DE69534429T2 - Verfahren und vorrichtung zur durchführung automatischer analysen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND
  • Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Partikelanalyse. Ausdrücklicher betrifft sie Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung automatisierter Blutzellanalysen, indem "Impedanzanalyse", "Lichtstreuungsanalyse" und "Fluoreszenzanalyse" sowie Durchflusszytometrieverfahren zu einem Ganzen zusammengefasst werden. Diese Erfindung betrifft auch ein Mehrzweckreagenzsystem und ein Verfahren zur schnellen Analyse einer Vollblutprobe.
  • Peripheres Blut von einem Menschen enthält normalerweise rote Blutkörperchen (RBC), Blutplättchen (PLT) und weiße Blutkörperchen (WBC), welche alle in einem leitenden Medium suspendiert sind, das für gewöhnlich als Plasma bekannt ist. Plasma umfasst Proteine, Anionen und Kationen. Plasma enthält außerdem Komponenten, welche die Bildung von Blutgerinnseln unterstützen.
  • Das Blut eines Erwachsenen enthält normalerweise etwa 4,5 bis 5 Millionen RBCs oder Erythrozyten pro Kubikmillimeter. Reife RBCs haben keine Kerne und sind im Allgemeinen als kreisförmige bikonkave Scheiben mit einem Durchmesser von etwa 7,5 bis 8 Mikron (μ) und einer Dicke von etwa 1,5 bis 1,8 Mikron geformt. RBCs enthalten Hämoglobin, welches Blut seine rote Farbe verleiht. Hämoglobin hilft, Sauerstoff und Kohlendioxid zu transportieren, und spielt eine Rolle bei der Aufrechterhaltung des pH-Werts in Blut.
  • Das Blut eines Erwachsenen enthält normalerweise etwa 200.000 bis 400.000 Blutplättchen pro Kubikmillimeter. Blutplättchen sind kleine bikonvexe Zellpartikel, deren mittleres Volumen etwa 7 μl bis 8 μl ist. Ihre allgemeine Konfiguration umfasst einen granulösen mittigen Abschnitt, der in einer homogenen Matrix eingebettet ist.
  • Peripheres Blut enthält außerdem rote Zellen von früheren Reifegraden, welche bedeutende diagnostische Indikatoren sind. Zwei davon sind Retikulozyten und Normoblasten.
  • In der frühesten Stufe der Entwicklung besteht die rote Zelle hauptsächlich aus einem Kern und wird als ein Erythroblast bezeichnet. Wenn der Erythroblast heranreift, wird der Kern kleiner, die Zelle wird kernlos und zunehmend fast kugelförmig. Folglich umfasst die Reifung einen vollständigen Verlust des Kerns. Die unreifen roten Zellen, die einen Kern zurückbehalten, werden als Normoblasten (NRBCs) bezeichnet. Die NRBC-Zahl ist nützlich gewesen bei der Patientenüberwachung unter vielen Krankheitszuständen. Jedoch tragen NRBCs in peripherem Blut oftmals zu einer ungenauen Zählung der weißen Zellzahl bei, teilweise wegen der Anwesenheit eines Zellkerns, welcher es schwierig macht, sie von kleinen weißen Zellen zu unterscheiden. Retikulozyten sind rote Zellen in dem Reifungsgrad gerade zwischen NRBCs und reifen RBCs. Retikulozyten stellen ein Mittel bereit zur Evaluierung des anämischen Zustandes eines Patienten. Anämie kommt normalerweise vor als ein Ergebnis einer unausgeglichenen Erhöhung der Geschwindigkeit der Entfernung von Erythrozyten aus Blut, oder einer Erniedrigung der Geschwindigkeit, mit welcher sie gebildet und in das Blut freigesetzt werden. Eine erhöhte Retikulozytenpatientenzahl bei einem anämischen Patienten zeigt den schnellen Erythrozytenumsatz an, welcher auf einen akuten Blutverlust oder Hämolyse schließen lässt.
  • In normalem menschlichen Blut ist die Konzentration von weißen Blutkörperchen, die als WBCs oder Leukozyten bezeichnet werden, viel geringer als die Konzentration von roten Zellen. Die normale Konzentration von WBCs ist ungefähr 7000 pro Mikroliter. Sie variieren in der Größe, die meisten von etwa 7,5 bis 12,5 Mikron im Durchmesser. Sie sind eher fast kugelförmig in der Form als RBCs und normalerweise etwas größer vom Volumen. WBCs können generell als entweder granulös oder nicht-granulös klassifiziert werden. Die granulösen WBCs umfassen Neutrophile, Eosinophile und Basophile. Die nicht-granulösen WBCs umfassen Monozyten und Lymphozyten. Diese Kategorien von WBCs werden häufig kollektiv als ein "Fünf-Teile-Differential" bezeichnet, und im Allgemeinen sind die signifikantesten dieser Kategorien Neutrophile und Lymphozyten.
  • Neutrophile umfassen normalerweise etwa 50 bis 60% aller WBCs. Ihr Zytoplasma enthält zahlreiche winzige Granula, welche angefärbt werden können. Unter bestimmten Bedingungen können Neutrophile die Blutgefäße verlassen und sich auflösen, wodurch Granula in das Bindegeweben freigesetzt werden. Diese Granula sind reich an bestimmten Enzymen, welche aktiv sind und an dem Abwehrmechanismus des Körpers teilnehmen.
  • Lymphozyten umfassen etwa 30% der WBCs bei Menschen. Der Kern eines normalen Lymphozyten belegt nahezu das gesamte Zellvolumen, und folglich ist das Zytoplasma, das den Kern umgibt, eine ziemlich dünne Hülle. Lymphozytenzytoplasma kann wegen des Gehalts an Ribonukleinsäure des Zytoplasmas mit Farbstoffen angefärbt werden.
  • Lymphozyten können die Blutgefäße verlassen und in das Bindegewebe eindringen, wo sie ebenfalls einen Teil des Abwehrmechanismus des Körpers bilden, wobei sie eine Hauptrolle bei den Immunantworten des Körpers spielen.
  • Es gibt drei "Hauptsubsets" von Lymphozyten, die derzeit klinisch bedeutend sind: T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und natürliche Killerzellen, auch bekannt als "große granulöse Lymphozyten" oder NK-Zellen. Jeder dieser Subsets kann auf der Grundlage der Existenz von charakteristischen Zelloberflächenmarkern oder -antigenen unterschieden werden. Außerdem haben B-Lymphozyten eine hohe Dichte an Immunglobulin von ihren Oberflächen, während T-Lymphozyten wenig oder gar keins aufweisen. T-Lymphozyten werden durch verschiedene Oberflächenmarker gekennzeichnet, gegen welche Antikörper gebildet werden können.
  • Kategorien von T-Lymphozyten sind gemäß ihrer Oberflächenmarker und ihrer Gesamtfunktion identifiziert worden. Die "Helfer-T- Zellen" helfen B-Zellen, bestimmte Klassen von Antikörpermolekülen zu produzieren, und helfen anderen T-Zellen bei ihren Immunantworten. Die "Suppressor-T-Zellen" sind Regulationszellen, die die Reaktionsfähigkeit von anderen T- oder B-Zellen unterdrücken können. Die Suppressor-T-Zellen umfassen mehrere Subsets, welche ebenfalls durch unterschiedliche Oberflächenmarker erkannt werden.
  • Die Fähigkeit, Blutkörperchen zu zählen, zu klassieren und zu klassifizieren ist nützlich beim Beurteilen der Gesundheit eines Individuums. Zum Beispiel wird der Spiegel von zirkulierenden CD4-Lymphozyten (Helfer-T-Zellen mit einem CD4-Antigen, das auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird) zur Zeit als die beste einzelne Vorhersagegröße für den Fortschritt von HIV-Infektionen betrachtet. Der CD4-Spiegel kann verwendet werden, um Individuen für die Aufnahme in experimentelle Behandlungssysteme zu klassifizieren, um zu bestimmen, wann mit einer Antivirustherapie begonnen werden sollte, und um die Behandlungsreaktionen in klinischen Versuchen zu überwachen. Da CD4-Lymphozytenspiegel für einige HIV-infizierte Individuen wichtig sein können, ist es wünschenswert, diesen Parameter genau zu messen.
  • Nach dem aktuellen Stand der Technik der Zellanalyse werden zwei Techniken zum Zählen und Klassifizieren von Zellen verwendet. Diese sind allgemein als "Durchflusszytometrie" und "Bildzytometrie" bekannt. Die Durchflusszytometrietechnik, welche im Wesentlichen darin besteht, dass Zellen jeweils eine nach der anderen durch eine Messzone einer Durchflusszelle hindurchgelassen werden, wird in klinischen Anwendungen bevorzugt, wo die Patiententestbelastung ein wichtiges Maß ist. Hauptsächlich deshalb, da sie mindestens den Vorteil von einer Größenordnung bei der Zahl der Zellen besitzt, die pro Sekunde analysiert werden können.
  • Die Instrumentierung, bei der Durchflusszytometrie eingliedert ist, kann weiter unterteilt werden in zwei Verfahren, welche allgemein klassifiziert werden können als "konventionelle Hämatologie" und "Fluoreszenzzytometrie".
  • Eine erste Unterscheidung zwischen den zwei Verfahren ist, dass konventionelle Hämatologie allgemein Zellen durch Größe und Form allein unter Verwendung von primär Impedanz- und Lichtstreuungsverfahren unterscheidet, während Fluoreszenzzytometrie Zellnukleinsäuregehalt und/oder Oberflächenantigene zusätzlich zu Größe und Form beim Unterscheiden von Zellen verwendet. Deshalb kann das Fluoreszenzverfahren verwendet werden, um die Zelltypen in feinere Klassifikationen zu unterteilen.
  • Eine zweite Unterscheidung zwischen den zwei Verfahren ist, dass konventionelle Hämatologie Ergebnisse in absoluter Form ergibt, während Fluoreszenzzytometrieergebnisse in relativer Form vorliegen. Hämatologieanalysatoren liefern genaue Volumen und Verdünnungen und sind deshalb in der Lage, absolute Zellkonzentrationen zu messen oder absolute Zahlen für Zelltypen pro Mikroliter menschlichem Blut. Das Fluoreszenzzytometrieverfahren ergibt nur relative Konzentrationen oder prozentuale Anteile der verschiedenen Zelltypen.
  • Eine dritte Unterscheidung ist, dass das Hämatologieverfahren im Allgemeinen automatisiert ist, während das Fluoreszenzzytometrieverfahren, wie es heute im Allgemeinen praktisch ausgeführt wird, bestenfalls halbautomatisiert ist, sowohl bei der Probenvorbereitung als auch bei der Probenanalyse. Das Fluoreszenzzytometrieverfahren ist deshalb bedeutend arbeitsintensiver als das Hämatologieverfahren.
  • Beide Verfahren benutzen Zelle-für-Zelle-Analyse. Deshalb ist es wegen der hohen Konzentration von Zellen in Vollblut notwendig, die Blutproben vor der Analyse zu verdünnen, so dass einzelne Zellen zum Erfassen innerhalb einer Durchflusszelle isoliert werden können.
  • Ein Beispiel für ein Instrument zur Durchführung automatisierter Hämatologiemessungen ist das Instrument Cell-Dyn® 3000, welches mehrere Jahre lang von Sequoia-Turner verkauft wurde, einem Rechtsvorgänger von Abbott Laboratories. WO 93/16384 umfasst eine ausführliche Offenbarung von diesem Instrument und von einem Verfahren zum Zählen und selektiv Qualifizieren heterogener Zellpopulationen unter zytolytischen Verarbeitungsbedingungen. Das Instrument Cell Dyn® 3000 verwendet "Impedanzmessungen", um RBCs und PLTs zu zählen und zu klassieren, "Absorptionsmessungen", um die Konzentration von Hämoglobin in RBCs (MCH) zu bestimmen, und "optische Streuungsmessungen", um WBCs und das Fünf-Teile-Differential zu zählen und zu klassifizieren.
  • Das Instrument Cell-Dyn® 3000 bereitet Blutproben automatisch vor, misst Zellparameter und generiert Testergebnisse. Die vollständige Automatisierung der Probenvorbereitung erfolgt so, dass kein wesentlicher Bedienereingriff notwendig ist, sobald die Patientenprobe von Vollblut dem Analysator präsentiert worden ist. Wie zuvor erwähnt liefert das Instrument Cell-Dyn® 3000 exakte Probenvolumina, Reagenzvolumina und Verdünnungsvolumina, um genaue "Patientenzahlen" für die verschiedenen Zellklassen sicherzustellen. Patientenzahlen sind allgemein definiert als die Zahl der "Ereignisse" pro Mikroliter Blut. Die Ereignisse können RBCs, PLTs, WBCs und Klassen oder Subklassen davon sein.
  • Andere kommerziell erhältliche Geräte zur Durchführung von Hämatologiemessungen umfassen den Coulter® STKR, den Sysmex® NE8000 und den Technicon® H-1. Jedes dieser Geräte verwendet Kombinationen aus Streuung, Impedanz und Absorption, um Zellen zu unterscheiden und zu quantifizieren, und kann folglich als ein herkömmliches Hämatologiemessgerät klassifiziert werden.
  • Im Gegensatz dazu sind im Fluoreszenzdurchflusszytometer die Prinzipien der Fluoreszenzzellanalyse mit Lichtstreuung vereinigt. Im Allgemeinen erfordert das, dass die Zelle mit einem geeigneten Farbstoff angefärbt wird, oder dass ein Fluorochrommarker an ein Antigen oder einen Antikörper auf der Oberfläche der Zelle angelagert wird und folglich das Auftreten einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion angezeigt wird. Bei der Fluoreszenzdurchflusszytometrie wird eine Suspension von zuvor angefärbten oder fluoreszent markierten Teilchen, typischerweise Zellen in einer Blutprobe oder einer anderen biologischen flüssigen Probe, durch eine Durchflusszelle transportiert, wo die einzelnen Teilchen in der Probe mit einem oder mehreren fokussierten Lichtstrahlen beleuchtet werden. Ein oder mehrere Detektoren erfassen die Wechselwirkung zwischen dem Lichtstrahl und den markierten Teilchen, die durch die Durchflusszelle strömen. Für gewöhnlich sind einige der Detektoren ausgelegt, Fluoreszenzemissionen zu messen, während andere Detektoren Streuungsintensität oder Impulsdauer messen. Folglich kann jedes Teilchen, das durch die Durchflusszelle gelangt, in einem Merkmalsraum abgebildet werden, dessen Achsen die Emissionsfarben, Lichtintensitäten oder andere Eigenschaften, nämlich Streuung, sind, die durch die Detektoren gemessen werden. Vorzugsweise können die unterschiedlichen Teilchen in der Probe in verschiedenen und sich nicht überlappenden Regionen des Merkmalsraums abgebildet werden, was es ermöglicht, dass jedes Teilchen auf der Grundlage seiner Abbildung in dem Merkmalsraum analysiert wird. In dieser Hinsicht unterscheidet sich die Durchflusszytometrie von den herkömmlichen Hämatologieinstrumenten insofern, als dass einige der Merkmalsraumachsen Fluoreszenzemissionen einschließen.
  • Wie oben angemerkt sind Lymphozytensubklassen entscheidende Gesundheitsfaktoren. Daher ist es wünschenswert, dass diese und andere Parameter genau gemessen werden. Wenn auch bekannte Hämatologie- und Fluoreszenzdurchflusszytometrieinstrumente bedeutende Fortschritte gemacht haben bei der Fähigkeit, Blutzellen zu charakterisieren, ist ein Problem, dem man immer noch in dem Bereich gegenübersteht, die Schwierigkeit, genaue Patientenzählwerte für bestimmte Klassen von Zellen zu erhalten. Ein Beispiel für dieses Problem ist die CD4-Zell-Patientenzahl. Aktuelle Analysenverfahren berechnen die CD4-Zell-Patientenzahl aus Zellparametern, die auf einem Hämatologieinstrument und einem separaten Fluoreszenzdurchflusszytometrieinstrument gemessen wurden. Diese Berechnung kann bis zu 100% Schwankung ergeben bei absoluten CD4-Patientenzahlen, die an einem einzigen Individuum im Abstand von einer Woche vorgenommen wurden. Siehe z.B.: Update, Testing In The Blood Bank, Volume 5, Nr. 2, Seite 1 bis 6, veröffentlicht 1991 durch Ortho Diagnostics Systems Inc.
  • Die folgenden Artikel besprechen zusätzliche Schwierigkeiten bei der Bildung von CD4-Patientenzahlen unter Verwendung aktueller
  • Verfahren und Vorrichtungen:
    • – The Lancet, Volume 340, 22. August 1992, Seite 485, beschreibt Schwankungen bei CD4-Zählergebnissen, wenn unterschiedliche Analysatoren verwendet werden. Die Schwankungen scheinen auf unterschiedliche Lymphozytenzählergebnisse zurückzuführen zu sein.
    • – Journal of Infectious Diseases, 1990, Volume 161, Seite 356-357, beschreibt Schwankungen der CD4-Zahl wegen der Variabilität bei der angezeigten Lymphozytenkonzentration. Die resultierende Schwankung bei CD4-Ergebnissen hat eine schädliche Wirkung auf die Moral eines Patienten.
    • – Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 1990, Volume 3, Nr. 2, Seite 144 bis 181, berichtet große Schwankungen bei CD4-Zahlen sowohl für HIV-Positive als auch für Kontrollpersonen. Der Anteil von Lymphozyten, die CD4-positiv sind, ist relativ konstant, während die WBC-Zahl und der Anteil von WBCs, die Lymphozyten sind, stark schwankt. Diese Variabilität verweist auf die Notwendigkeit für standardisierte Analysenverfahren.
    • – Laboratory Medicine, August 1983, Volume 14, Nr. 8, Seite 509 bis 514, bespricht zahlreiche falsche Ergebnisse und deren Ursachen bei automatisierten Hämatologieanalysatoren.
  • Ein Grund für die Variabilität bei CD4-Patientenzahlen ist die Probenvorbereitung von Hand, die nicht genau reguliert werden kann und von der Fertigkeit des Bedieners abhängig ist. Zum Beispiel beginnt ein herkömmliches Verfahren zur Bestimmung einer CD4-Patientenzahl mit der Entnahme von zwei Röhrchen Blut von einem Patienten. Ein Röhrchen wird auf einem Hämatologieinstrument analysiert, welches mehrere gemessene und/oder berechnete Parameter für die Blutprobe bildet, einschließlich eine Gesamtlymphozytenpatientenzahl, einen Lymphozytenanteil und eine Gesamt-WBC-Patientenzahl. Das zweite Röhrchen Blut wird auf einem Fluoreszenzdurchflusszytometrieinstrument analysiert. Die Probenvorbereitungsschritte für die Durchflusszytometrietests sind arbeitsintensiv und bedienerabhängig. Diese Schritte eignen sich nicht ohne weiteres für die Automatisierung und zur Präzision.
  • Um die Probe für das Durchflusszytometrieinstrument vorzubereiten, pipettiert der Bediener ein Volumen Blut aus dem Probenröhrchen in ein Analysenröhrchen. Ein Volumen des gewünschten Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpers wird hinzugegeben. Die Probe/Antikörper-Mischung wird dann eine vorherbestimmten Zeit lang inkubiert bei einer vorherbestimmten Temperatur, um Antikörper/Antigen-Bindungen stattfinden zu lassen. Nach der Inkubation fügt der Bediener ein Volumen RBC-Lysemittel hinzu, um die RBCs in der Probe zu zerstören. Die Wahl des richtigen Zeitpunktes während des Lysestadiums ist wichtig. Wenn der Bediener nicht zulässt, dass sich die Lysereaktion lang genug fortsetzen kann, können RBCs in der Probe verbleiben und die Messungen verzerren. Wenn der Bediener zulässt, dass die Lysereaktion zu lange fortgesetzt wird, kann das Lysemittel die WBCs angreifen.
  • Nach der Bestimmung, dass die Lysereaktion abgeschlossen ist, zentrifugiert der Bediener die Probe und wäscht sie, um alle Bruchstücke zu entfernen, die von lysierten RBCs übriggeblieben sind. Der Zentrifugations-/Waschschritt kann mehrmals durchgeführt werden, bis der Bediener zufriedengestellt ist, dass die Probe genügend rein ist. Bruchstücke, rote "Zellstroma", können die Nachweisverfahren der typischen Durchflusszytometer stören. Die Probe enthält jetzt WBCs mit Antikörper gebunden an Zellen, die die komplementären Oberflächenantigene tragen. Der Bediener resuspendiert die Probe in einem Volumen Fixiermittel und lässt dann die Probe durch das Fluoreszenzdurchflusszytometrieinstrument hindurch.
  • Das Fluoreszenzdurchflusszytometrieinstrument bildet nur Prozentanteilswerte für Lymphozytensubsets. Das ist mindestens teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die zahlreichen manuellen Verdünnungen und Volumenreduktionen, die während der Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden, die Isolierung eines genau abgemessenen Volumens nicht erlauben. Somit identifiziert das Fluoreszenzdurchflusszytometrieinstrument die CD4-positiven T-Helferzellen als den prozentualen Anteil von Lymphozyten, welche sowohl positiv für CD3 (T-Zellmarker) als auch positiv für CD4 (Helfer-T-Marker) sind.
  • Die CD4-Patientenzahl wird dann berechnet unter Verwendung der folgenden Gleichungen: (Lymphozyten/100) × (WBC-Zahl) = Lymphozytenzahl (% Helfer-T in Lymphozyten/100) × Lymphozytenzahl = CD4-Zahl
  • Die Lymphozytenzahl und die WBC-Patientenzahl werden von dem Hämatologieinstrument genommen, während der Wert "% T-Helferzellen in Lymphozyten" von dem Fluoreszenzinstrument genommen wird, nachdem ein Korrekturfaktor auf der Grundlage der Durchflusszytometerabbildung von Streuung und Fluoreszenz angewendet wurde.
  • Es gibt mehrere Probleme mit den aktuellen Verfahren zur Berechnung der Patientenzählwerte für Lymphozytensubsets. Zuallererst beruht die Berechnung auf Werten, die von getrennten Instrumenten erhalten werden, die jeweils ihre eigene Kalibrierung und insgesamt getrennte Funktionen haben. Zusätzlich können unterschiedliche Testverfahren auf den unterschiedlichen Instrumenten verwendet werden.
  • Nicht nur unterscheiden sich Messungen von Hämatologieinstrumenten von Messungen von Fluoreszenzinstrumenten, sondern es kann auch Schwankungen bei den Ergebnissen geben, die von unterschiedlichen Hämatologieinstrumenten erhalten werden.
  • Vorhergehende Versuche, die Probenvorbereitung bei der Fluoreszenzzytometrieuntersuchung zu automatisieren, sind nur teilweise erfolgreich gewesen. Solche Systeme erfordern immer noch, dass der Bediener Probenvorbereitungsschritte durchführt wie Trennen der Lymphozyten von anderen peripheren Blutkörperchen durch Dichtegradientzentrifugation, und/oder Lyse von roten Zellen, Entfernen roter Zellspuren und Zellbruchstücke durch Zentrifugation, oder Bewahren der Morphologie der verbleibenden weißen Zellen durch Suspendieren der weißen Zellen in einer isotonischen Salzlösung, die geeignete Fixiermittel enthält. Diese Operationen erfordern im Allgemeinen, dass der Bediener das Volumen der Probe von Hand ändert, was folglich die Probenvolumengenauigkeit beeinträchtigt, welche mit automatisierten mechanischen Volumenabgabevorrichtungen erreicht werden kann.
  • Ein anderes Problem bei dem vorliegenden Verfahren zum Durchführen der Messungen auf getrennten Instrumenten ist, dass ein relativ großes Volumen von Patientenblut benötigt wird, um zwei Röhrchen zu füllen. Das ist ein Problem wegen der erhöhten Wahrscheinlichkeit, dass das Blut hämolysiert wird (rote Zellen zerstört werden), wenn größere Mengen Blut entnommen werden. Zusätzlich ist es möglicherweise nicht ratsam oder möglich, eine ausreichende Menge Blut bestimmten Patienten zu entnehmen.
  • Bei Leukozytenanalysen ist es erwünscht, dass alle der RBCs lysiert werden. Da RBCs WBCs um etwa 700 zu 1 zahlenmäßig übertreffen, kann eine kleine Zahl nicht lysierter roter Zellen weiße Zellpatientenzahlen signifikant verzerren. Einige Reagenzien, die zum Lysieren roter Zellen verwendet werden, erfordern eine zu lange Inkubationszeit, um in einem automatisierten klinischen Analysator praktikabel zu sein. Zum Beispiel benötigt die Tris-gepufferte Ammoniumchloridlösung, die empfohlen wird von K.A. Murihead in Clinical Cytometry, Ann. N.Y. Acd. Sci., Vol. 468, Seite 113-127 (1986), etwa 5 bis 10 Minuten, um rote Blutkörperchen aufzulösen, was für die Automatisierung unpraktikabel sein kann.
  • Des weiteren kann unvollständige Hämolyse mit bestimmten Lysier-Reagenzien zu roten Zellstroma führen, die genügend Hämoglobin oder partikelförmige Substanz zurückhalten, um hohe Hintergrundpatientenzahlen in automatisierten klinischen elektrooptischen Systemen zu generieren. Wenn das vorkommt, ist es normalerweise notwendig, die WBCs, die analysiert werden sollen, von den roten Zellstroma durch Zentrifugation zu entfernen, ein Verfahren, das ein begrenzender Faktor ist, wenn ein Reagenzsystem für die Automatisierung angepasst wird.
  • Einige aktuell verwendete Reagenzsysteme erfordern zytochemisches Anfärben von fixierten WBCs vor der Differentialanalyse. Diese Systeme benötigen eine zeitlich abgestimmte Zugabe von mehreren Reagenzien und zeitlich abgestimmte Inkubationszeiten und können nicht generell adaptierbar sein zur quantitativen Bestimmung von kernhaltigen roten Zellen oder Lymphozytensubsets. Außerdem kann jeder Schritt der Reagenzzugabe oder einer anderen Handhabung einer Blutprobe die Genauigkeit der erhaltenen endgültigen Patientenzahl verringern.
  • Das früheste Stadium von RBC, die kernhaltige rote Zelle, NRBC, kann, wenn sie in dem peripheren Blut auf herkömmlichen Hämatologieanalysatoren gefunden wird, verwechselt werden mit einem kleinen Lymphozyt, da die Lyse den Kern vom dem NRBC nicht zerstören wird. Wegen des Verhältnisses von RBCs zu WBCs kann selbst ein relativ kleiner Anteil von NRBCs zu einem wesentlichen Fehler bei der WBC- und der Lymphozytenzählung führen. Das kann bei Proben von Neugeborenen oder Kindern lästig sein, bei welchen die Anwesenheit von NRBCs in peripherem Blut ein normaler Zustand ist. Aus diesem Grund kann das Labor manuelle gleitende Inspektionen an einigen dieser Proben vornehmen. Herkömmliche Hämatologieanalysatoren sind nur in der Lage, diese Proben zu markieren durch Anmerken des Spreizens des normalen Lymphozytenstreuclusters. Die manuelle Inspektion läuft auf eine Zählung der Anzahl von NRBCs pro 100 kernhaltiger Zellen hinaus. Dieser prozentuale Anteil wird dann verwendet, um die WBC-Zahl des Analysatores folgendermaßen zu korrigieren:
    Korrigierte WBC-Zahl = Analysator-Zahl (1-manueller NRBC-Anteil in %/100)
  • Es besteht klar der Bedarf nach einer genauen automatisierten Zählung von NRBCs.
  • Eine andere bedeutende Klasse von unreifen roten Blutkörperchen sind "Retikulozyten", welche typischerweise nachweisbare Mengen von RNA enthalten. Ein manuelles Verfahren zum Identifizieren und Zählen von Retikulozyten umfasst die Ausfällung der RNA mit einem Farbstoff. Ein Ausstrich wird von dem angefärbten Blut gezogen und manuell unter einem Mikroskop untersucht. Die ausgefällte RNA erscheint als intrazellulare Punkte oder Fäden. Retikulozyten in % wird bestimmt, indem 1.000 RBCs unter einem Mikroskop von Hand ausgezählt werden und jene, die als Retikulozyten qualitativ bestimmt wurden, durch 10 geteilt werden. Die Retikulozytenpatientenzahl wird abgeleitet von der RBC-Patientenzahl gemäß der folgenden Gleichung: Retikulozytenzahl = (RBC-Zahl) × (Prozent Retikulozyten)/100
  • Sowohl die Präzision als auch die Genauigkeit dieses manuellen Verfahrens sind kleiner als erwünscht. Es kann beträchtliche Schwankungen bei der Identifizierung von Retikulozyten sowie Schwankungen bei den Zählverfahren geben. Entsprechend gibt es einen Bedarf für ein Zellanalysensystem, das sich den oben beschriebenen Mängeln zuwendet.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen 1 und 17 definiert.
  • Eine Vorrichtung zum Analysieren einer Vollblutprobe wird bereitgestellt. Die Vorrichtung, ein automatisiertes Instrumenten-System zum Unterscheiden und Differenzieren von Zellen in einer Probe, umfasst einen herkömmlichen Hämatologieanalysator, der vollständig mit einem Fluoreszenzzytometrieanalysator vereinigt ist. Beide Analysatoren werden von einer Steuerung gesteuert, die die Ergebnisse, die sie von jedem Analysator erhält, nutzt, um Testergebnisse als absolute oder quantitative Ausdrücke anzuzeigen. Verfahren werden ebenfalls bereitgestellt zum Analysieren einer Vollblutprobe. Ein solches Verfahren umfasst die Schritte automatisierte Durchführung sowohl der herkömmlichen Hämatologieanalyse als auch der Fluoreszenzzytometrieanalyse an einer Probe. Daten werden gesammelt und genutzt und ein quantitatives Ergebnis wird, wenn geeignet, angezeigt.
  • Eine weitere Ausführungsform stellt ein automatisiertes Instrumenten-System bereit, das einen Probenhalter zur Aufnahme eines Probenbehälters und Ansaugen und Dispensieren der Probe, einen Probenanalysator, der sowohl Mehrfachwinkel- Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignalnachweis durchführt, und eine Steuerung umfasst, die den Analysator voll integriert, um es dem Instrument zu ermöglichen, quantitative Ergebnisse sowohl von herkömmlichen Hämatologie- als auch von Fluoreszenzzytometrieresultaten anzuzeigen. Dieses Instrumenten-System ist weiter in der Lage, diese Funktionen, falls notwendig nacheinander, durchzuführen, ohne irgendeinen Eingriff von dem Instrumentenbediener, sobald der Bediener eine Anordnung von Tests, die von dem Instrument durchzuführen sind, aus einem Menü ausgewählt hat, das dem Bediener präsentiert wird, und ohne Abtrennen von Zellen von der Probe während irgendeiner Phase der Analysen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist ein Blockdiagramm von einem Zellanalysensystem, das gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde;
  • 2 ist ein Blockdiagramm von einer Ausführungsform eines Software-Subsystems, das mit dem Zellanalysensystem verwendet wird, das in 1 gezeigt wird;
  • 3 veranschaulicht eine Ausführungsform eines Probenverarbeitungsbereichs des Zellanalysensystems, das in 1 gezeigt wird;
  • 4 ist ein ausführlicheres Diagramm von dem Probenverarbeitungsbereich, der in 3 gezeigt wird;
  • 4A ist eine Vorderansicht einer Entlüftungs-/Ansaugbaugruppe von dem System, das in 4 gezeigt wird;
  • 4B ist eine perspektivische Ansicht einer Inkubationssondenbaugruppe, die in dem System von 4 verwendet wird;
  • 5 veranschaulicht eine Ausführungsform eines Fluidverteilungssystems des Zellanalysensystems, das in 1 gezeigt wird;
  • 6A, 6B und 6C veranschaulichen die Inkubationssonde des Zellanalysensystems während Abscheidung, Reinigung und Ansaugung;
  • 7 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Ansaug- und Abscheidesystems des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 8 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Inkubationstransfersystems des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 9 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Retikulozytenfärbemittelliefersystems des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 10A ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Impedanzprobenliefersystems des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird. In dieser Ansicht sind die Ventile offen und die Probe wird gerade in großen Mengen über die Pumpe 220 in die Nähe des Impedanzwandlers überführt;
  • 10B ist ein Diagramm von dem Impedanzprobenliefersystem, das in 10A gezeigt wird. In dieser Ansicht sind die Ventile geschlossen und ein Volumen der Probe wird gerade in den Impedanzwandler abgemessen;
  • 11A ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines optischen Probenliefersystems des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird. In dieser Ansicht sind die Ventile offen und die Probe wird gerade in großen Mengen über die Pumpe 232 in die Nähe der Durchflusszelle überführt;
  • 11B ist ein Diagramm von dem optischen Probenliefersystem, das in 11A gezeigt wird. In dieser Ansicht sind die Ventile geschlossen und ein Volumen der Probe wird gerade in den optischen Durchflusszellenwandler abgemessen;
  • 12 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines HGB-Probenliefersystems des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 13A-13F sind Zeitablaufdiagramme, die eine Ausführungsform eines integrierten, automatisierten Hämatologie/Immunologie-Probenverarbeitungsverfahrens des Zellanalysensystems veranschaulichen, das in 1 gezeigt wird;
  • 14A und 14B sind veranschaulichende Anzeigen von isolierten Retikulozyten, wie in Abschnitt 4. unten beschrieben. 15 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines optischen Durchflusszellenwandlers des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 16 ist eine Querschnittsansicht der optischen Durchflusszelle, die in 15 gezeigt wird;
  • 17 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Impedanzwandlers des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 18 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines HGB-Wandlers des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 19 ist ein Diagramm, das eine Ausführungsform eines Optikprüfplatzes des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 20 ist ein Diagramm, das das Vorwärtswegsammelsystem des Optikprüfplatzes veranschaulicht, der in 19 gezeigt wird;
  • 21 ist ein Diagramm, das das Seitenstreuungssammelsystem des Optikprüfplatzes veranschaulicht, der in 19 gezeigt wird;
  • 22 ist ein Diagramm von dem Kondensor des Optikprüfplatzes, der in 19 gezeigt wird;
  • 23 ist ein Diagramm von dem Strahlenfächer von der Durchflusszelle zu der Kathode des Optikprüfplatzes, der in 19 gezeigt wird;
  • 24 ist ein Diagramm von dem PMT-Linsenset des Optikprüfplatzes, der in 19 gezeigt wird;
  • 25 ist ein Blockdiagramm, das eine Ausführungsform des Analysatormoduls des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 26 ist ein Blockdiagramm, das eine Ausführungsform des Datenerfassungsmoduls veranschaulicht, das in 25 gezeigt wird;
  • 27 ist ein Blockdiagramm, das weitere Details des Analysatorsmoduls veranschaulicht, das in 25 gezeigt wird;
  • 28 ist ein Diagramm, das die Datenverwahrungsorte des Zellanalysensystems veranschaulicht, das in 1 gezeigt wird;
  • 29 und 30 sind Zustandsdiagramme, die eine Ausführungsform der Software-Architektur veranschaulichen, die in 28 gezeigt wird;
  • 31 ist eine generische Vorderansicht eines Apparates, der eine Düse zum Einführen eines Fluides enthält;
  • 32 ist eine perspektivische Ansicht der Düse von 31;
  • 33 ist eine Querschnittsansicht von einem Abschnitt der Düse von 32, wobei Leitungen, die in 32 gezeigt sind, der Klarheit halber wechselseitig parallel angeordnet sind;
  • 34 ist eine Querschnittsansicht von einem Abschnitt der Düse von 32, die Fluideinführung veranschaulicht;
  • 35 ist eine Querschnittsansicht, die im Wesentlichen ähnlich ist zu der von 34, die Fluideinführung veranschaulicht;
  • 36 ist eine Querschnittsansicht, die im Wesentlichen ähnlich ist zu der von 35, die Fluideinführung veranschaulicht;
  • 37 ist ein schematisches Diagramm von einem Probenvorbereitungsapparat, der hierin beschrieben wird;
  • 38 ist eine Teilschnittansicht von einem Abschnitt des Apparates von 37;
  • 39 ist eine Teilschnittansicht von einem anderen Abschnitt des Apparates von 37;
  • 40A-40C veranschaulichen angezeigte Daten für NRBC, die durch eine Ausführungsform des Zellanalysensystems erhalten wurden;
  • 41A und 41B veranschaulichen angezeigte Daten für NRBC, die durch eine Ausführungsform des Zellanalysensystems erhalten wurden;
  • 42 ist ein schematisches Blockdiagramm von der Dreifachtriggerschaltung, die in Abschnitt 2. unten beschrieben wird.
  • 43 ist eine Veranschaulichung der Laserstrahl- und Durchflussstrahlkonfigurationen und -wechselwirkungen;
  • 44A-44F sind Seitenansichten von Abschnitten einer Ausführungsform des Zellanalysensystems von 1;
  • 45A-45F veranschaulichen angezeigte Daten, die durch eine Ausführungsform des Zellanalysensystems erhalten wurden;
  • 46 zeigt ein RBC-Volumenhistogramm, das mit einer Ausführungsform des Zellanalysensystems erhalten wurde;
  • 47 und 48 sind Veranschaulichungen von Blutplättchenstreudiagrammen, die mit einer Ausführungsform des Zellanalysensystems erhalten wurden;
  • 49A und 49B veranschaulichen Ereigniseinteilungen, die durch eine Ausführungsform des Zellanalysensystems erfasst wurden;
  • 50A und 50B zeigen ALL-Werte von hohen FL3-Zellen, die durch eine Ausführungsform des Zellanalysensystems erfasst wurden;
  • 51A und 51B sind Beispiele für eine Teilungslinie, die mit einer Ausführungsform des Zellanalysensystems zwischen Granulozyten und einkernigen Zellen gezogen wurde;
  • 52A und 52B zeigen Beispiele für ein Histogramm und eine Winkelteilungslinie, die von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems gebildet wurden;
  • 53 veranschaulicht ein Beispiel für ein ALL-Histogramm und von Teilungslinien, die mit einer Ausführungsform des Zellanalysensystems erhalten wurden;
  • 54 veranschaulicht eine Teilung, die von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems bei einem Wert gleich dem Mittelwert von IAS-Werten plus dem 2,5-fachen einer Standardabweichung der IAS-Werte gezogen wurde;
  • 55 zeigt eine Teilung, gezeichnet zwischen ¼ und ¾ des Abstandes von Lymphozyt-Stroma- und Lymphozyt-Monozyt-Trennlinien, die von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems gebildet wurden;
  • 56 zeigt ein Histogramm und eine Teilungslinie an, die von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems erzeugt wurden;
  • 57 zeigt ein anderes Histogramm und eine Teilungslinie an, die von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems erzeugt wurden;
  • 58 veranschaulicht ein Beispiel für ein Retikulozyten-Streudiagramm, das von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems gezeichnet wurde;
  • 59 zeigt ein Beispiel für ein Retikulozytenhistogramm, das von einer Ausführungsform des Zellanalysensystem gezeichnet wurde;
  • 60A – 60F veranschaulichen ein Beispiel der Datenverarbeitung wie in Beispiel 6 beschrieben;
  • 61A – 61G stellen Veranschaulichungen dar von Daten, die von einer Ausführungsform des Zellanalysensystems angehäuft wurden; und
  • 62A – 62D veranschaulichen eine Korrelation zwischen Fraktionen von Lymphozyten, die positiv sind sowohl für CD3 als auch CD4, positiv sind sowohl für CD3 als auch CD8, positiv sind für CD19 allein und positiv sind für CD3 allein.
  • 63A – 63F sind Tabellen, die Werte und Ventilfunktionen darstellen, wie in Abschnitt 13. F beschrieben wird.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen ein analytisches Instrumenten-System und ein Verfahren zum Analysieren flüssiger Proben. Allgemein umfasst ein solches automatisiertes Instrumenten-System einen herkömmlichen Hämatologieanalysator, der vollständig mit einer Steuerung und einem Fluoreszenzzytometer vereinigt ist. Das Instrumenten-System ist in der Lage, Zellen zu unterscheiden und zu klassifizieren, wobei die Daten, die von dem Hämatologieanalysator gesammelt werden, automatisch von dem Fluoreszenzzytometer verwendet werden, um Proben zu verarbeiten, Proben zu analysieren und Zellen innerhalb der Probe zu klassifizieren und quantitative sowie qualitative Ergebnisse anzuzeigen.
  • Das hierin offenbarte automatisierte Instrumenten-System kombiniert oder integriert herkömmliche Hämatologie mit Fluoreszenzzytometrie auf einer einzigen Analysatorenplattform. Bisher ist dieser Ansatz nicht möglich gewesen. Beide Verfahren profitieren von dieser einzigartigen Kombination. Fluoreszenzinformationen werden durch völlige Automatisierung und absolute Konzentrationen verbessert. Die Hämatologieinformationen werden durch Hinzufügen von Fluoreszenzzytometrie zu der Technik der Kolorimetrie, Impedanz und Mehrfachwinkel-Lichtstreuung erhöht, wodurch eine überragende Hämatologie und eine völlige Automatisierung von Tests ermöglicht wird, die aktuell entweder manuell oder auf getrennten und unterschiedlichen Analysatoren durchgeführt werden.
  • Dieser Veröffentlichung halber ist Automatisierung dadurch gekennzeichnet, dass ein Bediener nicht in den Probenvorbereitungsprozess oder in die Analyse der Probe einzugreifen braucht, sobald die Probe, d.h. Vollblut, Harn, Speichel usw. dem Instrument präsentiert worden ist. Zusätzlich werden alle Probenhandhabungs-, -verarbeitungs- und -analysenschritte und -funktionen automatisch von dem Instrument ausgeführt auf der Grundlage der Tests, die von dem Bediener ausgewählt wurden. Alle Daten und andere Informationen betreffend jeder anfänglichen Testprobe werden durch die Instrumentensteuerung überwacht, gesammelt und verarbeitet.
  • Die Ausführungsformen der Erfindung umfassen im Allgemeinen einen automatisierten Hämatologieanalysator und einen Durchflusszytometrieanalysator, die mit einer Steuerung vereinigt sind, die die Analysatoren überwacht und steuert, Daten von den Analysatoren sammelt und ein Ergebnis anzeigt. Veranschaulichend durch Beispiel ermöglicht Integration der Analysatoren mit einer Steuerung einem Bediener, Daten zu einer Vollblutprobe in die Steuerung einzugeben. Der Bediener wählt eine Reihe von Tests, die an der Probe, im Allgemeinen Vollblut, mit Hilfe der Steuerung durchgeführt werden sollen. Der Bediener präsentiert die Vollblutprobe den integrierten Analysatoren in einem zentralisierten Probenhandhabungs- oder -verarbeitungsbereich. Die Steuerung aktiviert die Analysatoren, was es den Analysatoren ermöglicht, Analysen an der Vollblutprobe unter der Leitung der Steuerung automatisiert durchzuführen. Die Steuerung nutzt Daten, die von den Analysatoren erhalten werden, um ein Ergebnis zu formulieren. Die Steuerung meldet das Ergebnis dem Bediener. Es sollte beachtet werden, dass keine Bedienertätigkeit notwendig ist, nachdem die Vollblutprobe den integrierten Analysatoren präsentiert worden ist. Da die Vollblutprobenvorbereitung vollständig automatisiert ist, werden in einer bevorzugten Ausführungsform herkömmliche Hämatologietests zuerst durchgeführt, wobei die inkubierten Probentests zu folgen haben. Da die Analysatoren mit der Steuerung integriert sind, erhält die Steuerung Daten sowohl von dem Hämatologieanalysator als auch von dem Durchflusszytometrieanalysator. Folglich ist die Steuerung in der Lage, dem Bediener eine kombinierte Patientenblutanalyse anzuzeigen. Zusätzlich können absolute Konzentrationen angezeigt werden wegen der Genauigkeit und Wiederholbarkeit von automatisierter Verdünnung, Zellvorbereitung und Analyse. Menschliche Fehler sind vollständig eliminiert worden, da das Instrumenten-System das einzige ist, was mit der Probe in Berührung kommt, sobald der Bediener das Instrument programmiert und die Probe darauf angeordnet hat.
  • Während spezielle Ausführungsformen der Erfindung ausführlich besprochen werden, um das Verständnis zu verdeutlichen, sollte daran gedacht werden, dass andere Ausführungsformen ebenfalls möglich sind. Jede wünschenswerte Kombination von Elementen der beschriebenen Ausführungsformen ist ebenfalls möglich.
  • 1. Systemübersicht
  • 1 ist ein Blockdiagramm von einem Zellanalysensystem 60. Das System 60 umfasst ein Analysatormodul 64, ein Datenstationsmodul 68 und eine Pneumatikeinheit 72. Das Analysatormodul 64 ist operativ mit dem Datenstationsmodul 68 durch einen seriellen Datenübermittlungsabschnitt 76 verbunden, der ein HDLC(High Level Data Link)-Protokoll implementiert. Die Pneumatikeinheit 72 ist operativ mit dem Analysatormodul 64 durch einen seriellen Datenübermittlungsabschnitt 84 und ein Netzwerk von Rohrleitungen 80 verbunden.
  • Das Analysatormodul 64 saugt Proben, Verdünnungsmittel und Reagenzien an, verdünnt Proben, misst und sammelt Daten, überträgt gemessene Daten an das Datenstationsmodul 68, verwaltet Reagenzien und beseitigt Abfall. Ein beispielhaftes Analysatormodul 64 umfasst eine eigene Stromversorgung, Impedanzwandler, HGB-Wandler, optische Durchflusszelle/Wandler (Lichtstreuung und Fluoreszenz), optische Detektoren, Elektronik, Reagenzvorräte, ein Fluidiksystem, eine integrierte und voll automatisierte Probenverarbeitungsvorrichtung sowohl für Hämatologie- als auch für Fluoreszenzzytrometrietests und alle notwendigen Inkubations- und/oder Kühlsysteme. Ein beispielhaftes Analysatormodul umfasst einen Motorola 68302-Mikrocomputer, der mechanische Komponenten des Analysators 64 steuert und die Ablaufsequenzen des Analysators ausführt.
  • Die Pneumatikeinheit 72 beherbergt Pneumatikquellen zum Bewegen von Fluiden durch das Analysatormodul 64. Die Pneumatikeinheit 72 empfängt Anweisungen von dem Analysatormodul 64 über den seriellen Datenübermittlungsabschnitt 84.
  • Das Datenstationsmodul 68 stellt allgemeine Steuerungen für das Analysatormodul 64 bereit, wandelt gemessene Daten in aussagekräftige Testergebnisse um, speichert gemessene Daten und Testergebnisse, druckt Berichte und stellt bidirektionale Kommunikation mit einem Offline-Host-Computer (nicht gezeigt) bereit. Ein beispielhaftes Datenstationsmodul 68 umfasst einen 80386- oder 80486-Mikrocomputer, ein Farbdisplay, ein 3 1/2-Zoll-Diskettenlaufwerk, mindestens 540 Megabyte Festplatte, eine PC-Tastatur, ein Zeigegerät und LAN-Anschlüsse. Die Datenstation 68 umfasst Speicher wie ein RAM, ein ROM, ein EPROM, ein SRAM und dergleichen, die ausreichend Software-Algorithmen haben, um gemessene Daten zu manipulieren, Parameter zu berechnen und Ergebnisse in einer Vielzahl von Formaten, einschließlich Histogramme, Streuwertdiagramme und andere multidimensionale Diagramme, anzuzeigen.
  • 2. Schnelllyse-Mehrzweckreagenzsystem
  • Das Zellanalysensystem 60 nutzt ein Mehrzweckreagenzsystem, das für die schnelle Analyse von kernhaltigen peripheren Blutkörperchen einschließlich weißer Blutkörperchen ("WBC") und Normoblasten ("NRBC") geeignet ist. Das Mehrzweckreagenzsystem kann im Wesentlichen rote Blutkörperchen vollständig und schnell lysieren, während gleichzeitig weiße Zellmorphologie und die Antigenität von Lymphozytenoberflächenantigenen im Wesentlichen erhalten bleiben.
  • Das Mehrzweckreagenzsystem ist vollständig beschrieben in einem US-Patent 5.516.695 mit der Bezeichnung "Multipurpose Reagent System For Rapid Lysis Of Whole Blood Samples", eingereicht am 29. August 1994.
  • Eine Ausführungsform des Mehrzweckreagenzsystems umfasst etwa 3 bis etwa 7 Gramm pro Liter eines nichtquartären Ammoniumsalzes, etwa 0,04 bis etwa 0,1 % Gewicht pro Volumen (d.h. Gramm pro 100 ml) eines aliphatischen Aldehyds mit ein bis vier Kohlenstoffen, etwa 10 bis etwa 20 mM eines Nichtphosphatpuffers, welcher im Wesentlichen inert gegenüber dem aliphatischen Aldehyd ist, und Wasser. Der pH des Reagenzsystems liegt innerhalb eines pH-Bereichs von etwa 5,5 bis etwa 7,5, und die Osmolalität des Reagenzsystems liegt zwischen etwa 160 und 310 (mOsm/l). Der Brechungsindex des Reagenzsystems kann ähnlich wie der von Salzlösung sein und sollte vorzugsweise innerhalb des Bereichs von etwa 1,333 bis etwa 1,336 liegen. Der Nichtphosphatpuffer ist inert gegenüber dem aliphatischen Aldehyd insofern, als dass der Nichtphosphatpuffer nicht mit dem aliphatischen Aldehyd reagieren wird. Folglich sollte der Nichtphosphatpuffer generell keine primäre Aminogruppe enthalten.
  • Eine andere Ausführungsform des Mehrzweckreagenzsystems umfasst etwa 135 mM Ammoniumchlorid, etwa 0,075 Vol-% Formaldehyd, etwa 20 mM Acetatpuffer, etwa 10 mM Kaliumbicarbonat und etwa 0,01 % Gewicht pro Volumen (d.h. Gramm pro 100 ml) Saponin und dergleichen. Der pH des Reagenzsystems ist auf etwa pH 6,2 eingestellt und die Osmolalität des Reagenzsystems beträgt etwa 267 bis 270 mOsm/l.
  • Das Mehrzweckreagenzsystem wird bei der automatisierten Bestimmung von Patienten-Differentialblutbildern, Normoblasten und der Lymphozytenimmunphänotypisierung genutzt. Ein Verfahren für die schnelle Analyse von kernhaltigen peripheren Vollblutkörperchen umfasst die folgenden Schritte: Mischen des beschriebenen Mehrzweckreagenzsystems mit einer antikoagulierten Vollblutprobe (wodurch das Blut 10- bis 100-fach verdünnt wird), Mischen der Verdünnungsmittel-Blut-Mischung bei Temperaturen von etwa 25°C bis 46°C mindestens etwa 10 Sekunden lang, und Analysieren der kernhaltigen peripheren Blutkörperchen mit dem automatisierten Zellanalysensystem der vorliegenden Erfindung.
  • Ein Verfahren zur Verwendung des Mehrzweckreagenzsystems in der Differentialanalyse von peripheren weißen Blutkörperchen ist ein schnelles Einreagenzverfahren zum gleichzeitigen Lysieren roter Blutkörperchen und Fixieren weißer Blutkörperchen, worin die weißen Zellen ihre Lichtstreuungsmerkmale beibehalten. Im Allgemeinen strömen die Zellen durch eine optische Ansichtskammer, wo ein photoelektrisches Messverfahren das absorbierte Licht oder den Typ von Licht aufzeichnet, der durch jede Zelle in ausgewählten Winkeln gestreut wird.
  • Ein erster Bestandteil des Mehrzweckreagenzsystems ist ein nicht-quartäres Ammoniumsalz. Vorzugsweise sollten keine Di- oder Triammoniumsalze verwendet werden. Eine Vielzahl von Monoammoniumsalzen, insbesondere die halogenierten Salze, können bei etwa drei bis etwa sieben Gramm pro Liter und vorzugsweise bei etwa 5 Gramm pro Liter verwendet werden. Beispiele für derartige nicht-quartäre Ammoniumsalze umfassen NH4X, worin X ein Halogen ist. Ein derartiges nicht-quartäres Ammoniumsalz ist NH4Cl.
  • Ein zweiter Bestandteil eines Mehrzweckreagenzsystems ist ein kurzkettiges aliphatisches Aldehyd. Vorzugsweise haben solche aliphatischen Aldehyde ein bis vier Kohlenstoffe. Beispielhafte Aldehyde umfassen Formaldehyd und das Poylmer Paraformaldehyd. In richtigen Verhältnissen und Konzentrationen werden das Aldehyd, in Verbindung mit dem nicht-quartären Monoammoniumsalz, und der Puffer rote Blutkörperchen schnell und im Wesentlichen vollständig lysieren. Zusätzlich wird das Aldehyd weiße Blutkörperchen fixieren und deren Membranintegrität im Wesentlichen bewahren. Formaldehyd, oder ein vergleichbares Aldehyd, ist in Mengen von etwa 0,04 Vol-% bis etwa 0,10 Vol-%, und vorzugsweise von etwa 0,08 Vol-% bis etwa 0,1 Vol-% vorhanden.
  • Ein dritter Bestandteil des Mehrzweckreagenzsystems ist ein Nichtphosphatpuffer, der im Wesentlichen inert gegenüber der Aldehydkomponente des Reagenzsystems ist. Folglich darf der Puffer keine primäre Aminogruppe enthalten. Der Puffer sollte außerdem eine wirksame Pufferkapazität zwischen einem pH von etwa 6,0 bis etwa 7,5 haben und eine Osmolarität von etwa 230 bis etwa 310 mOsm/ml. Beispiele für wirksame organische Puffer sind Acetatpuffer, Succinatpuffer, Maleatpuffer und Citratpuffer. Beispiele für wirksame biologische Puffer sind 2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure(MES)-Puffer, 3-(N-Morpholin) propansulfonsäure(MOPS)-Puffer und N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(2-ethansulfonsäure)(HEPES)-Puffer. Ein Acetat oder ein anderer geeigneter Puffer wird in Mengen von einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 20 mM, und vorzugsweise von einer Konzentration von etwa 20 mM vorhanden sein.
  • Eine wahlweise Komponente des Mehrzweckblutverdünnungsmittels ist ein oberflächenaktives Reagenz. Die bevorzugte oberflächenaktive Substanz ist Saponin, ein Pflanzenextrakt, das als ein Pulver handelsüblicher Klasse isoliert aus Quillaja-Baumrinde sowie von anderen Quellen erhältlich ist. Wenn auch die chemische Reinheit von handelsüblichem Saponin von Charge zu Charge variiert, ist es gegenüber roten Zellen selektiver als die quartären Ammoniumsalze. Saponin, oder ein anderes oberflächenaktives Reagenz, ist in Mengen von etwa 10 bis etwa 200 mg/l, und vorzugsweise bei etwa 100 mg/l vorhanden. Saponin lysiert gemeinsam mit den anderen Bestandteilen des Mehrzweckreagenzsystems im Wesentlichen vollständig die roten Blutkörperchen, die in Vollblut vorhanden sind.
  • Der Erythrozytenanteil (d.h. rote Blutkörperchen) von normalen Blutproben wird normalerweise innerhalb von etwa 20 Sekunden bei Raumtemperatur lysiert sein. Für schwer zu lysierende Blutproben (wie zum Beispiel Blutproben von Kleinkindern, Nierendialysepatienten, multiplen Myelompatienten, Diabetikern oder Patienten mit Urämie) ist es jedoch erforderlich, dass das Blut mit dem Reagenzsystem bei Temperaturen von etwa 38°C bis etwa 40°C bis zu etwa 20 Sekunden für eine vollständige Erythrozytenlyse inkubiert wird. Die Inkubation von Blutproben mit dem Mehrzweckreagenzsystem, selbst bei diesen leicht erhöhten Temperaturen, bewahrt wirksam die weiße Zellmembranintegrität und erhält die Antigenität von Lymphozytenoberflächenantigenen. Wenn Saponin allein verwendet wird, um die roten Zellen zu lysieren, sollte es im Gegensatz dazu bei einer etwa 10- bis 20-fach höheren Konzentration verwendet werden als jene, die oben besprochen wurde. Solche Konzentrationen können die Integrität der weißen Zellen kompromittieren und erfordern ein schnelles Quenchen der lytischen Aktivität des Reagenzes, um weiße Zellmorphologie zu bewahren. Ein Vorteil der Ausführungsformen dieses Reagenzsystems ist, dass die kombinierten Konstituenten des Mehrzweckreagenzsystems dazu dienen, die weißen Zellen sanft zu fixieren zu der gleichen Zeit, zu der die roten Zellen lysiert werden. Deshalb wird weiße Zellintegrität selbst bei relativ langen Inkubationszeiten im Wesentlichen bewahrt. Tatsächlich werden sogar fragile weiße Zellen wie jene, die bei chronischen lymphozytischen Leukämiepatienten zu sehen sind, in dem Mehrzweckreagenzsystem für Inkubationszeiten von bis zu 20 Minuten stabilisiert.
  • Ein zusätzlicher wahlweiser Bestandteil des Mehrzweckreagenzsystems ist ein Alkalisalz, vorzugsweise ein einwertiges Alkalisalz von Bicarbonat. Wenn auch ein einwertiges Alkalisalz von Bicarbonat keine wesentliche Komponente des Verdünnungsmittels ist, kann es zu dem Verdünnungsmittel hinzugegeben werden, um dessen Osmolalität zu erhöhen, ohne dass die rote Zelllysierfähigkeit des Reagenzsystems verringert wird. Viele andere Verbindungen, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Phosphatpuffer, vermindern die Lysierfähigkeit des Reagenzsystems, wenn sie verwendet werden, um die Osmolalität des Reagenzsystems zu erhöhen. Beispielhafte einwertige Alkalisalze von Bicarbonat sind Kaliumbicarbonat, Natriumbicarbonat, Lithiumbicarbonat und dergleichen. Kaliumbicarbonat oder ein anderes alkalisches Bicarbonatsalz kann in Mengen von etwa 0,005 % bis etwa 0,015 % Gewicht pro Volumen, und vorzugsweise mit etwa 0,01 % Gewicht pro Volumen vorhanden sein.
  • Noch ein anderer wahlweiser Bestandteil des Mehrzweckreagenzsystems ist ein Blutplättchen-Antiklumpmittel. Zum Beispiel kann ein Ethylendiamintetraacetat(EDTA)-Salz zu dem Reagenzsystem hinzugegeben werden, um die Blutplättchenaggregation in der Probe/Reagenz-Mischung zu verringern. Tetranatrium-EDTA oder ein anderes EDTA-Salz ist in Mengen von etwa 20 bis etwa 200 mg pro Liter vorhanden, und vorzugsweise bei etwa 100 mg pro Liter.
  • Eine weitere Ausführungsform des Mehrzweckreagenzsystems ermöglicht die quantitative Analyse von Lymphozytensubpopulationen. Lymphozytensubklassifikation wird erreicht, indem Fluoreszenzfarbstoff-konjugierte monoklonale Antikörper (gerichtet gegen spezifische Lymphozytenoberflächenantigene) mit Vollblutproben gemischt werden, bevor das Mehrzweckreagenzsystem oder Blutverdünnungsmittel hinzugegeben wird. Die Konzentration von markierten Antikörperfraktionen, die zu einer Blutprobe hinzugegeben wird, ist abhängig von dem einzelnen Antikörperpräparat, ist aber normalerweise etwa die Hälfte bis ein Zehntel des Volumens von Blut für kommerzielle Antikörperpräparate. Nachdem das Reagenzsystem hinzugegeben wurde und die roten Zellen lysiert sind, können die Lymphozytenantikörperreaktionsprodukte auf einem automatisierten Durchflusszytometriesystem analysiert werden. Es besteht keine Notwendigkeit, die Lymphozyten von den lysierten Zellen durch Zentrifugation oder Waschen zu "trennen", wie es auf dem Gebiet üblich ist.
  • Das offenbarte Reagenzsystem "quencht" keine Fluoreszenzmarker wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE), welche verwendet werden, um Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoff zu markieren. Lymphozytensubklassifikation ist ein Diagnosewerkzeug im Kampf gegen viele Krankheiten wie z.B. AIDS. Die Fähigkeit, Oberflächenmarker auf Blutzellpopulationen zu identifizieren, kann bedeutend sein, wenn sie mit der Kenntnis von Oberflächenkomponenten und Merkmalen von Subpopulationen von Lymphozyten und anderen weißen Zellfraktionen wie Monozyten und Neutrophilen gekoppelt wird.
  • 3. Kernhaltige rote Blutkörperchendifferenzierung und Reagenz
  • Das Zellanalysensystem 60 nutzt ein automatisiertes Verfahren zur simultanen Analyse von WBC/Diff und NRBC in einer Vollblutprobe unter Verwendung eines einzigartigen Dreifachtriggerverfahrens mit Lysereagenz wie dem oben beschriebenen Schnelllysereagenzsystem. Dieses Verfahren, das beansprucht wird in US-Patent 5.559.037 mit der Bezeichnung "Method For Rapid And Simultaneous Analysis of Nucleated Red Blood Cells" und eingereicht am 15. Dezember 1994, ermöglicht die genauen NRBC-Zählungen und genaue WBC/Diff-Daten gleichzeitig aus einer Vollblutprobe, die NRBC enthält.
  • Ein bedeutender Gesichtspunkt des NRBC-Verfahrens ist, dass die Signale von Debris (sowohl fluorenszente als auch nicht fluoreszente) durch das Dreifachtriggerverfahren blockiert werden, und die Signale, die unter den ALL-Trigger fallen, aber über dem FL3-Trigger liegen, identifiziert und als NRBC gezählt werden können. Deshalb werden genaue NRBC-Zahlen erhalten, die im Wesentlichen frei von Verunreinigung von fluoreszenten Kernbruchstücken sind. Fragile Blastzellen und tote (nicht lebensfähige) Zellen können ebenfalls erfasst werden unter Verwendung von Verfahren dieser Erfindung.
  • In dem Dreifachtriggerverfahren ist es möglich, gleichzeitig WBC/Diff und NRBC genau zu zählen, indem die Blutprobe mit einem Blutverdünnungsmittel gemischt wird, das RBC schnell lysiert und WBC bewahrt, und zu dem ein geeigneter Kernfarbstoff hinzugegeben worden ist, welcher nackte Kerne der NRBC anfärben wird. Ein derartiges Verdünnungsmittel ist oben offenbart. Die Verdünnungsmitttel/Probe-Mischung wird dann, im Wesentlichen jeweils eine Zelle nach der anderen, durch eine beleuchtete optische Durchflusszelle hindurchgelassen. Dies führt dazu, dass die Zellen das Beleuchtungslicht streuen und alle angefärbten Kerne, die vorhanden sind, fluoreszieren. Die gestreuten und fluoreszenten Lichtsignale werden durch bekannte Mittel erfasst, und unter Verwendung des Dreifachtriggerverfahrens in Verbindung mit der Verarbeitung der erfassten Signale ist es möglich, WBC, WBC/Diff und NRBC zu identifizieren und zu quantifizieren.
  • Das Dreifachtriggerverfahren ist einzigartig insofern, als dass die gleichzeitige Analyse von WBC/Diff/NRBC automatisch, genau und schnell ohne Störung durch andere Zellbruchstücke wie RNA aus lysierten Retikulozyten, Howell-Jolly-Körperchen, retikulierte Blutplättchen, Riesenblutplättchen, DNA aus WBC und Megakaryozytfragmenten, Parasiten und RBC-Fragmenten ausgeführt werden kann.
  • Das Dreifachtriggerverfahren erlaubt auch die genaue WBC/Diff-Analyse bei einer Blutprobe, die NRBC enthält, indem Signale, die als NRBC identifiziert wurden, von den Gesamt-WBC-Signalen subtrahiert werden, bevor eine WBC/Diff-Analyse durchgeführt wird. Nur ein Farbstoff wird zum NRBC-Anfärben benötigt, und die WBC/Diff-Analyse kann durch die Differenz von Lichtstreuungsmerkmalen der WBC-Subklassen durchgeführt werden. Das NRBC-Verfahren erreicht alle Ziele, die oben beschrieben wurden, durch ein einzigartiges Dreifachtriggerverfahren in dem dreidimensionalen Raum von Axiallichtverlust (Axial Light Loss, ALL), Zwischenwinkelstreuung (Intermediate Angle Scatter, IAS) und Rotfluoreszenz (FL3).
  • Um das zu erreichen, werden ein oder mehrere Detektoren 380 (19, 20 und 21) vorzugsweise in dem Vorwärtslichtweg angeordnet zum Messen von Vorwärts-Zwischenwinkelstreuung (IAS) 384 und entweder Kleinwinkelvorwärtsstreuung (SAS) oder Axiallichtverlust (ALL, auch als Vorwärtsextinktion bekannt) 382.
  • ALL ist allgemein die Abnahme der Lichtenergie aufgrund einer Zelle, die vor einem Laserstrahl hindurchgeht und die durch eine Photodiode nachgewiesen wird. Der Lichtverlust wird allgemein durch Streuung verursacht und ist definiert als die Abnahme der Lichtenergie, die einen Detektor erreicht, in dem Weg eines Laserstrahls aufgrund des Durchgangs einer Zelle durch diesen Strahl (allgemein wird ALL bei einem Winkel von etwa 0° bis etwa 1° erfasst.) Kleinwinkelvorwärtsstreuung (SAS) ist im Gegensatz dazu Lichtenergie, die einen Detektor außerhalb des einfallenden Laserstrahls (aber innerhalb eines schmalen Winkels von etwa 1° bis 3°) erreicht aufgrund von Streuung durch eine Zelle, die durch den Strahl hindurchgeht. Ein Strahlenstopp wird allgemein bereitgestellt, um den Laserstrahl davon abzuhalten, in den Detektor zu gelangen. ALL-Messsysteme sammeln Licht innerhalb des einfallenden Kegels der Laserbeleuchtung, während Kleinwinkelstreuungssysteme Licht außerhalb dieses Kegels sammeln. In ALL-Messsystemen ist das interessierende Signal ein negatives Signal, das von dem stabilen Lasersignal subtrahiert wird, während in der Kleinwinkelvorwärtsstreuungsmessung das Signal ein kleines positives Signal ist, das einem sehr niedrigen Hintergrundlichtpegel überlagert ist. Zwischenwinkelvorwärtsstreuung (IAS) ist ähnlich der Kleinwinkelvorwärtsstreuung, außer dass das Licht bei einem größeren Winkel von dem einfallenden Laserstrahl her gestreut wird. Ausdrücklicher betrifft IAS Licht, das in einem Ring zwischen etwa 3° und 10° weg von dem einfallenden Laserstrahl oder der Mittellinie eines Laserstrahls gestreut wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ALL in den Winkeln kleiner als etwa 0,3° horizontal und kleiner als 1,2° vertikal von der Laserachse gesammelt, und IAS wird bei Winkeln zwischen etwa 3° und 10° von der Laserachse her gesammelt.
  • Ein anderer technischer Vorteil des offenbarten Systems ist, dass das System eine viel geringere Konzentration des Farbstoffes benötigt, um NRBC wirksam und schnell anzufärben für eine genaue Erfassung und Zählung, da die vollständige Lyse des Zytoplasmas von NRBC deren Kerne für den Farbstoff zugänglicher macht. Diese Bedingung erlaubt ein hohes Signal-Rausch(S/N)-Verhältnis, größer als 100, bei dem NRBC-Nachweis. Die Konzentration eines vitalen Farbstoffes, die dieses System benötigt, um die gleichzeitige Analyse von WBC/Diff/NRBC durchzuführen, beträgt nur 1 bis 2 μg/ml, was mindestens 50-mal kleiner ist als die der vorhergehenden Technik.
  • Vitale Farbstoffe (Kernfarbstoffe, die nur tote oder beschädigte Zellen anfärben), die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, können alle vitalen Farbstoffe sein mit relativ hohem Extinktionskoeffizient und niedriger Fluoreszenzintensität, wenn sie nicht an Nukleinsäure gebunden sind. Die Spektralcharakteristika, d.h. Extinktion (EX) max. (nm)/Emission (EM) max. (nm), der vitalen Farbstoffe muss kompatibel mit der Laserlichtquelle sein, die in dem System verwendet wird.
  • Die folgenden Charakteristika sind für die vitalen Farbstoffe für das offenbarte System erwünscht:
    hoher Extinktionskoeffizient
    hohe Quantenausbeute
    hohe Bindungsaffinität zu Nukleinsäure
    niedrige Fluoreszenz, wenn sie nicht an Nukleinsäure gebunden sind
    Lichtquellenkompatibilität der Spektralcharakteristika (z.B. EX max. ~488 nm und EM max. ~630 nm bei einer Argon-Laserlichtquelle)
  • Es gibt viele Zellkernfarbstoffe, die für die Verwendung in dem offenbarten System bei geeigneter Lichtquelle qualifiziert sind. Einige der kommerziell erhältlichen Farbstoffe, die in dem offenbarten System verwendet werden können, sind YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1 und viele mehr. Es ist denjenigen, die mit dem Fachgebiet vertraut sind, bekannt, dass die Farbstoffe mit verschiedenen EX max. mit einer geeigneten Lichtquelle wie He-Ne-, Xenon- oder Quecksilberlampe angeregt werden können.
  • Qualifizierte Farbstoffe, welche mit einem Argon-Laser verwendet werden können, die ebenfalls kommerziell erhältlich sind, sind Propidiumiodid (PI), Ethidiumbromid (EBr), Ethidiumhomodimer-1 (EthD-1), Ethidiumhomodimer-2 (EthD-2) oder Diethylentriamin (DTA).
  • In einer Ausführungsform des NRBC-Verfahrens ist der verwendete vitale Farbstoff PI.
  • Ein Teil einer Vollblutprobe, etwa 25 Mikroliter, wird mittels einer Probenansaugsonde in die WBC-Schale 138 abgeschieden, welche etwa 850 Mikroliter eines isotonischen Lysier-Reagenzes enthält. Ein Lysereagenz, das oben beschrieben wurde, wird verwendet, um die Erythrozytenfraktion der Blutprobe zu lysieren und das Zytoplasma von NRBC zu lysieren, um die Kerne von irgendwelchen vorhandenen NRBC freizulegen. Dieses Reagenzsystem ist dadurch gekennzeichnet, dass es ein Einreagenz/Einschrittverfahren verkörpert, das Mehrzweckziele erreicht. Dieses Reagenz ist sanft genug, um die Morphologie von allen fragilen weißen Zellen zu bewahren, und lysiert gleichzeitig die gesamten roten Zellen wirksam. Diese beiden Ziele werden selbst in hämoglobinophatischen Proben erreicht, welche erfordern können, dass die Lysezeit ausgedehnt wird.
  • Egal wie die Formulierung des Lysemittels ist, das mit dem Dreifachtriggerverfahren genutzt wird, wird das Reagenz zusätzlich eine kleine Konzentration eines vitalen Zellkernfarbstoffes enthalten, oder damit kombiniert sein, welcher irgendwelche NRBC wirksam markiert, welche in dem peripheren Blut vorhanden sein könnten. Vorzugsweise wird für die Verwendung mit dem hierin erwähnten Analysator die Lysechemie so konfiguriert sein, dass der Brechungsindex dem einer Mantellösung im Wesentlichen um weniger als 0,1% angepasst ist.
  • Die Mischung von Lysereagenz und Probe wird normalerweise in der WBC-Schale 138 nur ungefähr 11 Sekunden lang bleiben. Dort wird sie bei 42°C ±3°C lysiert und gemischt. An dieser Stelle wird der Inhalt der WBC-Schale direkt zu einer optischen Durchflusszelle 170 zum Nachweis geleitet.
  • Der Messprozess beginnt, wenn die Zellen durch die Durchflusszelle 170 strömen, wobei sie durch die Zugabe von Lysemittel verdünnt worden sind, so dass die Zellen durch das Laser-beleuchtete Volumen als Einzelfaden in einem laminar strömenden Probenstrom hindurchgelangen, umgeben von Verdünnungsmittel/Mantellösung.
  • An dieser Stelle wird die Anwesenheit einer Zelle durch eine Verbundphotodiode 380, die Axiallichtverlust (ALL) und Zwischenwinkelstreuung (IAS) erfasst, einen Photomultiplier, welcher rote Fluoreszenz erfasst, und eine einzigartige Dreifachtriggerschaltung, gezeigt in 2, in dem dreidimensionalen Merkmalsraum von ALL, IAS und FL3 (rote Fluoreszenz) erfasst. Die Dreifachtriggerschaltung qualifiziert Signale zur Digitalisierung unter Verwendung von UND/ODER-Logik. Ein qualifiziertes Signal muss größer sein als der IAS-Trigger, während es gleichzeitig größer sein muss als entweder der ALL-Trigger oder der FL3-Trigger. Die Kombination dieser einzigartigen Triggerschaltung und der Lyseeigenschaften, welche eine ausgeglichene Fixierung einschließen, ermöglichen es, dass die freigelegten NRBC-Zellkerne schnell angefärbt werden, und eindeutig und nicht zweideutig gezählt und von der WBC-Differentialzellzählung ausgeschlossen werden, ohne die üblichen Störungen vom Hintergrund her, sowohl fluoreszente als auch nicht-fluoreszente wie DNA-Fragmente, RBC-Stroma und Blutplättchen.
  • Wenn Zellen, so getriggert, durch das zuvor erwähnte beleuchtete Volumen hindurchgelangen, werden bei den Detektoren 380, 400, 401 und 404 Impulse erzeugt. Die Amplituden von diesen Impulsen werden dann gefiltert, verstärkt, digitalisiert und im Listenmodus in dem entsprechenden fünfdimensionalen Merkmalsraum von ALL, IAS, FL3, PSS (polarisierte Seitenstreuung) und DSS (depolarisierte Seitenstreuung) gespeichert. Die normale Zählzeit durch Durchflusszelle 170 beträgt 10 Sekunden. Bei der Strömungsgeschwindigkeit und dem Verdünnungsverhältnis, die oben beschrieben sind, wäre mit einer normalen Patienten-WBC-Zahl von 7000 Zellen pro Mikroliter Blutvolumen die resultierende Ereigniszählrate 5000. In Niedrigzahlproben kann diese Zählzeit automatisch ausgedehnt werden, um die Statistik der Messung zu verbessern. Am Ende der Messzeit wird der Probenstrom zum Abfall geleitet, und die Sonde wird gereinigt und getrocknet und vorbereitet, um eine nachfolgende Probe zu verarbeiten. Algorithmen werden dann auf die Listenmodusdaten des zuvor genannten Merkmalsraums von ALL, IAS, FL3, PSS und DSS angewendet und die folgenden Zelltypen werden innerhalb von weniger als 30 Sekunden Verarbeitungszeit gezählt und/oder mit einem Merker versehen:
    Figure 00340001
  • ALL- und IAS-Signale werden erfasst und für die WBC/Diff-Analyse gesammelt, und FL3-Signale von angefärbten NRBC-Kernen werden für die NRBC-Analyse gesammelt, wie unten beschrieben werden wird. Die Dreifachtriggerschaltung, gezeigt in 42, qualifiziert diese Signale zur Digitalisierung unter Verwendung von UND/ODER-Logik. Um qualifiziert zu sein, muss ein Signal größer sein als der IAS-Trigger, während es gleichzeitig größer sein muss als entweder der ALL-Trigger oder der FL3-Trigger.
  • Die verschiedenen Komponenten und generierten oder genutzten Signale, die in 42 gekennzeichnet sind, entsprechen den folgenden Beschriftungen:
    • 900
    ALL-Spannungskomparator
    902
    ALL-Signal
    904
    ALL-Schwellwertspannung (Vth1)
    906
    ALL-Spannungskomparator-Ausgabe
    910
    FL3-Signal
    912
    FL3-Schwellwertspannung (Vth2)
    914
    FL3-Spannungskomparator
    916
    FL3-Spannungskomparator-Ausgabe
    918
    IAS-Signal
    920
    IAS-Schwellwertspannung (Vth3)
    922
    IAS-Spannungskomparator
    924
    IAS-Spannungskomparator-Ausgabe
    926
    ODER-Gatter
    928
    ODER-Gatterausgabe
    930
    UND-Gatter
    932
    gültige Triggerausgabe
  • Echtzeitsignale von den jeweiligen Kanälen sind an den Eingängen der Spannungskomparatoren vorhanden. Spannungskomparatoren 900, 914 und 922 arbeiten, indem sie die "+-Eingaben" (902, 910 und 918) mit den "– -Eingaben" (904, 912 und 920) vergleichen zu resultieren Ausgaben (906, 916, 924). Wenn die "+-Eingabe" von einer höheren Spannung ist als die "– -Eingabe", wird die Ausgabe hoch sein. Wenn die "+-Eingabe" von einer niedrigeren Spannung ist als die "– -Eingabe", wird die Ausgabe niedrig sein.
  • Die Schwellwertspannungen sind unabhängige Spannungen, welche durch Systemparameter bestimmt werden.
  • Die Ausgaben der Komparatoren 900 und 914 sind Eingaben für das ODER-Gatter 926, um die resultierende ODER-Gatterausgabe 928 zu ergeben. Das ODER-Gatter funktioniert, indem es seine Eingaben vergleicht. Die Ausgabe wird hoch sein, wenn entweder ein oder beide Eingaben hoch sind.
  • Die Ausgabe des ODER-Gatters 928 und die Ausgabe der Komparatoren 922 und 924 sind Eingaben für das UND-Gatter 930.
  • Das UND-Gatter funktioniert, indem es seine Eingaben vergleicht, um seine Ausgabe 932 abzuleiten, welche auch die gültige Triggerausgabe ist. Die Ausgabe wird nur dann hoch sein, wenn beide Ausgaben hoch sind.
  • Die gültige Triggerausgabe 932 wird nur hoch sein, wenn das IAS-Signal 918 größer ist als seine Schwellwertspannung 920, und entweder das ALL-Signal 902 größer ist als seine Schwellwertspannung 904 oder das FL3-Signal 910 größer ist als seine Schwellwertspannung 912.
  • Unter Verwendung der obigen Triggerschaltung bilden die NRBC ein eindeutiges Cluster in dem zuvor genannten dreidimensionalen Raum, siehe 40A – 40C und 41A und 41B, was leicht ausgezählt werden kann während der optischen WBC-Differentialanalyse, und schließen nicht zweideutig von der WBC-Zahl aus. Daher wird eine Zahl von NRBC pro 100 WBC und ein absoluter Wert für NRBC pro μl Patientenblut angezeigt. Folglich werden NRBC von den Gesamt-WBC-Zahlen subtrahiert, was eine genaue Gesamt-WBC- und Differentialanalyse in der Anwesenheit von NRBC in einer Blutprobe erlaubt. Hintergrundrauschen, sowohl fluoreszent als auch nicht-fluoreszent, von DNA-Fragmenten, RBC-Stroma, Blutplättchen, Howell-Jolly-Körperchen, basophiler Tüpfelung, RNA aus lysierten Retikulozyten und DNA aus WBC und Megakaryozyt-Fragmenten wird im Wesentlichen beseitigt. Angefärbte NRBC-Kerne werden von den verschiedenen Hintergrundrauschsignalen getrennt über das offenbarte Dreifachtriggerverfahren (auf ALL, IAS und FL3), und nur die FL3+-Signale von NRBC-Kernen oberhalb des FL3-Triggers auf dem ALL-über-FL3-Punktediagramm werden als NRBC gezählt (40A – 40C und 41A und 41B).
  • 4. Retikulozytenverfahren und Reagenz
  • Unter einem Gesichtspunkt des Zellanalysensystems 60 wird eine stabile, wässerige Reagenzzusammensetzung genutzt für die Erfassung und Zählung von Retikulozyten. Dieses Reagenz umfasst: einen unsymmetrischen Cyaninfarbstoff, der in der Lage ist, Retikulozyten anzufärben, etwa 20 mM bis etwa 50 mM eines Puffers gewählt aus der Gruppe bestehend aus Imidazolpuffer, 4- (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure ("HEPES")-Puffer, Bis-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure("Bis-Tris")-Puffer und Trishydroxymethylaminomethan("Tris")-Puffer; ein pH von etwa 6,0 bis etwa 8,0; eine Osmolarität eingestellt auf etwa 230 bis etwa 340 mOsm/l mit einem ein- oder zweiwertigen Alkalisalz; und eine nicht ionische oberflächenaktive Substanz (von etwa 5 mg/dl bis etwa 1,0 g/dl je nach oberflächenaktiver Substanz), welche die Membranpermeation erleichtert und die Cyaninfarbstoffe in einer wässerigen isotonischen Lösung stabilisiert. Vorzugsweise sind die Farbstoffe zyklisch substituiert und zeigen gesteigerte Fluoreszenz nach Bindung mit DNA oder RNA. Noch vorteilhafter umfasst das Reagenz etwa 0,1 μg/ml bis etwa 0,3 μg/ml eines zyklisch substituierten unsymmetrischen Cyaninfarbstoffes.
  • Die Verfahren für die schnelle und fortlaufende Erfassung und Zählung von Retikulozyten und CBC-Differentialen, die das vorliegende erfinderische Reagenzsystem nutzen. Derartige Verfahren unterscheiden sich wegen der besonderen Abwesenheit der Notwendigkeit, für einen separaten Inkubationsschritt zu sorgen. Die minimale Inkubationszeit von 10 bis 60 Sekunden ist alles, was notwendig ist.
  • Das offenbarte Verfahren und Reagenz sind der Gegenstand von US-Patent 5.691.204 mit der Bezeichnung "Composition And Method For The Rapid Analyses of Reticulocytes", eingereicht am 21. April 1995.
  • Das Verfahren ermöglicht die Zählung von Retikulozyten aus einer Vollblutprobe, während gleichzeitig ein separates Aliquot der Probe differenziert wird, um eine komplette Blutzell("CBC")-Analyse zu erhalten. Dieses Verfahren umfasst Lenken von einem oder mehreren Aliquoten der Probe zu verschiedenen Positionen innerhalb eines automatisierten Analysators für Analyse und Differenzierung, während ein Retikulozytenaliquot der Probe mit einem anfärbenden Reagenz kombiniert wird.
  • Das kombinierte Reagenz/Retikulozyten-Aliquot wird dann zu einer optischen Durchflusszelle 170 des automatisierten Analysators 60 geleitet. Danach wird das Reagenz/Retikulozyten-Aliquot durch eine beleuchtete Sensorzone 300 hindurchgeleitet, im Wesentlichen jeweils eine Zelle nach der anderen, um Fluoreszenz- und Streulichtereignisse herbeizuführen. Diese Ereignisse werden erfasst, und die Zahl der Retikulozyten, die in dieser Probe vorhanden sind, wird daraus bestimmt.
  • Die unsymmetrischen Farbstoffe, die mit dem Reagenzsystem verwendbar sind, haben im Allgemeinen die folgenden Merkmale:
    • 1. Absorptionsmaxima: 488 +20 nm
    • 2. hohe Nukleinsäurebindungsaffinität
    • 3. hohe Quantenausbeute: ≥ 0,1
    • 4. molarer Extinktionskoeffizient: ≥ 10.000
    • 5. Fluoreszenzsteigerung nach Bindung an RNA oder DNA: ≥ 20
    • 6. Membranpermeationsgeschwindigkeit: < 2 Minuten
  • Typischerweise sind die Farbstoffe, die in dem offenbarten wässerigen Reagenz und den offenbarten Retikulozytenzählverfahren genutzt werden, in wässerigen Umgebungen stark instabil. Jedoch stellt die offenbarte Reagenzformulierung verlängerte Stabilität und Lager- und Verarbeitbarkeitsdauer des fertigen Reagenzes bereit.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des Reagenzsystems umfasst etwa 0,05 μg/ml bis etwa 0,5 μg/ml Sybr 11, ein Markenfarbstoff verkauft von Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), etwa 20 mM bis etwa 50 mM Imidazolpuffer und etwa 5 mg/dl bis etwa 20 mg/dl N,N-Bis[3-D-gluconamidopropyl]cholamid ("BIGCHAP"), etwa 0,02 bis etwa 0,05 Proclin® 300 (5-Chlor-2-methyl-4-isothiazolin-3-on + 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on). Der pH wird auf etwa 6,8 bis etwa 7,2 mit 1 N HCl eingestellt und die Osmolarität mit NaCl auf etwa 270 bis etwa 310 mOsm/l eingestellt.
  • Ein Hauptbestandteil des Reagenzsystems ist der Farbstoff. Eine solche Klasse von Farbstoffen sind unsymmetrische Cyaninfarbstoffe wie solche, die offenbart sind in WO 94/24213, "CYCLIC-SUBSTITUTED UNSYMMETRIC DYES". Zusätzlich zeigen die Farbstoffe, die in dieser Erfindung genutzt werden, gesteigerte Fluoreszenz nach Bindung mit DNA oder RNA. Solche nützlichen Farbstoffe müssen außerdem eine hohe Bindungsaffinität zu RNA und DNA und eine hohe Quantenausbeute haben. Es wird angenommen, dass eine Vielzahl von unsymmetrischen Cyaninfarbstoffen, welche die beschriebenen und hierin beanspruchten Merkmale zeigen, verwendet werden können. Einige der Beispiele für solche Farbstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16, ebenfalls erhalten von Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) ("MPI"). Andere unsymmetrische Cyaninfarbstoffe wie Syto 12, ebenfalls bezogen von MPI, sind ebenfalls nützlich bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung. Für Syto 12 wird angenommen, dass es ein neutraler, unsymmetrischer Cyaninfarbstoff ist, der ein substituiertes Benzazoliumringsystem umfasst, das an eine Methinbrücke zu einem Pyridin- oder Chinolinringsystem gebunden ist.
  • Ein weiterer Bestandteil des Reagenzsystems ist ein Puffer, dessen pKa etwa 6,0 bis etwa 8,0 beträgt und der in der Lage ist, die (zum Anfärben von RNA oder DNA) erforderliche Konzentration des Cyaninfarbstoffes in einer wässerigen Lösung für einen ausgedehnten Zeitraum beizubehalten. Solche Puffer sollten nicht mit den Cyaninfarbstoffen oder den nicht-ionischen oberflächenaktiven Substanzen, die in der praktischen Ausführung dieser Erfindung zum Stabilisieren des Farbstoffes verwendet werden, reagieren. Beispielhafte Puffer umfassen Imidazol, Hepes, Bis-Tris und Tris.
  • Ein anderer Bestandteil des Reagenzsystems ist eine nichtionische oberflächenaktive Substanz. Je nach oberflächenaktiver Substanz, oder Kombination von oberflächenaktiven Substanzen, die verwendet wird, sollte die Konzentration etwa 5 mg/dl bis etwa 1 g/dl betragen. Die oberflächenaktiven Substanzen scheinen die Geschwindigkeit der Cyaninfarbstoffpermeation durch die Zellmembran zu steigern (innerhalb von 30 Sekunden). Zusätzlich werden die Löslichkeit und die Stabilität der Cyaninfarbstoffe in einer isotonischen wässerigen Lösung durch die oberflächenaktive Substanz gesteigert. Solche oberflächenaktiven Substanzen sollten jedoch nicht ausfallen oder mit den Cyaninfarbstoffen reagieren oder RBCs lysieren, auch nicht bei niedrigen Konzentrationen. Beispiele für solche oberflächenaktiven Substanzen sind, sind aber nicht beschränkt auf, BIGCHAP, n-Dodecyl-D-Maltosid, Polyoxypropylen- Polyoxyethylen-Blockcopolymer ("Pluronic® F127"), n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methyl-glucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid.
  • Noch ein anderer Bestandteil des Reagenzsystems ist ein ein- oder zweiwertiges Alkalisalz, um die Osmolarität des Reagenzes auf etwa 230 mOsm/l bis etwa 340 mOsm/l einzustellen, um die Lyse von roten Zellen, einschließlich der Retikulozyten, oder der weißen Zellen zu verhindern. Solche Salze sollten weder mit den Cyaninfarbstoffen reagieren noch in Lösung ausfallen.
  • Beispiele für solche Salze umfassen NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2, ZnCl2 und andere.
  • Ein wahlweiser Bestandteil ist ein Konservierungsmittel, um mikrobielles Wachstum in dem Reagenz zu verhindern. Ein derartiges Konservierungsmittel sollte die Lichtstreuungs- oder Fluoreszenzemissionseigenschaften der Zellen oder angefärbten Zellen nicht verändern. Beispiele für derartige Konservierungsmittel umfassen Proclin® 300, Proclin® 150, Natriumazid und andere.
  • Im Allgemeinen jedoch umfasst ein Verfahren zur praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung das Mischen einer Vollblutprobe mit einem Reagenz, um die RNA von allen vorhandenen Retikulozyten anzufärben, Spülen der Mischung, im Wesentlichen jeweils eine Zelle nach der anderen, durch eine beleuchtete optische Durchflusszelle, Erfassen des gestreuten Lichts und der davon emittierten Fluoreszenz und Bestimmen der Menge von Retikulozyten, die in der Probe vorhanden sind, ohne dass die Probe/Reagenz-Mischung einem separaten Inkubationsschritt oder einer separaten Inkubationszeit unterworfen wird.
  • Um eine Vollblutprobe auf den prozentualen Anteil sowie auf die absoluten Zahlen von Retikulozyten auf dem oben beschriebenen Multiparameter-Hämatologieanalysator zu analysieren, werden 18,75 μl einer Vollblutprobe mittels einer Probenansaugsonde in die RBC-Schale 134 abgeschieden, welche etwa 7856 μl einer Verdünnungsmittel-/Mantellösung (eine isotonische Salzlösung) enthält, und die Fluide werden gemischt. Die verdünnte Probe wird dann zu einer ummantelten Impedanzapertur 174 transportiert, um die absoluten RBC-Zahlen der Probe elektronisch zu bestimmen. In der Zwischenzeit werden etwa 200 μl der verdünnten Probe in Retic-Schale 136 überführt, die 600 μl des offenbarten Reagenzes enthalten, wo sie gemischt wird. Die vorbereitete (gemischte) Probe wird dann zu der ummantelten optischen Durchflusszelle 170 für den Nachweis transportiert. Der Messvorgang beginnt, wenn der Zellstrom durch die Durchflusszelle hindurchgeht, im Wesentliche jeweils eine Zelle nach der anderen, in einem laminar strömenden Probenstrom, der von einer Verdünnungsmittel-Mantellösung umgeben ist, die hierin offenbart wird.
  • Zu diesem Zeitpunkt, und wie in dem zweidimensionalen Merkmalsraum von IAS und FL1 des Zytogramms von 14A und 14B gezeigt, wird die Anwesenheit einer Zelle nachgewiesen durch eine Zwischenwinkelstreuungsphotodiode 380, welche Licht in einem Kegel von 3° bis 10° erfasst, und einen Photomultiplier ("PMT") 400, welcher grüne Fluoreszenz, FL1, erfasst. Wenn Zellen durch das zuvor erwähnte beleuchtete Volumen hindurchgelangen, werden Impulse erzeugt und durch diese Detektoren gemessen. Die Amplituden dieser Impulse werden dann gefiltert, verstärkt, digitalisiert und im Listenmodus in dem entsprechenden zweidimensionalen Merkmalsraum von IAS und FL1 gespeichert. Die Zellen werden 8 Sekunden lang gezählt. Bei der Strömungsgeschwindigkeit und dem Verdünnungsverhältnis, die oben beschrieben wurden, wäre bei normalen RBC-Zahlen für einen Menschen von 5 Millionen pro Mikroliter Blutvolumen die resultierende Ereigniszählrate 5950 pro Sekunde. Algorithmen werden dann auf die Listenmodusdaten des zuvor erwähnten Merkmalsraums von IAS und FL1 angewendet und die folgenden Parameter werden innerhalb von 20 Sekunden Rechenzeit gemessen:
    • 1. RBC-Gatter: WBCs und Blutplättchen werden ausgeschlossen, indem die RBC-Population einschließlich Retikulozyten durchgelassen wird, WBCs und Blutplättchen aber ausgeschlossen werden.
    • 2. Der prozentuale Anteil von Retikulozyten: Die durchgelassene RBC-Population wird wieder analysiert gemäß der Größe ihrer FL1-Signale. Eine logarithmische Anpassung wird auf das FL1-Histogramm angewendet, um den Bereich zu definieren, welcher zu ausgereiften RBCs gehört, und die Zellen, deren FL1-Signale über den Bereich fallen, werden als Retikulozyten markiert. Der Anteil von Retikulozyten in % wird berechnet, indem die Zahl der Retikulozyten durch die Gesamt-RBC-Zahl dividiert wird.
    • 3. Die absolute Retikulozyten-Zahl: Erhalten durch Multiplizieren des prozentualen Anteils von Retikulozyten mit der absoluten RBC-Zahl der Probe aus dem CBC-Modus.
    • 4. Retikulozytenreifeindex ("RMI"): RMI wird ausgedrückt als der prozentuale Anteil von Retikulozyten, deren FL1-Signale um mehr als eine (1) Standardabweichung ("S.D.") über der mittleren Fluoreszenz einer normalen Retikulozytenpopulation liegen.
  • Eine derartige Beschreibung ist nur der Bequemlichkeit halber und auf keinen Fall ist der Ausdruck für RMI der vorliegenden Erfindung nur auf die hier besprochenen Algorithmen beschränkt.
  • 5. Alternative Retikulozytenfärbung & Analyse
  • Die offenbarte alternative Klasse von Retikulozytenfarbstoffen ist stabil gegenüber Licht bei Raumtemperatur, besitzt eine verbesserte Fluoreszenzerhöhung des gebundenen Farbstoffes gegenüber dem ungebundenen Farbstoff, zeigt RNA-Selektivität gegenüber DNA, ermöglicht verbessertes Durchlassen der Retikulozytenzellen, liefert schnellere Permeation von Zellmembranen und besitzt ein optisches Absorptionsmaximum, das eng angepasst ist an das Emissionsmaximum eines Argonlaserstrahl (etwa 488 nm).
  • Ein bevorzugter Farbstoff gehört zu einer Klasse von Molekülen mit der allgemeinen Strukturformel:
    Figure 00420001
    worin:
    x = 0, S, Se oder C(CH3)2
    R1 = Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffen
    R2 = Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffen
    R3 = kondensiertes Benzol, Alkyl (mit 1-6 Kohlenstoffen), Methoxy oder Wasserstoff
    R4 = Alkyl mit 1-6 Kohlenstoffen, Methoxy oder Wasserstoff
    n = null oder eine ganze Zahl von 1-6
  • Diese Klasse von Farbstoffen wird hierin als "2,2'-Farbstoffe" bezeichnet werden.
  • Die bevorzugte Ausführungsform des oben gezeigten Retikulozytenfarbstoffes ist die, worin:
    vorzugsweise × Schwefel (S) ist
    vorzugsweise R3 und R4 beide Wasserstoff sind
    vorzugsweise n = 0 ist und
    vorzugsweise R1 und R2 beide Ethyl sind.
  • Dieser Farbstoff ist in dem Koch-Light-Biochemikalien-Katalog 1985 und 1988/89 auf Seite 53 aufgeführt in der Form eines Iodidsalzes und als 1,3'-Diethyl-2,2'-chinolylthiacyaniniodid bezeichnet. Er ist außerdem in dem Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho-Katalog auf Seite 7 aufgeführt. Der Bequemlichkeit halber werden wir hierin diesen speziellen Farbstoff, die besonders bevorzugte Ausführungsform, als "DE22QTC" bezeichnen, und die allgemeine Klasse von Farbstoffen, wie oben definiert, als "2,2'-Farbstoffe".
  • Allgemein werden diese Farbstoffe in der Form ihrer Salze verwendet, wobei Iodide besonders geeignet sind. Wie in dieser Spezifikation verwendet sollte bei allen Verweisen auf diese Farbstoffe verstanden werden, dass sie derartige Farbstoffe in Salzform einschließen.
  • In einer Ausführungsform befindet sich ein Reagenz, das nützlich ist zum Anfärben von RNA-haltigem Material, welches aus einem 2,2'-Farbstoff besteht, welcher in der Lage ist, RNA-haltiges Material anzufärben.
  • Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Anfärben von RNA-haltigem Material, worin eine wässerige Färbelösung von einem 2,2'-Farbstoff, der in der Lage ist, RNA-haltiges Material anzufärben, in Kontakt gebracht wird mit einem RNA-haltigen Material für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um zu ermöglichen, dass der Färbelösungsfarbstoff das RNA-haltige Material durchdringt.
  • Eine andere Ausführungsform stellt ein Verfahren bereit zur Zählung von Retikulozyten in einer Vollblutprobe unter Verwendung von Durchflusszytomtrie, worin eine wässerige Färbelösung von einem 2,2'-Farbstoff, der in der Lage ist, RNA-haltiges Material abzufärben, in Kontakt gebracht wird mit einem RNA-haltigen Material für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um zu ermöglichen, dass der Färbelösungsfarbstoff mit dem RNA-haltigen Material ins Gleichgewicht kommt. Die angefärbte Probe wird dann durch die optische Messzone eines Durchflusszytometrieinstruments geleitet und einmal innerhalb der optischen Messzone mit einem einfallenden Laserstrahl beleuchtet. Die Fuoreszenz der Retikulozyten in der Probelösung wird dann gemessen, wenn sie durch die optische Messzone hindurchgelangen.
  • Ein wichtiger Vorteil der 2,2'-Farbstoffe ist, dass sie in wässeriger Lösung stabiler zu sein scheinen als Thiazolorange. Das ist untersucht worden unter Verwendung von Proben von DE22QTC, Thiazolorange (beide bei 0,1 μg/ml in isotonischem Verdünnungsmittel) und "Retic-COUNT", aufbewahrt sowohl bei 4°C in der Dunkelheit als auch bei Raumlicht bei Raumtemperatur (etwa 25°C) über einen Zeitraum von 5 Tagen.
  • Die 2,2'-Farbstoffe zeigen eine merklich größere Fluoreszenz, wenn eher RNA als DNA die Bindungssubstanz ist. Auf einer Masse-Masse-Basis ermöglicht DE22QTC leichtes Durchlassen von roten Blutkörperchen weg von Blutplättchen und weißen Zellen unter Verwendung einer Strategie, die zuvor für die Retikulozytenanalyse nicht angenommen war. Der Farbstoff liefert durch seine signifikante Anfärbung von Blutplättchen über dem 30-Minuten-Zeitraum eines typisches Tests und seine erwartete Anfärbung von weißen Zellen in dem gleichen Zeitraum eine signifikante Differenzierung beider Gruppen von Zellen von allen roten Zellen bei einer Aufzeichnung von Fluoreszenz über Vorwärtsstreuung. Das schnelle Anfärben ist eine Eigenschaft, die nicht von vielen Farbstoffen gezeigt wird; z.B. färbt Thiazolorange Blutplättchen nicht merklich über dem 30-Minuten-Zeitraum an, auch wenn sich nach mehreren Stunden Anfärbung ereignet.
  • DE22QTC, wenn gebunden an RNA oder DNA, hat ein Absorptionsmaximum von fast genau 488 nm und eine Stokesche Verschiebung von etwa 33 nm. Dieser Farbstoff kann deshalb mit maximalem Vorteil mit dem Standard-Argonionenlaser verwendet werden. Weiterhin können die ohne weiteres verfügbaren optischen Filter, die für Fluoreszenn-basierte Assays verwendet werden, verwendet werden, und das Instrument braucht nicht modifiziert zu werden.
  • Die 2,2'-Farbstoffe können in jedem herkömmlichen Assayverfahren verwendet werden, welches das Anfärben von Retikulozyten mit einem Fluoreszenzmarker erfordert. Insbesondere können diese Farbstoffe in jedem Assay verwendet werden, für den Thiazolorange gegenwärtig empfohlen wird, wie Retikulozytenerfassung und -zählung in einem Argonionenlaser-Durchflusszytometer.
  • Wenn diese Klasse von Farbstoffen genutzt wird, um Retikulozyten zu erfassen und zu differenzieren, müssen eine Inkubationsstelle und verbundene Temperaturkontrollen und Probenhandhabungsvorrichtungen innerhalb des Instruments vorgesehen werden und operativ mit dem Analysator verbunden werden, um die Automatisierung des hier offenbarten erfinderischen Instrumenten-Systems zu bewahren.
  • 6. HGB-Reagenz
  • Das Hämoglobin("HGB")-Reagenz, das hierin besprochen wird, ist offenbart in US-Patent 5.612.223, "CYANIDE-FREE REAGENT AND METHOD FOR THE DETERMINATION OF HEMOGLOBIN", eingereicht am 11. März 1994.
  • Ein Cyanid-freies Reagenz muss in der Lage sein, die Erythrozyten schnell zu lysieren und mit dem Hämoglobin schnell Komplexe zu bilden, so dass eine erfassbare Farbstruktur gebildet wird für Nachweis und Messung. Das offenbarte Reagenz ist viele Wochen lang stabil und ist besonders vorteilhaft, da das resultierende Chromogen frei von Störungen durch andere Blutkomponenten zu sein scheint und bei Wellenlängen in dem Spektralbereich von automatisierten Hämatologiemessgeräten, die bereits auf dem Markt sind, gemessen werden kann. Für Vergleichszwecke, das Cyanmethämoglobinverfahren misst typischerweise die Extinktion bei 540 nm. Ein rötlichbraunes Chromogen kann gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet werden, das ein Extinktionsmaximum bei etwa 544 nm hat.
  • Ein HGB-Reagenz, für das festgestellt worden ist, dass es in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, ist eine wässerige Lösung einer Ligand-bildenden Verbindung wie Imidazol und Imidazolderivate. Die Ligand-bildende Verbindung ist in Konzentrationen von 0,1 M bis 2,0 M Imidazol, von dem vorliegenden Reagenz, vorhanden, ligiert mit dem Hämoglobin, welches von den Erythrozyten in der Probe freigesetzt wird. Andere Ligand-bildenden Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen N-Hydroxyacetamid, N-Hydrxylamin, Pyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrazol, Pyrimidin, Purin, Chinolin und Isochinolin. Anionen, welche das oxidierte Eisenhäm binden können, umfassen Cyanat, Fluorid, Azid, Nitrit, Hydroxid, Acetat und Formiat; verträgliche Salze dieser Anionen umfassen Natrium-, Kalium-, Ammoniumsalze und dergleichen.
  • Das Reagenz enthält weiter eine oberflächenaktive Substanz mit einer starken erythrolytischen Fähigkeit. Lauryldimethylaminoxid (Ammonix L.O.) [Stepan Chemical Company, Northfield, Illinois] und Oktylphenoxypolyethoxyethanol (Triton × 100) oder andere starke Detergenzien können als oberflächenaktive Komponente des Lysier-Reagenzes verwendet werden. Die oberflächenaktive Substanz sollte bei Konzentrationen von etwa 0,1 % bis etwa 1,0% (G/V) vorhanden sein. Der pH des Reagenzes sollte auf zwischen 11 und 14, vorzugsweise auf 12,5 eingestellt sein. Einwertige Basen wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid können für die pH- Einstellung verwendet werden.
  • Gemäß dem Verfahren zum Bestimmen von HGB (ausführlicher später in Abschnitt 8 E. und Beispiel 2 hierin beschrieben) wird das Lysier-Reagenz mit einer Vollblutprobe in dem Verhältnis von ungefähr 50-1000:1 Reagenz zu Blut gemischt. Die Probe und das Reagenz können schnell gemischt werden, um Erythrolyse und Umwandlung von Hämoglobin zu dem Chromogen zu erreichen. Die Probe- und Reagenzmischung kann dann einem Extinktionsspektrophotometer präsentiert werden, wo die optische Dichte des gebildeten Chromogens gemessen wird. Wenn der Ligand Imidazol ist, kann die Messung zwischen 540 nm und 550 nm durchgeführt werden. Die Gesamthämoglobinkonzentration in der Probe bezieht sich auf die optische Dichte des umgewandelten Chromogens.
  • 7. Isotonisches Verdünnungsmittel-Mantelreagenz
  • Das Zellanalysensystem 60 der vorliegenden Erfindung nutzt eine gepufferte isotonische Lösung mit nichtionischer oberflächenaktiver Substanz, die zum Minimieren der Oberflächenspannung der Mantelströmung und für die schnelle Analyse von roten Blutkörperchen und Blutplättchen geeignet ist. Das Reagenzsystem kann Blasenbildung im Wesentlichen vollständig verringern und eine glatte Strömung der Mantelströmung sowohl für Impedanz- als auch optische Durchflusszellen verstärken. Das unten offenbarte Verdünnungsmittel-Mantelreagenz verbessert auch die Abtrennung von mikrozytischen roten Blutkörperchen von Blutplättchen, während es gleichzeitig die Morphologie von sowohl roten Blutkörperchen- als auch Blutplättchenpopulationen im Wesentlichen bewahrt für eine genau und exakte Messung von Zahlen und Volumen.
  • In einer Ausführungsform sind etwa 10 mM bis etwa 50 mM einer gepufferten isotonischen Kochsalzlösung, deren pKa etwa 6,0 bis etwa 8,0 ist, in der Lage, den pH des Reagenzes innerhalb eines pH-Bereichs von etwa 7,0 bis etwa 7,6 beizubehalten, ist ein einwertiges Salz von EDTA mit etwa 0,1 Gramm pro Liter bis etwa 0,4 Gramm pro Liter vorhanden, um Blutplättchenklumpen zu verhindern, wird außerdem ein einwertiges Salz genutzt, das ausreichend ist, um die Osmolarität des Reagenzes auf etwa 270 mOsm/l bis etwa 320 mOsm/l einzustellen, wie eine nichtionische oberflächenaktive Substanz vorhanden ist, welche die Oberflächenspannung verringert, Blasenbildung verhindert und die Abtrennung von mikrozytischen roten Blutkörperchen von Blutplättchen steigert, gewählt aus der Gruppe n-Dodecyl-D-Maltosid, n-Tetradecyl-D-Maltosid, Decanoyl-N-methylglucamid, n-Dodecyl-D-glucopyranosid und n-Decyl-D-glucopyranosid, und zuletzt ist ein Konservierungsmittel vorhanden, um mikrobielles Wachstum zu verhindern, und deionisiertes Wasser.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagenz etwa 2,45 Gramm pro Liter Natriumphosphat, dibasisch, etwa 0,40 Gramm pro Liter Kaliumphosphat, monobasisch, etwa 0,20 Gramm Dinatrium-EDTA pro Liter, etwa 8,05 Gramm Natriumchlorid pro Liter, etwa 0,40 Gramm Kaliumchlorid pro Liter, etwa 0,012 Gramm n-Dodecyl-D-Maltosid pro Liter und etwa 0,03 Gramm pro Liter Proclin 300, pH eingestellt auf 7,4 und Osmolarität eingestellt auf 315 mOsm/l.
  • In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden 17,5 Mikroliter einer Blutprobe schnell mit 7400 Mikroliter des Verdünnungsmittel-Mantelreagenzes gemischt (Verdünnung 1:420), und 0,5 Mikroliter der verdünnten Probe werden durch einen hydrodynamisch fokussierten (ummantelten) Impedanzwandler 12 Sekunden lang hindurchgelassen für rote Blutkörperchenzählungen und Volumenmessung sowie Blutplättchenzählungen, und 2,5 Mikroliter der verdünnten Probe werden durch eine ummantelte optische Durchflusszelle 6 Sekunden lang hindurchgelassen für genaue und exakte Blutplättchenzahlbestimmung. Rauschsignale von Fragmenten von fragilen anomalen Zellen werden von den optischen Blutplättchenzählungen ausgeschlossen, indem die Blutplättchenpopulation genau durch den Blutplättchenalgorithmus des Zellanalysensystems 60 eingeklammert wird. Typische Beispiele für die rote Blutkörperchen- und Blutplättchenverteilung von normalen und anomalen Blutproben des Zellanalysensystems 60 sind in 45A – 45F und 46 – 47 dargestellt.
  • 8. Analysatormodul
  • A. Automatisierter Probentransport
  • Der Analysator 64 kann mit einer automatischen Ladevorrichtung (nachfolgend kurz Autolader, nicht gezeigt) versehen werden, um Probenröhrchen automatisch zu dem Analysator 64 für die Verarbeitung zu transportieren. Ein solcher Autolader kann einen Halter einschließen, welcher bis zu 100 Probenröhrchen verschiedener Größe hält. Eine Präsentationsvorrichtung, welche die Probenröhrchen dem Analysator 64 zum Ansaugen präsentiert, ist operativ mit dem Autolader verbunden. Ein Mischer, welcher die Probe kurz vor der Probenansaugung mischt, kann ebenfalls operativ mit dem Autolader verbunden sein. Ein Barcodeleser zum Lesen des Barcodeetiketts auf jedem Röhrchen kann ebenfalls operativ mit dem Autolader verbunden sein und operativ mit der Systemsteuerung verbunden sein, um Probeninformationen in die Systemsteuerung einzugeben.
  • B. Automatisierte Probenverarbeitung und Messung
  • 3 veranschaulicht eine Draufsicht von einer Ausführungsform eines automatisierten Probenverarbeitungsbereichs 110 zur Verwendung in dem Zellanalysensystem 60, das in 1 gezeigt wird. Der Verarbeitungsbereich 110 ist Teil des Analysatorabschnitts 64 des Zellanalysensystems 60. Der Verarbeitungsbereich 110 umfasst einen Probenschalenbereich 114 und einen Inkubationsbereich 118.
  • Wie in 3 gezeigt wird, umfasst der Inkubationsbereich 118 einen thermostatisierten Block 120 zur Aufnahme von Reagenzmodulen 122, Subset/Phänotypisierungs-Inkubationstabletts 124 und Sondenwasch- und -trockeneinheit 144. Der thermostatisierte Block 120 umfasst einen Temperaturregler (nicht gezeigt) zum Heizen und/oder Kühlen der Inkubationstabletts 124 und der Reagenzmodule 122, die in dem thermostatisierten Block 120 abgelegt sind.
  • Die Reagenzmodule 122 umfassen Vertiefungen 128 zum Halten eines Volumens von Antikörperreagenz. In der veranschaulichten Ausführungsform hat jedes Reagenzmodul 122 ein Gehäuse mit einer Reagenzvertiefung 128, vorzugsweise sechs an der Zahl, bepackt mit einem bestimmten Panel von Reagenzien. Die Reagenzien in jedem Panel sind so gewählt, dass für die Tests, die mit jedem Panel verbunden sind, eine ungefähr gleiche Menge von Reagenz aus jeder Vertiefung 128 verwendet wird. Falls weniger als sechs Reagenzien für den Test erforderlich sind, der mit dem Panel verbunden ist, sind die überschüssigen Vertiefungen 128 durch einen Stopfen bedeckt (nicht gezeigt). Jedes Reagenzmodul 122 ist außerdem mit einem Speicher ausgestattet, wie ein nichtflüchtiger RAM und dergleichen, um Modul-ID und Gebrauchsinformationen zu speichern. Die Reagenzmodule 122 sind vorzugsweise mit einem Bolzen versehen, so dass sie in eine Öffnung (nicht gezeigt), die sich in dem thermostatisierten Block 120 befindet, in einer vorherbestimmten Ausrichtung gesetzt werden können. Das ermöglicht der Zentraleinheit (CPU) des Analysators 64, den Ort und, aus den Gebrauchsinformationen, das Volumen des Inhalts von jeder Vertiefung 128 in jedem Reagenzmodul 122 zu speichern.
  • Die Subset/Phänotypisierungs-Inkubationstabletts 124 sind in der veranschaulichten Ausführungsform im Wesentlichen rechteckig in der Form und haben mehrere Reihen Inkubationsstellen 132 darauf ausgebildet. Jede Inkubationsstelle 132 ist in der Lage, eine Blutproben- und Antikörpermischung aufzunehmen, die inkubiert wird als Vorbereitung für eine Immun/Phänotypisierungsprüfung. Die Subset/Phänotypisierungstabletts 124 werden entfernbar in Öffnungen (nicht gezeigt) in dem thermostatisierten Block 120 gesetzt, so dass ihre Temperaturen durch den Temperaturregler des thermostatisierten Blocks 120 geregelt werden.
  • Der Probenschalenbereich 114 umfasst eine Reihe von Probenschalen, Versenkungen 114b und Ablasskanäle 114a. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen diese Schalen eine "RBC"-Schale 134, eine "RETIC"-Schale 136, eine "WBC"-Schale 138, eine "Transfer"-Schale 140, eine "HGB"-Schale 142 und eine "Wasch"-Schale 144a. Jede Probenschale ist oben offen zur Aufnahme eines Fluids. Die Böden der RBC-Schale 134, der RETIC-Schale 136, der WBC-Schale 138 und der HGB-Schale 142 sind mit einem Rohrleitungsnetzwerk 182 (gezeigt in 5) verbunden zum Transportieren von Proben zu den Messdurchflusszellen/Wandlern. Es ist außerdem möglich, Fluide wie Verdünnungsmittel, Reagenz, Lysemittel und dergleichen in den Schalen über das Rohrleitungsnetzwerk 182 abzuscheiden. Das kann erreicht werden, indem das Rohrleitungsnetzwerk 182 an Anschlüsse (nicht gezeigt) angeschlossen wird, die in den Wänden der verschiedenen Schalen ausgebildet sind. Die Positionierung dieser Anschlüsse und deren jeweilige Innendurchmesser ermöglichen, dass Mischen als ein Ergebnis der Fluidbewegung stattfindet, die durch den Liefermechanismus verursacht wird, welcher vorzugsweise eine Verdünnungsspritze gekoppelt an das Rohrleitungsnetzwerk 182 ist.
  • RBCs werden in der WBC-Schale 138 unter Verwendung von zum Beispiel dem Schnelllyse-Mehrzweckreagenzsystem lysiert, das zuvor besprochen wurde. Dementsprechend umfasst die WBC-Schale 138 einen Temperaturregler oder ein Heizgerät zum Erwärmen der Schnelllyse- und Probenmischung, vorzugsweise auf etwa 40°C. Zusätzlich umfasst die WBC-Schale 138 einen Verwirbeler 610 (37), um Motor-angetriebenes Wirbelmischen der Lysemittel- und Vollblutkombination bereitzustellen.
  • Zur Verdeutlichung wird eine beispielhafte Ausführungsform der Probenvorbereitung mit Bezug auf 37 bis 39 besprochen. Eine Ausführungsform, veranschaulicht in 37, stellt einen Apparat 610 bereit. Der Apparat 610 umfasst allgemein einen Mischapparat 612, einen Fluiddispenser 614 und einen Mischregler 616. Der Mischapparat ist weiter beschrieben und beansprucht in US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/356.412, eingereicht am 15. Dezember 1994, deren vollständiger Inhalt hier durch Verweis eingefügt wird.
  • Der Mischapparat 612 ist operativ mit dem Fluiddispenser 614 verbunden, so dass der Fluiddispenser 614 ein erstes Fluid, wie eine Vollblutprobe, eine Zellsuspension und dergleichen, in den Mischapparat 612 einführt. Der Fluiddispenser 614 ist elektrisch mit dem Mischregler 616 durch Leiter 618 verbunden, so dass der Mischregler 616 den Betrieb des Fluiddispensers 614 überwacht und koordiniert. Der Mischregler 616 ist elektrisch mit einer Quelle 620 für elektrische Energie durch Leitung 622 verbunden, um den Mischregler 616 mit elektrischer Energie zu versorgen. In einer beispielhaften Ausführungsform ist der Fluiddispenser 614 eine Pipettiervorrichtung, die operativ mit einer geeigneten Quelle von Fluid verbunden ist, die durch den Apparat 610 vorbereitet werden soll. Der Mischregler 616 kann ein Computer sein mit Speicher, der geeignete Routinen zur Steuerung des Betriebs von Apparat 610 enthält und ausführt.
  • Die veranschaulichte Ausführungsform des Mischapparates 612 umfasst ein erstes oder inneres Gehäuse 624, ein zweites oder äußeres Gehäuse 626 und ein Verbindungsglied 627. Das Innengehäuse 624 und das Außengehäuse 626 sind im Wesentlichen zylindrisch und umfassen offene Enden, um die Einführung von Fluid aus dem Fluiddispenser 614 in einen Innenraum 628 des Innengehäuses 624 zu erleichtern. Das Innengehäuse 624 und das Außengehäuse 626 sind im Wesentlichen koaxial angeordnet, wobei das Innengehäuse 624 im Wesentlichen innerhalb des Außengehäuses 626 angeordnet ist.
  • Das Verbindungsglied 627, veranschaulicht in 37 und 39, umgibt im Wesentlichen die offenen Ende des Innenglieds 624 und des Außenglieds 626 und verbindet diese operativ. Das Verbindungsglied 627 umfasst einen ersten im Wesentlichen kreisförmigen Vorsprung 630, welcher sich mit einer im Wesentlichen kreisförmigen Kerbe 632 an dem Innenglied 624 neben dessen offenem Ende verbindet, und einen zweiten im Wesentlichen kreisförmigen Vorsprung 634, welcher sich mit einer im Wesentlichen kreisförmigen Kerbe 636 an dem Außenglied 626 neben dessen offenem Ende verbindet. Um das Zurückhalten des Vorsprungs 630 innerhalb der Kerbe 632 zu erleichtern, wird ein O-Ring 638 bereitgestellt, der im Wesentlichen eine Rußendurchmesserfläche des im Wesentlichen kreisförmigen Vorsprungs 630 umrundet. Der O-Ring 638 arbeitet im Wesentlichen als eine Federklemme, um im Wesentlichem den Vorsprungs 630 innerhalb der Kerbe 632 zu sichern. Der O-Ring 638 hält das offene Ende des Innengehäuses 624 im Wesentlichen stationär bezüglich des offenen Endes des Außengehäuses 626 während des Betriebs von Apparat 610.
  • Das Innengehäuse 624 umfasst Strukturen zum Einführen von Fluid in den Innenraum 628 und zum Entfernen von Fluid aus dem Innenraum 628 des Innengehäuses 624. Ausdrücklicher umfasst das Innengehäuse 624 einen Fluideingang 642 und einen Fluidausgang 644. In einer Ausführungsform können der Fluideingang 642 und der Fluidausgang 644 aus Edelstahlrohrleitung gefertigt sein. In einer anderen Ausführungsform kann der Fluideingang 642 eine Leitung umfassen, wie eine Spule oder dergleichen, die neben dem Innengehäuse 624 angeordnet ist, so dass thermische Energie aus dem Innengehäuse 624 zu der Leitung überführt werden kann, wodurch thermische Energie auf das Fluid aufgebracht werden kann vor der Einführung in den Innenraum 628 des Innengehäuses 624. Der Fluideingang 642 in einer beispielhaften Ausführungsform ist um etwa 36,5 mm (1,43 Inch) von einem fernen Ende des Innengehäuses 624 axial versetzt. Der Fluidausgang 644 ist im Wesentlichen zentrisch an einem nahen Ende 646 des Innengehäuses 624 angeordnet. Um die Bewegung von Fluid von dem Innenraum 628 des Innengehäuses 624 in den Fluidausgang 644 zu erleichtern, ist das nahe Ende 646 von einer axialen Wand des Innengehäuses her in Richtung des Fluidausgangs 644 geneigt oder gekrümmt.
  • Der Fluideingang 642 ist fluidisch durch eine geeignete Leitung 648 an eine Quelle 650 eines zweiten Fluids angeschlossen, wie eine Lyselösung, ein Verdünnungsmittel oder dergleichen, die in den Innenraum 628 des Innengehäuses 624 eingeführt werden soll. Die Quelle 650 kann einen Mechanismus umfassen, wie eine Spritzenpumpe und dergleichen, um Fluid positiv aus der Quelle 650 durch die Leitung 648 zu dem Fluideingang 642 und dem Innenraum 628 des Innengehäuses 624 zu bewegen. Der Fluidausgang 644 ist fluidisch durch eine geeignete Leitung 652 an einen Tank 654 angeschlossen. Der Tank 654 kann ein anderer Teil von einem Analyseninstrument sein, mit welchem der Apparat 610 operativ verbunden ist. In anderen Ausführungsformen kann der Tank 654 Fluid aus dem Innenraum 628 des Innengehäuses 624 zurückhalten, bis es für eine weitere Verarbeitung benötigt wird.
  • In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, Fluid innerhalb des Innenraums 628 von dem Innengehäuse 624 bei einer gewünschten Temperatur zu halten. Dieses Fluid kann von dem Fluiddispenser 614 sein, aus der Quelle 650 sein, oder eine Kombination von Fluiden aus dem Fluiddispenser 614 und der Quelle 650 sein. Hierzu ist ein Heizelement 656 operativ mit dem Innengehäuse 624 verbunden. In der veranschaulichten Ausführungsform ist das Heizelement 656 ein elektrisches Heizelement. Das Heizelement 656 in der veranschaulichten Ausführungsform umgibt im Wesentlichen einen Abschnitt einer Außendurchmesseroberfläche des Innengehäuses 624 und berührt diese. Auf diese Weise wird thermische Energie, die durch das Heizelement 656 erzeugt wird, zu dem Innengehäuse 624 überführt und von dort zu dem Inhalt, d.h. dem Fluid, das in dem Innenraum 628 des Innengehäuses 624 angeordnet ist.
  • Das Heizelement 656 ist elektrisch durch Leiter 658 an einen Heizungsregler 660 angeschlossen. Der Heizungsregler 660 legt geeignet elektrische Energie an das Heizelement 656 an, so dass die gewünschte Menge an thermischer Energie durch das Heizelement 656 erzeugt wird und an das Innengehäuse 624 aufgebracht wird.
  • Um die Temperatur zu überwachen, die mit dem Heizelement 656 und dem Innengehäuse 624 verbunden ist, wird ein Sensor 664 bereitgestellt, der operativ thermisch mit dem Heizelement 656 und dem Innengehäuse 624 verbunden ist. In einer beispielhaften Ausführungsform ist ein Einschnitt an dem Innengehäuse 624 geformt, um den Sensor 664 aufzunehmen, so dass ein Außenprofil des Innengehäuses 624 im Wesentlich stetig und glatt ist. In einer Ausführungsform ist der Sensor 664 ein Widerstandstemperaturdetektor.
  • Der Heizungsregler 660 arbeitet im Allgemeinen, indem er ein elektrisches Signal, das die Temperatur anzeigt, die mit dem Innengehäuse 624 verbunden ist, mit einem Referenzsignal vergleicht und ein Ergebnis des Vergleichs verwendet, um das Heizelement 656 anzusteuern.
  • Das Innengehäuse 624 kann nicht nur ein Fluid in dem Innenraum 628 auf einem gewünschten thermischen Energiepegel halten, sondern kann bei Bedarf auch Fluide kombinieren oder mischen, wie zum Beispiel ein erstes Fluid von dem Fluiddispenser 614 und ein zweites Fluid von der Quelle 650. Um die Fluidkombination zu erleichtern, ist ein nahes Ende des Innengehäuses 624 operativ mit einer Antriebsmaschine 686 verbunden, so dass sich das Innengehäuse 624 als Reaktion auf die Aktion der Antriebsmaschine 686 bewegt. Ein nahes Ende des Außengehäuses 626 ist an der Antriebsmaschine 686 durch Verbindungselemente 687 fixiert. In einer beispielhaften Ausführungsform ist die Antriebsmaschine 686 ein elektrischer Gleichstrommotor wie Modell Nr. LC22-107, erhältlich von SKC Shinano Kenshi Corp. aus Culver City, Kalifornien. Diese Ausführungsform der Antriebsmaschine 686 arbeitet bei etwa 3.000 Upm.
  • Eine Verbindungsbaugruppe 688 verbindet die Antriebsmaschine 686 operativ oder antreibend mit dem Innengehäuse 624. Die Verbindungsbaugruppe 688 umfasst ein Antriebsglied 690 (38) und ein Lager 692. Eine Welle 696 an dem Antriebsglied 690 ist mit dem Lager 692 gekoppelt durch geeignete Mittel, wie eine Schraubensicherung, die über eine Nut in der Welle 696 gehalten wird. Das Lager 692 ist mit dem nahen Ende des Innengehäuses 624 durch einen O-Ring 694 gekoppelt, welcher eine relative sanfte, elastomer gepolsterte mechanische Kopplung von Lager 692 an das Innengehäuse 624 bereitstellt. Der O-Ring 694 kompensiert außerdem elastomer Winkelmittellinienversatz verursacht durch Bewegung (z.B. exzentrisch) allein an dem nahen Ende des Innengehäuses 624. Wie in 38 gezeigt, ist die Welle 696 von der Mittellinie des Antriebsglieds 690 versetzt.
  • Das Antriebsglied 690 umfasst eine Bohrung 698 zur Aufnahme einer Antriebswelle, welche drehbar mit der Antriebsmaschine 686 verbunden ist, so dass die Bewegung der Antriebswelle der Antriebsmaschine 686 eine komplementäre Bewegung des Antriebsglieds 690 verursacht. Eine andere Bohrung 700, im Wesentlichen senkrecht zu der Bohrung 698 angeordnet, wird in dem Antriebsglied 690 bereitgestellt zur Aufnahme eines Verbindungselements, das gegen die Antriebswelle der Antriebsmaschine 686 drücken kann, so dass sich das Antriebsglied 690 zusammen mit der Antriebswelle der Antriebsmaschine 686 bewegt.
  • Das Innengehäuse 624 bewegt sich als Reaktion auf den Betrieb der Antriebsmaschine 686. Die Bewegung des Innengehäuses 624 ist nicht identisch mit der Drehbewegung der Antriebswelle der Antriebsmaschine 686. Die Bewegung des Innengehäuses 624 wird teilweise definiert durch die versetzte Anordnung der Welle 696 und die Verbindung zwischen dem offenen Ende des Innengehäuses 624 und dem offenen Ende des Außengehäuses 626, die durch das Verbindungsglied 627 bereitgestellt wird. Dementsprechend bleiben die offenen Enden des Innengehäuses 624 und des Außengehäuses 626 im Wesentlichen stationär mit relativer Bewegung entsprechend der Flexibilität, die durch die elastomere Natur des Verbindungsglieds 627 bereitgestellt wird. Jedoch ist das nahe Ende des Innengehäuses 624 frei, um sich gemeinsam mit der Welle 696 an dem Antriebsglied zu bewegen, welche sich als Reaktion auf die Bewegung der Antriebswelle der Antriebsmaschine 686 bewegt. Da die Welle 696 versetzt an dem Antriebsglied 690 angeordnet ist, folgt die Bewegung der Welle 696 im Allgemeinen einem im Wesentlichen exzentrischen Weg. Folglich "vibriert" das Innengehäuse 624 im Allgemeinen als Reaktion auf den Betrieb der Antriebsmaschine 686. Es sollte beachtet werden, dass das Innengehäuse 624 bezüglich des Außengehäuses 626 als Reaktion auf die Antriebsmaschine 686 nicht frei rotiert.
  • Um den Betrieb der Antriebsmaschine 686 zu kontrollieren, und dadurch die Bewegung des Innengehäuses 624 zu kontrollieren, wird ein Regler 702 bereitgestellt. Ausdrücklicher ist der Regler 702 elektrisch mit der Antriebsmaschine 686 durch Leiter 704 verbunden. Ein Sensor 706 ist operativ mit dem Innengehäuse 624 verbunden und elektrisch mit dem Regler 702 durch Leiter 708 verbunden, um den Regler 702 mit einer Rückkopplung zu versehen, die die Bewegung des Innengehäuses 624 anzeigt. Der Regler 702 ist elektrisch mit dem Mischregler 616 durch Leiter 701 und mit Quelle 620 durch Leiter 703 verbunden. Folglich sind der Regler 702 und der Mischregler 616 in der Lage, den Betrieb der Antriebsmaschine 686 positiv zu regulieren, um eine beabsichtigte Bewegung des Innengehäuses 624 zu verursachen.
  • Um ein Magnetfeld bereitzustellen zur Wechselwirkung mit dem Sensor 706 in dieser Ausführungsform, wird ein Magnet 710 (38) mit dem Antriebsglied 690 bereitgestellt. In einer Ausführungsform wird der Magnet 710 innerhalb einer Aussparung 712 in dem Antriebsglied 690 gehalten durch geeignete Mittel, wie z.B. einem Klebstoff wie ein Epoxyzement. Der Magnet 710 ist innerhalb der Aussparung 712 so ausgerichtet, dass ein Südpol des Magnets 710 dem Sensor 706 gegenüberliegt. Folglich erzeugt der Magnet 710, wenn sich das Antriebsglied 690 als Reaktion auf den Betrieb der Antriebsmaschine 686 bewegt, ein periodisches elektrisches Signal in dem Sensor 706. Das elektrische Signal ist im Wesentlichen periodisch mit einer Frequenz, die im Wesentlichen gleich einer Rotationsfrequenz der Antriebswelle der Antriebsmaschine 686 ist.
  • Ein Beispiel für den Betrieb des Apparates 610 wird jetzt gegeben werden. Es sollte beachtet werden, dass die folgende Besprechung nur für veranschaulichende Zwecke ist.
  • Es wird angenommen, zwecks Deutlichkeit, dass der Apparat 610 in Ruhe ist (d.h. nichts ist elektrisch angeregt). Ein Bediener greift auf den Mischregler 616 zu, um den Betrieb des Apparats 610 zu beginnen. Ein geeignetes erstes Fluid, wie Vollblut, eine biologische Probe und dergleichen, wird für der Fluiddispenser 614 verfügbar gemacht. Ein geeignetes zweites Fluid, wie ein Blutverdünnungsmittel, ein Lysemittel und dergleichen, wird an der Quelle 650 verfügbar gemacht.
  • Der Mischregler 616 gibt ein elektrisches Signal an den Heizungsregler 660 über Leiter 662 ab, so dass der Heizungsregler 660 die Quelle 620 für elektrische Energie an das Heizelement 656 anschließt. Die elektrische Energie von der Quelle 620 gelangt entlang der Leiter 668 und 658 zu dem Heizelement 656. Die elektrische Energie wird in thermische Energie durch das Heizelement 656 umgewandelt. Die thermische Energie in dem Heizelement 656 wird zu dem Innengehäuse 624 übertragen. In einer Ausführungsform wird das Heizelement 656 mit elektrischer Energie versorgt, bis der Sensor 664 erfasst, dass die Temperatur, die mit dem Innengehäuse 624 verbunden ist, etwa 43 Grad Celsius (±1,5 Grad Celsius) ist. Durch Verwendung eines Temperaturpegels von weniger als etwa 45 Grad Celsius werden für den Fall, dass das erste Fluid Vollblut ist, einige Blutzelloberflächenantigene nicht im Wesentlichen denaturieren und einige Blutproteine nicht im Wesentlichen koagulieren. Falls genügend Blutzelloberflächenantigene zu denaturieren wären oder falls genügend Blutproteine zu koagulieren wären, dann könnten diese Substanzen Teile des Apparates 610 und des verbundenen Instruments beschichten. Die Überzüge könnten sich variabel losreißen und den Betrieb des Apparates 610 und des verbundenen Instruments beeinträchtigen.
  • Der Heizungsregler 660 hält die gewünschte Temperatur bei, die mit dem Innengehäuse 624 verbunden ist, indem er den elektrischen Energiefluss von der Quelle 620 für elektrische Energie zu dem Heizelement 656 reguliert. Entsprechend können der Heizungsregler 660 und somit das Heizelement 656 im Wesentlichen kontinuierlich arbeiten während des Betriebs des Apparates 610 oder des Instruments, mit welchem der Apparat 610 verbunden ist.
  • Sobald das Innengehäuse 624 die gewünschte Temperatur hat, die mit ihm assoziiert ist, sendet der Mischregler 616 ein elektrisches Signal an den Regler 702 entlang des Leiters 701. Als Reaktion auf dieses elektrische Signal verbindet der Regler 702 die Antriebsmaschine 686 mit der Quelle 620 für elektrische Energie elektrisch, wodurch die Antriebsmaschine 686 unter Strom gesetzt wird. Die Antriebsmaschine 686 bewegt das Innengehäuse 624 oder lässt es vibrieren.
  • Ein vorherbestimmtes Volumen eines zweiten Fluids, wie etwa 1275 Mikroliter ("μl") Lysemittel, wird von der Quelle 650 in die Leitung 648 bewegt durch einen geeigneten Mechanismus, wie eine Spritzenpumpe und dergleichen. Das zweite Fluid strömt durch den Fluideingang 642 in dem Innengehäuse 624 in Richtung des Innenraums 628 des Innengehäuses 624. Es ist zu beachten, dass bei Bedarf die Antriebsmaschine 686 entweder bevor oder nachdem das vorherbestimmte Volumen des zweiten Fluids innerhalb des Innenraums 628 des Innengehäuses 624 dispensiert worden ist, unter Spannung gesetzt werden kann. Das vorherbestimmte Volumen des zweiten Fluids bewegt sich zusammen mit dem Innengehäuse 624 als Reaktion auf die Aktion der Antriebsmaschine 686 für einen ersten vorherbestimmten Zeitraum, welcher in der Größenordnung von etwa 5 Sekunden sein kann. Nach dem ersten vorherbestimmten Zeitraum hat das zweite Fluid im Wesentlichen die gleiche thermische Energie wie das Innengehäuse 624.
  • Der Mischregler 616 sendet ein elektrisches Signal an dem Fluiddispenser 614 entlang Leiter 618. Der Fluiddispenser 614 agiert, um ein vorherbestimmtes Volumen des ersten Fluids, z.B. etwa 37,5 μl Vollblut, in den Innenraum 628 des Innengehäuses 624 einzuführen. In einer Ausführungsform kann der Fluiddispenser 614 eine Pipettiervorrichtung mit einer Entladedüse sein, welche in Richtung der Öffnung 640 in dem Verbindungsglied 627 bewegt werden kann. Sobald die Entladedüse in einer geeigneten Position bezüglich der Öffnung ist, wird das vorherbestimmte Volumen des ersten Fluids in den Innenraum 628 des Innengehäuses 624 bewegt.
  • Sobald die vorherbestimmte Menge an erstem Fluid in den Innenraum 628 des Innengehäuses 624 eingeführt ist, werden das erste Fluid und das zweite Fluid innerhalb des Innengehäuses 624 als Reaktion auf die Aktion der Antriebsmaschine 686 für einen zweiten vorherbestimmten Zeitraum bewegt, der etwa 11 Sekunden sein kann. Die Antriebsmaschine 686 arbeitet vorzugsweise bei einer Frequenz, die nicht gleich einer Resonanzfrequenz ist, die mit dem Apparat 610 verbunden ist.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform, wo das erste Fluid Vollblut und das zweite Fluid Lysemittel ist, wie oben beschrieben, vermischen sich das erste Fluid und das zweite Fluid im Wesentlichen vollständig aufgrund der Fluidbewegung innerhalb des Innengehäuses 624 als Reaktion auf die Antriebsmaschine 686. Das Verhältnis von ersten Fluid zu zweiten Fluid ist etwa 1 zu etwa 35. Die roten Zellen in dem Vollblut werden relativ schnell lysiert und die weißen Zellen werden relativ schnell fixiert, d.h. die weiße Zellmorphologie bleibt im Wesentlichen bewahrt. Da das zweite Fluid und das Innengehäuse 624 im Wesentlichen auf dem gleichen thermischen Energieniveau sind, erreicht das erste Fluid ebenfalls im Wesentlichen das gleiche thermische Energieniveau nach dem zweiten vorherbestimmten Zeitraum.
  • Nachdem das erste und zweite Fluid in dem Innenraum 628 des Innengehäuses 624 für den gewünschten Zeitraum bewegt worden sind, endet der Betrieb der Antriebsmaschine 686. Die Mischung von dem ersten Fluid und dem zweiten Fluid wird durch den Fluidausgang 644 und Leitung 652 in Richtung des Tanks 654 bewegt. Die Mischung wird durch einen geeigneten Mechanismus bewegt, wie eine Spritzenpumpe, die operativ mit dem Fluidausgang 644 verbunden ist. Die Mischung kann weiter verarbeitet werden oder in dem Tank 654 zurückgehalten werden, bis sie benötigt wird. Der Apparat 610 ist bereit zum weiteren Betrieb.
  • 4 ist eine detaillierte Veranschaulichung des Probenverarbeitungsbereichs 110, der in 3 gezeigt wird. Wie in 4 gezeigt umfasst der Probenverarbeitungsbereich 110 eine Entlüftungs-/Ansaugsondenbaugruppe 148 und eine Inkubationssondenbaugruppe 152. 4 zeigt außerdem die Entlüftungsbaugruppe 148a, die Frontplatte 158a, die Rückplatte 158b und den Barcodeleser 120a. Die Entlüftungs-/Ansaugsondenbaugruppe 148 (gezeigt in 4A) umfasst eine Entlüftungsnadel 154, eine Ansaugsonde 156, eine Antriebsbaugruppe 158 zum Bewegen der Ansaugsondenbaugruppe 148 entlang einer Schlittenbaugruppe 160, eine Antriebsbaugruppe 159 zum Bewegen der Entlüftungsnadel 154 entlang der gleichen Schlittenbaugruppe 160 und eine vertikale Antriebsbaugruppe 161. Die Schlittenbaugruppe 160 ist über den Probenschalen positioniert, so dass die Entlüftungsnadel 154 und die Ansaugsonde 156 direkt über dem Probenröhrchen und den Probenschalen positioniert werden können.
  • Die Ansaugsondenantriebsbaugruppe 158 bewegt die Ansaugsonde 156 über die Probenschalen oder das Probenröhrchen, so dass die Sonde 156 in das Probenröhrchen oder die Probenschalen eindringen kann, um Fluid anzusaugen oder abzugeben. Wenn die Ansaugsonde 156 ihre Annäherung zu einem vorevakuierten Behälter oder einem anderen abgedichteten Probenröhrchen (nicht gezeigt) vornimmt, bewegt die Entlüftungsantriebsbaugruppe 159 die Entlüftungsnadel 154 zuerst über das Probenröhrchen. Eine Kolbenbaugruppe (nicht gezeigt) bewegt die Entlüftungs-/Ansaugsondenbaugruppe 148 nach unten, so dass die Entlüftungsnadel 154 die Kappe des Probenröhrchens durchdringt. Während die Entlüftungsnadel 154 in die Kappe eingesteckt bleibt, zwingt die vertikale Antriebsbaugruppe 161 die Ansaugsonde 156 dazu, durch die Entlüftungsnadel 154 in das Probenröhrchen zu gleiten, um die Probe anzusaugen.
  • Vorzugsweise hat das Zellanalysensystem 60 die Flexibilität, Fluid aus einer Vielzahl von Probenröhrchengrößen anzusaugen und sich an verschiedene Röhrchenverschlüsse anzupassen. Entsprechend ist die vertikale Antriebsbaugruppe 161 mit einem Schalter versehen, der spürt, wenn die Ansaugsonde 156 den Boden des Röhrchens erreicht, und eine weitere Bewegung der Ansaugsonde 156 nach unten stoppt. Die vertikale Antriebsbaugruppe 161 hebt dann die Ansaugsonde 156 an und beginnt die Blutansaugung.
  • Die Inkubationssondenbaugruppe 152 (gezeigt in 4B) kann eine Inkubationssonde 160, eine erste Inkubationssondenantriebsbaugruppe 164 zum Bewegen einer zweiten Antriebsbaugruppe 168 entlang einer ersten Schlittenbaugruppe 166, und eine zweite Inkubationssondenantriebsbaugruppe 168 zum Bewegen einer vertikalen Antriebsbaugruppe 169 und der Inkubationssonde 160 entlang einer zweiten Schlittenbaugruppe 170 umfassen. Das ermöglicht, dass die Inkubationssonde 160 in einer diagonalen Richtung bewegt wird und direkt über den erforderlichen Probenverarbeitungsschalen in dem Probenverarbeitungsbereich 110 positioniert wird. Die Inkubationssonde 160 kann außerdem über jeder der Inkubationsstellen 132 auf den Subset/Phänotypisierungstabletts 124, jeder der sechs Reagenzvertiefungen 128 in jedem der Reagenzmodule 122 oder der Inkubationswaschschale 144 positioniert werden.
  • Die vertikale Antriebsbaugruppe 169 bewegt die Inkubationssonde 160 vertikal, so dass die Inkubationssonde 160 in die Probenschalen, die Inkubationsstellen 132 oder die Reaktionsvertiefungen 128 eindringen kann, um Fluide anzusaugen oder abzugeben.
  • 5 veranschaulicht weiter die Probenverarbeitung des Analysators. Wie in 5 gezeigt wird, sind mehrere der Probenverarbeitungsschalen 132, 134, 136, 138, 140 und 142 an die Durchflusszellen/Wandler 170, 174, 178 über ein Netzwerk von Transportrohrleitungen 182 angeschlossen. Die RBC-Schale 134, RETIC-Schale 136 und WBC-Schale 138 sind jeweils in fluidischer Kommunikation mit dem Impedanzwandler 174 und der optischen Durchflusszelle 170. Die HGB-Schale 142 ist in fluidischer Kommunikation mit dem HGB-Wandler 178.
  • 6A, 6B und 6C veranschaulichen die Inkubationssonde 160 während Abscheidung, Reinigung bzw. Ansaugung. Die Sonde 160 ist aus einem Mittelrohr 184 und einem Außenrohr 186 aufgebaut. Die Inkubationssonde 160 saugt Fluide durch das Mittelrohr 184 an und gibt sie dadurch ab. Die Inkubationssonde 160 kann verwendet werden, um die Probenschalen und/oder Inkubationsstellen zu reinigen, indem Reinigungsfluid durch eine kreisförmige Region, die zwischen dem Mittelrohr 184 und dem Außenrohr 186 gebildet wird, gesprüht wird, während durch das Mittelrohr 184 angesaugt wird.
  • In der offenbarten Ausführungsform wird das Analysatormodul 64 mit Verdünnungsmittel, monoklonalen Antikörper(Mab)-Reagenzien bei Bedarf, mehreren Lysier-Reagenzien und Retikulozytenfarbstoff versorgt. Das Verdünnungsmittel, die Lysier-Reagenzien und der Retikulozytenfarbstoff werden durch Reservoire 192 und 196 (gezeigt in 7, 8 und 9) geliefert, die an den Analysator 64 gekoppelt sind. Die Reservoire 192 für Verdünnungsmittel und Lysier-Reagenzien sind außerdem an Massenspeicherbehälter 193 gekoppelt. Wenn das Verfahrensmanuskript das Füllen eines Reservoirs anfordert, prüft der Pegelsensorschalter (nicht gezeigt) in den Reservoiren 192 auf einen vollen Zustand in dem Reservoir, und wenn der Instrumentensteuerung bestimmt, dass das Reservoir die Füllsequenz zu diesem Zeitpunkt vertragen kann, schaltet eine pneumatische Steuerleitung 189 von Anlegen eines positiven Drucks auf Anlegen eines Vakuums von etwa 15 Inch (381 mm) Quecksilber um. Dieses Vakuum führt dazu, dass Fluid aus dem Massenspeicherbehälter 193 in das Reservoir 192 fließt, bis der Pegelsensorschalter fühlt, dass das Reservoir 192 voll ist, zu welchem Zeitpunkt die pneumatische Steuerleitung 189 zu einem positiven Druck zurückkehrt und Fluidströmung von dem Massenspeicherbehälter 193 zu dem Reservoir 192 aufhört. Die Mab-Reagenzien können durch vorgepackte Wegwerfreagenzmodule 122 (gezeigt in 3 und 4) geliefert werden.
  • Der Analysator 64 ist mit Fluidsensoren (nicht gezeigt) versehen zur Bestimmung, wann einer der Massenbehälter leer ist. Diese Sensoren erfassen Luftblasen, die in die Rohrleitungen zwischen den Massenspeicherbehältern 193 und den Reservoiren 192 gezogen werden. Der Analysator 64 informiert das Datenstationsmodul 68, welches wiederum dem Bediener den leeren Behälter signalisiert. Der Bediener kann dann den leeren Behälter durch einen vollen ersetzen und über die Benutzerschnittstelle der Datenstation 68 anzeigen, dass der Behälter ausgetauscht worden ist. Bis der Behälter ausgetauscht ist, wird der Analysator 64 keine weiteren Proben aus den Probenröhrchen ansaugen, wenn auch die Verarbeitung von Proben, die bereits begonnen wurde, fortgesetzt wird mit dem ausreichenden Reagenz, das in den Reservoiren übrigbleibt.
  • Die Ansaugung und Dispensierung durch die Ansaugsonde 156 und die Inkubationssonde 160 werden bewirkt durch eine Reihe von Kolbenpumpen 190. 7 und 8 veranschaulichen, wie die Ansaugsonde 156 und die Inkubationssonde 160 mit Kolbenpumpen 190 und den Reagenzreservoiren 192 verbunden sind. Das Volumen und die Strömungsgeschwindigkeit von diesen Fluidtransfers werden durch den Analysator 64 und die Datenstation 198 reguliert.
  • Wie in 7 gezeigt wird die Ansaugsonde 156 an ein Lösungsmittelreservoir 192 über ein Ventil 194 und Kolbenpumpe 190 gekoppelt. 8 veranschaulicht die Inkubationssonde 160, die an ein Verdünnungsmittelreservoir 192 über ein Ventil 200 und eine Kolbenpumpe 190 gekoppelt ist.
  • Vorzugsweise sind die Kolbenpumpen 190 drehbare reversible Pumpen, die in der Lage sind, ein vorherbestimmtes Volumen von Fluid bei jeder Kolbendrehung anzusaugen. Jede Kolbenpumpe 190 saugt Fluid an, wenn ihr Kolben in einer Richtung gedreht wird, und gibt Fluid ab, wenn ihr Kolben in eine andere Richtung gedreht wird. Geeignete Kolbenpumpen sind offenbart in US- Patenten 4.941.809; 5.015.157; 5.020.980; und 5.044.889.
  • 9 veranschaulicht, wie Retikulozytenfarbstoffreservoir 196 an die Retikulozytenschale 136 über Ventile 202 und 203 und eine Retikulozytenfarbstoffspritze 191 angeschlossen ist. Verdünnungsmittel kann ebenfalls abgemessen und an die Probenschalen über Verdünnungsmittelspritzen (nicht gezeigt) und das Rohrleitungsnetzwerk 182 geliefert werden. Die Verdünnungsmittelspritzen und die Retikulozytenfarbstoffspritze 191 ähneln im Wesentlichen den Lieferspritzen 204, 206, 208, die in 10A, 10B, 11A, 11B und 12 gezeigt werden. Die Verdünnungsmittelspritzen können an das Rohrleitungsnetzwerk 182 angeschlossen werden.
  • 10A, 10B, 11A, 11B und 12 veranschaulichen, wie Proben, die zum Messen bereit sind, aus den Probenschalen zu den Durchflusszellen/Wandlern 170, 174, 178 geliefert werden.
  • 10A veranschaulicht einen Massentransfer von Probe aus einer Probenschale 216 in die Nähe eines Impedanzwandlers 174 über Pumpe 220. 10B veranschaulicht die abgemessene Lieferung der Probe durch die RBC-Lieferspritze 204 an den Impedanzwandler 174. Die Probenschale 216 ist an die RBC-Spritze 204, den Impedanzwandler 174 und eine Peristaltikpumpe 220 über Rohrleitung 182 angeschlossen. Ein ersten Ventil 210 ist in der Rohrleitung 182 unterhalb der Probenschale 216 angeordnet, und ein zweites Ventil 212 ist in der Rohrleitung 182 oberhalb der Peristaltikpumpe 220 angeordnet. Die Strömungsgeschwindigkeit und der allgemeine Betrieb der RBC-Spritze 204 werden automatisch durch die Elektronik und Software des Analysators gesteuert.
  • Massentransfer von Probe aus der Probenschale 216 in die Nähe des Impedanzwandlers 174 ereignet sich, wenn das erste und zweite Ventil 210, 212 geöffnet sind, wie in 10A gezeigt, und die Peristaltikpumpe 220 angetrieben wird. Eine abgemessene Lieferung der Probe aus der RBC-Spritze 204 zu dem Impedanzwandler 174 ereignet sich, wenn das erste und zweite Ventil 210, 212 geschlossen sind, wie in 10B gezeigt, und der Kolben 224 der RBC-Spritze 204 um eine vorherbestimmte Strecke bei einer angegebenen Geschwindigkeit verschoben wird. 11A veranschaulicht den Massentransfer von Probe aus einer Probenschale 230 in die Nähe der optischen Durchflusszelle 170 über Pumpe 232. Pumpe 232 kann im Wesentlichen Pumpe 220 ähneln. 11B veranschaulicht die abgemessene Lieferung der Probe durch die WBC-Lieferspritze 206 zu der optischen Durchflusszelle 170. Die Probenschale 230 ist an die WBC-Spritze 206, die optische Durchflusszelle 170 und eine Peristaltikpumpe 232 über Rohrleitung 182 angeschlossen. Ein erstes Ventil 236 ist in der Rohrleitung 182 unterhalb der Probenschale 230 angeordnet, und ein zweites Ventil 238 ist in der Rohrleitung 182 oberhalb der Peristaltikpumpe 232 angeordnet.
  • Wie in 11A gezeigt wird, ereignet sich Massentransfer von Probe aus der Probenschale 230 in die Nähe des optischen Wandlers 170, wenn das erste und zweite Ventil 236, 238 geöffnet sind und Pumpe 232 angetrieben wird, wodurch ein Volumen von Probe in die Nähe der optischen Durchflusszelle 170 geschoben wird. Eine abgemessene Lieferung der Probe durch die WBC-Spritze 206 zu der optischen Durchflusszelle 170 ereignet sich, wenn das erste und zweite Ventil 236, 238 geschlossen sind, wie in 11B gezeigt, und der Kolben 240 der WBC-Spritze 206 um eine vorherbestimmte Strecke bei einer angegebenen Geschwindigkeit verschoben wird.
  • 12 veranschaulicht den Massentransfer von einer Probe aus einer HGB-Probenschale 142 zu dem HGB-Wandler 178. Die HGB-Probenschale 142 ist an den HGB-Wandler 178 und eine Pumpe 246 über Rohrleitung 182 angeschlossen. Die Pumpe 246 kann im Wesentlichen der Pumpe 220 ähneln. Ein Ventil 248 ist in der Rohrleitung 182 unterhalb der HGB-Probenschale 142 angeordnet. Ein Massentransfer von Probe aus der HGB-Probenschale 142 zu dem HGB-Wandler 178 ereignet sich, wenn das Ventil 248 geöffnet ist und die Peristaltikpumpe 246 aktiviert ist.
  • C. Optische Durchflusszelle/Wandler
  • Innerhalb der optischen Durchflusszelle 170 werden einzelne Zellen innerhalb einer fließenden Strömung von Fluid isoliert, so dass die optischen Eigenschaften von jeder Zelle erfasst und in aussagekräftige Informationen umgewandelt werden können. 15 und 16 veranschaulichen eine Durchflusszelle 170 zur Verwendung mit dem Zellanalysensystem 60.
  • In einer Ausführungsform (wie veranschaulicht in 43) ist die optische Durchflusszelle 170 ein transparenter Quarzblock mit einer dünnen, länglichen, rechteckigen, inneren Durchflusskammer 300 (16) mit Querschnittsabmessungen von etwa 160 μ mal 400 μ. Ein im Wesentlichen konischer Kanal mit einem Winkel von etwa 30 Grad konvergiert in die Durchflusskammer 300 an einem Ende davon. Ein verdünnter Probenstrom wird von Düse 270, die in der Mitte einer sich bewegenden Mantelströmung 304 positioniert ist, in die Durchflusskammer 300 injiziert auf eine solche Art und Weise, dass der Probenabschnitt der Strömung auf eine sehr kleine Querschnittsabmessung, ungefähr 5 µ × 80 µ, senkrecht zu der Strömungsfließachse und beschränkt auf die Mitte der Durchflusskammer 300 fokussiert wird. Dieser Vorgang ist als hydrodynamische oder Fluidfokussierung bekannt. An einer vorherbestimmten Position entlang der fokussierten Strömungsachse ist ein Laserstrahl in Durchflusskammer 300 hinein gerichtet, aus einer Richtung senkrecht zu dem fließenden Probenstrom. In der Region, wo der Laserstrahl den fokussierten Probenstrom schneidet, wird der Laserstrahl ebenfalls optisch fokussiert, wie unten in Abschnitt 8. F. beschrieben, auf eine Abmessung von ungefähr 17 µ in einer Richtung parallel zu der Strömungsfließachse. Somit wird ein beleuchtetes Probenvolumen in der Mitte der Durchflusskammer 300 in der Region erzeugt, wo sowohl die Strömung als auch der Laserstrahl fokussiert sind, begrenzt in zwei Dimensionen durch das Strömungsausmaß, und in einer dritten Dimension durch das Laserstrahlausmaß. Dieses beleuchtete Volumen mit den Abmessungen von ungefähr 5μ × 80μ × 17μ ist die Messregion der Durchflusszelle 170. Jede Zelle wird erfasst, wenn sie durch diese Region hindurchgelangt, und die Daten werden gesammelt und durch die Steuerung verarbeitet, und die Ergebnisse werden angezeigt. Siehe 43. Beispielhafte Details der Düse 270 werden unten mit Bezug auf 31 bis 36 besprochen.
  • Wie in 32 gezeigt wird, betreffen hierin offenbarte Ausführungsformen eine Fluiddüse 270 und ein Verfahren zur Einführung eines Fluid 812, wobei das betroffene Fluid 812 das Fluid ist, das in dem Analyseninstrument verwendet wird.
  • In einer Ausführungsform, veranschaulicht in 31, ist die Fluiddüse 270 operativ mit einer Leitung oder einer Strömungsführung 814 des Fluids 812 und einer Durchflusszelle 170 verbunden, die ein interessierendes Element wie eine Zelle, ein Partikel und dergleichen erfasst, das in dem Fluid 812 vorhanden ist. In der veranschaulichten Ausführungsform umfasst die Strömungsführung 814 eine Leitung, gebildet aus einem geeigneten Material, wie einem Polymer wie Acryl, einschließlich einer Bohrung 818 zur Aufnahme der Fluiddüse 270. Die Fluiddüse 270 ist im Wesentlichen bezüglich der Strömungsführung 814 zentriert, um die Lenkung von Fluid 812 aus der Fluiddüse 270 zu der Bohrung 818 zu erleichtern. Eine Leitung 820 ist fluidisch mit der Bohrung 818 verbunden, so dass ein gewünschtes Fluid 844 aus einer geeigneten Quelle in die Bohrung 818 durch die Leitung 820 abgegeben werden kann. Die Durchflusszelle 170, wie oben beschrieben, kann eine optische Durchflusszelle sein, die das interessierende Element in dem Fluid 812 misst, wenn das Fluid 812 von der Fluiddüse 270 durch die Durchflusszelle 170 strömt. Die Durchflusszelle 170 kann verwendet werden, in einigen Ausführungsformen, um eine weiße Blutkörperchendifferentialanalyse, Blutplättchenanalyse und/oder Retikulozytenanalyse durchzuführen. In diesen Ausführungsformen können vorbereitende Schritte für jede Analyse auf Verarbeitungswegen durchgeführt werden, die getrennt sein können, und die Analyse kann in einer einzigen Durchflusszelle 170 durchgeführt werden.
  • Die Konstruktion der Fluiddüse 270 ist deutlicher in 32 und 33 veranschaulicht. Die Fluiddüse 270 umfasst allgemein einen Verteiler 822 und eine Vielzahl von Leitungen, die fluidisch mit dem Verteiler 822 verbunden sind. Die genaue Zahl von Leitungen kann gewählt werden, um eine bestimmte Ausführungsform der Fluiddüse 270 zu erleichtern. Ausdrücklicher sind in einer beispielhaften Ausführungsform eine erste Leitung 262, eine zweite Leitung 264 und eine dritte Leitung 266 fluidisch mit einem Abschnitt des Verteilers 822 verbunden. Die Leitungen 262, 264 und 266 können als Eingänge für Fluid 812 verwendet werden. Folglich können die Leitungen 262, 264 und 266 mit geeigneten Quellen des gewünschten Fluids 812 fluidisch verbunden werden.
  • In einer besonderen Ausführungsform ist der Verteiler 822 aus einem geeigneten Polymer wie Acryl und dergleichen gefertigt und hat eine axiale Länge von etwa 17,9 mm (0,7 Inch). Die Leitungen 262, 264 und 266 sind aus einem geeigneten Metall wie Edelstahl 316 und dergleichen gefertigt. Die Leitung 262 kann eine axiale Länge von etwa 29 mm (1,14 Inch) haben, einen Innendurchmesser von etwa 0,58 mm (0,023 Inch) und einen Außendurchmesser von etwa 1,58 mm (0,0625 Inch). Die Leitungen 264 und 266 können eine axiale Länge von etwa 12,7 mm (0,5 Inch), einen Innendurchmesser von etwa 0,48 mm (0,019 Inch) und einen Außendurchmesser von etwa 1,58 mm (0,0625 Inch) haben. Die Außenflächen der Leitungen 262, 264 und 266 können mit einem Klebstoff wie einem Epoxy und dergleichen überzogen werden und in komplementäre Bohrungen 830, 832 bzw. 834 eingesteckt werden, die in dem Verteiler 822 gebildet sind. In der veranschaulichten Ausführungsform sind die Leitungen 262, 264 und 266 axial und über den Umfang verteilt auf dem Verteiler 822 versetzt. Die Leitung 266 ist um etwa 1,8 mm (0,07 Inch) von einem Ende 831 des Verteilers 822 axial versetzt. Die Leitung 264 ist um etwa 6,6 mm (0,26 Inch) von dem Ende 831 versetzt und die Leitung 262 ist um etwa 11,43 mm (0,45 Inch) von dem Ende 831 axial versetzt. Auf dem Umfang ist die Leitung 262 um etwa 60 Grad gegenüber der Leitung 264 versetzt, und die Leitung 266 ist um etwa 60 Grad gegenüber der Leitung 264 versetzt. Somit ist die Leitung 262 um etwa 120 Grad gegenüber der Leitung 266 versetzt. Der Verteiler 822 verbindet die Leitungen 262, 264 und 266 fluidisch mit Leitungen 272, 274 bzw. 276, welche ebenfalls operativ mit dem Verteiler 822 verbunden sind. Der Verteiler 822 kann ermöglichen, dass eine der Leitungen 272, 274 und 276 einem einzelnen Fluid oder Test gewidmet ist, der durch das Instrument ausgeführt wird, mit dem die Düse 270 verbunden ist.
  • Die Leitungen 272, 274 und 276 sind im Wesentlichen koaxial und im Wesentlichen zentral bezüglich der Strömungsführung 814 angeordnet. Die Anordnung der Leitungen 272, 274 und 276 bezüglich der Strömungsführung 814 und der Durchflusszelle 170 kann gewählt werden, um eine beabsichtigte Positionsgenauigkeit der Strömung von Fluid 812 aus der Düse 270 zu der Durchflusszelle 170 bereitzustellen. Der Verteiler 822 umfasst eine Bohrung 42 zur Aufnahme der im Wesentlichen koaxialen Anordnung der Leitungen 272, 274 und 276. Der Verteiler 822 ermöglicht Fluid 812 in Leitungen 262, 264 und 266, durch den Verteiler 822 hindurch und in Leitungen 272, 274 bzw. 276 hineinzuströmen. Die Leitungen 272, 274 und 276 sind im Wesentlichen linear über ihre gesamte Länge. In einigen Ausführungsformen jedoch kann, um die koaxiale Anordnung der Leitungen 272, 274 und 276 zu bewahren, ein Distanzstück, nicht gezeigt, radial zwischen Leitungen 272 und 274 und zwischen Leitungen 274 und 276 bereitgestellt werden. Das Distanzstück ist so ausgelegt, z.B. durch Bereitstellen von Außenflächenreliefs, Kanälen und dergleichen, dass es die Bewegung von Fluid 812 in den Leitungen 272, 274 und 276 nicht stört. Auch wenn die veranschaulichte Ausführungsform ferne Enden der Leitungen 272, 274 und 276 zeigt, die gegenseitig axial versetzt sind, ist das nicht notwendig.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform ist die Leitung 272 aus einem geeigneten Metall wie Edelstahl 304 Temper-Subkutannadelrohr Nr. 3 (durchgehärtet) und dergleichen gefertigt. Die Leitung 272 hat eine axiale Länge von etwa 64,8 mm (2,55 Inch), einen Innendurchmesser von etwa 0,33 mm (0,13 Inch) und einen Außendurchmesser von etwa 0,64 mm (0,025 Inch). Die Leitung 274 ist ebenfalls aus einen geeigneten Metall wie Edelstahl 304 Temper-Subkutannadelrohr Nr. 3 (durchgehärtet) und dergleichen gefertigt. Die Leitung 274 hat einen Innendurchmesser von etwa 0,97 mm (0,038 Inch), einen Außendurchmesser von etwa 1,27 mm (0,050 Inch) und eine axiale Länge von etwa 57,4 mm (2,26 Inch). Die Leitung 276 ist aus einen geeigneten Metall wie Edelstahl 304 Subkutannadelrohr und dergleichen gefertigt. Die Leitung 276 hat einen Innendurchmesser von etwa 1,57 mm (0,062 Inch), einen Außendurchmesser von etwa 1,98 mm (0,078 Inch) und eine axiale Länge von etwa 50,04 mm (1,97 Inch).
  • In einer Ausführungsform umfasst die Strömungsführung 814 einen im Wesentlichen verjüngten Abschnitt mit einem Innendurchmesser von etwa 6,35 mm (0,25 Inch) an Punkt "A" und einem Innendurchmesser von etwa 3 mm (0,118 Inch) an Punkt "B". Beide Punkte A und B sind in 31 gekennzeichnet. Ein Verhältnis zwischen relevanten Abmessungen von Leitungen 272, 274 und 276 und entsprechenden Abmessungen der Strömungsführung 814 kann vorherbestimmt werden, um gewünschte Fluidfokussierung von Fluid 812 bereitzustellen, um eine Wahrscheinlichkeit für Kontakt zwischen der Strömungsführung 814 und dem Fluid 812 zu verringern, um Durchflusszelle 170 zu optimieren, z.B. Optik, Betrieb usw. In einigen Ausführungsformen kann die Abmessungsrelation auf die Strömungsgeschwindigkeitsdifferenz bezogen sein. Ausdrücklicher, in einer beispielhaften Ausführungsform ist ein Breitenquerschnitt von relevanten Abschnitten der Strömungsführung 814 proportional zu einer betreffenden Strömungsgeschwindigkeitsdifferenz.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform definiert der verjüngte Abschnitt eine Steigung von etwa 60 Grad. Ein Fluid-führender Abschnitt der Durchflusszelle 170 neben einem fernen Ende der Fluiddüse 270 definiert eine Steigung von etwa 30 Grad bei einem Innendurchmesser von etwa 3 mm (0,118 Inch). Die Abmessungen können gewählt werden, um eine beabsichtigte Positionsgenauigkeit der Strömung von Fluid 812 bezüglich der Durchflusszelle 170 herzustellen.
  • Indem die Konstruktion der Fluiddüse 270 somit ausführlich offenbart wurde, wird ein Verfahren zur Einführung von Fluid mit der Fluiddüse 270 jetzt ausführlich besprochen werden.
  • Eine Quelle von Fluid 812, wie Blut, eine Blutkomponente und dergleichen, die durch die Durchflusszelle 170 verarbeitet werden soll, wird fluidisch mit einer der Leitungen 262, 264 oder 266 verbunden, so dass Fluid 812 von der Quelle zu der gewählten Leitung 262, 264 oder 266 strömt. Die anderen Leitungen 262, 264 oder 266, die nicht fluidisch mit der Quelle von Fluid 812 verbunden sind, werden nicht mit Fluid 812 versorgt. Das Fluid 812 enthält ein interessierendes Element wie ein Partikel, eine Zelle und dergleichen, das durch die Durchflusszelle 170 nachweisbar ist.
  • Eine Quelle für ein anderes Fluid 844, wie Wasser, Pufferlösung, Verdünnungsmittel oder ein anderes Fluid, das nicht nachteilig mit dem Fluid 812 reagiert, und dergleichen, ist fluidisch mit der Leitung 820 verbunden, so dass das andere Fluid 844 von der Quelle zu der Leitung 820 und der Strömungsführung 814 strömt. Das Fluid 844, das aus der Leitung 820 in die Strömungsführung 814 strömt, umgibt einen Abschnitt der Leitungen 272, 274 und 276, wie in 34 bis 36 gezeigt. Die versetzte Anordnung der Leitungen 272, 274 und 276 ermöglicht eine Reduktion der Strömungsdiskontinuitäten von Fluid 844. Eine graduelle Reduktion im Breitenquerschnitt des Fluidströmungswegs durch die Strömungsführung 814 ermöglicht eine Reduktion der Wahrscheinlichkeit von Fluiddiffusion innerhalb der Strömungsführung 814. Bei Bedarf können, wenn Fluid 812 aus einer der Leitungen 272, 274 oder 276 strömt, die anderen zwei Leitungen 272, 274 oder 276 gereinigt oder "zurückgespült" werden mit Fluid 844, indem zum Beispiel eine geeignet relativ reduzierte Druckquelle an die zu reinigenden Leitungen 272, 274 oder 276 angelegt wird. Alternativ können, nachdem Fluid 812 sequenziell durch jede der Leitungen 272, 274 und 276 eingeführt worden ist, alle Leitungen 272, 274 und 276 gleichzeitig gereinigt werden, indem ein geeignetes Fluid durch die Leitungen hindurchgeführt wird. Folglich kann, da alle Leitungen 272, 274 und 276 im Wesentlichen gleichzeitig gereinigt werden können, der Durchsatz der Durchflusszelle 170 erhöht werden, indem die Stillstandszeit, die zum Reinigen der Düse 270 benötigt wird, verringert wird, während außerdem für eine schnelle Einführung von Fluid 812 gesorgt wird. Das kann entsprechend auch den Durchsatz des Analyseninstruments erhöhen, mit welchem die Durchflusszelle 170 verbunden ist.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform ist die Strömungsgeschwindigkeit von Fluid 844 größer als die Strömungsgeschwindigkeit von Fluid 812. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform die Strömungsgeschwindigkeit von Fluid 812 etwa 2,5 μl pro Sekunde und die Strömungsgeschwindigkeit des Fluids 844 ist etwa 300 μl pro Sekunde. Diese Strömungsgeschwindigkeitsdifferenz lenkt oder fokussiert die Strömung von Fluid 812 fluidisch in Richtung der Durchflusszelle 170. Im Allgemeinen kann die Strömungsgeschwindigkeitsdifferenz so vorherbestimmt werden, dass der Nachweis des interessierenden Elements in dem Fluid 812 durch die Durchflusszelle 170 erleichtert wird.
  • Die Fluidfokussierung, die durch die Strömungsgeschwindigkeitsdifferenz bereitgestellt wird, ist im Wesentlichen ähnlich ungeachtet der Leitung 272, 274 oder 276, die gewählt ist, um das Fluid 812 einzuführen, da Fluid 812, das entweder von Leitung 272, 274 oder 276 eingeführt wird, im Wesentlichen in Richtung der gleichen Position bezüglich der Durchflusszelle 170 fluidisch fokussiert wird. Dies ermöglicht Fluiden 812 aus jeder der Leitungen 272, 274 und 276, und Tests, die durch das Instrument durchgeführt werden, mit dem die Fluiddüse 270 verbunden ist, die gleiche Durchflusszelle 170 gemeinsam zu nutzen. Entsprechend kann jede der Leitungen 272, 274 und 276 fluidisch mit einer getrennten Quelle von Fluid 812 so verbunden werden, dass die Wahrscheinlichkeit, dass Fluid 812 aus einer Quelle auf Fluid 812 aus einer anderen Quelle treffen könnte, verringert ist. Daher kann die Möglichkeit der Überkreuzung (Cross over) von Fluid 812 und/oder Kontamination von Fluid 812 verringert werden. Die Fluide 812 von jeder der Leitungen 272, 274 und 276 können durch die Durchflusszelle 170 im Wesentlichen auf parallele Art verarbeitet werden, wodurch der Durchsatz der Fluiddüse 270 und des Instruments, mit dem die Düse 270 verbunden ist, verbessert wird.
  • Diese Fähigkeit der Fluiddüse 270 ist empirisch verifiziert worden. In einem Experiment, das in 34 durch 272 veranschaulicht ist, wurde eine beispielhafte Ausführungsform der Fluiddüse 270 durch eine Finite-Elemente-Methode analysiert, um die Fluideigenschaften aufzudecken, die mit der Düse 270 verbunden sind. In dieser Ausführungsform hat die Leitung 272 einen Innendurchmesser von etwa 0,33 mm (0,013 Inch). Das ferne Ende der Leitung 274 ist um etwa 7,366 mm (0,29 Inch) von dem fernen Ende der Leitung 272 versetzt. Die Leitungen 272 und 274 definieren im Wesentlichen einen kreisförmigen Fluidströmungsweg mit einem Innendurchmesser von etwa 0,64 mm (0,025 Inch) und einem Außendurchmesser von etwa 0,94 mm (0,037 Inch). Das ferne Ende der Leitung 276 ist um etwa 7,37 mm (0,29 Inch) von einem fernen Ende der Leitung 274 versetzt. Die Leitungen 274 und 276 definieren einen im Wesentlichen kreisförmigen Fluidströmungsweg mit einem Innendurchmesser von etwa 1,24 mm (0,049 Inch) und einem Außendurchmesser von etwa 1,55 mm (0,061 Inch).
  • Die Finite-Elemente-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung des Computerprogramms FIDAP, Version 6.01, erhältlich von Fluid Dynamics International aus Evanston, Illinois. Stationäre rotationssymmetrische Modelle für Fluidströmung durch die Leitungen 272, 274 und 276 und stationäre dreidimensionale Modelle für Fluidströmung durch die Durchflusszelle 170 wurden analysiert, um zu zeigen, dass die Position des fluidisch fokussierten Fluids 812 bezüglich der Durchflusszelle 170 unabhängig ist von der Leitung 272, 274 oder 276, die zum Einführen des Fluids 812 verwendet wird. In allen Fällen ist die Fluidströmungsgeschwindigkeit des Fluids 844 etwa 300 μl pro Sekunde, und die Fluidströmungsgeschwindigkeit des Fluids 812 durch die gewählte Leitung 272, 274 oder 276 ist im Wesentlichen innerhalb des Bereichs von etwa 2,5 μl pro Sekunde bis etwa 2,0 μl pro Sekunde. Die Analysen setzten Newtonsche Fluideigenschaften voraus ohne Schlupf-Randbedingungen an den festen Oberflächen.
  • In einem Beispiel wurden, um weiße Blutkörperchendiffentialanalyse, Blutplättchenanalyse und Retikulozytenanalyse zu simulieren, drei separate Fluidanalysen durchgeführt. Das weiße Blutkörperchendifferentialanalysenfluid 812 wird durch die Leitung 272 eingeführt, wie in 34 gezeigt, bei einer Fluidströmungsgeschwindigkeit von etwa 2,5 μl pro Sekunde. Wie in 35 gezeigt wird das Blutplättchenanalysenfluid 812 durch die Leitung 274 eingeführt, ebenfalls bei einer Fluidströmungsgeschwindigkeit von etwa 2,5 μl pro Sekunde. Das Retikulozytenanalysenfluid 812 wird durch die Leitung 276 geleitet, wie in 36 gezeigt, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von etwa 2,0 μl pro Sekunde. Nach Vergleich mit der Strömung von 34 durch 272 zeigen die Fluidströmungswege von den jeweiligen Leitungen 272, 274 und 276, die aus den Fluidanalysen resultieren, dass keine Kontamination einer Strömung von Fluid 812 durch eine vorherigen Strömung von Fluid 812 vorkommt und dass die Position des fluidisch fokussierten Fluids 812 bezüglich der Durchflusszelle 170 unabhängig ist davon, welche Leitung 272, 274 oder 276 gewählt ist.
  • Die Unabhängigkeit der Position des fluidisch fokussierten Fluids 812 bezüglich der Durchflusszelle 170 bezüglich der Auswahl der Leitung 272, 274 oder 276 wird ebenfalls experimentell verifiziert, indem Strömung von Fluid 812, das Kügelchen mit 7 µm Durchmesser enthält, nacheinander durch jede der Leitungen 272, 274 und 276 optisch gemessen wird. Das Fluid 812, das die Kügelchen enthält, wird mit einer Fluidströmungsgeschwindigkeit von etwa 2 μl pro Sekunde eingeführt.
  • % CV, Indexübereinstimmung
    Figure 00740001
  • Wie aus den obigen Variationskoeffizienten ersichtlich ist, sind die Variationskoeffizienten (CV) für drei gemessene optische Eigenschaften (ALL: Axiallichtverlust; IAS: Zwischenwinkelstreuung; und DSS: depolarisierte Seitenstreuung) im Wesentlichen ähnlich für alle Leitungen 272, 274 und 276. Diese Ähnlichkeit bei der optischen Reaktion verifiziert, dass die Fluiddüse 270 für mehrere Messungen auf interessierende Elemente von Fluid 812 verwendet werden kann vor irgendeinem Reinigungsschritt, wodurch der Durchsatz oder die Analysenkapazität der Durchflusszelle 170 und jedes Instrument, das mit der Durchflusszelle 170 verbunden ist, erhöht wird. Die Zahl der Messungen für Fluid 812 oder Einführungen von Fluid 812, die vor einer Reinigung vorkommen können, entspricht der Zahl der Leitungen, die mit der Fluiddüse 270 bereitgestellt werden. Ungeachtet der Zahl der eingeschlossenen Leitungen ermöglichen die hierin beschriebenen Ausführungsformen eine im Wesentlichen gleichzeitige Reinigung von im Wesentlichen allen Leitungen.
  • Falls das Fluid 812 eine hinreichende Neigung haben sollte, auf einen Abschnitt der Leitungen 272, 274 und 276 einzuwirken oder sich an einen solchen Abschnitt zu heften, dann könnten Überreste von einem ersten Fluid in der Leitung 272, 274 oder 276 auf ein zweites Fluid treffen (d.h. verschleppt werden), das durch die gleiche Leitung 272, 274 oder 276 hindurchgelangt. Ähnliche Bedenken sind bei den Leitungen 262, 264 und 266 vorhanden. Diese Bedenken können die Genauigkeit der Durchflusszelle 170 beeinträchtigen.
  • Um diese Bedenken anzusprechen, ist es möglich, eine spezielle Leitung 272, 274 oder 276 einem speziellen Fluid 812 oder Test, der durch die Durchflusszelle 170 durchgeführt wird, zu widmen. Die Zahl der so gewidmeten Leitungen 272, 274 und 276 kann abhängig sein von den Eigenschaften der Fluide 812, die durch die Fluiddüse 270 eingeführt werden. Dadurch, dass im Wesentlichen mindestens eine der Leitungen 272, 274 und 276 isoliert wird, kann ein Verschleppen von einem Fluid 812 zu einem anderen Fluid 812 verringert werden. Zum Beispiel könnte eine Leitung 272, 274 oder 276 einem Test gewidmet werden, der ein Fluid 812 verwendet, das einen relativ strahlenden Fluoreszenzmarker enthält, wie Auromine O und dergleichen, und eine andere Leitung 272, 274 oder 276 könnte einem Test gewidmet werden, der ein Fluid verwendet, das einen relativ blassen Fluoreszenzmarker enthält. Sobald die Fluide die Leitungen 272, 274 oder 276 verlassen, ist das Volumen und die Strömung von Fluid 844 durch die Strömungsführung 814 ausreichend, um die Wahrscheinlichkeit für Diffusion von Fluid 812 zu verringern, während das Fluid 812 in Richtung einer gemeinsamen Durchflusszelle 170 fluidisch fokussiert wird. Folglich können die zwei Tests im Wesentlichen nacheinander durch die gleiche Durchflusszelle 170 durchgeführt werden, ohne dass die Genauigkeit oder Sensitivität der Durchflusszelle 170 wesentlich beeinträchtigt würde.
  • Nach Bewegung nach oben in den rechteckigen Querschnitt der Durchflusszelle 170 nimmt die Geschwindigkeit schnell zu, was den Probenstrom auf einen zentralen Kern mit den Abmessungen von ungefähr 5μ × 80μ im Querschnitt fokussiert. Die kleine Abmessung von 5 µ, welche in der Richtung des Fokus der Weitwinkel-Kondensorlinse ist, die in 22 veranschaulicht ist, stellt eine minimale Defokussierung sicher und deshalb gleiche Helligkeit von fluoreszierenden Zellen, die sich an unterschiedlichen Positionen innerhalb der Strömung befinden. Zusätzlich sollte sich, da die Breite der Durchflusskammer 300 viel größer ist als der Probenstrom, die Durchflusskammer 300 nicht ohne weiteres verstopfen, jedoch ergibt sie immer noch eine Auflösung vergleichbar der, die durch eine kleinere Messregion bereitgestellt wird.
  • Eine Fokussierlinse (gezeigt in 19) fokussiert einen Laserstrahl auf die Durchflusskammer 300, und Detektoren (gezeigt in 20 und 21) erfassen die Lichtstreuung und/oder Fluoreszenzeigenschaften von Zellen, die durch die Durchflusskammer 300 hindurchgelangen. Diese Merkmale werden ausführlicher in Abschnitt 8. F. dieser Offenbarung beschrieben.
  • D. Impedanzwandler
  • Das Zellanalysensystem 60 kann einen Impedanzwandler 174 verwenden, um rote Blutkörperchen und Blutplättchen zu zählen. 17 veranschaulicht eine bevorzugte Ausführungsform eines Impedanzwandlers 174, der Impedanz-basierte Zellzählung und Klassierung durchführt und Gebrauch macht von hydrodynamischer Fokussierung. Die Impedanzzellzählung beruht auf dem Nachweis von Änderungen im elektrischen Widerstand, hervorgerufen durch ein Partikel, wenn es durch eine kleine Blende 314 hindurchgelangt. Leitung wird bereitgestellt durch eine Elektrolytflüssigkeit (wie eine gepufferte Salzlösung und dergleichen) in zwei Kammern 310, 312 des Impedanzwandlers 174. Eine Probeneinführungsdüse 316 und eine hydrodynamische Fokussierung leiten Zellen zu der Blende 314 des Impedanzwandlers 174. Wenn jede einzelne Zelle durch die Blende 314 hindurchgeht, erhöht sich der elektrische Widerstand des Wegs durch die Kammern 310, 312 und die Blende 314. Eine Stromquelle 317, die mit zwei Elektroden verbunden ist, die unten beschrieben sind und in den Kammern 310, 312 auf jeder Seite der Blende 314 angeordnet sind, führt dazu, dass sich diese Erhöhung des Widerstands als ein elektrischer Spannungsimpuls manifestiert. Die Probeneinführungsdüse 316 spielt eine zweite Rolle als die vordere Elektrode. Die zweite Elektrode 318 befindet sich hinter der Blende 314. Die Zahl der Impulse zeigt die Zellzahl an, während die Amplitude von jedem Impuls mit dem Zellvolumen in Verbindung steht. Volumenhistogramme werden erzeugt, indem Frequenzverteilungen von Impulsamplituden aufgezeichnet werden. Diese Histogramme werden verwendet, um RBC- und PLT-Parameter zu erhalten wie MCV (mean cell volume = mittleres Zellvolumen) und RDW (red cell distribution width = rote Zellverteilungsbreite).
  • Der Impedanzwandler 174 ist vorzugsweise aus einem Material gefertigt, das nichtleitend und transparent ist, wie Acryl, ein ähnliches Polymer oder dergleichen. Die zweite Elektrode 318 in dem Wandler 174 ist vorzugsweise Platin, da Elektrolyse bei dieser Polarität korrosive Gase erzeugt, welche einige andere Elektrodenmaterialien auflösen können. Andere Materialien, die ähnliche Korrosionsbeständigkeit haben, können für die Elektrode 318 verwendet werden. Das Volumen der Kammer 310 auf der vorderen Seite des Wandlers 174 kann reduziert werden, ohne den Betrieb des Wandlers 174 für die offenbarten Anwendungen zu beeinträchtigen. Die Probeneinführungsdüse 316 ist vorzugsweise innerhalb von etwa 1,5 mm von der Blende 314 platziert. Der Abstand zwischen der Düse 316 und der Blende 314 sollte während des Betriebs beibehalten werden, ebenso eine relativ hohe Mantelgeschwindigkeit (etwa 10 m/s durch die Blende).
  • Etwa 30% der Zellen, die durch einen nicht hydrodynamisch fokussierten Impedanzwandler 174 strömen, gelangen eher dicht an den Kanten der Blende der Durchflusszelle hindurch, als dass sie durch deren Mitte hindurchgehen. Das kann die Blende verstopfen und gestörte Messungen verursachen. Hydrodynamische Fokussierung kann in dem Impedanzwandler 174 des Zellanalysensystems 60 genutzt werden, um Verstopfung zu verringern und die Messgenauigkeit zu verbessern.
  • Hydrodynamische Fokussierung wird in dem Impedanzwandler 174 erreicht durch das folgende Verfahren. Die RBC-Lieferspritze 204 (gezeigt in 10A und 10B) liefert die Probe an die Düse 316 des Impedanzwandlers 174 mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,333 μl/s. Wenn die strömende Probe die Impedanzwandlerdüse 316 verlässt, wird sie auf eine Geschwindigkeit von etwa 10 m/s durch eine RBC-Mantelströmung 315 beschleunigt. Da der Probenvolumendurchsatz, welcher im Wesentlichen konstant mit etwa 0,333 μl/s ist, das Produkt aus der Geschwindigkeit und der Querschnittfläche ist, verringert sich diese Fläche, wenn die Probe sich beschleunigt. In einer bevorzugten Ausführungsform führt eine Beschleunigung auf 10 m/s dazu, dass sich der Durchmesser des Probenstroms auf etwa 6,5 µm verringert.
  • Der Impedanzwandler 174 ist mit einem Abfallröhrchen 314a versehen, das sich unmittelbar hinter der Blende 314 befindet, um rote Zellen zu "fangen", wenn sie die Blende verlassen. Wenn die roten Zellen nicht beseitigt werden nach Verlassen der Blende 314, können sie in die Nachbarschaft der Blende zurückkehren und dadurch Signale generieren, welche die Blutplättchenmessungen stören und in einem geringeren Ausmaß die rote Zellmessung stören. Um das Einfangen der gemessenen Zellen zu unterstützen, wird eine Sekundärströmung (über Anschluss E) bereitgestellt, einzig und allein, um Zellen das Abfallröhrchen 314a herunter anzutreiben.
  • Der Impedanzwandler 174 ist außerdem mit mehreren Anschlüssen (A, B, C, D und E) versehen. Anschluss A stellt eine Entlüftung bereit zum Entlüften von Luft (oder anderen Gasen) von der Seite vor der Blende 314. Anschluss B stellt einen Einlass bereit zum Injizieren von Luft in die Kammer 310, um die Seite vor dem Wandler 174 trockenzulegen. Anschluss D stellt den Ablasskanal für die Seite vor dem Wandler bereit, zusammen mit einem Manteleinlassanschluss. Anschluss C stellt einen Einlass bereit zum Injizieren von Luft in die Kammer 312, um die Seite hinter dem Wandler 174 trockenzulegen. Anschluss C stellt auch eine Entlüftung bereit zum Entlüften von Gas von der Seite hinter dem Wandler 174. Anschluss E stellt einen Ablasskanal bereit und einen Einlass für die Sekundärströmung. Anschluss G stellt einen Auslass für Abfall bereit. Anschluss H, auch wenn er in der vorliegenden Ausführungsform nicht verwendet wird, kann verwendet werden, um einen tangentialen Eingangspunkt bereitzustellen zum Einströmen zusätzlicher Fluide in die Seite vor dem Wandler 174.
  • E. HGB-Wandler
  • Der HGB-Wandler 178 misst die optische Absorption von Zellen in einer Blutprobe, um die Spiegel von HGB in der Blutprobe zu bestimmen. Ein HGB-Wandler 178 ist in 18 gezeigt, zusammen mit einem Blockdiagramm der Schaltung zum Erfassen und Analysieren von Signalen von dem HGB-Wandler 178. In einer Ausführungsform wird die HGB-Konzentration gemessen in Gramm pro Deziliter und ist proportional zu der Menge von Licht, die von der Probe in dem grünen Wellenlängenbereich (ungefähr 540 nm) absorbiert wird.
  • Der HGB-Wandler 178 erzeugt ein elektrisches Signal, das mit der Lichtabsorption der Flüssigkeit in der HGB-Wandlerkammer 338 in Beziehung steht. Die Lichtabsorption wird in dem HGB-Wandler 178 gemessen für eine vorbereitete Probe, die Hämoglobin enthält, und für eine klare Referenzlösung. Die Differenz im elektrischen Signal, das durch den Wandler während dieser zwei Messungen erzeugt wird, ist ungefähr proportional zu dem Hämoglobingehalt der vorbereiteten Probe.
  • Die HGB-Wandlerkammer 338, welche transparent sein kann, ist zwischen einer Lichtquelle 322, wie eine Licht-emittierende Diode und dergleichen, und einem Detektor 326, wie eine Photodiode, ein Phototransistor und dergleichen, positioniert (18). Ein Interferenzfilter 326, vorzugsweise angesetzt bei etwa 540 nm, ist zwischen der HGB-Wandlerkammer 338 und dem Detektor 324 platziert. Der Ausgangsstrom des Detektors 324, welcher ungefähr proportional zu der empfangenen Lichtenergie ist, wird durch einen Strom-Spannungs-Verstärker 332 verstärkt. Die analoge Signalverarbeitung der HGB-Signale wird in Abschnitt 8. F. dieser Offenbarung in Verbindung mit den elektronischen Systemen besprochen.
  • Vollblut wird in der HGB-Schale 142 durch die Geschwindigkeit des hereinkommenden HGB-Lysier-Reagenzes zu einem Verdünnungsverhältnis von vorzugsweise etwa 190:1 gemischt. Eine Pumpe 246, welche eine Peristaltikpumpe sein kann, wird verwendet, um eine Probe aus der HGB-Schale 142, durch ein Rohrleitungsnetzwerk 182, das an die HGB-Schale 142 angeschlossen ist, und in die HGB-Wandlerkammer 338 hineinzuziehen. Die HGB-Schale 142 wird durch Auswaschen mit HGB-Lysier-Reagenz gespült, um irgendeine Verschleppung von einer Probe auf nachfolgende Proben zu verringern. HGB-Reagenz wird direkt in dem HGB-Wandler platziert, um die HGB-Referenzablesung bereitzustellen.
  • F. Optikprüfplatz
  • Eine Draufsicht von dem Optikprüfplatz 350 ist in 19 gezeigt. Der Optikprüfplatz 350 ist an dem Analysatormodul 64 befestigt und umfasst eine Laserlichtquelle 352, Spiegel 354, 356, Linsen 358, 360, eine Durchflusszelle 170 (durchscheinendes Kieselglas in einer beispielhaften Ausführungsform) und mehrere Detektoren 400, 402, 404. Der Laserstrahl 368 wird durch einen hinteren Spiegel 354, einen vorderen Spiegel 356, einen Strahleinsteller 370 gelenkt, durch ein Paar zylindrische Linsen 358 und eine Laserfokussierlinse 360 geformt und fokussiert.
  • Der Laser 352 ist vorzugsweise ein vertikal polarisierter, luftgekühlter 488-nm-Argonlaser (Uniphase 2114B-125LAB, oder gleichwertig), der in dem TEM(Tranverse-Elektromagnetik)-Modus mit Lichtrückkopplung arbeitet. In diesem Modus hat die Lichtintensität eine Gauß'sche Normalverteilung und ist in Phase. Der Laserstrahl 368 wird durch das Lichtrückkopplungssystem innerhalb der Laserschaltung bei etwa 10 mW gehalten.
  • Die optischen Elemente zwischen Laser 352 und der optischen Durchflusszelle 170 sind so ausgelegt, dass die Gauß'sche Brenn-Strahltaille bei der Durchflusskammer 300 der optischen Durchflusszelle 170 im Wesentlichen elliptisch ist und etwa 17 µ Höhe auf etwa 64 µ Breite misst. Die Strahltaille ist definiert als die Position entlang der Laserstrahlachse, wo die Querschnittsstrahlabmessung, in einer gegebenen Richtung senkrecht zu der Achse, minimal ist. In der bevorzugten Ausführungsform, die in 19 gezeigt wird, ist das optische System gekennzeichnet durch zwei orthogonale Ebenen der Symmetrie, eine vertikale Ebene und eine horizontale Ebene, wobei jede dieser Ebenen die optische Achse des Laserstrahls enthält. Deshalb ist an jeder Position entlang der Strahlachse die Strahlausdehnung definiert durch zwei orthogonale Abmessungen, eine vertikale Abmessung und eine horizontale Abmessung. Die vertikale Abmessung ist definiert als der lineare Abstand, in der vertikalen Ebene senkrecht zu der optischen Achse gemessen, zwischen den Punkten, wo die Intensität das 1/e2-fache der maximalen Intensität ist, welche in der Mitte des Strahls vorkommt. Die entsprechende horizontale Abmessung ist genauso definiert, außer dass sie in der horizontalen Ebene liegt. Diese Strahlkonfiguration wird erreicht durch ein Paar zylindrische Linsen 358, welche als ein vertikaler Strahlerweiterer wirken. Vorzugsweise hat die vordere Linse eine Brennweite von ungefähr –18,8 mm und die nachgeschaltete Linse hat eine Brennweite von etwa +75,4 mm. Die Linsen 358 sind leicht abseits von der konfokalen Bedingung positioniert, so dass eine zusammenfallende vertikale und horizontale Taille in der Durchflusskammer 300 vorkommt. Vorzugsweise ist die Fokussierlinse 360 sphärisch mit einer Brennweite von etwa 79,5 mm.
  • Ein Strahlfeineinstellmechanismus 370 ist zwischen Laserfokussierlinse 360 und Durchflusszelle 170 positioniert.
  • Dieser Mechanismus besteht aus einem Paar schmaler 10°-Keile mit einem einstellbaren Luftzwischenraum, der verwendet wird, um einen feinen lateralen Versatz des Laserstrahls relativ zu der Probenströmung zu produzieren. Diese Keile sind mit den Eingangs- und Ausgangsflächen senkrecht zu der Laserstrahlachse ausgerichtet. Der Luftzwischenraum kann mittels einer 32-Gewindesteigungsschraube in einer Richtung parallel zu der Laserachse eingestellt werden. Das Verhältnis Luftzwischenraum zu lateralem Strahlversatz ist 10,5/1 bei Verwendung von BK7-Glas als Keilmaterial. Eine vollständige Umdrehung der 32-Gewindesteigungsschraube bewegt daher den einfallenden Laserstrahl lateral um ±75μ relativ zu der Probenströmung, ohne dass irgendeine Änderung in dem Einfallswinkel der Beleuchtung produziert wird. Die laterale Strahlversatzauflösung ist etwas kleiner als ±1μ. Dieses System ermöglicht in Verbindung mit der Gestaltung der Vorwärts- und Seitenwinkelsammeloptik eine einfache Regulierung zur optimalen Ausrichtung des Laserstrahls gegenüber der Probenströmung ohne Beeinträchtigung der Ausrichtung der nachfolgenden Optik.
  • Die Durchflusskammer 300 der Durchflusszelle 170 hat vorzugsweise ein Seitenverhältnis von etwa 2,5. Hydrodynamische Fokussierung innerhalb der optischen Durchflusszelle 170 erzeugt im Wesentlichen eine elliptische Probenkernströmung mit einem näherungsweisen Seitenverhältnis von 15. Wenn die Probenströmungsgeschwindigkeit etwa 2,0 μl/s ist, ist die resultierende Probenströmung ein im Wesentlichen elliptischer Zylinder. Die Längen- und Breitenabmessungen des Probenstroms sind ungefähr 80μ × 5,0μ. Die Strömungsbreite von ungefähr 5μ korrespondiert mit der horizontalen Brenntaille von ungefähren 80μ. Dies führt zu einer maximalen Intensitätsschwankung innerhalb der Strömung von etwa 1%.
  • Die vertikale Brenntaille von etwa 17μ führt zu einer Impulsbreite von ungefähr 2,0 bis 3,5 μs, je nach Zellgröße, wann immer eine Zelle durch den Laserstrahl 368 bei der nominellen Strömungsgeschwindigkeit von etwa 8 Meter/s hindurchgelangt.
  • Die Detektoren 380, 400, 402 und 404 messen die Effekte von Zellen, die durch die Durchflusszelle 170 hindurchgelangt. Vorzugsweise sind die Detektoren 380, 400, 402 und 404 in der Lage, mindestens sieben optische Parameter zu messen. Ein oder mehrere Detektoren sind vorzugsweise in dem Vorwärts-Lichtweg platziert zum Messen von Vorwärts-Zwischenwinkelstreuung und entweder Kleinwinkelvorwärtsstreuung oder Axiallichtverlust (ALL, auch bekannt als Vorwärtsextinktion). ALL ist im Allgemeinen die Abnahme von Lichtenergie aufgrund einer Zelle, die vor einem Laserstrahl vorbeikommt, und die durch eine Photodiode erfasst wird. Der Lichtverlust erfolgt im Allgemeinen aufgrund von Streuung. Vorzugsweise ist ein gemessener Parameter ALL, was definiert ist als die Abnahme von Lichtenergie, die einen Detektor in dem Weg eines Laserstrahls wegen der Passage einer Zelle durch diesen Strahl erreicht. Kleinwinkelvorwärtsstreuung ist im Gegensatz dazu Lichtenergie, die einen Detektor außerhalb (aber innerhalb eines kleinen Winkels von 1° bis 3°) des einfallenden Laserstrahls erreicht aufgrund von Streuung durch eine Zelle, die durch den Strahl hindurchgeht. Ein Strahlstopp wird generell bereitgestellt, um den Laserstrahl davon abzuhalten, in den Detektor zu gelangen. ALL-Messsysteme sammeln Licht innerhalb des einfallenden Kegels von Laserbeleuchtung, während Kleinwinkelstreuungssysteme Licht außerhalb dieses Kegels sammeln. In ALL-Messsystemen ist das interessierende Signal ein negatives Signal, das von dem gleichbleibenden Lasersignal subtrahiert wird, während in der Kleinwinkelvorwärtsstreuungsmessung das Signal ein kleines positives Signal ist, das einem sehr niedrigen Hintergrundlichtpegel überlagert ist. Zwischenwinkelvorwärtsstreuung (IAS) ähnelt der Kleinwinkelvorwärtsstreuung, außer dass das Licht bei einem größeren Winkel von dem einfallenden Laserlicht her gestreut wird. Ausdrücklicher betrifft IAS Licht, das in einem Ring zwischen etwa 3 Grad und 10 Grad weg von dem einfallenden Laserstrahl oder der Mittellinie eines Laserstrahls gestreut wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ALL in den Winkeln kleiner als etwa 0,3 Grad horizontal und kleiner als etwa 1,2 Grad vertikal von der Laserachse gesammelt, und IAS wird bei Winkeln zwischen etwa 3 Grad und 10 Grad von der Laserachse gesammelt.
  • Das bevorzugte Vorwärtswegoptiksystem, das in 19 und 20 gezeigt wird, umfasst eine sphärische plankonvexe Linse 376 und eine Zweielement-Photodiode 380, die sich in der hinteren Brennebene der Linse befindet. In dieser bevorzugten Konfiguration bildet jeder Punkt innerhalb der Zweielement-Photodiode 380 einen spezifischen Sammelwinkel für Licht von Zellen ab, die sich durch die Durchflusskammer 300 bewegen, unabhängig von der Position der Zellen. Folglich ist das innere Element 382 vorzugsweise im Wesentlichen rechteckig, was die Asymmetrie der Laserstrahldivergenz entsprechend abbildet, und misst ALL. Das äußere Element 384 ist vorzugsweise ein im Wesentlichen kreisförmiger Ring und bildet entsprechend den Bereich von Sammelwinkeln von Vorwärtsstreuung ab, was für die Messung von IAS erwünscht ist.
  • Diese Ausrichtung des Vorwärtswegs ist unabhängig von der optischen Durchflusszelle 170 und der Laserstrahlfeinausrichtung. Um die gewünschte Sammelgeometrie bereitzustellen wird die laterale Position des Zweielement-Detektors bezüglich der Sammellinse 376 ausgerichtet. Eine Änderung der optischen Durchflusszelle 170 oder Neueinstellung des einfallenden Laserstrahls 368 mittels Element 370, was nur den Strahl neu positioniert, ohne dass es irgendeine Winkelneuverteilung bewirkt, hat keine Auswirkung auf die Winkelakzeptanz des Detektors 380 und erfordert deshalb keine entsprechende Neueinstellung der Vorwärtswegoptik.
  • Alternativ könnte der Zweielement-Einzeleinheit-Detektor 380 ersetzt werden durch zwei getrennte Detektoren. In diesem Fall würde ein Spiegel mit einem Mittelloch von richtigem Durchmesser in der hinteren Ebene der Linse 376 platziert werden. Der Spiegel würde IAS zu einem der Detektoren reflektieren. Ein Schlitz, der mit dem Mittelloch des Spiegels zusammenfällt und geformt ist, nur den Laserstrahl hindurchzulassen, würde Licht für ALL-Messungen zu dem zweiten Detektor übertragen, der sich hinter dem Spiegel befindet.
  • Jedes der oben beschriebenen Schemata ist eine Variation an Kleinwinkelsammelsystemen. Die beschriebenen Schemata erfordern keinen Verdunkelungsbalken und seine zugehörigen Einstellungen. In dem bevorzugten ersten Fall können beide Detektoren auf einem Chip integriert werden. Kein Spiegel ist erforderlich. Integration eines Neutraldichtefilters 386, wie in 20 gezeigt, ist wünschenswert, um das ALL-Signal davon abzuhalten, das innere ALL-Element 382 zu sättigen. Vorzugsweise wird der Filter 386 bereitgestellt durch Beschichten des inneren ALL-Elementes 382 mit einem Neutral Density 2.0-Überzug (ein Überzug, der etwa 1% des einfallenden Lichts durchlässt). Ein Antireflexionsüberzug kann über das äußere IAS-Element 384 aufgeschichtet werden.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform, wie in 19 und 21 veranschaulicht, sind die übrigen Detektoren 400, 402 und 404 drei Photomultiplier (PMTs), welche entweder Seitenstreuung (Licht gestreut in einem Kegel, dessen Achse ungefähr senkrecht zu dem einfallenden Laserlicht ist) oder Fluoreszenz (Licht emittiert von den Zellen bei einer anderen Wellenlänge als die des einfallenden Laserlichts) erfassen. Ein bewegliche s Polarisationsfilter 436, das in dem Lichtweg von PMT 400 platziert ist, konfiguriert PMT 400 und PMT 401, depolarisierte Seitenstreuung (DSS) bzw. polarisierte Seitenstreuung (PSS) zu erfassen, während bewegliche Filter (430, 432, 434) den Nachweis von Fluoreszenzemissionen bei spezifischen Wellenlängen von den Zellen ermöglichen. FL1, grüne Fluoreszenz, wird erfasst zwischen etwa 515 und 545 nm. FL2, gelbe Fluoreszenz, wird erfasst zwischen etwa 565 und 595 nm. FL3, rote Fluoreszenz, wird erfasst zwischen etwa 615 und 645 nm. Seitenstreuung und Fluoreszenzemissionen werden zu diesen PMTs durch zweifarbige Strahlteiler 401 und 403 gelenkt, welche die erforderlichen Wellenlängen wirksam weitergeben und reflektieren, um einen wirksamen Nachweis zu ermöglichen.
  • Die Sensitivität wird bei PMTs 400, 402 und 404 beim Messen von Fluoreszenz gesteigert durch Nutzung eines Immersionssammelsystems, wie in 22 veranschaulicht. In diesem Beispiel ist das Immersionssammelsystem ein System, das die erste Linse 414 an Durchflusszelle 170 mittels einer Brechungsindexanpassungsschicht 416 optisch koppelt, was die Sammlung von Licht über einen weiten Winkel ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Sammelwinkel etwa 130° bei der Probenströmung, im Vergleich zu etwa 44° in einem typischen Luftzwischenraumkondensorsystem mit einer numerischen Apertur von 0,5. Es kann mathematisch gezeigt werden, dass die Fluoreszenzenergie, die von einem fluoreszierenden Partikel gesammelt wird, proportional zu (1-cosU) ist, worin U definiert ist als die Hälfte des Kegelsammelwinkels. Folglich sammelt das bevorzugte 130°-System fast 8 mal mehr Energie als das 44°-System, eine Differenz, die Fluoreszenznachweis mit kleineren leistungsarmen Lasern und/oder schwächeren Fluoreszenzmarkern ermöglicht. Das System ist auch farbkorrigiert, so dass ein gegebener optischer Pfad bei im Wesentlichen unterschiedlichen Wellenlängen ohne Neufokussierung verwendet werden kann. Das ermöglicht einem einzelnen PMT, mehrere Wellenlängen von Licht nachzuweisen durch Dazwischenlegen oder Entfernen von optischen Filtern 430, 432 und 434.
  • Wie in 21, 22 und 24 gezeigt wird, ist das veranschaulichte Immersionssammelsystem telozentrisch insofern, als dass die Kathodenfläche eines gegebenen PMT mit einem Objektivöffnungsanschlag 410 (gezeigt in 22) gepaart ist und sich bezüglich der Durchflusskammer 300 der Durchflusszelle 170 im Unendlichen befindet. Diese Konstruktion verringert die Notwendigkeit zur genauen Ausrichtung der PMTs bezüglich zueinander und bezüglich der Durchflusszelle 300.
  • Wie in 22 gezeigt wird, umfasst der Kondensor 412 vorzugsweise ein plan-hemisphärisches erstes Element 414, das an die Quarzdurchflusszelle 170 durch eine Indexanpassungsgelschicht 416 optisch gekoppelt ist. Im Allgemeinen ist der Kondensor 412 ein optisches Linsensystem mit Abbildungsfehlerkorrektur, das für Weitwinkellichtsammlung ausreichend ist, aber unzureichend ist für brechungsbegrenzte Bildgebung, die in hochauslösender Mikroskopie verwendet wird. Ein geeignetes Gel ist erhältlich von Dow Corning (Identifikationsnummer 02-3067). Die Spezifikationen einer bevorzugten Ausführungsform des Kondensors sind in Tabelle 1 aufgelistet.
  • Tabelle 1
    • R1 → ∞
    • t12 = 1,82 (SiO2-Fenster)
    • R2 → ∞
    • t23 = 3,913 (FK5 – Kronflintglas Nr. 487704)
    • R3 = –3,913
    • d34 = 0,929 (Luftzwischenraum)
    • R4 = –54,7
    • t45 = 5,14 (FK5)
    • R5 = –9,753
    • d56 = 3,348 (Luftzwischenraum)
    • R6 = 45,7
    • t67 = 2,0 (SF5 – dichtes Flintglas Nr. 673322)
    • R7 = 16,853
    • t78 = 7,9 (BK7)
    • R8 = –24,028
    • d89 = 0,635 (Luftzwischenraum)
    • R9 = 35,649
    • t910 = 2,0 (SF5)
    • R10 = 13,014
    • t1011 = 6,95 (BK7)
    • R11 = –120,59
    • A = 3,913 + 0,02/–0,12
    • B = 1,82 ± 0,02
    • C = 0,16 ± 0,02
    • D = 0,929
  • Das PMT-optische System ist vorzugsweise modular und ist in 23 und 24 veranschaulicht. Jedes PMT-Modul umfasst entweder 1 oder 2 PMTs und eine Schlitz/Feldlinsenbaugruppe 420, welche einen Schlitz 422 und Feldlinsen 424 und 425 (23 und 24) umfasst. Der Schlitz 422, welcher mit der Durchflusskammer 300 verbunden ist, minimiert Hintergrundlicht an der Kathode des PMT 400. Die Feldlinsen 424 (vorzugsweise mit Brennweite von etwa –12,0 mm) und 425 (vorzugsweise mit Brennweite von etwa 15,0 mm) bewirken die telozentrische Konfiguration, die oben besprochen wurde. Optische Filter 430, 432, 434 und Polarisationsfilter 436 werden in die Lichtwege der PMTs eingesetzt, um die Wellenlänge und/oder die Polarisation des erfassten Lichts zu ändern. Zusätzlich gelten die folgenden Abmessungen für 24:
    A = 46,0
    B = 20,61
    C = 22,98
    D = +14,976
    E = 13,292
    F = 0,522
    G = 2,0
    H = 6,7
    I = 3,8
    J = 3,78
    K = 22,98
    L = F530 = –12,025
    R1 = –6,248
    Φ = 5,0
    t1 = 2,0 (BK7)
    R2 → ∞
    Q2 = 10,0
    M = 6,43
  • Es sollte erwähnt werden, dass das System so ausgelegt ist, dass ein drittes PMT-Modul leicht hinzugefügt werden kann, was, mit dem Hinzufügen geeigneter zweifarbiger Spiegel und Bandpassfilter, ermöglichen würde, dass bis zu 6 PMTs in das System integriert würden. Zum Beispiel könnte man sich eine anspruchsvolle Analyse vorstellen, die gleichzeitige Messungen von vier Fluoreszenzdetektoren zusammen mit polarisierter Seitenstreuung (PSS) und depolarisierter Seitenstreuung (DSS) erfordert.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform wird ALL durch eine im Wesentlichen rechteckige Photodiode und ein N.D.-2.0-Filter (siehe 20) gemessen. IAS wird durch eine Außenringphotodiode ohne Filter gemessen. PSS wird durch ein Hamamatzu PMT R928 (402) ohne Filter gemessen. DSS wird durch ein PMT R928 (400) und ein horizontales Polarisationsfilter (436) gemessen. FL1 wird durch ein PMT R928 (400) und ein 530/30-Filter (ein Bandpassfilter, das bei etwa 530 nm zentriert ist, mit einem Passband von etwa 30 nm, 430) gemessen. FL2 wird durch ein PMT R928 (402) und ein 580/30-Bandpassfilter (432) gemessen. FL3 wird durch ein PMT R928 (404) und ein 630/30-Bandpassfilter (434) gemessen.
  • 9. Pneumatikeinheit
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Zellanalysensystems 60 ist die Pneumatikeinheit 72 eine separate Einheit mit einer eigens zugeordneten Stromversorgung. Diese Konstruktion verringert Gewicht, Größe und Energieverbrauch des Analysatormoduls 64 und des Datenstationsmoduls 68.
  • Die Pneumatikeinheit 72 umfasst eine Druckpumpe und eine Vakuumpumpe. Sie stellt einen geregelten Druck von ungefähr 0,58 × 105 Pa (8 ½ psi), einen anderen Druck von etwa 0,83 × 105 Pa – 1,03 × 105 Pa (12-15 psi), einen höheren Druck von etwa 2,75 × 105 Pa (40 psi) und ein Vakuum von etwa 0,52 × 105 Pa (15 Inch (381 mm) Quecksilbersäule) bereit.
  • Die Vakuumdrücke werden durch die Analysator-Software kontrolliert, die in einem geeigneten Speicher wie einem RAM, einem ROM, einem EPROM, einem SRAM und dergleichen vorhanden ist.
  • 10. Datenstation/Computer
  • Das Datenstationsmodul 68 ist vorzugsweise ein 80386- oder 80486-basierter PC-kompatibler Computer einschließlich einem Anzeigenterminal, Diskettenlaufwerk, einer Festplatte, einer Tastatur, einem Zeigegerät und LAN-Anschluss. In einer beispielhaften Ausführungsform ist das Anzeigenterminal farbig, das Diskettenlaufwerk ist ein 3,5 Zoll-Laufwerk, die Festplatte hat mindestens 540 Megabyte Speicher und die Tastatur ist vom PC-Typ. Die Datenstation 68 kann mit Speicher versehen sein, wie RAM, ROM, SRAM, EPROM und dergleichen, die ausreichend Software-Algorithmen enthalten, um gemessene Daten zu manipulieren, Parameter zu berechnen und Ergebnisse anzuzeigen in einer Vielzahl von Formaten, einschließlich Histogramme, Streuwertdiagramme und andere multidimensionale Diagramme.
  • Die Datenstation 68 des Zellanalysensystems 60 hat Speicher und andere Vorrichtungen, welche Algorithmen für verschiedene Zellanalysen anwenden. Diese Algorithmen werden verwendet, um Cluster von Datenpunkten zu analysieren, die durch das Analysatormodul 64 erzeugt werden, um Informationen von klinischer Relevanz zu ergeben. Das offenbarte integrierte Hämatologie/Immunologieinstrument stellt eine einzige Plattform bereit, auf welcher eine derartige Software implementiert werden kann, wodurch ein Instrument bereitgestellt wird, das nicht nur Hämatologie- und Immunologieprobenverarbeitung und -messung automatisiert, sondern auch die Datenanalyse automatisiert.
  • Die Datenstation 68 stellt auch Datenverwahrungsorte bereit, welche Sammlungen sind von verwandten Probendatensätzen. 28 veranschaulicht einen bevorzugten Satz von Datenverwahrungsorten einschließlich Datenprotokolle, Patientengeschichten, Qualitätskontroll(QC)-Dateien, Standardreferenzpartikeldateien, gepaarte Duplikate-Dateien, Bull-Algorithmus(X-B)-Batches, gleitende Mittelwerte-Dateien und Kalibrierungsdateien.
  • 11. Elektronische Systeme
  • Elektronische Systeme sind in dem Analysatormodul 64, dem Datenstationsmodul 68 und der Pneumatikeinheit 72 zu finden. Der Analysator 64 stellt die Hardware-Plattform für Datenerfassung und Fluidik- und Bewegungssteuerung bereit. In einer beispielhaften Ausführungsform ist die Datenstation 68 ein Allzweck-Computer, der als eine Benutzerschnittstelle dient und die erfassten Daten verarbeitet, anzeigt und speichert. Die Pneumatikeinheit 72 reguliert die Vakuum- und Druckquellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die drei Module physikalisch getrennt und jede Einheit wird von einer separaten Wechselstromsteckdose mit Strom versorgt. Die Datenstation 68 und die Pneumatikeinheit 72 kommunizieren mit dem Analysator 64 durch unabhängige serielle Kommunikationskanäle 76, 84.
  • 25 ist ein Blockdiagramm, das einige elektronische Hardware-Komponenten des Analysators 64 veranschaulicht. Diese Komponenten umfassen ein Zentralverarbeitungsmodul 500 (CPM), ein Datenerfassungs-Subsystem 502 und ein Bewegungssteuerungs-Subsystem 504. Das CPM 500 steuert das Datenerfassungs-Subsystem 502, das Bewegungssteuerungs-Subsystem 504 und Kommunikationsfunktionen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des CPM 500 umfasst die folgenden Leistungsmerkmale:
    • – Motorola 68302 Integral-Multiprotokoll-Prozessor, getaktet mit 20 MHz
    • – 1 MB dynamisches RAM, erweiterbar in Schritten von 1 MB bis auf 4 MB
    • – 128 KB EPROM
    • – 2 KB nichtflüchtiges RAM
    • – DMA-Controller für schnelle 16-Bit-Übertragungen von erfassten Impulsdaten von A/D-Wandlern zum CPM-RAM
    • – gepufferter 8-Bit-Bus für Datenerfassungskontrolle und Diagnosefunktionen
    • – zwei serielle Motorprozessmodul(MPM)-Verbindungen
    • – eine serielle Peripherie-Verbindung
    • – eine serielle Pneumatikeinheit-Verbindung
    • – eine serielle HDLC-Verbindung
    • – Direkter Speicherzugriff(Direct Memory Access, DMA)-Kanal, dediziert zu serieller HDLC-Verbindung
    • – ein RS-232-Anschluss für Barcode-Leser
    • – ein RS-232-Anschluss für Diagnoseterminal
  • 26 ist ein Blockdiagramm, das Details des Datenerfassungs- Subsystems 502 veranschaulicht, das in 25 gezeigt wird. Zell- oder Probenmerkmale werden in elektrische Signale umgewandelt bei dem HGB-Wandler 178, dem Impedanzwandler 174 und der optischen Durchflusszelle 170. Der Impedanzwandler 174 und die optische Durchflusszelle 170 erzeugen generell elektrische Impulse als ihre Ausgangssignale, und der HGB-Wandler 176 gibt ein Niederfrequenz-Signal aus. Der Ausgang von jeder Durchflusszelle/jedem Wandler wird separat durch das Datenerfassungs-Subsystem 502 verarbeitet.
  • Die Ausgangssignale des Impedanzwandlers 174 und der optischen Durchflusszelle 170 werden durch mehrere Detektoren 510 erzeugt. Diese Detektoren bestehen aus PMTs und Photodioden des Optikprüfplatzes 350 oder der elektrischen Schaltung des Impedanzwandlers 174. Jeder Detektorausgang wird durch ein Vorverstärkermodul 512 und ein Signalverarbeitungsmodul 514 zu einem Analog-Digital-Wandler(ADC)-Modul 516 gespeist. Die Signalverarbeitungsmodule 514 umfassen eine Schaltung für die Messung von Impulsattributen wie Impulshöhe und dergleichen. Der AD-Wandler 516 ist ein Multiplex-Wandler, der Analogausgaben von dem Signalverarbeitungsmodul 514 in Digitalwerte ändert, die diese Impulsattribute darstellen. Die Digitalwerte werden dann zu dem CPM 500 über direkten Speicherzugriff (DMA) 518 übertragen. Das CPM 500 verarbeitet die Informationen und sendet dann die Daten zu der Datenstation 68 durch die High Level Data Link Control(HDLC, ein Kommunikationsprotokoll)-Datenverbindung 76. Das Datenerfassungs-Subsystem 502 erzeugt außerdem die Analogspannungen, die für verschiedene Parametereinstellungen erforderlich sind, wie Triggerpegel, Gatterpegel, Laserausgangsleistung und andere.
  • Die Ausgaben des HGB-Wandlers 178 werden durch eine HGB-Detektor/Analog-Multiplexer-Baugruppe 328 direkt zu dem ADC-Modul 516 gespeist. Im Allgemeinen umfasst die HGB-Baugruppe 328 einen Transresistance-Verstärker 332 und eine Stromquelle 334 (18). Die HGB-Baugruppe 328 und ihre Komponenten werden ausführlicher unter Abschnitt 8. F. dieser Offenbarung besprochen.
  • A. ADC-Modul
  • Das ADC-Modul 516 enthält einen Analog-Digital-Wandler. Das ADC-Modul 516 ist multiplexed, um Analogspannungen von den Signalverarbeitungsmodulen 514 und Hilfsspannungen innerhalb des ADC-Moduls 516 selbst zu messen.
  • Die Digitaldarstellung von jeder Spannungsmessung hat eine zugeordnete identifizierende Markierung. In einem Strom von Daten zeigt die Markierung den speziellen Messwert an, der folgt. Alle Markierungen sind 7 Bit lang, was maximal 128 unterschiedliche Parameter erlaubt.
  • Die Signalverarbeitungsmodule 514 enthalten eine Spitzenwerthalteschaltung, die jedem Ausgangssignal von dem Vorverstärker 512 zugeordnet ist. Eine Spitzenwerthalteschaltung empfängt einen elektrischen Impuls als ihr Eingangssignal und erzeugt eine stabile Spannung gleich der Maximalspannung, die während des Impulses erfasst wurde. Ein programmierbarer Markierungssequenzer in dem ADC-Modul 516 zeigt jeweils auf eine dieser Spitzenwerthalteschaltungen, wodurch der Wert, der gemessen werden soll (die stabile Ausgangsspannung), zu dem ADC-Modul geleitet wird, welches die Umwandlung von diesem einzelnen Signal von seiner Analogform (Spannung) in einen Digitalwert durchführt. Nachdem genügend Zeit für diese Umwandlung zugelassen worden ist, zeigt der Markierungssequenzer auf die nächste Spitzenwerthalteschaltung, die einen Wert hält, der gemessen werden soll. Wenn jede Umwandlung beendet ist, wird die entsprechende Markierung, die das gemessene Signal identifiziert, an die Daten angehängt. Auf diese Weise teilt der Markierungssequenzer das ADC-Modul zeitlich, indem er jedem Eingang einen Zeitschlitz zuordnet. Die Ergebnisse dieser Umwandlungen werden zu dem Hauptspeicher auf dem CPM 500 über den DMA 518 übertragen. DMA wird genutzt, um Daten mit hohen Raten ohne CPU-Intervention zu übertragen.
  • B. Impedanzwandler-Vorverstärker
  • Der Vorverstärker 512 enthält eine rauscharme programmierbare Konstantstromquelle. Dieser konstante Strom wird zwischen zwei Bahnen verteilt. Eine Strombahn fließt durch die Elektroden in dem Impedanzwandler; der andere fließt in den Vorverstärker 512. Da die Summe der beiden Ströme konstant ist, wird eine Änderung des Stroms durch die Elektroden (verursacht durch Zelldurchgänge durch den Impedanzwandler 174) als eine Änderung der Ausgangsspannung des Vorverstärkers 512 wiedergegeben.
  • C. Impedanzwandler-Signalverarbeitung
  • Die Ausgabe von dem Impedanzwandler-Vorverstärker wird auf zwei unabhängige Wege geleitet, jeder mit einem programmierbaren 12-Bit-Gatter, Basislinienrücksteller, Impulsdetektor und einer Spitzenwerthalteschaltung. Ein Weg ist für den RBC-Impulsnachweis und der andere Weg ist für den PLT-Impulsnachweis. Der gleiche Impuls wird somit gleichzeitig auf die folgenden zwei verschiedenen Kriterien geprüft.
  • Ein Impuls wird als gültig erfasst, falls sein Höchstwert einen gegebenen Schwellwert überschreitet. Das Datenerfassungs-Subsystem 502 erkennt Pegelschwellwerte und Flankenschwellwerte. Der Flankenschwellwert verbessert die Hardware-Zähler-Totzeit, indem die Zählung von zwei Impulsen ermöglicht wird, die zeitlich sehr dicht hintereinander ankommen.
  • Jeder Typ von Zelle erfordert seine eigenen Qualifikationskriterien. RBC-Impulse sollten einen bestimmten Pegel und eine bestimmte Flanke überschreiten. Eine bestimmte negative Flanke sollte überschritten werden, um den Detektor für den nächsten Impuls zurückzusetzen.
  • PLT-Impulse kommen in der gleichen Sequenz mit RBC-Impulsen vor. Jedoch sind PLTs von RBCs unterscheidbar, da PLTs kleiner sind. Ein Impuls wird als ein nachgewiesenes PLT klassifiziert, wenn er einen unteren Pegelschwellwert überschreitet, aber nicht über einen oberen Schwellwert hinausgeht. Zusätzlich müssen die Impulse eine vorherbestimmte positive Flanke überschreiten, um als ein gültiger PLT angesehen zu werden. Eine bestimmte negative Flanke sollte überschritten werden, damit der Detektor für den nächsten Impuls zurückgesetzt wird.
  • Falls ein Impuls die Qualifikationskriterien befriedigt, wird ein Triggersignal zu der Spitzenwerthalteschaltung gesendet und eine nachfolgende ADC-Umwandlung wird initiiert. Triggerimpulse von dem Impedanzwandler 174 werden in zwei eigens zugeordneten 16-Bit-Zählern gezählt. Ein Zähler ist für RBCs und der andere Zähler ist für PLTs.
  • Jeder Ausgabeweg von den Impedanzwandler-Vorverstärkern umfasst eine Basislinienrücksetzschaltung, um die Hintergrundgleichstromkomponente von den verstärkten Signalen zu subtrahieren. Die Offsetspannung, die von diesen Schaltungen erzeugt wird, wird überwacht, so dass sie ein Werkzeug für die Diagnose bereitstellt.
  • D. Optischer Vorverstärker
  • Licht, das von der optischen Durchflusszelle 170 emittiert wird, wird in unterschiedlichen Winkeln durch die Detektoren 510 gesammelt, welche Photodioden (PD1 und PD2) und Photomultiplier (PMT1, PMT2 und PMT3) umfassen. Diese Signale haben einen weiten dynamischen Bereich und entsprechend wird ein weiter Bereich an Verstärkungseinstellung bereitgestellt. Für die PMTs wird eine Verstärkungseinstellung vorzugsweise erreicht, indem eine Dynodenspannung an dem PMT selbst (etwa 200 V bis etwa 1100 V) geregelt wird. Diese Prozedur kann die Verstärkung über einen Bereich von ungefähr 105 einstellen. Die optischen Vorverstärker der PMTs wandeln die Stromausgabe von den PMTs in eine Spannung mit fester Verstärkung.
  • Die Verstärkung von jeder Photodiode (PD) ist an ihrem Vorverstärker in Leistungsschritten von 2 programmierbar. Die PD-Vorverstärker wandeln den PD-Ausgangsstrom in Spannung.
  • E. Optische Signalverarbeitung
  • Die optischen Vorverstärkerausgaben werden auf fünf unabhängige Wege oder Kanäle geleitet. Jeder Kanal umfasst seinen eigenen Basislinienrücksteller, Impulsdetektor, Spitzenwerthalteschaltung und programmierbare 12-Bit-Verstärkung (nach Spitzenwerteinfang).
  • Ein "optischer" Impuls wird als gültig erfasst, wenn sein Spitzenwert einen vorherbestimmten programmierbaren Schwellwert überschreitet. Ein gültiger Impuls erzeugt einen digitalen Triggerimpuls. Der Triggerimpuls kann programmiert werden, einer von mehreren gewählten logischen Kombinationen von Kanälen (PD1, PD2, PMT1, PMT2, PMT3) zu sein. Jeder Kanal hat seinen eigenen programmierbaren unteren Schwellwert.
  • Der Triggerimpuls initiiert den Spitzenwerteinfang und nachfolgende ADC-Wandlung der eingefangenen Spitzenwerte für die fünf Kanäle. Der Trigger kann qualifiziert sein, indem ein Gatterkriterium verlangt wird. Zum Beispiel kann der Trigger ungültig sein, falls das Signal an PD1, PD2 oder PMT2 einen vorherbestimmten Gatterschwellwert überschreitet.
  • Eine Basislinienrückstellerschaltung wird bereitgestellt zum Subtrahieren der Gleichstromkomponente von den Impulssignalen, wodurch irgendwelche Gleichstrom-Hintergrundoffsets verringert werden. Die Reaktionszeit dieser Schaltungen ist kleiner als die Breite des mittleren Impulses. Die Offsetspannung, die durch diese Schaltungen erzeugt wird, wird überwacht, wodurch ein Werkzeug für die Diagnose bereitgestellt wird.
  • Triggerimpulse von der optischen Durchflusszelle 170 werden in zwei eigens zugeordneten 16-Bit-Zählern gezählt. Ein Zähler ist für die durchgelassenen Zellen (jene Zellen, die durch das Gatterkriterium nicht zurückgewiesen worden sind) und der andere Zähler ist für die Gesamtzahl von Zellen, die der unteren Schwellwertanforderung genügen.
  • F. HGB-Signalverarbeitung
  • 18 ist ein Blockdiagramm eines vereinfachten Hämoglobin (Hb)-Messsystems. Die Konzentration von Hämoglobin, die in der vorbereiteten Probe enthalten ist, wird gemessen, zum Beispiel in Gramm pro Deziliter. Diese Konzentration ist proportional zu der Extinktion des Lichts durch die Probe in dem grünen Wellenlängenbereich (etwa 540 Nanometer).
  • Der Lichtweg besteht aus einer stromgesteuerten Licht emittierenden Diode 322, einer Wandlerkammer 338, einem Filter 326 (etwa 540 nm) und einer Photodiode 324.
  • Der Ausgangsstrom von der Photodiode, der proportional ist zu der empfangenen Lichtenergie, wird verstärkt durch den Transresistance-Verstärker 332. Die Ausgabe des Transresistance-Verstärkers 332 wird an das ADC-Modul 516 gesendet.
  • Die Differenz zwischen Spannungen, die gebildet wird, wenn eine klare Referenzlösung in der Wandlerkammer 338 gemessen wird und wenn die vorbereitete Probe, die Hämoglobin enthält, gemessen wird, ist repräsentativ für die Hämoglobinkonzentration.
  • G. Zeitstempel
  • Das Signalverarbeitungsmodul 514 verwendet einen 16-Bit-Zähler (nicht gezeigt), um einen Zeitstempel mit einer Auflösung von ungefähr 0,5 ms zu generieren. Der Zeitstempelwert wird mit den Daten aus jeder automatischen Sequenziteration, welche zu gültigen Daten führte, die in dem ADC-Modul 516 erfasst wurden, gespeichert.
  • H. Bewegungssteuerung
  • 27 ist ein Blockdiagramm, das eine beispielhafte Ausführungsform des Bewegungssteuerungs-Subsystems 504 veranschaulicht. Die Ablaufsequenzen und automatisierten Probenverarbeitungsoperationen des Analysators 64 werden durch das Bewegungssteuerungs-Subsystem 504 gesteuert.
  • Wie dargestellt umfasst das Bewegungssteuerungs-Subsystem 504 ein Motorprozessmodul 520 (MPM), ein Ventilsteuerungsmodul 522 (VCM), ein Fluidsensormodul 524 (FSM) und ein Digitaleingabemodul 526 (DIM). Die MPMs 520 kommunizieren mit dem CPM 500 über zwei unabhängige serielle Verbindungen 530, 532 (500 KB), und jedes MPM 520 steuert vorzugsweise bis zu 12 Schrittmotoren 534. Die VCMs 522 steuern alle Ventile in dem Analysator 64. Die DIMs 526 überwachen alle Digitaleingaben (Schalter, optische Sensoren und magnetische Sensoren). Das FSM 524 überwacht alle Fluid-Sensoren.
  • Die VCMs 522, DIMs 526 und das FSM 524 sind intelligente Module, die vorzugsweise mit dem CPM 500 über einen halbduplexen, differentiellen seriellen Peripheriebus kommunizieren. Zusätzliche Peripheriemodule können zu diesem Bus hinzugefügt werden.
  • 12. Software
  • Software steuert die Hauptoperationen des Zellanalysensystems 60, einschließlich die Analysatorablaufsequenzen, die zeitliche Steuerung und die Reihenfolge von Ereignissen, das Sammeln von Daten und Umwandeln gemessener Daten in aussagefähige Ergebnisse. Die Software ist auf geeigneten Speichern wie RAM, ROM, EPROM, SRAM und dergleichen resident, die in dem System 60 zu finden sind. Die Software-Komponenten sind vorzugsweise in die sechs Domänen (dargestellt durch Kreise) verteilt, die in 2 gezeigt sind.
  • Die Bedienerschnittstellen-Domäne 90 reguliert Benutzerinteraktion mit der Datenstation 68, einschließlich alle bedienergesteuerten Eingabegeräte, die an die Datenstation angeschlossen sind, Definition und Generierung aller Datenstationsanzeigen und Definition aller gedruckten Ausgaben. Die Datenstationsbetriebssoftware 92 steuert Probenverarbeitung, Datenverwaltung, Sicherheit, Kommunikation mit dem Analysatormodul und Laborinformationssystemen (LIS) und Generierung von gedruckten Ausgaben.
  • Die Algorithmus-Software 96 kann jede gewünschte Kombination von angewandter Mathematik einschließen. Die Algorithmen werden bei der Analyse von Probendaten, der Umwandlung von Listenmodusdaten in grafische und numerische Ergebnis und der statistischen Analyse von Gruppierungen von numerischen Ergebnissen angewendet. Diese Algorithmen umfassen vorzugsweise Cluster-Verfahren zur Identifizierung diskreter Zelltypen oder Konditionen.
  • Die Analysatorbetriebssoftware (AOS) 98 steuert die Elektronik des Analysatormoduls (Hardware), Datensammlung und Übermittlungen an das Datenstationsmodul. Die zeitliche Steuerung und Planung von allen Analysatoraktivitäten einschließlich Analysatorablaufsequenzen wird ebenfalls durch die AOS 98 gesteuert.
  • Die Ablaufsequenz(FSQ)-Software 100 steuert die mechanischen Komponenten, die zum Bewegen von Fluiden durch das Analysatormodul 64 erforderlich sind, einschließlich die Ausführung von automatisierten Probenverarbeitungsprotokollen und integrierten Hämatologie- und Immunologietests.
  • Die Firmware 102 umfasst ein Netzwerk von EPROM-residenten Gerätecontrollern für verschiedene Hardware-Module des Analysators 64 und der Pneumatikeinheit 72.
  • Die Bedienerschnittstelle (OI), Datenstationsbetriebssoftware (DSOS) und Algorithmen verwenden das Datenstationsmodul 68 als ihre Plattform. Die AOS 98, FSQ-Software 100 und Firmware 102 ruhen in dem Analysatormodul 64 und verwenden dieses Modul als ihre Plattform. Die bevorzugte Software ist eine Multitasking-Multithreaded-Applikation.
  • Die AOS 98 ruht in dem CPM 500 und ist die Hauptsteuerung für den detaillierten Betrieb des Analysators 64. Sie kommuniziert mit mehreren Slave-Mikrocontrollern, die für Schrittmotorzeitsteuerung, Analog-Digital-Wandlung, geregelte Vakuum/Druck-Überwachung/Steuerung, Ventilsteuerung und Digitalsensorausgaben verantwortlich sind. Zusätzlich ist sie verantwortlich für Daten-, Status- und Steuerungskommunikation mit der Datenstation 68, an die sie angeschlossen ist. Die AOS 98 wird vorzugsweise auf einem Motorola 68302-CPU-Chip ausgeführt. Ihre Firmware wird in einem oder mehreren externen EPROMs gespeichert, und die heruntergeladene AOS und Ablaufsequenzen werden in einem Onboard-RAM (RAM auf der Baugruppe) gespeichert. Eine Ausführungsform der AOS-Operation ist in 29 und 30 gezeigt.
  • Die AOS 98 umfasst Multitasking-Funktionen zum Implementieren der Ablaufsequenzen. Die AOS lädt Ablaufsequenzen von der Datenstation herunter und speichert sie in ihrem Speicher. Die AOS führt die Ablaufsequenzen, die für die gewünschten Probentests erforderlich sind, nach Anweisung der Datenstation 68 aus.
  • Jede Ablaufsequenz erfordert Aufgaben von mehreren Analysatorkomponenten gemäß einem Plan. 13A – 13F sind Zeitablaufdiagramme für eine beispielhafte Ablaufsequenz zum Integrieren und Automatisieren von Hämatologie- und Immunologieprobenvorbereitung und -messung auf einer einzigen Einheit. Die oberste horizontale Achse, wie gesehen, stellt die Zeit in Sekunden dar, und die vertikale Achse ganz links listet Probenverarbeitungs- und Messkomponenten des Analysators 64 auf. Das Netz des Diagramms beschreibt die Aktivitäten der Analysatorkomponenten. Jede der Komponenten, die entlang der linken vertikalen Achse in 13A – 13F aufgelistet ist, führt einen speziellen Satz von Aufgaben in der Ablaufsequenz aus. Wenn eine Komponente ihre Aufgaben abgeschlossen hat, beginnt sie nach ihrer nächsten Anweisung zu suchen, ohne abzuwarten, dass nachfolgende Komponenten ihre Arbeit an der aktuellen Probe beenden.
  • Die AOS pflegt eine Sammlung von Zählungs-bezogenen Hardware-Sollwerten und Parametern. Ein Satz wird für jeden Zähltyp (CBC WBC, CBC OPLT usw.) bereitgestellt. Zusätzlich wird ein Satz für Diagnosezwecke bereitgestellt. Die AOS hat Platz für das Herunterladen von jedem dieser Sätze von der Datenstation 68. Zusätzlich kann jeder Satz unter Befehl entweder von der Datenstation 68 oder der Ablaufsequenz-Software aktiviert werden (d.h. verwendet werden, um die Hardware zu konfigurieren).
  • Zusätzlich zu den Zählungs-bezogenen Hardware-Sollwerten und Parametern pflegt die AOS eine Sammlung von Ereigniszählungsunabhängigen Parametern. Die AOS hat Platz für die Modifikation von jedem dieser Parameter von der Datenstation 68 her. Im Gegensatz zu den Zählungs-bezogenen Parametern lädt die AOS diese Werte direkt.
  • Um eine Ablaufsequenz zu beginnen, bestimmt die AOS 98, dass eine Probe zum Ansaugen bereit ist. Dies beruht entweder auf Bedieneraktivierung einer Drucktaste oder einem Befehl von einem Autoladermechanismus. Alle Informationen, die dem Analysator 64 über die Probe bekannt sind, werden zu der Datenstation 68 gesendet. Die Datenstation 68 antwortet mit Informationen über die erforderlichen Messungen, die an der Probe auszuführen sind.
  • Auf der Grundlage dieser Antwort und in Zusammenhang mit dem Zustand des Analysators 64 (d.h. Reagenzien, Inkubationen, Ablaufsequenz-Flags Ansaugen aktiviert/nicht aktiviert) bestimmt die AOS, ob mit Probenansaugung fortgefahren werden soll oder nicht. Egal ob sich eine Ansaugung ereignet oder nicht, informiert die AOS die Datenstation 68 über den Status der Probe.
  • Wenn eine Ablaufsequenz Inkubation erfordert, versieht die AOS die Ablaufsequenz mit der Fähigkeit, eine unbenutzte Stelle 132 in dem Probenverarbeitungsbereich 110 für eine Inkubation "zuzuweisen". Der Probentyp (und deshalb die geeignete Ablaufsequenz, um bei Abschluss der Inkubation ausgeführt zu werden) wird als Teil des Zuweisungsprozesses spezifiziert. Wenn die Inkubation gestartet wird, startet die AOS einen Inkubationszeitgeber, der mit einer bestimmten Inkubationsstelle 132 verbunden ist. Ein Probenidentifikator, ein Probentyp und eine Inkubationszeit sind ebenfalls mit jeder Inkubationsstelle 132 verbunden. Die AOS aktualisiert die aktiven Inkubationszeitgeber periodisch und erkennt die Beendigung von Inkubationsintervallen. Bei Beendigung setzt die AOS die Ausführung der Ablaufsequenz für diesen Test fort. Die AOS meldet die Gesamtinkubationszeit für jede inkubierte Probe und die Inkubationsstellennummer (Position) als Teil der Daten, die für jeden Test an jeder Probe gesammelt werden. Nachdem die inkubierte Probe verarbeitet worden ist und die Inkubationsstelle gereinigt und getrocknet worden ist, benachrichtig die Ablaufsequenz die AOS, dass die Stelle wieder für eine Zuweisung verfügbar ist.
  • Die AOS 98 hemmt die Ansaugung von Proben in den Inkubationsbereich 118, wenn die entsprechenden Inkubationstabletts 124 nicht vorhanden sind. Alle Änderungen an den Inkubationstabletts 124 oder Reagenzmodulen 122 werden an die Datenstation 68 weitergegeben. Immer, wenn eine Ansaugung nicht erlaubt wird, sendet die AOS eine beratende Nachricht an die Datenstation 68.
  • Nach Datenstationsanfrage liefert die AOS den aktuellen Inkubationsstatus für alle Stellen in dem Analysator 64. Diese Informationen umfassen Inkubationszeit, Stellenstatus (sauber/schmutzig) und Stellennutzungszahlen.
  • Der Ablaufsequenzinterpreter 100 ist in der Lage, mehrere Ablaufsequenzen gleichzeitig auszuführen. Der Ablaufsequenzinterpreter erlaubt, dass Ablaufsequenzen ihre Aktivitäten durch das Setzen und Testen von verschiedenen "Flags" koordinieren. Eine Ablaufsequenzlogik trifft Entscheidungen auf der Grundlage des Status von Flags, welche durch andere Ablaufsequenzen, die gleichzeitig laufen, gesetzt und aufgehoben werden.
  • Der Ablaufsequenzinterpreter unterstützt feste oder variable Probenereigniszählzeiten. Variable Ereigniszählzeiten können entweder durch Software- oder Hardware-Sollwerte eingestellt werden. Variable Ereigniszählzeiten werden vorzugsweise mit einem oberen Grenzwert bereitgestellt, wie durch die Ablaufsequenzen definiert.
  • Der Ablaufsequenzinterpreter ermöglicht, dass Ablaufsequenzen, Ereigniszählung und Datensammelintervalle initiieren. Daten, die während des Datensammelintervalls generiert werden, werden automatisch an die Datenstation 68 durch die AOS gesendet. Die an die Datenstation 68 gesendeten Daten umfassen vorzugsweise mindestens den Probenidentifikator, Hardware-Zähler, Listenmodusdaten und die Inkubationszeit (falls vorhanden). Zählungstypen umfassen vorzugsweise:
    • – CBC: vollständiges Blutbild einschließlich aller Hämatologiemessungen außer solchen, die Retikulozyten betreffen.
    • – RETICS
    • – SUBSET/PHÄNOTYP
  • Die AOS erlaubt dem Analysator 64, die Zählaktivität auf den Durchflusszellen/Wandlern 170, 174, 178 zu überlappen. Folglich maximiert Multiplexing und Pipelining (Fließbandbearbeitung) der Analysatoraktivität den Instrumentendurchsatz.
  • Der Analysator 64 kann an externe Behälter für Abfall (nicht gezeigt) oder Massenreagenzspeicher (193) angeschlossen sein. AOS überwacht Sensoren, die erfassen, wenn der Abfallbehälter voll wird oder ein Massenreagenzspeicherbehälter 193 leer wird. Ein weiteres Ansaugen von Proben wird durch die AOS 98 gehemmt, bis der Zustand in Ordnung gebracht worden ist.
  • Die AOS liest und modifiziert den nichtflüchtigen seriellen Zugriffsspeicher in jedem Antikörperreagenzmodul 122. Mindestens die folgenden Informationen werden in jedem Antikörperreagenzmodulspeicher gespeichert:
    • – Chargen-Nummer
    • – Verfallsdatum
    • – Testtyp (Panel-Nummer)
    • – Modul-Nummer
    • – Anzahl von Vertiefungen, die in Modul verwendet werden
    • – Nutzungen von Modul
    • – initialisiertes Flag
    • – Redundanz/Fehlersteuerung
  • Die Antikörperreagenzmodule 122 werden als Teil der normalen Analysatorinitialisierung gelesen. Danach wird jede Operation, die sich auf den Status des Moduls 122 auswirkt, in dem Speicher des Moduls aufgezeichnet.
  • Die AOS 98 kommuniziert mit den Motorprozessmodulen 520, welche für die Steuerung der Analysatorschrittmotoren 534 verantwortlich sind. Die AOS stellt die Motorprozessmodule 520 bei der Initialisierung zurück. Die AOS verfolgt die Position von jedem Motor in dem Analysator 64 und überprüft diese Informationen mit dem steuernden Motorprozessmodul 520. Positionsdiskrepanzen werden an die Datenstation 68 gemeldet.
  • Nach erfolgreichem Abschluss der Einschaltselbsttests nimmt der Analysator 64 AOS-Betriebs-Software entgegen, die von der Datenstation 68 heruntergeladen wurde. Bei Beendigung des Herunterladens der Software wird eine Startadresse von der Datenstation 68 geliefert, die die Adresse spezifiziert, bei der die Ausführung zu beginnen ist.
  • 13. Probenverarbeitungsbeispiele
  • A. Generelle Probenverarbeitung
  • Die folgenden Abschnitte besprechen ausführlich einen beispielhaften Betrieb des Zellanalysensystems 60. Ein weiteres Verständnis von Einzelheiten des Systems 60 kann durch Bezug auf diese Besprechung erreicht werden. Auch wenn spezielle Beispiele besprochen werden zum Zweck der Klarheit des Verständnisses, sollte daran gedacht werden, dass das System 60 andere Verfahrensschritte durchführen kann, ohne von dem beabsichtigten Umfang der Ansprüche abzuweichen.
  • Das automatisierte Probenverarbeitungsprotokoll des Zellanalysensystems 60 kann in drei Phasen betrachtet werden – Probenvorbereitung, Probenmessung und Probenanalyse. Das einzelne Protokoll für jede dieser Phasen ist Test-abhängig. Zum Beispiel unterscheiden sich Vorbereitung, Messung und Analyse für das WBC-Differential von denen für Blutplättchen, Retikulozyten, Lymphozytensubsets usw. Generelle Schritte sind jedoch für jede Phase gemeinsam.
  • In der ersten Phase, automatisierter Probenvorbereitung, saugt der Analysator 64 ein Volumen von der Probe an, transportiert die Probe zu designierten Schalen und mischt die Probe mit Verdünnungsmittel und/oder Reagenz bei Bedarf, um die Probe für die Messung vorzubereiten. Die Vorbereitung kann nur das Verdünnen der Probe einschließen, und das Verdünnungsmittel kann auch das Lysemittel zum Entfernen von RBCs sein. Manchmal, wie in dem Retikulozytentest, umfasst die Vorbereitungsphase zwei Schritte, einen ersten Schritt Vorverdünnung mit einem Verdünnungsmittel/Mantelreagenz, und einen zweiten Schritt Verdünnung durch Zugabe eines bekannten Volumens von Fluoreszenzfarbstoff.
  • In anderen Tests wie dem Lymphozytensubset-Test kann die Vorbereitungsphase viele Schritte einschließen und eine ausgedehnte Inkubation mit einem Reagenz erfordern. Wenn dies vorkommt, legt Ansaugsondenbaugruppe 148 ein Volumen von der Probe in einer Transferschale 140 ab und kehrt zu einer Position "bereit" zurück, um eine nachfolgende Patientenprobe anzusaugen. Die übrigen Schritte in dem Vorbereitungsprozess werden durch die Inkubationssondenbaugruppe 152 ausgeführt. Diese Schritte können weiter Verteilung der Probe in eine oder mehrere Portionen auf Inkubationsstellen 132, Zugabe eines spezifischen Mab-Reagenzes zu jeder Portion und Inkubation einschließen. Die meisten dieser Schritte, die durch Inkubationssonde 152 durchgeführt werden, können sich ereignen, während die Entlüftung/Ansaugsondenbaugruppe 148 mit der Verarbeitung von nachfolgenden Proben beschäftigt ist.
  • Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, schließt die Inkubationssondenbaugruppe 152 die Vorbereitungsphase ab, indem die inkubierte Probenportion mit einem Lysereagenz gemischt wird, um die roten Zellen zu entfernen, so dass die Probenportion bereit ist, an die optische Durchflusszelle für die Messung weitergeleitet zu werden.
  • Die zweite Phase, die Messphase, beginnt, wenn die Probenschalen eine Probe enthalten, die für die Messung bereit ist. Die Probe wird dann durch ein Rohrleitungsnetzwerk 182, das vom Boden der Probenschalen her angeschlossen ist, zu dem gewünschten Messwandler 170, 174, 178 geleitet. Nach Verlassen des Wandlers werden die Proben zu Abfallbehältern (nicht gezeigt) geschickt. Die Signale werden durch die geeigneten Detektoren für jeden Test erfasst, dann verstärkt, verarbeitet, digitalisiert und in einer Listenmodusdatei entsprechend dem einzelnen Test gespeichert.
  • Die dritte Phase, die Analysenphase, beginnt mit den Listenmodusdaten. Algorithmen werden auf die Daten angewendet, welche die verschiedenen Partikel oder Zelltypen in dem Merkmalsraum mit Achsen entsprechend der Detektoren abbilden, die für jeden Test geeignet sind, wodurch einzelne Populationscluster identifiziert werden und die Zellen innerhalb jedes Clusters gezählt werden. Die Endausgabe kann grafisch und/oder numerisch sein und kann ein Maß oder eine Funktion für Zellvolumen, Hämoglobingehalt, Populationstyp oder irgendein anderes Zellmerkmal sein. Die Ausgabe wird normalerweise sowohl in absoluten Ausdrücken als auch in Prozentanteilen quantifiziert. Zum Beispiel werden Populationen von Zell-Subtypen als Prozentanteile der Elternzellen angegeben sowie als Ereignisse pro Mikroliter Patientenblut gezählt. Immer, wenn inkubierte Proben analysiert werden, wird die Analyse der herkömmlichen Hämatologietests zuerst durchgeführt. Wenn die inkubierte Probenmessung abgeschlossen ist, findet die inkubierte Probenanalyse statt und die kombinierte Patientenanalyse ist vollständig.
  • Das Testprotokoll für die Probenvorbereitungs- und -messphase der Probenverarbeitung wird automatisch mittels Ablaufsequenzen implementiert, welche von der Komplexität her variieren. Bei Tests, die ausgedehnte Inkubation einschließen, integriert die Ablaufsequenz die Inkubations- und die Nicht-Inkubationsprüfung, so dass immer dann, wenn eine Probe inkubiert wird, der Analysator 64 mit nachfolgenden Tests weitermachen darf. Wenn die Inkubationsprobe zur Messung bereit ist, wird die Verarbeitung von weiteren Proben unterbrochen und die inkubierte Probe durchläuft Messung und Analyse.
  • B. Hämoglobin-Probenverarbeitung
  • Ein größeres Verständnis dieser Besprechung kann mit Bezug auf 5 und 12 erhalten werden. Zum Beispiel wird eine Portion Patientenprobe 166, etwa 18,75 Mikroliter Volumen, in die HGB-Schale 142 mittels der Ansaugsonde 156 abgeschieden, wo sie mit einem großen Volumen HGB-Lysereagenz mit einer resultierenden Verdünnung von etwa 200:1 gemischt wird. Nach etwa 20 Sekunden Lysezeit enthält die Schale nur verdünntes Hämoglobin, welches für die Messung durch Leitung 182 zu dem Hämoglobinwandler 178 mittels Peristaltikpumpe 246 überführt wird. Die optische Durchlässigkeit der Hämoglobinprobe in der Wandlerkammer 338 wird gemessen mittels der LED-Quelle 122 und Photodiode 324. Die Durchlässigkeit, darstellt durch T, wird verstärkt, verarbeitet, digitalisiert und gespeichert. Sie wird dann in der Analysenphase mittels eines Algorithmus A = log(1/T) in Absorption umgewandelt, welche weiter in Hämoglobinkonzentration, HGB, in Gramm pro Deziliter Patientenprobe mittels eines vorher bestimmten Kalibrators umgewandelt wird. Der Hämoglobintest ermöglicht in Kombination mit den RBC-Impedanztestergebnissen die Bestimmung der folgenden gemessenen und berechneten Parameter:
    HGB = (Hämoglobinkonzentration)
    MCH = HGB × 10/RBC (mittleres Zellhämoglobin)
    MCHC = HGB × 100/HCT (mittlere Zellhämoglobinkonzentration)
    worin RBC die rote Blutkörperchenzahl ist (RBCs pro μl) und HCT das Hämatokrit ist (Volumenanteil der Blutprobe in Prozent, der aus roten Blutkörperchen besteht), die beide in dem Impedanzwandler 174 gemessen werden.
  • C. RBC- und Blutplättchen-Probenverarbeitung
  • Der Leser sollte sich auf 4 und 5 beziehen. Eine Portion einer Patientenprobe 166, etwa 18,75 Mikroliter Volumen, wird in Schale 134 mittels Ansaugsonde 156 abgeschieden, wo sie mit einem Volumen Verdünnungsmittel/Mantelreagenz mit einer resultierenden Verdünnung von etwa 420:1 gemischt wird. Das Verdünnungsmittel/Mantelreagenz ist geeignet sowohl als ein Mantelträger in den Laminarströmungssystemen in Impedanzdurchflusszelle 174 und optischer Durchflusszelle 170 als auch als ein Probenverdünnungsmittel, so dass die RBCs und Blutplättchen als Einzelfaden in jeden Wandler wandern. Die Formulierung umfasst eine operflächenaktive Substanz, welche eine unzweideutige Unterscheidung kleiner roter Zellen von großen Blutplättchen ermöglicht.
  • Nachdem Mischen in der RBC-Schale 134 abgeschlossen ist, wird die verdünnte Probe zu Impedanzwandler 174 (10A und 10B) durch Pumpe 220, Ventile 210 und 212 und Spritzenbaugruppe 204, 224 überführt. Blutplättchen werden in Impedanzwandler 174 klassiert und gezählt (17). Blutplättchen werden außerdem zu dem optischen Wandler 170 überführt und dort gezählt (16). Wegen dem kleineren beleuchteten Volumen und dem geringeren Rauschen in dem optischen Wandler besitzt die optische Blutplättchenzählung eine überragende Leistung. Die Blutplättchenzählung von dem optischen Wandler 170 wird als ein Patientendatum angezeigt, wobei die Impedanzzählung als ein Diagnosewerkzeug zur Überwachung der Instrumentenleistung verwendet wird.
  • Der Impedanzwandler 174 wird zum Anzeigen der Blutplättchengrößenparameter verwendet. Ein unterer Schwellwert wird gesetzt, welcher Blutplättchen von Rauschen unterscheidet, und ein oberer Schwellwert wird gesetzt, welcher Blutplättchen von RBCs unterscheidet. Impulsamplituden werden gefiltert, verstärkt, digitalisiert und als Listenmodusereignisse gespeichert. Auf diese Daten werden Algorithmen angewendet zur Berechnung der folgenden Blutplättchengrößenparameter und Anzeigen des Blutplättchenhistogramms:
    Blutplättchenzahl (PLT)
    mittleres Blutplättchenvolumen (MPV)
    Blutplättchenverteilungsbreite (PWD)
    Thrombokrit (PCT = MPV × PLT)
    Blutplättchenkonzentration (verwendet für Instrumentendiagnosezwecke)
  • Die verdünnte Probe aus der ABC-Schale 134 wird außerdem zu dem optischen Wandler durch Ventile 236 und 238, Pumpe 232 und Spritze 240, 206 überführt. Die Blutplättchen werden im zweidimensionalen Merkmalsraum unter Verwendung der optischen Parameter PSS (polarisierte Seitenstreuung) und IAS (Zwischenwinkelstreuung) bestimmt. Die Impulse von Detektor 384 und 402 werden verarbeitet, digitalisiert und in Listenmodusdateien für die Verarbeitung durch Algorithmen gespeichert. Die Probenströmungsgeschwindigkeit für die Messung von Blutplättchen ist etwa 2,5 Mikroliter pro Sekunde, und die Zählzeit durch die Durchflusszelle ist etwa 6 Sekunden für normale Patientenproben. Diese Zählzeit wird automatisch für geringzahlige Proben ausgedehnt, um die Zählungsstatistik zu verbessern. Die Zahl, die von dem optischen Wandler angezeigt wird, ist die Blutplättchenkonzentration (PLT).
  • Der Impedanzwandler 174 wird außerdem verwendet zur Bestimmung von RBC-Größen- und Zählparametern. Der obere Schwellwert, der zum Erfassen von Blutplättchen in dem Impedanzwandler 174 verwendet wird, ist auch der untere Schwellwert für die RBC-Zahl. Die Impulse über diesem Schwellwert werden verarbeitet, digitalisiert und in der RBC-Listenmodusdatei gespeichert. Algorithmen werden angewendet zur Berechnung der folgenden RBC-Parameter und Anzeigen des RBC-Histogramms:
    rote Blutkörperchenkonzentration (RBC)
    mittleres Zellvolumen (MCV)
    rote Zellverteilungsbreite (RDW)
    Hämatokrit (HCT)
  • D. WBC-Differential-Probenverarbeitung
  • Bezugsnehmend auf 4 und 5 wird eine Portion Patientenprobe 166, ungefähr 37,5 Mikroliter, mittels einer Probenansaugsonde 156 in WBC-Schale 138 abgeschiedene, welche etwa 850 Mikroliter WBC-Lysemittel enthält.
  • Die Lyse ist ein Ein-Reagenz/Ein-Schritt-Prozess, der Mehrzweckziele erreicht. Sie ist sanft genug, um die Morphologie von fragilen weißen Zellen zu erhalten, und lysiert gleichzeitig wirksam im Wesentlichen alle der roten Zellen. Diese beiden Ziele werden selbst in hämoglobinophatischen Proben erreicht, wo es erforderlich sein kann, dass die Lysezeit über 11 Sekunden hinaus ausgedehnt wird. Zusätzlich enthält in der bevorzugten Ausführungsform das Lysemittel eine kleine Konzentration eines vitalen Kernfarbstoffes, welcher alle kernhaltigen roten Blutkörperchen (NRBCs) wirksam markiert, die in dem peripheren Blut vorhanden sein können. Die Lysechemie ist so vorherbestimmt worden, dass der Brechungsindex dem des Mantels im Wesentlichen auf weniger als etwa 0,1% entspricht.
  • Die Mischung von Lysemittel und Probe bleibt normalerweise in Schale 138 für weniger als etwa 11 Sekunden, wo sie lysiert und bei einer erhöhten Temperatur gerührt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Lysetemperatur auf 42°C ± 3°C geregelt. An dieser Stelle wird der Inhalt von Schale 138 direkt in die optische Durchflusszelle 170 geleitet.
  • Bezugnehmend auf 19 und 20 beginnt der Messvorgang, wenn der Zellstrom durch die optische Durchflusszelle 170 hindurchgelangt, wobei er durch die Zugabe von Lysemittel verdünnt worden ist, so dass die Zellen durch die Laserbeleuchtung als Einzelfaden hindurchgehen, in einem laminar fließenden Probenstrom, der von Verdünnungsmittel/Mantel 304 umgeben ist (veranschaulicht in 16). Das beleuchtete Volumen ist in den zwei Dimensionen senkrecht zu der Strömungsachse durch den hydrodynamisch fokussierten Zellstrom begrenzt und in einer Dimension parallel zu der Strömungsachse durch die vertikale Strahltailte des Laserstrahls, die etwa 17 Mikron ist. Die Probenströmungsgeschwindigkeit während dieses Tests ist etwa 2,5 Mikroliter pro Sekunde, und das entsprechende beleuchtete Messvolumen der WBC- und NRBC-Zellen entspricht einem elliptischen Zylinder mit Abmessungen von etwa 80μ × 5μ × 17μ. Die Abmessung von ungefähr 17μ wird entlang der Achse des Zylinders gemessen.
  • Die Anwesenheit einer Zelle in der beleuchteten Region wird nachgewiesen durch Photodioden 382 und 384, Photomultiplier 404 und eine einzigartige Dreifachschwellwert-Triggerschaltung, die in drei Merkmalsraumdimensionen arbeitet. Das heißt, sie verarbeitet die drei Parameter ALL (axialer Lichtverlust), IAS (Zwischenwinkelstreuung) und FL3 (rote Fluoreszenz) und qualifiziert Signale zur Digitalisierung unter Verwendung von UND/ODER-Logik. Ein qualifiziertes Signal muss größer sein als der IAS-Schwellwert, während es gleichzeitig größer sein muss als entweder der ALL-Schwellwert oder der FL3-Schwellwert. Die Kombination von dieser einzigartig triggernden Schaltung und der Lysemitteleigenschaften (welche ein ausgeglichenes Fixierungsmittel umfassen, was es ermöglicht, dass die NRBC-Kerne schnell angefärbt werden) zählt klar und nicht zweideutig NRBCs und schließt diese von der WBC-Differential-Zellzählung aus. Dieser Test zählt WBC-Populationen und NRBCs ohne die übliche Störung durch Hintergrundsignale, sowohl fluoreszente als auch nicht fluoreszente, so wie die, die von DNA-Fragmenten, RBC-Stroma und Blutplättchen emittiert werden.
  • Wenn Zellen, die die Dreifachschwellwertkriterien erfüllen, durch das beleuchtete Volumen hindurchgelangen, werden Impulse erzeugt bei Detektoren 382, 384, 400, 402 und 404. Die Amplituden dieser Impulse werden gefiltert, verstärkt, digitalisiert und im Listenmodus in dem entsprechenden fünfdimensionalen Merkmalsraum von ALL, IAS, FL3 PSS (polarisierte Seitenstreuung) und DSS (depolarisierte Seitenstreuung) gespeichert. Die normale Zählzeit durch Durchflusszelle 170 beträgt etwa 10 Sekunden. Bei der beschriebenen Strömungsgeschwindigkeit und dem beschriebenen Verdünnungsverhältnis und mit einer normalen Patienten-WBC-Zahl von etwa 7000 Zellen pro Mikroliter Blutvolumen wäre die resultierende Ereigniszählrate etwa 5000. In geringzahligen Proben kann diese Zählzeit automatisch ausgedehnt werden, um die statistische Genauigkeit der Messung zu verbessern. Bei Beendigung der Messzeit wird der Probenstrom zum Abfall geleitet und Sonde 156 wird gereinigt und getrocknet und darauf vorbereitet, eine nachfolgende Probe zu verarbeiten.
  • Algorithmen werden auf die fünf Parameter angewendet, die in den Listenmodusdaten (ALL, IAS, FL3, PSS und DSS) quantifiziert sind, und die folgenden Zelltypen werden innerhalb von weniger als etwa 30 Sekunden Verarbeitungszeit quantifiziert und/oder markiert: weiße Zellkonzentration (WBC), Neutrophilenkonzentration (NEU) und prozentualer Anteil (% N), Lymphozytenkonzentration (LYMPH) und prozentualer Anteil (% L), Monozytenkonzentration (MONO) und prozentualer Anteil (% M), Eosinophilenkonzentration (EOS) und prozentualer Anteil (% E), Basophilenkonzentration (BASO) und prozentualer Anteil (% B), Normoblasten (NRBC) und prozentualer Anteil von WBC (% NRBC), Blastenkonzentration (BLST), reife Granulozytenkonzentration (IG), Variant-Lymph-Konzentration (VARL) und Bandkonzentration (BAND).
  • E. Lymphozytensubset-Probenverarbeitung
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Probenverarbeitung für Lymphozytensubset-Tests die folgenden Schritte, wie in 3, 4 und 5 veranschaulicht. Ansaugsonde 156 saugt zuerst eine Menge Vollblut an, die für den Subset-Test ausreichend ist, und scheidet die Menge in Transferschale 140 ab. Das erforderliche Volumen Blut ist etwa 50 N Mikroliter, wobei N die Zahl von Mab(monoklonalen Antikörper)-Paaren ist, die für den Test erforderlich sind. In dem Standardpanel wird für N erwartet, 5 zu sein, und folglich ist das erforderliche Volumen für die Abgabe in Schale 140 etwa 250 Mikroliter. An dieser Stelle wird die Ansaugsonde 156 gereinigt und kehrt dann zu Probenstation 166 zurück, um nachfolgende Proben zu verarbeiten, während die Inkubationssondenbaugruppe 152 die Subset-Probenverarbeitung fortsetzt.
  • Die Inkubationssonde 160 saugt das Blut aus der Transferschale 140 und scheidet etwa 40 Mikroliter in jeder der 5 aufeinanderfolgenden Schalen 132 in Inkubationstablett 124 ab. Dann wird Inkubationssonde 160 gereinigt, bevor sie zu dem Reagenzmodul 122 verfahren wird, etwa 20 Mikroliter des ersten Mab-Paares 128 entnimmt und in die erste entsprechende Inkubationsschale 132 abgibt. Nachdem Sonde 160 wieder gereinigt ist, kehrt sie zu dem Reagenzmodul 122 zurück und überführt von dem zweiten Mab-Paar 128 weitere etwa 20 Mikroliter Reagenz in die zweite entsprechende Inkubationsschale 132. Dieser Vorgang wird fortgesetzt, bis jede der erforderlichen Inkubationsschalen eine Mischung von Blut und Mab für die Inkubation enthält.
  • An dieser Stelle wird Inkubationssonde 160 gereinigt und getrocknet und wartet, dass die erste Mab/Blutprobeninkubation abgeschlossen ist. Alle Aktivitäten der Probenansaugbaugruppe 148 werden dann ausgesetzt, bis die inkubierten Subsetproben wie folgt verarbeitet sind. Inkubationssonde 160 scheidet etwa 30 Mikroliter von dem ersten inkubierten Subset 132 in die WBC-Schale 138 ab, welche etwa 670 Mikroliter WBC-Lysier-Reagenz enthält. Nachdem die inkubierte Probe bei etwa 42°C ±3°C für etwa 11 Sekunden lysiert und verwirbelt wird, ist das erste Mab/Blut-Paar zur Messung bereit, woraufhin der Inhalt von Schale 138 direkt zur optischen Durchflusszelle 170 geleitet wird.
  • Der Messvorgang beginnt, wenn der Zellstrom das Laserbeleuchtete Volumen in Durchflusszelle 170 kreuzt. Daten werden von optischen Detektoren 382, 384, 400 und 402 über die Systemelektronik und Analysator-Software gesammelt und im Listenmodus für jede Mab/Blut-Reagenz-Mischung gespeichert. Die Probe ist verdünnt worden, so dass die Zellen innerhalb der Strömung durch die beleuchtete Zone des Lasers als Einzelfaden hindurchgehen. Jede Zelle wird durch die Anwesenheit von Impulsen nachgewiesen, die vier Merkmale anzeigen – ALL (Axiallichtverlust), IAS (Zwischenwinkelstreuung), FL1 (Grünfluoreszenz) und FL2 (Orangefluoreszenz). Die Amplitude von jedem Impuls wird verstärkt, digitalisiert und im Listenmodus auf der entsprechenden Merkmalsraumachse gespeichert.
  • Die Analyse beginnt mit der Anwendung von Algorithmen auf die gespeicherten vierdimensionalen Daten, von denen Subset-Prozentanteile berechnet werden. Nachdem die Zählzeit für die erste Subset-Messung abgeschlossen ist, wird Sonde 160 gereinigt und getrocknet, bevor sie zu dem nächsten inkubierten Subset 132 zurückkehrt und den Vorgang wiederholt, bis alle Subsets gemessen und analysiert worden sind. Die endgültige Analyse, die sowohl zu Prozentanteilen als auch zu absoluten Zahlen pro Mikroliter Patientenblutvolumen führt, ist eine Zusammensetzung aus allen der oben beschriebenen Subset-Messungen und der WBC-Differential-Hämatologiemessung.
  • Die normale Zählzeit durch Durchflusszelle 170 ist etwa 10 Sekunden. In bestimmten geringzahligen Proben wird diese Zählzeit automatisch ausgedehnt werden, um die Zählstatistik der Messung zu verbessern.
  • Nachdem der Probenmessvorgang abgeschlossen ist, wird Probenansaugsonde 148 reaktiviert und ist bereit, die Verarbeitung von irgendwelchen nachfolgenden Proben fortzusetzen.
  • Die offenbarten automatisierten Probenvorbereitungsmerkmale bieten Platz für zahlreiche Antikörperpanele zur Verwendung in einer Vielzahl von Immunologie- und Phänotypisierungstests. Für Lymphozytensubsets umfasst jedes Panel vorzugsweise fünf 2-Farben-Antikörpersets. Vorzugsweise umfasst jedes Antikörperset einen Antikörper (Mab), der mit FITC (Fluoresceinisothyocyanat) und dergleichen markiert ist, und einen zweiten Mab, der mit PE (Phycoerythrin) und dergleichen markiert ist. Die Antikörper werden durch Clusterbezeichnungs(CD)-Nummern unterschieden. Als Veranschaulichung durch Beispiel können mindestens die folgenden Lymphozytensubset-Mabs in einem Panel eingeschlossen sein.
  • Figure 01140001
  • Ein reduziertes Panel wird ebenfalls vorgeschlagen, welches zur Überwachung von CD4-positiven Zellen bei HIV-Patienten verwendet werden könnte. Mindestens die folgenden Mabs können in diesem Panel eingeschlossen sein:
    Mab-Kombination ausgezählter Zelltyp
    CD45/CD14+CD13 Lymphozyten
    CD3/CD4 T-Helfer-Subset
  • In bestimmten anderen Phänotypisierungs-Mab-Tests könnte die Zahl von Mab-Paaren, N, 1 sein und daher wäre das erforderliche Probenvolumen etwa 50 Mikroliter. Jede Kombination von Mabs kann verwendet werden. Für einige Tests könnte das Volumen des erforderlichen Mab-Reagenzes auf einer Schätzung der WBC-Patientenzahl beruhen, die aus den Hämatologiemessungen erhalten wird, die an dieser Probe vorgenommen wurden. Zum Beispiel kann es in extremen Fällen von Leukozytosen oder Leukopenie notwendig sein, das Verhältnis von Mab-Antikörper zu Patientenblut so einzustellen, dass eine geeignete Antikörperbindung sichergestellt ist oder dass ein Hintergrundsignal von überschüssigem freiem Antikörper verhindert wird. Da die Hämatologiemessungen keine Inkubation benötigen, begeben sie sich durch den Durchflusszellen-Wandler, lange bevor die Lymphozytensubset-Probenvorbereitungen abgeschlossen sind. Die Datenstation kann deshalb eine geschätzte Patientenzahl aus den Hämatologieergebnissen für diese Probe berechnen, um es dem Analysator 64 zu ermöglichen, die Mab-Blut-Verhältnisse wie benötigt einzustellen, um diese Tests auszuführen.
  • F. Retikulozyten-Probenverarbeitung
  • Bezugnehmend auf 4a und 5 entnimmt zur Verarbeitung von Retikulozytentests die Ansaugsonde 156, nachdem die Ansaugsonde 156 RBC- und Blutplättchenverdünnungen in der RBC-Schale 134 vollständig gemischt hat, etwa 200 Mikroliter Blut, das auf etwa 420:1 verdünnt worden ist, und legt es in der Retic-Schale 136 ab. Die Retic-Schale 136 enthält etwa 600 Mikroliter Retic-Reagenz, was das resultierende Verdünnungsverhältnis von etwa 1680:1 ergibt.
  • Das Reagenz der bevorzugten Ausführungsform enthält einen Fluoreszenzfarbstoff mit einem Anregungsmaximum nahe der 488-nm-Argonlaserwellenlänge und einer hohen Quantenausbeute. Das bevorzugte Reagenz färbt sowohl DNA als auch RNA schnell an, und auf eine solche Weise, dass ein eindimensionales Fluoreszenzhistogramm die normale WBC-Konfusion vermeidet. Es ist so empfindlich, dass der Analysator 64 zwei Fragmente von RNA in einer Zelle erfassen wird. Das Verfahren ist linear bis zu etwa 90% Retikulozytenzählungen.
  • Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum (etwa 25 Sekunden mit dem zuvor beschriebenen bevorzugten Reagenz) oder sofort nach dem Mischen wird die Mischung von verdünntem Blut und Retic-Reagenz zur optischer Durchflusszelle 170 transportiert. Dieser Transportvorgang kann zeitlich geplant werden, damit genügend Inkubationszeit zum Anfärben der Retikulozyten bereitgestellt wird, nämlich 25 Sekunden, falls separate Inkubationsvorgänge nicht notwendig sind.
  • Wenn die Population, welche ausgereifte rote Blutkörperchen und Retikulozyten enthält, durch das laserbeleuchtete Volumen in Durchflusszelle 170 hindurchgeht, werden die Streuungs- und Fluoreszenzeigenschaften der Probe gemessen unter Verwendung von Photodiode 384 und Photomultiplier 400, welcher für FL1 mit einem grünen Fluoreszenzfilter 430 ausgerüstet ist. Die Amplituden der Impulse werden gefiltert, verstärkt, digitalisiert und als Listenmodusdaten in dem zweidimensionalen Merkmalsraum von IAS und FL1 gespeichert. Die Messzeit durch die Durchflusszelle ist etwa 8 Sekunden bei einer Probenströmungsgeschwindigkeit von etwa 2 Mikroliter pro Sekunde. Bei einem Patienten-RBC von etwa 5.000.000 pro Mikroliter Blut misst eine bevorzugte Ausführungsform ungefähr 50.000 Ereignisse, was 500 Retikulozytenereignissen bei einem Patienten mit einer 1%igen Retikulozytenkonzentration entspricht.
  • Ein Algorithmus wird angewendet, welcher WBCs und Blutplättchen ausschließt und Retikulozyten mittels Fluoreszenz-positiven Ereignissen zählt, die dem negativen RBC-Histogramm überlagert sind. Dieses Verfahren kennzeichnet auch einen Retikulozytenreifeindex, RMI, mittels Fluoreszenzintensität. Die Zeit, um eine Probe zu verarbeiten, was sowohl die Standardhämatologietests als auch Retikulozyten einschließt, beträgt in der bevorzugten Ausführungsform etwa 45 Sekunden. Die folgenden Parameter werden für den Retikulozytentest angezeigt: Retikulozytenkonzentration (RETC), prozentualer Retikulozytenanteil (% R von RBC) und Retikulozytenreifeindex (RMI).
  • Ein anderes Verfahren, welches ausgedehnte Inkubation des Kernfarbstoffes verwendet, kann ebenfalls verwendet werden, um Retikulozyten zu messen, indem sowohl Inkubationssonde 160 als auch Ansaugsonde 156 verwendet werden in einem Verfahren ähnlich dem, das in Lymphozytensubset-Verarbeitung, wie oben beschrieben, verwendet wird.
  • Zum Zweck der Veranschaulichung werden mehrere Verwendungen einer hier besprochenen Ausführungsform dargestellt. Die folgende Besprechung wird nur für beispielhafte Zwecke bereitgestellt und diese Besprechung ist nicht erschöpfend. Ausdrücklicher besprochen werden unten Arten der Verwendung einer offenbarten Ausführungsform, um eine integrierte Blutzellanalyse, eine Hämoglobinanalyse, eine rote Blutkörperchen- und Plättchenanalyse, eine weiße Blutkörperchendifferentialanalyse, eine Retikulozytenanalyse, eine Lymphozyten-Immunphänotypisierungsanalyse, Messung eines T-Helfer-Sets, Messung eines T-Suppressor-Subsets und Messung von T- und B-Lymphozyten durchzuführen. Geeignete Verweise werden auf Software vorgenommen, welche auf einem RAM, einem ROM, einem EPROM, einem SRAM oder einer anderen geeigneten Speichervorrichtung vorhanden sein kann, die beim Durchführen der beschriebenen Schritte verwendet wird. Quellcode für die Software wird in Anhang A und Anhang B präsentiert, welche unmittelbar vor den Ansprüchen erscheinen. Die Schrittnummern, auf die in den Beispielen verwiesen wird, werden als "SCHRITT"-Nummern wiedergegeben, die sich in geeigneten Zeilen in dem Quellcode der Software befinden. Abschnitte der Software können schneller verstanden werden, wenn sie mit Bezug auf 44A – 44F und 63A – 63F kombiniert werden.
  • Beispiel 1 – Integrierte Blutzellanalyse
  • Eine Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um Zellanalysen von Vollblutproben durchzuführen. Ein Beispiel einer solchen Analysenprozedur folgt. Die Schritte von der Probenverarbeitung werden durch Software wie die, die in Anhang A präsentiert wird, gesteuert. Die Schritte von der Datenanalyse werden durch Software wie die, die in Anhang B präsentiert wird, gesteuert.
    • 1 – Ein Probenröhrchen mit einer Vollblutprobe wird von dem Bediener in den Probenröhrchenhalter gesetzt.
    • 2 – Die Entlüftungsbaugruppe senkt sich und durchsticht die Probenröhrchenkappe (Schritt A1).
    • 3 – Die Ansaugsonde wird in das Probenröhrchen abgesenkt (Schritt A2).
    • 4 – 75 μl Blut werden in die Ansaugsonde gesaugt (Schritt A3).
    • 5 – Die Ansaugsonde wird aus dem Röhrchen herausgehoben, wobei sie gereinigt wird, während sie nach oben steigt (Schritt A4).
    • 6 – Eine Prüfung wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Ansaugsonde vollständig herausgehoben ist (Schritt A5).
    • 7 – Die Ansaugsonde bewegt sich zu einem Punkt direkt über der HGB-Schale (Schritt A6).
    • 8 – Die Entlüftungsbaugruppe steigt nach oben, um aus der Probenröhrchenkappe herausgezogen zu werden (Beendigung von Schritt A7).
    • 9 – Die Ansaugsonde wird etwas in Richtung der HGB-Schale abgesenkt (Schritt A8).
    • 10 – 18,75 μl Blut werden in die HGB-Schale für die HGB-Analyse abgeschieden (Schritt A9).
    • 11 – Die Ansaugsonde bewegt sich zu einer Position direkt über der WBC-Schale (Schritt A10).
    • 12 – 18,75 μl Blut werden in die WBC-Schale für die WBC-Analyse abgeschieden (Schritt A11).
    • 13 – Die Ansaugsonde bewegt sich zu einer Position direkt über der RBC-Schale (Schritt A12).
    • 14 – Die Ansaugsonde wird in die RBC-Schale abgesenkt (Schritt A13).
    • 15 – Ein Ventil, das Lösungsmittel zu der Ansaugsonde liefert, wird geöffnet (Schritt A14).
    • 16 – 2000 μl Verdünnungsmittel werden von der Ansaugsonde, zusammen mit den restlichen 18,75 μl Blut, in die RBC-Schale dispensiert für die RBC- und Blutplättchenanalyse (Schritt A15). 17 – 1000 μl der Blut/Verdünnungsmittel-Mischung werden aus der RBC-Schale in die Ansaugsonde angesaugt (Schritt A16).
    • 18 – Die Ansaugsonde wird herausgehoben und gereinigt (Schritt A17).
    • 19 – Die Ansaugsonde wird zu einer Position direkt über der RETIC-Schale verfahren (Schritt A18).
    • 20 – Die Ansaugsonde wird etwas in Richtung der RETIC-Schale abgesenkt (Schritt A19).
    • 21 – 200 μl der Blut/Verdünnungsmittel-Mischung werden von der Ansaugsonde in die RETIC-Schale für die Retikulozytenanalyse dispensiert (Schritt 20). Während 600 μl Retic-Reagenz gleichzeitig in die RETIC-Schale von einem festen Anschluss abgeschieden werden.
    • 22 – Die Entlüftungsbaugruppe kehrt zu ihrer Ausgangsposition zurück (Schritt A21).
    • 23 – Die Ansaugsonde wird zu der Waschschale verfahren (Schritt A22).
    • 24 – Die Ansaugsonde wird in die Waschschale abgesenkt (Schritt A23).
    • 25 – Die Ansaugsonde wird gespült (Schritt A24).
    • 26 – Die Ansaugsonde wird herausgehoben (Schritt A25).
    • 27 – Die Ansaugsonde kehrt zu ihrer Ausgangsposition zurück (Schritt A26)
    • 28 – Das Instrument führt die Probenverarbeitung und die Datenanalyse für die HGB-, WBC-, RBC-, Blutplättchen- und Retikulozyten-Analyse aus, wie ausführlich in den folgenden Beispielen beschrieben wird (oberste Algorithmusdatei mcCBCAlgorithm.cc).
    • 29 – Die Ergebnisse der Analysen werden gespeichert und so wie die in 45A bis 45F veranschaulichten Ergebnisse angezeigt.
  • Beispiel 2 – Hämoglobin(HGB)-Analyse
  • Eine Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um Hämoglobinanalysen von Vollblutproben durchzuführen. Ein Beispiel für eine solche Analysenprozedur folgt. Die Schritte von der Probenverarbeitung werden durch Software wie die, die in Anhang A präsentiert wird, gesteuert. Die Schritte von der Datenanalyse werden durch Software wie die, die in Anhang B präsentiert wird, gesteuert.
    • 1 – 1590 μl HGB-Lysemittel werden in die HGB-Schale dispensiert (Schritt H1).
    • 2 – 18,75 μl Vollblut werden in die HGB-Schale von der Ansaugsonde abgeschieden, als Teil der Sequenz von Beispiel 1 (Schritt A9).
    • 3 – 4273 μl HGB-Lysemittel werden in die HGB-Schale dispensiert auf eine Art und Weise, die Fluidvermischung verursacht (Schritt H2).
    • 4 – Etwa 7 Sekunden werden verstreichen gelassen, um Zelllyse zu ermöglichen.
    • 5 – Die lysierte HGB-Probe wird durch die Instrumentenverrohrung bewegt, um den Transfer zu dem HGB-Wandler zu fördern (Schritt H3).
    • 6 – Die lysierte HGB-Probe wird in den HGB-Wandler gepumpt (Schritt H4).
    • 7 – Die HGB-Schale wird abgelassen und gespült (Schritt H5).
    • 8 – Die HGB-Schale wird mit HGB-Lysemittel gefüllt, um die Referenzprobe zu bilden (Schritt H6).
    • 9 – Die Lichtdurchlässigkeit in dem HGB-Wandler wird abgelesen (Schritt H7). Der Wandler enthält die lysierte HGB-Probe, und dieser Schritt ereignet sich etwa 15-20 Sekunden nach dem Mischen der Blutprobe und des Lysemittels.
    • 10 – Die Referenzprobe wird durch die Instrumentenverrohrung bewegt, um den Transfer zu dem HGB-Wandler zu fördern (Schritt H8).
    • 11 – Die Referenzprobe wird in den HGB-Wandler gedrängt (Schritt H9).
    • 12 – Die Spritzenpumpe, die verwendet wird, um HGB-Lysemittel abzugeben, wird zurückgesetzt (Schritt H10).
    • 13 – Die HGB-Schale wird abgelassen (Schritt H11).
    • 14 – Rückstand wird aus der HGB-Lysemittelspritzenpumpe entfernt (Schritt H12).
    • 15 – Die optische Durchlässigkeit der Referenzprobe in dem HGB-Wandler wird abgelesen (Schritt H13).
    • 16 – Die Daten von der Probe und der Referenzprobe werden in einer Datei gespeichert für die nachfolgende Analyse, die in den Schritten 17-22 beschrieben wird und durch die Algorithmusdatei mcRBCAlgorithm.cc ausgeführt wird.
    • 17 – Analysenvariablen und Flags werden initialisiert (Subroutinen ParamDefaults und ClassFlagDefaults).
    • 18 – Die HGB-Daten werden aus einer Datendatei zu lokalem Speicher übertragen (Subroutine GetHGBData).
    • 19 – Hämoglobinkonzentration wird berechnet als HGB = log (Referenzmessung/Probenmessung) × 0,64 × (Kalibierfaktoren) (Subroutine DoHGBAnalysis).
    • 20 -Zell-HGB-Parameter berechnen (Subroutine DoHGBAnalysis) unter Verwendung der Parameter RBC (rote Blutkörperchenkonzentration) und HCT (Hämatokrit), die durch RBC-Analyse bestimmt wurden, die später beschrieben wird: mittleres Zellhämoglobin MCH = HGB/RBC × (Einheitenumwandlungsfaktor)mittlere Zellhämoglobinkonzentration MCHC = HGB × (Einheitenumwandlungsfaktor)/HCT.
    • 21 – HGB-Flags setzen, falls irgendwelche Ergebnisse anomal oder suspekt sind (Subroutine SetHgbFlags).
    • 22 – Analysenergebnisse und Flags zurückgeben zum Speichern (Subroutine SendNumResults und SendAlertResults) und auf Anzeigengerät anzeigen.
  • Beispiel 3: Rote Blutkörperchen(RBC)- und Blutplättchen (PLT)-Analyse
  • 17,5 Mikroliter einer Blutprobe werden schnell mit 7400 Mikroliter des Reagenzes der vorliegenden Erfindung gemischt (1:420 Verdünnung), und 0,5 Mikroliter der verdünnten Probe werden durch einen hydrodynamisch fokussierten (ummantelten) Impedanzwandler 174 12 Sekunden lang für rote Blutkörperchenzählungen und Volumenmessung sowie für Blutplättchenzählungen hindurchgelassen. Zusätzlich werden 2,5 Mikroliter der verdünnten Probe durch eine ummantelte optische Durchflusszelle 170 6 Sekunden lang hindurchgelassen für genaue und exakte Blutplättchenzählungen. Rauschsignale von Fragmenten von fragilen anomalen Zellen werden aus den optischen Blutplättchenzählungen ausgeschlossen, indem die Blutplättchenpopulation genau durch einen Blutplättchenalgorithmus eingeklammert wird.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde verwendet, um rote Blutkörperchen(RBC)- und Blutplättchen(PLT)-Analysen von Vollblutproben, wie oben beschrieben, durchzuführen. Ein Beispiel für eine solche Analysenprozedur folgt. Die Schritte von der Probenverarbeitung werden durch Software wie die, die in Anhang A präsentiert wird, gesteuert. Die Schritte von der Datenanalyse werden durch Software wie die, die in Anhang B präsentiert wird, gesteuert.
    • 1 – Die RBC-Schale wird abgelassen (Schritt RBC1).
    • 2 – 2,2 ml RBC-Verdünnungsmittel werden mit einer RBC-Verdünnungsmittelspritze in die RBC-Schale dispensiert (Schritt RBC2).
    • 3 – 18,75μl Vollblut und 2000 μl RBC-Verdünnungsmittel werden über die Ansaugsonde in die RBC-Schale dispensiert, wie in Beispiel 1 beschrieben (Schritt A15).
    • 4 – 3,2 ml Verdünnungsmittel werden in die RBC-Schale mit der RBC-Verdünnungsmittelspritze dispensiert (Schritt RBC3).
    • 5 – Die Blut- und Verdünnungsmittel-Mischung wird in die Nähe des Impedanzwandlers mit der RBC-Peristaltikpumpe geschoben (Schritt RBC4).
    • 6 – Die RBC-Lieferspritze wird gefüllt (Schritt RBC5).
    • 7 – Lösungsmittelfluss wird initiiert durch den optischen Wandler (Schritt RBC6).
    • 8 – Die Blut- und Verdünnungsmittel-Mischung wird in die Nähe des optischen Wandlers mit der optischen Peristaltikpumpe geschoben (Schritt RBC7).
    • 9 – Die Blut- und Verdünnungsmittel-Mischung wird in Richtung des Impedanzwandlers mit der RBC-Lieferspritze vorwärtsgebracht (Schritt RBC8).
    • 10 – Die Blut- und Verdünnungsmittel-Mischung wird mit etwa 52 μl/s mit der optischen Lieferspritze durch den optischen Wandler geschickt (Schritt RBC9).
    • 11 – Durchfluss durch den optischen Wandler wird auf etwa 2,5 μl/s verringert (Schritt RBC10).
    • 12 – Die Blut- und Verdünnungsmittel-Mischung wird mit etwa 0,5 μl/s mit der RBC-Lieferspritze durch den Impedanzwandler geschickt (Schritt RBC11).
    • 13 – Daten werden von dem optischen Wandler gesammelt (Schritt RBC12). Ein Hardware-Gatter wird angewendet, um nur Daten zu sammeln, die Blutplättchen entsprechen.
    • 14 – Daten werden von dem Impedanzwandler gesammelt (Schritt RBC13). Ein Hardware-Gatter wird verwendet, um Daten, die sich auf Blutplättchen beziehen (< 35 fl), und Daten, die sich auf rote Blutkörperchen beziehen (< 30 fl), zu sammeln und zu trennen, auf der Grundlage der Höhe der Impedanzspitzen.
    • 15 – Die RBC-Schale wird abgelassen (Schritt RBC14).
    • 16 – Die RBC-Verdünnungsmittelspritze wird zurückgesetzt (Schritt RBC15).
    • 17 – Die RBC-Schale wird mit Verdünnungsmittel gefüllt (Schritt RBC16).
    • 18 – Die RBC-Schale wird abgelassen (Schritt RBC17).
    • 19 – Rückstand wird aus der RBC-Verdünnungsmittelspritze entfernt (Schritt RBC18).
    • 20 – RBC-Leitungen zu dem optischen Wandler werden gespült (Schritt RBC19).
    • 21 – Der Impedanzwandler wird zurückgespült (Schritt RBC20).
    • 22 – Andere RBC-Leitungen werden gespült (Schritt RBC21).
    • 23 – Die RBC-Lieferspritze wird zurückgesetzt (Schritt RBC22).
    • 24 – Rückstand wird aus der RBC-Lieferspritze entfernt.
    • 25 – Daten von dem Impedanzwandler und dem optischen Wandler werden in einer Datei gesichert zur Verwendung in nachfolgender RBC-Analyse (Schritte 26-34, ausgeführt durch die Algorithmusdatei mcRBCAlgorithm.cc) und Blutplättchenanalyse (Schritte 35-50, ausgeführt durch die Algorithmusdatei mcPLTAlgorithm.cc).
    • 26 – Flags und Parameter werden initialisiert (Subroutinen ParaDefaults und ClassFlagDefaults).
    • 27 – RBC-Impedanzdaten werden aus einer Datei ausgelesen und lokal gespeichert (Subroutine GetRBCData).
    • 28 – Ein 256-Bin-Histogramm von RBC-Impedanzwerten wird erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 29 – Bin-Schwellwerte werden für das Histogramm folgendermaßen festgelegt (Subroutine BinCut): a. Der Histogrammdichtewert wird bestimmt. b. Auf beiden Seiten des Dichtewerts wird das erste Bin mit einer Population kleiner als 0,04 mal der Population des Dichtewerts identifiziert. Diese Grenzwerte werden als die Diskriminanten bezeichnet, und nur Werte zwischen ihnen werden zur Berechnung von Verteilungsparametern RDW (RBC-Verteilungsbreite) und MCV (mittleres Zellvolumen) verwendet. c. Links (d.h. für kleinere Werte des RBC-Volumens) von dem unteren Bin-Schwellwert wird das erste Tal- oder Nullzählbin, falls vorhanden, identifiziert und als der Zählschwellwert festgelegt. Werte größer als dieser Schwellwert werden als durch RBCs verursacht betrachtet.
    • 30 – RBC (rote Blutkörperchenkonzentration) wird berechnet (Subroutine CalcRedConc): RBC = (Anzahl der Ereignisse) × (Anteil, der RBCs ist) × (Verdünnungsverhältnis) × (Koinzidenzkorrekturfaktor) × (Kalibrierfaktor)/(Strömungsgeschwindigkeit × Messzeit);wobei Anzahl der Ereignisse die Zahl von Zellen ist, die durch das Hardware-Gatter in Schritt 14 erfasst wurden; Anteil, der RBCs ist, ist die Histogrammzählung rechts von dem Zählschwellwert geteilt durch die Gesamthistogrammzählung. Der Koinzidenzkorrekturfaktor legt Rechenschaft ab über doppelte Zellzählung und entspricht 2-exp(unkorrigierte RBC-Konzentration × Wandlervolumen/Verdünnungsverhältnis)
    • 31 – MCV und RDW berechnen (Subroutine CalcRedDist): MCV = (Mittel des Histogramms zwischen Diskriminanten) × (0,8 fl pro Bin) × (Kalibrierfaktor) RDW = Standardabweichung von RBC-Volumen/mittleres Zellvolumen (innerhalb Diskriminanten)
    • 32 – RBC-assoziierte Flags setzen, um anomale Analysenergebnisse anzuzeigen (Subroutine SetRbcFlags).
    • 33 – Numerische und Flag-RBC-Ergebnisse werden an das System zurückgegeben zum Speichern und Anzeigen (Subroutinen SendNumResults und SendAlertResults). Beispiele für numerische RBC-Ergebnisse werden in 45A – 45F gezeigt.
    • 34 – Ein Histogramm wird erzeugt zum Speichern und Anzeigen von RBC-Volumenwerten (Subroutine MakeDisplayHist). Beispiele für RBC-Volumenhistogramme werden in 45A – 45F und 46 gezeigt.
    • 35 – Flags und Parameter werden initialisiert (Subroutinen ParamDefaults und ClassFlagDefaults).
    • 36 – Optische und Impedanzblutplättchendaten werden aus einer Datei gelesen und lokal gespeichert (Subroutinen GetPLTiData und GetPLToData). Impedanzdaten bestehen aus Impedanzwerten, die Blutplättchenvolumen darstellen. Optische Daten bestehen aus optischen polarisierten Seitenstreuungs(PSS)- und Zwischenwinkelstreuungs(IAS)-Werten.
    • 37 – Ein 256-Bin-Histogramm von Blutplättchen-Impedanzdaten wird erzeugt (Subroutine mmHist256). Diese stellen Volumenwerte im Bereich von 0 und 35 fl dar.
    • 38 – Bin-Schwellwerte werden auf jeder Seite des Histogrammdichtewertes festgelegt (Subroutine BinCut) wie folgt: a. Die ersten Bins auf beiden Seiten des Dichtewerts, deren Zählung kleiner als 0,04 mal die Zählung des Dichtewerts ist, werden identifiziert. b. Ein zweiter Peak jenseits des ursprünglichen Schwellwertes wird, falls er existiert, zusammen mit dem Tal zwischen einem derartigen Peak und dem Dichtewert identifiziert. c. Falls ein zweiter Peak vorhanden ist und die Zählung in dem Tal kleiner als 0,02 mal die Zählung des Dichtewertes ist, wird der Schwellwert zu dem Tal verschoben.
    • 39 – PLTi, die Blutplättchenkonzentration auf der Grundlage von Impedanzwerten (Subroutine CalcPLTiConc): PLTi = (Anzahl der Ereignisse) × (Anteil, der Blutplättchen ist) × (Verdünnungsverhältnis) × (Kalibrierfaktoren)/(Strömungsgeschwindigkeit × Messzeit);wobei Anzahl der Ereignisse die Zahl von Zellen ist, die durch das Hardware-Gatter in Schritt 14 erfasst wurden; Anteil, der Blutplättchen ist, ist die Histogrammzählung rechts von dem linken Schwellwert geteilt durch die Gesamthistogrammzählung.
    • 40 – Blutplättchenverteilungsparameter MPV (mittleres Blutplättchenvolumen) und PDW (Blutplättchenverteilungsbreite) werden berechnet (Subroutine CalcPLTDist): MPV = (Bin-Zahl des Mittelwerts von Histogrammwerten zwischen Schwellwerten) = (0,137 fl pro Bin) × (Kalibrierfaktoren) PDW = (Standardabweichung von Blutplättchenvolumenwerten zwischen Schwellwerten)/(mittleres Blutplättchenvolumen)
    • 41 – Impedanz-assoziierte Blutplättchen-Flags werden auf anomale Analysenergebnisse gesetzt (Subroutine SetPLTiFlags).
    • 42 – Ein Rauschgatter wird auf die optischen Blutplättchendaten angewendet mit log(PSS) = 8,0 (Subroutine PLToNoiseGate).
    • 43 – Regressionsbandgatter werden auf die verbleibenden optischen Blutplättchendaten angewendet (Subroutine PLToRegressBandGate) wie folgt: a. Eine lineare Regression wird berechnet für die optischen Blutplättchendaten über dem Rauschgatter in der Analysenebene log(IAS) über log(PSS), zusammen mit einer Standardfehlerabschätzung für diese Regression. b. Das obere Regressionsbandgatter wird parallel zu und in einem Abstand von 2,0 Standardfehler über der Regressionslinie gezeichnet. c. Das untere Regressionsbandgatter wird parallel zu und in einem Abstand von 2,5 Standardfehler unter der Regressionslinie gezeichnet.
    • 44 – Die optischen Blutplättchendaten oberhalb des Rauschgatters und zwischen den Regressionsbandgattern werden auf eine obere Population geprüft (Subroutine PLToFindUpperPopulation): a. Die übrigen Punkte werden auf die Regressionslinie von Schritt 43 projiziert. b. Ein 256-Bin-Histogramm wird erzeugt, auf 64 Bin durch Mittelwertbildung reduziert, mit einem 7-Pin-Boxcar-Filter gefiltert und auf 256 Bin durch Interpolation erweitert. c. Ein Dichtewert wird in den unteren 2/3 des Histogramms identifiziert. d. Das obere Viertel des Histogramms wird auf einen zweiten Peak durchsucht. e. Falls ein zweiter Peak in dem oberen Viertel vorhanden ist, wird das obere Populationsgatter auf das Tal zwischen dem Dichtewert und dem zweiten Peak festgelegt. Ansonsten wird das obere Populationsgatter auf die rechte Kante des Histogramms festgelegt. Zellen, die nicht vorher ausgeschlossen wurden und die über diesem Gatter liegen, sind die "obere Population". Zellen, die nicht vorher ausgeschlossen wurden und die unter diesem Gatter liegen, sind die "untere Population". f. Die obere Population wird mit einem Satz von Kriterien verglichen, um zu bestimmen, ob sie mikrozytische RBCs einschließt. Wenn dies der Fall ist, wird ein Warnflag gesetzt.
    • 45 – Die optisch bestimmte Blutplättchenkonzentration (PLTo) wird berechnet (Subroutine CalcPLToParams): PLTo = (Anzahl der Ereignisse) × (Anteil, der Blutplättchen ist) × (Verdünnungsverhältnis)/(Strömungsgeschwindigkeit × Messzeit);wobei Anzahl der Ereignisse die Zahl der optischen Ereignisse ist, durch Hardware gezählt, die innerhalb des quadratischen Hardwaregatters im log(IAS)-über-log(PSS)-Raum liegen; Anteil, der Blutplättchen ist, ist die Zählung der oberen Population geteilt durch die Summe der Zählungen der oberen und unteren Population.
    • 46 – Das Thrombokrit (PCT, oder Fraktion von Vollblut, die aus Blutplättchen besteht) wird berechnet (Subroutine CalcPCT): PCT = PLTo × MPV × (Einheitenumwandlungsfaktor)
    • 47 – Flags, die mit optisch bestimmten Blutplättchenparametern assoziiert sind, werden gesetzt, um anomale Ergebnisse anzuzeigen (Subroutine SetPLToFlgs).
    • 48 – Numerische Ergebnisse und Flags, die mit optisch bestimmten Blutplättchenparametern assoziiert sind, werden an das System zurückgegeben zum Speichern und Anzeigen (Subroutinen SendNumResults und SendAlertResults). Beispiele für numerische Blutplättchenergebnisse werden in 45a – 45F, 47 und 48 gezeigt.
    • 49 – Ein Histogramm von Blutplättchenimpedanzwerten wird zum Speichern und Anzeigen erzeugt (Subroutine MakeDisplayHist). Ein Beispiele für ein Blutplättchenimpedanzhistogramm ist in 47 gezeigt.
    • 50 – Ein Streudiagramm von optischen Blutplättchenwerten und – gattern wird zum Speichern und Anzeigen erzeugt (Subroutine SendScatResults). Beispiele für Blutplättchen-Streudiagramme werden in 45A – 45F, 47 und 48 gezeigt.
  • Beispiel 4 – Weiße Blutkörperchen (WBC)-Differentialanalyse
  • Eine Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um weiße Blutkörperchen(WBC)-Differentialanalysen von Vollblutproben durchzuführen. Ein Beispiel für eine solche Analysenprozedur folgt. Die Schritte von der Probenverarbeitung werden durch Software wie die, die in Anhang A präsentiert wird, gesteuert. Die Schritte von der Datenanalyse werden durch Software wie die, die in Anhang B präsentiert werden, gesteuert.
    • 1 – Der WBC-Schalen-Motor beginnt die Mischbewegung der Schale (Schritt W1).
    • 2 – 1275 μl von WBC-Lysemittel werden in die WBC-Schale mit der WBC-Verdünnungsmittelspritze dispensiert (Schritt W2).
    • 3 – 37,5 μl Vollblut werden von der Ansaugsonde in die WBC-Schale abgeschieden (Schritt A9 von Beispiel 1).
    • 4 – Die WBC-Verdünnungsmittelspritze wird zurückgesetzt (Schritt W3).
    • 5 – Die WBC-Verdünnungsmittelspritze wird verschoben, um Rückstand zu entfernen (Schritt W4).
    • 6 – Etwa 9,4 Sekunden werden verstreichen gelassen nach dem Vermischen der Blutprobe und dem WBC-Lysemittel.
    • 7 – Mantelströmung wird in dem optischen Wandler initiiert (Schritt RBC6 von Beispiel 3).
    • 8 – Die Blut- und Lysemittel-Mischung wird unter Verwendung der HGB-Peristaltikpumpe zu der optischen Wandlerleitung verschoben (Schritt W5).
    • 9 – Die WBC-Schale wird abgelassen und gespült (Schritt W6).
    • 10 – Eine Ventilneuausrichtung ermöglicht den WBC-Probenstrom durch den optischen Wandler (Schritt W7).
    • 11 – WBC-Probenstrom durch den optischen Wandler mit etwa 27,6 μl/s mit der optischen Lieferspritze beginnt (Schritt W8).
    • 12 – Die WBC-Probenströmungsgeschwindigkeit wird auf etwa 2,5 μl/s verringert (Schritt W9).
    • 13 – Optische WBC-Daten werden durch den optischen Wandler gesammelt (Schritt W10).
    • 14 – Die optische Lieferspritze wird zurückgesetzt (Schritt W11).
    • 15 – Rückstand wird aus der optischen Lieferspritze entfernt (Schritt W12).
    • 16 – Daten von dem optischen Wandler werden in einer Datei gespeichert zur Verwendung in nachfolgender WBC-Differentialanalyse (Schritte 17-XX, ausgeführt durch die Algorithmusdatei mcWBCAlgorithm.cc).
    • 17 – WBC-Daten werden aus einer Datei gelesen und lokal gespeichert (Subroutine GetWBCData). Diese Daten bestehen aus Werten für Axiallichtverlust (ALL), Zwischenwinkelstreuung (IAS), polarisierte Seitenstreuung (PSS), depolarisierte Seitenstreuung (DSS) und rote Fluoreszenz (FL3) für jedes erfasste Ereignis.
    Schritte 18 – 22 identifizieren Normoblasten (NRBCs).
    • 18 – Ein 256-Bin-Histogramm von FL3-Werten wird erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 19 – Die Ereignisse werden eingeteilt in "hohe FL3" oder "niedrige FL3", indem ein Tal in der Nähe von log(FL3) = 100 identifiziert wird (Subroutine FindFl3Cells). Ein Beispiel für diese Einteilung ist in 49A und 49B veranschaulicht.
    • 20 – Ein Histogramm der ALL-Werte der hohen FL3-Zellen wird erzeugt (Subroutine mmHist256). Ein Beispiel für dieses Histogramm ist in 50A und 50B veranschaulicht.
    • 21 – Ein Peak wird bei einem Wert von weniger als ALL=75 identifiziert, falls er vorhanden ist (Subroutine AnalyzeFl3Cells). Falls er nicht vorhanden ist, werden keine NRBCs angezeigt.
    • 22 – Falls ein Peak bei ALL<75 vorhanden ist, werden die Ereignisse mit einem PSS-Wert größer als der PSS-Schwellwert (etwa 45) als NRBCs klassifiziert und durchlaufen keine weitere Analyse.
    Schritte 23 – 26 identifizieren Neutrophile und Eosinophile.
    • 23 – Eine Auftragung aller Ereignisse auf der Ebene PSS über ALL wird verwendet, um die zwei größten Peaks zu identifizieren, welche der Neutrophilenpeak und der Monozytenpeak sind (Subroutine FindMGLine).
    • 24 – Eine Linie wird zwischen den beiden Peaks gezogen. Beginnend bei dem Minimalwert entlang dieser Linie wird eine Teilungslinie zwischen den Granulozyten (oberhalb der Linie) und mononuklearen Zellen (unterhalb der Linie) gezogen (Subroutine FindMGLine, fortgesetzt). Ein Beispiel für die Teilungslinie ist in 51A und 51B veranschaulicht.
    • 25 – Für die Granulozyten (oberhalb der Linie) wird ein Histogramm der Werte von arctan(DSS/PSS) erzeugt (Subroutine FindNELine).
    • 26 – Das Histogramm von Schritt 25 wird auf ein Tal zwischen den Winkelwerten von 10° und 31° durchsucht (Subroutine FindNELine fortgesetzt). Zellen mit einem Winkelwert von arctan(DSS/PSS) größer als dieses Tal werden als Eosinophile klassifiziert, und die Zellen mit Winkelwerten kleiner als dieses Tal werden als Neutrophile klassifiziert. Ein Beispiel für dieses Histogramm und diese Winkelteilungslinie ist in 52A und 52B veranschaulicht.
    Schritte 27 – 28 identifizieren Monozyten und Stroma.
    • 27 – Von den restlichen Zellen wird ein 256 Bin-Histogramm von ALL-Werten erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 28 – Das ALL-Histogramm wird auf zwei Täler durchsucht, in der Hochregion (Bins 100-160) und in der Niederregion (Bins 45-75). Zellen oberhalb des oberen Tals werden als Monozyten klassifiziert. Zellen unterhalb des niederen Tals werden als Stroma identifiziert (Subroutine FindLymphLines). Ein Beispiel für das ALL-Histogramm und Teilungslinien ist in 53 veranschaulicht.
    Schritte 29 – 30 werden verwendet, um Lymphozyten zu identifizieren.
    • 29 – Von den restlichen Zellen wird ein 256-Bin-Histogramm von IAS-Werten erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 30 – Ein Tal wird identifiziert, falls es vorhanden ist, zwischen Bins 70 und 110. Falls ein derartiges Tal nicht vorhanden ist, wird eine Teilungslinie bei einem Wert gleich dem Mittelwert der IAS-Werte plus 2,5 mal die Standardabweichung der IAS-Werte gezogen. Zellen links von diesem Tal oder dieser Linie werden als Lymphozyten klassifiziert. Ein Beispiel für diese Einteilung ist in 54 veranschaulicht.
    Schritte 31 – 32 werden zum Identifizieren von Basophilen verwendet.
    • 31 – Von den restlichen Zellen wird ein 256-Bin-Histogramm von ALL-Werten erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 32 – Ein Tal in dem ALL-Histogramm wird, falls es vorhanden ist, identifiziert zwischen ¼ und 3/4 des Abstandes von den Lymphozyt-Stroma- und Lymphozyt-Monozyt-Trennlinien, die in Schritt 28 bestimmt wurden. Wenn kein solches Tal vorhanden ist, wird eine Standardteilungslinie bei der Hälfte dieser Distanz gezogen. Zellen mit ALL-Werten über dieser Linie werden als Basophile klassifiziert. Ereignisse mit ALL-Werten unter dieser Linie werden als Rauschen klassifiziert (Subroutine FindBasoLines). Ein Beispiel für diese Teilung ist in 55 veranschaulicht.
    • 33 – Histogramme und Statistiken werden für jede klassifizierte Population erzeugt (Subroutine DoPopStats).
    • 34 – Alarmflags werden für irgendwelche anomale Analysenergebnisse gesetzt (Subroutine SetFlags). Insbesondere umfasst dieser Schritt die Durchführung einer statistischen Prüfung auf die Anwesenheit von Lyse-resistenten RBCs und auf Blastzellen. Ein Blastenalarmsignal wird gesetzt, falls eine gewichtete Kombination der folgenden Statistikwerte über einem Schwellwert liegt (etwa 3,874):
      Populationsstatistik Wichtungsfaktor
      Monozytenprozentanteil 0,030352
      Mittelwert von Lymphozyt-ALL 0,013182
      Mittelwert von Monozyt-ALL 0,016766
      Variationskoeffizient von Monozyt-ALL 0,152739
      Variationskoeffizient von Monozyt-IAS –0,041058
      Mittelwert von Monozyt-PSS –0,051015
      Variationskoeffizient von Monozyt-PSS 0,028661
      Variationskoeffizient von Lymphozyt und –0,02960
      Monozyt-PSS
      Mittelwert von allen WBC-FL3 0,024813
    • 35 – Alle numerischen Ergebnisse und Alarmflags werden an das System zurückgegeben zum Speichern und Anzeigen (Subroutinen SendNumResults und SendFlagResults).
    • 36 – Ein Streudiagramm wird erzeugt und an das System zum Speichern und Anzeigen geschickt (Subroutine SendScatResults). Eine typische Anzeige wird ALL über IAS, DSS über PSS und ALL über FL3 anzeigen, wie veranschaulicht in 45A – 45F.
  • Beispiel 5 – Retikulozytenanalyse
  • Eine Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um Retikulozytenanalysen von Vollblutproben durchzuführen. Ein Beispiel für eine solche Analysenprozedur folgt. Die Schritte von der Probenverarbeitung werden durch Software wie die, die in Anhang A präsentiert wird, gesteuert. Die Schritte von der Datenanalyse werden durch Software wie die, die in Anhang B präsentiert wird, gesteuert. Die Streudiagramme, die durch diese Analyse erzeugt werden, sind beispielhaft in 14A und 14B dargestellt.
    • 1 – Die Analyse beginnt mit einer leeren RBC-Schale.
    • 2 – 2200 μl RBC-Verdünnungsmittel werden in die RBC-Schale mit der RBC-Verdünnungsmittelspritze abgegeben (Schritt RBC2).
    • 3 – 18,75 μl Vollblut und 2000 μl RBC-Verdünnungsmittel werden über die Ansaugsonde in die RBC-Schale abgegeben, wie in Beispiel 1 (Schritt A15) beschrieben.
    • 4 – 3656 μl Verdünnungsmittel werden in die RBC-Schale mit der RBC-Verdünnungsmittelspritze abgegeben (Schritt RBC3). Ein Verdünnungsverhältnis von etwa 420:1 wird hergestellt.
    • 5 – 500 μl der Blut/Verdünnungsmittel-Mischung werden in die Ansaugsonde aus der RBC-Schale angesaugt (Schritt A16).
    • 6 – Die Ansaugsonde wird hochgezogen und gereinigt (Schritt A17).
    • 7 – Die Ansaugsonde wird zu einer Position direkt über der RETIC-Schale verfahren (Schritt A18).
    • 8 – Die Ansaugsonde wird etwas in Richtung der RETIC-Schale abgesenkt (Schritt A19).
    • 9 – 200 μl der Blut/Verdünnungsmittel-Mischung werden von der Ansaugsonde in die RETIC-Schale für die Retikulozytenanalyse abgegeben. (Schritt A20).
    • 10 – 600 μl Retikulozytenfarbstoff werden durch einen festen Anschluss in die RETIC-Schale mit der Retikulozyten-Verdünnungsmittelspritze abgegeben (Schritt R1). Ein Verdünnungsverhältnis von etwa 1680:1 wird hergestellt.
    • 11 – Die Retikulozyten-Verdünnungsmittelspritze wird zurückgesetzt (Schritt R2).
    • 12 – Die Retikulozytenprobe wird in die Nähe der optischen Durchflusszelle mit der RBC-Peristaltikpumpe überführt (Schritt R3).
    • 13 – Kurzer Rückfluss in der WBC-Probenleitung zu der optischen Durchflusszelle wird initiiert, um Verschleppung zu verhindern (Schritt R4).
    • 14 – Die RETIC-Schale wird abgelassen (Schritt R5).
    • 15 – Retikulozytenprobenstrom durch die optische Durchflusszelle mit 78 μl/s wird initiiert unter Verwendung der optischen Lieferspritze (Schritt R6), um Fluidleitungstotvolumen zu verdrängen.
    • 16 – Retikulozytenprobenstrom durch die optische Durchflusszelle wird auf etwa 2,0 μl/s verringert (Schritt R7).
    • 17 – Die RETIC-Schale wird mit Verdünnungsmittel gefüllt zum Spülen (Schritt R8).
    • 18 – Retikulozytendaten werden in dem optischen Messaufnehmer gesammelt (Schritt R9). Ein Hardware-Gatter sammelt Daten für jedes optische Ereignis mit einem Zwischenwinkelstreuungs(IAS)-Wert größer als einem bestimmten Schwellwert.
    • 19 – Die RETIC-Schale wird abgelassen, gespült und abgelassen (Schritt R10).
    • 20 – Die optische Lieferspritze wird zurückgesetzt (Schritt R11).
    • 21 – Retikulozytenprobenlieferleitungen werden gespült (Schritt R12).
    • 22 – Rückstand wird aus der optischen Lieferspritze entfernt (Schritt R13).
    • 23 – Optische Retikulozytendaten werden in einer Datei zur nachfolgenden Analyse gespeichert. Die Analyse von Schritt 24 – Schritt 33 wird durch Algorithmusdatei mrRETCAlgorithm.cc gesteuert.
    • 24 – Daten werden aus einer Datei gelesen und lokal gespeichert (Subroutine GetRETCData). Diese Daten bestehen aus Zwischenwinkelstreuungs(IAS)- und Grünfluoreszenz(FL1)-Werten.
    • 25 – Ein 256-Bin-Histogramm von log(IAS)-Werten wird erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 26 – Ein Tal wird zwischen Kanal 150 und Kanal 190 identifiziert, falls es vorhanden ist. Zellen mit log(IAS)-Werten kleiner als dieses Tal (oder 170, falls kein Tal vorhanden ist) werden als Blutplättchen betrachtet und von einer weiteren Analyse entfernt (Subroutine FindPLTs). Ein Beispiel für dieses Histogramm und die Teilungslinie ist in 56 veranschaulicht.
    • 27 – Von den verbleibenden Zellen wird ein 256-Bin-Histogramm von log(FL1)-Werten erzeugt (Subroutine mmHist256).
    • 28 – Ein Tal wird, falls es vorhanden ist, in dem oberen Bereich von diesem Histogramm identifiziert (zwischen Bins 175 und 225). Zellen mit log(FL1)-Werten größer als dieses Tal (oder 200, falls kein Tal vorhanden ist) werden als WBCs betrachtet und von der weiteren Analyse entfernt (Subroutine FindWBCs).
    • 29 – Das log(FL1)-Histogramm wird auf ein Tal rechts von dem Haupt(RBC-)peak abgesucht. Falls ein solches Tal vorhanden ist, werden Zellen rechts davon als Retikulozyten identifiziert. Fall kein Tal vorhanden ist, wird eine Teilungslinie bei Kanal 120 (Standardretikulozytencursor) gesetzt. Zellen rechts von dieser Teilungslinie werden als Retikulozyten identifiziert (Subroutine FindRETCs). Beispiele für dieses Histogramm und die Teilungslinien sind in 45F und 57 veranschaulicht.
    • 30 – Der Retikulozytenreifeindex (RMI) wird berechnet. Dieser Wert ist gleich dem Prozentanteil von Retikulozyten, der in eine "hohe FL1-Region" fällt, die definiert ist, dass sie log(FL1)-Histogramm-Bins höher als der untere Retikulozytengrenzwert (wie in Schritt 29 gebildet) plus einem festen Wert (etwa 24) hat (Subroutine GetFionalCounts).
    • 31 – Numerische Ergebnisse werden an das System zum Speichern und Anzeigen zurückgegeben (Subroutine SendNumResults).
    • 32 – Ein Streudiagramm wird erzeugt zum Speichern und Anzeigen (Subroutine SendScatResults). Ein Beispiel eines Retikulozytenstreudiagramms ist in 14A und 58 veranschaulicht.
    • 33 – Ein Histogramm von log(FL1)-Werten wird erzeugt zum Speichern und Anzeigen (Subroutine SendHistResults). Beispiele für Retikulozytenhistogramme sind in 14B, 45F und 59 veranschaulicht.
  • Beispiel 6 – Lymphozyten-Immunphänotypisierungsanalyse
  • Eine Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um Lymphozyten-Immunphänotypisierunganalysen von Vollblutproben durchzuführen. Ein Beispiel für eine solche Analysenprozedur folgt. Die Schritte von der Probenverarbeitung werden durch Software wie die, die in Anhang A präsentiert wird, gesteuert.
    • 1. 100 μl Vollblut werden von der Ansaugsonde angesaugt und in die Transferschale abgeschieden (Subroutine subasp.f). Dieses Volumen kann bei Bedarf angepasst werden, um genug Blut bereitzustellen, um alle gewünschten Immunphänotypisierungsassays für diese Probe auszuführen.
    • 2. Die Inkubationssonde saugt etwa 70 μl aus der Transferschale und scheidet sie in der entsprechenden Anzahl von Inkubationsschalen ab (Subroutine subprep.f).
    • 3. Reagenzien wie Antikörperreagenzien zur Immunphänotypisierung werden durch die Inkubationssonde angesaugt und in den entsprechenden Inkubationsschalen abgeschieden (Subroutine subinc.f).
    • 4. Eine geeignete Zeitverzögerung zur Inkubation tritt ein.
    • 5. Etwa 670 μl WBC-Verdünnungsmittel werden zu der WBC-Schale hinzugegeben. Das und die folgenden Probenverarbeitungsschritte (5 bis 8) werden durch Software wie die in Subroutine subvu.f gesteuert.
    • 6. Im Anschluss an die Inkubation werden etwa 30 μl der Probe durch die Inkubationssonde angesaugt und in die WBC-Schale abgeschieden.
    • 7. Die Proben- und Verdünnungsmittel-Mischung wird durch die WBC-Schale etwa 5 Sekunden lang gemischt.
    • 8. Die Mischung wird für die Messung von optischen Eigenschaften durch den optischen Messaufnehmer geschickt. Die gemessenen Eigenschaften können Axiallichtverlust (ALL), Zwischenwinkelstreuung (IAS) und zwei Fluoreszenzwerte (FL1 und FL2) umfassen.
    • 9. Die Daten werden zur nachfolgenden Analyse gespeichert. Allgemein können Analysenschritte jene einschließen, die hier aufgelistet sind.
    • 10. Eine Auftragung von ALL- über IAS-Werten wird erzeugt und in polare zweidimensionale Bereiche eingeteilt. Solche Bereiche werden begrenzt durch Radien und Bögen, die von einem Ursprung ausgehen. Der Ursprung kann variiert werden, ist aber normalerweise bei der maximalen ALL-Grenze und dem IAS-Nullpunkt positioniert, siehe 60A.
    • 11. Eine zweite Auftragung von log(FL2) über log(FL1) wird erzeugt und in polare zweidimensionale Bereiche eingeteilt. Der Ursprung für diese Einteilung ist normalerweise bei (0,0). Eine Veranschaulichung von einem Beispiel sowohl für das ALL-über-IAS-Diagramm als auch das log(FL2)-über-log(FL1)-Diagramm ist in 60A und 60D dargestellt.
    • 12. Beide Diagramme werden gegen den Uhrzeigersinn und dann radial nach außen auf Lymphozytenpeaks durchsucht. Schwellwerte werden bei 1/10 der Peak-Höhen festgelegt. Zellen, deren assoziierte Datenpunkte innerhalb der Schwellwerte liegen, werden als Lymphozyten betrachtet.
    • 13. Die Zahl von Lymphozytenereignissen in jedem Diagramm wird gezählt und miteinander und mit der hämatologischen Lymphozytenzahl verglichen, um mögliche Fehler zu erfassen. Siehe 60B, 60C, 60E und 60F.
    • 14. Statistische Analyse kann die Grenzen für IAS- und ALL-Werte, die am genauesten Lymphozyten identifizieren, weiter verfeinern. Diese Darstellung kann Ellipsoide, Polygone oder andere geometrische Bereiche innerhalb des ALL-über-IAS-Analysenraums bilden.
    • 15. Analyse der gleichen Probe, die mit anderen Antikörperreagenzien behandelt worden ist, kann fortgesetzt werden. Zellen werden nur für die Analyse in Betracht gezogen, wenn ihre IAS- und ALL-Werte innerhalb der Grenzen liegen, die durch die Lymphozytenidentifikation (Schritte 10 bis 14) bestimmt wurden.
  • Beispiel 6A – Messung von T-Helfer-Subsets
  • Eine Ausführungsform der Erfindung kann verwendet werden, um die Fraktion von Lymphozyten zu messen, die T-Helfer-Zellen sind, durch Befolgung einer Prozedur ähnlich dem Folgenden:
    • 1. Eine Portion einer Vollblutprobe wird mit einem Reagenzgemisch inkubiert, das fluoreszent markierte Antikörper umfasst, die an CD45-Rezeptoren auf WBCs binden werden und Fluoreszenz emittieren, die durch einen der zwei Fluoreszenzdetektoren (FL1 oder FL2) nachweisbar ist, und fluoreszent markierte Antikörper, die sowohl an CD13- als auch CD14-Rezeptoren auf WBCs binden werden und Fluoreszenz emittieren, die durch den anderen der zwei Fluoreszenzdetektoren nachweisbar ist. In diesem Beispiel ist der CD45-Antikörper an Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und die CD13- und CD14-Antikörper sind an Phycoerythrin (PE) gebunden. Eine typische Inkubation ereignet sich etwa 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    • 2. Eine zweite Portion der gleichen Vollblutprobe wird mit einem Reagenzgemisch inkubiert, das fluoreszent markierte Antikörper einschließt, die an CD3-Rezeptoren auf WBCs binden werden und Fluoreszenz emittieren, die durch einen der beiden Fluoreszenzdetektoren (FL1 oder FL2) nachweisbar ist, und fluoreszent markierte Antikörper, die an CD4-Rezeptoren auf WBCs binden werden und Fluoreszenz emittieren, die durch den anderen der zwei Fluoreszenzdetektoren nachweisbar ist. In diesem Beispiel sind die CD3-Antikörper an FITC gebunden und die CD4-Antikörper sind an PE gebunden.
    • 3. Die erste inkubierte Blutprobe wird auf eine ähnliche Art und Weise wie die in Beispiel 6 beschriebene analysiert. Diese Analyse ergibt einen Bereich von IAS- und ALL-Werten (das Lymphozytengatter), der Lymphozyten entspricht, welche gekennzeichnet sind durch die Anwesenheit von CD45-Rezeptoren und die Abwesenheit von CD13- und CD14-Rezeptoren. Eine Auftragung der Fluoreszenzpegel entsprechend der CD13/CD14-Aktivität und der CD45-Aktivität und die resultierende Kennzeichnung von Lymphozyten ist in 61A dargestellt. Eine Auftragung der IAS- und ALL-Werte für die gleichen Zellen und das resultierende Lymphozytengatter ist in 61B dargestellt.
    • 4. Die Reinheit der Lymphozytengatter-Prozedur kann bestimmt werden durch Berechnung der Fraktion aller Zellen innerhalb des Lymphozytengatters, die die Anwesenheit von CD45-Rezeptoren und die Abwesenheit von CD13- und CD14-Rezeptoren demonstriert, wie durch die Pegel von Fluoreszenz angezeigt, die durch die FL1- und FL2-Detektoren nachgewiesen werden. Eine Auftragung der Fluoreszenzpegel, die der CD13/CD14-Aktivität und der CD45-Aktivität für Zellen innerhalb des Lymphozytengatters entsprechen, ist in 61C dargestellt.
    • 5. Die zweite inkubierte Blutprobe wird auf eine ähnliche Art und Weise analysiert wie die, die in Schritten 1 bis 8 von Beispiel 6 beschrieben ist. Jede Zelle, deren Werte für IAS und ALL innerhalb des Lymphozytengatters liegen, wird als positiv oder negativ für jeden der zwei Antikörper in dem Reagenzgemisch (CD3 und CD4) gekennzeichnet, beruhend auf einem Vergleich der erfassten Pegel von FL1 und FL2 mit Fluoreszenzpegeln von Kontrollzellen, die mit einem Antikörpergemisch inkubiert wurden, die als nicht bindend betrachtet werden und mit PE und FITC markiert sind. Die Fluoreszenzpegel der Kontrollzellen (die negative Reaktionen darstellen) sind in 61D veranschaulicht.
    • 6. Die Fraktion von Lymphozyten, die T-Helfer-Zellen sind, wird bestimmt als die Fraktion von Zellen innerhalb des Lymphozytengatters, die positiv für CD3 und positiv für CD4 sind. Eine Auftragung der Fluoreszenzpegel entsprechend CD3-Aktivität und CD4-Aktivität für Zellen innerhalb des Lymphozytengatters, die die Fraktion zeigt, die positiv für beide ist, ist in 61E dargestellt.
    • 7. Die Konzentration von T-Helfer-Zellen kann bestimmt werden als der Bruchteil von Lymphozyten, die positiv für CD3 und positiv für CD4 sind (bestimmt in Schritt 6), mal der Lymphozytenzahl, die in der WBC-Differentialanalyse bestimmt wurde, die beschrieben ist in Beispiel 4.
  • Beispiel 6B – Messung von T-Suppressor-Subsets
  • Eine ähnliche Prozedur kann verwendet werden, um das Lymphozytensubset von T-Suppressor-Zellen quantitativ zu bestimmen, das gekennzeichnet ist dadurch, dass es positiv sowohl für CD3 als auch CD8 ist.
    • 1. Eine Portion einer Vollblutprobe wird mit einem Reagenzgemisch inkubiert, das fluoreszent markierte Antikörper umfasst, die an CD45-Rezeptoren auf WBCs binden werden, und fluoreszent markierte Antikörper, die sowohl an CD13- als auch CD14-Rezeptoren auf WBCs binden werden, wie in Schritt 1 von Beispiel 6A. Analyse dieser inkubierten Probe wird ausgeführt wie in Schritt 3 und Schritt 4 von Beispiel 6A beschrieben, was ein Lymphozytengatter ergibt. Eine typische Inkubation ereignet sich etwa 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    • 2. Eine zweite Portion der gleichen Vollblutprobe wird mit einem Reagenzgemisch inkubiert, das fluoreszent markierte Antikörper einschließt, die an CD3-Rezeptoren auf WBCs binden werden und Fluoreszenz emittieren, die durch einen der beiden Fluoreszenzdetektoren (FL1 oder FL2) nachweisbar ist, und fluoreszent markierte Antikörper, die an CD8-Rezeptoren auf WBCs binden werden und Fluoreszenz emittieren, die durch den anderen der zwei Fluoreszenzdetektoren nachweisbar ist. In diesem Beispiel sind die CD3-Antikörper an FITC gebunden und die CD8-Antikörper sind an PE gebunden.
    • 3. Die zweite inkubierte Blutprobe wird auf eine ähnliche Art und Weise analysiert wie die, die in Schritten 1 bis 8 von Beispiel 6 beschrieben ist. Jede Zelle, deren Werte für IAS und ALL innerhalb des Lymphozytengatters liegen, wird als positiv oder negativ für jeden der zwei Antikörper in dem Reagenzgemisch (CD3 und CD8) gekennzeichnet, beruhend auf einem Vergleich der erfassten Pegel von FL1 und FL2 mit Kontrollfluoreszenzpegeln.
    • 4. Die Fraktion von Lymphozyten, die T-Suppressor-Zellen sind, wird bestimmt als die Fraktion von Zellen innerhalb des Lymphozytengatters, die positiv für CD3 und positiv für CD8 sind. Eine Auftragung der Fluoreszenzpegel entsprechend CD3-Aktivität und CD8-Aktivität für Zellen innerhalb des Lymphozytengatters, die die Fraktion zeigt, die positiv für beide ist, ist in 61F dargestellt.
    • 5. Die Konzentration von T-Suppressor-Zellen kann bestimmt werden als der Bruchteil von Lymphozyten, die positiv für CD3 und positiv für CD8 sind (bestimmt in Schritt 5), mal der Lymphozytenzahl, die in der WBC-Differentialanalyse bestimmt wurde, die beschrieben ist in Beispiel 4.
  • Beispiel 6C – Messung von T- und B-Lymphozyten
  • Die Zahl von T- und B-Lymphozyten kann gemessen werden unter Verwendung einer Prozedur ähnlich der, die in Beispiel 6A und 6B beschrieben ist. Die erste inkubierte Probe, die verwendet wird, um das Lymphozytengatter einzurichten, ist die gleiche Mischung von markierten CD45- und CD13/CD14-Antikörpern wie in Beispiel 6A und 6B. Die zweite Portion von der Blutprobe wird mit einer Mischung von CD3-Antikörpern (markiert mit FITC) und CD19-Antikörpern (markiert mit PE) inkubiert. Die Fraktionen von T-Zellen und B-Zellen werden aus der Fraktion von Zellen bestimmt, die CD3-positiv und CD19-negativ sind (T-Zellen), und der Fraktion, die CD3-negativ und CD19-positiv sind (B-Zellen). Eine Auftragung der Fluoreszenzpegel entsprechend CD3-Aktivität und CD19-Aktivität, die die Fraktionen von T-Zellen und B-Zellen anzeigt, ist in 61G dargestellt.
  • Die Gültigkeit der Lymphozytensubset-Messungen, die in diesen Beispielen beschrieben wurden, wird demonstriert, indem die Analysenergebnisse unter Verwendung einer Ausführungsform dieser Erfindung mit Ergebnissen von herkömmlichen manuellen Durchflusszytometrieassays verglichen werden. Die Ergebnisse eines solchen Vergleichs, zwischen einer Ausführungsform der aktuellen Erfindung (bezeichnet als BB3) mit herkömmlichen Analysen auf einem FACScan-System von Becton Dckinson Immunocytometry Systems, sind in 62A – 62D dargestellt.
  • Die Auftragungen in 62A – 62D veranschaulichen die Korrelation zwischen Fraktionen von Lymphozyten, die positiv sind sowohl für CD3 als auch CD4 (62A), positiv sind für sowohl CD3 als auch CD8 (62B), positiv sind für CD19 allein (62C) und positiv sind für CD3 allein (62D).
  • Beispiel 7 – NRBC-Analyse
  • Fünfundzwanzig (25) μl einer klinischen Vollblutprobe werden in dem hier offenbarten Zellanalyseninstrumentensystem direkt mit 675 μl des Mehrzweckreagenzes gemischt, vorgewärmt bei 42°C in der WBC-Schale 138. Die Probe/Reagenz-Mischung wird gemischt und 11 Sekunden lang inkubiert. Diese Mischung wird dann zu der Durchflusszelle 170 transportiert, welche ungefähr 8½ Sekunden für eine WBC/Diff/NRBC-Analyse benötigt. 40A – 40C und 41A und 41B zeigen das Ergebnis dieser Analyse an Probe, die 56 NRBC/100 WBC bzw. 140 NRBC/100 WBC enthält.

Claims (34)

  1. Eine automatisiertes Instrumenten-System zum Unterscheiden und Differenzieren von Zellen in einer Vollblut-Probe, wobei das System folgendes umfasst: a) einen Probenhalter zur Aufnahme von Proben-Behältern (216, 230), zum Ansaugen der Probe und zu ihrer Dispension in einem Proben-Aufnahme-Gefäß (134) und einem anderen Proben-Aufnahme-Gefäß (138) zur Verdünnung ohne mit zusätzlicher Lyse; b) einen Analysator (64), der eine optische Durchflusszelle (170) für den Durchlass von dem Proben-Aufnahme-Gefäß (134) und von dem anderen Proben-Aufnahme-Gefäß (138) und zum Nachweis von Mehrfachwinkel-Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignalen umfasst, wobei der Analysator weiter einen Impedanzwandler (174) für den Durchlass von Probe vom Proben-Aufnahme-Gefäß (134) und zum Nachweis von Impedanz-Signalen umfasst, und c) eine Systemsteuerung (68, 92, 98), die operativ mit dem Probenhalter und dem Analysator (64) verbunden und in der Lage ist, den Betrieb von beiden als Reaktion auf ein ausgewähltes Protokoll zu steuern und Daten, die durch die Erfassung der Mehrfachwinkel-Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignale und der Impedanz-Signale erzeugt wurden, zu speichern, wobei die Systemsteuerung in der Lage ist, mindestens eine Probe automatisch zu verarbeiten und Testergebnisse davon anzuzeigen, wobei die Testergebnisse quantitative Informationen über rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Fluoreszenz-Zellen oder Zellkörper umfassen.
  2. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Systemsteuerung (68, 92, 98) Speicher und Software umfasst, die in der Lage ist, Messdaten zu handhaben, Parameter zu berechnen und Testergebnisse in einer Vielzahl von Formaten darzustellen.
  3. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse anzeigen, welche Informationen über Fluoreszenz-Zellen oder Zellkörper umfassen, die fluoreszent markierte Oberflächen-Antigene umfassen.
  4. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 1 oder 2, worin das Protokoll mit Hilfe einer Bedienerschnittstelle (90) ausgewählt wird.
  5. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse anzeigen, die weiter quantitative Informationen über Blutplättchen umfassen.
  6. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse anzeigen, die Informationen über Fluoreszenz-Zellen oder Zellkörper umfassen, die weiter Normoblasten umfassen.
  7. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse anzeigen, die Informationen über Fluoreszenz-Zellen oder Zellkörper umfassen, worin die fluoreszierenden Zellen oder Zellkörper weiter Retikulozyten umfassen.
  8. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate quantitative Informationen zu weißen Blutkörperchen anzeigen, die Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignal-erzeugte Daten umfassen.
  9. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse berichten, die Informationen über weiße Blutkörperchen umfassen, welche ein 5-Teile-Differential umfassen.
  10. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2, worin das Protokoll Analysator-Anweisungen umfasst, die zumin dest teilweise auf Daten beruhen, die zuvor vom Analysator (64) erzeugt wurden.
  11. Das automatisierte Instrumenten-System der Ansprüche 2 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse anzeigen, welche Informationen zu weißen Blutkörperchen umfassen, die ein 5-Teile-Differential umfassen, welches eine Lymphozyten-Teilmengen-Analyse umfasst.
  12. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 2 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Formate Testergebnisse anzeigen, die Informationen zu weißen Blutkörperchen umfassen, welche ein 5-Teile-Differential umfassen, das eine Lymphozyten-Teilmengen-Analyse umfasst, welche fluoreszent markierte monoklonale Antikörper verwendet.
  13. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 1, 2 oder 3, worin der Analysator (64) weiter mindestens eine temperaturgesteuerte Inkubationsstelle (118) umfasst.
  14. Das automatisierte Instrumenten-System zum Unterscheiden und Differenzieren von Zellen in einer Vollblut-Probe von Anspruch 2, wobei das System weiter folgendes umfasst: a) eine Operations/Befehls-Verarbeitungs-Station und b) Datenerfassungs- und Datenverarbeitungs-Station (500), wobei die Steuerung (68, 92, 98) operativ mit der Operations/Befehls-Verarbeitungs-Station, dem Probenhalter, dem Analysator (64) und der Datenerfassungs- und -verarbeitungs-Station (500) verbunden ist, wobei die Formate Testergebnisse anzeigen, die quantitative Informationen über Oberflächen-Antigene umfassen.
  15. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 14, worin der Proben-Analysator (64) in der Lage ist, zumindest teilweise auf der Grundlage von Daten, die zuvor vom Analysator (64) für Zellen in der Probe erzeugt wurden, auf die Steuerung (64, 92, 98) zu reagieren.
  16. Das automatisierte Instrumenten-System von Anspruch 15, worin der Proben-Analysator (64) weiter in der Lage ist, eine automatisierte Lymphozyten-Teilmengen-Analyse durchzuführen.
  17. Ein automatisiertes Verfahren zum Unterscheiden und Differenzieren von Zellen in einer Vollblut-Probe mit einem automatisierten Instrumenten-System, wobei das automatisierte Verfahren, das vom automatisierten Instrumenten-System durchgeführt wird, folgende Schritte umfasst: a) Ansaugen einer Vollblut-Probe; b) Dispensieren der Probe in einem Proben-Aufnahme-Gefäß (134) und in einem anderen Proben-Aufnahme-Gefäß (138) zur Verdünnung ohne bzw. mit zusätzlicher Lyse; c) Durchlassen der dispensierten Probe von dem Proben-Aufnahme-Gefäß (134) und von dem anderen Proben-Aufnahme-Gefäß (138) an eine optische Durchflusszelle (170) und Erfassen von Mehrfachwinkel-Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignalen; d) Sammeln erster Daten, die durch das Erfassen der Mehrfachwinkel-Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignale erzeugt wurden; e) Durchlassen der dispensierten Probe vom Proben-Aufnahme-Gefäß (134) an einen Impedanzwandler (174) und Erfassen von Impedanzsignalen; f) Sammeln zweiter Daten, die durch das Erfassen der Impedanzsignale erzeugt wurden; g) Korrelieren und Verarbeiten der ersten und zweiten Daten, um Informationen über rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und fluoreszente Zellen oder Zellkörper in der Vollblut-Probe zu erzeugen, und h) Anzeigen von Testergebnissen, die Informationen über rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und fluoreszente Zellen oder Zellkörper in der Vollblut-Probe umfassen.
  18. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 17, das weiter folgendes umfasst: das Dispensieren der Probe in das Proben-Aufnahme-Gefäß (134) und die optische Analyse der dispensierten Probe mit der optischen Durchflusszelle (170) zum Nachweis von Blutplättchen in der Vollblut-Probe.
  19. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 17, worin die dispensierte Probe in Bezug auf weiße Blutkörperchen und fluoreszente Zellen oder Zellkörper hin analysiert wird.
  20. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 19, worin die fluoreszenten Zellen oder Zellkörper Normoblasten sind.
  21. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 17, das weiter folgendes umfasst: das Dispensieren der Probe in das Proben-Aufnahme-Gefäß (134, 136) und die Analyse der in das Proben-Aufnahme-Gefäß (134, 136) dispensierten Probe im Hinblick auf Mehrfachwinkel-Lichtstreuungs-Fluoreszenz mit der optischen Durchflusszelle (170).
  22. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 21, das folgendes umfasst: Analysieren der dispensierten Probe, um Daten zu sammeln, die verwendet werden, um ein Ergebnis anzuzeigen, welches Informationen über fluoreszierende Zellen oder Zellkörper in der Vollblut-Probe umfasst, und die Zellen oder Zellkörper sind Retikulozyten.
  23. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 17, worin die angezeigten Informationen über weiße Blutkörperchen quantitativ sind und aus der Verarbeitung von Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignal-erzeugten Daten gewonnen werden.
  24. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 23, worin die quantitativen Informationen über weiße Blutkörperchen ein 5-Teile-Differential umfassen.
  25. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 24, worin das 5-Teile-Differential weiter einen Prozentanteil von Normoblasten umfasst.
  26. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 17, worin die dispensierte Probe analysiert wird, um Informationen über die Lebensfähigkeit der Zelle in der Vollblut-Probe zu liefern.
  27. Das automatisierte Verfahren zum Unterscheiden und Differenzieren von Zellen in einer Vollblut-Probe gemäß Anspruch 19, mit einem automatisierten Instrumenten-System, das in der Lage ist, sowohl eine Hämatologie-Analyse als auch eine Fluoreszenz-Zytometrie-Analyse durchzuführen, und dem eine Vollblut-Probe zugeführt wird, wobei das automatisierte Verfahren weiter folgende Schritte umfasst: i) Auswählen einer Reihe aus einem oder mehreren Tests, die vom automatisierten Instrumenten-System an der Vollblut-Probe vorzunehmen sind; j) Korrelieren des einen oder mehreren Tests, die vom automatisierten Instrumenten-System an der Vollblut-Probe vorzunehmen sind; k) Verdünnen der im Proben-Aufnahme-Gefäß (134) dispensierten Probe mit einem Verdünnungs-Reagenz, wodurch eine verdünnte Probe produziert wird; 1) Lysieren der im anderen Proben-Aufnahme-Gefäß (138) dispensierten Probe mit einem Lysier-Reagenz, wodurch eine lysierte Probe produziert wird; m) Transportieren der verdünnten Probe durch einen ersten Durchflußwandler (174) des automatisierten Instrumenten-Systems; n) Erfassen und Zählen roter Blutkörperchen in der verdünnten Probe mit dem ersten Durchflußwandler (174); o) Transportieren der verdünnten Probe durch einen zweiten Durchflußwandler (170); p) Zählen und Differenzieren von Blutplättchen und/oder Retikulozyten in der verdünnten Probe mit dem zweiten Durchflußwandler (170); q) Transportieren der lysierten Probe durch den zweiten Durchflußwandler (170); r) Erfassen und Differenzieren weißer Blutkörperchen darin mit dem zweiten Durchflußwandler (170); s) Erfassen von Mehrfachwinkel-Lichtstreuung und Fluoreszenz aus der lysierten Probe oder der verdünnten Probe und Zählen und Differenzieren von Normoblasten oder Retikulozyten oder von beiden darin mit dem zweiten Durchflußwandler (170); t) Speichern, Korrelieren und Verarbeiten der Erfassungs- und Differenzier-Daten des ersten und des zweiten Durchfluß-Wandlers für die Tests, die an der Vollblut-Probe vorgenommen wurden; und u) Anzeigen der Ergebnisse jedes Tests, der an der Vollblut-Probe vorgenommen wurde, auf der Grundlage der Erfassungs- und Differenzier-Daten des ersten und des zweiten Durchflußmeßumformers, worin das automatisierte Instrumenten-System automatisiert die Verfahrensschritte (j) bis (u) mit der Vollblut-Probe oder einer dispensierten Probe davon durchführt, wobei die Ergebnisse der Hämatologie-Analyse zumindest beim Anzeigen der Ergebnisse der Fluoreszenz-Zytometrie-Analyse verwendet werden.
  28. Das Verfahren von Anspruch 27, das weiter folgende Schritte umfasst: v) Einfärben der verdünnten Probe, wodurch eine gefärbte Probe in einem weiteren Proben-Aufnahme-Gefäß (136) produziert wird; w) Transportieren der gefärbten Probe durch den zweiten Durchflußwandler (170), worin Retikulozyten in der gefärbten Probe gezählt und differenziert werden.
  29. Das Verfahren von Anspruch 27, worin der erste Durchflußwandler eine Impedanz-Durchflusszelle (170) umfasst.
  30. Das Verfahren von Anspruch 27, worin die verdünnte Probe vom automatisierten Instrumenten-System durch den zweiten Durchflußwandler (170) transportiert wird und Mehrfachwinkel-Lichtstreuung erfasst wird, um Blutplättchen in der verdünnten Probe zu zählen und zu differenzieren.
  31. Das Verfahren von Anspruch 27, worin Normoblasten und weiße Blutkörperchen gezählt und aus der lysierten Probe differenziert werden.
  32. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 27, worin eine gemeldete quantitative Information über weiße Blutkörperchen aus Mehrfachwinkel-Lichtstreuungs- und Fluoreszenz-erfassten Daten gewonnen wird.
  33. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 32, worin das Ergebnis für weiße Blutkörperchen ein 5-Teile-Differential umfasst.
  34. Das automatisierte Verfahren von Anspruch 33, worin das 5-Teile-Differential weiter einen Prozentanteil von Normoblasten umfasst.
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