DE69617699T2

DE69617699T2 - Neuartige opioid-peptide

Info

Publication number: DE69617699T2
Application number: DE69617699T
Authority: DE
Inventors: Wuyi Wang
Original assignee: Shire BioChem Inc
Current assignee: Shire Canada Inc
Priority date: 1995-08-18
Filing date: 1996-08-14
Publication date: 2003-08-07
Anticipated expiration: 2016-08-15
Also published as: TR199800258T1; AU6760096A; NO980592D0; ATE210148T1; SK282469B6; HUP9901209A3; SK20398A3; EE9800048A; IL123258A0; JPH11512086A; KR19990037677A; SE9503924D0; EP0845003A1; PL325113A1; WO1997007130A1; NO980592L; CA2229797A1; CN1200127A; RU2165432C2; AU711862B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Opioid-artige Peptidverbindungen. Insbesondere betrifft sie Opioid-artige Peptidverbindungen, die periphere analgetische Aktivität und Selektivität für den u-Subtyp von Opioid-Rezeptoren zeigen.

Hintergrund der Erfindung

Viele endogene Peptide, die von Säugern und Amphibien stammen, binden an spezifische Opioid-Rezeptoren und rufen eine analgetische Reaktion ähnlich klassischen narkotischen Opiaten hervor. Es ist gezeigt worden, dass viele verschiedene Typen von Opioid-Rezeptoren in höheren Tieren gleichzeitig vorliegen; vergl. z. B. W. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 197, S. 517 (1975); und J. Lord et al., Nature (London), 257, S. 495 (1977). Drei verschiedene Typen von Opioid- Rezeptoren sind identifiziert worden. Der erste Typ, δ, zeigt eine differenzierende Affinität für Enkephalin-artige Peptide. Der zweite Typ, u, zeigt verstärkte Selektivität für Morphin und andere polycyclische Alkaloide. Der dritte Typ, κ, zeigt gleiche Affinität für beide Gruppen der vorstehenden Liganden und eine bevorzugte Affinität für Dynorphin. Im Allgemeinen scheinen u-Rezeptoren stärker an analgetischen Wirkungen beteiligt zu sein. Die δ-Rezeptoren scheinen Verhaltenswirkungen zu betreffen, wobei jedoch die δ- und die κ-Rezeptoren ebenfalls Analgesie vermitteln können.
Jeder Opioid-Rezeptor ruft bei Kopplung mit einem Opiat eine spezifische biologische Reaktion hervor, die einzigartig für den Typ von Rezeptor ist. Wenn ein Opiat mehr als einen Rezeptor aktiviert, dann ist die biologische Reaktion für Jeden Rezeptor betroffen, wobei Nebenwirkungen hervorgerufen werden. Je weniger spezifisch und selektiv ein Opiat ist, um so größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass verstärkte Nebenwirkungen durch die Verabreichung des Opiats hervorgerufen werden.
Im Stand der Technik haben Opiate, Opioidpeptide und Analoga davon entweder keine Selektivität für den Typ von Rezeptor oder Rezeptoren, an den sie binden, gezeigt, oder sie haben einen begrenzten Grad an Selektivität gezeigt.
Opiate können ernsthafte und potentiell tödliche Nebenwirkungen hervorrufen. Nebeneffekte wie Atemnot, Gewöhnung, physische Abhängigkeit und verstärkte Ent zugserscheinungen werden durch nicht-spezifische Wechselwirkungen mit Rezeptoren des zentralen Nervensystems hervorgerufen; vergl. K. Budd, in: International Encyclopedia of Pharmacology and Therapeutics; N. E. Williams und H. Wilkinson, Hrsg., Pergamon: (Oxford), 112, S. 51 (1983). Es wäre daher zu erwarten, dass Opioidanalgetika, die hauptsächlich durch Opioid-Rezeptoren im peripheren Nervensystem wirken, keine ähnlichen unerwünschten Nebenwirkungen hervorrufen wie die Nebenwirkungen, die mit Opioidanalgetika, die das zentrale Nervensystem beeinflussen, verbunden sind.
Bis heute sind eine der wenigen Klassen von Mitteln, von denen bekannt ist, dass sie periphere analgetische Wirkungen hervorrufen, die nicht steroidalen entzündungshemmenden Mittel, wie Aspirin, Ibuprofen und Ketorolac. Diese Mittel treten nicht in Wechselwirkung mit Opioid-Rezeptoren, sondern es ist bekannt, dass sie Cyclooxygenase hemmen und die Prostaglandinsynthese abschwächen. Diese schwachen Analgetika haben keine zentral vermittelten Nebenwirkungen, können jedoch andere Nebenwirkungen, wie Geschwürbildungen im Magen-Darm-Trakt, hervorrufen.
Es wurde angenommen, dass nicht-polare Peptide leichter in das zentrale Nervensystem eindringen als polare Peptide, indem sie die Blut-Hirn-Schranke überqueren. Es ist veröffentlicht worden, dass TAPP(H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH&sub2;) antinozizeptive Eigenschaften sowohl peripher als auch zentral zeigt (P. Schiller et al., Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, 1988). Im Gegensatz dazu wurde vom Erfinder der vorliegenden Anmeldung gefunden, dass dieses Tetrapeptid selbst bei Dosen von 100 mg/kg nicht zentral wirkt.
WO 95/22557 offenbart selektive u-Opioid-Rezeptoragonisten mit Tetrapeptidstruktur, z. B. H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe(pF)-NH&sub2; und H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe(pF)-NH&sub2;.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Opioid-artige Peptidverbindungen bereitzustellen, die peripher wirken, im Wesentlichen jedoch die unerwünschten Nebenwirkungen, die mit herkömmlichen peripher wirkenden Analgetika verbunden sind, vermeiden. Eine weitere Aufgabe besteht darin, Peptidverbindungen bereitzustellen, die selektiv an den u-Opioid-Rezeptor binden.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt neue Peptidverbindungen, die peripher wirken und selektiv für u-Opioid-Rezeptoren sind, wobei die Verbindungen durch die Formel (1) dargestellt werden:
sowie Salze, Derivate und Analoga davon bereit, worin gilt:
R&sub1; ist Tyr oder 2',6'-Dimethyltyrosin oder ein Analogon oder Derivat davon;
R&sub2; ist D-Ala oder D-Arg;
R&sub3; ist Phe(p-F);
R&sub4; ist Phe oder Phe(p-F);
X ist H oder C-&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl; und
Y und Z sind unabhängig H, Aralkyl oder C-&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine Verbindung der Formel (1) im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder einem zweiten therapeutisch aktiven Mittel enthalten.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung von Schmerzen bereitgestellt, das die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (1) an einen Säuger, der dessen bedarf, umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Verbindungen der Formel (1) für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Schmerzen bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1, 2 und 4 veranschaulichen die Hemmwirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen in zwei verschiedenen Heizplattenassays.
Fig. 3 veranschaulicht die Hemmwirkung von H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH&sub2; in einem Heizplatten-Assay.
Fig. 5 veranschaulicht die Hemmwirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen im Schwanzschlag-Assay.

Darstellung der Erfindung

Die folgenden üblichen Abkürzungen werden in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet:
Ala - Alanin
Arg - Arginin
Phe - Phenylalanin
Ser - Serin
Tyr - Tyrosin
TAPP - H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH&sub2;
GPI - Meerschweinchen-Ileum
MVD - Maus vas deferens
Phe(p-F) - para-Fluorphenylalanin
HOBT - N-Hydroxybenzothiazol
BOP - Benzotriazolyl-N-oxy-tris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat
DMF - Dimethylformamid
TFA - Trifluoressigsäure
tBU - tert.-Butyl
Pmc - 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
FMOC - 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl
PBQ - Phenyl-p-benzochinon
Der Ausdruck "ED&sub5;&sub0;", wie er in Tabelle 1 für die PBQ-Krümmungsassays angegeben ist, ist definiert als die Dosis an Arzneistoff, die eine 50%ige Verringerung der Anzahl der Krümmungen, die im Vergleich mit der Kontrolle beobachtet werden, induziert. Der Ausdruck "Ki" in Tabelle 1 für den Bindungsassay ist die Inhibitionskonstante für den bekannten u-Rezeptorliganden DAMGO und den δ- Rezeptorliganden DADLE. Der Ausdruck "Kiδ/Kiu" ist ein Wert, der herangezogen wird, um Selektivität anzugeben. Dieses Verhältnis stellt die Beziehung der Affinitäten von Opioidpeptiden für die Bindung an u- und δ-Rezeptoren dar.
Erfindungsgemäße Verbindungen werden durch die Formel (1) dargestellt:
sowie deren Salze, Derivate und Analoga.
X ist H oder Methyl und vorzugsweise H.
R&sub1; ist Tyr oder 2',6'-Dimethyltyrosin und vorzugsweise Tyr. Die alpha-Aminogruppe von R&sub1; ist mit X unter Bildung einer Aminogruppe, wenn X für H steht, oder einer Alkylaminogruppe, wenn X für Methyl steht, substituiert.
R&sub2; ist D-Ala oder D-Arg und vorzugsweise D-Ala.
R&sub5; ist Phe(p-F).
R&sub4; ist Phe oder Phe(p-F) und vorzugsweise Phe.
Y und Z sind unabhängig H; Aralkyl, wie Benzyl; und C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, wie Methyl. Vorzugsweise sind Y und Z beide H.
Erfindungsgemäße Verbindungen umfassen, jedoch ohne Beschränkung hierauf:
Verbindung Nr. 1B: H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH&sub2;;
Verbindung Nr. 1C: H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;;
Verbindung Nr. 2B: H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH&sub2;; und
Verbindung Nr. 2C: H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verbindungen aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus:
Verbindung Nr. 1C: H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;; und
Verbindung Nr. 2C: H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;.
Gemäß einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der erfindungsgemäßen Verbindung um:
Verbindung Nr. 1C: H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;.
Das Aminosäurederivat 2',6'-Dimethyltyrosin (Dmt) kann anstelle von Tyrosin in den Opioid-Peptidverbindungen eingesetzt werden. Versuche haben gezeigt, dass der Einsatz von Dmt anstelle von Tyrosin in der R&sub1;-Position, dem ersten Aminosäurerest in der allgemeinen Formel 1, die Wirksamkeit des Opioid-Peptids am u-Rezeptor um bis zu 2 Größenordnungen verstärkt. Die Selektivität für den u-Rezeptor nimmt zu, wenn die Verbindung Dmt an der R&sub1;-Position einschließt. Diese Substitution ruft eine entsprechende Verschiebung im Verhältnis der Bindungsinhibitionskonstanten hervor, wobei die erhöhte u-Rezeptorselektivität widergespiegelt wird.
Die Opioid-Aktivität der Peptide wurde in vitro unter Verwendung des Meerschweinchen-Ileum (GPI)-Longitudinalmuskelpräparats bewertet, und ihre antinozizeptive Aktivität wurde in vivo in PBQ-induzierten Krümmungsmodellen (periphere Aktivität) und in zwei Heizplattentests (zentrale Aktivität) bei Nagern bestimmt. Die analgetische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde auch im Schwanzschlag-Assay bewertet. Der Schwanzschlag-Assay wird herangezogen, um die zentrale analgetische Aktivität der Verbindung zu bewerten. Ein Vergleich der Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen in den Krümmungs-, Heizplatten- und Schwanzschlag-Assays zeigte, dass die analgetischen Wirkungen vorwiegend in der Peripherie vermittelt wurden. Periphere Analgesie wurde durch eine hohe Potenz im Krümmungstest gekoppelt mit einer niedrigen Potenz im Heizplattentest und im Schwanzschlag-Test gezeigt.
Die PBQ (Phenyl-p-benzochinon)-induzierte Krümmung bei Mäusen ist eine Bewertung sowohl zentraler als auch peripherer Analgesie. Für experimentelle Anleitungen vergl. Sigmund et al., Proc. Soc. Ex. Biol. Med., 95, S. 729 (1957), wobei diese Veröffentlichung durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird. Zentrale Analgesie wird durch Hemmung einer Heizplattenreaktion bei Mäusen bestimmt. Für eine experimentelle Anleitung vergl. G. Wolfe und A. MacDonald, J. Pharmacol. Exp. Ther., 80, S. 300 (1944), wobei diese Veröffentlichung durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird. Assays, die Opioidrezeptor-Bindungsaffinitäten für u- und δ-Rezeptoren messen, sowie der GPI- Assay wurden nach der experimentellen Anleitung, die in Schiller et al., Biophys. Res. Commun., 85, S. 1322 (1975) dargelegt ist, durchgeführt, wobei diese Veröffentlichung durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Peptidchemie gut bekannt sind; vergl. z. B. Principle of Peptide synthesis, M. Bodansky, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokio 1984; oder The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, herausgegeben von Erhard Gross und Johannes Meienhofer, Academic Press, 1979.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden unter Anwendung der Festphasensynthese, wie nachstehend dargelegt, entsprechend etablierten Verfahren auf dem Gebiet der Peptidsynthese hergestellt. Kommerziell erhältliches para-Fluorphenylalanin (Phe(p-F)) wurde in der entsprechenden Synthesestufe eingesetzt. 2',6'-Dimethyltyrosin kann bei der Synthese ebenfalls eingesetzt werden und wird entsprechend etablierter chemischer Synthesetechniken hergestellt.
Pharmazeutisch annehmbare Salze der erfindungsgemäßen Peptide können auf herkömmliche Weise durch Umsetzung mit einer geeigneten Säure hergestellt werden. Geeignete Säureadditionssalze können durch Addition von Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Fumarsäure, Salicylsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Mandelsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Methansulfonsäure und anderen geeigneten Säuren, die Fachleuten bekannt sind, gebildet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit. Geeignete Zusammensetzungen weisen eine pharmazeutisch wirksame Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbarer Salze davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Adjuvans auf. Die therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Peptids und eine pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanz (z. B. Magnesiumcarbonat oder Lactose) können zu einer therapeutischen Zusammensetzung, wie (i) einer Pille, Tablette, Kapsel oder Flüssigkeit für die orale Verabreichung an einen Patienten; (ii) einer Flüssigkeit oder einer Salbe, die durch Inhalation, transdermal, nasal, rektal oder sublingual verabreicht werden kann; (iii) einer Flüssigkeit, die intravenös, parenteral, subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden kann; oder (iv) einer oralen oder parenteralen Formulierung mit verzögerter Freisetzung; formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung von Schmerzen bei Säugern unter Einschluss von Menschen bereit. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge eines Peptids der Formel 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder einer Zusammensetzung davon auf einem der traditionellen Wege, z. B. oral, parenteral, transdermal oder transmukosal, in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung unter Verwendung eines biologisch abbaubaren biologisch verträglichen Polymers oder durch gerichtete Abgabe unter Verwendung von Mizellen, Gelen und Liposomen. Die Peptide können einem menschlichen Patienten in einer Dosierung von etwa 0,01 bis 100 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,05 bis 20 mg/kg und insbesondere etwa 0,1 bis 1 mg/kg verabreicht werden.
Die nachstehenden Beispiele werden verwendet, um die Erfindung besser zu beschreiben. Diese Beispiele dienen nur dem Zweck der Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken.

Beispiel 1

Herstellung von 1C: H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;

Das synthetische Peptid wurde unter Verwendung von Knorr-Harz hergestellt. Die verwendeten Aminosäuren wiesen Fmoc-geschützte α-Aminogruppen und eine tBu- geschützte Tyrosin-Seitenkette auf. Das in der Kupplungsstufe verwendete Dimethylformamid war frei von Dimethylamin. DMF, das für die Waschstufen verwendet wurde, und TFA wiesen Biograde-Reinheit auf. Für die Reinigungsstufe wurden gereinigtes H&sub2;O nach USP und Acetonitril in HPLC-Qualität verwendet. Die sonstigen Lösungsmittel wiesen ACS-Reinheit auf und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Die Festphasensynthese erfolgte manuell auf dem Harz mit einer Beladung von 0,84 mMol/g. Die Peptidkondensation wurde unter Verwendung von 1,5 bis 2 Äquivalenten jeweils an Fmoc-Aminosäure, HOBT und BOP in DMF für 3 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Stufe der α-Amino-Fmoc-Schutzgruppenentfernung wurde unter Verwendung von 20% (Vol./Vol.) Pyridin in DMF für 25 Minuten durchgeführt. Die Peptidspaltung und Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen wurden durch Behandlung mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2;/Anisol bewirkt. Das Peptidharz wurde mit TFA für zwei Zeitspannen von 90 Minuten bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre behandelt. Nach CH&sub2;Cl&sub2;-Waschen und Eindampfen wurde der Rückstand mit Ethylether behandelt, der Niederschlag filtriert und unter Vakuum getrocknet.
Das erhaltene rohe Peptid wurde durch HPLC über eine C&sub1;&sub8; 10 u-15 u 300A-Umkehrphasensäule mit einer Gradientenelution unter Verwendung von 0,06% TFA/H&sub2;O und 0,06% TFA/Acetonitril gereinigt. Die Überwachung erfolgte bei 220 nm. Reine Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert. Das gereinigte Material wurde in Hydrochloridsalzform überführt, wobei man die reine Titelverbindung erhielt.
In gleicher Weise wurden die folgenden Peptide synthetisiert:
1A: H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH&sub2;.
1B: H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH&sub2;

Beispiel 2

Herstellung von 2C: H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;

Das synthetische Peptid wurde unter Verwendung von Knorr-Harz hergestellt. Die Aminosäuren wiesen Fmoc-geschützte α-Aminogruppen auf und die folgenden Seitenketten waren geschützt: (Pmc) für D-Arginin und tBu für Tyrosin. Das in der Kupplungsstufe verwendete Dimethylformamid war frei von Dimethylamin. Das in den Waschstufen verwendete DMF und TFA wiesen Biograde-Reinheit auf. Für die Reinigungsstufe wurden gereinigtes H&sub2;O nach USP und Acetonitril in HPLC-Qualität verwendet. Die sonstigen Lösungsmittel wiesen ACS-Reinheit auf und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.
Die Festphasensynthese erfolgte manuell auf dem Harz mit einer Beladung von 0,84 mMol/g. Die Peptidkondensation wurde unter Verwendung von 2 Äquivalenten jeweils an Fmoc-Aminosäure, HOBT und BOP in DMF für 2 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die α-Amino-Fmoc-Schutzgruppenentfernung wurde unter Verwendung von 20% (Vol./Vol.) Piperidin in DMF für 25 Minuten durchgeführt. Die Peptidspaltung und Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen wurden durch Behandlung mit TFA/CH&sub2;Cl&sub2;/Anisol bewirkt. Das Peptidharz wurde für zwei Perioden von 90 Minuten bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre mit TFA behandelt.
Nach CH&sub2;Cl&sub2;-Waschen und Eindampfen wurde der Rückstand mit Ethylether behandelt, der Niederschlag filtriert und unter Vakuum getrocknet.
Das erhaltene rohe Peptid wurde durch HPLC über eine C&sub1;&sub8; 10 u-15 u 300A-Umkehrphasensäule bei Gradientenelution unter Verwendung von 0,06% TFA/H&sub2;O und 0,06% TFA/Acetonitril gereinigt. Die Überwachung erfolgte bei 220 nm. Reine Fraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert.
In entsprechender Weise wurden die folgenden Peptide synthetisiert:
2A: H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH&sub2;.
2B: H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH&sub2;

Beispiel 3

Radioligandenbindungsassay

Membranpräparation

Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 350 und 450 g wurden durch Inhalation von CO&sub2; getötet. Die Ratten wurden enthauptet, und die Gehirne ohne das Cerebellum wurden entnommen und in eisgekühlte Kochsalzlösung gegeben und anschließend in eisgekühltem 50 mM Tris-Puffer, pH-Wert 7,4 (10 ml/Gehirn) homogenisiert. Die Membranen wurden bei 14 000 U/min für 30 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Pellets wurden in ungefähr 6 ml/Gehirn eisgekühltem Tris-Puffer, 50 mM, pH-Wert 7,4, resuspendiert und bei -78ºC bis zur Verwendung gelagert. Die quantitative Proteinbestimmung der Gehirnhomogenisate wurde entsprechend dem Proteinassay-Kit, das von Bio-Rad bezogen wurde, durchgeführt.

Radioligandassay

(³H)-DAMGO und (³H)-DAGLE wurden als Radioliganden für den u- bzw. δ-Rezeptor verwendet. Radioligand (50 ul), Membranen (100 ul) und seriell verdünnte Testverbindung wurden für 1 Stunde bei 22ºC inkubiert. Die nicht-spezifische Bindung wurde unter Verwendung eines 500-fachen Überschusses an unmarkiertem Liganden in Gegenwart von Tracer und Membranen bestimmt. Freier Ligand wurde von gebundenem durch Filtration durch Whatman GF/B-Papier (zuvor getränkt mit 1% wässriger Polyethylenimin-Lösung) und Spülen mit eisgekühltem 50 mM Tris, pH- Wert 7,4, unter Verwendung einer Brandel-Zellerntevorrichtung getrennt. Die Filter wurden getrocknet, und die Radioaktivität wurde in einer Mikrotiterplatte mit 24 Ver tiefungen in Gegenwart von 500 ml Szintillationssubstanz pro Vertiefung gezählt. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Wallac 1450 Microbeta-Zählers gemessen.
Ki-Werte für die verschiedenen Verbindungen wurden aus den IC&sub5;&sub0;-Werten nach der Gleichung von Cheng und Prusoff bestimmt. Die Ergebnisse des Bindungsassays sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Die Aktivität der Peptidverbindungen gegenüber u-Rezeptoren wurde unter Anwendung des Meerschweinchen-Ileum (GPI)-Assays (Longitudinalmuskelpräparat) gemäß den Verfahren, die in Schiller et al., Biophys. Res. Commun., 85, S. 1322 (1975) beschrieben werden, durchgeführt. Die Aktivitätsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Beispiel 4

Heizplattenassay (Messung der analgetischen Aktivität), durchgeführt bei 55ºC

Für diesen Assay wurden männliche Mäuse CD Nr. 1 mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g verwendet. Die Mäuse wurden gewogen, markiert und in Gruppen von 10 eingeteilt.
Die Mäuse wurden durch subkutane Injektion der Verbindung (oder des Standards oder des Mediums) bei einem Injektionsvolumen entsprechend 0,1 ml/10 g p. c. (10 ml/kg) behandelt.
Die Mäuse wurden individuell auf die Reaktionszeit auf der Heizplatte bewertet. Die Temperatur der Heizplatte (Sorel, Modell DS37) wurde auf 55ºC eingestellt. Die Mäuse wurden auf Zeichen von Unbehagen, wie Lecken oder Schütteln der Pfoten, Fluchtversuche (Springen von der Platte) oder Zittern beobachtet. Die Reaktionszeit wurde aufgezeichnet, wenn eines dieser Zeichen festgestellt wurde, und wurde in Sekunden festgehalten. Jede Maus wurde für eine maximale Zeitspanne von 30 Sekunden beobachtet, so dass eine Schädigung des Pfotengewebes verhindert wurde.
Für jede Zeitablesung wurde die mittlere Reaktionszeit der Kontrollgruppe mit 1,5 multipliziert. Die Reaktionszeit jeder behandelten Maus wurde mit dem "Kontrollmittelwert · 1,5" verglichen. Wenn die Reaktionszeit schlechter als der "Kontrollmittelwert · 1,5" war, wurde angenommen, dass bei der Maus kein analgetischer Effekt auftrat. Wenn die Reaktionszeit dem "Kontrollmittelwert · 1,5" überlegen war, wurde angenommen, dass die Maus einen analgetischen Effekt hatte. Die Anzahl der analgetischen Mäuse in einer Gruppe bestimmte den analgetischen Prozentsatz der Verbindung für diese Ablesung. Wenn der analgetische Prozentsatz schlechter als 30% war, wurde die Verbindung als inaktiv angesehen.
Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 bis 3 gezeigt.

Beispiel 5

Krümmungsassay

Der Test wurde mit männlichen Mäusen CD Nr. 1 mit einem Gewicht zwischen 18 und 22 g durchgeführt. Die Mäuse wurden gewogen und markiert. Ihnen wurde auf intraperitonealem Weg 0,3 ml/20 g, bezogen auf das Gewicht, eine Lösung von Phenylchinon bei 0,02% injiziert. Die Verrenkungen, die während einer Zeitspanne von 15 Minuten nach der Injektion auftraten, wurden gezählt. Das Phenylchinon wurde zu Zeitpunkten von 5, 20 oder 60 Minuten nach Verabreichung von Verbindung (oder Medium oder Standard) auf subkutanem Weg injiziert.
Die 0,02%ige Phenylchinon (2-Phenyl-1,4-benzochinon; Sigma)-Lösung wurde auf folgende Weise hergestellt. 20 mg Phenylchinon wurden in 5 ml 90%igem Ethanol (Sigma, Reagenz, Alkohol) gelöst.
Das gelöste Phenylchinon wurde langsam zu 95 ml destilliertem Wasser, das kontinuierlich geschüttelt und vorgewärmt (nicht gekocht) war, gegeben. Die Phenylchinonlösung wurde 2 Stunden vor der Verwendung belassen und jederzeit vor Licht geschützt. Eine neue Lösung wurde jeden Tag für den Test hergestellt.
Die Ergebnisse der Assays sind nachstehend in Tabelle 1 zusammengefasst. Es ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäßen Peptidverbindungen, bei denen einer oder beide Reste R&sub3; und R&sub4; für Phe(p-F) stehen, eine größere Selektivität für den u- Opioid-Rezeptor im Vergleich mit den entsprechenden Verbindungen ohne Phe(p-F) sowie eine größere Transduktion des Rezeptors, wie es im GPI-Assay bestimmt wurde, zeigen. Weiter zeigen erfindungsgemäße Verbindungen größere periphere analgetische Aktivität, wie sie im Krümmungsassay bestimmt wird. Tabelle 1

Beispiel 6

Heizplattenassay (Messung der analgetischen Aktivität), durchgeführt bei 58ºC

Für diesen Assay wurden männliche Mäuse NMR1 mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g verwendet. Die Mäuse wurden gewogen, markiert und in Gruppen von 6 eingeteilt.
Die Mäuse wurden durch subkutane Injektion der Verbindung (oder des Standards oder des Mediums) bei einem Injektionsvolumen äquivalent zu 0,1 ml/10 g p. c. (10 ml/kg) behandelt.
Die Mäuse wurden individuell auf die Reaktionszeit auf der Heizplatte bewertet. Die Temperatur der Heizplatte (IITC, Inc.; Modell 35-0) wurde auf 58ºC eingestellt. Die Mäuse wurden auf Zeichen von Unbehagen, wie Lecken oder Schütteln der Pfoten, Fluchtversuche (Springen von der Platte) oder Zittern beobachtet. Die Reaktionszeit wurde aufgezeichnet, wenn eines dieser Zeichen festgestellt wurde, und wurde in Sekunden festgehalten. Jede Maus wurde für eine maximale Zeitspanne von 20 Sekunden beobachtet, so dass eine Schädigung des Pfotengewebes verhindert wurde.
Die Verbindung wurde als analgetisch angesehen, wenn die Reaktionszeit signifikant verschieden (p < 0,05; Zweiweg-ANOVA, Sigma Slot) von der Kontrollgruppe war.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 7

Schwanzschlag-Assay

Für diesen Assay wurden männliche Mäuse NMR1 mit einem Gewicht zwischen 20 und 25 g verwendet. Die Mäuse wurden gewogen, markiert und in Gruppen von 6 eingeteilt.
Die Mäuse wurden durch subkutane Injektion der Verbindungen (oder des Standardmediums) bei einem Injektionsvolumen äquivalent zu 0,1 ml/10 g p. c. (10 ml/kg) behandelt. Die Mäuse wurden einzeln auf die Reaktionszeit im Schwanzschlag-Test bewertet. Die Latenz gegenüber dem Schlagen des Schwanzes wurde gemessen, wenn ein Rheostat-gesteuerter Lichtstrahl auf die Spitze des Schwanzes gerichtet war (IITC Inc., Modell 33). Die einzelnen Mäuse wurden für eine maximale Zeitspanne von 10 Sekunden beobachtet, so dass eine Schädigung des Gewebes verhindert wurde.
Die Verbindung wurde als analgetisch angesehen, wenn die Reaktionszeit signifikant verschieden p < 0,05; Zweiweg-ANOVA, Sigma Stat) von der Kontrollgruppe war.
Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.

Claims

1. Verbindung der Formel (1):

und deren Salze, wobei

R&sub1; für Tyr oder 2',6'-Dimethyltyrosin steht;

R&sub2; für D-Ala oder D-Arg steht;

R&sub3; für Phe(p-F) steht;

R&sub4; für Phe oder Phe(p-F) steht;

X für H oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl steht; und

Y und Z unabhängig für H oder C&sub1;&submin;&sub6;Alkyl stehen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub2; für D-Ala steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub2; für D-Arg steht.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R&sub4; für Phe steht.

5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei R&sub2; für D-Ala steht.

6. Verbindung nach Anspruch 4, wobei R&sub2; für D-Arg steht.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei X für H steht und Y und Z beide für H stehen.

8. Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt unter:

H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH&sub2;;

und

H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;.

9. Die Verbindung H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2; und deren Salze.

10. Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt unter:

H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH&sub2;;

und

H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;.

11. Die Verbindung H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2; und deren Salze.

12. Das Hydrochloridsalz der Verbindung H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH&sub2;.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 und 12 in Abmischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 7 in Abmischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

15. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 und 12 zur Herstellung einer bei der Behandlung von Schmerzen wirksamen Formulierung.

16. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 7 zur Herstellung einer bei der Behandlung von Schmerzen wirksamen Formulierung.

17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 unter Anwendung von Festphasensynthese.