Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft die Alzheimererkrankung, insbesondere einen
monoklonalen Antikörper, der spezifisch ist für das βA4-Peptid, das vom
Amyloidvorläuferprotein abstammt, Zellen, die solche Antikörper herstellen,
Verfahren zur Erzeugung solcher monoklonaler Antikörper und Verfahren zur
Verwendung solcher Antikörper in der Diagnostik und Therapie.
Hintergrund
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Die Alzheimererkrankung (AD) ist eine irreversible, fortschreitende
neurodegenerative Störung des Gehirns. Im Verlauf mehrerer Jahre führt das
Fortschreiten der AD zu Gedächtnisverlust, Demenz und schliesslich zum Tod.
Zur Zeit ist sie die vierthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten und
ist der Grund für ungefähr 100000 Todesfälle pro Jahr. Üblicherweise betrifft
die AD in erster Linie die Älteren und es wird darum vor dem Hintergrund des
Alterns der heutigen Gesellschaft damit gerechnet, dass die AD in der nahen
Zukunft ein zunehmendes Gesundheitsproblem darstellen wird. Kurz nach dem
Ausbruch der Krankheit müssen die Patienten rund um die Uhr betreut werden.
Dies stellt ein enormes psychologisches und auch finanzielles Problem für
unsere Gesellschaft dar. Zur Zeit gibt es keine bewährten Mittel für die
Diagnose, die Prävention, die Behandlung oder die Heilung der AD.
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Neuropathologisch ist die AD durch einen starken Verlust von Neuronen in
gewissen Hirnbereichen und durch die Ablagerung von proteinhaltigem Material
in den Gehirnen von AD-Patienten gekennzeichnet. Diese Ablagerungen sind
die intrazellulären neurofibrillären Knäuel und die extrazellulären β-
Amyloidplaques. Die Hauptproteinkomponente der β-Amyloidpiaques stellt das
βA4-Peptid dar. Sequenzanalyse und Massenspektrometrie des gereinigten β-
Amyloidplaquematerials zeigte, dass die maximale Länge des βA4-Peptids 43
Aminosäuren beträgt. Üblicherweise können Peptidspezies jedoch auch an der
Position 40 oder der Position 42 enden (Miller et al., 1993, Arch. Biochem.
Biophys. 301 : 41-52). Ebenso wird am N-Terminus eine gewisse
Uneinheitlichkeit beobachtet, die zu verschiedenen Peptidformen führt, die
hauptsächlich an den Positionen 1,4 oder 11 beginnen (Miller et al., 1993).
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Molekulares Klonieren zeigte, dass das βA4-Peptid von einem viel längeren
Vorläuferprotein abstammt, das "Amyloidvorläuferprotein" (APP) genannt wird
(Kang et al., 1987, Nature 325: 733-766) (Fig. 1). Fig. 1 veranschaulicht das
Amyloidvorläuferprotein (APP), das ein Transmembran (TM = Membranbereich)
-protein ist, wobei sich der N-Terminus extrazellulär und sich der C-Terminus
intrazellulär (cytoplasmatisch) befindet. βA4 ist teilweise in der Membran
eingebettet. Mehrere alternativ gespleisste Isoformen wurden beschrieben, die
ausgedehnte posttranslationale Modifikationen durchlaufen (Selkoe, 1994,
Ann. Rev. Neurosci. 17: 489-517). Die βA4-Sequenz selbst befindet sich
teilweise auf der extrazellulären Seite und erstreckt sich teilweise in den
Transmembranbereich (Fig. 2). Fig. 2 (SEQ ID NO: 3) veranschaulicht die
βA4-Sequenz (eingekreister Bereich), deren C-terminales Ende sich in die
Transmembranregion (Tm, durch Rechteck markierter Bereich) erstreckt und
deren N-terminales Ende sich im extrazellulären Teil befindet. Sterne weisen
auf die Positionen der familiären Mutationen im APP-Gen hin, die entweder an
die βA4-Sequenz angrenzen oder im mittleren Bereich der βA4-Sequenz
vorliegen. Die drei Hauptschnittstellen (α, β und γ) in APP sind angegeben. Es
wurde darum vorgeschlagen, dass die Freisetzung von βA4 durch die
proteolytische Wirkung von einer oder mehreren Proteasen am N-Terminus (β-
Schnittstelle) und am C-Terminus (γ-Schnittstelle) des Peptids erfolgt. Das
Hauptereignis während der Sekretion des APP ereignet sich an der α-
Schnittstelle (Position 16/17 von βA4 "1-42"). Dieses sekretierte APP-Molekül
(αAPPs) enthält an seinem Carboxyende die ersten 16 Aminosäuren der βA4-
Sequenz. Die verbleibenden zellassoziierten APP-Fragmente (sogenannte
Cterminale Fragmente (CTFs)) enthalten den C-terminale Teil der βA4-Sequenz
und erstrecken sich in Richtung des cytoplasmatischen Bereiches des APP.
Darum führt diese proteolytische Spaltung zu Fragmenten, die nicht auf eine
solche Art und Weise prozessiert werden können, welche direkt oder indirekt
zu Amyloidfragmenten führt (nicht-amyloides Prozessieren) (Selkoe, 1994).
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Vor kurzem wurde gezeigt, dass Zelllinien, die grosse Mengen von APP durch
ein stabil transfektiertes APP-cDNA-Konstrukt exprimieren, hohe picomolare bis
niedrige nanomolare Mengen von βA4 produzieren und dieses schnell ins
Medium abgeben (Shoji et al., 1992, Science 258: 126-129). Es wurde
ebenfalls gefunden, dass praktisch jede primäre Zellkultur und Zelllinie βA4
konstitutiv abgeben (Busciglio et al., 1993, PNAS USA 90: 2092-2096).
Zusätzlich wurde gezeigt, dass sowohl gesunde Kontrollpersonen als auch
Alzheimer-Patienten niedrige nanomolare Mengen von βA4 im Serum und CSF
aufweisen (Seubert et al., 1992, Nature 359: 325-327). Der Hauptanteil der
nachgewiesenen löslichen βA4-Spezies in diesen Körperflüssigkeiten und
konditionierten Medien war βA4 "1-40", was nicht wirklich mit der
Gesamtzusammensetzung, die man in β-Amyloidplaqueablagerungen findet,
übereinstimmt. Die Feststellung, dass die Herstellung und anschliessende
Abgabe von βA4 ausreichend ist und darum verantwortlich für die Entstehung
von β-Amyloidplaques in den Gehirnen von AD-Patienten ist, konnte deshalb
nicht länger aufrechterhalten werden; andere Faktoren müssen zu den
Ablagerungen der β-Amyloidplaques beitragen. Eine einleuchtende Hypothese
ist es, dass die akute oder chronische Überproduktion von βA4 den erhöhten
Amyloidgehalt, der bei der AD beobachtet wird, verursacht.
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Die Feststellung, dass spezifische Punktmutationen in und um den βA4-Bereich
des APP-Gens mit gewissen familiären Alzheimererkrankungs (FAD) -fällen
gekoppelt sind, zeigte eindeutig, dass das APP-Gen ein "Krankheitsgen" ist
(Goate et al., 1991, Nature 349: 704-706; Murrell et al., 1991, Science
254: 97-99; Levy et al., 1990, Science 248: 1124-1126; Carter et al., 1992,
Nature Genetics 2: 255-256). In Familien, bei denen die AD mit einem
bestimmten Alter des Ausbruchs dominant vererbt wird, sind Punktmutationen
im APP-Gen nötig und ausreichend, um die AD zu verursachen. Obwohl die
allergrösste Mehrheit der Fälle von Alzheimererkrankungen sporadisch und
wahrscheinlich multifaktoriell auftreten, kann man von diesen familiären APP-
Mutationen viel über die Amylogenese, d. h. die Erzeugung der kleinen βA4-
Peptide aus dem grösseren Vorläufer und deren Ablagerung in β-
Amyloidplaques, lernen.
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Die Doppelpunktmutation des APP-Codons 670/671 (die "Schwedische
Variante", am N-Terminus des βA4 im APP) verursacht eine 5- bis 8-fach
höhere Freisetzung von βA4 in Zellkulturen, die stabil mit dieser mutierten APP-
cDNA transfektiert wurden (Fig. 2) (Citron et al., 1992; Cai et al., 1993). Es
ist durchaus denkbar, dass diese Doppelpunktmutation aufgrund erhöhter.
Proteolyse an der β-Schnittstelle zu einem erhöhten Umsatz von APP führt,
was wiederum zu einem höheren Anteil von freigesetztem βA4 führt. Erhöhte
Mengen an βA4-Monomeren, wie durch Transfektionsuntersuchungen mit der
"Schwedischen Mutation" gezeigt, können die schnelleren Kinetiken der βA4-
Aggregation zu β-Amyloidplaques in diesen Familien erklären.
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Eine andere FAD-Mutation befindet sich C-terminal von βA4 an der Position
717 ("London Variante") und beeinflusst den Anteil von freigesetztem βA4 in
Gewebekulturen nicht (Fig. 2). Es wurde kürzlich gezeigt, dass diese 717-
Mutation das "1-40/1-42"-βA4-Verhältnis verändert (Suzuki et al., 1994,
Science 264: 1336-1340). Obwohl es zur Zeit nicht klar ist, wie die Bildung
des C-Terminus von βA4 abläuft, da dieser Teil im Transmembranbereich
eingebettet ist, liegt es nahe anzunehmen, dass die "London Mutation" die
proteolytische Spaltung von APP zu βA4 beeinflusst. Möglicherweise
interferiert diese Punktmutation mit der Spaltungsgenauigkeit der
verantwortlichen Protease an der γ-Schnittstelle. βA4 1-40 weist unter
anderem im Vergleich zu βA4 1-42 einen einschneidenden Unterschied
bezüglich seiner Löslichkeit in wässrigen Lösungen auf (Burdick et al., 1992,
JBC 267: 546-554). Letzteres ist praktisch unlöslich in Wasser, während βA4
1-40 in vitro bis mehrere mg/ml wasserlöslich ist. Geringe Mengen der längeren
βA4 1-42-Form können die Präzipitation von βA4 1-40 in vitro extrem steigern.
Ein etwas höherer Anteil der längeren βA4 1-42-Spezies würde den frühen
Beginn der Ablagerung von βA4 zu β-Amyloidplaques in Patienten mit dieser
"London Mutation" erklären. Das Verhältnis der βA4 1-42-Spezies zu der
kürzeren, besser löslichen βA4 1-40-Spezies kann auch einer der kritischen
Faktoren bei den sporadischen AD-Fällen (d. h. Fälle, bei denen keine genetische
Prädisposition festgestellt wurde) sein. Monoklonale Antikörper, die spezifisch
an die 1-42-Spezies binden, sind deshalb nützlich, um die Produktion und das
Vorhandensein von βA4-Spezies, die an der Aminosäureposition 42 enden, zu
untersuchen und können als diagnostischer Indikator von anomalen Spezies,
die bei der AD vorkommen, verwendet werden.
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Kürzliche biochemische Analysen mit einem Antikörper, der βA4, das an
Position 40 endet, erkennt und einem Antikörper, der eine βA4-Spezies, die
sich bis Position 42 oder weiter erstreckt, erkennt, zeigten, dass die
Beteiligung der längeren βA4-Spezies für den Ausbruch der Krankheit kritisch
sein kann (Suzuki et al., 1994). Allerdings unterscheidet der monoklonale
Antikörper von Suzuki nicht zwischen βA4 1-42, 1-43 und längeren βA4-
Spezies. Dies ist auch der Fall für einen anderen beschriebenen monoklonalen
Antikörper 2G9 (Yang et al., 1994, Neuro Report 5: 2117-2120). Darum
wären, um diese Kreuzreaktivität zu vermeiden, Antikörper, die spezifisch sind
für βA4-Spezies, die an der Position 42 enden, zum Ausschluss der anderen
Formen sehr nützlich, um die Kreuzreaktivität mit membranassoziierten C-
terminalen APP-Fragmenten, die typische zelluläre Produkte darstellen, welche
nicht notwendigerweise mit den β-Amyloidplaques assoziiert sind, zu
vermeiden.
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Ein monoklonaler Antikörper, der βA4 1-42 erkennt, wurde beschrieben
(Murphy et al., 1994, Am. J. Path. 144: 1082-1088). Die βA4 1-43-
Peptidspezies wurde in diesen Untersuchungen jedoch nicht verwendet und
folglich ist es nicht bekannt, was die genaue Spezifität dieses monoklonalen
Antikörpers gegenüber dem 1-43-Peptid ist. Mit diesem Antikörper wurden nur
Kompetitionsstudien mit den βA4-Peptiden, die an der Position 40 ("1-40") und
Position 44 ("1-44") und dahinter enden, dürchgeführt. Es ist wichtig, dass
über den Antikörper berichtet wurde, dass er diffuses Amyloid, fibrilläres
Amyloid, intraneuronale und extraneuronale neurofibrilläre Knäuel, jedoch nicht
vaskuläres Amyloid anfärben kann.
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Ein biochemischer, diagnostischer in vitro Test für die Alzheimererkrankung in
ihren frühen Phasen, wie auch die Mittel, um Risiko-AD-Personen zu Screenen,
ist nicht verfügbar. Die gegenwärtige Diagnose der AD benötigt eine detaillierte
klinische Prüfung, die keine klaren Antworten geben kann, bis sich wesentliche
Symptome der Demenz und des Gedächtnisverlust manifestieren. Vor dem
Hintergrund der Forschung, auf die im Obigen Bezug genommen wurde, stellt
βA4 1-42 einen präklinischen Marker für die AD dar. Somit stellt die
Identifikation der Konzentration oder der Bildung von βA4 1-42 oder anderer
mit dem Rest 42 endender Spezies und wie diese im Verlauf der Krankheit
fortschreiten könnten und wie diese sich im Gehirn verteilen wertvolle
Erkenntnisse zur Überwachung des Verlaufs der AD, wie auch zur spezifischen
Diagnose und möglichen Behandlung der AD bereit.
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EP-A 0 683 234 offenbart monoklonale Antikörper gegen das β-
Amyloidprotein. Spezifische Kombinationen der darin offenbarten monoklonalen
Antikörper wurden in Sandwich-Immunoassays verwendet, um zwischen β-
Amyloid (1-40) und β-Amyloid (1-42) zu unterscheiden. Dieses Dokument
erörtert das Binden der monoklonalen Antikörper, auf die darin Bezug
genommen wird, an β-Amyloid (1-43) nicht.
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Für die Herstellung von diagnostischen Tests, von Therapeutika und für AD-
Überwachungsassays wäre es hilfreich, einen monoklonalen Antikörper zu
besitzen, der im Gegensatz zu der Spezifität der momentan verfügbaren
Antikörper (kreuzreaktiv mit βA4 1-43; färben vaskuläres Amyloid nicht)
vaskuläres Amyloid anfärbt und spezifisch für das βA4-Peptid, das mit Rest 42
endet, ist und deshalb die diagnostischen Fähigkeiten des Standes der Technik
erweitert, d. h. einer, der den freien C-Terminus von βA4 1-42 erkennt und
diffuses und fibrilläres Amyloid, neurofibrilläre Knäuel und vaskuläres Amyloid
anfärbt. Ein solcher Antikörper ist Gegenstand der vorliegenden Anmeldung.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt einen spezifischen monoklonalen Antikörper
bereit, der spezifisch ist für das βA4-Peptid und insbesondere für den C-
Terminus von βA4 "1-42" und diffuses und fibrilläres Amyloid, neurofibrilläre
Knäuel und vaskuläres Amyloid anfärbt. Insbesondere stellt die vorliegende
Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der spezifisch für alle βA4-
Peptide ist, bei denen der C-Terminus der Rest 42 der βA4-Aminosäuresequenz
ist. Die vorliegende Erfindung umfasst insbesondere den monoklonalen
Antikörper, der als "MAb 369.2B" bekannt ist und durch die Zelllinie "369.2B"
erzeugt wird, welche in Übereinstimmung mit dem Vertrag von Budapest am
26. Januar 1995 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt
wurde und welcher die Zugangsnummer HB 11829 zugewiesen wurde. Die
vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung des monoklonalen Antikörpers
der vorliegenden Erfindung in in vitro diagnostischen Anwendungen und
Reinigungsanwendungen.
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Somit umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen
monoklonalen Antikörper, der spezifisch für das βA4-Peptid ist, das an der
Position 42 endet, wobei der Antikörper an diffuses Amyloid, fibrilläres
Amyloid, vaskuläres Amyloid und neurofibrilläre Knäuel bindet, welcher ein
monoklonaler Antikörper ist, der durch 369.2B gekennzeichnet ist und durch
die Zelllinie erzeugt wird, die bei der American Type Culture Collection (ATCC)
unter der Zugangsnummer HB 11829 hinterlegt ist. Eine bevorzugte
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine Zelle, die
durch die ATCC-Zugangsnummer HB 11829 gekennzeichnet ist. Eine weitere
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung eines
immunologisch reaktiven Fragmentes des erfindungsgemässen monoklonalen
Antikörpers, das zur gleichen Bindung wie der erfindungsgemässe monoklonale
Antikörper fähig ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Erzeugung von βA4-
spezifischen Antikörpern, welche den freien C-terminalen Rest 42 erkennen,
bereit. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweis des
Vorhandenseins von βA4-Peptiden, die an der Position 42 enden, in Gewebe
bereit, umfassend das Inkontaktbringen einer Gewebeprobe mit dem
erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper und das Nachweisen des
Vorhandenseins des monoklonalen Antikörpers in einer selektiven Weise. Die
vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur selektiven Reinigung von βA4-
Peptiden, welche an der Position 42 enden, bereit, umfassend das
Inkontaktbringen einer zu reinigenden Probe mit dem erfindungsgemässen
monoklonalen Antikörper, das Abtrennen des βA4-Peptids aus der zu
reinigenden Probe und das Isolieren des βA4-Peptids. In einer weiteren
Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis
eines βA4-Peptids, welches mit der Alzheimererkrankung assoziiert ist, bereit,
umfassend das Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Probe mit einem
erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper und das Nachweisen des
Vorhandenseins des βA4-Peptids.
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Kit zum Nachweisen und Überwachen des
Gehaltes eines βA4-Peptids in Gewebe- oder Fluidproben (z. B. Blut, andere
Körperflüssigkeiten, Gewebesektionen, Biopsiegewebe, etc.) bereit. Das βA4-
Peptid, das nachgewiesen, überwacht, inhibiert oder gereinigt wird, ist ein
βA4-Peptid mit einem freien carboxyterminalen Aminosäurerest, welcher der
Rest Nummer 42 der Aminosäuresequenz des βA4-Peptids ist. Das Kit enthält
den monoklonaler Antikörper 369.2B.
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Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden
anhand der folgenden detaillierteren Beschreibung einiger bevorzugter
Ausführungsformen und der Ansprüche veranschaulicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die Erfindung wird unter Berücksichtigung der folgenden detaillierten
Beschreibung, zusammen mit den Zeichnungen, vollständiger verstanden, in
denen:
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Fig. 1 eine schematische Darstellung ist, welche den βA4-Anteil des Amyloid-
Vorläuferproteins (APP), dessen Lage in Bezug auf die Zellmembran und die α,
β und γ-Schnittstellen, zeigt;
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Fig. 2 den βA4-Anteil des APP, dessen Lage in Bezug auf den
Transmembranbereich einer Zelle und die drei Hauptschnittstellen (α, β und γ)
in APP zeigt;
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Fig. 3 eine schematische Darstellung des Klones pGK003 ist, der verwendet
wurde, um das βA4 1-42 Peptid zu erzeugen;
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Fig. 4A ein 16% Tris/Tricin- SDS-PAGE-Gel von in vitro tranlatiertem radioaktiv
markiertem βA4 aus einem Weizenkeimsystem zeigt;
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Fig. 4B ein 16% Tris/Tricin- SDS-PAGE-Gel von in vitro tranlatiertem radioaktiv
markiertem βA4 aus einem Weizenkeimsystem zeigt, das mit MAb 286.SA
immunopräzipitiert wurde;
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Fig. 5 ein Diagramm ist, das die Immunopräzipitation von in vitro translatiertem
βA4 (IVT βA4) mit 286.8A zeigt;
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Fig. 6 ein Diagramm der Peptide ist, die verwendet wurden, um die
Immunantwort zu erzeugen (Immunogen) und um die Mausseren zu screenen;
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Fig. 7 ein Diagramm ist, das die Immunopräzipitation von in vitro translatiertem
βA4 gegen die Antikörperkonzentration zeigt; -o-286.8A, -Δ-369.2B, - -0369.6;
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Fig. 8 ein Diagramm ist, das die % von verschiedenen βA4-Sequenzen, die
durch MAb 369.2 immunopräzipitiert wurden, zeigt;
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Fig. 9 ein Diagramm ist, welches das Epitop-Mapping des Mab369.2 durch
einen Kompetitionsassay zeigt; wobei - - 35-42(OVA) ist (Ovalbumin
gekoppeltes 35-42 βA4-Peptid), - -1-42 Peptid ist und - -1-40 βA4-Peptid ist;
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Fig. 10 eine Photographie ist, welche das Binden von MAb 369.2B an
vaskuläres Amyloid und andere Plaques mit verschiedenen Morphologien zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die β-Amyloidablagerungen in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten bestehen
hauptsächlich aus βA4-Peptiden, die sowohl eine N-terminale als auch eine
Cterminale Heterogenität aufweisen. Die wichtigsten C-terminalen Spezies, die
durch Peptidsequenzierung von β-Amyloid, das aus obduziertem Hirnmaterial
gereinigt wurde, identifiziert wurden, enden entweder an Position 40 oder 42
des βA4-Peptids, das höchstens 43 Reste lang ist. In vitro Experimente mit
synthetischen βA4-Peptiden, die entweder an Position 40 oder 42 enden,
weisen auf erhebliche physikalisch-chemische Unterschiede hin. Zuvor konnte
die Verteilung dieser zwei βA4-Spezies in Obduktionsgewebe, wie auch deren
Erzeugung in vitro, nicht angegangen werden aufgrund des Fehlens von
spezifischen Antikörpern gegen das Carboxyende, die zwischen Subspezies der
βA4-Peptide unterscheiden können.
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Neuliche Anhaltspunkte legen nahe, dass die Freisetzung von βA4 ein normaler
Vorgang in praktisch jeder Zellkultur ist. Üblicherweise können hoche
picomolare bis niedrige nanomolare Konzentrationen von βA4 im Serum und in
der Cerebrospinalflüssigkeit gemessen werden (Seubert et al., 1993). Diese
Feststellung war überraschend, weil angenommen wurde, dass die Erzeugung
von βA4 ein pathologischer Vorgang ist, da βA4 in riesigen Mengen als β-
Amyloidplaques in den kortikalen Gehirnbereichen und im Hippocampus von
Alzheimer-Patienten abgeschieden wird. Eine detaillierte Sequenzanalyse des
freizusetzenden βA4 aus Zellkulturen zeigte, dass die Hauptspezies an Position
40 endet (Selkoe, 1994). Amyloidplaques, die aus Obduktionsgehirn gereinigt
wurden, zeigen ein etwas unterschiedliches Erscheinungsbild: amyloide
Ablagerungen der Congophilen Amyloiden Angiopathie (CAA) sind βA4-
Aggregate, die Blutgefässe umgeben und sind vorwiegend βA4 1-40, während
im Gegensatz dazu Amyloidplaques-Cores (APC), die im Gehirn parenchym
vorliegen und nicht mit Blutgefässen assoziiert sind, eine N-terminale
Uneinheitlichkeit (üblicherweise beginnend an den Resten 1, 4 und 11)
aufweisen und hauptsächlich entweder bei Position 40 oder 42 enden (Glenner
und Wong, 1984, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 885-890; Masters et
al., 1985, PNAS USA 82: 4245-4249; Miller et at, 1993). Gelegentlich wurden
längere Spezies beschrieben, die bei 43 enden oder sich sogar noch weiter
erstrecken (Miller et al., 1993). Weil die Länge des hydrophoben C-Terminus
für die Fähigkeit des Peptids in vitro selbstzuaggregieren entscheidend ist
(Burdick et al., 1992; Jarrett et aL, 1993, Biochem. 32: 4693-4697), ist es
durchaus möglich, dass die zwei verschiedenen pathologischen Aggregate,
APC und CAA und andere vaskuläre β-Amyloidplaques, mit den
unterschiedlichen Eigenschaften der zwei Spezies 1-40 und 1-42 erklärt
werden können. Dies könnte auch der Fall sein für die sogenannten "diffusen
Plaques" (Selkoe, 1994), die häufig in Gehirnen von älteren Personen gefunden
werden und nicht mit der AD assoziiert sind, von denen man jedoch annimmt,
dass sie Vorläufer von β-Amyloidablagerungen sind. Eine nicht-fibrilläre
Aggregation von βA4 wurde für diese Strukturen vorgeschlagen. Es ist darum
von höchster Bedeutung, die gewebespezifische Erzeugung von diesen
längeren βA4-Spezies (d. h. diejenigen, die an Position 42 enden) und deren
pathologisches Auftreten in Gehirnen von AD-Patienten zu bestimmen. Kürzlich
wurden drei Berichte veröffentlicht, in denen Antikörper beschrieben wurden,
welche die 1-42 und 1-40 Spezies von βA4 unterscheiden (Suzuki et al., 1994;
Murphy et al., 1994; Yang et al., 1994). Anders als der Antikörper 369.2B der
vorliegenden Erfindung, kreuzreagieren die durch Suzuki et al. und Yang et al.
beschriebenen Antikörper in beträchtlichem Masse sowohl mit der 1-43 als
auch mit der 1-42 Spezies des βA4-Peptids. Die Antikörper von Murphy et al.
weisen, wobei sie nicht auf die Bindung mit der 1-43 Spezies des βA4-Peptids
getestet wurden, ein anderes Gewebebindungsmuster auf als der Antikörper
der vorliegenden Erfindung und erkennt folglich ein anderes oder modifiziertes
Epitop als dasjenige, das vom Antikörper der vorliegenden Erfindung erkannt
wird.
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Die Positionen 29 bis 42 des βA4-Peptids liegen vollständig innerhalb des
mutmasslichen Transmembranbereichs des Amyloidvorläuferproteins und sind
von hydrophober Beschaffenheit (Miller et al., 1993). Synthetische Peptide der
C-terminalen Sequenzen in diesem Bereich müssen die Fähigkeit der 34-42
Sequenz, eine ungewöhnlich stabile β-Struktur auszubilden, die in Wasser und
starken Denaturierungsmitteln praktisch unlöslich ist, überwinden (Halverson
et al., 1990, Biochem. 29: 2639-2644), wenn diese dazu verwendet werden
sollen, eine starke Immunantwort gegen lösliches βA4 auszulösen. Wir
entwickelten einen hydrophoben Spacer einer Länge von fünf Resten, der diese
Unlöslichkeitsprobleme überwinden sollte und das mutmassliche Epitop auch
von der Nähe des Trägers wegstrecken sollte. Um die Wahrscheinlichkeit einer
Kreuzreaktivität mit den kürzeren, jedoch wichtigsten βA4-Spezies 1-40 zu
verkleinern, haben wir ein minimales Peptidylepitop von 8 Resten, die den
Positionen 35-42 der βA4-Seugenz entsprechen, ausgewählt. Die gesamte
synthetische Sequenz, die in dieser Art und Weise entwickelt wurde, wurde
über eine freie Sulfhydrylgruppe eines N-terminalen Cysteins an KLH (keyhole
limpet hemocyanin) gekoppelt.
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Die erfolgreiche Verwendung von Spacern und hydrophilen Resten bei der
Herstellung von Antipeptid-Antikörpern ist gut beschrieben, wie auch die
Verwendung von hydrophilen Strukturen, um unlösliche Haptene für eine
Konjugation in Lösung zu bringen (McMillan et al., 1983, Cell 35: 859-863;
Makela und Seppala, 1986, in Handbook of Experimental Immunology, Volume
1: Immunochemistry, Wier, D. M., Herausgeber, Blackwell Scientific
Publications, Oxford, S. 3.1-3.13). Der Erfolg dieser Methode bei der
Herstellung von spezifischen Antikörpern ist zumindest teilweise dem
Vorhandensein eines - freien geladenen Carboxyendes zuzuschreiben,
insbesondere im Zusammenhang mit einer hydrophoben Sequenz, da terminale
Reste von Peptidantigenen zu signifikanten Anteilen von Antipeptid-Antikörpern
führen (Gras-Masse et al., 1985, in Synthetic Peptides in Biology and
Medicine, Alitalo, K. et al., Herausgeber, Elsevier, Amsterdam, S. 105). Dies,
zusammen mit der selektiven und neuen Verwendung einer minimalen βA4-
Sequenz, die als Immunogen verwendet wird, erhöhte die Wahrscheinlichkeit
der Herstellung eines Antikörpers, der zwischen βA4-Spezies, die an Position
42 enden und denjenigen, die das nicht tun, unterscheiden kann. Obwohl
Peptidkompetitionsstudien die antigene Determinante nicht genau kartieren
konnten, waren andere βA4-Sequenzen als 1-42 nicht wirksam zur Inhibierung
der Bindung. Die Tatsache, dass 1-42 nicht vollständig mit dem
³&sup5;S-Methioninmarkierten in vitro translatierten βA4 konkurrierte, kann entweder auf die
speziellen Eigenschaften des Moleküls selbst oder auf die Tatsache, dass das
35-42 Peptidimmunogen zusammen mit einem besonderen Spacer und/oder
Träger präsentiert wurde oder dass ein 200-1000facher Überschuss von
unmarkiertem Peptid nicht genug ist, um das Signal zu quenchen,
zurückgeführt werden. Nicht-spezifische Effekte von N-terminalen Resten auf
die antigene Aktivität sind ebenfalls gut beschrieben (Benjamini et al., 1968,
Biochem. 7: 1261-1264).
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Die interessanten Ergebnisse, dass 25-35 tatsächlich die Fähigkeit von 369.2B
und anderen Antikörpern an βA4 zu binden erhöht, kann auf eine besondere
Wechselwirkung zwischen dem verkürzten Peptid und der vollständigen βA4-
Sequenz selbst zurückzuführen sein. Es wird angenommen, dass die Reste 26-
33 in wässriger Lösung als Zufallsknäuel vorkommen (Halverson et al., 1990)
und mit dem löslichen βA4 auf eine solche Art und Weise wechselwirken
können, die den C-Terminus zugänglicher für die Bindungsstellen der Antikörper
macht.
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Der hochspezifische Antikörper der vorliegenden Erfindung 369.2B wurde
gegen ein synthetisches βA4-Peptid gerichtet, das die Reste 35-42 besitzt und
erkennt die kürzere βA4-Spezies 1-40 in Lösung oder auf einer festen Phase
nicht. Desweiteren konnten sowohl 1-40 als auch 1-43. den Antikörper bei
einer immunhistochemischen Anwendung nicht absorbieren. Eine zweite
Screeningmethode mit Mediumdurchsatzvermögen wurde zum Screenen von
Hybridomüberständen, unter Verwendung von radioaktivmarkiertem in vitro
translatiertem βA4, angewendet, so dass die Antikörper, die dem ersten
Screening entnommen wurden, weiter auf ihr Vermögen, lösliches βA4 zu
präzipitieren, selektiert werden konnten. Dieses Verfahren kann leicht an die
anderen Proteine/Antikörper von Interesse angepasst werden. Der resultierende
MAb 369.2B stellt ein vorzügliches Werkzeug dar, um die Rolle der βA4-
Peptide, die an der Position 42 enden, in situ, in Obduktionsgewebe, in
transgenen Tieren und die in vitro Herstellung von βA4-Peptiden in etablierten
zellulären βA4-Herstellungsmodellen zur diagnostischen Anwendung und für
die Therapeutik, zu untersuchen.
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Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung stellt ein wichtiges
Werkzeug dar, das zur Herstellung eines diagnostischen Testkits benötigt wird.
Er ermöglicht es einem, die Menge von βA4 1-42 oder Derivaten davon (z. B.
4-42 Spezies und andere verkürzte Formen mit dem "42" Carboxyende) in
humanen Körperflüssigkeiten (CSF, Serum, Urin, etc.) oder Geweben zu
messen/quantifizieren. Er kann auch dazu verwendet werden, das
Verteilungsmuster der 1-42 oder βA4-Species, die mit Rest 42 enden, in AD-
Gehirnen verglichen mit gesunden Kontrollen zu untersuchen. Seine
aussergewöhnlich hohe Avidität macht ihn zu einem überlegenen und neuen
Werkzeug für solche Testverfahren. Der hierin offenbarte monoklonale
Antikörper kann auch in biologischen Modellsystemen, wie in transfektierten
Zellkulturen oder in Tiermodellen (transgene Maus), verwendet werden, die
entwickelt wurden, um das Vorhandensein und/oder die Erzeugung von βA4-
Spezies, die mit der Aminosäure 42 enden, zu messen und/oder zu
beeinflussen. Diese Modellsysteme stellen Mittel dar, um selektive Modulatoren
der Erzeugung von βA4, die an der Aminosäureposition 42 enden, in
biologischen Systemen nachzuweisen. Der Antikörper der vorliegenden
Erfindung stellt Verfahren zur Verhinderung der Aggregation des βA4-Peptids
bereit, weil die Spezifität des Antikörpers die spezifische Wechselwirkung mit
dem freien C-terminalen Rest ermöglicht, wodurch er die Aggregation, die bei
der AD pathogen sein kann, stört und zerstört.
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Überraschenderweise unterscheidet sich der Antikörper der vorliegenden
Erfindung vom Stand der Technik in der Hinsicht, dass er diffuses und
fibrilläres Amyloid, neurofibrilläre Knäuel und vaskuläre Amyloide färbt,
während er für den C-terminalen Rest 42 des βA4-Peptids spezifisch ist. Dieses
einzigartige Bindungsmuster zeigt, dass der erfindungsgemässe Antikörper ein
anderes Epitop erkennt als dasjenige des Standes der Technik und dass die
Gewebeverteilung oder Zugänglichkeit des βA4-Peptids, das durch den
erfindungsgemässen Antikörper erkannt wird, auch verschieden ist.
Desweiteren stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper
bereit, der das βA4-Peptid aus der Lösung präzipitieren kann, was für die
Antikörper des Standes der Technik nicht gezeigt wurde. Somit stellt die
vorliegende Erfindung einen einzigartigen monoklonalen Antikörper, der eine
einzigartige Untergruppe von βA4-Spezies erkennt, die eine unterschiedliche
Gewebeverteilung aufweist, die sehr wahrscheinlich ein besserer
diagnostischer Indikator ist als derjenige, der früher verfügbar war und ein
einzigartiges Ziel für eine therapeutische Intervention bereit.
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Somit stellt die vorliegende Erfindung den Antikörper 369.2B bereit, der
spezifisch ist für die βA4-Peptidspezies, bei der der C-Terminus mit Rest 42
endet. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines solchen
Antikörpers, von Bindefragmenten und Konstrukten davon in diagnostischen
Verfahren, analytischen Verfahren und biochemischen Reinigungsverfahren
bereit, welche die Bindungsspezifität des erfindungsgemässen monoklonalen
Antikörpers benutzen.
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Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter und sind
veranschaulichend und nicht limitierend aufzufassen. Die folgenden Beispiele
veranschaulichen sowohl bestimmte Aspekte der oben angeführten Verfahren
und Zusammensetzungen als auch vorteilhafte Ergebnisse.
Beispiel 1: Expressionssystem für das βA4-Peptid
Herstellung des Plasmides pGK002
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Allgemeine Klonierungsmethoden und molekularbiologische Methoden sind
beispielsweise in Sambrook, Fritsch und Maniatis, 1989, Molecular Cloning 2.
Herausgabe, Cold Spring Harbor Lab Press zu finden. Das Plasmid pMTI-26,
das ein Bluescript KS Klon ist, der eine 2,415 kb (Kilobasenpaare) APP-
Sequenz mit einem TAG-Stop-Codon, gefolgt von einer BamHI-Schnittstelle,
die durch ortsspezifische Mutagenese nach dem Codon der 42. Aminosäure
des βA4-Bereiches im Leseraster eingefügt wurde, enthält, wurde durch
Ausschneiden eines 1,8 kb Xba I/BgI II-Fragmentes und Religation des
Plasmides nach Auffüllen der Enden modifiziert. Das resultierende Konstrukt,
als pGK002 bezeichnet, enthält die Consensus-Sequenz der βA4-Sequenz,
welche das Startcodon enthält, unmittelbar stromabwärts des Bluescript T7-
Promotors.
Herstellung des Plasmides pGK003
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Das Plasmid pGK003 (Fig. 3), das in allen unten beschriebenen in vitro
Weizenkeimtranslationen von βA4 verwendet wurde, wurde hergestellt durch
Subklonieren eines 590 bp (Basenpaare) Not I/Xho I-Fragments von pGK002,
welches die gesamte humane βA4-Sequenz mit dem mutagenisierten Stop/Bam
HI enthält, in einen pSP64 PolyA-Vektor (Promega Corp.). Bei der Herstellung
dieses Plasmides wurde pGK002 mit Not I und Xho I verdaut und das
resultierende 590 bp-Fragment wurde mit. Klenow aufgefüllt, isoliert und ligiert
mit pSP64polyA, das mit Sma linearisiert wurde. Fig. 3 stellt eine
schematische Darstellung des Klones pGK003 dar. Der offene Leserahmen von
βA4 1-42 wird mittels des bakteriellen SP6-Promotors in vitro exprimiert. Der
3'-untranslatierte (3'-UT) Bereich von APP ist in Schwarz gezeigt.
Beispiel 2: In vitro Transkription und Translation von pGK003
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Das Plasmid pGK003 wurde mit EcoRV linearisiert und der vollständige Verdau
wurde durch Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Die Probe wurde zweimal
mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt von zwei Extraktionen mit Chloroform
und einer Präzipitation mit Ethanol. Das resultierende Pellet wurde einmal mit
70%igem Ethanol gewaschen, im Vakuum partiell getrocknet und in TE zu
einer Konzentration von 1 ug/ml resuspendiert.
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In vitro Transkripte wurden unter Verwendung von linearisierten Matrizen bei
30 pg/ml in 80 mM HEPES-KOH (pH 7,5)-Puffer, der 16 mM MgCl&sub2;, 2 mM
Spermidin, 40 mM DTT, 3 mM ATP/CTP/GTP/UTP, 800 Units/ml RNAsin
Ribonuklease-Inhibitor (Promega Corp.), 5 Units/ml Hefe-Anorganische
Pyrophosphatase (Sigma Corp.) und 1800 Units/ml SP6 RNA-Polymerase
(Promega Corp.) enthielt, hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde für 4 Std.
bei 37ºC gehalten. Das resultierende Transkript wurde durch Elektrophorese
mittels eines 1,2%-Agarose/TBE/EtBr-Gel mit denaturierten Proben (65ºC ·
10 Min.) verifiziert.
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Die Transkripte wurden unter Verwendung eines Weizenkeimextraktes (Sigma
Corp.) translatiert. Die Transkripte wurden erhitzt (65ºC · 10 Min.), mit dem
Weizenkeimextrakt, der KAc, RNAsin und eine Methionin-minus
Aminosäuremischung enthielt, gemischt und bei 25ºC für 1 Std. in der
Gegenwart von ³&sup5;S-markiertem Methionin (Amersham) translatiert. Die
Translation eines 4 kD (Kilodalton) βA4-Proteins wurde durch SDS-PAGE unter
Verwendung eines 16% Tris/Tricin-Gels (Novex) überprüft. Die Gele wurden
fixiert und die Proteine wurden mittels Photofluorographie unter Verwendung
eines kommerziellen Systems, "Amplify"® (Amersham), sichtbar gemacht.
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Die Inkorporation der Markierung in in vitro translatiertes βA4, welches einen
Methioninrest pro Molekül enthält, wurde durch Ausschneiden aus dem Gel
bestimmt. 2 mm Stücke wurden in 1 ml 30% Wasserstoffperoxid, 0,75 M
NH&sub4;OH über Nacht bei 37ºC solubilisiert. Dann wurde ein Volumen von 10 ml
eines "Ready Value" Szintillationscocktails (Beckman) zugegeben und die DPMs
(Zerfälle pro Minute) wurden unter Verwendung eines Beckman LS6000IC
Szintillationszählers im Auto-DMP-Modus bestimmt. Typische Reaktionen
erzeugten -250 ng βA4/ml oder ~56 nM.
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In vitro Transkription, gefolgt von einer Translation des βA4-Klons, pGK003,
in einem Weizenkeimsystem resultierte in einem einzigen durch Fluorographie
eines 16% Tris-Tricin-SDS-Polyacrylamidgels sichtbar gemachten 4 kD
Proteinprodukts (Fig. 4A). Fig. 4A zeigt die Ergebnisse einer SDS-PAGE mit
einem 16% Tris/Tricin-Gel. Spur 1: Hoch-MW-Marker. Spur 2: Niedrig-MW-
Marker. Spur 3: in vitro translatiertes βA4 in einem Weizenkeimsystem. Die
Identität dieses 4 kD-Produkts wurde mittels Immunopräzipitation mit βA4-
spezifischen Antikörpern bestätigt (Fig. 4B).. Fig. 4B zeigt die Ergebnisse
einer SDS-PAGE mit einem 16% Tris/Tricin-Gel. Spur 1: Hoch-MW-Marker.
Spur 2: Niedrig-MW-Marker. Spur 3: in vitro translatiertes βA4 aus einem
Weizenkeimsystem, das mit MAb 286.8A immunopräzipitiert wurde. Die
Transkription und die Translation von diesem wie auch von anderen βA4-
Klonen in einem kombinierten Retikulozytenlysatsystem (TnT) führte nicht zur
gleichen Ausbeute oder Reinheit des radioaktiv markierten βA4 (Daten nicht
gezeigt). Dies könnte auf die kurzen Transkripte oder auf die besondere
Beschaffenheit des βA4-Peptids selber zurückzuführen sein.
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Der monoklonale Antikörper 286.8A, der gegen das Rohpeptid 1-42 erzeugt
wurde und dem Bereich 3-8 von βA4 entspricht, konnte dieses Protein in einer
konzentrationsabhängigen Art und Weise präzipitieren (Fig. 5). Fig. 5 stellt
diese Immunopräzipitation von in vitro tranlatiertem βA4 (IVT βA4) graphisch
dar. Zunehmende Mengen von IVT βA4 wurden mit einer konstanten Menge
von 286.8A (7,4 ug) in 100 ul RIPA-Puffer immunopräzipitiert.
Beispiel 3: Herstellung des Immunogens und des Screeningpeptids
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Die Peptide wurden mittels Standard-Fmoc-Festphasenverfahren hergestellt
(siehe beispielsweise Gras-Masse et al., 1985).
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Das Peptid #959, ein synthetisches Peptid mit 14 Resten, das ein an den
hydrophilen Spacer DGDGD angehängtes N-terminales Cystein und die Reste
35-42 des humanen βA4 aufweist (führt zu der vollständigen Sequenz:
CDGDGDMVGGVVIA (SEQ ID NO: 1)), wurde an einen Maleinimid-aktivierten
KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)-Träger unter Verwendung des kommerziell
erhältlichen "Imject®" Activated Immunogen Conjugation Kit (Pierce) gekoppelt.
2 mg des Peptids wurden in 200 ml Konjugationspuffer gelöst und bei
Raumtemperatur für 2 Std. mit 2 mg rekonstituiertem Maleinimid-aktiviertem
KLH umgesetzt. Das Konjugat wurde durch Gelfiltration gereinigt und unter
Verwendung von Standardprotokollen, wie in Beispiel 4 beschrieben, als
Immunogen für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern benutzt.
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Das Peptid #958, ein synthetisches Peptid mit 14 Resten, das ein an den
Spacer GGGGG angehängtes N-terminales Cystein und die Reste 35-42 des
humanen βA4 aufweist (führt zu der vollständigen Sequenz:
CGGGGGMVGGVVIA (SEC ID NO: 2)), wurde an Ovalbumin gekoppelt durch
Auflösen von 2 mg Peptid in 200 ul 6 M Guanidin, 0,01 M Phosphat pH 7,0
und wie oben an 2 mg rekonstituiertes Maleinimid-aktiviertes Ovalbumin
konjugiert. Das gereinigte Konjugat wurde beim ELISA-Screening von
monoklonalen Fusionsprodukten verwendet. Antikörper, die auf diese Art und
Weise gescreent wurden, sind eher spezifisch für die "35-42"-Determinante als
für den Spacer, die Cysteinbrücke oder die Trägeranteile des Immunogens.
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Fig. 6: Veranschaulicht das Peptid, das zur Erzeugung der Immunantwort
verwendet wurde (das Immunogen) und die Peptide, die verwendet wurden,
um die Mausseren, wie auch Fusionen, in der Enzymimmunoassayplatte (EIA)
zu screenen sind gezeigt. Die βA4-Sequenz 35-42 wurde zusammen mit einem
Spacer und einem C-terminalen Cystein synthetisiert, das dann verwendet
wurde, um es kovalent über eine Maleinimid-Brücke an grössere
Trägermoleküle zu koppeln. Sowohl der Spacer als auch das Trägermolekül im
Immunogen- und Screeningpeptid sind verschieden, um βA4-
sequenzspezifische Antikörper zu selektieren.
ELISA (Festphasen-Enzymimmunoassay)
Biotinylierung von MAb
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Der N-Hydroxysuccinimidester von Biotin wird verwendet, um den
monoklonalen Antikörper 286.8A zu biotinylieren. Die Integrität des Reagens
wird zuerst überprüft durch das Beobachten seiner spontanen Hydrolyse in der
Abwesenheit von primären Aminen: eine 0,2 mg/ml Lösung NHS-LC-Biotin
(Vector Labs, Burlingame, CA) in PBS wird bei 260 nm über die Zeit verfolgt.
Eine OD&sub2;&sub6;&sub0; von 1,0 nach ungefähr 2 Std. (Anstieg von einer anfänglichen OD&sub2;&sub6;&sub0;
von ~0,55) zeigt die erwartete Hydrolyse an.
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Für die Biotinylierungsreaktion stellte sich heraus, dass ein 66 : 1 Molverhältnis
von Biotin zu monoklonalem 286.8A bei neutralem pH optimale Ergebnisse
ergibt, wenn der biotinylierte 286.8A in einem ELISA-Format getestet wurde.
0,6 mg NHS-LC-Biotin in H&sub2;O bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml wurde zu
1 ml (2 mg) 286.8A in PBS (innerhalb 5 Min. des Auflösens) gegeben. Ein
nukleophiler Angriff auf den NHS-Ester erfolgte bei 25ºC für 4 Stunden,
anschliessend wurden 10 mg Glycin in 50 ul H&sub2;O zugegeben, um die Reaktion
zu stoppen. Die Reaktion wird dann über eine 10 ml quervernetzte Dextran-
Entsalzungssäule gegeben, die mit PBS äquilibriert war und 0,5 ml Aliquots
wurden gesammelt. Der erste Peak, der dem IgG-Peak entspricht, wurde
vereinigt und bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.
ELISA-Verfahren
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Corning 25801 96-Well ELISA-Platten werden über Nacht bei 4ºC mit 100 ul
monoklonalem 4G8 oder mit einem anderen Einfangantikörper bei 5 ug/ml,
üblicherweise in H&sub2;O oder Puffer, beschichtet. Die Platte wird dann mit PBS,
das 1% Triton X-100 enthält, in einem Dynatech Ulrawash plus gewaschen.
Die Wells wurden dann für 90 Min. mit 300 pl PBS, das 1% Triton X-100 und
1% BSA von ELISA-Reinheit enthält (Blockierungspuffer), blockiert. Nach dem
Waschen wurde verdünntes Antigen oder eine unbekannte Substanz, die in
Blockierungspuffer gelöst waren, in dreifacher Ausführung zu den Wells
gegeben und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Platte wird
zweimal gewaschen und es werden 400 ng biotinylierter 286.8A oder ein
anderer Nachweisantikörper zugegeben. Nach 30 Min, wird die Platte
ausgiebiger gewaschen (zweimal Waschen, 2 Min. Einwirken, zweimal
Waschen) und 100 ul vorgebildete Avidin-Biotin-Alkalische Phosphatase-
Kompexe (Vector Labs) werden zugegeben. Die Platte wird gewaschen
(zweimal Waschen, 2 Min. Einwirken, zweimal Waschen, 5 Min. Einwirken,
viermal Waschen) und MUP-Substrat wird bei einer Konzentration von 0,06
mg/ml in 1 · Diethanolamin-Puffer zugegeben. Nach 15 Minuten werden die
Platten in einem Millipore Cytoflour unter Verwendung eines 360 nm-
Anregungsfilters und eines 460 nm-Emissionsfilters ausgelesen.
Beispiel 4: Erzeugung von Monoklonalen Antikörpern
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Balb/c-Mäuse wurden durch mehrere I.P.-Inokulationen mit an KLH-
konjugiertem Peptid #959 immunisiert. Milzzellen von immunisierten Tieren
wurden mit Maus-Myelomzellen AG8 unter Verwendung von
Standardprotokollen fusioniert (Wunderlich et al., 1992, J. Immunol. Methods
147: 1-11). Die Überstände der resultierenden Hybridome wurden auf ihre
Immunreaktivität gegenüber dem Ovalbumin gekoppelten Peptid #958 unter
Verwendung von Standard-ELISA-Protokollen wie oben beschrieben gescreent.
Hybridome, die positiv für die Expression von immunreaktiven MAbs waren,
wurden wenigstens zweimal durch limitierte Verdünnung vereinzelt und es
wurde eine MAb-Isotyp-Analyse durchgeführt. Gereinigtes MAb-IgG wurde aus
Ascitesflüssigkeit mittels Protein-A-Affinitätschromatographie hergestellt.
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Nach der Fusion zeigte ein Screening, dass die Immunisierung von Mäusen mit
dem an KLH konjugierten Peptid #959 und Screening in einem Festphasen-
ELISA-Format mit dem an Ovalbumin gekoppelten Peptid #958, zu sechs
positiven elterlichen Signalen (identifiziert als 369.1 bis 369.6) führte. Beide
Peptide weisen die Aminosäuren 35-42 des βA4-Bereichs, unterschiedliche N-
terminale Spacer und ein Cystein zur kovalenten Kopplung an Trägerproteine
auf (Fig. 6). Der freie C-Terminus mit der geladenen Carboxygruppe und einer
begrenzten Länge von nur 8 Aminosäuren begünstigt die Bildung von
Antikörpern, welche spezifisch gegen längere Formen der βA4-Peptide
gerichtet sind; kürzere βA4-Peptide, die vor der Aminosäure 42 enden, werden
somit nicht erkannt.
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Fig. 6 stellt schematisch den Aufbau des verwendeten Immunogens (Träger-
Peptid) und des verwendeten Screeningpeptids (Träger-Screeningpeptid) dar.
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Zwei der sechs elterlichen Signale waren schlussendlich nicht klonierbar. Von
den verbleibenden vier ergaben zwei Immunopräzipitations-
/Szintillationssignale, die nur einige Prozente über den normalen nicht-immunen
Kontrollen lagen; die anderen zwei (identifiziert als 369.6 und 369.2) wiesen
Signale von 18% beziehungsweise 19% auf. Es wurde die Herstellung der
monoklonalen Antikörper aus Ascitesflüssigkeit und die anschliessende
Immunreinigung dieser Klone durchgeführt. Die Tabelle I vergleicht die Daten,
die mit IPSA für Hybridomüberstände und gereinigte Antikörper erhalten
wurden.
Tabelle I
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Tabelle 1. Vergleich der Antikörper-Aktivitäten in Hybridomzelllinien. IPSA-Daten
stellen den Prozentanteil von in vitro translatiertem βA4 dar, der entweder mit
Hybridomüberständen oder gereinigten Antikörpern immunopräzipitiert werden
konnte.
Beispiel 5: Immunopräzipitations-/Szintillationsassay für das Hybridomscreening
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Um monoklonale Antikörper, welche das βA4-Peptid eher in Lösung als an eine
feste Phase gebunden erkennen, zu entwickeln und für diese zu Screenen,
wurde ein Assay entwickelt, bei dem die Immunopräzipitation von ³&sup5;S-
Methionin-markiertem in vitro markiertem βA4 (IVT βA4) gemessen wird. Eine
Standardmenge von in vitro translatiertem βA4 bildet Antikörper/Antigen-
Komplexe in einer Lösung, die bezüglich der Ionenstärke, dem pH und der
Detergenzzusammensetzung optimiert werden kann. Nachdem die
Immunkomplexe mit Protein G (Omnisorb® Zellen) präzipitiert und ausgiebig
gewaschen wurden, wird die gebundene Radioaktivität in einem
Flüssigkeitsszintillationszähler ausgezählt; der Hintergrund wird subtrahiert und
der Ausbeutegrad der Präzipitation berechnet. Dieser Immunpräzipitations-
/Szintillationsassay (IPSA) ermöglicht sowohl die schnelle Identifizierung als
auch die Charakterisierung von Antikörpern und wurde verwendet, um eine
Vielzahl von βA4-Antikörpern zu testen. Der Assay kann allgemein auf
monoklonale Hybridomüberstände als auch auf polyklonales Serum angewendet
werden, um Antikörper zu identifizieren, die für die Immunpräzipitationen
verwendet werden können. Üblicherweise können 18 IPSAs in einem Tag
durchgeführt werden. Dies ist somit ein schnelles und informatives zweites
Hybridomscreeningverfahren.
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Ungefähr 1,5 · 10&sup5; DPMs von ³&sup5;S-Methionin-markiertem in vitro translatiertem
βA4 (IVT βA4) wurden zu 10 ul eines 10x-Immunopräzipitationspuffers (150
mM NaCl, 10% NP-40, 5% Desoxycholsäure, 1% SDS, 500 mM Tris pH 8)
gegeben. Dazu wurden 90 ul eines monoklonalen Zellüberstandes von der
monoklonalen Fusionszelle von Interesse (unsere Bezeichnung #369) gegeben
und für 2 Std. bei 4ºC umgesetzt. Der Hintergrund wurde unter Verwendung
von 90 ul eines Überstandes von einem nicht-reaktiven Klon bestimmt; die
positive Kontrolle war 90 ul eines Überstandes, der den monoklonalen
Antikörper 286.8A enthielt, der zuvor gegen eine synthetische βA4(1-42)-
Rohaufbereitung hergestellt wurde. Nach 2 Std. wurden 40 ul einer 10%
Lösung Omnisorb®-Zellen (Calbiochem), die in 1x-Immunopräzipitationspuffer
(RIPA-Puffer, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Desoxycholsäure, 0,1% SDS,
50 mM Tris pH 8) äquilibriert waren, zugegeben und für weitere 2 Std. bei 4
ºC unter Schütteln umgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation für 5
Min. bei 4500 g und 4ºC pelletiert und 3x mit 800 ul kaltem 1x-
Immunopräzipitationspuffer gewaschen. Die Pellets wurden quantitativ in
Szintillationsvials transferiert und in einem Beckman LS6000
Szintilllationszähler im Auto-DPM-Modus ausgezählt. Der Prozentanteil von
immunopräzipitiertem βA4 wurde berechnet.
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Immunopräzipitations-/Szintillationsassays wurden mit 1 ug des gereinigten
monoklonalen Antikörpers 369.2B in einem Gesamtvolumen von 100 ul 1x-
Immunopräzipitationspuffer, zu dem 5 ug des kompetitiven Peptids gegeben
wurden, durchgeführt. Die Inkubationen und Präzipitationen wurden wie oben
beschrieben durchgeführt.
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Fig. 7 zeigt den Prozentanteil von immunopräzipitiertem IVT βA4 als Funktion
der Antikörperkonzentration für die MAbs 369.2, 369.6 und den MAb 286.8A.
Unter den Bedingungen dieses Assays, ist 369.2 (und weiter der Subklon
369.2B) bei der Immunopräzipitation von löslichem LVT-βA4 ungefähr viermal
besser als 369.6, präzipitiert jedoch ein bisschen weniger als halb so viel wie
286.8A. Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Immunopräzipitation von in vitro
translatiertem βA4 gegen die Antikörperkonzentration (pg Antikörper/100 ul
RIPA-Puffer), wobei:
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Die Prozentanteile bei einer gegebenen MAb-Konzentration variierten nur um
wenige Prozentpunkte zwischen und innerhalb der Experimente.
IPSA für die monoklonale Charakterisierung
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Ungefähr 1,5 · 10&sup5; DPMs von ³&sup5;S-Methionin-markiertem in vitro translatiertem
βA4 wurde zu verschiedenen Mengen von gereinigtem monoklonalem
Antikörper, entweder 369.2B, 369.6 oder 286.8A zu einem Gesamtvolumen
von 100 ul 1x-Immunopräzipitationspuffer gegeben und wie oben beschrieben
umgesetzt. Die Immunkomplexe wurden mit Omnisorb präzipitiert, gewaschen
und wie oben beschrieben ausgezählt.
Beispiel 6: Charakterisierung von MAb 369.2B
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Um die beste Zelllinie, 369.2B, weiter zu charakterisieren, wurde ein.
Kompetitionsimmunopräzipitations-/-szintillationsassay (Kompetitions-IPSA)
durchgeführt. In dieser Variation wurden zur gleichen Zeit 369.28 und
markiertes in vitro translatiertes βA4 1-42 zu einem ungefähr 200-fachen
molaren Überschuss von unmarkiertem kompetitiven Peptid gegeben. Wie
erwartet konkurrierten die Peptide der humanen βA4-Bereiche 1-40, 1-11, 1-
28, 12-28, wie auch das reverse Peptid 40-1 bei der Immunpräzipitation nicht
mit dem ³&sup5;S-Methioninmarkierten in vitro translatierten βA4, während das
vollständige 1-42 Peptid dies tat (Fig. 8).
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Diese Ergebnisse wurden in einem Festphasen-ELISA-Format bestätigt: das
absorbierte Ovalbumin-gekoppelte Screeningpeptid, das den βA4-Bereich 35-42
enthält, wie auch das 1-42 Peptid, konkurrierten, während 1-40 dies nicht tat
(Fig. 9). Das verringerte Kompetitionsvermögen des 1-42 Peptids im Vergleich
zu dem Ovalbumin gekoppelten 35-42 kann auf konformationelle Faktoren
und/oder Löslichkeitsfaktoren unter Beteiligung der antigenen Determinanten
oder möglicherweise einfacher auf die besondere Stöchiometrie der
Konjugation (Ovalbumin, ein Träger mit einem Molekulargewicht von 45 kD
verglichen mit den 4 kD des 1-42 Peptids, wobei der Träger etwa zwischen 5-
15 mit Maleinimid-konjugierbare Gruppen pro Mol des Trägers aufweist)
zurückzuführen sein.
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Fig. 8 zeigt einen Peptidkompetitions-Immunopräzipitations-
/Szintillationsassay für die Epitop-Bestimmung von MAb 369.2. Das
kompetitive Peptid (5 ug) wurde mit in vitro translatiertem βA4 (~1,5 · 10&sup5;
DPMs oder ~200 pg) gemischt und dann mit 2 ug 369.2 immunopräzipitiert,
wobei:
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Die Prozentanteile bei einer gegebenen MAb-Konzentration variierten nur um
wenige Prozentpunkte zwischen und innerhalb der Experimente.
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Die Fig. 9 zeigt das Epitop-Mapping von MAb 369.2 durch einen
Kompetitionsassay. C369.2 (50 ng IgG/100 ul) wurden mit oder ohne
synthetische kompetitive Peptide präinkubiert (22ºC, 1 h) und dann einem
ELISA gegen plattengebundene Ovalbumin-gekoppelte 35-42 (200 ng/Well)
unterzogen. Der Prozentanteil der Kompetition wurde bezüglich des Bindens
von MAb in der Abwesenheit eines Kompetitors berechnet, d. h. wobei:
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Das ausgefüllte Quadrat steht für das 35-42(OVA)-Peptidkonjugat; das
nichtausgefüllte Quadrat steht für das 1-42 Peptid; und die ausgefüllte Raute steht
für das 1-40 Peptid.
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Aus diesen Daten schliessen wir, dass der monoklonale 369.2B spezifisch für
das C-terminale Ende des vollständigen (1-42) βA4-Peptids ist. Obwohl die
genaue antigene Determinante nicht detailliert kartiert werden konnte, umfasst
sie eindeutig Reste nach der Position 40 und, da der Antikörper gegen ein
kurzes synthetisches Peptid hergestellt wurde, ist es unwahrscheinlich, dass
die Determinante andere Reste von βA4 umfasst, die konformationell
benachbart sein können. Insbesondere ist 369.2B ein sehr wichtiges Werkzeug
zur Erkennung von βA4-Spezies, die an der Position 42 enden.
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Eine zusätzliche und interessante Beobachtung des Peptidkompetitionsassays
stellt die verstärkte Immunopräzipitierfähigkeit von in vitro translatiertem βA4
durch das Dekapeptid 25-32 dar. Dieses Phänomen wurde auch in anderen
Assays, die einen anderen monoklonalen Antikörper (d. h. 286.8A), sowie ein
polyklonales Kaninchenserum verwenden, beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Wir wissen auch von anderen Experimenten, die unterschiedliche Mengen an
Detergenzien, insbesondere SDS, in IPSA-Assays mit dem MAb 286.8A
verwenden, dass mit zunehmenden Mengen von Detergenzien mehr βA4
immunopräzipitiert werden kann (Daten nicht gezeigt). Interessanterweise
wurde für SDS gezeigt, dass es unwirksam bei der Solubilisierung von βA4-
Aggregaten ist, was wenigstens durch SDS-PAGE gezeigt wurde (Burdick et
al., 1992). Es ist jedoch nicht unmittelbar klar, warum SDS die
Immunopräzipitierfähigkeit von βA4 erhöhen sollte.
Beispiel 7: Immunhistochemische Untersuchungen
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Wir haben immunhistochemische Untersuchungen mit 369.2B durchgeführt.
Das Färbemuster von 369.2B (1/10000-Verdünnung einer aus Ascites
gereinigten Antikörperlösung von 22 mg/ml) zeigte im Vergleich zu dem
monoklonalen Antikörper 286.8A, für den wir gezeigt haben, dass er das
Epitop 3-8 von βA4 erkennt und humanspezifisch ist (Daten nicht gezeigt),
interessante Unterschiede auf. Die Ergebnisse, die von der Immunhistochemie
erhalten wurden, zeigten, dass 369.2B ein ausgezeichneter Antikörper (bei
einer 1/10000-Verdünnung) ist, um spezifisch Amyloidplaques-Cores, diffuse,
wie auch fibrilläre Amyloidablagerungen und vaskuläre Amyloidablagerungen
zu markieren (Fig. 10).
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Fig. 10 ist eine mikrofotographische Aufnahme, die β-Amyloidpiaques,
Blutgefässe und perivaskuläre Ablagerungen von βA4 in einem
Paraffineingebetteten 10 um dicken Schnitt des Gehirns einer 76-Jahre alten
weiblichen Patientin mit Alzheimererkrankung zeigt. Die Gewebeschnitte
wurden mit 88% Ameisensäure (30 Min.) vorbehandelt und dann unter
Verwendung eines Avidin-Biotin-Peroxidase-Kits (Vector Laboratories,
Burlington, CA) mit Nickel-Diaminobenzidin als Chromogen markiert. Der
monoklonale Antikörper 369.2B markiert Plaques mit einer Vielzahl von
Morphologien, umfassend hohle, perivaskuläre und diffuse (nicht-amyloide)
Plaques. Er markiert auch eine Untergruppe von amyloidischen Blutgefässen.
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Weitere Untersuchungen zeigten auch, dass das βA4 1-43 Peptid mit dem
Färben nicht konkurrieren konnte (mehr als ein 1000-facher Überschuss von
Peptid), wobei das βA4 1-42 das Signal vollständig aufhob (Tabelle 2). Wieder
konkurrierten 1-40 und 40-1 wie erwartet nicht mit dem Färben. Von diesen
Untersuchungen können wir bereits schliessen, dass dieser Antikörper ein
ausgezeichnetes Werkzeug für die Immunhistochemie darstellt. Wie durch in
vitro Untersuchungen, die physikalisch-chemische Unterschiede zwischen 1-40
und 1-42 zeigen, nahegelegt wird, ist es möglich, dass diese zwei βA4-Spezies
unterschiedliche Muster in Alzheimer-Gehirnen zeigen. Mit dem Antikörper der
vorliegenden Erfindung sind wir nun in der Lage diese Fragestellung anzugehen.
Somit sind der monoklonale Antikörper und die Verfahren der vorliegenden
Erfindung nützlich für diagnostische Anwendungen in allen immunologischen
und verwandten Methodiken, die zum Nachweis, Überwachung und
Gewinnung von einzigartigen βA4-Species, sowie in der Diagnose und Therapie
der AD, verwendet werden können.
Tabelle 2
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Tabelle 2. Die Ergebnisse der Kompetitionsbindungsexperimente und Hemmung
der Färbung, ein + + + steht für eine starke Färbung, - steht für keine
nachweisbare Färbung.
SEQUENZPROTOKOLL
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(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
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(i) ANMELDER: König, Gerhard
Graham, Paul
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(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: βA4-spezifischer monoklonaler
Antikörper
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(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
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(iv) POSTADRESSE:
-
(A) ADRESSAT: Allegretti & Witcoff, Ltd.
-
(B) STRASSE: 10 South Wacker Drive Suite 3000
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(C) ORT: Chicago
-
(D) STAAT: Illinois
-
(E) LAND: USA
-
(F) POSTLEITZAHL: 60606
-
(v) COMPUTER LESBARE FASSUNG:
-
(A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
-
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
-
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
-
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
-
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
-
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
-
(B) EINREICHUNGSZEITPUNKT:
-
(C) KLASSIFIKATION:
-
(viii) ANWALT/VERTRETER-ANGABEN
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(A) NAME: McDonell, John J
-
(B) EINTRAGUNGSNUMMER: 26,949
-
(C) AKTENZEICHEN/BEZUGSZEICHEN: 95,216
-
(ix) TELEFON/FAX-ANGABEN:
-
(A) TELEFON: 312-715-1000
-
(B) FAX: 312-715-1234
-
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
-
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
-
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
-
(B) ART: Aminosäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xii SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
-
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
-
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
-
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
-
(B) ART: Aminosäure
-
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
-
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
-
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
-
(A) LÄNGE: 59 Aminosäuren
-
(B) ART: Aminosäure
-
(C) STRANG FORM: Einzelstrang
-
(D) TOPOLOGIE: linear
-
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spaltungsstelle
-
(B) POSITION: 4..5
-
(D) ANDERE ANGABEN: /label = Beta
/note = "Beta-Schnittstelle in APP"
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spaltungsstelle
-
(B) POSITION: 20..21
-
(D) ANDERE ANGABEN: /label = Alpha
/note = "Alpha-Schnittstelle in APP, Reste 16/17 von βA4"
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spaltungsstelle
-
(B) POSITION: 46..47
-
(D) ANDERE ANGABEN: /label = Gamma
/note = "Gamma-Schnittstelle in APP"
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Peptid
-
(B) POSITION: 5..47
-
(D) ANDERE ANGABEN: /label = βA4
/note = "βA4-Peptid"
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Bereich
-
(B) POSITION: 33..56
-
(D) ANDERE ANGABEN: /label = Tm
/note = "Transmembranbereich von APP"
-
(ix) MERKMAL:
-
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Bereich
-
(B) POSITION: 1..32
-
(D) ANDERE ANGABEN: /label = Ex
/note = "N-terminaler extrazellulärer Teil von APP"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3: