alternativen, oben beschriebenen Ausführungsform verwendet wird, sind in der Tabelle IV unten zusammengefasst.
- pH 8,5
- Puffer 0,1 M Glycin
- Reaktionszeit 1 Minute
- Lebensdauer (ausgedrückt als Anzahl von Tests) 500-600
- Gleichung der Eichkurve: Y = iΔ(nA); X = [Milchsäure] in ppm Y = 0,33-0,056X
- Linearitätsbereich 50-450 ppm
- Korrelationskoeffizient 0,9950
- Mindesterfassungsgrenze 40 ppm
- Reproduzierbarkeit der Messungen (ausgedrückt als "gepoolte Standardabweichung" in dem Linearitätsbereich) 6,0%
- Die perfekte Reproduzierbarkeit des Verfahrens und seine ausgezeichnete Genauigkeit, Empfindlichkeit und Einfachheit machen es ideal für eine große Anzahl von Anwendungen in der Nahrungsmittelindustrie (Tomate, Fruchtsäfte, abgepackte Produkte, Fleisch in Dosen usw.).
- Schließlich ist noch zu erwähnen, dass das Verfahren gemäß der Erfindung leicht durchzuführen ist, sogar außerhalb eines chemischen Laboratoriums und selbst für Personal, das nicht speziell ausgebildet ist, so dass die Gesamtkosten beträchtlich reduziert werden.
Claims (10)
1. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung von D(-) und L(+)
Milchsäure in einem organischen Material von
ernährensmäßigem Interesse, umfassend die folgenden Schritte:
- Reaktion einer Probe dieser Materialien oder einer
Lösung, die durch Extraktion dieser Materialien mit
einem Lösungsmittel erhalten worden ist, mit einem
Enzymsystem enthaltend L(+)-Lactatoxidase (LOD), D(-)-
Lactatdehydrogenase (D-LDH) und Meerrettichperoxidase
(HPO), in Anwesenheit von NAD und Mn++, in einem
gepufferten wässrigen Medium,
- Messung der Konzentration von jeglichem Sauerstoff,
der als Ergebnis der Oxidation von Milchsäure, die in
der Probe oder der Lösung enthalten war, gebildet
worden ist, mit Hilfe einer amperometrischen
Elektrode, die selektiv für Sauerstoff ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
genannten Enzyme auf einem einzelnen Träger bestehend aus
einer Membran immobilisiert sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
für die Messung verwendete amperometrische Elektrode von
dem gepufferten wässrigen Medium durch eine erste,
gaspermeable Membran, die in direktem Kontakt mit der Elektrode
steht, getrennt ist und daß eine zweite Membran, die die
obigen immobilisierten Enyzme trägt, extern über der ersten
Membran angebracht ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine
weitere Membran bestehend aus einer Dialysemembran extern
über der zweiten Membran angebracht ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
genannte zweite Membran eine Membran ist, die aus Nylon 6,6
mit Carboxylgruppen an ihrer Oberfläche hergestellt ist.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die amperometrische Elektrode aus einer
Platindrahtelektrode (2), die mit einer Schicht (2a) eines
Exoxyharzes beschichtet ist, besteht, welche sie von einer
Referenzelektrode (3) (Ag/AgCl) trennt und isoliert, wobei
diese koaxial um sie herum angebracht ist, wobei die beiden
Elektroden (2) und (3) innerhalb eines zylindrischen
Behälters (4), der mit einer Elektrolytlösung oder einem
Elektrolytgel mit einer geeigneten dazwischengesetzten
Beschichtung (3a) gefüllt ist, fixiert sind und daß die
Platinelektrode (2) als Indikator für den Sauerstoff wirkt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Platinelektrode (2) auf einem Potential von ungefähr -650
mV im Vergleich mit der Referenzelektrode gehalten wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
amperometrische Elektrode von dem gepufferten wässrigen
Medium durch eine erste Membran aus Teflon getrennt ist,
über der extern eine zweite Membran bestehend aus der aus
Nylon 6,6 hergestellten Membran, die die immobilisierte
LOD, D-LDH und HPO trägt, und eine dritte Membran bestehend
aus einer Dialysemembran angebracht ist.
9. Biosensor (B) für die gleichzeitige Bestimmung von D (-)
und L (+) Milchsäure in organischen Materialien von
ernährungsmäßigem Interesse umfassend einen Sensor (1) für
Sauerstoff, einschließlich einer aus Teflon hergestellten
Membran (6), die für Sauerstoff permeabel ist, dadurch
gekennnzeichnet, daß über der Membran (6) eine Membran (7),
auf der L(+)-Lactatoxidase (LOD), D(-)-Lactatdehydrogenase
(D-LDH) und Meerrettichperoxidase (HPO) immobilisiert sind,
und eine Dialysemembran (8) angebracht sind, wobei die
genannten Membranen durch einen elastischen Ring fest an
ihrem Platz gehalten werden.
10. Biosensor (B) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
die Membran (7) aus Nylon 6,6 hergestellt ist.
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