SK282469B6

SK282469B6 - Opiátové peptidy, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a ich použitie

Info

Publication number: SK282469B6
Application number: SK203-98A
Authority: SK
Inventors: Wuyi Wang
Original assignee: Astra Aktiebolag
Priority date: 1995-08-18
Filing date: 1996-08-14
Publication date: 2002-02-05
Also published as: NZ315809A; DK0845003T3; CZ40198A3; DE69617699D1; IS4664A; CN1200127A; IL123258A; TR199800258T1; AU711862B2; AR003475A1; NO980592L; ES2171224T3; NO980592D0; WO1997007130A1; DE69617699T2; AU6760096A; PL325113A1; US6337319B1; TW424095B; SE9503924D0

Abstract

Sú opísané opiátové peptidy všeobecného vzorca (I), kde R1 je Tyr alebo 2',6'-dimetyltyrozín, alebo jeho analóg alebo derivát; R2 je D-Ala alebo D-Arg; R3 je Phe (p-F); R4 je Phe alebo Phe (p-f); X, Y a Z sú atóm vodíka, ich soli, deriváty a analógy, farmaceutické kompozície s ich obsahom a ich použitie na prípravu analgetika na ošetrenie bolesti. Peptidy podľa tohto vynálezu majú vysoký stupeň selektivity k mí-opiátovým receptorom. Sú vhodné najmä ako analgetické látky pôsobiace prevažne na mí-opiátových receptoroch, pôsobia periférne, tak sa vyhýbajú nežiaducim účinkom vznikajúcim pri centrálnej analgézii.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka peptidových zlúčenín podobných opiátom, najmä tých, ktoré majú periférnu analgetickú aktivitu a selektivitu pre μ podtyp opiátových receptorov. Vynález sa ďalej týka farmaceutickej kompozície s ich obsahom a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Mnoho endogénnych peptidov cicavčieho aj obojživelného pôvodu sa viaže k špecifickým opiátovým receptorom a vyvoláva analgetickú odpoveď podobnú klasickým narkotickým opiátom. Dokázalo sa, že u vyšších živočíchov koexistuje mnoho odlišných typov opiátových receptorov. Príklady pozri W. Martin et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 197, p. 517 (1975); a J. Lord et al., Náture (London), 257, p. 495 (1977). Boli identifikované tri odlišné typy opiátových receptorov. Prvý typ, δ, vykazuje diferencovanú afinitu k peptidom podobným eneefalínu. Druhý typ, μ, vykazuje zvýšenú selektivitu na morfin a iné polycyklické alkaloidy. Tretí typ, k, vykazuje rovnakú afinitu ku každej skupine zmienených ligandov a preferenčnú afinitu na dynorfm. Všeobecne povedané, μ receptory sa zdajú byť viac zapojené do analgetických účinkov, δ receptory majú účinky na správanie, hoci δ a κ receptory sprostredkúvajú tiež analgetické účinky.

Každý opiátový receptor, ak je naň naviazaný opiát, spôsobuje špecifickú biologickú odpoveď podľa typu receptora. Pokiaľ opiát aktivuje viac ako jeden receptor, je ovplyvnená biologická odpoveď každého receptora, čím vznikajú nežiaduce účinky. Čím menej je opiát špecifický a selektívny, tým je po podaní opiátu väčšie riziko objavenia sa nežiaducich účinkov. V predchádzajúcich štúdiách s opiátmi, opiátovými peptidmi a ich analógmi nebola dokázaná, alebo len v obmedzenej miere, selektivita na receptor alebo receptory, ku ktorým sa viažu.

Opiáty môžu spôsobiť vážne a potenciálne fatálne vedľajšie účinky. Vedľajšie účinky ako útlm dýchania, tolerancia, fyzikálna závislosť a syndróm z rýchleho vysadenia sú spôsobené nešpecifickými interakciami s receptormi centrálneho nervového systému. Viac pozri K. Budd, v International Encyclopedia of Pharmacology and Therapeutics; N. E. Wiliams a H. Wilkinson, Eds., Pergammon: (Oxford), 112, str. 51 (1983). Z tohto dôvodu sa nepredpokladá, aby mohli analgetiká účinkujúce predovšetkým prostredníctvom opiátových receptorov periférneho nervového systému spôsobovať podobné nežiaduce účinky, aké sú spojené s podávaním opiátových analgetík ovplyvňujúcich centrálny nervový systém.

Nesteroidné protizápalové látky, ako aspirín, ibuprofén a ketorolak patria dosiaľ do jednej z mála skupín látok, o ktorých je známe, že majú periférne analgetické účinky. Tieto látky neinteragujú s opiátovými receptormi, ale je známe, že inhibujú cyklooxygenázu a znižujú syntézu prostagladínov. Tieto slabé analgetiká nemajú nežiaduce účinky na centrálny nervový systém, ale môžu spôsobiť iné nežiaduce účinky, ako napríklad vznik ulcerácií gastrointestinálneho traktu.

Skôr sa myslelo, že nepoláme peptidy prenikajú do centrálneho nervového systému cez hematoencefalickú bariéru omnoho jednoduchšie ako poláme peptidy. Publikovalo sa, že peptid TAPP (H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH₂) vykazuje antinociceptívne vlastnosti tak periférne, ako aj centrálne (P. Schiller et al., Proceedings of the 20^ώΕω·ορεαη Peptide symposium, 1988). V protiklade s to uto informáciou preukázal vynálezca predloženého vynálezu, že tento tetrapeptid neúčinkuje centrálne dokonca ani v dávkach 100 mg/kg.

Predmetom vynálezu sú peptidové zlúčeniny podobné opiátom, ktoré účinkujú periférne, ale podstatne obmedzujú nežiaduce vedľajšie účinky konvenčných periférne pôsobiacich analgetík. Ďalším predmetom vynálezu sú peptidové zlúčeniny, ktoré sa selektívne viažu k μ-opiátovému receptoru.

Podstata vynálezu

Zhrnutie vynálezu

Predložený vynález poskytuje peptidové zlúčeniny, ktoré účinkujú periférne a sú selektívne k μ-opiátovým receptorom; opiátový peptid vzorca (I) /^ZX-R’-R²-R³-R⁴-N

a jeho soli, deriváty a analógy, kde

R¹ je Tyr alebo 2',6'-dimetyltyrozín, alebo jeho analóg alebo derivát;

R² je D-Ala alebo D-Arg;

R³ je Phe(p-F);

R⁴je Phe alebo Phe (p-f); a

X, Y a Z sú atóm vodíka.

Z iného pohľadu na vynález je tu poskytnutá farmaceutická kompozícia obsahujúca zlúčeninu vzorca (I) v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičom.

Vynález sa ďalej týka použitia zlúčeniny vzorca (I) na prípravu analgetika na ošetrenie bolesti.

Opis vynálezu

V opise vynálezu a v patentových nárokoch sú použité nasledujúce bežné skratky:

Ala - alanín

Arg - arginín

Phe - fenylalanín

Ser - serfn

Tyr - tyrozín

TAPP - H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH₂

GPI - morčacie ileum

MVD - myší semenovod

Phe(p-F) - para-fluoro fenylalanín

HOBT - N-hydroxybenzotiazol

BOP - benzotriazolyl-N-oxytris(dimetylamino)-fosfóniumhexafluorofosfát

DMF - dimetylformamid

TFA - trifluóroctová kyselina tBU - terc-butyl pmc - 2,2,5,7,8 pentametylchróman-6-sulfonyl

FMOC - 9-fluorenylmetyloxykarbonyl

PBQ - fenyl-p-benzoquinón

Termín „ED₅₀“ v tabuľke 1 na PBQ analýzy je definovaný ako dávka lieku, ktorá vyvoláva 50 % zníženie počtu zášklbov v porovnaní s kontrolnou skupinou. Termín „Ki“ v tabuľke 1 väzbovej analýzy je inhibičná konštanta známeho ligandu μ receptora DAMGO a ligandu δ receptora

DADLE. Termín „ki⁸ /Kŕ¹ “ je hodnota používaná ako in2

SK 282469 Β6 dikátor selektivity. Tento pomer vyjadruje vzťah afinitných vlastností opiátových peptidov k väzbe na μ a δ receptory.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sú reprezentované vzorcom (I):

x-r’-r²-r’-r⁴-n

a odvodenými soľami, derivátmi a analógmi.

X je H;

R¹ je Tyr alebo 2',6'-dimetyltyrozín (výhodne Tyr), alfa-amino skupina radikálu R* je nahradená pomocou X a vzniká aminoskupina, kde X je H, alebo alkylaminoskupina, kde X je metyl;

R² je D-Ala alebo D-Arg, (výhodne D-Ala);

R³je Phe(p-F);

R⁴ je Phe alebo Phe(p-F), výhodne Phe;

Y a Z sú atóm vodíka.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu zahŕňajú (ale nie sú týmto obmedzené):

zlúčenina č. 1B zlúčenina č. IC zlúčenina č. 2B a

H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂;

H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂;

H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂;

zlúčenina č. 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH₂.

Výhodné konkrétne formy zlúčenín podľa predloženého vynálezu sú vybrané zo skupín pozostávajúcich z: zlúčenina č. IC H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂;

zlúčenina č. 2C H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH₂.

Najvýhodnejšia zlúčenina podľa predloženého vynálezu je zlúčenina č. IC H-Tyi-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂.

Aminokyselinový derivát 2',6'-dimetyltyrozín (Dmt) sa môže nahradiť tyrozínom v zlúčeninách opiátových peptidov. Experimenty preukázali, že substitúcia Dmt tyrozínom v R* pozícii prvého aminokyselinového rezídua vo všeobecnom vzorci (I) zvyšuje účinnosť opiátového peptidu na μ receptore o 2 rády. Selektivita k μ receptoru sa zvyšuje, pokiaľ zlúčenina obsahuje Dmt v pozícii R¹. Táto substitúcia spôsobuje korešpondujúci posun v pomere väzbových inhibičných konštánt k zvýšenej selektivite k μ receptoru.

Opiátová aktivita peptidov sa posudzovala in vitro s použitím pozdĺžneho svalstva morčacieho ilea (GPI) a ich antinociceptívna aktivita sa určila in vivo na hlodavcoch na modeloch pomocou PBQ vyvolaných zášklbov (periférna aktivita) a na 2 testoch s horúcou platničkou (centrálna aktivita). Analgetická aktivita zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa hodnotila tiež pomocou tail-flick testu. Tento test je používaný na hodnotenie centrálnej analgetickej aktivity zlúčeniny. Porovnanie aktivít zlúčenín podľa predloženého vynálezu v testoch vyvolania zášklbov, s horúcou platničkou a v tail-flick teste preukázalo, že analgetické účinky boli prevažne sprostredkované na periférii. Periférna analgézia sa preukázala vysokou účinnosťou v teste vyvolania zášklbov spolu s nízkou účinnosťou v testoch s horúcou platničkou alebo v tail-flick teste.

PBQ (fenyl-p-benzochinón) indukoval u myší zášklby pri posudzovaní tak centrálnej, ako aj periférnej analgézie. Experimentálny protokol pozri Sigmund et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 95, str. 729 (1957), je tu začlenený ako referencia. Centrálna analgézia je určená inhibíciou odpovede na horúcu platničku u myší. Experimentálny protokol pozri

G. Wolfe a A. MacDonald, J. Pharmacol. Exp. Ther., 80, str. 300 (1944), je tu začlenený ako referencia. Analýza merania väzbových afinít opiátových receptorov μ a δ, práve tak ako GPI test sa uskutočnili podľa experimentálneho protokolu, pozri Schiller et al., Biophys. Res. Commun., 85, str. 1322 (1975), ktorý je tu začlenený ako referencia.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu pripraviť metódami dobre známymi v peptidovej chémii. Napríklad, pozri Principle of Peptide synthesis, Bodansky M., Spinger-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo 1984, alebo pozri The Peptides, Analysis, Synthesil, Biology, vydaného Erhardom Grossom a Johannesom Meinehoferom, Academic Press 1979.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa pripravili použitím syntézy pevnej fázy, ako je opísané ďalej, podľa zaužívaných postupov v peptidovej chémii. V príslušnom kroku syntézy bol použitý komerčne dostupný para-fluorofenylalanín (Phe(p-F)). 2',6'-Dimetyltyrozín sa môže v syntéze tiež použiť a je pripravený podľa zaužívaných techník chemickej syntézy.

Farmaceutický prijateľné soli peptidov podľa tohto vynálezu sa môžu vytvoriť konvenčné reakciou s príslušnou kyselinou. Vhodné soli kyselín sa môžu pripraviť pridaním kyselín, ako sú kyseliny chlorovodíková, bromovodíková, fosforečná, octová, fumarová, salicylová, citrónová, mliečna, mandľová, vínna, šťaveľová, metánsulfónová, alebo iné vhodné kyseliny, ktoré sa môžu použiť skúseným biochemikom.

Predložený vynález zahŕňa tiež farmaceutické kompozície. Vhodné kompozície majú farmaceutický účinné množstvo zlúčenín podľa predloženého vynálezu, alebo ich farmaceutický prijateľných solí, v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičom alebo adjuvans. Terapeuticky účinné množstvo peptidu podľa predloženého vynálezu a farmaceutický prijateľný nosič (napr. uhličitan horečnatý alebo laktóza) sa môžu navrhnúť tak, aby vytvorili terapeutickú formu, ako napríklad (i) pilulku, tabletu, kapsulu, alebo tekutinu na perorálne podanie; (ii) tekutinu alebo masť, ktoré sa môžu podať inhaláciou, transdermálne, nazálne, rektálne alebo sublingválne; (iii) tekutinu, ktorá sa môže podať intravenózne, parenterálne, subkutánne, alebo intraperitoneálne; alebo (iv) perorálnu alebo parenterálnu formu s postupným uvoľňovaním.

Predložený vynález zahŕňa tiež použitie zlúčenín podľa vynálezu na prípravu analgetika na ošetrenie bolesti. Cicavcovi, vrátane človeka, sa podáva farmaceutický účinné množstvo peptidu definovaného vzorcom (I) alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli, resp. farmaceutická kompozícia s ich obsahom v jednej z tradičných foriem na podanie napr. orálne, parenterálne, transdermálne, transmukozálne, vo forme postupného uvoľňovania s použitím biodegradabilného biokompatibilného polyméru, alebo vo forme na doručenie lieku na špecifické miesto s použitím miciel, gélov a lipozómov. Peptidy sa môžu podať ľudskému pacientovi v dávke 0,01 až 100 mg/kg, výhodne 0,05 až 20 mg/kg a najvýhodnejšie v dávke 0,1 až 1 mg/kg.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1, 2 a 4 ilustrujú analgetickú aktivitu zlúčenín podľa predloženého vynálezu v dvoch odlišných testoch s horúcou platničkou.

Obrázok 1 znázorňuje meranie analgetickej aktivity zlúčeniny č. 1B, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂, a zlúčeniny č. 2B, ktorou je H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂, v teste s horúcou platničkou.

Obrázok 2 znázorňuje meranie analgetickej aktivity zlúčeniny č. IC, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH2, a zlúčeniny č. 2C, ktorou je H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH₂, v teste s horúcou platničkou.

SK 282469 Β6

Obrázok 4 znázorňuje meranie analgetickej aktivity zlúčeniny č. IB, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂, a zlúčeniny č. IC, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂, s. c. u myší v teste s horúcou platničkou.

Obrázok 3 znázorňuje meranie analgetickej aktivity zlúčeniny č. IA, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH₂, v teste s horúcou platničkou.

Obrázok 5 znázorňuje meranie analgetickej aktivity zlúčeniny č. IB, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂, a zlúčeniny č. IC, ktorou je H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂, s. c. u myší v tail-flick teste.

Nasledujúce príklady sú použité na lepší opis vynálezu. Tieto príklady majú len ilustračný charakter a v nijakom prípade neobmedzujú rozsah vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava zlúčeniny IC H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂

Syntetický peptid sa pripravil s použitím Knorrovej živice. Použité aminokyseliny mali aminoskupiny chránené pomocou Fmoc a tyrozínový vedľajší reťazec chránený pomocou tBu. Dimetylformamid použitý v spojovacom kroku sa zbavil dimetylamínu. DMF použitý v premývacích krokoch a TFA mali čistotu Biograde. Na purifikačný krok sa použila voda purifikovaná pomocou USP a acetonitril na HPLC. Všetky zvyšné rozpúšťadlá mali čistotu ACS a použili sa bez ďalšej purifíkácie. Syntéza pevnej fázy sa uskutočnila manuálne na živici so záťažou 0,84 mmol/g. Kondenzácia peptidu sa uskutočnila s použitím 1,5 až 2 ekvivalentov každej Fmoc aminokyseliny, HOBT a BOP v DMF počas 3 - 24 hodín pri laboratórnej teplote. Alfa amino Fmoc deprotekčné kroky sa uskutočnili s použitím 20 % (v/v) piperidínu v DMF počas 25 minút. Štiepenie peptidu a deprotekcia vedľajšieho reťazca sa dosiahli reakciou s TFA/CH₂Cl₂/anizolom. Peptidová živica sa podrobila reakcii s TFA počas 2 x 90 minút, pri laboratórnej teplote a v dusíkovej atmosfére. Po premytí CH₂C1₂ a odparení sa rezíduum podrobilo reakcii s etyléterom, precipitát sa sfiltroval a vysušil vo vákuu. Získaný surový peptid sa purifikoval pomocou HPLC na C_I810 μ -15 μ 300A reverznom stĺpci s gradientovou elúciou s použitím 0,06 % zmesi TFA/H₂O a 0,06 % zmesi TFA/acetonitril. Sledovanie sa uskutočňovalo pri 220 nm. Čisté frakcie sa zbierali a lyofilizovali. Purifikovaný materiál sa previedol do formy hydrochloridnej soli tak, že vznikla čistá zlúčenina uvedená v titulku.

Podobným spôsobom sa syntetizovali tiež nasledujúce peptidy:

Zlúčenina IA H-Tyr-D-Ala-Phe-Phe-NH₂; Zlúčenina IB H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂;

Príklad 2

Príprava zlúčeniny 2C H-Tyr-D-ARg-Phe(p-F)-Phe-NH₂

Syntetický peptid sa pripravil s použitím Knorrovej živice. Použité aminokyseliny mali aminoskupiny chránené pomocou Fmoc a nasledujúce vedľajšie reťazce sa chránili takto: (Pmc) pre D-Arginín, tBu pre Tyrozín. Dimetylformamid použitý v spojovacom kroku sa zbavil dimetylamínu. DMF použitý v premývacích krokoch a TFA mali čistotu Biograde. Na purifikačný krok sa použila voda purifikovaná pomocou USP a acetonitril na HPLC. Všetky zvyš né rozpúšťadlá mali čistotu ACS a použili sa bez ďalšej purifíkácie.

Syntéza pevnej fázy sa uskutočnila manuálne na živici so záťažou 0,84 mmol/g. Kondenzácia peptidu sa uskutočnila s použitím 2 ekvivalentov každej Fmoc aminokyseliny, HOBT a BOP v DMF počas 2 - 5 hodín pri laboratórnej teplote. Alfa amino Fmoc deprotekčné kroky sa uskutočnili s použitím 20 % (v/v) piperidínu v DMF počas 25 minút. Štiepenie peptidu a deprotekcia vedľajšieho reťazca sa dosiahli reakciou s TFA/CH₂Cl₂/anizolom. Peptidová živica sa podrobila reakcii s TFA počas 2 x 90 minút, pri laboratórnej teplote a v dusíkovej atmosfére. Po premytí CH₂C1₂ a odparení sa rezíduum podrobilo reakcii s etyléterom, precipitát sa sfiltroval a vysušil vo vákuu.

Získaný surový peptid sa purifikoval pomocou HPLC na Cis 10 μ - 15 μ 300A reverznom stĺpci s gradientovou elúciou s použitím 0,06 % zmesi TFA/H₂O a 0,06 % zmesi TFA/acetonitril. Sledovanie sa uskutočňovalo pri 220 nm. Čisté frakcie sa zbierali a lyofilizovali.

Podobným spôsobom sa syntetizovali tiež nasledujúce peptidy:

2A H-Tyr-D-Arg-Phe-Phe-NH₂;

2B H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂;

Príklad 3

Analýza väzby rádioligandu

Príprava membrány

Samce Sprague-Dawleyho krýs vážiace medzi 350 - 450 g boli usmrtené inhaláciou CO₂. Krysy sa dekapitovali a mozgy bez mozočku vybrali a umiestnili do ľadového fyziologického roztoku a potom sa homogenizovali v ľadovom 50 mM Tris pufri s pH 7,4 (10 ml/mozog). Membrány sa centrifugovali pri 14000 ot./min. počas 30 minút pri teplote 4 °C. Pelety sa resuspendovali v približne 6 ml/mozog ľadového Tris pufra 50 mM, pH 7,4 a skladovali pri -78 °C až pokiaľ sa pripravili na použitie. Kvantifikácia proteínu homogenátu mozgu sa uskutočnila podľa zakúpeného kitu na stanovenie proteínov (Bio-Rad).

Inhibícia rádioligandov (³H)-DAMGO a (³H)-DAGLE sa použili ako rádioligandy na μ a κ receptory, respektíve 50 μΐ rádioligandu, 100 μΐ membrán a sériovo nariedená testovaná zlúčenina sa inkubovali počas 1 hodiny pri 22 °C. Nešpecifická väzba sa určila s použitím 500-násobného prebytku neznačeného ligandu v prítomnosti značenej látky a membrán. Voľný ligand sa odseparoval od nadväzného ligandu filtráciou cez Whatman GF/B filtračný papier (vopred nasiaknutý 1 % vodným roztokom polyetylénimínu) a premytím ľadovým 50 mM Tris pufrom s pH 7,4 s použitím Brandelovho bunkového zberača. Filtre sa vysušili a rádioaktivita spočítaná v 24-jamkovej mikrodoske v prítomnosti 500 ml scintilačnej látky na jednu jamku. Rádioaktivita sa merala s použitím počítača Wallac 1450 Microbeta.

Ki pre rôzne zlúčeniny sa určili z IC₅o podľa rovnice Chenga a Prusoffa. Výsledky väzbovej analýzy sú zhrnuté v tabuľke L

Aktivita peptidových zlúčenín k μ receptorom sa určila použitím testu s morčacím ileom (GPI) (preparát pozdĺžneho svalu) podľa postupov opísaných v Schiller et al., Biophys. Res. Commun., 85, str. 1322 (1975). Výsledky aktivity sú zhrnuté v tabuľke L

SK 282469 Β6

Príklad 4

Test s horúcou platničkou (meranie analgetickej aktivity) sa uskutočnil pri 55 °C. Na tento test sa použili CDč. 1 samce myší vážiace medzi 20 a 25 g. Myši sa odvážili, označili a rozdelili do skupín po 10.

Myšiam sa aplikovala subkutánnou injekciou zlúčenina (alebo štandard alebo médium) v injekčnom objeme ekvivalentnému 0,1 ml/10 g p. c. (10 ml/kg).

Reakčný čas na horúcej platničke sa vyhodnotil individuálne pre každú myš. Teplota platničky (Sorel, model DS 37) sa nastavila na 55 °C. U myší sa pozorovali príznaky diskomfortu, ako napríklad lízanie alebo trasenie labiek, pokus utiecť (vyskakovanie z platničky) alebo chvenie. Reakčný čas sa započítal po objavení sa prvého z týchto príznakov a zaznamenal sa v „sekundách“. Každá myš sa pozorovala počas maximálne 30 sekúnd, aby sa zabránilo poškodeniu tkaniva labiek.

Pri každom odčítaní sa priemerný reakčný čas kontrolnej skupiny násobil faktorom 1,5. Reakčný čas každej skúmanej myši sa porovnal s hodnotou „priemeru kontrol x x 1,5“. Pokiaľ bol reakčný čas pod hodnotou „priemer kontrol x 1,5“, bola myš považovaná za takú, u ktorej analgetický efekt nenastal. Pokiaľ bol reakčný čas nad hodnotou „priemer kontrol x 1,5“, bola myš považovaná za takú, u ktorej analgetický efekt nastal. Podľa počtu myší s analgetickým účinkom sa pre každú skupinu vypočítalo percento analgézie pre danú zlúčeninu. Pokiaľ bolo percento analgézie pod 30 %, zlúčenina sa považovala za neaktívnu. Výsledky sú zobrazené na obrázkoch 1 a 3.

Príklad 5

Test vyvolania zvíjania

Test sa uskutočnil na CD č. 1 samcoch myší vážiacich medzi 18 a 22 g. Myši sa odvážili a označili. Intraperitoneálnou cestou im bol injikovaný roztok 0,02 % fenylchinónu v množstve 0,3 ml/20 g váhy. Počítalo sa objavenie sa skrútenia častí tela v priebehu 15 minút. Fenylchinón sa injikoval v časových intervaloch 5, 20 alebo 60 minút po podaní zlúčeniny (alebo média alebo štandardu) subkutánnou cestou.

Roztok 0,02 % fenylchinónu (2-fenyl-l,4-benzochinón, Sigma) sa pripravil nasledujúcim spôsobom. 20 mg fenylchinónu sa rozpustilo v 5 ml 90 % etanolu (sigma, reagens, alkohol). Rozpustený fenylchinón sa pomaly, pri stálom miešaní pridal k 95 ml predhriatej (nie vriacej) destilovanej vody. Roztok fenylchinónu sa nechal pred použitím 2 hodiny stáť a chránil sa proti prístupu svetla. Každý deň sa pripravoval na test nový roztok.

Výsledky testov sú zhrnuté ďalej v tabuľke 1. Vidieť, že peptidové zlúčeniny predloženého vynálezu, kde buď jeden alebo obidva R³ a R⁴ sú Phe(p-F), vykazujú vyššiu selektivitu na μ opiátové receptory v porovnaní s korešpondujúcou zlúčeninou bez Phe(p-F), rovnako tak ako vykazujú vyššiu transdukciu receptora, ako bolo určené v teste GPI. Ďalej vykazujú zlúčeniny predloženého vynálezu vyššiu periférnu analgetickú aktivitu, ako sa preukázalo v teste vyvolávania zvíjania.

Tabuľka 1

Príklad	tixford analýza	ŕrfanit	GPI
	Κ₄μ (nM)	K,ä (nM)	Κ,δ/Κ,μ		IC_w(nM)
IA	1,53	625,8	409	1/4	3
IB	0/2	199,6	998	0/2	0,12
IC	0,36	201,2	559	0,5
2A	0.69	1 652,6	2 430	0,5	6,7
2B	0,22	>1000		0/3
2C	0,57	952,5	1 671	0,3	1,52

Príklad 6

Test s horúcou platničkou (meranie analgetickej aktivity) sa uskutočňoval pri 58 °C. Na tento test sa použili NMR1 samce myší vážiace medzi 20 a 25 g. Myši sa odvážili, označili a rozdelili do skupín po 6.

Myšiam sa aplikovala subkutánnou injekciou zlúčenina (alebo štandard alebo médium) v injekčnom objeme ekvivalentu 0,1 ml/10 g p. c. (10 ml/kg).

Reakčný čas na horúcej platničke sa vyhodnotil individuálne pre každú myš. Teplota platničky (IITC, Inc; Model 35-0) sa nastavila na 58 °C. U myší sa pozorovali príznaky diskomfortu, ako napríklad lízanie alebo trasenie labiek, pokus utiecť (vyskakovanie z platničky) alebo chvenie. Reakčný čas sa započítal po objavení sa prvého z týchto príznakov a zaznamenal v „sekundách“. Každá myš sa pozorovala počas maximálne 20 sekúnd, aby sa zabránilo poškodeniu tkaniva labiek.

Zlúčenina sa hodnotila ako majúca analgetický účinok, pokiaľ sa reakčný čas odlišoval významne (p < 0,05; two way ANOVA, sigma slot) od kontrolnej skupiny.

Výsledky sú uvedené na obrázku 4.

Príklad 7

Tail-flick test (test trhnutia chvostom)

Na tento test sa použili NMR1 samce myší vážiace medzi 20 a 25 g. Myši sa odvážili, označili a rozdelili do skupín po 6.

Myšiam sa aplikovali subkutánnou injekciou zlúčeniny (alebo štandardné médium) v injekčnom objeme ekvivalentnému 0,1 ml/10 g p. c. (10 ml/kg).

Reakčný čas v tail-flick teste sa vyhodnotil individuálne pre každú myš. Latencia v trhnutí chvostom sa merala po namierení reostatom kontrolovaného svetelného lúča na koniec chvosta (IITC, Inc; Model 33). Každá myš sa pozorovala počas maximálne 10 sekúnd, aby sa zabránilo poškodeniu tkaniva. Zlúčenina sa hodnotila ako majúca analgetický efekt, pokiaľ sa reakčný čas odlišoval významne (p < 0,05; two way ANOVA, Sigma Stat) od kontrolnej skupiny.

Výsledky sú uvedené na obrázku 5.

SK 282469 Β6

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Opiátové peptidy vzorca (I) x-r'-r²-r³-r⁴-n / a jeho soli, deriváty a analógy, kde

R¹ je Tyr alebo 2',6'-dimetyltyrozín, alebo jeho analóg alebo derivát;

R²je D-Ala alebo D-Arg;

R³ je Phe(p-F);

R⁴ je Phe alebo Phe (p-f); a

X, Y a Z sú atóm vodíka.
2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R² je D-Ala.
3. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R² je D-Arg.
4. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R⁴ je Phe.
5. Zlúčenina podľa nároku 4, kde R² je D-Ala.
6. Zlúčenina podľa nároku 4, kde R² je D-Arg.
7. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorá je vybraná z:

H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂;

a H-Tyr-D-Ala-Phe(p-F)-Phe-NH₂.
8. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorá je vybraná z:

H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe(p-F)-NH₂; a H-Tyr-D-Arg-Phe(p-F)-Phe-NH₂.
9. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje zlúčeninu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičom.
10. Použitie zlúčeniny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8 na prípravu analgetika na ošetrenie bolesti.