ITMI951062A1 - Metodo per la determinazione di acido lattico in materiali organici di interesse alimentare e biosensore per l'esecuzione di tale metodo - Google Patents
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Abstract
E' descritto un metodo per la determinazione di acido lattico in materiali organici di interesse alimentare comprendente la reazione in un mezzo acquoso tamponato di un campione di detti materiali, o di una soluzione ottenuta per estrazione di essi, con un sistema enzimatico costituito da L(+) lattato ossidasi, D(-) lattato deidrogenasi e perossidasi da barbaforte e la misurazione della concentrazione dell'ossigeno eventualmente sviluppatosi in conseguenza dell'ossidazione dell'acido lattico contento in detto campione mediante un elettrodo amperometrico selettivo per l'ossigeno. E' descritto anche un biosensore utilizzabile per l'esecuzione del suddetto metodo.
Description
DESCRIZIONE
Nel suo aspetto più generale, la presente invenzione riguarda la rilevazione e la determinazione di acido lattico in materiali organici di interesse alimentare.
In particolare, la presente invenzione si riferisce ad un metodo enzimatico per la determinazione simultanea di acido L(+) lattico e acido D(-) lattico in materiali organici, di interesse industriale nel campo agroalimentare.
L’invenzione riguarda inoltre un biosensore utilizzabile per l'effettuazione del suddetto metodo.
E’ noto che molti materiali organici di interesse alimentare subiscono processi di degradazione, per lo più causati da microorganismi di varia natura, non necessariamente patogeni, presenti nell'ambiente.
Tali processi di degradazione possono dar luogo alla formazione di acido lattico in forma otticamente attiva.
In particolare, quando la degradazione è operata da microoganismi ed alghe si forma generalmente acido D(-) lattico; esistono tuttavia microorganismi, quali ad esempio i lattobacilli, che danno luogo alla formazione di entrambi gli enantiomeri dell’acido lattico in miscela racemica.
Il livello di acido lattico presente in sostanze alimentari può pertanto essere considerato un indice della freschezza e della qualità di tali sostanze.
In particolare, l’enantiomero D(-) dell’acido lattico costituisce un indicatore del diminuito grado di freschezza di prodotti a base di carne confezionati sotto vuoto o insaccati, mentre la sua miscela racemica rappresenta un indice di contaminazione batterica di alimenti di origine vegetale, quali ad esempio succhi e polpa di pomodoro o di altri tipi di verdura o di frutta.
Quando la concentrazione dell’acido lattico all'interno di tali alimenti raggiunge valori dell’ordine di 300 mg/Kg, la contaminazione batterica ha già raggiunto livelli tali da provocare alterazioni delle caratteristiche organolettiche degli alimenti.
Per la determinazione della concentrazione dell’acido lattico all’interno di matrici alimentari sono a disposizione varie metodiche analitiche chimico-strumentali classiche, che consentono di effettuare rilevazioni molto accurate e sono caratterizzate da un’elevata sensibilità, ma presentano l’inconveniente di richiedere apparecchiature di costo molto elevato e di dover essere eseguite da personale altamente specializzato. Inoltre, il loro impiego è necessariamente confinato nell’ambito di laboratori chimici e difficilmente proponibile sul luogo di campionamento. Tutto ciò conduce a costi di gestione molto elevati e parallelamente l’esecuzione di tali controlli risulta necessariamente limitata ad un esiguo numero di campioni.
Infine, i tempi necessari per l’effettuazione di un’analisi mediante le metodiche di cui sopra sono piuttosto lunghi, generalmente dell’ordine di alcune ore, in quanto sono necessarie laboriose operazioni di preparazione e pretrattamento dei campioni.
Più di recente sono stati sviluppati diversi metodi analitici basati sull’impiego di enzimi.
Tali metodi sono generalmente basati su sistemi monoenzimatici; in alcuni di essi vengono impiegati enzimi che catalizzano l’ossidazione dell’acido L(+) lattico (vedi ad esempio Mascini, M e coll. (1987) "Lactic acid and pyruvate electrochemical biosensors for whole blood in ex vivo experiraents with an endocrine artificial pancreas", Clin. Chem., 33, 591-593, e Mizutani, F. e coll. (1985) "An Enzyme Electrode for L-lactic acid with a Cheraically Amplified Response", Anal. Chim. Acta, 177, 153-166), mentre altri sono basati sulla determinazione della concentrazione del NADH che si accompagna alla formazione di acido piruvico conseguente all’ossidazione dell’acido lattico (vedi ad esempio Durliat, H., Comtat, M. (1980), "Adsorption of L(+) Lactic acid Dehydrogenase from Aerobic Yeast on a Platinum Electrode", J. Electroanal.Chem.Interfacial.Electrochem., 89, 221-229; Durliat, H. e coll. (1990) "Bienzyme Amperometric Lactic Acid -Specific Electrode", Anal.Chim.Acta, 231, 309-311; Gorton, L., Hedlund, A, (1988), "A flow-injection method for thè amperometric determination of L-lactic acid with immobilized-enzymes and a chemically modified electrode", Anal.Chim.Acta, 213, 91-100).
Questi ultimi metodi consentono la determinazione di entrambi gli enantiomeri dell’acido lattico e prevedono l’utilizzo di D(-) e L(+) lattato deidrogenasi, che, in presenza del coenzima NAD, determina l’ossidazione del lattato a piruvato con contemporanea riduzione del NAD a NADH. E’ dalla concentrazione di quest’ultima molecola che si desume la concentrazione di acido lattico all’interno della matrice alimentare.
Il NADH viene a sua volta determinato mediante la sua ossidazione diretta su una superficie elettrodica solida, generalmente di platino o di grafite (vedi Moiroux, J., Elving P.J. (1979) "Optimization of thè analytical oxidation of dihydronicotinamide Adenine Dinucleotide at carbon and platinum electrodes" Anal.Chem., 51, 346-350).
Tuttavia questo metodo presenta alcuni inconvenienti dovuti all’elevata differenza di potenziale di scarica (-1-800 mV) che esso comporta; in tali condizioni è possibile incorrere nella scarica all’elettrodo di sostanze estranee, che possono interferire nella misura.
In alternativa, è stato proposto di determinare il NADH sottoponendolo a reazione con esacianof errato (III) in presenza dell’enzima diaforasi, in modo da ottenere esacianoferrato (II), la cui concentrazione viene determinata amperometricamente mediante la sua scarica su un elettrodo di platino ad un potenziale di 400 mV rispetto ad un opportuno elettrodo di riferimento, generalmente Ag/AgCl (Montagné, M., Durliat, H., Comtat, M. (1993) "Simultaneous use of dehydrogenases and hexacyanoferrate(III) ion in electrochemical biosensors for L-lactic acid, D-lactic acid and L-glutamate ions", Anal.Chim.Acta, 278, 25-33).
Anche quest'ultimo metodo non risulta del tutto soddisfacente a causa della sua complessità e laboriosità.
Il problema che sta alla base della presente invenzione è quello di mettere a disposizione un metodo per la determinazione di entrambi gli enantiomeri dell’acido lattico contenuto in materiali organici di interesse alimentare che ovvi agli inconvenienti dei metodi della tecnica nota basati sulla determinazione separata dei due enantiomeri, che risulti di agevole esecuzione anche da parte di personale non particolarmente specializzato e che possa essere idoneo anche ad un impiego "sul campo", cioè sul luogo in cui si trovano i materiali organici da analizzare.
Un tale problema è stato risolto da un metodo che comprende le fasi di:
- far reagire in un mezzo acquoso tamponato un campione di materiale organico di interesse alimentare, o una soluzione ottenuta per estrazione con solvente di detto materiale, con un sistema enzimatico costituito da L(+) lattato ossidasi (LOD), D(— ) lattato deidrogenasi (D-LDH) e perossidasi da barbaforte (HPO), in presenza di NAD e Mn<ft>,
misurare la concentrazione dell'ossigeno eventualmente sviluppatosi in conseguenza dell’ossidazione dell’acido lattico contenuto in detto campione o in detta soluzione, per mezzo di un elettrodo amperometrico per esso
Preferibilmente gli enzimi LOD, D-LDH e HPO sono immobilizzati su almeno un idoneo supporto.
Convenientemente, tali enzimi possono essere immobilizzati su un unico supporto costituito da una membrana.
Secondo una modalità di realizzazione preferita del metodo secondo l’invenzione, l’elettrodo amperometrico utilizzato per la misurazione è separato dal mezzo acquoso tamponato mediante una prima membrana permeabile ai gas a diretto contatto dell'elettrodo stesso, alla quale è sovrapposta esternamente una seconda membrana recante i suddetti enzimi immobilizzati.
Convenientemente, la suddetta prima membrana è in teflon. Su detta seconda membrana è preferibilmente sovrapposta esternamente un’ulteriore membrana, costituita da una membrana da dialisi.
La suddetta seconda membrana è preferibilmente costituita da una membrana in nylon 6,6 recante gruppi carbossilici sulla superficie.
I solventi utilizzabili per l’estrazione dell’acido lattico dai materiali organici di interesse alimentare comprendono acqua e solventi polari miscibili con l’acqua.
II pH del mezzo acquoso tamponato è compreso preferibilmente fra 8,0 e 8,5.
La concentrazione del NAD è preferibilmente da 1 a 2 mM e quella del Mn<fl >da 1 a 2 mM.
I suddetti elettrodi amperometrici accoppiati a membrane recanti sistemi enzimatici appartengono alla classe dei "biosensori". Il metodo secondo l’invenzione sarà ora esposto in maggior dettaglio, facendo riferimento alle figure allegate, in cui:
la figura 1 illustra schematicamente l’elettrodo amperometrico del biosensore elettrochimico;
la figura 2 illustra schematicamente il biosensore elettrochimico;
la figura 3 mostra schematicamente un’apparecchiatura per l’effettuazione del metodo dell’invenzione;
la figura 4 illustra schematicamente una variante dell’apparecchiatura per l’effettuazione del metodo secondo l’invenzione.
Con riferimento alla figura 1, un elettrodo amperometrico per l’esecuzione del metodo secondo l’invenzione comprende un sensore 1 per ossigeno di tipo commerciale, costituito, ad esempio, da un elettrodo filiforme di platino 2 rivestito da uno strato 2a di una resina epossidica, che lo separa ed isola da un elettrodo 3 di riferimento (Ag/AgCl) disposto coassialmente attorno ad esso. Gli elettrodi 2 e 3 sono fissati all’interno di un contenitore cilindrico 4 riempito con una soluzione elettrolitica o con un gel elettrolitico e con interposizione di un appropriato rivestimento 3a. Un’estremità dell’elettrodo di platino 2 risulta però scoperta, in modo tale che possa fungere da elettrodo indicatore per l’ossigeno presente nel mezzo tamponato acquoso. Tale elettrodo 2 è mantenuto ad un potenziale di circa -650 mV rispetto all’elettrodo di riferimento 3.
In corrispondenza dell’estremità scoperta dell’elettrodo di platino 2, sul contenitore cilindrico 4 viene avvitato un cappuccio 5 anch’esso cilindrico. La superficie di base di detto cappuccio cilindrico 5 è costituita da una membrana 6, generalmente in teflon, permeabile ai gas.
Con riferimento alla figura 2, sulla membrana 6 di un biosensore B secondo l’invenzione sono stratificate, nell’ordine, una membrana 7 su cui sono immobilizzate L ( ) lattato ossidasi (LOD), D(-) lattato deidrogenasi (D-LDH) e perossidasi da barbaforte (HPO), ed una membrana da dialisi 8. Le membrane 7 e 8 sono mantenute stabilmemte in posizione mediante un anello elastico 9.
Con riferimento alla figura 3, il suddetto biosensore B è inserito in una cella 10 mantenuta a temperatura costante da un termostato 11 e contenente una soluzione acquosa tamponata a pH compreso fra 8,0 e 8,5, nella quale è parzialmente immerso il biosensore B; quest’ultimo è collegato ad un misuratore amperometrico 12, avente un’uscita collegata ad un registratore grafico 13 o ad un qualsiasi altro sistema di acquisizione di dati.
Opportunamente, la cella 10 è collocata su un agitatore magnetico 14 e munita di relativa ancoretta magnetica 15.
Il metodo secondo l’invenzione sarà ulteriormente descritto facendo riferimento ad un esempio fornito qui di seguito a titolo puramente illustrativo e non limitativo.
ESEMPIO
Un campione di succo di pomodoro venne saggiato riguardo al contenuto di acido lattico secondo il metodo dell’invenzione utilizzando l’apparecchiatura schematizzata in figura 3.
La membrana 7 del biosensore contenente LOD, D-LDH e HPO immobilizzate era stata preparata nella maniera seguente.
0,25 mg di lattato ossidasi (20 U/mg di solido da Pedicoccus sp.). 0,5 mg di D(-) lattato deidrogenasi (10 U/mg di solido da Staphylococcus epidermidis) e 0,25 mg di perossidasi da barbaforte (300 U/mg di solido da Armoracia rusticana) vennero stratificati uniformemente, sciolti in 20 μΐ di soluzione di poliazetidina prepolimero (P.A.P.) al 12% in acqua/su una membrana in nylon 6,6 Biodyne Transfer del diametro di 8 mm, con porosità di 0,2 mm e funzionalizzata con gruppi carbossilici.
Trascorse 24 ore a 4‘C, la membrana fu lavata con tampone fosfato 0,1 M a pH = 7,00 e successivamente conservata a secco alla temperatura di 4 *C. ;Il biosensore multienzimatioo per la determinazione dell’acido lattico fu quindi preparato sovrapponendo alla membrana in teflon 6 del sensore per l’ossigeno, nell’ordine, la membrana 7 preparata come sopra descritto ed una membrana da dialisi 8, fissando poi le suddette membrane al sensore mediante un anello elastico 9. ;Il biosensore così preparato fu immerso nella cella termostatata 10 a 37 *C più sopra descritta, contenente 4,5 mi di tampone costituito da glieina 0,1 M, pH 8,0 e 0,5 mi di NAD Mntf 2,0 mM, e collegato al misuratore amperometrico 12.
Un campione di 0,1 mi di succo di pomodoro filtrato su carta da filtro venne aggiunto alla soluzione tamponata contenuta nella cella termostatata 10 e mantenuta in agitazione mediante l’agitatore magnetico 14.
La variazione dell’intensità di corrente verificatasi in seguito all’aggiunta del campione da saggiare risultava proporzionale alla concentrazione dell’ossigeno, a sua volta proporzionale al contenuto di acido D(-) e L(+) lattico del campione.
Tale contenuto poteva essere quantificato in relazione ad una curva di taratura ottenuta in precedenza a partire da soluzioni standard di acido lattico contenenti 90 o 180 ppm di acido lattico.
Nel caso in esame venne rilevata una quantità di acido lattico totale (forme enantiomeriche D(-) e L(+)) pari a 58.5 ppm (media dei risultati di dieci determinazioni).
Un’aliquota dello stesso campione di succo di pomodoro fu sottoposta ad analisi mediante il metodo enzimaticospettrofotometrico basato sul Boehringer-Mannheim Enzymatic Kit, Cat. N. 1112821, per determinarne il contenuto in acido lattico totale (D(-) L(+) ).
Dai risultati di tali analisi emerse che il contenuto in acido lattico era pari a 59,4 ppm.
Ciò conferma l’affidabilità del metodo secondo la presente invenzione.
La procedura sopra descritta fu ripetuta su altri 9 campioni di succo di pomodoro di diverse provenienze, ottenendo i risultati riassunti nella seguente Tabella I (valori espressi in ppm), che comprende anche i risultati forniti dalle analisi condotte sugli <' >stessi campioni mediante il metodo enzimatico-spettrofotometrico sopra citato.
TABELLA I
Le principali proprietà del biosensore utilizzato nel metodo sopra descritto sono riassunte nella seguente Tabella II.
TABELLA Π
Con riferimento alla figura 4, un’apparecchiatura alternativa per l’effettuazione del metodo secondo l'invenzione comprende un biosensore B, identico a quello più sopra descritto, inserito in una cella a flusso 16, nella quale viene alimentato il fluido da analizzare. La suddetta cella a flusso 16 è mantenuta a temperatura costante dal termostato 17 ed è in contatto di fluido con una pompa peristaltica 18 collegata ad uno scarico 19 per il fluido che ha subito la misurazione. L’elettrodo del biosensore B è collegato ad un misuratore amperometrico 20, la cui uscita è collegata con un registratore grafico 21.
Secondo una modalità alternativa di realizzazione dell’invenzione, il metodo può essere condotto utilizzando l’apparecchiatura più sopra illustrata con riferimento alla figura 4.
Secondo tale modalità, il campione da analizzare o l’estratto
acquoso concentrato ottenuto a partire da esso viene alimentato nella cella a flusso 16, mantenuta a temperatura costante mediante il termostato 17, nella quale si trova il biosensore B contenente LOD, D-LDH e HPO immobilizzate. In seguito alle reazioni catalizzate dai suddetti enzimi si determina produzione di ossigeno, il quale viene rilevato dal biosensore B, con produzione di un segnale elettrico, che viene inviato al misuratore amperometrico 20 e registrato mediante il registratore grafico 21.
Il fluido in uscita dalla cella a flusso 16 viene scaricato, mediante la pompa peristaltica 18, attraverso l’apertura di scarico 19.
L’utilizzo della modalità di attuazione dell’invenzione sopra descritta consente di automatizzare la metodica analitica, con conseguente riduzione dei tempi di analisi e semplificazione della procedura, conservando nel contempo una più che buona riproducibilità, come dimostrato dai dati sperimentali riportati nella seguente Tabella III, che rappresentano ciascuno la media di almeno dieci determinazioni eseguite su campioni di succo di pomodoro.
TABELLA IΙ
Le principali proprietà del biosensore secondo l’invenzione utilizzato nel metodo secondo la modalità di realizzazione alternativa sopra descritta sono riassunte nella seguente Tabella IV.
TABELLA IV
La perfetta riproducibilità del metodo e la sua notevole accuratezza, sensibilità e semplicità di esecuzione lo rendono idoneo alle più svariate applicazioni in campo alimentare (pomodoro, succhi di frutta, insaccati, carni in scatola ecc.)
Si ricorda infine che il metodo secondo l’invenzione può essere agevolmente eseguito anche fuori da un laboratorio chimico ed anche da personale non particolarmente specializzato, con costi globali decisamente contenuti.
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione simultanea di acido D(-) e L(+) lattico in materiali organici di interesse alimentare comprendente le fasi di: - far reagire in un mezzo acquoso tamponato un campione di detti materiali, o una soluzione ottenuta per estrazione con solvente dei suddetti materiali, con un sistema enzimatico costituito da L(+) lattato ossidasi (LOD), D(-) lattato deidrogenasi (D-LDH) e perossidasi da barbaforte (HPO), in presenza di NAD e Mn<f>\ misurare la concentrazione dell’ossigeno eventualmente sviluppatosi in conseguenza dell’ossidazione dell’acido lattico contenuto in detto campione o in detta soluzione, per mezzo di un elettrodo amperometrico per esso selettivo.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detti enzimi LOD, D-LDH e HPO sono immobilizzati su almeno un idoneo supporto.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detti enzimi sono immobilizzati su un unico supporto costituito da una membrana.
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che l’elettrodo amperometrico utilizzato per la misurazione è separato dal mezzo acquoso tamponato mediante una prima membrana permeabile ai gas a diretto contatto dell’elettrodo stesso, alla quale è sovrapposta esternamente una seconda membrana recante i suddetti enzimi immobilizzati.
- 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che su detta seconda membrana è sovrapposta esternamente un’ulteriore membrana, costituita da una membrana da dialisi.
- 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che detta seconda membrana è costituita da una membrana in nylon 6,6 recante gruppi carbossilici sulla superficie
- 7. Metodo secondo una qualunque delle precedenti rivendicazioni, caratterizzato dal fatto che detto elettrodo amperometrico è costituito da un elettrodo (2) filiforme di platino rivestito da uno strato (2a) di una resina epossidica, che lo separa ed isola da un elettrodo (3) di riferimento (Ag/AgCl) disposto coassialmente attorno ad esso, essendo i due elettrodi (2) e (3) fissati all’interno di un contenitore cilindrico (4) riempito con una soluzione elettrolitica o un gel elettrolitico con interposizione di un appropriato rivestimento (3a), e dal fatto che detto elettrodo (2) di platino funge da elettrodo indicatore per detto ossigeno.
- 8. Metodo secondo la rivendicazione 7 caratterizzato dal fatto che detto elettrodo (2) di platino è mantenuto ad un potenziale di circa -650 mV rispetto a detto elettrodo (3) di riferimento.
- 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, caratterizzato dal fatto che detto elettrodo amperometrico è separato dal mezzo acquoso tamponato mediante una prima membrana in teflon, a cui sono sovrapposte esternamente una seconda membrana costituita da detta membrana in nylon 6,6 recante LOD, D-LDH e HPO immobilizzate ed una terza membrana costituita da una membrana da dialisi.
- 10. Biosensore (B) per la determinazione simultanea di acido D(-) e L{+) lattico in materiali organici di interesse alimentare comprendente un sensore (1) per ossigeno, includente una membrana (6) in teflon permeabile all’ossigeno, caratterizzato dal fatto che su detta membrana (6) sono stratificate una prima membrana (7) su cui sono immobilizzate L(+) lattato ossidasi (LOD), D(-) lattato deidrogenasi (D-LDH) e perossidasi da barbaforte (HPO) ed una membrana da dialisi (8), essendo dette membrane mantenute stabilmemte in posizione mediante un anello elastico (9).
- 11. Biosensore (B) secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che detta membrana (7) è in nylon 6,6.
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