ES2210426T3 - Metodo y aparato de preparacion de un fluido. - Google Patents
Metodo y aparato de preparacion de un fluido.Info
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Optical Measuring Cells (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
- Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)
Abstract
SE PRESENTA UN METODO Y UN APARATO (610) PARA PREPARAR UN LIQUIDO. EL METODO COMPRENDE LAS ETAPAS SIGUIENTES: A) COLOCAR EL LIQUIDO DENTRO DE UN PRIMER ALOJAMIENTO (624), ESTANDO EL PRIMER ALOJAMIENTO OPERATIVAMENTE CONECTADO CON Y BASICAMENTE DISPUESTO DENTRO DE UN SEGUNDO ALOJAMIENTO (626); B) APLICAR ENERGIA TERMICA AL PRIMER ALOJAMIENTO (624) Y AL LIQUIDO DENTRO DEL PRIMER ALOJAMIENTO CON UN CALENTADOR (656) UNIDO DE FORMA MOVIL CON EL PRIMER ALOJAMIENTO; Y C) HACER VIBRAR EL PRIMER ALOJAMIENTO (624) CON UNA FUENTE DE MOVIMIENTO (686) PARA MOVER EL LIQUIDO CONTENIDO EN EL PRIMER ALOJAMIENTO MIENTRAS EL SEGUNDO ALOJAMIENTO (626) PERMANECE BASICAMENTE ESTACIONARIO CON RESPECTO A LA FUENTE DE MOVIMIENTO. EL METODO Y EL APARATO SON PARTICULARMENTE UTILES PARA DILUIR MUESTRAS DE SANGRE COMPLETA Y SUSPENSIONES DE CELULAS.
Description
Método y aparato de preparación de un fluido.
Esta invención se refiere en general a análisis
de partículas. Más en concreto, se refiere a métodos y dispositivos
para llevar a cabo análisis automatizado de células sanguíneas
integrando análisis de "impedancia", "dispersión de luz"
y "fluorescencia" y técnicas de citometría de flujo. Esta
invención también se refiere a un sistema de reactivo multipropósito
y un método para análisis rápido de una muestra de sangre
entera.
La sangre periférica de un humano contiene
generalmente glóbulos rojos (RBC), plaquetas (PLT), y glóbulos
blancos (WBC), todos los cuales están suspendidos en un medio
conductor denominado comúnmente plasma. El plasma incluye
proteínas, aniones y cationes. El plasma también contiene
componentes que contribuyen a la formación de coágulos de
sangre.
La sangre en un adulto contiene generalmente de
aproximadamente 4,5 a 5 millones de RBCs o eritrocitos por
milímetro cúbico. Los RBCs maduros no tienen núcleos y tienen
generalmente forma de discos circulares bicóncavos con un diámetro
de aproximadamente 7,5 a 8 micras (\mu), y un grosor de
aproximadamente 1,5 a 1,8 micras. Los RBCs contienen hemoglobina que
da a la sangre su color rojo. La hemoglobina contribuye a
transportar oxígeno y dióxido de carbono y desempeña un papel en el
mantenimiento del pH de la sangre.
La sangre en un adulto contiene generalmente de
aproximadamente 200.000 a 400.000 plaquetas por milímetro cúbico.
Las plaquetas son pequeñas partículas celulares biconvexas.
Su configuración general incluye una porción
central granular embebida en una matriz homogénea.
La sangre periférica también contiene glóbulos
rojos de niveles de maduración anteriores que son importantes
indicadores de diagnóstico. Dos de estos son los reticulocitos y
los glóbulos rojos nucleados.
En la primera etapa de desarrollo el glóbulo rojo
consta en su mayor parte de núcleo, y se denomina un eritroblasto.
Cuando el eritroblasto madura, el núcleo resulta más pequeño,
anucleolado, y casi más esférico. La madurez siguiente implica una
pérdida completa de núcleo. Los glóbulos rojos inmaduros que
conservan un núcleo se denominan glóbulos rojos nucleados (NRBCs).
El recuento de NRBCs ha sido útil en la monitorización de pacientes
en muchos estados de enfermedad. Sin embargo, los NRBCs en sangre
periférica contribuyen frecuentemente a una enumeración inexacta
del recuento de glóbulos blancos, debido en parte a la presencia de
un núcleo que los hace difíciles de distinguir de los glóbulos
blancos pequeños.
Los reticulocitos son glóbulos rojos en el nivel
de maduración entre NRBCs y RBCs maduros. Los reticulocitos
proporcionan un medio de evaluar el estado anémico del paciente. La
anemia se produce generalmente como resultado de un aumento no
compensado de la velocidad de extracción de eritrocitos de la
sangre, o una disminución de la velocidad a la que se forman y
liberan a la sangre. Un recuento incrementado de reticulocitos en
un paciente anémico indica renovación eritroide rápida que sugiere
pérdida aguda de sangre o hemólisis.
En sangre humana normal, la concentración de
glóbulos blancos, denominados WBCs o leucocitos, es mucho menor que
la concentración de glóbulos rojos. La concentración normal de WBCs
es aproximadamente 7000 por microlitro. Su tamaño varía, en muchos
de ellos desde aproximadamente 7,5 a 12,5 micras de diámetro. Son
de forma casi más esférica que los RBCs y generalmente de volumen
algo mayor. Los WBCs se pueden clasificar en general en granulares
o no granulares. Los WBCs granulares incluyen neutrófilos,
eosinófilos y basófilos. Los WBCs no granulares incluyen monocitos
y linfocitos. Estas categorías de WBCs se suelen denominar
colectivamente una "diferencial de cinco partes" y, en general,
las más significativas de estas categorías son neutrófilos y
linfocitos.
Los neutrófilos comprenden en general desde
aproximadamente 50 a 60% de todos los WBCs. Su citoplasma contiene
numerosos gránulos diminutos que pueden ser teñidos. En
determinadas condiciones los neutrófilos pueden salir de los vasos
sanguíneos y desintegrarse, liberando por ello gránulos a los
tejidos conectivos. Estos gránulos son ricos en algunas enzimas que
son activas y participan en el mecanismo de defensa del cuerpo.
Los linfocitos incluyen aproximadamente 30% de
los WBCs en humanos. El núcleo de un linfocito normal ocupa casi
todo el volumen de la célula, y así el citoplasma que rodea el
núcleo es una envuelta bastante fina. El citoplasma linfocítico se
puede teñir con colorantes debido al contenido de ácido
ribonucleico del citoplasma.
Los linfocitos pueden salir de los vasos
sanguíneos y entrar en el tejido conectivo donde también
constituyen una parte del mecanismo de defensa del cuerpo, jugando
un papel principal en las respuestas inmunológicas del cuerpo.
Hay tres "subconjuntos" principales de
linfocitos que actualmente son clínicamente significativos:
linfocitos T, linfocitos B, y células killer naturales, también
denominadas "linfocitos granulares grandes" o células NK. Cada
uno de estos subconjuntos se puede distinguir en base a la
existencia de marcadores celulares superficiales distintivos o
antígenos. Además, los linfocitos B tienen una alta densidad de
inmunoglobulina de sus superficies, mientras que los linfocitos T
tienen poca o nula. Los linfocitos T se caracterizan por varios
marcadores superficiales contra los que se puede producir
anticuerpos.
Se han identificado categorías de linfocitos T
según sus marcadores superficiales y función general. Las células T
helper ayudan a las células B a producir algunas clases de
moléculas de anticuerpo, y ayudan a otras células T en sus
respuestas inmunes. Las células T "supresoras" son células
reguladoras que pueden suprimir la respuesta de otras células T o
B. Las células T supresoras incluyen varios subconjuntos que son
también reconocidos por distintos marcadores superficiales.
La capacidad de contar, calibrar y clasificar
células sanguíneas es útil al evaluar la salud de un individuo. Por
ejemplo, el nivel de linfocitos CD4 circulantes (células T helper
que tienen un antígeno CD4 expresado en la superficie de la célula)
es considerado actualmente el mejor predictor único de la
progresión de las infecciones VIH. El nivel de CD4 se puede usar
para clasificar individuos para alistamiento en regímenes de
tratamiento experimentales, determinar cuando se deberá inicial
terapia antiviral, y comprobar las respuestas al tratamiento en
ensayos clínicos. Dado que los niveles de linfocitos CD4 pueden ser
importantes para algunos individuos infectados con VIH, es deseable
medir este parámetro con exactitud.
En el estado corriente de la técnica de análisis
celular, se utilizan dos tecnologías para contar y clasificar
células. Se denominan en general "citometría de flujo" y
"citometría de imagen". La tecnología de la citometría de
flujo, que consiste esencialmente en pasar células de una en una a
través de una zona de detección de una celda de flujo, se prefiere
en aplicaciones clínicas donde la carga de pruebas del paciente es
una métrica importante. Esto se debe principalmente a que tiene al
menos una ventaja de orden de magnitud en el número de células que
se puede analizar por segundo.
La instrumentación que incorpora citometría de
flujo se puede subdividir además en dos métodos que se pueden
clasificar en general como "hematología convencional" y
"citometría de fluorescencia".
Una distinción primaria entre los dos métodos es
que la hematología convencional distingue en general las células
por medio del tamaño y la forma usando sólo primariamente
tecnologías de impedancia y dispersión de luz, mientras que la
citometría de fluorescencia usa el contenido de ácido nucleico de
las células y/o antígenos de superficie además del tamaño y la forma
al distinguir células. Por lo tanto, el método de fluorescencia se
puede usar para subdividir los tipos de células en clasificaciones
más estrictas.
Una segunda distinción entre los dos métodos es
que la hematología convencional da lugar a términos absolutos,
mientras que los resultados de la citometría de fluorescencia son
en términos relativos. Los analizadores hematológicos suministran
volúmenes y diluciones exactos, y son así capaces de medir
concentraciones absolutas de células, o recuentos absolutos de tipos
de células por microlitro de sangre humana. El método de citometría
de fluorescencia da solamente concentraciones relativas, o
porcentajes de los varios tipos de células.
Una tercera distinción es que el método de
hematología es generalmente automático, mientras que el método de
citometría de fluorescencia tal como se practica en general hoy
día, es a lo sumo semiautomático, tanto en la preparación de la
muestra como en el análisis de la muestra. Por lo tanto, el método
de citometría de fluorescencia requiere considerablemente mucha más
mano de obra que el método hematológico.
Ambos métodos usan análisis célula a célula. Por
lo tanto, debido a la alta concentración de células en sangre
entera, hay que diluir las muestras de sangre antes del análisis de
manera que las células individuales puedan ser aisladas para
detección dentro de una celda de flujo.
Un ejemplo de un instrumento para llevar a cabo
mediciones hematológicas automáticas es el instrumento
Cell-Dyn® 3000, comercializado durante varios años
por Sequoia-Turner, un predecesor en interés de
Abbott Laboratories. El instrumento Cell-Dyn® 3000
usa mediciones de "impedancia" para contar y calibrar RBCs y
PLTs, mediciones de "absorción" para determinar la
concentración de hemoglobina en RBCs (MCH), y mediciones de
"dispersión óptica" para contar y clasificar WBCs y la
diferencial de cinco partes.
El instrumento Cell-Dyn® 3000
prepara automáticamente muestras de sangre, mide parámetros
celulares y genera resultados de prueba. La completa automatización
de la preparación de la muestra es tal que no se requiere
intervención sustantiva del operador una vez que la muestra de
sangre entera del paciente ha sido presentada al analizador. Como
se ha indicado previamente, para asegurar "recuentos de
paciente" exactos para las varias clases de células, el
instrumento Cell-Dyn® 3000 proporciona volúmenes de
muestra, volúmenes de reactivo y volúmenes de dilución exactos. Los
recuentos de paciente se definen en general como el número de
"eventos" por microlitro de sangre. Los eventos pueden ser
RBCs, PLTs, WBCs, y sus clases y subclases.
Otros dispositivos disponibles en el mercado para
llevar a cabo mediciones hematológicas incluyen el Coulter® STKR, el
Sysmex® NE8000, y el Technicon® H-1. Cada uno de
ellos usa combinaciones de dispersión, impedancia, y absorción para
distinguir y cuantificar células, y así se pueden clasificar como un
instrumento hematológico convencional.
En contraposición, el citómetro de flujo de
fluorescencia incorpora los principios del análisis de células por
fluorescencia con la dispersión de luz. En general, esto requiere
teñir la célula con un colorante de color apropiado, o unir una
etiqueta de fluorocromo a un antígeno o anticuerpo en la superficie
de la célula, indicando así la aparición de una reacción específica
antígeno- anticuerpo.
En citometría de flujo de fluorescencia, una
suspensión de partículas previamente teñidas o marcadas con
fluorescente, típicamente células en una muestra de sangre u otro
fluido biológico, es transportada a través de una celda de flujo
donde las partículas individuales de la muestra son iluminadas con
uno o varios haces de luz enfocados. Uno o más detectores detectan
la interacción entre el (los) haz (haces) de luz y las partículas
marcadas que fluyen a través de la celda de flujo. Es común que
algunos de los detectores estén diseñados para medir emisiones
fluorescentes, mientras que otros detectores miden la intensidad de
dispersión o la duración del pulso. Así, cada partícula que pasa a
través de la celda de flujo se puede correlacionar con un espacio de
características cuyos ejes son los colores de emisión, intensidades
de luz, u otras propiedades, es decir, dispersión, medidas por los
detectores. Preferiblemente, las diferentes partículas de la
muestra se pueden correlacionar con regiones distintas y sin
solapamiento de los espacios de características, que permite
analizar cada partícula en base a su aplicación en los espacios de
características. A este respecto, la citometría de flujo difiere de
los instrumentos hematológicos convencionales en que parte del eje
del espacio de características incluye emisiones de
fluorescencia.
Como se ha observado anteriormente, las subclases
de linfocitos son determinantes de la salud. Así, es deseable medir
con exactitud estos y otros parámetros. Aunque los instrumentos
conocidos de hematología y citometría de flujo fluorescente han
realizado avances significativos en la capacidad de caracterizar
células sanguíneas, un problema que todavía existe en este campo es
la dificultad de obtener valores exactos de recuento de paciente
para algunas clases de células.
Un ejemplo de este problema es el recuento de
células CD4 del paciente. Los métodos de análisis corrientes
calculan el recuento de células CD4 del paciente a partir de
parámetros celulares medidos en un instrumento de hematología y un
instrumento separado de citometría de flujo de fluorescencia. Este
cálculo puede proporcionar una variabilidad de hasta 100% en
recuentos absolutos de CD4 de paciente realizados en un solo
individuo con un intervalo de tiempo de una semana. Véase, por
ejemplo: Update, Testing in the Blood Bank, Volumen 5, Nº 2,
páginas 1 a 6, publicado en 1991 por Ortho Diagnóstico Systems,
Inc.
Los artículos siguientes describen dificultades
adicionales del desarrollo de recuentos de CD4 de paciente usando
métodos y dispositivos corrientes;
- \text{*}
- The Lancet, Volumen 340, 22 agosto 1992, página 485, describe una variación de los resultados del recuento de CD4 cuando se usan diferentes analizadores. La variación parece derivar de diferentes resultados del recuento de linfocitos.
- \text{*}
- Journal of Infectious Diseases, 1990, Volumen 161, páginas 356 a 357, describe variaciones en el recuento de CD4 debido a variabilidad en la concentración referida de linfocitos. La variación resultante de resultados de CD4 tiene un efecto perjudicial en la moral del paciente.
- \text{*}
- Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, 1990, Volumen 3, Nº 2, páginas 144 a 181, refiere grandes variaciones en el recuento de CD4 para sujetos VIH positivos y de control. La fracción de linfocitos positivo CD4 es relativamente constante, mientras que el recuento WBC y la fracción de WBCs que son linfocitos varían en gran medida. Esta variabilidad apunta a la necesidad de procedimientos de análisis estandarizados.
- \text{*}
- Laboratory Medicine, Agosto 1983, Volumen 14, Nº 8, páginas 509 a 514, describe numerosos resultados espurios y sus causas en analizadores hematológicos automatizados.
Una razón de la variabilidad de los recuentos de
CD4 de paciente es la preparación manual de la muestra que no se
puede controlar exactamente y depende de la competencia del
operador. Por ejemplo, un procedimiento convencional para
determinar un recuento de CD4 de paciente comienza con extraer dos
tubos de sangre de un paciente. Un tubo se analiza en un
instrumento de hematología que genera varios parámetros medidos y/o
calculados para la muestra de sangre, incluyendo un recuento total
de linfocitos del paciente, un porcentaje de linfocitos y un
recuento total de WBC del paciente. El segundo tubo de sangre se
analiza en un instrumento de citometría de flujo de fluorescencia.
Los pasos de preparación de la muestra para las pruebas de
citometría de flujo requieren mucha mano de obra y son
dependientes del operador. Estos pasos no se prestan fácilmente a
automatización y precisión.
Para preparar la muestra para el instrumento de
citometría de flujo, el operador pipeta manualmente un volumen de
sangre del tubo de muestra a un tubo de análisis. Se añade un
volumen del anticuerpo monoclonal marcado con fluorocromo deseado.
Después, se incuba la mezcla de muestra/anticuerpo durante un
tiempo predeterminado a una temperatura predeterminada para permitir
que tengan lugar las uniones anticuerpo/antígeno. Después de la
incubación, el operador añade un volumen de reactivo lisante RBC
para destruir los RBCs en la muestra. La temporización es
importante durante la etapa de lisis. Si el operador no permite que
la reacción de lisis continúe durante un tiempo suficientemente
largo, pueden permanecer RBCs en la muestra y distorsionar las
mediciones. Si el operador permite que la reacción de lisis continúe
demasiado tiempo, el reactivo lisante puede atacar a los WBCs.
Después de determinar que la reacción de lisis ha
terminado, el operador centrifuga y lava la muestra para quitar los
residuos que queden sobre los RBCs lisados. El paso de
centrifugación/lavado se puede realizar varias veces hasta que el
operador quede satisfecho de que la muestra está suficientemente
limpia. Residuos, "estroma" de glóbulos rojos, pueden
interferir con los procesos de detección del citómetro de flujo
típico. La muestra contiene ahora WBCs con anticuerpos unidos a
células que llevan los antígenos de superficie complementarios. El
operador vuelve a suspender la muestra en un volumen de fijador, y
pasa después la muestra por el instrumento de citometría de flujo de
fluorescencia.
El instrumento de citometría de flujo de
fluorescencia genera solamente valores porcentuales para
subconjuntos de linfocitos. Esto es debido al menos parcialmente al
hecho de que numerosas diluciones manuales y reducciones de volumen
realizadas durante los pasos de preparación de la muestra no
permiten el aislamiento de un volumen de medición exacto. Así, el
instrumento de citometría de flujo de fluorescencia identifica las
células T helper positivas CD4 como el porcentaje de linfocitos que
son positivo para CD3 (marcador de células T), y positivo para CD4
(marcador T helper).
Los recuentos de CD4 de paciente se calculan
después usando las ecuaciones siguientes:
(%linf/100)X(recuento WBC) =
recuento
linf
(% T helper en linf/100) x recuento linf =
recuento
CD4
El recuento linf y los recuentos de WBC de
paciente se toman del instrumento de hematología, mientras que el
valor "% células T helper en linf" se toma del instrumento de
fluorescencia después de aplicar un factor de corrección en base a
la aplicación de dispersión y fluorescencia del citómetro de
flujo.
Los métodos corrientes de calcular valores de
recuento de paciente para subconjuntos de linfocitos tienen varios
problemas. Ante todo, el cálculo se basa en valores obtenidos de
instrumentos separados, cada uno de los cuales tiene su propia
calibración y funciones generales separadas. Además, se puede usar
diferentes métodos de verificación en los diferentes
instrumentos.
No solamente son las mediciones de instrumentos
de hematología diferentes de las mediciones de instrumentos de
fluorescencia, sino que también puede haber variaciones en
resultados obtenidos de diferentes instrumentos de hematología.
Los intentos anteriores de automatizar la
preparación de la muestra en verificación de citometría de
fluorescencia solamente han tenido éxito parcial. Tales sistemas
todavía requieren que el operador realice pasos de preparación de
la muestra tal como separar los linfocitos de otras células
sanguíneas periféricas por centrifugación por gradiente de
densidad, y/o lisar glóbulos rojos, quitar glóbulos rojos fantasmas
y residuos celulares por centrifugación, o preservar la morfología
de los glóbulos blancos restantes suspendiendo los glóbulos blancos
en una solución salina isotónica conteniendo fijadores apropiados.
Estas operaciones requieren en general que el operador altere
manualmente el volumen de la muestra, poniendo así en peligro la
exactitud del volumen de la muestra que se puede lograr con
dispensadores de volumen mecánicos automáticos.
Otro problema de la técnica presente de hacer las
mediciones en instrumentos separados es que se precisa un volumen
relativamente grande de sangre del paciente para llenar dos tubos.
Éste es un problema a causa de la mayor probabilidad de que la
sangre se hemolice (se destruyan glóbulos rojos) cuando se extraen
cantidades más grandes de sangre. Además, puede no ser aconsejable
o posible extraer una cantidad suficiente de sangre de algunos
pacientes.
En análisis de leucocitos, es deseable lisar
todos los RBCs. Dado que el número de RBCs supera al de WBCs en
aproximadamente 700 a 1, un pequeño número de glóbulos rojos no
lisados puede distorsionar considerablemente los recuentos de
glóbulos blancos del paciente. Algunos reactivos usados para lisar
glóbulos rojos requieren un período de incubación demasiado largo
para ser prácticos en un analizador clínico automático. Por
ejemplo, la solución de Tris cloruro amónico tamponada recomendada
por K. A. Murihead en Clinical Cytometry, Ann.N.Y. Acd. Sci., vol.
468, pp. 113-127 (1986), tarda aproximadamente 5 a
10 minutos en lisar glóbulos rojos, lo que puede no ser práctico
para automatización.
Además, una hemólisis incompleta con algunos
reactivos líticos puede dar lugar a estroma de glóbulos rojos que
retienen suficiente hemoglobina o materia particulada para generar
altos recuentos de fondo del paciente en sistemas electro-ópticos
clínicos automáticos. Cuando esto ocurre, suele ser necesario sacar
los WBCs a analizar del estroma de glóbulos rojos por
centrifugación, un procedimiento que es un factor limitador al
adaptar un sistema de reactivo para automatización.
Algunos sistemas de reactivo actualmente usados
requieren tinción citoquímica de WBCs fijados antes del análisis
diferencial. Estos sistemas requieren la adición temporizada de
múltiples reactivos y períodos de incubación y pueden no ser
adaptables en general a cuantificar glóbulos rojos nucleados o
subconjuntos de linfocitos. Además, cada paso de adición de reactivo
u otra manipulación de una muestra de sangre puede disminuir la
precisión del recuento final obtenido del paciente.
La etapa anterior de RBC, el glóbulo rojo
nucleado, NRBC, cuando se halla en la sangre periférica en
analizadores hematológicos convencionales, se puede confundir con
un linfocito pequeño, puesto que la lisis no destruirá el núcleo
del NRBC. A causa de la relación de RBCs a WBCs, incluso un
porcentaje relativamente pequeño de NRBCs puede conducir a error
sustancial en el recuento de WBC y linfocitos. Esto puede ser
problemático en muestras de neonatos o pediátricas, en las que la
presencia de NRBCs en sangre periférica es una condición normal.
Por esta razón, el laboratorio puede hacer inspecciones manuales en
portaobjetos en algunas de estas muestras. Los analizadores
hematológicos convencionales solamente son capaces de indicar estas
muestras observando la dispersión del grupo usual de dispersión de
linfocitos. La inspección manual da lugar a un recuento del número
de NRBCs por 100 células nucleadas. Este porcentaje se usa después
para corregir los recuentos del analizador WBC de la siguiente
manera:
recuento WBC corregido = recuento del analizador
(1-porcentaje NRBC
manual/100)
Es claro que se necesita un recuento automático
exacto de NRBCs.
Otra clase importante de glóbulos rojos inmaduros
son los "reticulocitos" que contienen típicamente cantidades
detectables de ARN. Un método manual de identificar y contar
reticulocitos implica precipitar el ARN con un colorante. Se extrae
un frote de la sangre teñida y se examina manualmente al
microscopio. El ARN precipitado aparece como puntos o filamentos
intracelulares. El porcentaje de reticulocitos se determina
contando manualmente 1.000 RBCs bajo un microscopio y dividiendo
por 10 los cuantificados como reticulocitos. El recuento de
reticulocitos del paciente se deriva del recuento de RBCs del
paciente según la ecuación siguiente:
recuento de reticulocitos = (recuento de RBCs) x
(reticulocitos por
ciento)/100
Tanto la precisión como la exactitud de este
método manual son inferiores a las deseables. Puede haber
considerable variación de identificación de reticulocitos así como
variación de las técnicas de recuento.
La presente invención proporciona un método para
preparar una solución hecha de un primer volumen predeterminado de
un primer fluido y un segundo volumen predeterminado de un segundo
fluido, incluyendo el método los pasos de:
a) poner en funcionamiento un calentador unido a
una primera carcasa y móvil con la primera carcasa para recibir el
primer fluido y el segundo fluido para aplicar energía térmica a la
primera carcasa, estando conectada la primera carcasa
operativamente con y dispuesta sustancialmente dentro de una segunda
carcasa;
b) introducir el segundo volumen predeterminado
del segundo fluido en la primera carcasa;
c) hacer vibrar la primera carcasa con un motor
principal para mover el segundo volumen predeterminado del segundo
fluido en la primera carcasa durante un primer período de tiempo
predeterminado mientras la segunda carcasa permanece
sustancialmente estacionaria con respecto al motor principal;
d) introducir el primer volumen predeterminado
del primer fluido en la primera carcasa;
e) hacer vibrar la primera carcasa con el motor
principal para mover el primer volumen predeterminado del primer
fluido y el segundo volumen predeterminado de segundo fluido en la
primera carcasa durante un segundo período de tiempo predeterminado
para hacer la solución mientras la segunda carcasa permanece
sustancialmente estacionaria con respecto al motor principal; y
f) sacar de la primera carcasa la solución hecha
del primer volumen predeterminado del primer fluido y el segundo
volumen predeterminado de segundo fluido.
Otras realizaciones de la invención se definen en
las reivindicaciones dependientes 2-10.
También se describe un dispositivo para analizar
una muestra de sangre entera.
El dispositivo, un sistema de instrumentos
automatizado para distinguir y diferenciar células en una muestra,
incluye un analizador hematológico convencional completamente
integrado con un analizador de citometría de fluorescencia. Ambos
analizadores son controlados por un controlador que utiliza los
resultados obtenidos de cada analizador para referir resultados de
la prueba en términos absolutos o cuantitativos. También se
facilitan métodos para analizar una muestra de sangre entera. Un
método incluye los pasos de realizar automáticamente tanto análisis
de hematología convencional como de citometría de fluorescencia en
una muestra. Se recogen y se utilizan datos y se refiere un
resultado cuantitativo cuando es apropiado.
También se describe un sistema de instrumento
automatizado, que incluye un manipulador de muestras para recibir un
recipiente de muestra y aspirar y dispensar la muestra, un
analizador de muestra que realiza tanto dispersión multi-ángulo de
luz como detección de señal de fluorescencia, y un controlador que
integra completamente el analizador para permitir que el sistema de
instrumentos refiera resultados cuantitativos de los resultados
hematológicos convencionales y citométricos de fluorescencia. Este
sistema de instrumentos es capaz además de efectuar estas
funciones, secuencialmente si es necesario, sin ninguna
intervención del operador del instrumento una vez que el operador ha
seleccionado una serie de pruebas a realizar por el instrumento de
un menú presentado al operador, y sin separar células de la muestra
durante ninguna fase de los análisis.
La figura 1 es un diagrama de bloques de un
sistema analítico celular.
La figura 2 es un diagrama de bloques de un
subsistema de software usado con el sistema analítico celular
mostrado en la figura 1.
La figura 3 ilustra una zona de procesado de
muestras del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 4 es un diagrama más detallado de la
zona de procesado de muestras representada en la figura 3.
La figura 4A es una vista en alzado frontal de un
conjunto de ventilación/aspiración del sistema representado en la
figura 4.
La figura 4B es una vista en perspectiva de un
conjunto de sonda de incubación utilizado en el sistema de la
figura 4.
La figura 5 ilustra un sistema de distribución de
fluido del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 6A, 6B y 6C ilustran la sonda de
incubación del sistema analítico celular durante la deposición,
limpieza y aspiración.
La figura 7 es un diagrama que ilustra un sistema
de aspiración y deposición del sistema analítico celular mostrado
en la figura 1.
La figura 8 es un diagrama que ilustra un sistema
de transferencia de incubación del sistema analítico celular
mostrado en la figura 1.
La figura 9 es un diagrama que ilustra un sistema
de administración de colorante de reticulocito del sistema
analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 10A es un diagrama que ilustra un
sistema de administración de muestra de impedancia del sistema
analítico celular mostrado en la figura 1. En esta vista, las
válvulas están abiertas, y la muestra se está transfiriendo a
granel a la proximidad del transductor de impedancia mediante la
bomba 220.
La figura 10B es un diagrama del sistema de
administración de muestra de impedancia representado en la figura
10A. En esta vista, las válvulas están cerradas, y se está
dosificando un volumen de la muestra al transductor de
impedancia.
La figura 11A es un diagrama que ilustra un
sistema óptico de administración de muestra del sistema analítico
celular mostrado en la figura 1. En esta vista, las válvulas están
abiertas, y la muestra se está transfiriendo a granel a la
proximidad de la celda de flujo mediante la bomba 232.
La figura 11A es un diagrama del sistema óptico
de administración de muestra representado en la figura 11A. En esta
vista, las válvulas están cerradas, y un volumen de la muestra está
siendo dosificado al transductor de celda de flujo óptico.
La figura 12 es un diagrama que ilustra un
sistema de administración de muestras HGB del sistema analítico
celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 13A-13F son diagramas
de temporización que ilustran un método integrado, automático, de
procesado de muestras de hematología/inmunología del sistema
analítico celular mostrado en la figura 1.
Las figuras 14A y 14B son ilustraciones de
reticulocitos aislados como se describe en la sección 4
siguiente.
La figura 15 es un diagrama que ilustra un
transductor de celda de flujo óptico del sistema analítico celular
mostrado en la figura 1.
La figura 16 es una vista en sección de la celda
de flujo óptico representada en la figura 15.
La figura 17 es un diagrama que ilustra un
transductor de impedancia del sistema analítico celular de la
figura 1.
La figura 18 es un diagrama que ilustra un
transductor HGB del sistema analítico celular mostrado en la figura
1.
La figura 19 es un diagrama que ilustra un banco
óptico del sistema analítico celular mostrado en la figura 1.
La figura 20 es un diagrama que ilustra el
sistema de recogida de recorrido directo del banco óptico
representado en la figura 19.
La figura 21 es un diagrama que ilustra el
sistema de recogida de dispersión lateral del banco óptico
representado en la figura 19.
La figura 22 es un diagrama del condensador del
banco óptico representado en la figura 19.
La figura 23 es un diagrama del ventilador de
rayos de la celda de flujo al cátodo del banco óptico representado
en la figura 19.
La figura 24 es un diagrama del conjunto de
lentes PMT del banco óptico representado en la figura 19.
La figura 25 es un diagrama de bloques que
ilustra el módulo analizador del sistema analítico celular mostrado
en la figura 1.
La figura 26 es un diagrama de bloques que
ilustra el módulo de adquisición de datos representado en la figura
25.
La figura 27 es un diagrama de bloques que
ilustra otros detalles del módulo analizador representado en la
figura 25.
La figura 28 es un diagrama que ilustra los
depósitos de datos del sistema analítico celular mostrado en la
figura 1.
Las figuras 29 y 30 son diagramas de estado que
ilustran la arquitectura de software representada en la figura
28.
La figura 31 es una vista genérica en alzado de
un aparato conteniendo una boquilla para introducir un fluido.
La figura 32 es una vista en perspectiva de la
boquilla de la figura 31.
La figura 33 es una vista en sección de una
porción de la boquilla de la figura 32, estando dispuestos los
conductos representados en la figura 32 mutuamente paralelos para
claridad.
La figura 34 es una vista en sección de una
porción de la boquilla de la figura 32 ilustrando la introducción
de fluido.
La figura 35 es una vista en sección
sustancialmente similar a la de la figura 34 ilustrando la
introducción de fluido.
La figura 36 es una vista en sección
sustancialmente similar a la de la figura 35 ilustrando la
introducción de fluido.
La figura 37 es un diagrama esquemático de un
aparato de preparación de muestras.
La figura 38 es una vista parcialmente cortada de
una porción del aparato de la figura 37.
La figura 39 es una vista parcialmente cortada de
otra porción del aparato de la figura 37.
Las figuras 40A-40C ilustran
datos visualizados para NRBC obtenidos por el sistema analítico
celular.
Las figuras 41A y 41B ilustran datos visualizados
para NRBC obtenidos por el sistema analítico celular.
La figura 42 es un diagrama esquemático de
bloques del circuito de triple disparo descrito en la sección 2
siguiente.
La figura 43 es una ilustración de las
configuraciones e interacciones del haz láser y corriente de
flujo.
Las figuras 44A-44F son vistas en
alzado lateral de porciones del sistema analítico celular de la
figura 1.
Las figuras 45A-45F ilustran
datos visualizados obtenidos por el sistema analítico celular.
La figura 46 muestra un histograma de volumen de
RBC obtenido con el sistema analítico celular.
Las figuras 47 y 48 son ilustraciones de
diagramas de dispersión de plaquetas obtenidos con el sistema
analítico celular.
Las figuras 49A y 49B ilustran divisiones de
eventos detectadas por el sistema analítico celular.
Las figuras 50A y 50B muestran valores ALL de
células FL3 altas detectados por el sistema analítico celular.
Las figuras 51A y 51B son ejemplos de una línea
divisoria trazada con el sistema analítico celular entre
granulocitos y células mononucleares.
Las figuras 52A y 52B muestran ejemplos de un
histograma y línea divisoria angular formados por el sistema
analítico celular.
La figura 53 ilustra un ejemplo de un histograma
ALL y líneas divisorias obtenidas con el sistema analítico
celular.
La figura 54 ilustra una división trazada a un
valor igual a la media de valores IAS más 2,5 veces una desviación
estándar de los valores IAS por el sistema analítico celular.
La figura 55 muestra una división trazada entre
1/4 y 3/4 de la distancia de líneas de separación de
linfocito-estroma y
linfocito-monocito formadas por el sistema
analítico celular.
La figura 56 presenta un histograma y una línea
divisoria generada por el sistema analítico celular.
La figura 57 presenta otro histograma y una línea
divisoria generada por el sistema analítico celular.
La figura 58 ilustra un ejemplo de un diagrama de
dispersión de reticulocitos trazado por el sistema analítico
celular.
La figura 59 muestra un ejemplo de histograma de
reticulocitos trazado por el sistema analítico celular.
Las figuras 60A-60F ilustran un
ejemplo de procesado de datos como se describe en el Ejemplo 6.
Las figuras 61A-61G ilustran
ilustraciones de datos acumulados por el sistema analítico
celular.
Y las figuras 62A-62D ilustran
una correlación entre fracciones de linfocitos que son positivos
para CD3 y CD4, positivos para CD3 y CD8, positivos para CD19, y
positivos para CD3 solo.
Las figuras 63A-63F son tablas
que ilustran válvulas y funciones de válvula descritas en la
sección 13F.
En general, un sistema de instrumentos analíticos
automáticos para analizar muestras de fluido incluye un analizador
hematológico convencional completamente integrado con un
controlador y un citómetro fluorescente. El sistema de instrumentos
es capaz de distinguir y clasificar células, por lo que los datos
recogidos por el analizador hematológico son utilizados
automáticamente por el citómetro fluorescente para procesar
muestras, analizar muestras y clasificar células dentro de la
muestra y referir resultados cuantitativos así como
cualitativos.
El sistema de instrumentos automatizado aquí
descrito combina o integra hematología convencional con citometría
fluorescente en una sola plataforma analizadora. Hasta ahora, este
acercamiento no ha sido posible. Ambos métodos se benefician de
esta combinación única. La información de fluorescencia se mejora
con la automatización total y las concentraciones absolutas. La
información hematológica se mejora añadiendo citometría de
fluorescencia a la tecnología de colorimetría, impedancia, y
dispersión de luz multi-ángulo, permitiendo excelente hematología y
automatización total de pruebas que actualmente se realizan
manualmente, o en analizadores separados y distintos.
A los efectos de esta descripción, la
automatización se distingue porque el operador no tiene que
intervenir en el proceso de preparación de la muestra o análisis de
la muestra, una vez que la muestra, es decir, sangre entera, orina,
saliva, etc, ha sido presentada al instrumento. Además, todos los
pasos y funciones de manejo, procesado y análisis de la muestra los
realiza automáticamente el instrumento en base a las pruebas
seleccionadas por el operador. Todos los datos y demás información
perteneciente a cada muestra de prueba inicial son monitoreados,
recogidos y procesados por el controlador de instrumento.
Un analizador hematológico automático y un
analizador de citometría de flujo se integran con un controlador
que verifica y controla los analizadores, recoge datos de los
analizadores y refiere un resultado. Como ilustración a modo de
ejemplo, la integración de los analizadores con un controlador
permite al operador introducir datos acerca de una muestra de
sangre entera en el controlador. El operador selecciona una serie
de pruebas a realizar en la muestra, en general sangre entera, con
la ayuda del controlador. El operador presenta toda la muestra de
sangre a los analizadores integrados en una zona centralizada de
manejo o procesado de muestra. El controlador activa los
analizadores, dejando que los analizadores realicen automáticamente
análisis en la muestra de sangre entera bajo la dirección del
controlador. El controlador utiliza datos obtenidos de los
analizadores para formular un resultado. El controlador refiere el
resultado al operador. Se ha de notar que no se necesita ninguna
acción del operador después de que la muestra de sangre entera ha
sido presentada a los analizadores integrados. Dado que la
preparación de la muestra de sangre entera está totalmente
automatizada, en una realización preferida, primero se realizan
pruebas hematológicas convencionales, siguiendo las pruebas de
muestra incubada. Dado que los analizadores están integrados con el
controlador, el controlador obtiene datos del analizador
hematológico y el analizador de citometría de flujo. Así, el
controlador es capaz de referir al operador un análisis combinado
de sangre del paciente. Además, las concentraciones absolutas son
referibles a causa de la precisión y repetibilidad de dilución,
preparación de células y análisis automatizados. Se ha eliminado
todo error humano porque el sistema de instrumentos es lo único que
toca la muestra una vez que el operador ha programado el
instrumento y colocado la muestra a bordo.
Aunque se explicará con detalle realizaciones
específicas de la invención para esclarecer la comprensión, se ha
de recordar que también son posibles otras realizaciones. También
es posible cualquier combinación deseable de elementos de las
realizaciones descritas.
La figura 1 es un diagrama de bloques de un
sistema analítico celular 60. El sistema 60 incluye un módulo
analizador 64, un módulo de estación de datos 68, y una unidad
neumática 72. El módulo analizador 64 está conectado operativamente
al módulo de estación de datos 68 por un enlace serie de datos 76
que implementa un protocolo HDLC (enlace de datos de alto nivel). La
unidad neumática 72 está conectada operativamente al módulo
analizador 64 por un enlace serie de datos 84 y una red de tubos
80.
El módulo analizador 64 aspira muestras,
diluyente y reactivos, diluye muestras, mide y recoge datos,
transmite datos medidos al módulo de estación de datos 68, gestiona
reactivos, y desecha residuos. Un módulo analizador ejemplar 64
incluye su propia fuente de alimentación, transductor de impedancia,
transductor HGB, celda de flujo óptico/transductor (dispersión de
luz y fluorescencia), detectores ópticos, circuitos electrónicos,
depósitos de reactivo, sistema fluídico, procesador de muestras
integrado y totalmente automatizado para pruebas tanto de
hematología como de citometría fluorescente, y los sistemas
necesarios de incubación y/o enfriamiento. Un módulo analizador
ejemplar incluye un microordenador Motorola tipo 68302 que controla
los componentes mecánicos del analizador 64 y ejecuta las secuencias
de flujo del analizador.
La unidad neumática 72 aloja fuentes neumáticas
para mover fluidos a través del módulo analizador 64. La unidad
neumática 72 recibe instrucciones del módulo analizador 64 mediante
dicho enlace serie de datos 84.
El módulo de estación de datos 68 proporciona
controles generales al módulo analizador 64, convierte los datos
medidos en resultados de prueba significativos, guarda los datos
medidos y los resultados de prueba, imprime informes, y proporciona
comunicación bidireccional con un ordenador central fuera de línea
(no representado). Un módulo ejemplar de estación de datos 68
incluye un microordenador de tipo 80386 ó 80486, pantalla en color,
unidad de disco de 3 1/2 pulgadas, disco duro de al menos 540
megabytes, teclado tipo PC, puntero, y conexiones LAN. La estación
de datos 68 incluye memoria, tal como una RAM, una ROM, una EPROM,
una SRAM y análogos, que tienen suficientes algoritmos de software
para manipular datos medidos, calcular parámetros, y visualizar
resultados en varios formatos, incluyendo histogramas, diagramas de
dispersión, y otros gráficos multidimensionales.
El sistema analítico celular 60 utiliza un
sistema de reactivo multipropósito adecuado para el análisis rápido
de células de sangre periférica nucleadas, incluyendo glóbulos
blancos ("WBC") y glóbulos rojos nucleados ("NRBC"). El
sistema de reactivo multipropósito puede lisar de forma
sustancialmente completa y rápida glóbulos rojos, conservando al
mismo tiempo sustancialmente la morfología de los glóbulos blancos
y la antigenicidad de antígenos de superficie de linfocitos.
El sistema de reactivo multipropósito se describe
plenamente en una Patente de Estados Unidos 5516695 titulada
"Sistema de reactivo multipropósito para lisis rápida de muestras
de sangre entera", presentada el 29 de agosto de 1994 y
propiedad del cesionario de la presente solicitud.
Una realización del sistema de reactivo
multipropósito incluye desde aproximadamente 3 a aproximadamente 7
gramos por litro de una sal de amonio no cuaternario, desde
aproximadamente 0,04 a aproximadamente 0,1% en peso en volumen (es
decir, gramos por 100 ml) de un aldehído alifático con uno a cuatro
carbonos, desde aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM de una
solución tampón no fosfato que es sustancialmente inerte al
aldehído alifático, y agua. El pH del sistema de reactivo está
dentro de un rango de pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente
7,5 y la osmolaridad del sistema de reactivo es entre
aproximadamente 160 y 310 (mOsm/L). El índice de refracción del
sistema de reactivo puede ser similar al de la salina y deberá
estar preferiblemente dentro del rango de aproximadamente 1,333 a
aproximadamente 1,336. La solución tampón no fosfato es inerte al
aldehído alifático en el que la solución tampón no fosfato no
reaccionará con el aldehído alifático. Así, en general, la solución
tampón no fosfato no deberá contener un grupo amino primario.
Otra realización del sistema de reactivo
multipropósito incluye aproximadamente 135 mm de cloruro de amonio,
aproximadamente 0,075% por volumen de formaldehído, aproximadamente
20 mM de solución tampón acetato, aproximadamente 10 mM de
bicarbonato potásico, y aproximadamente 0,01% en peso en volumen
(es decir, gramos por 100 ml) de saponina y análogos. El pH del
sistema de reactivo se regula a aproximadamente pH 6,2 y la
osmolaridad del sistema de reactivo es desde aproximadamente 267 a
270 mOsm/L.
El sistema de reactivo multipropósito se utiliza
en la determinación automática de recuentos diferenciales de
glóbulos blancos del paciente, glóbulos rojos nucleados, y
inmunofenotipificación del linfocito. Un método para el análisis
rápido de células nucleadas de sangre periférica entera incluye los
pasos siguientes: mezclar el sistema de reactivo multipropósito
descrito con una muestra de sangre entera anticoagulada (por lo que
la sangre se diluye de 10 a 100 veces), mezclar la mezcla de
diluyente-sangre a temperaturas desde
aproximadamente 25ºC a 46ºC durante al menos aproximadamente 10
segundos, y analizar las células sanguíneas periféricas nucleadas
con el sistema analítico celular automatizado.
Un método de usar el sistema de reactivo
multipropósito en el análisis diferencial de glóbulos blancos
periféricos es un método rápido de reactivo único de lisar
simultáneamente glóbulos rojos y fijar glóbulos blancos, donde los
glóbulos blancos mantienen sus características de dispersión de luz.
En general, las células fluyen a través de una cámara de visión
óptica donde un proceso de medición fotoeléctrico registra la luz
absorbida o el tipo de luz dispersada por cada célula en ángulos
seleccionados.
Un primer ingrediente del sistema de reactivo
multipropósito es una sal de amonio no cuaternario.
Preferiblemente, no se deberá usar sales de di- ni
tri-amonio. Se puede usar varias sales de
monoamonio, en particular las sales halogenadas, desde
aproximadamente tres a aproximadamente siete gramos por litro, y
preferiblemente a aproximadamente 5 gramos por litro. Los ejemplos
de tales sales de amonio no cuaternario incluyen NH_{4}X, donde X
es un halógeno. Dicha sal de amonio no cuaternario es
NH_{4}CI.
Un segundo ingrediente del sistema de reactivo
multipropósito es un aldehído alifático de cadena corta.
Preferiblemente, tales aldehídos alifáticos tienen de uno a cuatro
carbonos. Los aldehídos ejemplares incluyen formaldehído y el
polímero paraformaldehído. En relaciones y concentraciones
apropiadas, el aldehído, en unión con la sal de monoamonio no
cuaternario, y la solución tampón, lisará rápidamente y de forma
sustancialmente completa glóbulos rojos. Además, el aldehído fijará
glóbulos blancos y conservará sustancialmente la integridad de su
membrana. El formaldehído, o aldehído comparable, está presente en
cantidades desde aproximadamente 0,04% a aproximadamente 0,10% en
volumen, y preferiblemente desde aproximadamente 0,08% a
aproximadamente 0,1% en volumen.
Un tercer ingrediente del sistema de reactivo
multipropósito es una solución tampón no fosfato que es
sustancialmente inerte al componente aldehído del sistema de
reactivo. Así, la solución tampón no debe contener un grupo amino
primario. La solución tampón también deberá tener una capacidad
tampón efectiva entre un pH de aproximadamente 6,0 a
aproximadamente 7,5, y una osmolaridad de aproximadamente 230 a
aproximadamente 310 mOsm/L. Los ejemplos de soluciones tampón
orgánicas efectivas son solución tampón de acetato, solución tampón
de succinato, solución tampón de maleato, y solución tampón de
citrato. Los ejemplos de soluciones tampón biológicas efectivas son
solución tampón de ácido 2-(N-morfolina) etano
sulfónico (MES), solución tampón de ácido
3-(N-morfolina) propano sulfónico (MOPS), y solución
tampón de ácido N-(2-hidroxietil)
piperazina-N'-(2-etano sulfónico)
HEPES. Un acetato, u otra solución tampón adecuada, estará presente
en cantidades desde concentraciones de aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 20 mM, y preferiblemente a una concentración de
aproximadamente 20 mM.
Un componente opcional del diluyente de sangre
multipropósito es un reactivo tensioactivo. El agente tensioactivo
preferido es saponina, un extracto vegetal que está disponible en
un polvo de calidad comercial aislado de corteza de quillaja así
como otras fuentes. Aunque la pureza química de la saponina
comercial varía de un lote a otro, es más selectiva hacia glóbulos
rojos que son las sales de amonio cuaternario. La saponina, u otro
reactivo tensioactivo, está presente en cantidades de desde
aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg/l, y preferiblemente a
aproximadamente 100 mg/l. La saponina, en concierto con los otros
ingredientes del sistema de reactivo multipropósito, lisa de forma
sustancialmente completa los glóbulos rojos presentes en sangre
entera.
La fracción de eritrocito (es decir, glóbulos
rojos) de muestras de sangre normales se lisará normalmente dentro
de aproximadamente 20 segundos a temperaturas ambiente. Sin
embargo, las muestras de sangre difíciles de lisar (tales como
muestras de sangre de bebés, pacientes con diálisis de riñón,
pacientes con mieloma múltiple, diabéticos, o pacientes con uremia,
por ejemplo) requieren incubar la sangre con el sistema de reactivo
a temperaturas de aproximadamente 38ºC a aproximadamente 40ºC
durante hasta aproximadamente 20 segundos para lisis completa del
eritrocito. La incubación de muestras de sangre con el sistema de
reactivo multipropósito, incluso a estas temperaturas ligeramente
elevadas, preserva efectivamente la integridad de la membrana de los
glóbulos blancos y retiene la antigenicidad de los antígenos de
superficie de linfocitos. En contraposición, si se utiliza saponina
por sí misma para lisar los glóbulos rojos, se debería usar a una
concentración de aproximadamente 10 a 20 veces más alta que las
explicadas anteriormente. Tales concentraciones pueden poner en
peligro la integridad de los glóbulos blancos y requerir un
enfriamiento rápido de la actividad lítica del reactivo para
preservar la morfología de los glóbulos blancos. Una ventaja de las
realizaciones de este sistema de reactivo es que los constituyentes
combinados del sistema de reactivo multipropósito sirven para fijar
suavemente los glóbulos blancos al mismo tiempo que se lisan los
glóbulos rojos. Por lo tanto, la integridad de los glóbulos blancos
se preserva sustancialmente incluso en períodos de incubación
relativamente largos. De hecho, incluso los glóbulos blancos
frágiles, tal como los vistos en pacientes de leucemia linfocítica
crónica, se estabilizan en el sistema de reactivo multipropósito
durante períodos de incubación de hasta aproximadamente 20
minutos.
Un ingrediente opcional adicional del sistema de
reactivo multipropósito es una sal álcali, preferiblemente una sal
álcali monovalente de bicarbonato. Aunque una sal álcali
monovalente de bicarbonato no es un componente esencial del
diluyente, se puede añadir al diluyente para elevar su osmolaridad
sin reducir la lisabilidad de los glóbulos rojos del sistema de
reactivo. Otros muchos compuestos, tal como cloruro sódico, cloruro
de potasio o solución tampón de fosfato, disminuyen la lisabilidad
del sistema de reactivo cuando se utilizan para incrementar la
osmolaridad del sistema de reactivo. Sales álcali monovalentes
ejemplares de bicarbonato son bicarbonato potásico, bicarbonato
sódico, bicarbonato de litio y análogos. El bicarbonato potásico, u
otra sal álcali de bicarbonato, puede estar presente en cantidades
de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,015% en peso en
volumen, y preferiblemente a aproximadamente 0,01% en peso en
volumen.
Otro ingrediente opcional del sistema de reactivo
multipropósito es un agente anticoagulación de plaquetas. Por
ejemplo, se puede añadir un etilendiaminetetraacetato (EDTA) sal al
sistema de reactivo para reducir la agregación de plaquetas en la
mezcla de muestra/reactivo. EDTA tetrasódico, u otra EDTA sal, está
presente en cantidades desde aproximadamente 20 a aproximadamente
200 mgs por litro y preferiblemente a aproximadamente 100 mgs por
litro.
Otra realización del sistema de reactivo
multipropósito permite el análisis cuantitativo de subpoblaciones
de linfocitos. La subclasificación de linfocitos se logra mezclando
anticuerpos monoclonales fluorocromo-conjugados
(dirigidos a antígenos específicos de superficie de linfocitos) con
muestras de sangre entera antes de añadir el sistema de reactivo
multipropósito, o diluyente de sangre. La concentración de
fracciones de anticuerpo marcadas añadidas a una muestra de sangre
depende de la preparación de anticuerpos individuales, pero es
comúnmente de aproximadamente la mitad a una décima parte del
volumen de la sangre para preparados de anticuerpos comerciales.
Después de añadir el sistema de reactivo y lisar los glóbulos
rojos, los productos de reacción
linfocito-anticuerpo se pueden analizar en un
sistema de citometría de flujo automatizado. No hay que
"separar" los linfocitos de las células lisadas por
centrifugación y lavado como es común en la técnica.
El sistema de reactivo descrito no "enfría"
los marcadores fluorescentes, tal como isotiocianato de
fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE), que se utilizan para
anticuerpos marcados con fluorocromo. La subclasificación de
linfocitos es una herramienta de diagnóstico en la lucha contra
muchas enfermedades, tal como SIDA. La capacidad de identificar
marcadores superficiales en poblaciones de células sanguíneas puede
ser importante cuando se une al conocimiento de los componentes de
superficie y las características de subpoblaciones de linfocitos y
otras fracciones de glóbulos blancos tal como monocitos y
neutrófilos.
El sistema analítico celular 60 utiliza un método
automático para análisis simultáneo de WBC/Dif y NRBC en una
muestra de sangre entera usando un método único de disparo triple
con reactivo lisante; tal como el sistema de reactivo de lisis
rápida descrito anteriormente. Este método, reivindicado en U.S.
5.559.037, titulada "Método para análisis rápido y simultáneo de
glóbulos rojos nucleados", y presentada el 15 de diciembre de
1994 permite los recuentos NRBL exactos y datos WBC/Dif,
simultáneamente de una muestra de sangre entera conteniendo
NRBC.
Un aspecto importante del método NRBC es que las
señales de residuos (tanto fluorescentes como no fluorescentes) se
bloquean por el método de disparo triple y las señales que caen por
debajo del disparo ALL pero por encima del disparo FL3 se pueden
identificar y contar como NRBC. Por lo tanto, se obtienen recuentos
exactos de NRBC, esencialmente libres de contaminación de residuos
nucleares fluorescentes. También se puede detectar blastos frágiles
y células muertas (no viables).
En el método de disparo triple, es posible contar
con precisión simultáneamente WBC/Dif y NRBC mezclando la muestra
de sangre con un diluyente de sangre que lisa rápidamente RBC y
preserva WBC, y al que se ha añadido un colorante nuclear adecuado
que teñirá núcleos desnudos de los NRBC. Tal diluyente se describe
anteriormente. La mezcla de diluyente/muestra se pasa después,
esencialmente una célula cada vez por una celda de flujo óptico
iluminada. Esto hace que las células dispersen la luz iluminante y
que los núcleos teñidos presentes fluorescan. Las señales de luz
dispersada y fluorescente son detectadas por medios conocidos y,
utilizando el método de disparo triple en unión con el procesado de
las señales detectadas, es posible identificar y cuantificar WBC,
WBC/Dif y NRBC.
El método de disparo triple es único porque el
análisis simultáneo de WBC/Dif/NRBC se puede llevar a cabo
automáticamente, con exactitud, y rápidamente sin interferencia de
otros residuos celulares tales como ARN de reticulocitos lisados,
cuerpos de Howell Jolly, plaquetas reticuladas, plaquetas gigantes,
ADN de WBC y fragmentos megacariocíticos, parásitos, y fragmentos
RBC.
El método de disparo triple también permite el
análisis exacto de WBC/Dif en una muestra de sangre que contiene
NRBC restando señales identificada como NRBC de las señales WBC
totales antes de realizar análisis WBC/Dif. Solamente se necesita
un colorante para tinción de NRBC y el análisis WBC/Dif se puede
realizar por la diferencia de las características de dispersión de
luz de las subclases de WBC.
El método NRBC logra todos los objetivos
descritos anteriormente por un método único de disparo triple en el
espacio tridimensional de Pérdida de Luz Axial (ALL), Ángulo de
Dispersión Intermedio (IAS) y Fluorescencia Roja (FL3).
Para realizarlo, se colocan preferiblemente uno o
varios detectores 380 (figuras 19, 20 y 21) en el recorrido directo
de luz para medir la dispersión directa de ángulo intermedio (IAS)
384 y la dispersión directa de ángulo pequeño (SAS) o pérdida de
luz axial (ALL, también denominada extinción directa) 382.
ALL es generalmente la disminución de energía
luminosa debido a una célula que pasa delante de un haz láser y que
se detecta por un fotodiodo. La pérdida de luz se debe generalmente
a dispersión y se define como la disminución de energía luminosa
que llega a un detector en el recorrido de un haz láser debido al
paso de una célula a través de dicho haz (en general ALL se detecta
en un ángulo de desde aproximadamente 0º a aproximadamente 1º). En
contraposición, la dispersión directa de ángulo pequeño (SAS) es
energía luminosa que llega a un detector fuera de (pero dentro de
un ángulo estrecho de aproximadamente 1º a 3º) el haz láser
incidente debido a dispersión de una célula que pasa por el haz. Se
dispone generalmente un tope de haz para evitar que el haz láser
llegue al detector. Los sistemas de medición ALL recogen luz dentro
del cono incidente de iluminación láser, mientras que los sistemas
de dispersión de ángulo pequeño recogen luz fuera de este cono. En
los sistemas de medición ALL, la señal de interés es una señal
negativa restada de la señal láser de régimen constante, mientras
que en la medición de dispersión directa de ángulo pequeño la señal
es una pequeña señal positiva impuesta a un nivel de luz de fondo
muy bajo. La dispersión directa de ángulo intermedio (IAS) es
similar a la dispersión directa de ángulo pequeño, a excepción de
que la luz se dispersa en un ángulo más grande del haz láser
incidente. Más específicamente, IAS se refiere a luz dispersada en
un aro entre aproximadamente 3º y 10º lejos de la línea incidente o
central de un haz láser. En una realización preferida, ALL se
recoge en los ángulos inferiores a aproximadamente 0,3º
horizontalmente e inferiores a aproximadamente 1,2º verticalmente
del eje del láser, y AS se recoge a ángulos entre aproximadamente
3º y 10º del eje del láser.
Otra ventaja técnica del sistema descrito es que
requiere mucha menos concentración del colorante para teñir efectiva
y rápidamente NRBC para detección y recuento exactos a causa de que
la lisis completa del citoplasma de NRBC hace sus núcleos más
accesibles al colorante. Esta condición permite una relación alta
de señal a ruido (S/N), superior a 100, en detección NRBC. La
concentración de un colorante vital requerido en este sistema para
realizar rápidamente el análisis simultáneo de WBC/Dif/NRBC es
solamente 1 a 2 \mug/ml que es al menos 50 veces menos que en la
técnica anterior.
Los colorantes vitales (colorantes nucleares que
tiñen solamente células muertas o dañadas) que se puede usar,
pueden ser cualquier colorante vital con coeficiente de extinción
relativamente alto y baja intensidad de fluorescencia cuando no
están unidos a ácido nucleico. Las características espectrales, es
decir, Extinción (EX) max. (nm)/Emisión (EM) max. (nm), de los
colorantes vitales deben ser compatibles con la fuente de luz láser
utilizada en el sistema.
Son deseables las características siguientes de
los colorantes vitales para el sistema descrito:
Alto coeficiente de extinción.
Alto rendimiento cuántico.
Alta afinidad de unión a ácido nucleico.
Baja fluorescencia cuando no se une a ácido
nucleico.
Compatibilidad de características espectrales de
la fuente de luz (por ejemplo, EX max.-488 nm y EM max. - 630 nm
con una fuente de luz láser de argón).
Son varios los colorantes nucleares cualificados
para uso en el sistema descrito con fuente de luz apropiada.
Algunos de los colorantes comercializados que se puede usar en el
sistema descrito son YOYO-1, YOYO-3,
TOTO-1, TOTO-3, BO-
PRO-1, YO-PRO-1,
TO-PRO-1, y muchos más. Los expertos
en la técnica saben que los colorantes con diferente EX max pueden
ser excitados con una fuente de luz apropiada tal como lámparas de
He-Ne, xenón o mercurio.
Los colorantes que se puede usar con un láser de
argón también comercializados son yoduro de propidio (PI), bromuro
de etidio (EBr), homodímero de etidio-1
(EthD-1), homodímero de etidio-2
(EthD-2) o dietilen triamina (DTA).
En una aplicación del método NRBC, el colorante
vital usado es PI.
Una porción de una muestra de sangre entera,
aproximadamente 25 microlitros, se deposita por medio de una sonda
de aspiración de muestra en la copa WBC 138 que contiene
aproximadamente 850 microlitros de un reactivo lisante isotónico.
Se utiliza un reactivo lisante antes descrito para lisar la fracción
de eritrocito de la muestra de sangre y para lisar el citoplasma de
NRBC para exponer los núcleos de NRBC presente. Este sistema de
reactivo se caracteriza porque realiza un proceso de un reactivo/un
paso que logra finalidades multipropósito. Este reactivo es
suficientemente suave para preservar la morfología de todos los
glóbulos blancos frágiles, y al mismo tiempo lisar eficientemente
todos los glóbulos rojos. Estas dos finalidades se realizan incluso
en muestras hemaglobinofáticas, que pueden requerir que se prolongue
el tiempo de lisis.
Sin que importe la formulación del reactivo
lisante utilizado con el método de triple disparo, el reactivo
contendrá además, o se combinará con, una concentración pequeña de
un colorante nuclear vital que marque efectivamente los NRBC que
puedan estar presentes en la sangre periférica. Preferiblemente,
para uso con el analizador aquí referenciado, la química de la
lisis se configurará de tal manera que el índice de refracción
coincida con el de una solución envolvente sustancialmente a menos
de 0,1%.
La mezcla de reactivo lisante y muestra
permanecerá normalmente en la copa WBC 138 solamente durante
aproximadamente 11 segundos. Allí se lisa y mezcla a 42ºC \pm3ºC.
En este punto, se pipeta el contenido de la copa WBC directamente a
una celda de flujo óptico 170 para detección.
El proceso de medición comienza cuando la
corriente de células pasa a través de la celda de flujo 170, que ha
sido diluido con la adición de lisis de manera que las células
pasen por la fila única de volumen iluminada por láser, en una
corriente de muestra de flujo laminar rodeada por diluyente/solución
envolvente.
En este punto la presencia de una célula es
detectada por un fotodiodo compuesto 380 que detecta pérdida de luz
axial (ALL) y dispersión de ángulo intermedio (IAS), tubo
fotomultiplicador que detecta fluorescencia roja, y un circuito
único de disparo triple, representado en la figura 2, en el espacio
tridimensional de características de ALL, IAS, y FL3 (fluorescencia
roja). El circuito de disparo triple cualifica señales para
digitalización usando lógica Y/O. Una señal cualificada debe ser
mayor que el disparo IAS, mientras que al mismo tiempo debe ser
mayor que el disparo ALL o el disparo FL3. La combinación de este
circuito único de disparo, y las propiedades lisantes que incluyen
un fijador equilibrado, permiten que los núcleos NRBC expuestos se
tiñan rápidamente, y sean contados claramente y sin ambigüedad y
excluidos del recuento celular diferencial WBC sin la interferencia
usual de fondo, tanto fluorescente como no fluorescente, tal como
fragmentos de ADN, estroma de RBC, y plaquetas.
Cuando las células, así disparadas, pasan por
dicho volumen iluminado, se generan pulsos en los detectores 380,
400, 401 y 404. Después, las amplitudes de estos pulsos son
filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en modo de
lista en el correspondiente espacio pentadimensional de
características de ALL, IAS, FL3, PSS (dispersión lateral
polarizada); y DSS (dispersión lateral despolarizada). El tiempo de
recuento normal a través de celda de flujo 170 es 10 segundos. A la
relación de caudal y dilución descrita anteriormente, con un
recuento normal de WBC de paciente de 7000 células por microlitro de
volumen de sangre, la tasa de recuento de eventos resultante sería
5000. En muestras de recuento bajo, este tiempo de recuento se puede
ampliar automáticamente para mejorar las estadísticas de la
medición. A la conclusión del tiempo de medición, la corriente de
muestra es pipetada a residuos, y la sonda se limpia y seca y
prepara para procesar una muestra siguiente.
Después se aplican algoritmos a los datos de modo
de lista de dicho espacio de características de ALL, IAS, FL3, PSS,
y DSS, y se enumeran y/o señalizan los tipos siguientes de células
dentro de menos de 30 segundos de tiempo de procesado:
Tipos de células enumeradas | Porcentajes | Señalizadas o enumeradas | |
Concentración de glóbulos blancos | (WBC) | ||
Concentración de neutrófilos | %N de WBC | ||
Concentración de linfocitos | %LINF de WBC | ||
Concentración de monocitos | %MONO de WBC | ||
Concentración de eosinófilos | % EOS de WBC | ||
Concentración de basófilos | %BASO de WBC | ||
NRBC | %NRBC de WBC | ||
Concentración de banda | (BANDA) | ||
Concentración de blastos | (BLST) | ||
Conc. gran. inmaduros | (IG) | ||
Concentración de linf. -variante | (VARL) |
Las señales ALL e IAS son detectadas y recogidas
para el análisis WBC/Dif y las señales FL3 de núcleos NRBC teñidos
se recogen para análisis de NRBC, como se describirá más adelante.
El circuito de triple disparo, representado en la figura 42,
cualifica estas señales para digitalización usando lógica Y/O. Para
ser cualificada una señal debe ser mayor que el disparo IAS,
mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el disparo ALL o el
disparo FL3.
Los varios componentes y señales generadas o
utilizadas identificadas en la figura 42 corresponden a las marcas
siguientes:
900 - Comparador de voltaje ALL
902 - Señal ALL
904 - Voltaje umbral ALL (Vth1)
906 - Salida del comparador de voltaje ALL
910 - Señal FL3
912 - Voltaje umbral FL3 (Vth2)
914 - Comparador de voltaje FL3
916 - Salida del comparador de voltaje FL3
918 - Señal IAS
920 - Voltaje umbral IAS (Vth3)
922 - Comparador de voltaje IAS
924 - Salida del comparador de voltaje IAS
926 - Puerta O
928 - Salida de puerta O
930 - Puerta Y
932 - Salida de disparo válida
Señales en tiempo real procedentes de sus canales
respectivos están presentes en las entradas de los comparadores de
voltaje. Los comparadores de voltaje 900, 914 y 922 funcionan
comparando las "entradas +" (902, 910 y 918) con las
"entradas -" (904, 912 y 920) con salidas resultantes (906,
916, 924). Si la "entrada +" es de un voltaje más alto que la
"entrada -", la salida será alta. Si la "entrada +" es de
un voltaje más bajo que "entrada -", la salida será baja.
Los voltajes umbral son voltajes independientes
que se determinan por parámetros del sistema.
Las salidas de comparadores 900 y 914 son
entradas a la puerta O 926 para dar la salida resultante 928 de la
puerta O. La puerta O funciona comparando sus entradas. La salida
será alta si una o ambas entradas son altas.
La salida de la puerta O 928 y la salida de los
comparadores 922 y 924 son entradas a la puerta Y 930. La puerta Y
funciona comparando sus entradas para derivar su salida 932 que
también es la salida de disparo válida. La salida será alta
solamente si ambas entradas son altas.
La salida de disparo válida 932 solamente será
alta si la señal IAS 918 es mayor que su voltaje umbral 920, y una
o ambas, la señal ALL 902 es mayor que su voltaje umbral 904 o la
señal FL3 910 es mayor que su voltaje umbral 912.
Usando el circuito de disparo anterior, los NRBCs
forman un agrupamiento único en dicho espacio tridimensional, véase
las figuras 40A-40C y 41A y 41B, que se puede
contar fácilmente durante el análisis óptico diferencial de WBC, y
excluir de forma no ambigua del recuento de WBC. Así, se refiere un
recuento de NRBC por 100 WBC y NRBC absoluto por \muI de sangre
del paciente. En consecuencia, los NRBC se restan de los recuentos
totales de WBC permitiendo el análisis exacto WBC total y
Diferencial en presencia de NRBC en una muestra de sangre. Se
eliminan sustancialmente el ruido de fondo, tanto fluorescente como
no fluorescente, de fragmentos de ADN, estroma de RBC, plaquetas,
cuerpos de Howell-Jolly, punteado basófilo, ARN de
reticulocitos lisados y ADN de WBC y fragmentos megacariocíticos.
Los núcleos NRBC teñidos se separan de las varias señales de ruido
de fondo mediante el proceso de triple disparo descrito (en ALL,
IAS y FL3) y solamente las señales FL3+ de los núcleos NRBC encima
del disparo FL3 en el diagrama de puntos de ALL en función de FL3
se cuentan como NRBC (figuras 40A-40C y 41A y
41B).
En un aspecto del sistema analítico celular 60 se
utiliza una composición reactiva acuosa estable para la detección y
enumeración de reticulocitos. Este reactivo incluye: un colorante
de cianina asimétrico capaz de teñir reticulocitos, desde
aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM de una solución
tampón seleccionada del grupo que consta de solución tampón de
imidazol, solución tampón de ácido
4-(2-hidroxietil)-1-peperazinetano
sulfónico ("Hepes"), solución tampón de ácido bis
(2-hidroxietil)-1 -piperazineetano
sulfónico ("Bis-Tris") y solución tampón de
Tris hidroximetil aminometano ("Tris"); un pH de desde
aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0; una osmolaridad ajustada
a aproximadamente 230 a aproximadamente 340 mOsm/L con una sal
álcali mono- o divalente; y un surfactante iniónico (desde
aproximadamente 5 mg/dl a aproximadamente 1,0 g/dl dependiendo del
surfactante) que facilita la permeación de la membrana y estabiliza
los colorantes de cianina en una solución isotónica acuosa.
Preferiblemente los colorantes son cíclicos sustituidos y exhiben
mejor fluorescencia al unirse con ADN o ARN. Aún más
preferiblemente, el reactivo incluye desde aproximadamente 0,1
\mug/ml a aproximadamente 0,3 \mug/ml de un colorante de
cianina asimétrico cíclico sustituido.
Los métodos para la detección rápida y continua y
la enumeración de reticulocitos y diferenciales CBC utilizan el
sistema de reactivo de la presente invención. Tales métodos son
distintos debido a la ausencia particular de la necesidad de
realizar un paso de incubación separado. El período de incubación
mínimo, de 10 a 60 segundos, es todo lo necesario.
El método y reactivo descritos son la materia de
US 5691204, titulada "Composición y método para el análisis rápido
de reticulocitos", presentada el 21 de abril de 1995.
El método permite la enumeración de reticulocitos
a partir de una muestra de sangre entera diferenciando
simultáneamente una alícuota separada de la muestra para obtener un
análisis completo de células sanguíneas ("CBC"). Este método
incluye dirigir una o varias alícuotas de la muestra a varias
posiciones dentro de un analizador automático para análisis y
diferenciación, mientras que una alícuota de reticulocitos de la
muestra se combina con un reactivo de tinción.
La alícuota de reactivo/reticulocito combinada se
dirige después a una celda de flujo óptico 170 del analizador
automático 60. La alícuota de reactivo/reticulocitos se pasa
después a través de una zona de detección iluminada 300
esencialmente una célula cada vez para producir eventos de
fluorescencia y dispersión de luz. Estos eventos son detectados y el
número de reticulocitos presentes en dicha muestra se determinan a
partir de ellos.
Los colorantes asimétricos utilizables con el
sistema de reactivo tienen en general las características
siguientes:
1. Absorción máxima: 488 +20 nm.
2. Alta afinidad de unión a ácido nucleico.
3. Alto rendimiento cuántico: \geq 0,1.
4. Coeficiente de extinción molar: \geq
10.000.
5. Mejora de fluorescencia a la unión a ARN o
ADN: \geq 20.
6. Tasa de permeación de membrana: < 2
minutos.
Típicamente, los colorantes utilizados en los
métodos descritos de enumeración de reticulocito y reactivo acuoso
son altamente inestables en entornos acuosos. Sin embargo, la
formulación de reactivo descrita proporciona mayor estabilidad y
duración en almacenamiento al reactivo acabado.
Una realización preferida del sistema de reactivo
incluye desde aproximadamente 0,05 \mug/ml a aproximadamente 0,5
\mug/ml de Sybr 11, un colorante de propiedad comercializado por
Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), desde aproximadamente 20 mM a
aproximadamente 50 mM de solución tampón de imidazol, y desde
aproximadamente 5 mg/dl a aproximadamente 20 mg/dl de
N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida
("BIGCHAP"), desde aproximadamente 0,02% a aproximadamente
0,055% de Proclin® 300
(5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona
+
2-metil-4-isotiazolin-3-ona).
El pH se regula a desde aproximadamente 6,8 a aproximadamente 7,2
con 1N HCI y la osmolaridad ajustada con NaCl desde aproximadamente
270 a aproximadamente 310 mOsm/L.
Un ingrediente principal del sistema de reactivo
es el colorante. Una clase de colorantes son colorantes asimétricos
de cianina tal como los descritos en W094/24213, "COLORANTES
ASIMÉTRICOS CÍCLICOS-SUSTITUIDOS". Además, los
colorantes exhiben mejor fluorescencia a la unión con ADN o ARN.
Tales colorantes útiles también deben tener alta afinidad de unión
a ARN y ADN y un rendimiento cuántico alto. Se anticipa que se
puede usar varios colorantes asimétricos de cianina que exhiben las
características aquí descritas y reivindicadas. Algunos ejemplos de
tales colorantes incluyen, aunque sin limitación, Sybr 11, Sybr 14,
Sybr 16, también obtenidos de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR)
("MPI"). También son útiles otros colorantes asimétricos de
cianina tal como Syto 12, que se obtienen también de MPI. Se
considera que Syto 12 es un colorante de cianina asimétrico neutro
incluyendo un sistema de anillo de benzazolio sustituido enlazado a
un puente de metina a un sistema de anillo piridínico o de
quinolina.
Otro ingrediente del sistema de reactivo es una
solución tampón cuyo pKa es desde aproximadamente 6,0 a
aproximadamente 8,0 y es capaz de mantener la concentración
requerida (para teñir ARN o ADN) del colorante de cianina en una
solución acuosa en un período de tiempo prolongado. Tales soluciones
tampón no deberán reaccionar con los colorantes de cianina o los
surfactantes iniónicos usados para estabilizar el colorante. Las
soluciones tampón ejemplares incluyen imidazol, Hepes,
Bis-Tris y Tris.
Otro ingrediente del sistema de reactivo es un
surfactante iniónico. Dependiendo del surfactante, o combinación de
surfactantes iniónico, que se usen, la concentración deberá ser
desde aproximadamente 5 mg/dl a aproximadamente 1 g/dl. El (los)
surfactante(s) parece(n) mejorar la velocidad de la
permeación del colorante de cianina a través de la membrana celular
(en 30 segundos). Además, el surfactante mejora la solubilidad y la
estabilidad de los colorantes de cianina en una solución acuosa
isotónica. Sin embargo, tal(es) surfactante(s) no
deberán precipitar o reaccionar con los colorantes de cianina o
lisar RBCs, incluso a las concentraciones bajas. Ejemplos de tales
surfactantes son, aunque sin limitación, BIGCHAP,
n-dodecil-D-maltósido,
copolímero bloque polioxipropileno-polioxietileno
("Pluronic® F127"),
n-tetradecil-D-maltósido,
decanoil-N-metil-glucamida,
n-dodecil-D-glucopiranósido
y
n-decil-D-glucopiranósido.
Otro ingrediente del sistema de reactivo es una
sal álcali mono-, o divalente para regular la osmolaridad del
reactivo desde aproximadamente 230 mOsm/L a aproximadamente 340
mOsm/L para evitar la lisis de glóbulos rojos, incluyendo los
reticulocitos, o los glóbulos blancos. Tales sales no deberán
reaccionar con los colorantes de cianina o precipitar en solución.
Los ejemplos de tales sales incluyen NaCl, KCI, LiCl, CaCl_{2},
MgCl_{2}, ZnCl_{2} y otros.
Un ingrediente opcional es un conservante para
evitar el crecimiento microbiano en el reactivo. Tal conservante no
deberá cambiar las propiedades de dispersión de luz o emisión
fluorescente de las células o células teñidas. Los ejemplos de
tales conservantes incluyen Proclin® 300, Proclin® 150, azida sódica
y otros.
Sin embargo, en general, un método de análisis de
sangre incluye la mezcla de una muestra de sangre entera con un
reactivo para teñir el ARN de los reticulocitos presentes, pasar la
mezcla, esencialmente una célula cada vez, por una celda de flujo
óptico iluminada, detectar la luz dispersada y fluorescencia
emitida y determinar la cantidad de reticulocitos presentes en la
muestra sin someter la mezcla de muestra/reactivo a un paso o
período de incubación separado.
Para analizar en una muestra de sangre entera el
porcentaje así como los recuentos absolutos de reticulocitos en el
analizador hematológico multiparamétrico antes descrito, se
deposita aproximadamente 18,75 \mul de una muestra de sangre
entera por medio de una sonda de aspiración de muestra en la copa
RBC 134 que contiene aproximadamente 7856 \mul de un
diluyente/solución envolvente (una salida isotópica) y se mezclan
los fluidos. La muestra diluida es transportada después a un
agujero de impedancia envuelto 174 para determinar electrónicamente
el recuento absoluto de RBC de la muestra. Mientras tanto,
aproximadamente 200 \mul de la muestra diluida son transferidos a
una copa Retic 136 que contiene 600 \mul del reactivo descrito,
donde se mezclan. La muestra preparada (mezclada) es transportada
después a la celda de flujo óptico envuelta 170 para detección. El
proceso de medición comienza cuando la corriente de células pasa a
través de la celda de flujo esencialmente una célula cada vez, en
una corriente de muestra de flujo laminar rodeada por un
diluyente-solución envolvente, que se describe a
continuación.
En este punto, y como se representa en el espacio
bidimensional de características de IAS y FL1 del citograma de las
figuras 14A y B, la presencia de una célula es detectada por un
fotodiodo de dispersión de ángulo intermedio 380 que detecta luz en
un cono de 3º a 10º, y un tubo fotomultiplicador ("PMT") 400
que detecta fluorescencia verde, FL1. Cuando pasan células a través
de dicho volumen iluminado, estos detectores generan y miden
pulsos. Las amplitudes de estos pulsos son después filtradas,
amplificadas, digitalizadas y almacenadas en modo de lista en el
correspondiente espacio bidimensional de características de IAS y
FL1. Las células son contadas durante 8 segundos. A la relación de
caudal y dilución descrita anteriormente, con un recuento de RBC de
un sujeto normal de 5 millones por microlitro de volumen de sangre,
la tasa de recuento de eventos resultante sería 5950 por segundo.
Después se aplican algoritmos a los datos de modo de lista de dicho
espacio de características de IAS y FL1 y se miden los parámetros
siguientes dentro de 20 segundos de tiempo de cálculo:
1. Puerta RBC: Los WBCs y las plaquetas se
excluyen conmutando por puerta la población RBC, incluyendo
reticulocitos, pero excluyendo WBCs y plaquetas.
2. El porcentaje de reticulocitos: la población
RBC conmutada por puerta es reanalizada según el tamaño de sus
señales FL1. Se aplica un ajuste logarítmico al histograma FL1 para
definir la región que pertenece a RBCs maduros, y las células cuyas
señales FL1 caen encima de la región se marcan como reticulocitos.
El porcentaje de reticulocitos se calcula dividiendo el recuento de
reticulocitos por los recuentos RBC totales.
3. Los recuentos de reticulocitos totales: Se
obtienen multiplicando el porcentaje de reticulocitos por los
recuentos RBC absolutos de la muestra partir del modo CBC.
4. Índice de Madurez de Reticulocitos
("RMI"): El RMI se expresa como el porcentaje de reticulocitos
cuyas señales FL1 son más de una (1) desviación estándar
("D.E.") por encima de la fluorescencia media de una población
normal de reticulocitos.
Tal descripción se hace meramente por razones de
conveniencia y la expresión de RMI no se limita de ningún modo
solamente a los algoritmos aquí explicados.
La clase alternativa descrita de tinciones de
reticulocitos es estable a luz a temperatura ambiente, posee mayor
mejora de fluorescencia del colorante unido sobre el colorante no
unido, exhibe selectividad ARN sobre ADN, permite mejor paso por
puerta de las células de reticulocitos, proporciona permeación más
rápida de membranas celulares, y posee una absorción óptica máxima
estrechamente alineada con la emisión máxima de un láser de argón
(aproximadamente 488nm).
Un colorante preferido pertenece a una clase de
moléculas que tiene la fórmula estructural siguiente:
donde:
x = O, S, Se o
C(CH_{3})_{2}2.
R_{1} = alquilo que tiene de
1-6 carbonos.
R_{2} = alquilo que tiene de
1-6 carbonos.
R_{3} = benceno fundido, alquilo (que tiene
1-6 carbonos), metoxi o hidrógeno.
R_{4} = alquilo que tiene 1-6
carbonos, metoxi o hidrógeno.
n = cero o un entero de 1-6.
Esta clase de colorantes se denominará aquí
"2,2'-colorantes".
La realización preferida del colorante de
reticulocito mostrado anteriormente es donde:
Preferiblemente, x es azufre (S).
Preferiblemente, R_{3} y R_{4} son
hidrógeno.
Preferiblemente, n = O y
Preferiblemente, R_{1} y R_{2} son etilo.
Este colorante se enumera en el
Koch-light Biochemical Catalogue 1985, y 1988/89,
página 53, en forma de una sal yoduro, y se denomina yoduro de
1,3'-dietil-2,2'-quinoliltiacinina.
También se enumera en el catálogo Nippon
Kankoh-Shikiso Kenkyusho, página 7. Por razones de
conveniencia en lo que sigue, este colorante específico, la
realización especialmente preferida, se denominará "DE22QTC",
y la clase general de colorantes, definida anteriormente,
"2,2'-colorantes".
En general, estos colorantes se utilizan en forma
de sus sales, siendo los yoduros especialmente convenientes. En el
sentido en que se utiliza en esta memoria descriptiva, todas las
referencias a estos colorantes se deberán entender como incluyendo
tales colorantes en forma de sal.
En una realización, un reactivo útil para teñir
material conteniendo ARN que se compone de un
2,2'-colorante es capaz de teñir material
conteniendo ARN.
Otra realización proporciona un método para teñir
material conteniendo ARN, donde una solución de tinción acuosa de
un 2,2'-colorante, que es capaz de teñir material
conteniendo ARN, se pone en contacto con un material conteniendo
ARN durante un período de tiempo adecuado para permitir que el
colorante de la solución de tinción penetre en el material
conteniendo ARN.
Otra realización proporciona un método para
enumeración de reticulocitos en una muestra de sangre entera usando
citometría de flujo donde una solución de tinción acuosa de un
2,2'-colorante, que es capaz de teñir material
conteniendo ARN, se pone en contacto con un material conteniendo
ARN durante un período de tiempo adecuado para permitir que el
colorante de la solución de tinción se equilibre con el material
conteniendo ARN. La muestra teñida se dirige después a través de la
zona de detección óptica de un instrumento de citometría de flujo e
ilumina una vez dentro de la zona de detección óptica con un haz de
luz incidente. La fluorescencia de los reticulocitos en solución
de muestra se mide después cuando pasan por la zona de detección
óptica.
Una ventaja importante de los
2,2'-colorantes es que parecen ser más estables en
solución acuosa que naranja de tiazol. Esto se ha examinado usando
muestras de DE22QTC, naranja de tiazol (ambos a 0,1 \mug/ml en
diluyente isotónico) y "Retic-COUNT"
almacenados ambos a 4ºC en oscuridad y en luz de sala a temperatura
ambiente (aproximadamente 25ºC) durante un período de 5 días.
Los 2,2'-colorantes exhiben una
fluorescencia considerablemente mayor cuando ARN en vez de ADN es
la sustancia de unión, en base de peso por peso DE22QTC permite el
paso fácil por puerta de glóbulos rojos lejos de plaquetas y
glóbulos blancos usando una estrategia no adoptada previamente para
análisis de reticulocitos. El colorante, por su tinción
significativa de plaquetas en el período de 30 minutos de una
prueba típica y su tinción esperada de glóbulos blancos en el mismo
período, proporciona diferenciación significativa de ambos grupos
de células de todos los glóbulos rojos en un gráfico de
fluorescencia frente a dispersión directa. La tinción rápida es una
propiedad no mostrada por otros muchos colorantes; por ejemplo,
naranja de tiazol no tiñe plaquetas considerablemente en el período
de 30 minutos de tiempo aunque después de varias horas, se produce
tinción.
DE22QTC, cuando se une a ARN o ADN, tiene una
absorción máxima de casi exactamente 488 nm, y un desplazamiento
Stokes de aproximadamente 33 nm. Por lo tanto, este colorante se
puede usar con ventaja máxima con el láser de iones argón estándar.
Además, se pueden usar los filtros ópticos fácilmente disponibles
usados para ensayos a base de fluorescencia y no hay que modificar
el instrumento.
Los 2,2'-colorantes se pueden
usar en cualquier técnica de ensayo convencional que requiera la
tinción de reticulocitos con un marcador fluorescente. En
particular, estos colorantes se pueden usar en cualquier ensayo
para el que se recomienda actualmente naranja de tiazol, tal como
detección de reticulocitos y enumeración en un citómetro de flujo
de láser de iones argón.
Cuando se utiliza esta clase de colorantes para
detectar y diferenciar reticulocitos, hay que prever un lugar de
incubación y controles de temperatura asociados y manipuladores de
muestras dentro del instrumento y conectar operativamente al
analizador para mantener la automatización del sistema de
instrumentos de la invención aquí descrito.
El reactivo de hemoglobina ("HGB") explicado
aquí se describe en U.S. 5612223, "REACTIVO LIBRE DE CIANURO Y
MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA", presentada el 11 de
marzo de 1994.
Un reactivo libre de cianuro debe ser capaz de
lisar rápidamente los eritrocitos y complejar rápidamente con la
hemoglobina de manera que se forme una estructura cromogénica
detectable para la detección y medición. El reactivo descrito es
estable durante muchas semanas y es especialmente ventajoso porque
el cromógeno resultante parece estar libre de interferencia de otros
componentes de la sangre y se puede medir a longitudes de onda en
el rango espectral de instrumentos hematológicos automáticos ya
existentes en este campo. A efectos de comparación, el método de
met hemoglobina cyan mide típicamente la absorbancia a 540 nm. Se
puede formar un cromógeno marrón rojizo que tiene una absorción
máxima a aproximadamente 544 nm.
Un reactivo HGB que se considera útil es una
solución acuosa de un compuesto de formación de ligando tal como
imidazol y derivados de imidazol. El compuesto de formación de
ligando está presente a concentraciones de 0,1 M a 2,0M imidazol,
del reactivo presente, liga con la hemoglobina que se libera de los
eritrocitos en la muestra. Otros compuestos de formación de ligandos
incluyen N-hidroxiacetamida,
N-hidroxil amina, piridina, oxazol, tiazol,
pirazol, pirimidina, purina, quinolina e isoquinolina. Los aniones
que pueden unir el hierro heme oxidado incluyen cianato, fluoruro,
azida, nitrito, hidróxido, acetato y formato; las sales aceptables
de estos aniones incluyen sodio, potasio, amonio y análogos.
El reactivo contiene además un surfactante con
fuerte capacidad eritrolítica. Se puede usar óxido de
laurildimetilamina (Ammonix L. O.) [Stepan Chemical Company;
Northfield, Illinois], y octilfenoxi polietoxietanol (Triton X 100)
u otros detergentes fuertes como el componente surfactante del
reactivo lisante. El surfactante deberá estar presente a
concentraciones desde aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1,0%
(p/v). El pH del reactivo deberá ajustarse a entre 11 y 14,
preferiblemente 12,5. Se puede utilizar bases monovalentes, tal como
hidróxido de sodio e hidróxido de potasio, para ajuste del pH.
Según el método para determinar HGB (descrito con
más detalle más adelante en la sección 8 E y el Ejemplo 2 de la
presente), el reactivo lisante se mezcla con una muestra de sangre
entera en la relación de aproximadamente 50-1000:1
reactivo a la sangre. La muestra y el reactivo se pueden mezclar
rápidamente para lograr eritrolisis y conversión de hemoglobina al
cromógeno. La mezcla de muestra y reactivo se puede presentar
después a un espectrofotómetro de absorbancia donde se mide la
densidad óptica del cromógeno formado. Cuando el ligando es
imidazol, la medición se puede hacer entre 540 nm y 550 nm. La
concentración de hemoglobina total en la muestra se refiere a la
densidad óptica del cromógeno convertido.
El sistema analítico celular 60 utiliza una
solución isotónica tamponada con surfactante iniónico adecuada para
minimizar la tensión superficial de la corriente envuelta y para el
análisis rápido de glóbulos rojos y plaquetas. El sistema de
reactivo puede reducir de forma sustancialmente completa la
formación de burbuja y mejorar un flujo suave de la corriente
envuelta para impedancia y celdas de flujo óptico. El
diluyente-reactivo envolvente descrito a
continuación también mejora la separación de los glóbulos rojos
microcíticos de las plaquetas, conservando al mismo tiempo
sustancialmente la morfología de ambas poblaciones de glóbulos
rojos y plaquetas para medición exacta y precisa de recuentos y
volumen.
En una realización, desde aproximadamente 10 mM a
aproximadamente 50 mM de una solución de sal isotónica tamponada
cuyo pKa es desde aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0, es
capaz de mantener el pH del reactivo dentro de un rango de pH de
desde aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,6, está presente una
sal monovalente de EDTA de aproximadamente 0,1 gramo por litro a
aproximadamente 0,4 gramo por litro para evitar la presencia de
agregados de plaquetas, también se utiliza una sal monovalente
suficiente para regular la osmolaridad del reactivo desde
aproximadamente 270 mOsm/L a aproximadamente 320 mOsm/ L, así como
un surfactante iniónico que reduce la tensión superficial, evita la
formación de burbuja y mejora la separación de los glóbulos rojos
microcíticos de las plaquetas, seleccionado a partir del grupo
n-dodecil-D-maltósido,
n-tetradecil-D-maltósido,
decanoil-N-metil-glucamida,
n-dodecil-D-glucopiranósido
y
n-decil-D-glucopiranósido,
y finalmente está presente un conservante para evitar el crecimiento
microbiano y agua desionizada.
En una realización preferida, el reactivo incluye
desde aproximadamente 2,45 gramos por litro de fosfato sódico,
dibásico, aproximadamente 0,40 gramos por litro de fosfato
potásico, monobásico, aproximadamente 0,20 gramos de EDTA disodio
por litro, aproximadamente 8,05 gramos de cloruro de sodio por
litro, aproximadamente 0,40 gramos de cloruro de potasio por litro,
aproximadamente 0,012 gramos por litro de
n-dodecil-D-maltósido
y aproximadamente 0,03 gramos por litro de proclina 300, pH
ajustado a 7,4 y osmolaridad ajustada a 315 mOsm/L.
En la realización más preferida, se mezcla
rápidamente 17,5 microlitros de una muestra de sangre con 7400
microlitros de diluyente reactivo envolvente (dilución 1:420), y se
pasa 0,5 microlitros de la muestra diluida por un transductor de
impedancia de enfoque hidrodinámico (con envoltura) durante 12
segundos para recuento de glóbulos rojos y medición de volumen así
como recuentos de plaquetas, y se pasan 2,5 microlitros de la
muestra diluida por una celda de flujo óptico con envuelta durante
6 segundos para determinación del recuento exacto y preciso de
plaquetas. Las señales de ruido de fragmentos de células anormales
frágiles se excluyen de los recuentos ópticos de plaquetas
delimitando con precisión la población de plaquetas por el algoritmo
de plaquetas del sistema analítico celular 60. Ejemplos típicos de
distribución de glóbulos rojos y plaquetas de muestras de sangre
normales y anormales del sistema analítico celular 60 se presentan
en las figuras 45A-45F y las figuras
46-47.
El analizador 64 puede estar provisto de un
autocargador (no representado) para transportar automáticamente
tubos de muestra al analizador 64 para procesado. Tal autocargador
puede incluir un soporte que retiene hasta aproximadamente 100
tubos de muestra de varios tamaños. Un presentador que presenta
secuencialmente los tubos de muestra al analizador 64 para
aspiración, está conectado operativamente con el autocargador. Una
mezcladora que mezcla la muestra justo antes de la aspiración de
muestra, también puede estar asociada operativamente con el
autocargador. Un lector de código de barras para leer la etiqueta
de código de barras en cada tubo también puede estar asociado
operativamente con el autocargador y conectado operativamente al
controlador de sistema para introducir información de muestra en el
controlador del sistema.
La figura 3 ilustra una vista desde arriba de una
realización de una zona de procesado automático de muestras 110
para uso en el sistema analítico celular 60 representado en la
figura 1. La zona de procesado 110 es parte de la porción del
analizador 64 del sistema analítico celular 60. La zona de procesado
110 incluye una zona de copas de muestra 114 y una zona de
incubación 118.
Como se representa en la figura 3, la zona de
incubación 118 incluye un bloque termostatizado 120 para alojar
módulos de reactivo 122, bandejas de incubación de
subconjunto/fenotipificación 124 y unidad de lavado y secado de
sonda 144. El bloque termostatizado 120 incluye un controlador de
temperatura (no representado) para calentar y/o enfriar las
bandejas de incubación 124 y módulos de reactivo 122 dispuestos en
el bloque termostatizado 120.
Los módulos de reactivo 122 incluyen cavidades
128 para contener un volumen de reactivo de anticuerpo. En la
realización ilustrada, cada módulo de reactivo 122 tiene una
carcasa con una cavidad de reactivo 128, preferiblemente en número
de seis, empaquetadas con un panel particular de reactivos. Los
reactivos en cada panel se seleccionan de manera que, para las
pruebas asociadas con cada panel, se utilice una cantidad
aproximadamente igual de reactivo de cada cavidad 128. Si se
requieren menos de seis reactivos para la prueba asociada con el
panel, las cavidades excedentes 128 se tapan con un tapón (no
representado). Cada módulo de reactivo 122 también está provisto de
una memoria, tal como una RAM no volátil y análogos, para almacenar
información de ID y uso del módulo. Los módulos de reactivo 122
están preferiblemente enchavetados de manera que puedan asentar en
un agujero (no representado), situado en el bloque termostatizado
120, en una orientación predefinida. Esto permite que la unidad
central de proceso (CPU) del analizador 64 almacene la posición y, a
partir de la información de uso, el volumen del contenido de cada
cavidad 128 en cada módulo de reactivo 122.
Las bandejas de incubación de
subconjunto/fenotipificación 124 son, en la realización ilustrada,
de forma sustancialmente rectangular, y tienen varias filas de
lugares de incubación 132 formadas en ellas. Cada lugar de
incubación 132 es capaz de contener una mezcla de muestra de sangre
y anticuerpo que se incuba en preparación para la prueba de
inmuno/fenotipo. Las bandejas de subconjunto/fenotipificación 124
asientan extraiblemente en agujeros (no representados) en el bloque
termostatizado 120 de tal manera que sus temperaturas sean
controladas por el controlador de temperatura del bloque
termostatizado 120.
La zona de copas de muestra 114 incluye una fila
de copas de muestra, y colectores 114b y drenajes 114a. En una
realización preferida, estas copas incluyen una copa "RBC"
134, una copa "RETIC" 136, una copa "WBC" 138, una copa
de "transferencia" 140, una copa "HGB" 142, y copa de
"lavado" 144a. Cada copa de muestra está abierta en la parte
superior para recibir un fluido. Los fondos de las copas RBC 134,
RETIC 136, WBC 138 y HGB 142 están conectados a una red de tubos
182 (representada en la figura 5) para transportar muestras a celdas
de flujo/transductores de medición. También es posible depositar
fluidos, tal como diluyente, reactivo, agente lisante y análogos,
en las copas mediante la red de tubos 182. Esto se puede llevar a
cabo conectando la red de tubos 182 a orificios (no representados)
formados en las paredes de las varias copas. La colocación de estos
orificios y sus respectivos diámetros interiores permiten que la
mezcla tenga lugar como resultado del movimiento del fluido
producido por el mecanismo de distribución, que es preferiblemente
una jeringa de dilución acoplada a la red de tubos 182.
Los RBCs son lisados en la copa WBC 138 usando,
por ejemplo, el sistema de reactivo multipropósito de agente lisante
rápido explicado previamente. Por consiguiente, la copa WBC 138
incluye un controlador de temperatura o calentador para calentar la
mezcla de agente lisante rápido y muestra, preferiblemente a
aproximadamente 40ºC. Además, la copa WBC 138 incluye una mezcladora
vorticial 610 (figura 37) para obtener mezcla vorticial movida por
motor de la combinación de reactivo lisante y sangre entera.
Por razones de claridad, una realización
ejemplificativa de la preparación de la muestra se explica con
referencia a las figuras 37 a 39.
Una realización ilustrada en la figura 37
proporciona un aparato 610. El aparato 10 incluye en general un
aparato mezclador 612, un dispensador de fluido 614 y un
controlador de mezcla 616. El aparato mezclador se describe mejor y
reivindica en la Solicitud de Patente de Estados Unidos, número de
serie 08/356.412, presentada el 15 de diciembre de 1994, cuyo
contenido completo se incorpora aquí por referencia.
El aparato mezclador 612 está asociado
operativamente con el dispensador de fluido 614 de tal manera que
el dispensador de fluido 614 introduzca un primer fluido, tal como
una muestra de sangre entera, una suspensión de células y análogos,
en el aparato mezclador 612. El dispensador de fluido 614 está
conectado eléctricamente con el controlador de mezcla 616 por el
conductor 618 de manera que el controlador de mezcla 616 verifique
y coordine la operación del dispensador de fluido 614. El
controlador de mezcla 616 está conectado eléctricamente con una
fuente 620 de energía eléctrica por el conducto 622 para
suministrar energía eléctrica al controlador de mezcla 616. En una
realización ejemplar, el dispensador de fluido 614 es un pipetador
asociado operativamente con una fuente adecuada de fluido a preparar
por el aparato 610. El controlador de mezcla 616 puede ser un
ordenador que tiene memoria que contiene y ejecuta rutinas
apropiadas para controlar la operación del aparato 610.
La realización ilustrada del aparato mezclador
612 incluye una carcasa primera o interna 624, una carcasa segunda
o externa 626 y un elemento de unión 627. La carcasa interna 624 y
la carcasa externa 626 son sustancialmente cilíndricas e incluyen
extremos abiertos para facilitar la introducción de fluido desde el
dispensador de fluido 614 al interior 628 de la carcasa interna
624. La carcasa interna 624 y la carcasa externa 626 están
dispuestas de forma sustancialmente coaxial, estando dispuesta la
carcasa interna 624 sustancialmente dentro de la carcasa externa
626.
El elemento de unión 627, ilustrado en las
figuras 37 y 39, rodea sustancialmente y conecta operativamente los
extremos abiertos del elemento interior 624 y el elemento exterior
626. El elemento de unión 627 incluye un primer saliente
sustancialmente anular 630 que acopla con una ranura
sustancialmente anular 632 en el elemento interior 624 junto a su
extremo abierto y un segundo saliente sustancialmente anular 634
que acopla con una ranura sustancialmente anular 636 en el elemento
exterior 626 junto a su extremo abierto. Para facilitar la
retención del saliente 630 dentro de la ranura 632, un aro en O 638
está dispuesto de manera que rodee sustancialmente una superficie
de diámetro externo del saliente sustancialmente anular 630. El aro
en O 638 funciona esencialmente como una abrazadera elástica para
fijar sustancialmente el saliente 630 dentro de la ranura 632. El
aro en O 38 mantiene el extremo abierto de la carcasa interna 624
sustancialmente estacionario con respecto al extremo abierto de la
carcasa externa 626 durante el funcionamiento del aparato 610.
La carcasa interna 624 incluye estructuras para
introducir y sacar fluido del interior 628 de la carcasa interna
624. Específicamente, la carcasa interna 624 incluye una entrada de
fluido 642 y una salida de fluido 644. En una realización, la
entrada de fluido 642 y la salida de fluido 644 se pueden hacer de
tubo de acero inoxidable. En otra realización, la entrada de fluido
642 puede incluir un conducto, tal como una bobina y análogos,
dispuesto junto a la carcasa interna 624 de tal manera que se pueda
transferir energía térmica desde la carcasa interna 624 al conducto
aplicando por ello energía térmica al fluido antes de la
introducción en el interior 628 de la carcasa interna 624. La
entrada de fluido 642, en una realización ejemplar, está desviada
axialmente aproximadamente 36,5 mm (1,43 pulgadas) de un extremo
distal de la carcasa interna 624. La salida de fluido 644 está
dispuesta sustancialmente en el centro en un extremo próximo 646 de
la carcasa interna 624. Para facilitar el movimiento de fluido
desde el interior 628 de la carcasa interna 624 a la salida de
fluido 644, el extremo próximo 646 está inclinado o en pendiente
desde una pared axial de la carcasa interna hacia la salida de
fluido 644.
La entrada de fluido 642 está conectada por
fluido por un conducto adecuado 648 a una fuente 650 de un segundo
fluido, tal como una solución lisante, diluyente o análogos, a
introducir en el interior 628 de la carcasa interna 624. La fuente
650 puede incluir un mecanismo, tal como una bomba de jeringa y
análogos, para mover positivamente fluido desde la fuente 650 a
través del conducto 648 a la entrada de fluido 642 y el interior
628 de la carcasa interna 624. La salida de fluido 644 está
conectada por fluido por un conducto adecuado 652 a un depósito 654.
El depósito 654 puede ser otra porción de un instrumento analítico
con el que el aparato 610 está asociado operativamente. En otras
realizaciones, el depósito 654 puede retener fluido del interior 628
de la carcasa interna 624 hasta que sea necesario para procesado
adicional.
En algunas realizaciones, puede ser deseable
mantener fluido dentro del interior 628 de la carcasa interna 624 a
una temperatura deseada. Este fluido puede proceder del dispensador
de fluido 614, de la fuente 650 o una combinación de fluidos del
dispensador de fluido 614 y la fuente 650. Para ello, un elemento
de calentamiento 656 está asociado operativamente con la carcasa
interna 624. En la realización ilustrada, el elemento de
calentamiento 656 es un elemento de calentamiento eléctrico. El
elemento de calentamiento 656, en la realización ilustrada, rodea
sustancialmente y contacta una porción de una superficie de
diámetro externo de la carcasa interna 624. De esta forma, se
transfiere energía térmica generada por el elemento de calentamiento
656 a la carcasa interna 624 y desde allí al contenido, es decir,
fluido, dispuesto en el interior 628 de la carcasa interna 624.
El elemento de calentamiento 656 está conectado
eléctricamente por un conductor 658 a un controlador de calentador
660. El controlador de calentador 660 aplica energía eléctrica
apropiada al elemento de calentamiento 656 de tal manera que la
cantidad deseada de energía térmica sea generada por el elemento de
calentamiento 656 y aplicada a la carcasa interna 624.
Para comprobar la temperatura asociada con el
elemento de calentamiento 656 y la carcasa interna 624, se ha
dispuesto un sensor 664 conectado operativa y térmicamente con el
elemento de calentamiento 656 y la carcasa interna 624. En una
realización ejemplar, se forma un rebaje en la carcasa interna 624
para recibir el sensor 664 de tal manera que un perfil externo de
la carcasa interna 624 sea sustancialmente constante y liso. En una
realización, el sensor 664 es un detector de temperatura de
resistencia.
El controlador de calentador 660 opera en general
comparando una señal eléctrica indicativa de la temperatura
asociada con la carcasa interna 624 con una señal de referencia y
usando un resultado de la comparación para activar el elemento de
calentamiento 656.
La carcasa interna 624 no sólo puede mantener un
fluido en el interior 628 a un nivel deseado de energía térmica,
sino que también puede combinar o mezclar fluidos, tal como un
primer fluido del dispensador de fluido 614 y un segundo fluido de
la fuente 650, si se desea. Para facilitar la combinación de
fluidos, un extremo próximo de la carcasa interna 624 está
conectado operativamente con un motor principal 686 de tal manera
que la carcasa interna 624 se mueva en respuesta a la acción del
motor principal 686. Un extremo próximo de la carcasa externa 626
está fijado al motor principal 686 por sujetadores 687. En una
realización ejemplar, el motor principal 686 es un motor eléctrico
de corriente continua, tal como el modelo número
LC22-107 que se puede adquirir de SKC Shinano Kenshi
Corp., de Culver City, California. Esta realización del motor
principal 686 opera a aproximadamente 3.000 rpm.
Un conjunto de articulaciones 688 conecta
operativamente o con accionamiento el motor principal 686 con la
carcasa interna 624. El conjunto de articulaciones 688 incluye un
elemento de accionamiento 690 (figura 38) y un cojinete 692. Un eje
696 en el elemento de accionamiento 690 está acoplado con el
cojinete 692 por medios apropiados, tal como una arandela de bloqueo
retenida alrededor de una ranura en el eje 696. El cojinete 692
está acoplado con el extremo próximo de la carcasa interna 624 por
un aro en O 694 que proporciona un acoplamiento mecánico
elastomérico amortiguado, relativamente blando, del cojinete 692 a
la carcasa interna 624. El aro en O 694 también compensa
elastoméricamente el desplazamiento angular central producido por el
movimiento (por ejemplo, excéntrico) solamente en el extremo
próximo de la carcasa interna 624. Como se representa en la figura
38, el eje 696 está desviado de una línea media del elemento de
accionamiento 690.
El elemento de accionamiento 690 incluye un
agujero 698 para recibir un eje de accionamiento, que puede girar,
asociado con el motor principal 686 de tal manera que el movimiento
del eje de accionamiento del motor principal 686 produzca
movimiento complementario del elemento de accionamiento 690. Otro
agujero 700, dispuesto de forma sustancialmente ortogonal al agujero
698, está dispuesto en el elemento de accionamiento 690 para
recibir un sujetador que puede apoyar sobre el eje de accionamiento
del motor principal 686 de tal manera que el elemento de
accionamiento 690 se mueva conjuntamente con el eje de
accionamiento del motor principal 686.
La carcasa interna 624 se mueve en respuesta a la
operación del motor principal 686. El movimiento de la carcasa
interna 624 no es idéntico al movimiento rotativo del eje de
accionamiento del motor principal 686. El movimiento de la carcasa
interna 624 se define, en parte, por la disposición desviada del
eje 696 y la unión entre el extremo abierto de la carcasa interna
624 y el extremo abierto de la carcasa externa 626 proporcionada por
el elemento de unión 627. Por consiguiente, los extremos abiertos
de la carcasa interna 624 y la carcasa externa 626 permanecen
sustancialmente estacionarios con movimiento relativo
correspondiente a la flexibilidad proporcionada por la naturaleza
elastomérica del elemento de unión 627. Sin embargo, el extremo
próximo de la carcasa interna 624 se puede mover libremente
conjuntamente con el eje 696 en el elemento de accionamiento, que
se mueve en respuesta al movimiento del eje de accionamiento del
motor principal 686. Dado que el eje 696 está dispuesto desviado en
el elemento de accionamiento 690, el movimiento del eje 696 sigue en
general un recorrido sustancialmente excéntrico. Así, la carcasa
interna 624 "vibra" en general en respuesta a la operación del
motor principal 686. Se ha de notar que la carcasa interna 624 no
gira libremente con respecto a la carcasa externa 626 en respuesta
al motor principal 686.
Para controlar la operación del motor principal
686, y por lo tanto para controlar el movimiento de la carcasa
interna 624, se ha dispuesto un controlador 702. Específicamente,
el controlador 702 está conectado eléctricamente con el motor
principal 686 por el conductor 704. Un sensor 706 está asociado
operativamente con la carcasa interna 624 y conectado
eléctricamente con el controlador 702 por un conductor 708 para
proporcionar al controlador 702 realimentación indicativa del
movimiento de la carcasa interna 624. El controlador 702 está
conectado eléctricamente con el controlador de mezcla 616 por un
conductor 701 y con la fuente 620 por un conductor 703. Así, el
controlador 702 y el controlador de mezcla 616 son capaces de
regular positivamente la operación del motor principal 686
produciendo el movimiento deseado de la carcasa interna 624.
Para proporcionar un campo magnético para
interacción con el sensor 706 en esta realización, un imán 710
(figura 38) está provisto del elemento de accionamiento 690. En una
realización, el imán 710 se retiene dentro de un rebaje 712 en el
elemento de accionamiento 690 por medios adecuados, tal como un
adhesivo como un cemento epoxi. El imán 710 está orientado dentro
del rebaje 712 de tal manera que un polo sur del imán 710 mire al
sensor 706. Así, cuando el elemento de accionamiento 690 se mueve
en respuesta a la operación del motor principal 686, el imán 710
genera una señal eléctrica periódica en el sensor 706. La señal
eléctrica es sustancialmente periódica con una frecuencia que es
sustancialmente igual a una frecuencia rotacional del eje de
accionamiento del motor principal 686.
Ahora se ofrecerá un ejemplo de operación del
aparato 610. Se ha de notar que la explicación siguiente tiene
fines ilustrativos solamente.
Se supone, por razones de claridad, que el
aparato 610 está en reposo (es decir, nada está energizado). Un
operador accede al controlador de mezcla 616 para iniciar la
operación del aparato 610. Un primer fluido adecuado, tal como
sangre entera, una muestra biológica y análogos, se pone a
disposición del dispensador de fluido 614. Un segundo fluido
adecuado, tal como un diluyente de sangre, un agente lisante y
análogos, se pone a disposición en la fuente 650.
El controlador de mezcla 616 envía una señal
eléctrica al controlador de calentador 660 mediante el conductor
662 de tal manera que el controlador de calentador 660 conecte
eléctricamente la fuente 620 de energía eléctrica al elemento de
calentamiento 656. La energía eléctrica de la fuente 620 pasa a lo
largo de conductores 668 y 658 al elemento de calentamiento 656. La
energía eléctrica es convertida en energía térmica por el elemento
de calentamiento 656. La energía térmica en el elemento de
calentamiento 656 se transfiere a la carcasa interna 624. En una
realización, el elemento de calentamiento 656 recibe energía
eléctrica hasta que el sensor 664 detecta que la temperatura
asociada con la carcasa interna 624 es aproximadamente 43 grados
Celsius (\pm1,5 grados Celsius). Usando un nivel de temperatura
de menos de aproximadamente 45 grados Celsius, en caso de que el
primer fluido sea sangre entera, parte de los antígenos de
superficie de las células sanguíneas no se desnaturalizan
sustancialmente y algunas proteínas sanguíneas no coagulan
sustancialmente. Si se desnaturalizan suficientes antígenos de
superficie de células sanguíneas o si coagulasen suficientes
proteínas sanguíneas, dichas sustancias podrían recubrir porciones
del aparato 610 y el instrumento asociado. Los recubrimientos
podrían desalojar variablemente y poner en peligro la operación del
aparato 610 y el instrumento asociado.
El controlador de calentador 660 mantiene la
temperatura deseada asociada con la carcasa interna 624 regulando
el flujo de energía eléctrica desde la fuente 620 de energía
eléctrica al elemento de calentamiento 656. Por consiguiente, el
controlador de calentador 660, y así el elemento de calentamiento
656, pueden operar de forma sustancialmente continua durante el
funcionamiento del aparato 610 o el instrumento con el que el
aparato 610 está asociado.
Una vez que la carcasa interna 624 tiene la
temperatura deseada asociada con ella, el controlador de mezcla 616
envía una señal eléctrica al controlador 702 a lo largo del
conductor 701. En respuesta a esta señal eléctrica, el controlador
702 conecta eléctricamente el motor principal 686 con la fuente 620
de energía eléctrica energizando por lo tanto el motor principal
686. El motor principal 686 mueve o hace vibrar la carcasa interna
624.
Un volumen predeterminado del segundo fluido, tal
como aproximadamente 1275 microlitro ("\mul") de agente
lisante, se desplaza de la fuente 650 al conducto 648 por un
mecanismo adecuado, tal como una bomba de jeringa y análogos. El
segundo fluido fluye mediante la entrada de fluido 642 en la
carcasa interna 624 hacia el interior 628 de la carcasa interna 624.
Se ha de notar que, si se desea, el motor principal 686 puede ser
energizado antes o después de disponer el volumen predeterminado
del segundo fluido dentro del interior 628 de la carcasa interna
624. El volumen predeterminado de segundo fluido se mueve
conjuntamente con la carcasa interna 624 en respuesta a la acción
del motor principal 686 durante un primer período de tiempo
predeterminado, que puede ser del orden de aproximadamente 5
segundos. Después del primer período de tiempo predeterminado, el
segundo fluido tiene sustancialmente la misma energía térmica que
la carcasa interna 624.
El controlador de mezcla 616 envía una señal
eléctrica al dispensador de fluido 614 a lo largo del conductor
618. El dispensador de fluido 614 hace que se introduzca un volumen
predeterminado del primer fluido, tal como aproximadamente 37,5
\mul de sangre entera, en el interior 628 de la carcasa interna
624. En una realización, el dispensador de fluido 614 puede ser un
pipetador que tiene una boquilla de descarga que se puede aproximar
al agujero 640 en el elemento de unión 627. Una vez que la boquilla
de descarga está en posición apropiada con respecto al agujero, se
desplaza el volumen predeterminado del primer fluido al interior
628 de la carcasa interna 624.
Una vez que se ha introducido la cantidad
predeterminada de primer fluido en el interior 628 de la carcasa
interna 624, el primer fluido y el segundo fluido se mueven dentro
de la carcasa interna 624 en respuesta a la acción del motor
principal 686 durante un segundo período de tiempo predeterminado
que puede ser aproximadamente 11 segundos. El motor principal 686
opera preferiblemente a una frecuencia que no es igual a una
frecuencia resonante asociada con el aparato 610.
En una realización ejemplar, donde el primer
fluido es sangre entera y el segundo fluido es agente lisante, como
se describe anteriormente, el primer fluido y el segundo fluido se
mezclan de forma sustancialmente completa debido al movimiento de
fluido dentro de la carcasa interna 624 en respuesta al motor
principal 686. La relación del primer fluido al segundo fluido es
aproximadamente 1 a aproximadamente 35. Los glóbulos rojos en la
sangre entera son lisados de forma relativamente rápida y los
glóbulos blancos son fijados de forma relativamente rápida, es
decir, conservando sustancialmente la morfología de los glóbulos
blancos. Dado que el segundo fluido y la carcasa interna 624 están
sustancialmente al mismo nivel de energía térmica, el primer fluido
también llega sustancialmente al mismo nivel de energía térmica
después del segundo período de tiempo predeterminado.
Después de que los fluidos primero y segundo se
han movido en el interior 628 de la carcasa interna 624 durante el
período de tiempo deseado, cesa la operación del motor principal
686. La mezcla del primer fluido y el segundo fluido pasa por la
salida de fluido 644 y el conducto 652 hacia el depósito 654. La
mezcla es desplazada por un mecanismo apropiado, tal como una bomba
de jeringa, asociada operativamente con la salida de fluido 644. La
mezcla se puede procesar más o retener en el depósito 654 hasta que
se necesite. El aparato 610 está listo para operación
posterior.
La figura 4 es una ilustración más detallada de
la zona de procesado de muestras 110 representada en la figura 3.
Como se representa en la figura 4, la zona de procesado de muestras
110 incluye un conjunto de sonda de ventilación/aspiración 148 y un
conjunto de sonda de incubación 152. La figura 4 muestra también el
conjunto de ventilación 148a, el panel frontal 158a, la chapa base
158b y el lector de código base 120a. El conjunto de sonda de
ventilación/aspiración 148 (representado en la figura 4A) incluye
una aguja de ventilación 154, una sonda de aspiración 156, un
conjunto de accionamiento 158 para mover el conjunto de sonda de
aspiración 148 a lo largo de un conjunto deslizante 160, un
conjunto de accionamiento 159 para mover la aguja de ventilación
154 a lo largo del mismo conjunto deslizante 160, y un conjunto de
accionamiento vertical 161. El conjunto deslizante 160 está colocado
encima de las copas de muestra de manera que la aguja de
ventilación 154 y la sonda de aspiración 156 se puedan colocar
directamente sobre el tubo de muestra y las copas de muestra.
El conjunto de accionamiento de sonda de
aspiración 158 mueve la sonda de aspiración 156 sobre las copas de
muestra o el tubo de muestra de manera que la sonda 156 pueda
entrar en el tubo de muestra o copas de muestra para aspirar o
depositar fluido. Cuando la sonda de aspiración 156 está efectuando
su acercamiento a un recipiente pre-evacuado u otro
tubo de muestra sellado (no representado), el conjunto de
ventilación de accionamiento 159 mueve primero la aguja de
ventilación 154 sobre el tubo de muestra. Un conjunto de pistón (no
representado) mueve el conjunto de sonda de ventilación/aspiración
148 hacia abajo de manera que la aguja de ventilación 154 perfore
el tapón del tubo de muestra. Mientras la aguja de ventilación 154
permanece introducida en el tapón, el conjunto de accionamiento
vertical 161 hace que la sonda de aspiración 156 deslice a través
de la aguja de ventilación 154 al tubo de muestra para aspirar la
muestra.
Preferiblemente, el sistema analítico celular 60
tiene la flexibilidad de aspirar fluido de tubos de muestra de
varios tamaños y de adaptarse a varios cierres de tubo. Por
consiguiente, el conjunto de accionamiento vertical 161 está
provisto de un interruptor que detecta cuándo llega la sonda de
aspiración 156 a la parte inferior del tubo y para el movimiento
descendente adicional de la sonda de aspiración 156. El conjunto de
accionamiento vertical 161 eleva después la sonda de aspiración 156
y comienza la aspiración de sangre.
El conjunto de sonda de incubación 152
(representado en la figura 4B) puede incluir una sonda de
incubación 160, un primer conjunto de accionamiento de sonda de
incubación 164 para mover un segundo conjunto de accionamiento 168 a
lo largo de un primer conjunto deslizante 166, y un segundo
conjunto de accionamiento de sonda de incubación 168 para mover un
conjunto de accionamiento vertical 169 y la sonda de incubación 160
a lo largo de un segundo conjunto deslizante 170. Esto permite que
la sonda de incubación 160 se mueva en una dirección diagonal y se
coloque directamente encima de las copas requeridas de procesado de
muestra en la zona de procesado de muestras 110. La sonda de
incubación 160 también se puede colocar encima de cualquiera de los
lugares de incubación 132 en las bandejas de
subconjunto/fenotipificación 124, cualquiera de la seis cavidades
de reactivo 128 en cada uno de los módulos de reactivo 122, o la
copa de lavado de incubación 144.
El conjunto de accionamiento vertical 169 mueve
la sonda de incubación 160 verticalmente de manera que la sonda de
incubación 160 pueda entrar en las copas de muestra, los lugares de
incubación 132, o las cavidades de reactivo 128 para aspirar o
dispensar fluidos.
La figura 5 ilustra además el procesado de
muestras del analizador. Como se representa en la figura 5, varias
copas de procesado de muestra 132, 134, 136, 138, 140 y 142 están
conectadas a las celdas de flujo/transductores 170, 174, 178
mediante una red de tubos de transporte 182. La copa RBC 134, la
copa RETIC 136, y la copa WBC 138 están en comunicación de fluido
con el transductor de impedancia 174 y la celda de flujo óptico
170. La copa HGB 142 está en comunicación de fluido con el
transductor HGB 178.
Las figuras 6A, 6B y 6C ilustran la sonda de
incubación 160 durante la deposición, limpieza y aspiración,
respectivamente. La sonda 160 está formada por un tubo central 184
y un tubo exterior 186. La sonda de incubación 160 aspira y
deposita fluidos a través del tubo central 184. La sonda de
incubación 160 se puede usar para limpiar las copas de muestra y/o
lugares de incubación pulverizando fluido limpiador mediante una
región anular formada entre el tubo central 184 y el tubo externo
186 a la vez que aspira a través del tubo central 184.
En la realización descrita, al módulo analizador
64 se le suministra diluyente, reactivos de anticuerpos
monoclonales (MAb) si es necesario, varios reactivos lisantes y
colorante de reticulocito. El diluyente, los reactivos lisantes y
el colorante de reticulocito se suministran mediante depósitos 192 y
196 (representados en las figuras 7, 8 y 9) acoplados al analizador
64. Los depósitos 192 para diluyente y reactivos lisantes también
están acoplados a recipientes de almacenamiento a granel 193.
Cuando la secuencia de flujo pide el llenado de un depósito, el
interruptor detector de nivel (no representado) en los depósitos
192 verifica una condición de lleno en el depósito, y si el
instrumento controlador determina que el depósito puede tolerar la
secuencia de llenado en ese momento, una línea neumática de control
189 se conmuta de aplicar una presión positiva a aplicar un vacío
de aproximadamente 15 pulgadas de mercurio. Este vacío hace que
fluya fluido del recipiente de almacenamiento a granel 193 al
depósito 192 hasta que el interruptor detector de nivel detecte que
el depósito 192 está lleno, tiempo en el que la línea neumática de
control 189 vuelve a una presión positiva y cesa el flujo de fluido
del recipiente de almacenamiento a granel 193 al depósito 192. Los
reactivos Mab se pueden suministrar por módulos de reactivo
preempaquetados desechables 122 (representados en las figuras 3 y
4).
El analizador 64 está provisto de sensores de
fluido (no representados) para determinar cuándo uno de los
recipientes a granel está vacío. Estos sensores detectan burbujas
de aire aspiradas a los tubos entre los recipientes de
almacenamiento a granel 193 y los depósitos 192. El analizador 64
informa al módulo de estación de datos 68 que, a su vez, envía
señales al operador acerca del recipiente vacío. El operador puede
sustituir entonces el recipiente vacío por uno lleno e indicar
mediante la interface de usuario a la estación de datos 68 que el
recipiente ha sido sustituido. Hasta que el recipiente sea
sustituido, el analizador 64 no aspirará más muestras de los tubos
de muestra, aunque el procesado de muestras ya iniciado continuará
con el reactivo suficiente que queda en los depósitos.
La aspiración y dispensación por la sonda de
aspiración 156 y la sonda de incubación 160 se efectúan por una
serie de bombas de pistón 190. Las figuras 7 y 8 ilustran cómo la
sonda de aspiración 156 y la sonda de incubación 160 están
conectadas a bombas de pistón 190 y los depósitos de reactivo 192.
El volumen y caudal de estas transferencias de fluido son
controlados por el analizador 64 y la estación de datos 198.
Como se representa en la figura 7, la sonda de
aspiración 156 está acoplada a un depósito de diluyente 192
mediante una válvula 194 y la bomba de pistón 190. La figura 8
ilustra la sonda de incubación 160 acoplada a un depósito de
diluyente 192 mediante una válvula 200 y una bomba de pistón
190.
Preferiblemente, las bombas de pistón 190 son
bombas rotativas reversibles capaces de aspirar un volumen
predeterminado de fluido por cada rotación del pistón. Cada bomba
de pistón 190 aspira fluido cuando su pistón gira en una dirección,
y deposita fluido cuando su pistón gira en otra dirección. Se
describen bombas de pistón adecuadas en las Patentes de Estados
Unidos 4.941.809, 5.015.157, 5.020.980 y 5.044.889.
La figura 9 ilustra cómo el depósito de colorante
de reticulocito 196 está conectado a la copa de reticulocito 136
mediante válvulas 202 y 203 y una jeringa de colorante de
reticulocito 191.
También se puede medir y suministrar diluyente a
las copas de muestra mediante jeringas de diluyente (no
representadas) y la red de tubos 182. Las jeringas de diluyente y
la jeringa de colorante de reticulocito 191 son sustancialmente
similares a las jeringas de distribución 204, 206, 208,
representadas en las figuras 10A, 10B, 11A, 11B y 12. Las jeringas
de diluyente se puede conectar a la red de tubos 182.
Las figuras 10A, 10B, 11A, 11B y 12 ilustran cómo
se suministran muestras preparadas para la medición desde las copas
de muestra a las celdas de flujo/transductores 170, 174, 178.
La figura 10A ilustra la transferencia a granel
de muestra desde una copa de muestra 216 a la proximidad del
transductor de impedancia 174 mediante la bomba 220. La figura 10B
ilustra la distribución dosificada de la muestra por la jeringa de
distribución de RBC 204 al transductor de impedancia 174. La copa de
muestra 216 está conectada a la jeringa RBC 204, el transductor de
impedancia 174 y una bomba peristáltica 220 por tubos 182. Una
primera válvula 210 está colocada en el tubo 182 hacia abajo de la
copa de muestra 216, y una segunda válvula 212 está colocada en el
tubo 182 hacia arriba de la bomba peristáltica 220. El caudal y la
operación general de la jeringa RBC 204 son controlados
automáticamente por los circuitos electrónicos y software del
analizador.
La transferencia a granel de muestra desde la
copa de muestra 216 a la proximidad del transductor de impedancia
174 se produce cuando las válvulas primera y segunda 210, 212 están
abiertas, como se representa en la figura 10A, y la bomba
peristáltica 220 es accionada. La distribución dosificada de la
muestra desde la jeringa RBC 204 al transductor de impedancia 174 se
produce cuando las válvulas primera y segunda 210, 212 están
cerradas, como se representa en la figura 10B, y el émbolo 224 de
la jeringa RBC 204 se desplaza una distancia predeterminada a una
velocidad especificada.
La figura 11A ilustra la transferencia a granel
de muestra de una copa de muestra 230 a la proximidad de la celda
de flujo óptico 170 mediante la bomba 232. La bomba 232 puede ser
sustancialmente parecida a la bomba 220. La figura 11B ilustra la
distribución dosificada de la muestra por la jeringa de
distribución WBC 206 a la celda de flujo óptico 170. La copa de
muestra 230 está conectada a la jeringa WBC 206, la celda de flujo
óptico 170 y una bomba peristáltica 232 por tubos 182. Una primera
válvula 236 está colocada en el tubo 182 hacia abajo de la copa de
muestra 230, y una segunda válvula 238 está colocada en el tubo
182 hacia arriba de la bomba peristáltica 232.
Como se representa en la figura 11A, la
transferencia a granel de muestra de la copa de muestra 230 a la
proximidad del transductor óptico 170 se produce cuando las
válvulas primera y segunda 236, 238 están abiertas y la bomba 232 es
accionada, desplazando por lo tanto un volumen de muestra a la
proximidad de la celda de flujo óptico 170. La distribución
dosificada de la muestra por la jeringa WBC 206 a la celda de flujo
óptico 170 se produce cuando las válvulas primera y segunda 236,
238 están cerradas, como se representa en la figura 11B, y el
émbolo 240 de la jeringa WBC 206 se desplaza una distancia
predeterminada a una velocidad especificada.
La figura 12 ilustra la transferencia a granel de
una muestra desde una copa de muestra HGB 142 al transductor HGB
178. La copa de muestra HGB 142 está conectada al transductor HGB
178 y una bomba 246 por tubos 182. La bomba 246 puede ser
sustancialmente parecida a la bomba 220. Una válvula 248 está
colocada en el tubo 182 hacia abajo de la copa de muestra HGB 142.
La transferencia a granel de muestra desde la copa de muestra HGB
142 al transductor HGB 178 se produce cuando la válvula 248 está
abierta y la bomba peristáltica 246 es activada.
Dentro de la celda de flujo óptico 170 las
células individuales están aisladas dentro de una corriente de
fluido de manera que las propiedades ópticas de cada célula se
puedan detectar y convertir a información significativa. Las
figuras 15 y 16 ilustran una celda de flujo 170 para uso con el
sistema analítico celular 60.
En una realización (ilustrada en la figura 43),
la celda de flujo óptico 170 es un bloque de cuarzo claro con una
cámara de flujo interior rectangular, alargada, fina 300 (figura
16) de dimensiones transversales de aproximadamente 160 \mu por
400 \mu. Un canal sustancialmente cónico en un ángulo de
aproximadamente 30 grados converge a la cámara de flujo 300 en su
extremo. Se inyecta una corriente de muestra diluida desde una
boquilla 270 colocada en el centro de una corriente envuelta móvil
304 a la cámara de flujo 300 de tal forma que la porción de muestra
de la corriente sea enfocada a una dimensión en sección transversal
muy pequeña, aproximadamente 5 \mu x 80 \mu, normal al eje de
flujo de la corriente y confinada en el centro de la cámara de flujo
300. Este proceso se denomina enfoque hidrodinámico o de fluido. En
una posición predeterminada a lo largo del eje de la corriente
enfocada, se dirige un haz láser a la cámara de flujo 300 desde una
dirección ortogonal a la corriente de muestra fluida. En la región
donde el haz láser intersecta la corriente de muestra enfocada, el
haz láser también es enfocado ópticamente, como se describe más
adelante en la sección 8. F, a una dimensión de aproximadamente 17
\mu en una dirección paralela al eje de flujo de la corriente.
Así, se crea un volumen de muestra iluminado en el centro de la
cámara de flujo 300 en la región donde se enfocan la corriente y el
haz láser, delimitada en dos dimensiones por la extensión de la
corriente, y en una tercera dimensión por la extensión del haz
láser. Este volumen iluminado, con las dimensiones de
aproximadamente 5 \mu x 80 \mu x 17 \mu es la región
detectora de la celda de flujo 170. Cada célula es detectada cuando
pasa por esta región y los datos son recogidos y procesados por el
controlador y se refieren los resultados. Véase la figura 43.
A continuación se explican detalles ejemplares de
la boquilla 270 con referencia a las figuras 31 a 36.
Como se representa en la figura 32, las
realizaciones aquí descritas se refieren a una boquilla de fluido
270 y un método para introducir un fluido 812, el fluido 812
implicado es el fluido usado en el instrumento analítico.
En un empleo, ilustrado en la figura 31, la
boquilla de fluido 270 está asociada operativamente con un conducto
o una guía de flujo 814 del fluido 812 y una celda de flujo 170 que
detecta un elemento de interés, tal como una célula, una partícula
y análogos, presente en el fluido 812. En la realización ilustrada,
la guía de flujo 814 incluye un conducto formado a partir de un
material adecuado, tal como un polímero parecido a acrílico,
incluyendo un agujero 818 para recibir la boquilla de fluido 270.
La boquilla de fluido 270 está centrada sustancialmente con
respecto a la guía de flujo 814 para facilitar la dirección del
fluido 812 desde la boquilla de fluido 270 al agujero 818. Un
conducto 820 está conectado por fluido con el agujero 818 de tal
manera que un fluido deseado 844 de una fuente adecuada se pueda
depositar en el agujero 818 a través del conducto 820. La celda de
flujo 170, como se ha descrito anteriormente, puede ser una celda
óptica de flujo que mide el elemento de interés en el fluido 812
cuando el fluido 812 fluye desde la boquilla de fluido 270 a través
de la celda de flujo 170. La celda de flujo 170 se puede utilizar,
en algunas realizaciones, para efectuar un análisis diferencial de
glóbulos blancos, análisis de plaquetas y/o análisis de
reticulocitos. En estas realizaciones, los pasos preparatorios para
cada análisis se pueden realizar en recorridos de procesado, que
pueden estar separados, y el análisis se puede realizar en una sola
celda de flujo 170.
La construcción de la boquilla de fluido 270 se
ilustra más claramente en las figuras 32 y 33. La boquilla de
fluido 270 incluye en general un colector 822 y una pluralidad de
conductos conectados de forma fluida con el colector 822. El número
exacto de conductos se puede elegir para facilitar un empleo
particular de la boquilla de fluido 270. Específicamente, en una
realización ejemplar, un primer conducto 262, un segundo conducto
264 y un tercer conducto 266 están conectados de forma fluida con
una porción del colector 822. Los conductos 262, 264 y 266 se
pueden usar como entradas de fluido 812. Así, los conductos 262,
264 y 266 pueden estar conectados de forma fluida con fuentes
adecuadas de fluido deseado 812.
En una realización particular, el colector 822
está hecho de un polímero adecuado, tal como acrílico y análogos, y
tiene una longitud axial de aproximadamente 17,8 mm (0,7 pulgadas).
Los conductos 262, 264 y 266 son de un metal adecuado, tal como
acero inoxidable 316 y análogos. El conducto 262 puede tener una
longitud axial de aproximadamente 1,14 pulgadas, un diámetro interno
de aproximadamente 0,58 mm (0,023 pulgadas) y un diámetro externo
de aproximadamente 1,58 mm (0,0625 pulgadas). Los conductos 264 y
266 pueden tener una longitud axial de aproximadamente 12,7 mm (0,5
pulgadas), un diámetro interno de aproximadamente 0,48 mm (0,019
pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 1,59 mm (0,0625
pulgadas). Las superficies de diámetro exterior de los conductos
262, 264 y 266 se pueden recubrir con un adhesivo, tal como una
epoxi y análogos, e introducir en agujeros complementarios 830, 832
y 834, respectivamente, formados en el colector 822. En la
realización ilustrada, los conductos 262, 264 y 266 están desviados
axial y circunferencialmente en el colector 822. El conducto 266
está desviado axialmente aproximadamente 1,8 mm (0,07 pulgadas) de
un extremo 831 del colector 822. El conducto 264 está desviado
aproximadamente 6,6 mm (0,26 pulgadas) del extremo 831 y el conducto
266 está desviado aproximadamente 11,4 mm (0,45 pulgadas)
axialmente del extremo 831. Circunferencialmente, el conducto 262
está desviado aproximadamente 60 grados del conducto 264 y el
conducto 266 está desviado aproximadamente 60 grados del conducto
264. Así, el conducto 262 está desviado aproximadamente 120 grados
del conducto 266.
El colector 822 conecta de forma fluida los
conductos 262, 264 y 266 con los conductos 272, 274 y 276,
respectivamente, que también están asociados operativamente con el
colector 822. El colector 822 puede permitir que uno de los
conductos 272, 274 y 276 esté dedicado a un fluido particular o
prueba realizada por el instrumento con el que la boquilla 270 está
asociada.
Los conductos 272, 274 y 276 están dispuestos de
forma sustancialmente coaxial y sustancialmente en el centro con
respecto a la guía de flujo 814. La disposición de los conductos
272, 274 y 276 con respecto a la guía de flujo 814 y la celda de
flujo 170 se puede elegir para proporcionar la exactitud posicional
deseada del flujo de fluido 812 desde la boquilla 270 a la celda de
flujo 170. El colector 822 incluye un agujero 42 para recibir la
disposición sustancialmente coaxial de los conductos 272, 274 y
276. El colector 822 permite que el fluido 812 en los conductos 262,
264 y 266 fluya a través del colector 822 y a los conductos 272,
274 y 276, respectivamente. Los conductos 272, 274 y 276 son
sustancialmente lineales en toda su longitud. Sin embargo, en
algunas realizaciones, para preservar la disposición coaxial de los
conductos 272, 274 y 276, se puede disponer un espaciador, no
representado, radialmente entre los conductos 272 y 274 y entre los
conductos 274 y 276. El separador está configurado, tal como
disponiendo relieves, canales y análogos en la superficie de
diámetro externo, de modo que no interfieran con el movimiento del
fluido 812 en los conductos 272, 274 y 276. Aunque la realización
ilustrada muestra extremos distales de los conductos 272, 274 y 276
desviados axialmente uno de otro, esto no es necesario.
En una realización ejemplar, el conducto 272 se
hace de un metal adecuado, tal como acero inoxidable 304, tubo de
aguja hipodérmica de temple nº 3 (duro pleno) y análogos. El
conducto 272 tiene una longitud axial de aproximadamente 64,8 mm
(2,55 pulgadas), un diámetro interno de aproximadamente 0,33 mm
(0,013 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 0,64 mm
(0,025 pulgadas). El conducto 274 también se hace de un metal
adecuado, tal como acero inoxidable 304, tubo de aguja hipodérmica
de temple nº 3 (duro pleno) y análogos. El conducto 274 tiene un
diámetro interno de aproximadamente 0,97 mm (0,038 pulgadas), un
diámetro externo de aproximadamente 1,27 mm (0,050 pulgadas) y una
longitud axial de aproximadamente 57,4 mm (2,26 pulgadas). El
conducto 276 se hace de un metal adecuado, tal como tubo de aguja
hipodérmica de acero inoxidable 304 y análogos. El conducto 276
tiene un diámetro interno de aproximadamente 0,062 pulgadas, un
diámetro externo de aproximadamente 1,98 mm (0,078 pulgadas) y una
longitud axial de aproximadamente 50 mm (1,97 pulgadas).
En una realización, la guía de flujo 814 incluye
una porción sustancialmente ahusada que tiene un diámetro interno
de aproximadamente 6,35 mm (0,25 pulgadas), en el punto "A", y
un diámetro interno de aproximadamente 3 mm (0,118 pulgadas), en el
punto "B". Ambos puntos A y B se marcan en la figura 31. La
relación entre las dimensiones de los conductos relevantes 272, 274
y 276 y las dimensiones correspondientes de la guía de flujo 814
puede ser predeterminada para proporcionar enfoque deseado del
fluido 812, para reducir una probabilidad de contacto entre la guía
de flujo 814 y el fluido 812, para optimizar la celda de flujo 170,
por ejemplo, la óptica, la operación, etc. En algunas realizaciones,
la relación dimensional se puede relacionar con el caudal
diferencial. Específicamente, en una realización ejemplar, una
sección transversal latitudinal de porciones relevantes de la guía
de flujo 814 es proporcional a un caudal diferencial
relacionado.
En una realización ejemplar, la porción ahusada
define una pendiente de aproximadamente 60 grados. Una porción de
transporte de fluido de la celda de flujo 170 junto a un extremo
distal de la boquilla de fluido 270 define una pendiente de
aproximadamente 30 grados con un diámetro interno de
aproximadamente 3 mm (0,118 pulgadas). Las dimensiones se pueden
elegir para producir la exactitud posicional prevista del flujo de
fluido 812 con respecto a la celda de flujo 170.
Habiendo descrito así con detalle la construcción
de la boquilla de fluido 270, ahora se explicará con detalle un
método de introducir fluido con la boquilla de fluido 270.
Una fuente de fluido 812, tal como sangre, un
componente de la sangre y análogos, a procesar por la celda de
flujo 170, está conectada por fluido con uno de los conductos 262,
264 ó 266 de tal manera que fluya fluido 812 desde la fuente al
conducto seleccionado 262, 264 ó 266. Los otros conductos 262, 264 ó
266 que no están conectados de forma fluida con la fuente de fluido
812, no reciben fluido 812. El fluido 812 contiene un elemento de
interés, tal como una partícula, una célula y análogos, detectable
por la celda de flujo 170.
Una fuente de otro fluido 844, tal como agua,
solución tampón, diluyente u otro fluido que no reaccione
adversamente con el fluido 812, y análogos, está conectada por
fluido con el conducto 820 de tal manera que el otro fluido 844
fluya desde la fuente al conducto 820 y la guía de flujo 814. El
fluido 844 que fluye desde el conducto 820 a la guía de flujo 814
rodea una porción de los conductos 272, 274 y 276, como se
representa en las figuras 34 a 36. Las disposiciones desviadas de
los conductos 272, 274 y 276 permiten la reducción de las
discontinuidades del flujo de fluido 844. Una reducción gradual en
la sección transversal latitudinal del recorrido de flujo de
fluido mediante la guía de flujo 814 permite una reducción de la
probabilidad de difusión de fluido dentro de la guía de flujo 814.
Si se desea, cuando fluye fluido 812 desde uno de los conductos
272, 274 ó 276, los otros dos conductos 272, 274 ó 276 se pueden
limpiar o "purgar" con fluido 844 aplicando una fuente
apropiada de presión relativamente reducida, por ejemplo, a los
conductos 272, 274 ó 276 que se limpian. Alternativamente, después
de haber introducido secuencialmente fluido 812 mediante cada uno de
los conductos 272, 274 y 276, todos los conductos 272, 274 y 276 se
pueden limpiar simultáneamente pasando un fluido apropiado por los
conductos. Así, dado que todos los conductos 272, 274 y 276 se
pueden limpiar de forma sustancialmente simultánea, se puede
incrementar la producción de la celda de flujo 170 reduciendo el
tiempo de parada necesario para limpiar la boquilla 270 realizando
también la introducción rápida de fluido 812. Esto también puede
aumentar correspondientemente la producción del instrumento
analítico con el que la celda de flujo 170 está asociada.
En una realización ejemplar, el caudal de fluido
844 es mayor que el caudal de fluido 812. Por ejemplo, en una
realización, el caudal de fluido 812 es aproximadamente 2,5 \mul
por segundo y el caudal del fluido 844 es aproximadamente 300
\mul por segundo. Este caudal diferencial dirige de forma fluida
o enfoca el flujo de fluido 812 hacia la celda de flujo 170. En
general, la velocidad diferencial de flujo puede ser predeterminada
de tal manera que se facilite la detección del elemento de interés
en el fluido 812 por la celda de flujo 170.
El enfoque de fluido proporcionado por el caudal
diferencial es sustancialmente similar independientemente del
conducto 272, 274 ó 276 elegido para introducir el fluido 812
puesto que el fluido 812 introducido desde el conducto 272, 274 ó
276 es enfocado de forma fluida sustancialmente hacia la misma
posición con respecto a la celda de flujo 170. Esto permite que los
fluidos 812 de cada uno de los conductos 272, 274 y 276, y las
pruebas realizadas por el instrumento con el que la boquilla de
fluido 270 está asociada, compartan la misma celda de flujo 170.
Por consiguiente, cada uno de los conductos 272, 274 y 276 puede
estar conectado de forma fluida con una fuente separada de fluido
812 de tal manera que se reduzca la probabilidad de que el fluido
812 de una fuente pueda encontrar el fluido 812 de otra fuente.
Así, se puede reducir la probabilidad de cruce de fluido 812 y/o
contaminación de fluido 812. Los fluidos 812 de cada uno de los
conductos 272, 274 y 276 pueden ser procesados por la celda de flujo
170 de forma sustancialmente paralela, mejorando por ello la
producción de la boquilla de fluido 270 y el instrumento con el que
la boquilla 270 está asociada.
Esta capacidad de la boquilla de fluido 270 se ha
verificado empíricamente. En un experimento, ilustrado en las
figuras 34 a 272, se analizó una realización ejemplar de la
boquilla de fluido 270 por un método de elementos finitos para
revelar las propiedades fluidas asociadas con la boquilla 270. En
esta realización, el conducto 272 tiene un diámetro interno de
aproximadamente 0,33 mm (0,013 pulgadas). El extremo distal del
conducto 274 está desviado de forma próxima aproximadamente 7,4 mm
(0,29 pulgadas) del extremo distal del conducto 272. Los conductos
272 y 274 definen un recorrido de flujo de fluido sustancialmente
anular que tiene un diámetro interno de aproximadamente 0,64 mm
(0,025 pulgadas) y un diámetro externo de aproximadamente 0,94 mm
(0,037 pulgadas). El extremo distal del conducto 276 está desviado
de forma próxima aproximadamente 0,29 pulgadas de un extremo distal
del conducto 274. Los conductos 274 y 276 definen un recorrido de
flujo de fluido sustancialmente anular que tiene un diámetro
interno de aproximadamente 1,25 mm (0,049 pulgadas) y un diámetro
externo de aproximadamente 1,55 mm (0,061 pulgadas).
El análisis de elementos finitos se realizó
usando un programa informático FIDAP, versión 6.01, que se puede
adquirir de Fluid Dynamics International de Evanston, Illinois. Se
analizaron modelos axisimétricos constantes de flujo de fluido
mediante los conductos 272, 274 y 276 y modelos tridimensionales
constantes de flujo de fluido mediante la celda de flujo 170 para
mostrar que la posición del fluido enfocado de forma fluida 812 con
respecto a la celda de flujo 170 es independiente del conducto 272,
274 ó 276 usado para introducir fluido 812. En todos los casos, el
caudal de fluido del fluido 844 es aproximadamente 300 \mul por
segundo y el caudal de fluido del fluido 812 mediante el conducto
elegido 272, 274 ó 276 está sustancialmente dentro del rango de
aproximadamente 2,5 \mul por segundo a aproximadamente 2,0 \mul
por segundo. Los análisis supusieron propiedades fluidas
newtonianas sin condiciones límite de deslizamiento en las
superficies sólidas.
En un ejemplo, para simular análisis diferencial
de glóbulos blancos, análisis de plaquetas, y análisis de
reticulocitos, se realizaron tres análisis de fluido separados. El
fluido del análisis diferencial de glóbulos blancos 812 se
introduce a través del conducto 272, como se representa en la figura
34, a un caudal de fluido de aproximadamente 2,5 \mul por
segundo. Como se representa en la figura 35, el fluido de análisis
de plaquetas 812 se introduce a través del conducto 274 también a
un caudal de fluido de aproximadamente 2,5 \mul por segundo. El
fluido de análisis de reticulocitos 812 se dirige a través del
conducto 276, como se representa en la figura 36, a una velocidad de
aproximadamente 2,0 \mul por segundo. Después de la comparación
de las figuras 34 a 272, los recorridos de flujo de fluido de los
conductos respectivos 272, 274 y 276 resultantes de los análisis de
fluido demuestran que no se produce contaminación de un flujo de
fluido 812 por un flujo de fluido anterior 812 y que la posición del
fluido enfocado de forma fluida 812 con respecto a la celda de
flujo 170 es independiente de qué conducto 272, 274 ó 276 se
seleccione.
La independencia de la posición del fluido
enfocado de forma fluida 812 con respecto a la celda de flujo 170
con respecto a la selección del conducto 272, 274 ó 276 también se
verifica experimentalmente midiendo ópticamente el flujo de fluido
812 conteniendo perlas de 7 \mum de diámetro secuencialmente
mediante cada uno de los conductos 272, 274 y 276. El fluido 812
conteniendo las perlas se introduce a un caudal de fluido de
aproximadamente 2 \mul por segundo.
% C.V., Índice en coincidencia | |||||
ALL | IAS | DSS | |||
Conducto 272 | 4,7 | 3,2 | 2,6 | ||
4,3 | 3,1 | 2,2 | |||
Conducto 274 | 5,0 | 3,6 | 2,0 | ||
4,6 | 4,2 | 2,6 | |||
Conducto 276 | 4,3 | 31 | 2,4 | ||
5,1 | 28 | 2,7 |
Como es evidente por los coeficientes de
variación anteriores, los coeficientes de variación (CV) para tres
propiedades ópticas medidas (ALL: pérdida de luz axial; IAS:
dispersión de ángulo intermedio; y DSS: dispersión lateral
despolarizada) son sustancialmente similares para todos los
conductos 272, 274 y 276. Esta semejanza en la respuesta óptica
verifica que la boquilla de fluido 270 se puede usar para múltiples
mediciones del fluido de interés 812 antes de cualquier paso de
limpieza, incrementando por ello la producción o capacidad
analítica de la celda de flujo 170 y cualquier instrumento asociado
con la celda de flujo 170. El número de mediciones de fluido 812 o
introducciones de fluido 812 que se pueden producir antes de la
limpieza corresponde al número de conductos provistos con la
boquilla de fluido 270. Independientemente del número de conductos
implicados, las realizaciones aquí descritas permiten
sustancialmente la limpieza simultánea de sustancialmente todos los
conductos.
Si el fluido 812 tuviese suficiente propensión a
interactuar con o adherirse a una porción de los conductos 272, 274
y 276, los restos de un primer fluido en el conducto 272, 274 ó 276
pueden encontrar (es decir, transferir) un segundo fluido pasado
por el mismo conducto 272, 274 ó 276. Cuestiones similares están
presentes con respecto a los conductos 262, 264 y 28. Estas
cuestiones pueden poner en peligro la exactitud de la celda de
flujo 170.
Para afrontar estas cuestiones, es posible
dedicar un conducto específico 272, 274 ó 276 a un fluido
específico 812 o prueba realizada por la celda de flujo 170. El
número de conductos 272, 274 y 276 así dedicado puede depender de
las propiedades de los fluidos 812 introducidos por la boquilla de
fluido 270. Aislando sustancialmente al menos uno de los conductos
272, 274 y 276, se puede reducir la transferencia de un fluido 812
a otro fluido 812. Por ejemplo, un conducto 272, 274 ó 276 podría
estar dedicado a una prueba que utilice un fluido 812 conteniendo
un marcador fluorescente relativamente brillante, tal como auromina
O y análogos, y otro conducto 272, 274 ó 276 podría estar dedicado a
una prueba que utilice un fluido conteniendo un marcador
fluorescente relativamente tenue. Una vez que los fluidos salen de
los conductos 272, 274 ó 276, el volumen y flujo de fluido 844
mediante la guía de flujo 814 es suficiente para reducir la
probabilidad de difusión de fluido 812 enfocando al mismo tiempo de
forma fluida el fluido 812 hacia una celda de flujo común 170. Así,
las dos pruebas se pueden realizar sustancialmente secuencialmente
por la misma celda de flujo 170 sin poner en peligro
sustancialmente la exactitud o sensibilidad de la celda de flujo
170.
Al subir a la sección transversal rectangular de
la celda de flujo 170, la velocidad aumenta rápidamente, lo que
enfoca hidrodinámicamente la corriente de muestra a un núcleo
central que mide aproximadamente 5 \mu x 80 \mu de sección
transversal. La pequeña dimensión de 5 \mu, que es en la dirección
de enfoque de la lente condensadora de ángulo ancho ilustrada en la
figura 22, garantiza mínimo desenfoque y por lo tanto igual brillo
de células fluorescentes situadas en posiciones diferentes dentro
de la corriente. Además, dado que la anchura de la cámara de flujo
300 es mucho más grande que la corriente de muestra, la cámara de
flujo 300 no se obstruirá fácilmente; sin embargo, todavía da
resolución comparable a la proporcionada por una región de detección
más pequeña.
Una lente de enfoque (representada en la figura
19) enfoca un haz láser en la cámara de flujo 300, y detectores
(representados en las figuras 20 y 21) detectan las propiedades de
dispersión de luz y/o fluorescencia de células que pasan por la
cámara de flujo 300. Estas características se describen con más
detalle en la sección 8.F de esta descripción.
El sistema analítico celular 60 puede usar un
transductor de impedancia 174 para contar glóbulos rojos y
plaquetas. La figura 17 ilustra una realización preferida de un
transductor de impedancia 174 que realiza recuento y determinación
de tamaño de células basados en impedancia, y hace uso de enfoque
hidrodinámico. El recuento de células por impedancia se basa en la
detección de cambios de resistencia eléctrica producidos por una
partícula cuando pasa por un orificio pequeño 314. La conducción la
facilita un fluido electrolítico (tal como salina tamponada y
análogos) en dos cámaras 310, 312 del transductor de impedancia
174.
Una boquilla de introducción de muestra 316 y
enfoque hidrodinámico dirigen células al orificio 314 del
transductor de impedancia 174. Cuando cada célula pasa por el
orificio 314, aumenta la resistencia eléctrica del recorrido a
través de las cámaras 310, 312 y el orificio 314. Una fuente de
corriente 317 conectada a dos electrodos, descritos más adelante,
dispuestos en las cámaras 310, 312 a ambos lados del orificio 314
hace que este aumento de resistencia se manifieste como un pulso de
voltaje eléctrico. La boquilla de introducción de muestra 316
también sirve como el electrodo de lado situado hacia arriba. El
electrodo secundario 318 está situado hacia abajo del orificio 314.
El número de pulsos es indicativo del recuento de células, mientras
que la amplitud de cada impulso está relacionada con el volumen de
células. Se crean histogramas de volumen representando las
distribuciones de frecuencia de amplitudes de pulsos. Estos
histogramas se utilizan para obtener parámetros RBC y PLT tal como
MCV (volumen medio de células) y RDW (anchura de la distribución de
glóbulos rojos).
El transductor de impedancia 174 se hace
preferiblemente de un material que es no conductor y transparente,
tal como acrílico, un polímero similar o análogos. El electrodo
secundario 318 en el transductor 174 es preferiblemente de platino
porque la electrólisis a esta polaridad crea gases corrosivos que
pueden disolver algunos otros materiales de electrodo. Se puede usar
para el electrodo 318otros materiales que tienen una resistencia
similar a la corrosión. El volumen de la cámara 310 en el lado
ascendente del transductor 174 se puede reducir sin afectar a la
operación del transductor 174 para las aplicaciones descritas. La
boquilla de introducción de muestra 316 se coloca preferiblemente
dentro de aproximadamente 1,5 mm del orificio 314. La distancia
entre la boquilla 316 y el orificio 314 se deberá mantener durante
la operación, así como una velocidad de envuelta relativamente alta
(aproximadamente 10 m/s a través del orificio).
Aproximadamente 30% de las células que fluyen a
través de un transductor de impedancia enfocado de forma no
hidrodinámica pasan cerca de los bordes del orificio de la celda de
flujo en vez de pasar por su centro. Esto puede obstruir el
orificio y producir mediciones distorsionadas. El enfoque
hidrodinámico se puede utilizar en el transductor de impedancia 174
del sistema analítico celular 60 para reducir las obstrucciones y
mejorar la exactitud de la medición.
El enfoque hidrodinámico se lleva a cabo en el
transductor de impedancia 174 mediante el procedimiento siguiente.
La jeringa de distribución de RBC 204 (representada en las figuras
10A y 10B) suministra la muestra a la boquilla 316 del transductor
de impedancia 174 a una velocidad de aproximadamente 0,333
\mul/s. Cuando la muestra fluida sale de la boquilla del
transductor de impedancia 316, se acelera a una velocidad de
aproximadamente 10 m/s por un flujo envolvente RBC 315. Dado que la
velocidad de flujo volumétrico de la muestra, que es
preferiblemente sustancialmente constante a aproximadamente 0,333
\mul/s, es el producto de la velocidad y el área en sección
transversal, esta zona disminuye a medida que se acelera la muestra.
En una realización preferida, la aceleración a 10 m/s hace que el
diámetro de la corriente de muestra disminuya a aproximadamente 6,5
\mum.
El transductor de impedancia 174 está provisto de
un tubo de residuos 314a situado inmediatamente hacia abajo del
orificio 314 para "capturar" glóbulos rojos cuando salen del
orificio. Si los glóbulos rojos no se desechan después de salir del
orificio 314, pueden volver a la proximidad del orificio, y por lo
tanto generar señales que distorsionan las mediciones de plaquetas y
en menor grado distorsionan la medición de glóbulos rojos. Para
contribuir a capturar células medidas, se facilita un flujo
secundario (mediante el orificio E) solamente para empujar las
células hacia abajo del tubo de residuos 314a.
El transductor de impedancia 174 también está
provisto de varios orificios (A, B, C, D y E). El orificio A
proporciona un agujero de ventilación para ventilar aire (u otros
gases) del lado ascendente del orificio 314. El orificio B
proporciona una entrada para inyectar aire a la cámara 310 para
drenar el lado ascendente del transductor 174. El orificio D
proporciona el drenaje para el lado ascendente del transductor,
junto con un orificio de entrada envolvente. El orificio C
proporciona una entrada para inyectar aire a la cámara 312 para
drenar el lado descendente del transductor 174. El orificio C
también proporciona un agujero de ventilación para ventilar gas del
lado descendente del transductor 174. El orificio E proporciona un
drenaje y una entrada para el flujo secundario. El orificio G
proporciona una salida para residuos. El orificio H, aunque no se
usa en la presente realización, se puede usar para proporcionar un
punto de entrada tangencial para fluidos adicionales al lado
ascendente del transductor 174.
El transductor HGB 178 mide la absorción óptica
de células en una muestra de sangre para determinar los niveles de
HGB en la muestra de sangre. Un transductor HGB 178 se representa
en la figura 18, junto con un diagrama de bloques de circuitería
para detectar y analizar señales del transductor HGB 178. En una
realización, la concentración de HGB se mide en gramos por
decilitro, y es proporcional a la cantidad de luz absorbida por una
muestra en la región verde de longitud de onda (aproximadamente 540
nm).
El transductor HGB 178 genera una señal eléctrica
que está relacionada con la absorción de luz del líquido en la
cámara de transductor HGB 338. La absorción de luz se mide en el
transductor HGB 178 para una muestra preparada conteniendo
hemoglobina y para una solución de referencia clara. La diferencia
en señal eléctrica generada por el transductor durante estas dos
mediciones es aproximadamente proporcional al contenido de
hemoglobina de la muestra preparada.
La cámara de transductor HGB 338, que puede ser
transparente, está colocada entre una fuente de luz 322, tal como
un diodo fotoemisor y análogos, y un detector 326, tal como un
fotodiodo, un fototransistor y análogos (figura 18). Un filtro de
interferencia 326, preferiblemente a un régimen de aproximadamente
540 nm, se coloca entre la cámara de transductor HGB 338 y el
detector 324. La corriente salida del detector 324, que es
aproximadamente proporcional a la energía luminosa recibida, es
amplificada por un amplificador de corriente a voltaje 332. El
procesado de señal analógica de las señales HGB se explica en la
sección B.F de esta descripción en conexión con los sistemas
electrónicos.
Se mezcla sangre entera en la copa HGB 142 por la
velocidad del reactivo lisante HGB entrante a una relación de
dilución preferiblemente de aproximadamente 190:1. Se utiliza una
bomba 246, que puede ser peristáltica, para aspirar una muestra de
la copa HGB 142, mediante una red de tubos 182 conectada a la copa
HGB 142, y a la cámara de transductor HGB 338. La copa HGB 142 se
enjuaga lavando el reactivo lisante HGB para reducir toda
transferencia de una muestra con las muestras siguientes. Se coloca
reactivo HGB directamente al transductor HGB para proporcionar la
lectura de referencia HGB.
Una vista en planta del banco óptico 350 se
representa en la figura 19. El banco óptico 350 está montado en el
módulo analizador 64 e incluye una fuente de luz láser 352, espejos
354, 356, lentes 358, 360, una celda de flujo 170 (sílice fundida
en una realización ejemplar), y varios detectores 400, 402, 404. El
haz láser 368 se dirige por un espejo trasero 354, un espejo
delantero 356, un ajustador de haz 370, es conformado y enfocado
por un par de lentes cilíndricas 358 y una lente de enfoque de
láser 360.
El láser 352 es preferiblemente un láser de argón
refrigerado por aire, verticalmente polarizado 488 nm (Uniphase
2114B-125LAB, o equivalente) que opera en el modo
TEM (electromagnético transversal) con realimentación de luz. En
este modo, la intensidad luminosa tiene una distribución gaussiana
y está en fase. El haz láser 368 se mantiene a aproximadamente 10
mW por el sistema de realimentación de luz dentro de la circuitería
láser.
Los elementos ópticos entre el láser 352 y la
celda de flujo óptico 170 están construidos de manera que la
cintura del haz focal gaussiano en la cámara de flujo 300 de la
celda de flujo óptico 170 sea sustancialmente elíptica y mida
aproximadamente 17 \mu de alto por aproximadamente 64 \mu de
ancho. La cintura del haz se define como la posición a lo largo del
eje del haz láser donde la dimensión del haz en sección
transversal, en una dirección dada normal al eje, es mínima. En la
realización preferida representada en la figura 19, el sistema
óptico se caracteriza por dos planos de simetría ortogonales, un
plano vertical y un plano horizontal, conteniendo cada uno de estos
planos el eje óptico del haz láser. Por lo tanto, en cualquier
posición a lo largo del eje del haz, la extensión del haz se define
por dos dimensiones ortogonales, una dimensión vertical, y una
dimensión horizontal. La dimensión vertical se define como la
distancia lineal, en el plano vertical medido normal al eje óptico,
entre los puntos donde la intensidad es 1/e^{2} veces la
intensidad máxima que se produce en el centro del haz. La dimensión
horizontal correspondiente se define de forma idéntica a excepción
de que cae en el plano horizontal. Esta configuración del haz se
lleva a cabo por un par de lentes cilíndricas 358 que hacen de un
expansor vertical del haz. Preferiblemente la lente situada hacia
arriba tiene una longitud focal de aproximadamente -18,8 mm, y la
lente situada hacia abajo tiene una longitud focal de
aproximadamente +75,4 mm. Las lentes 358 están colocadas
ligeramente descentradas de la condición confocal de manera que se
produzca una cintura vertical y horizontal coincidente en la cámara
de flujo 300. Preferiblemente, la lente de enfoque 360 es esférica
con una longitud focal de aproximadamente 79,5 mm.
Un mecanismo de ajuste fino del haz 370 está
colocado entre la lente de enfoque de láser 360 y la celda de flujo
170. Este mecanismo consta de un par de pequeñas cuñas de 10º con
un espacio de aire ajustable que se usa para producir un
desplazamiento lateral fino del haz láser con relación a la
corriente de muestra. Estas cuñas se orientan con las superficies
de entrada y salida normales al eje del haz láser. El espacio de
aire se puede ajustar por medio de un tornillo de paso 32 en una
dirección paralela al eje del láser. La relación del espacio de
aire al desplazamiento lateral del haz es 10,5/1 al utilizar vidrio
BK7 como el material de cuña. Una vuelta completa del tornillo de
paso 32 mueve así el haz láser incidente lateralmente \pm75 \mu
con relación a la corriente de muestra, sin producir ningún cambio
en el ángulo de iluminación incidente. La resolución del
desplazamiento lateral del haz es algo inferior a \pm1 \mu.
Este sistema, en unión con el diseño de la óptica de captación de
ángulo delantero y lateral, permite el fácil control para alinear de
forma óptima el haz láser a la corriente de muestra sin afectar a
la alineación de la óptica siguiente.
La cámara de flujo 300 de la celda de flujo 170
tiene preferiblemente una relación de aspecto de aproximadamente
2,5x. El enfoque hidrodinámico dentro de la celda de flujo óptico
170 crea una corriente central de muestra sustancialmente elíptica
con una relación de aspecto de aproximadamente 15x. Cuando el
caudal de muestra es aproximadamente 2,0 \mul/s, la corriente de
muestra resultante es un cilindro sustancialmente elíptico. Las
dimensiones de longitud y anchura de la corriente de muestra son
aproximadamente 80 \mu x 5,0 \mu. La anchura de la corriente de
aproximadamente 5 \mu corresponde a la cintura focal horizontal
de aproximadamente 80 \mu. Esto da lugar a una variación de
intensidad máxima dentro de la corriente de aproximadamente 1%.
La cintura focal vertical de aproximadamente 17
\mu da lugar a una anchura de impulso de aproximadamente 2,0 a
3,5 \mu/s, dependiendo del tamaño de célula, siempre que una
célula pasa por el haz láser 368 a la velocidad nominal de la
corriente de aproximadamente 8 metros/s.
Los detectores 380, 400, 402, y 404 miden los
efectos de las células que pasan a través de la celda de flujo 170.
Preferiblemente, los detectores 380, 400, 402, y 404 son capaces de
medir al menos siete parámetros ópticos. Se coloca uno o más
detectores preferiblemente en el recorrido directo de luz para
medir la dispersión directa de ángulo intermedio y la dispersión
directa de ángulo pequeño o la pérdida de luz axial (ALL, también
denominada extinción directa). ALL es generalmente la disminución
de energía luminosa debida a que una célula pasa delante de un haz
láser y es detectada por un fotodiodo. La pérdida de luz se debe
generalmente a dispersión. Preferiblemente, un parámetro medido es
ALL, definido como la disminución de energía luminosa que llega a un
detector en el recorrido de un haz láser debido al paso de una
célula por dicho haz. La dispersión directa de ángulo pequeño, en
contraposición, es energía luminosa que llega a un detector fuera
de (pero dentro de un estrecho ángulo de 1º a 3º) el haz láser
incidente debido a dispersión de una célula que pasa a través del
haz. Se dispone generalmente un tope de haz para impedir que el haz
láser llegue al detector. Los sistemas de medición ALL recogen luz
dentro del cono incidente de iluminación láser, mientras que los
sistemas de dispersión de ángulo pequeño recogen luz fuera de este
cono. En sistemas de medición ALL, la señal de interés es una señal
negativa restada de la señal láser de régimen constante, mientras
que en medición de dispersión directa de ángulo pequeño la señal es
una señal positiva pequeña impuesta en un nivel de luz de fondo muy
bajo. La dispersión directa de ángulo intermedio (IAS) es similar a
la dispersión directa de ángulo pequeño, a excepción de que la luz
se dispersa a un ángulo más grande del haz láser incidente. Más
específicamente, IAS se refiere a luz dispersada en un aro entre
aproximadamente 3 y 10 grados lejos de la línea incidente o central
de un haz láser. En una realización preferida, ALL se recoge en los
ángulos de menos de aproximadamente 0,3 grados horizontalmente y
menos de aproximadamente 1,2 grados verticalmente del eje del
láser, e IAS se recoge a ángulos de entre aproximadamente 3 grados
y 10 grados del eje del láser.
El sistema óptico de recorrido directo preferido
representado en las figuras 19 y 20 incluye una lente esférica
plano-convexa 376 y un fotodiodo de dos elementos
380 situado en el plano focal trasero de la lente. En esta
configuración preferida, cada punto dentro del fotodiodo de dos
elementos 380 se aplica a un ángulo específico de recogida de luz
de células que pasan por la cámara de flujo 300, independientemente
de la posición de las células. Así, el elemento interno 382 es
preferiblemente sustancialmente rectangular, que por consiguiente
se aplica a la asimetría de la divergencia de haz láser, y mide
ALL. El elemento externo 384 es preferiblemente un aro
sustancialmente circular y por consiguiente se aplica al rango de
ángulos de recogida de dispersión directa deseados para la medición
de IAS.
Esta alineación del recorrido directo es
independiente de la celda de flujo óptico 170 y la alineación fina
de haz láser. Para proporcionar la geometría de recogida deseada,
la posición lateral del detector de dos elementos se alinea con
respecto a la lente de recogida 376. Cambiar la celda de flujo
óptico 170, o reajustar el haz láser incidente 368 por medio del
elemento 370, que solamente reposiciona el haz sin efectuar
redistribución angular, no tiene efecto en la aceptación angular
del detector 380, y por lo tanto no requiere ningún reajuste
correspondiente de la óptica de recorrido directo.
Alternativamente, el detector unitario de dos
elementos 380 se podría sustituir por dos detectores separados. En
este caso, se colocaría un espejo con un agujero central de
diámetro apropiado en el plano trasero de la lente 376. El espejo
reflejaría IAS a uno de los detectores. Una hendidura, coincidente
con el agujero central del espejo y conformada para pasar solamente
el haz láser, transmitiría luz para medición ALL al segundo
detector situado detrás del espejo.
Ambos esquemas antes descritos son una variación
en sistemas de recogida de ángulo pequeño. Los esquemas descritos
no requieren una barra de oscurecimiento y sus ajustes
relacionados. En el primer caso preferido, ambos detectores se
pueden incorporar en un chip. No se requiere espejo. La
incorporación de un filtro de densidad neutra 386, como se
representa en la figura 20, es deseable para evitar que la señal
All sature el elemento ALL interior 382. Preferiblemente, el filtro
386 se obtiene recubriendo el elemento ALL interior 382 con un
recubrimiento de Neutral Density 2.0 (un recubrimiento que transmite
aproximadamente 1 de la luz incidente). Se puede recubrir un
recubrimiento antirreflexión sobre el elemento IAS exterior 384.
En una realización ejemplar, como se ilustra en
las figuras 19 y 21, los detectores restantes 400, 402 y 404 son
tres tubos fotomultiplicadores (PMTs) que detectan dispersión
lateral (luz dispersada en un cono cuyo eje es aproximadamente
perpendicular al haz láser incidente) o fluorescencia (luz emitida
por las células a una longitud de onda diferente del haz láser
incidente). Un polarizador móvil, 436, colocado en el recorrido de
luz de PMT 400 configura los PMTs 400 y 401 para detectar dispersión
lateral despolarizada (DSS) y dispersión lateral polarizada (PSS),
respectivamente, mientras que los filtros móviles (430, 432, 434)
permiten la detección de emisiones fluorescentes a longitudes de
onda especificadas de las células. FL1, fluorescencia verde, se
detecta entre aproximadamente 515 y 545 nm. FL2, fluorescencia
amarilla, se detecta entre aproximadamente 565 y 595 nm. FL3,
fluorescencia roja, se detecta entre aproximadamente 615 y 645 nm.
Las emisiones de dispersión lateral y fluorescente se dirigen a
estos PMTs por divisores de haz dicroicos 401 y 403 que transmiten
y reflejan eficientemente las longitudes de onda requeridas para
permitir una detección eficiente.
La sensibilidad se mejora en los PMTS 400, 402, y
404, cuando se mide fluorescencia, utilizando un sistema de recogida
por inmersión como se ilustra en la figura 22. En este ejemplo, el
sistema de recogida por inmersión es uno que acopla ópticamente la
primera lente 414 a la celda de flujo 170 por medio de una capa de
coincidencia de índice de refracción 416, permitiendo la recogida de
luz en un ángulo ancho. En una realización preferida, este ángulo
de recogida es aproximadamente 130º a la corriente de muestra,
comparable a aproximadamente 44º en un sistema condensador de
espacio de aire típico con una apertura numérica de 0,5. Se puede
mostrar matemáticamente que la energía de fluorescencia recogida de
una partícula fluorescente es proporcional a
(1-cosU), donde U se define como la mitad del
ángulo cónico de recogida. Así el sistema de 130º preferido recoge
casi 8 veces más energía que el sistema de 44º, una diferencia que
permite la detección de fluorescencia con láseres más pequeños de
baja potencia y/o marcadores de fluorescencia más débiles. El
sistema también se corrige en color de manera que se pueda usar un
recorrido óptico dado para longitudes de onda sustancialmente
diferentes sin reenfoque. Esto permite que un solo PMT detecte
varias longitudes de onda de luz interponiendo o sacando filtros
ópticos 430, 432, 434.
Como se representa en las figuras 21, 22 y 24, el
sistema ilustrado de recogida por inmersión es telocéntrico de tal
manera que la superficie de cátodo de un PMT dado se conjugue con
un tope de apertura de objetivo 410 (representado en la figura 22)
y situado al infinito con respecto a la cámara de flujo 300 de la
celda de flujo 170. Esta construcción reduce la necesidad de
alineación precisa de los PMTs uno con respecto a otro y la cámara
de flujo 300.
Como se representa en la figura 22, el
condensador 412 incluye preferiblemente un primer elemento
plano-semiesférico 414 acoplado ópticamente a la
celda de flujo de cuarzo 170 por una capa de gel de coincidencia de
índice 416. En general, el condensador 412 es un sistema de lentes
ópticas con corrección de aberración suficiente para recogida de
luz de ángulo grande, pero no suficiente para formación de imágenes
limitada por difracción utilizada en microscopia de alta
resolución. Un gel adecuado es el que se puede adquirir de Dow
Corning (número de identificación #02-3067). Las
especificaciones de una realización preferida del condensador se
exponen en la Tabla 1.
R_{1} \rightarrow \infty |
t_{12} = 1,82 (ventana de SiO_{2}) |
R_{2} \rightarrow \infty |
t_{23} = 3,913 (FK5 - vidrio flint en corona #487704) |
R_{3} = -3,913 |
d_{34} = 0,929 (Espacio de aire) |
R_{4} = -54,7 |
t_{45} = 5,14 (FK5) |
R_{5} = -9,753 |
d_{56} = 3,348 (Espacio de aire) |
R_{6} = 45,7 |
t_{67} = 2,0 (SF5 - vidrio flint denso #673322) |
R_{7} = 16,853 |
t_{78} = 7,9 (BK7) |
R_{8} = -24,028 |
t_{89} = 0,635 (Espacio de aire) |
R_{9} = 35,649 |
t_{910} = 2,0 (SF5) |
R_{10} = 13,014 |
t_{1011} = 6,95 (BK7) |
R_{11} = -120,59 |
A = 3,913 + 0,02/-0,12 |
B = 1,82 \pm 0,02 |
C = 0,16 \pm 0,02 |
D = 0,929 |
El sistema óptico PMT es preferiblemente modular
y se ilustra en las figuras 23 y 24. Cada módulo PMT incluye 1 ó 2
PMTs y un conjunto de hendidura/lente de campo 420, que incluye una
hendidura 422 y lentes de campo 424 y 425 (figuras 23 y 24). La
hendidura 422, que se conjuga con la cámara de flujo 300, minimiza
la luz de fondo al cátodo del PMT 400. Las lentes de campo 424
(preferiblemente con longitud focal de aproximadamente -12,0 mm) y
425 (preferiblemente con longitud focal de aproximadamente 15,0 mm)
efectúan la configuración telocéntrica explicada anteriormente.
Filtros ópticos 430, 432, 434 y el polarizador 436 están
introducidos en los recorridos de luz de los PMTs para cambiar la
longitud de onda y/o la polarización de la luz detectada. Además,
las dimensiones siguientes se refieren a la figura 24:
\newpage
A = | 46,0 |
B = | 20,61 |
C = | 22,98 |
D = | + 14,976 |
E = | 13,292 |
F = | 0,522 |
G = | 2,0 |
H = | 6,7 |
I = | 3,8 |
J = | 3,78 |
K = | 22,98 |
L = | F_{530} = -12,025 |
R_{1} = -6,248 | |
\Phi = 5,0 | |
t_{1} = 2,0 (BK7) | |
R_{2} \rightarrow \infty | |
Q_{2} = 10,0 | |
M = | 6,43 |
Se deberá indicar que el sistema se diseña de
manera que se pueda añadir fácilmente un tercer módulo PMT, que,
con la adición de espejos dicroicos apropiados y filtros de paso de
banda, permitiría incorporar hasta 6 PMTs en el sistema. Por
ejemplo, cabría imaginar un análisis sofisticado que requiera
mediciones simultáneas de cuatro detectores de fluorescencia junto
con dispersión lateral polarizada (PSS) y despolarizada (DSS).
En una realización ejemplar, ALL se mide por un
fotodiodo sustancialmente rectangular y un filtro N.D. 2,0 (véase la
figura 20). IAS se mide por un fotodiodo de aro exterior sin
filtro. PSS se mide con un Hamamatzu R928 PMT (402) sin filtro. DSS
se mide por un R928 PMT (400) y un polarizador horizontal (436).
FL1 se mide con un R928 (400) PMT y un filtro 530/30 (un filtro de
paso de banda centrado a aproximadamente 530 nm con una banda de
paso de aproximadamente 30 nm, 430). FL2 se mide por un R928 PMT
402 y un filtro de paso de banda 580/30 (432). FL3 se mide con un
R928 PMT (404) y un filtro de paso de banda 630/30 (434).
En una realización preferida del sistema
analítico celular 60, la unidad neumática 72 es una unidad separada
que tiene un suministro de potencia dedicado. Esta construcción
reduce el peso, tamaño y consumo de potencia del módulo analizador
64 y el módulo de estación de datos 68.
La unidad neumática 72 incluye una bomba de
presión y una bomba de vacío. Proporciona una presión regulada de
aproximadamente 1,6\cdot10^{5} Pa (8 1/2 psi), otra presión
desde aproximadamente 12-15 psi, una presión mayor
de aproximadamente 3,7\cdot10^{5} Pa (40 psi), y un vacío de
aproximadamente 0,5\cdot10^{5} Pa (15 pulgadas de
mercurio).
Las presiones de vacío son controladas por el
software analizador presente en una memoria adecuada, tal como una
RAM, una ROM, una EPROM, una SRAM y análogos.
El módulo de estación de datos 68 es
preferiblemente un ordenador compatible PC basado en 80386 ó 80486
incluyendo un terminal de visualización, unidad de disco, disco
duro, teclado, puntero y conexión LAN. En una realización ejemplar,
el terminal de visualización es en color, la unidad de disco es de
3,5 pulgadas, el disco duro tiene al menos 540 megabytes de memoria
y el teclado es de tipo PC. La estación de datos 68 puede estar
provista de memorias, tal como RAMs, ROMs, SRAMs, EPROMs y
análogos, conteniendo suficientes algoritmos de software para
manipular datos medidos, calcular parámetros, y presentar
resultados en varios formatos, incluyendo histogramas, diagramas de
dispersión, y otros gráficos multidimensionales.
La estación de datos 68 del sistema analítico
celular 60 tiene memorias y otros dispositivos que aplican
algoritmos para varios análisis celulares. Estos algoritmos se
utilizan para analizar grupos de puntos de datos generados por el
módulo de análisis 64 para producir información de relevancia
clínica. El instrumento de hematología/inmunología integrado
descrito proporciona una plataforma única en que se puede
implementar dicho software, proporcionando por ello un instrumento
que no sólo automatiza el procesado y la medición de muestras de
hematología e inmunología, sino que también automatiza el análisis
de datos.
La estación de datos 68 también proporciona
depósitos de datos que son colecciones de registros de muestras
relacionados. La figura 28 ilustra un conjunto preferido de
depósitos de datos, incluyendo registros de datos, historias de
pacientes, archivos de control de calidad (QC), archivos de
partículas de referencia estándar, archivos duplicados pareados,
lotes de algoritmos de Bull (X-B), archivos de
media móvil, y archivos de calibración.
Los sistemas electrónicos se hallan en el módulo
analizador 64, módulo de estación de datos 68, y unidad neumática
72. El analizador 64 proporciona la plataforma de hardware para
adquisición de datos y control de fluidos y movimiento. En una
realización ejemplar, la estación de datos 68 es un ordenador
general que sirve como una interface de usuario y procesa, visualiza
y guarda los datos adquiridos. La unidad neumática 72 controla las
fuentes de vacío y presión.
En una realización preferida, los tres módulos
están físicamente separados, y cada unidad es alimentada desde una
toma CA separada. La estación de datos 68 y la unidad neumática 72
comunican con el analizador 64 mediante canales de comunicación
serie independientes 76, 84.
La figura 25 es un diagrama de bloques que
ilustra algunos componentes electrónicos de hardware del analizador
64. Estos componentes incluyen un módulo central de proceso 500
(CPM), un subsistema de adquisición de datos 502, y un subsistema
de control de movimiento 504. El CPM 500 controla el subsistema de
adquisición de datos 502, el subsistema de control de movimiento
504, y funciones de comunicación.
Una realización preferida del CPM 500 incluye las
características siguientes:
* Procesador Multiprotocolo Integral Motorola
68302 a 20 MHz.
* RAM dinámica de 1 MB expansible en pasos de 1
MB hasta 4 MB.
* 128KB EPROM.
* 2KB RAM no volátil.
* Controlador DMA para transferencias rápidas de
16 bits de datos de pulso adquiridos de convertidores A/D a CPM
RAM.
* Bus buffer de 8 bits para funciones de
diagnóstico y de control de adquisición de datos.
* Dos Enlaces Serie de Módulo de Procesado de
Motor (MPM).
* Un enlace serie periférico.
* Un enlace serie de unidad neumática.
* Un enlace serie HDLC.
* Canal de acceso directo a memoria (DMA)
dedicado al enlace serie HDLC.
* Un puerto RS-232 para lector de
código de barras.
* Un puerto RS-232 para terminal
de diagnóstico.
La figura 26 es un diagrama de bloques que
ilustra detalles del subsistema de adquisición de datos 502
representado en la figura 25. Las características de célula o
muestra se convierten en señales eléctricas en el transductor HGB
178, el transductor de impedancia 174, y la celda de flujo óptico
170. El transductor de impedancia 174 y la celda de flujo óptico
170 producen en general pulsos eléctricos como sus señales de
salida, y el transductor HGB 176 envía una señal de baja
frecuencia. La salida de cada celda de flujo/transductor se trata
por separado por el subsistema de adquisición de datos 502.
Las señales de salida del transductor de
impedancia 174 y la celda de flujo óptico 170 se generan por varios
detectores 510. Estos detectores constan de los PMTs y fotodiodos
del banco óptico 350 o la circuitería eléctrica del transductor de
impedancia 174. La salida de cada detector es alimentada a través
de un módulo preamplificador 512 y un módulo de procesado de señal
514 a un módulo convertidor analógico a digital (ADC) 516. Los
módulos de procesado de señal 514 incluyen circuitería para la
medición de atributos de pulso tal como altura de pulso y análogos.
El convertidor ADC 516 es un convertidor multiplexado que cambia
salidas analógicas del módulo de procesado de señal 514 a valores
digitales que representan estos atributos de pulso. Los valores
digitales son transferidos después al CPM 500 mediante acceso
directo a memoria (DMA) 518. El CPM 500 procesa la información y
envía después los datos a la estación de datos 68 mediante el
enlace de datos 76 de control de enlace de datos de alto nivel
(HDLC, un protocolo de comunicaciones). El subsistema de
adquisición de datos 502 también genera los voltajes analógicos
requeridos para varios valores paramétricos, tal como niveles de
disparo, niveles de paso por puerta, potencia de salida del láser,
y otros.
Las salidas del transductor HGB 178 son
alimentadas mediante una placa detectora HGB/multiplexor analógico
328 directamente al módulo ADC 516. En general, la placa HGB 328
incluye un amplificador de transresistencia 332 y una fuente de
corriente 334 (figura 18). La placa HGB 328 y sus componentes se
explican con más detalle en la sección 8.F de esta descripción.
El módulo ADC 516 contiene un convertidor
analógico a digital. El módulo ADC 516 es multiplexado para medir
voltajes analógicos de los módulos de procesado de señal 514 y
voltajes auxiliares dentro del módulo ADC 516 propiamente
dicho.
La representación digital de cada medición de
voltaje tiene una etiqueta identificadora asociada. En una corriente
de datos, la etiqueta indica el valor específico medido que sigue.
Todas las etiquetas son de 7 bits de largo, lo que permite un
máximo de 128 parámetros diferentes.
Los módulos de procesado de señal 514 contienen
un circuito de mantenimiento de pico asignado a cada señal de
salida de los preamplificadores 512. Un circuito de mantenimiento
de pico recibe un pulso eléctrico como su señal de entrada y genera
un voltaje constante igual al voltaje máximo detectado durante el
pulso. Un secuenciador de etiquetas programable en el módulo ADC 516
apunta a uno de estos circuitos de mantenimiento de pico a la vez,
enrutando el valor a medir (el voltaje de salida de régimen
constante) al módulo ADC, que realiza la conversión de dicha señal
particular de su forma análoga (voltaje) a un valor digital.
Después de dejar tiempo suficiente para esta conversión, el
secuenciador de etiquetas apunta al circuito de mantenimiento de
pico siguiente que mantiene un valor a medir. Cuando termina cada
conversión, se une a los datos la etiqueta correspondiente que
identifica la señal medida. De esta forma, el secuenciador de
etiquetas comparte el tiempo con el módulo ADC asignando un
intervalo de tiempo a cada entrada. Los resultados de estas
conversiones son transferidos a la memoria principal en el CPM 500
mediante LA DMA 518. El DMA se utiliza para transferir datos a
altas tasas sin intervención de la CPU.
El preamplificador 512 contiene una fuente de
corriente constante programable de bajo ruido. Esta corriente
constante se divide entre dos recorridos. Un recorrido de corriente
fluye a través de los electrodos en el transductor de impedancia;
el otro fluye al preamplificador 512. Dado que la suma de ambas
corrientes es constante, un cambio en la corriente a través de los
electrodos (producido por el paso de células a través del
transductor de impedancia 174) se refleja como un cambio en el
voltaje de salida del preamplificador 512.
La salida del preamplificador de transductor de
impedancia se dirige a dos recorridos independientes, teniendo cada
uno una ganancia de 12 bits, restaurador de línea base, detector de
pulso, y circuito de mantenimiento de pico. Un recorrido es para
detección de pulso RBC, y el otro trayecto es para detección de
pulso PLT. El mismo pulso se analiza así simultáneamente en los dos
criterios diferentes siguientes.
Un pulso se detecta como válido si su valor
máximo excede de un umbral dado. El subsistema de adquisición de
datos 502 reconoce umbrales de nivel y umbrales de pendiente. El
umbral de pendiente mejora el tiempo muerto del contador de
hardware permitiendo el recuento de dos pulsos que llegan muy
próximos en el tiempo.
Cada tipo de célula requiere sus propios
criterios de cualificación. Los pulsos RBC deberán exceder un
cierto nivel y pendiente. Se deberá superar una cierta pendiente
negativa para reposicionar el detector para el pulso siguiente.
Los pulsos PLT se producen en la misma secuencia
con los pulsos RBC. Sin embargo, los PLTs se pueden distinguir de
los RBCs porque los PLTs son más pequeños. Un pulso se clasifica
como un PLT detectado si excede de un umbral de nivel inferior,
pero no supera un umbral superior. Además, el pulso debe exceder
una pendiente positiva predeterminada para considerarse un PLT
válido. Se deberá exceder una cierta pendiente negativa para
reposicionar el detector para el pulso siguiente.
Si un pulso cumple los criterios de
cualificación, se envía una señal de disparo al circuito de
mantenimiento de pico, y se inicia la conversión ADC siguiente. Los
pulsos de disparo del transductor de impedancia 174 son contados en
dos contadores de 16 bits dedicados. Un contador es para RBCs, y el
otro contador es para PLTs.
Cada recorrido de salida de los preamplificadores
del transductor de impedancia incluye un circuito de restauración
de línea base para restar el componente DC de fondo de las señales
amplificadas. El voltaje desviado creado por estos circuitos es
monitoreado, proporcionando así una herramienta para
diagnóstico.
La luz emitida por la celda de flujo óptico 170
es recogida a ángulos diferentes por los detectores 510, que
incluyen fotodiodos (PD1 y PD2) y fotomultiplicadores (PMT1, PMT2,
y PMT3). Estas señales tienen un rango dinámico ancho, y por
consiguiente se facilita una amplia gama de ajuste de ganancia.
Para los PMTs, el ajuste de ganancia se realiza preferiblemente
controlando un voltaje de dinodo en el PMT propiamente dicho
(aproximadamente 200V a aproximadamente 1100V). Este procedimiento
puede regular la ganancia en un rango aproximado de 105. Los
preamplificadores ópticos de los PMTs convierten la salida de
corriente de los PMTs a un voltaje con ganancia fija.
La ganancia de cada fotodiodo (PD) es programable
en su preamplificador en pasos de potencia de 2. Los
preamplificadores PD convierten la corriente de salida PD a
voltaje.
Las salidas de los preamplificadores ópticos se
enrutan a cinco recorridos o canales independientes. Cada canal
incluye su propio restaurador de línea base, detector de pulso,
circuito de mantenimiento de pico, y ganancia programable de 12
bits (captura postpico).
Un pulso "óptico" es detectado como válido
si su valor máximo excede de un umbral predeterminado programable.
Un pulso válido genera un pulso digital de disparo. El impulso de
excitación se puede programar de manera que sea una de varias
combinaciones lógicas seleccionadas de canales (PD1, PD2, PMT1,
PMT2, PMT3). Cada canal tiene su propio umbral inferior
programable.
El impulso de disparo inicia la captura de pico y
conversión ADC siguiente de los valores máximos capturados para los
cinco canales. El disparo puede ser cualificado requiriendo un
criterio de paso por puerta. Por ejemplo, el disparo puede ser
invalidado si la señal en PD1, PD2, o PMT2 excede de un umbral de
puerta predeterminado.
Se ha dispuesto un circuito restaurador de línea
base para restar el componente DC de las señales de pulso,
reduciendo por ello toda desviación de fondo DC. El tiempo de
respuesta de estos circuitos es más lento que la anchura del pulso
medio. El voltaje desviado creado por estos circuitos es
monitoreado, proporcionando una herramienta para diagnóstico.
Los pulsos de disparo de la celda de flujo óptico
170 son contados en dos contadores de 16 bits dedicados. Un contador
es para las células con puerta (las que no han sido rechazadas por
los criterios de paso por puerta), y el otro contador es para el
número total de células que cumplen el requisito de umbral más
bajo.
La figura 18 es un diagrama de bloques de un
sistema simplificado de medición de hemoglobina (HGB). Se mide la
concentración de hemoglobina contenida en la muestra preparada, por
ejemplo, en gramos por decilitro. Esta concentración es
proporcional a la absorbancia de la luz por la muestra en la región
de longitud de onda verde (aproximadamente 540 nanómetros).
El recorrido de luz consta de un diodo fotoemisor
controlado por corriente 322, una cámara de transductor 338, un
filtro 326 (aproximadamente 540 nm), y un fotodiodo 324.
La corriente de salida del fotodiodo, que es
proporcional a la energía luminosa recibida, es amplificada por el
amplificador de transresistencia 332. La salida del amplificador de
transresistencia 332 se envía al módulo ADC 516.
La diferencia entre voltajes desarrollados al
medir una solución de referencia clara en la cámara de transductor
338 y al medir la muestra preparada conteniendo hemoglobina es
representativa de la concentración de hemoglobina.
El módulo de procesado de señal 514 usa un
contador de 16 bits (no representado) para generar un sello de
tiempo con una resolución de aproximadamente 0,5 ms. El valor de
sello de tiempo se almacena con los datos de cada iteración de
secuencia automática que dio lugar a datos válidos adquiridos en el
módulo ADC 516.
La figura 27 es un diagrama de bloques que
ilustra una realización ejemplificativa del subsistema de control
de movimiento 504. Las secuencias de flujo y las operaciones de
tratamiento automático de muestras del analizador 64 son
controladas mediante el subsistema de control de movimiento 504.
Como se ilustra, el subsistema de control de
movimiento 504 incluye un módulo de procesado de motor 520 (MPM),
un módulo de control de válvula 522 (VCM), un módulo sensor de
fluido 524 (FSM), y un módulo de entrada digital 526 (DIM). Los
MPMs 520 comunican con el CPM 500 mediante dos enlaces serie
independientes 530, 532 (500 KB), y cada MPM 520 controla
preferiblemente hasta 12 motores paso a paso 534. Los VCMs 522
controlan todas las válvulas en el analizador 64. Los DIMS 526
verifican todas las entradas digitales (interruptores, sensores
ópticos, y sensores magnéticos). El FSM 524 verifica todos los
sensores de fluido.
Los VCMs 522, DIMs 526, y el FSM 524 son módulos
inteligentes que comunican preferiblemente con el CPM 500 mediante
un bus periférico serie diferencial semi-duplex. Se
puede añadir módulos periféricos adicionales a este bus.
El software controla las operaciones principales
del sistema analítico celular 60, incluyendo las secuencias de
flujo del analizador, la temporización y secuencia de eventos,
recogida de datos y conversión de datos medidos a resultados
significativos. El software es residente en memorias adecuadas, tal
como RAMs, ROMs, EPROMs, SRAMs y análogos, que se hallan en el
sistema 60. Los componentes de software están divididos
preferiblemente en la seis dominios (representados por círculos)
mostrados en la figura 2.
El dominio de interface de operador 90 regula la
interacción de usuario con la estación de datos 68 incluyendo todos
los dispositivos de entrada controlados por operador unidos a la
estación de datos, la definición y generación de todas las
pantallas de la estación de datos, y la definición de toda salida
impresa.
El software operativo de estación de datos 92
controla el procesado de muestra, gestión de datos, seguridad,
comunicaciones con el módulo analizador y sistemas de información
de laboratorio (LIS), y generación de salidas impresas.
El software de algoritmos 96 puede incluir
cualquier combinación deseada de matemática aplicada. Los
algoritmos se aplican en el análisis de datos de muestra, la
conversión de datos en modo de lista a resultados gráficos y
numéricos, y el análisis estadístico de agrupaciones de resultados
numéricos. Estos algoritmos incluyen preferiblemente técnicas de
agrupamiento para identificar tipos o condiciones discretos de
células.
El software operativo de analizador (AOS) 98
controla los circuitos electrónicos del módulo analizador
(hardware), recogida de datos, y comunicaciones con el módulo de
estación de datos. La temporización y programación de todas las
actividades del analizador, incluyendo las secuencias de flujo del
analizador, también son controladas por el AOS 98.
El software de secuencia de flujo (FSQ) 100
controla los componentes mecánicos responsables de mover fluidos a
través del módulo analizador 64, incluyendo la ejecución de
protocolos de procesado automático de muestras y verificación de
hematología e inmunología integradas.
Los microprogramas 102 incluyen una red de
dispositivos controladores residentes en EPROM para varios módulos
de hardware del analizador 64 y la unidad neumática 72.
La interface de operador (OI), el software
operativo de estación de datos (DSOS) y los algoritmos usan el
módulo de estación de datos 68 como su plataforma. El AOS 98, el
software FSQ 100 y los microprogramas 102 residen y usan el módulo
analizador 64 como su plataforma. El software preferido es una
aplicación multitarea y multihilo.
El AOS 98 reside en el CPM 500 y es el
controlador principal de la operación detallada del analizador 64.
Comunica con varios microcontroladores esclavos responsables de
temporización de los motores paso a paso, conversión analógico a
digital, verificación/control en bucle cerrado de vacío/presión,
control de válvulas, y entradas de sensores digitales. Además, es
responsable de la comunicación de datos, estado y control con la
estación de datos 68 a la que está conectado. El AOS 98 se ejecuta
preferiblemente en un chip CPU Motorola 68302. Sus microprogramas
se almacenan en EPROM(s) externa(s), y el AOS
descargado y las secuencias de flujo se almacenan en RAM en placa.
Una realización de una operación AOS se muestra en las figuras 29 y
30.
El AOS 98 incluye características multitarea para
realizar las secuencias de flujo. El AOS descarga secuencias de
flujo de la estación de datos, almacenándolas en su memoria. El AOS
ejecuta las secuencias de flujo requeridas para las verificaciones
de muestra deseadas según la dirección de la estación de datos
68.
Cada secuencia de flujo requiere tareas de
múltiples componentes del analizador según un programa. Las figuras
13A-13F son diagramas de temporización de una
secuencia de flujo ejemplar para integrar y automatizar la
preparación hematológica e inmunológica de la muestra y la medición
en una sola unidad. El eje horizontal superior, como se ve,
representa el tiempo en segundos, y el eje vertical inferior
enumera componentes de procesado y medición de muestras del
analizador 64. Las rejillas del diagrama describen las actividades
de los componentes del analizador. Cada uno de los componentes
enumerados a lo largo del eje vertical izquierdo en las figuras
13A-13F realiza un conjunto específico de tareas en
la secuencia de flujo. Cuando un componente ha terminado su tarea,
comienza a buscar su instrucción siguiente sin esperar a que los
componentes situados hacia abajo terminen el trabajo en la muestra
corriente.
El AOS mantiene una colección de puntos de
referencia y parámetros de hardware relacionados con recuento. Se
facilita un conjunto para cada tipo de recuento (CBC WBC, CBC OPLT,
etc). Además, se facilita un conjunto a efectos de diagnóstico. El
AOS acomoda la descarga de cualquiera de estos conjuntos de la
estación de datos 68. Además, cualquier conjunto puede ser activado
(es decir, usado para configurar el hardware) bajo orden de la
estación de datos 68 o software de secuencia de flujo.
Además de los puntos de referencia y parámetros
de hardware relacionados con recuento, el AOS mantiene una
colección de parámetros independientes de recuento de eventos. El
AOS acomoda la modificación de cualquiera de estos parámetros de la
estación de datos 68. En contraposición a los parámetros
relacionados con recuento, el AOS carga estos valores
directamente.
Para comenzar una secuencia de flujo, el AOS 98
determina que una muestra está disponible para aspiración. Esto se
basa en la activación por parte del operador de un pulsador o una
orden de un mecanismo autocargador. Toda la información conocida
por el analizador 64 acerca de la muestra se envía a la estación de
datos 68. La estación de datos 68 responde con información acerca de
las mediciones que hay que realizar en la muestra. En base a esta
respuesta, y en unión con el estado del analizador 64 (es decir,
reactivos, incubaciones, señalizadores de
habilitación/inhabilitación de aspiración de secuencia de flujo), el
AOS determina si proseguir o no con la aspiración de muestra. Tanto
si se produce aspiración como si no, el AOS informa a la estación de
datos 68 del estado de la muestra.
Cuando una secuencia de flujo requiere
incubación, el AOS proporciona a la secuencia de flujo la capacidad
de "asignar" un lugar no usado 132 en la zona de procesado de
muestras 110 para una incubación. El tipo de muestra (y, por lo
tanto, la secuencia de flujo apropiada a ejecutar a la terminación
de la incubación) se especifica como parte del proceso de
asignación. Cuando se inicia la incubación, el AOS pone en marcha
un temporizador de incubación asociado con un lugar de incubación
particular 132. También están asociados con cada lugar de
incubación 132 un identificador de muestra, tipo de muestra y tiempo
de incubación. El AOS actualiza periódicamente los temporizadores
de incubación activos y reconoce la terminación de intervalos de
incubación. Cuando termina, el AOS continúa la ejecución de la
secuencia de flujo para dicha prueba. El AOS refiere el tiempo
total de incubación de cada muestra incubada y el número de lugar
de incubación (posición) como parte de los datos acumulados para
cada prueba en cada muestra. Después de procesar la muestra
incubada y de limpiar y secar el lugar de incubación, la secuencia
de flujo notifica al AOS que el lugar está disponible de nuevo para
asignación.
El AOS 98 inhibe la aspiración de muestras a la
zona de incubación 118 cuando las bandejas de incubación apropiadas
124 no están presentes. Los cambios en las bandejas de incubación
124 o módulos de reactivo 122 son remitidos a la estación de datos
68. Siempre que se inhabilita una aspiración, el AOS envía un
mensaje de aviso a la estación de datos 68.
A la petición de la estación de datos, el AOS
suministra el estado de incubación corriente de todos los lugares
en el analizador 64. Esta información incluye el tiempo de
incubación, estado del lugar (limpio/sucio) y recuentos de uso de
lugar.
El intérprete de secuencia de flujo 100 es capaz
de ejecutar simultáneamente múltiples secuencias de flujo. El
intérprete de secuencia de flujo permite que las secuencias de
flujo coordinen sus actividades mediante el establecimiento y la
verificación de varios "señalizadores". La lógica de secuencia
de flujo hace decisiones en base al estado de los señalizadores que
son puestos y quitados por otras secuencias de flujo que se ejecutan
simultáneamente.
El intérprete de secuencia de flujo soporta
tiempos fijos o variables de recuentos de eventos de muestra. Los
tiempos variables de recuento de eventos se pueden establecer
mediante puntos de referencia de software o hardware. Los tiempos
variables de recuento de eventos están provistos preferiblemente de
un límite superior definido por las secuencias de flujo.
El intérprete de secuencia de flujo permite que
las secuencias de flujo inicien intervalos de recogida de datos y
recuento de eventos. Los datos generados durante el intervalo de
recogida de datos son enviados automáticamente a la estación de
datos 68 por el AOS. Los datos enviados a la estación de datos 68
incluyen preferiblemente al menos el identificador de muestra,
contadores de hardware, datos en modo de lista, y tiempo de
incubación (si lo hay). Los tipos de recuento incluyen
preferiblemente:
- CBC: recuento completo de sangre incluyendo
todas las mediciones hematológicas excepto las relacionadas con
reticulocitos.
- RETICS.
- SUBCONJUNTO/FENOTIPO.
El AOS permite que el analizador 64 solape la
actividad de recuento en las celdas de flujo/transductores 170,
174, 178. Así, mediante multiplexión y segmentación, la actividad
del analizador maximiza la producción del instrumento.
El analizador 64 puede estar conectado a
recipientes externos para residuos (no representados) o
almacenamiento de reactivo a granel (193). AOS verifica los
sensores que detectan cuándo el recipiente de residuos está lleno o
el recipiente de almacenamiento de reactivo a granel 193 está vacío.
La aspiración adicional de muestras la inhibe el AOS 98 hasta que
se remedia la condición.
El AOS lee y modifica la memoria no volátil de
acceso serie en cada módulo de reactivo de anticuerpo 122. Al menos
la información siguiente se almacena en cada memoria de módulo de
reactivo de anticuerpo:
- Número de lote.
- Fecha de caducidad.
- Tipo de prueba (número de panel).
- Número de módulo.
- Número de cavidades utilizadas en el
módulo.
- Usos del módulo.
- Señalizador inicializado.
- Redundancia/control de error.
Los módulos de reactivo de anticuerpo 122 se leen
como parte de inicialización normal del analizador. Después,
cualquier operación que afecte al estado del módulo 122 se registra
en la memoria del módulo.
El AOS 98 comunica con los módulos de procesado
de motor 520 que son responsables de controlar los motores paso a
paso 534 del analizador. El AOS reposiciona los módulos de
procesado de motor 520 a la inicialización. El AOS hace el
seguimiento de la posición de cada motor en el analizador 64 y
verifica esta información con módulo procesado de motor de control
520. Las discrepancias de posición se refieren a la estación de
datos 68.
A la terminación con éxito del autodiagnóstico a
la conexión, el analizador 64 acepta software operativo AOS
descargado de la estación de datos 68. A la terminación de la
descarga de software, se suministra una dirección de inicio desde
la estación de datos 68 especificando la dirección en la que
iniciar la ejecución.
Los párrafos siguientes explican con detalle una
operación ejemplar del sistema analítico celular 60. Se puede
lograr una mejor comprensión de detalles del sistema 60 por
referencia a esta explicación. Aunque se explican ejemplos
específicos para esclarecer la comprensión, se ha de recordar que el
sistema 60 puede realizar otros pasos de método sin apartarse del
alcance previsto de las reivindicaciones.
El protocolo de procesado automático de muestras
del sistema analítico celular 60 se puede considerar en tres
fases-preparación de muestra, medición de muestra,
y análisis de muestra. El protocolo particular para cada una de
estas fases depende de la prueba. Por ejemplo, la preparación,
medición, y análisis para el diferencial WBC difiere del de
plaquetas, reticulocitos, subconjuntos de linfocitos, etc. Sin
embargo, los pasos generales son comunes a cada fase.
En la primea fase, preparación automática de
muestra, el analizador 64 aspira un volumen de la muestra,
transporta la muestra a las copas designadas, y mezcla la muestra
con diluyente y/o reactivo según sea preciso para preparar la
muestra para medición. La preparación puede implicar solamente
diluir la muestra, y los medios de dilución también pueden ser la
lisis para sacar RBCs. A veces, como en la prueba de reticulocitos,
la fase de preparación implica dos pasos, un primer paso,
predilución con un diluyente/reactivo envolvente, y un segundo
paso, dilución añadiendo un volumen conocido de colorante
fluorescente.
En otras pruebas, tal como la prueba de
subconjunto de linfocitos, la fase de preparación puede implicar
muchos pasos y requerir una incubación prolongada con un reactivo.
Cuando esto ocurre, el conjunto de sonda de aspiración 148 pone un
volumen de la muestra en la copa de transferencia 140 y vuelve a una
posición lista para aspirar una muestra de paciente siguiente. Los
pasos restantes en el proceso de preparación los ejecuta el
conjunto de sonda de incubación 152. Estos pasos pueden incluir
además dividir la muestra en una o varias porciones en lugares de
incubación 132, añadir un reactivo Mab específico a cada porción, e
incubar. La mayoría de estos pasos, realizados por la sonda de
incubación 152, pueden tener lugar mientras el conjunto de sonda de
ventilación/aspiración 148 está ocupado con el procesado de las
muestras siguientes.
Después de terminar la incubación, el conjunto de
sonda de incubación 152 completa la fase de preparación mezclando la
porción de muestra incubada con un reactivo de lisis para quitar
los glóbulos rojos de manera que la porción de muestra esté lista
para ser dirigida a la celda de flujo óptico para medición.
La segunda fase, la fase de medición, comienza
cuando las copas de muestra contienen una muestra que está lista
para medición. La muestra es enrutada después mediante una red de
tubos 182 conectados desde la parte inferior de las copas de
muestra al transductor de medición deseado 170, 174, 178. Después de
salir del transductor, las muestras se envían a recipientes de
residuos (no representados). Las señales son detectadas por los
detectores apropiados para cada prueba, amplificadas después,
procesadas, digitalizadas, y almacenadas en un archivo de modo de
lista correspondiente a la prueba particular.
La tercera fase, la fase de análisis, comienza
con los datos de modo de lista. Se aplican algoritmos a los datos
que aplican las varias partículas o tipos de células al espacio de
características con ejes correspondientes a los detectores
apropiados para cada prueba, identificando por lo tanto grupos de
población únicos, y enumerando las células dentro de cada grupo. La
salida final puede ser gráfica y/o numérica, y puede ser una medida
o función de volumen de la célula, contenido de hemoglobina, tipo
de población, o alguna otra característica celular. La salida es
cuantificada por lo general tanto en términos absolutos como en
porcentajes. Por ejemplo, los subtipos de poblaciones de células se
dan como porcentajes de células padre y también se enumeran como
eventos por microlitro de sangre del paciente. Siempre que se
analizan muestras incubadas, primero se realiza el análisis de las
pruebas hematológicas convencionales. Cuando ha terminado la
medición de muestra incubada, tiene lugar el análisis de muestra
incubada y se termina el análisis combinado del paciente.
El protocolo de prueba para las fases de
preparación y medición de la muestra del procesado de muestras se
implementan automáticamente por medio de secuencias de flujo, cuya
complejidad varía. En pruebas que implican incubación prolongada,
la secuencia de flujo integra la verificación de incubación y no
incubación de manera que siempre que se incube una muestra, el
analizador 64 puede proseguir con pruebas siguientes. Cuando la
muestra de incubación está lista para medición, se interrumpe el
procesado de más muestras y la muestra incubada experimenta
medición y análisis.
Se puede lograr una mejor comprensión de esta
explicación con referencia a las figuras 5 y 12. Por ejemplo, una
porción de muestra de paciente 166, de aproximadamente 18,75
microlitros de volumen, se deposita en la copa HGB 142 por medio de
la sonda de aspiración 156, donde se mezcla con un volumen grande de
reactivo lisante HGB con una dilución resultante de aproximadamente
200: 1. Después de aproximadamente 20 segundos de tiempo de lisis,
la copa contiene solamente hemoglobina diluida, que es transferida
para medición mediante la línea 182 al transductor de hemoglobina
178 por medio de la bomba peristáltica 246. La transmitancia óptica
de la muestra de hemoglobina en la cámara de transductor 338 se mide
por medio de la fuente LED 122 y el fotodiodo 324. La transmitancia,
representada por T, es amplificada, procesada, digitalizada y
almacenada. Después, se convierte en absorción en la fase de
análisis por medio de un algoritmo A = log(1/T), que además
se convierte en concentración de hemoglobina, HGB, en gramos por
decilitro de muestra de paciente, por medio de un calibrador
previamente determinado. La prueba de hemoglobina, en combinación
con los resultados de la prueba de impedancia RBC, permite la
determinación de los parámetros medidos y calculados
siguientes:
- HGB = (concentración de hemoglobina).
- MCH = HGBx10/RBC (hemoglobina celular media).
- MCHC = HGBx100/H CT (concentración celular media de hemoglobina).
donde RBC es el recuento de glóbulos rojos (RBCs
por \mul) y HCT es el hematocrito (fracción de volumen, en
porcentaje, de la muestra de sangre que consta de glóbulos rojos),
que se miden en el transductor de impedancia
174.
El lector deberá consultar las figuras 4 y 5. Una
porción de muestra de paciente 166, de aproximadamente 18,75
microlitros en volumen, se deposita en la copa 134 por medio de una
sonda de aspiración 156, donde se mezcla con un volumen de
diluyente/reactivo envolvente con una dilución resultante de
aproximadamente 420:1. El diluyente/reactivo envolvente es adecuado
tanto como un soporte envolvente en los sistemas de flujo laminar
en la celda de flujo de impedancia 174 y la celda de flujo óptico
170 y como una muestra diluyente de manera que los RBC y las
plaquetas avancen en fila única en cada transductor. La formulación
incluye un surfactante que permite distinguir de forma no ambigua
los glóbulos rojos pequeños de plaquetas grandes.
Después de terminar la mezcla en la copa RBC 134,
la muestra diluida se transfiere al transductor de impedancia 174
(figuras 10A y 10B) por la bomba 220, las válvulas 210 y 212, y el
conjunto de jeringa 204, 224. Las plaquetas son clasificadas por
tamaño y contadas en el transductor de impedancia 174 (figura 17).
Las plaquetas también son transferidas y contadas en el transductor
óptico 170 (figura 16). A causa del menor volumen iluminado y ruido
más bajo en el transductor óptico, el recuento óptico de plaquetas
tiene rendimiento excelente. El recuento de plaquetas del
transductor óptico 170 se refiere como datos de paciente,
utilizándose el recuento de impedancia como una herramienta de
diagnóstico para verificar el rendimiento del instrumento.
El transductor de impedancia 174 se utiliza para
referir los parámetros de tamaño de plaquetas. Se establece un
umbral inferior que distingue las plaquetas del ruido, y se
establece un umbral superior que distingue las plaquetas de los
RBCs. Las amplitudes de pulso son filtradas, amplificadas,
digitalizadas y almacenadas como eventos de modo de lista. A partir
de estos datos se aplican algoritmos para calcular los siguientes
parámetros de tamaño de plaquetas, y visualizar el histograma de
plaquetas:
- Recuento de plaquetas (PLT).
- Volumen medio de plaquetas (MPV).
- Anchura de distribución de plaquetas (PDW).
- Plaquetocrito (PCT = MPV x PLT).
- Concentración de plaquetas (utilizada a efectos de diagnóstico de instrumento).
La muestra diluida de la copa RBC 134 también es
transferida al transductor óptico por las válvulas 236 y 238, la
bomba 232, y la jeringa 240, 206. Las plaquetas se determinan en el
espacio bidimensional de características usando los parámetros
ópticos PSS (dispersión lateral polarizada) e IAS (dispersión de
ángulo intermedio). Los pulsos de los detectores 384 y 402 son
procesados, digitalizados y almacenados en archivos de modo de lista
para procesado por algoritmos. El caudal de muestra para medir
plaquetas es aproximadamente 2,5 microlitros por segundo, y el
tiempo de recuento a través de la celda de flujo es aproximadamente
6 segundos para pacientes normales. Este tiempo de recuento se
prolonga automáticamente para muestras de recuento bajo para
mejorar la estadística del recuento. El recuento referido del
transductor óptico es la concentración de plaquetas (PLT).
El transductor de impedancia 174 también se
utiliza para determinar parámetros de tamaño y recuento de RBC. El
umbral superior usado para detectar plaquetas en el transductor de
impedancia 174 también es el umbral inferior para el recuento de
RBC. Los pulsos por encima de este umbral son procesados,
digitalizados y almacenados en el archivo de modo de lista de RBC.
Se aplican algoritmos para calcular los parámetros RBC siguientes y
visualizar el histograma RBC:
- Concentración de glóbulos rojos (RBC).
- Volumen medio de células (MCV).
- Anchura de distribución de glóbulos rojos (RDW).
- Hematocrito (HCT).
Con referencia a las figuras 4 y 5, se deposita
una porción de muestra de paciente 166, aproximadamente 37,5
microlitros, por medio de la sonda de aspiración de muestra 156 en
la copa WBC 138 que contiene aproximadamente 850 microlitros de
agente lisante WBC.
El reactivo lisante es un proceso de un
reactivo/un paso que logra finalidades multipropósito. Es
delicadamente suficiente para preservar la morfología de los
glóbulos blancos frágiles y al mismo tiempo lisar eficientemente
sustancialmente todos los glóbulos rojos. Estas dos finalidades se
realizan incluso en muestras hemaglobinofáticas, que pueden requerir
que el tiempo de lisis se prolongue más de 11 segundos. Además, en
la realización preferida, el reactivo lisante contiene una
concentración pequeña de un colorante nuclear vital que marca
efectivamente los glóbulos rojos nucleados (NRBCs) que pueden estar
presentes en la sangre periférica. La química de la lisis se ha
predeterminado de tal manera que el índice de refracción coincida
con el de la envuelta sustancialmente en menos de aproximadamente
0,1%.
La mezcla de agente lisante y muestra permanece
normalmente en la copa 138 durante aproximadamente 11 segundos,
donde se lisa y agita a una temperatura elevada. En una realización
preferida, la temperatura de lisis se controla a 42ºC \pm3º. En
este punto, el contenido de la copa 138 se pipeta directamente a la
celda de flujo óptico 170.
Con referencia a las figuras 19 y 20, el proceso
de medición comienza cuando la corriente de células pasa a través
del transductor óptico 170, habiéndose diluido con la adición de
agente lisante de manera que las células pasen a través de la
iluminación de láser en una sola fila, en una corriente de muestra
de flujo laminar rodeada por diluyente/envuelta 304 (ilustrada en la
figura 16). El volumen iluminado está delimitado en las dos
dimensiones normales al eje de flujo por la corriente celular
hidrodinámicamente enfocada, y en una dimensión paralela al eje de
flujo por la cintura vertical del haz láser que es aproximadamente
de 17 micras. El caudal de muestra durante esta prueba es
aproximadamente 2,5 microlitros por segundo, y el volumen de
detección iluminado correspondiente de las células WBC y NRBC se
aproxima a un cilindro elíptico con dimensiones de aproximadamente
80 \mu x 5 \mu x 17 \mu. La dimensión de aproximadamente 17
\mu se mide a lo largo del eje del cilindro.
La presencia de una célula en la región iluminada
es detectada por los fotodiodos 382 y 384, el tubo
fotomultiplicador 404, y un único circuito de disparo umbral triple
que opera en tres dimensiones del espacio de características. Es
decir, procesa los tres parámetros de ALL (Pérdida de Luz Axial),
IAS (dispersión intermedia), y FL3 (fluorescencia roja) y cualifica
señales para digitalización usando lógica Y/O. Una señal cualificada
debe ser mayor que el umbral IAS, al mismo tiempo que debe ser
mayor que el umbral ALL o el umbral FL3. La combinación de este
circuito único de disparo y las propiedades lisantes (que incluyen
un fijador equilibrado, que permite teñir rápidamente los núcleos
NRBC) cuenta claramente y de forma no ambigua y excluye NRBCs del
recuento diferencial WBC. Esta prueba cuenta poblaciones WBC y NRBCs
sin la interferencia usual de señales de fondo, tanto fluorescentes
como no fluorescentes, tal como las emitidas por fragmentos de ADN,
estroma de RBC, y plaquetas.
Cuando las células que cumplen el triple criterio
de umbral pasan por el volumen iluminado, se generan pulsos en los
detectores 382, 384, 400, 402, y 404. Las amplitudes de estos
pulsos son filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en
modo de lista en el correspondiente espacio de características
pentadimensional de ALL, IAS, FL3, PSS (dispersión lateral
polarizada), y DSS (dispersión lateral despolarizada). El tiempo de
recuento normal a través de celda de flujo 170 es aproximadamente
10 segundos. Al caudal y la relación de dilución descritos, y con
un recuento normal de WBC de paciente de aproximadamente 7000
células por microlitro de volumen de sangre, la tasa de recuento de
eventos resultante sería aproximadamente 5000. En muestras de
recuento bajo, este tiempo de recuento puede ser prolongado
automáticamente para mejorar la exactitud estadística de la
medición. A la conclusión del tiempo de medición, la corriente de
muestra es pipetada a residuos, y la sonda 156 se limpia y seca y
prepara para procesar una muestra siguiente.
Se aplican algoritmos a los cinco parámetros
cuantificados en los datos de modo de lista (ALL, IAS, FL3, PSS, y
DSS), y los tipos de células siguientes son cuantificados y/o
señalizados dentro de menos de aproximadamente 30 segundos de
tiempo de procesado: Concentración de glóbulos blancos (WBC),
Concentración de neutrófilos (NEU) y porcentaje (%N), Concentración
de linfocitos (LINF) y porcentaje (%L), Concentración de monocitos
(MONO) y porcentaje (%M), Concentración de eosinófilos (EOS) y
porcentaje (%E), Concentración de basófilos (BASO) y porcentaje
(%B), Glóbulos rojos nucleados (NRBC) y porcentaje de WBC (%NRBC),
Concentración de blastos (BLST), Concentración de granulocitos
inmaduros (IG), concentración de linf-variantes
(VARL), y Concentración de banda (BAND).
En una realización preferida, el procesado de
muestras para pruebas de subconjuntos de linfocitos implica los
pasos siguientes como se ilustra en las figuras 3, 4, y 5. La sonda
de aspiración 156 aspira primero una cantidad de sangre entera
suficiente para la prueba de subconjunto y deposita la cantidad en
la copa de transferencia 140. El volumen de sangre requerido es
aproximadamente 50N microlitros, donde N es el número de pares Mab
(anticuerpo monoclonal) requerido para la prueba. En el panel
estándar, se espera que N sea 5, y así el volumen requerido para
deposición en la copa 140 es aproximadamente 250 microlitros. En
este punto la sonda de aspiración 156 se limpia y vuelve después a
la estación de muestra 166 para procesar muestras siguientes al
mismo tiempo que el conjunto de sonda de incubación 152 continúa el
procesado de muestras de subconjuntos.
La sonda de incubación 160 aspira la sangre de la
copa de transferencia 140 y deposita aproximadamente 40 microlitros
en cada una de las cinco copas secuenciales 132 en bandejas de
incubación 124. Después, la sonda de incubación 160 se limpia antes
de pasar al módulo de reactivo 122, sacar aproximadamente 20
microlitros del primer par Mab 128, y depositarlos en la primera
copa de incubación correspondiente 132. Después de limpiar de nuevo
la sonda 160, vuelve al módulo de reactivo 122 y transfiere del
segundo par Mab 128 aproximadamente otros 20 microlitros de
reactivo a la segunda copa de incubación correspondiente 132. Este
proceso continúa hasta que cada una de las copas de incubación
requeridas contiene una mezcla de sangre y Mab para incubación.
En este punto, la sonda de incubación 160 se
limpia y seca y espera a que termine la primera incubación de
Mab/muestra de sangre. Toda la actividad del conjunto de
aspiración de muestra 148 se suspende después hasta que las muestras
incubadas del conjunto son procesadas de la siguiente manera. La
sonda de incubación 160 deposita aproximadamente 30 microlitros del
primer subconjunto incubado 132 en la copa WBC 138 que contiene
aproximadamente 670 microlitros de reactivo lisante WBC. Después de
que la muestra incubada es lisada y arremolinada a aproximadamente
42ºC \pm 3º durante aproximadamente 11 segundos, el primer par
Mab/sangre incubado está listo para medición, después de lo que el
contenido de la copa 138 es pipetado directamente a la celda de
flujo óptico 170.
El proceso de medición comienza cuando la
corriente de células intersecta el volumen iluminado por láser en
la celda de flujo 170. Se adquieren datos de los detectores ópticos
382, 384, 400 y 402, mediante la electrónica del sistema y el
software del analizador y almacenan en modo de lista para cada
mezcla de Mab/reactivo de sangre. La muestra ha sido diluida de
manera que las células dentro de la corriente pasen por la zona de
iluminación del láser en una sola fila. Cada célula es detectada
por la presencia de pulsos indicativos de cuatro características:
ALL (Pérdida de Luz Axial), IAS (dispersión de ángulo intermedio),
FL1 (fluorescencia verde), y FL2 (fluorescencia naranja). La
amplitud de cada impulso es amplificada, digitalizada y almacenada
en modo de lista en el eje apropiado del espacio de
características.
El análisis comienza con la aplicación de
algoritmos a los cuatro datos dimensionales almacenados, a partir de
los que se calculan los porcentajes del subconjunto. Después de
terminar el tiempo de recuento para la medición del primer
subconjunto, la sonda 160 se limpia y seca antes de volver al
subconjunto incubado siguiente 132 y repetir el proceso hasta que
todos los subconjuntos han sido medidos y analizados. El análisis
final, con resultados en porcentajes y recuentos absolutos por
microlitro de volumen de sangre del paciente, es un compuesto de
todas las mediciones de subconjunto antes descritas y la medición
hematológica diferencial WBC.
El tiempo de recuento normal a través de la celda
de flujo 170 es aproximadamente 10 segundos. En algunas muestras de
recuento bajo, este tiempo de recuento se prolongará
automáticamente para mejorar la estadística del recuento de la
medición.
\newpage
Después de terminar el proceso de medición de
muestra, el conjunto de aspiración de muestra 148 se reactiva y
está preparado para continuar el procesado de muestras
siguientes.
Las características descritas de preparación
automática de muestras acomodan numerosos paneles de anticuerpos
para uso en varias pruebas de inmunología y fenotipificación. Para
subconjuntos de linfocitos, cada panel incluye preferiblemente
cinco conjuntos de anticuerpos de dos colores. Preferiblemente,
cada conjunto de anticuerpos incluye un anticuerpo (Mab) marcado
con FITC (isotiocianato de fluoresceína) y análogos, y un segundo
Mab marcado con PE (Ficoeritrina) y análogos. Los anticuerpos se
distinguen por números de designación de grupo (CD). Ilustrándolo
por medio de un ejemplo, se puede incluir en un panel al menos los
Mabs de subconjunto de linfocitos siguientes.
Combinación de Mabs | Tipo de células enumerado | Porcentajes de células |
CD45/CD14+CD13 | Linfocitos | % de WBC |
CD3/CD4 | Subconjunto T helper | % de Ts, linfs \textamp WBCs |
CD3/CD8 | Subconjunto T supresor | % de Ts, linfs \textamp WBCs |
CD3/CD16 | Células T. tot./NK tot | % de linfs \textamp WBCs |
CD5/CD19 | Células T. tot./B tot | % de linfs \textamp WBCs |
También se propone un panel reducido que se
podría usar para verificar células CD4 positivas en pacientes con
VIH. Se puede incluir al menos los Mabs siguientes en este
panel:
Combinación de Mabs | Tipo de células enumerado |
CD45/CD 14+CD13 | Linfocitos |
CD3/CD4 | Subconjunto T helper |
En otras pruebas Mab de fenotipificación, el
número de pares Mab, N, podría ser 1, y por lo tanto el volumen
requerido de muestra sería aproximadamente 50 microlitros. Se puede
usar cualquier combinación de Mabs. Para algunas pruebas, el
volumen de reactivo Mab requerido podría basarse en una estimación
del recuento de WBC de paciente obtenido de las mediciones
hematológicas hechas en la muestra. Por ejemplo, en casos extremos
de leucocitosis o leucopenia, puede ser necesario regular la
relación de anticuerpo Mab a sangre del paciente para garantizar una
unión adecuada de anticuerpos o para evitar fondo excesivo libre de
anticuerpos. Dado que las mediciones hematológicas no requieren
incubación, prosiguen a través del transductor de celda de flujo
antes de que terminen las preparaciones de muestras de subconjuntos
de linfocitos. Por lo tanto, la estación de datos puede calcular un
recuento estimado de paciente a partir de los resultados
hematológicos para dicha muestra para permitir que el analizador 64
regule, según sea necesario, las relaciones de Mab a sangre para
llevar a cabo estas pruebas.
Con referencia a las figuras 4a y 5 para procesar
pruebas de reticulocitos, después de que la sonda de aspiración
156 ha terminado de mezclar las diluciones de RBC y plaquetas en la
copa RBC 134, la sonda de aspiración 156 quita aproximadamente 200
microlitros de sangre diluida a aproximadamente 420:1 y los pone en
la copa RETIC 136. La copa RETIC 136 contiene aproximadamente 600
microlitros de reactivo retic, haciendo que la relación de dilución
resultante sea aproximadamente 1680:1.
El reactivo de la realización preferida contiene
un colorante fluorescente con una excitación máxima cerca de la
longitud de onda láser de argón de 488 nm y un rendimiento
cuántico alto. El reactivo preferido tiñe ADN y ARN rápidamente, y
de tal forma que un histograma de fluorescencia de dimensión única
evite la confusión WBC normal. Es tan sensible que el analizador 64
detectará dos fragmentos de ARN en una célula. El método es linear
hasta aproximadamente un recuento de reticulocitos de 90%.
Después de un período de incubación apropiado
(aproximadamente 25 segundos con el reactivo preferido descrito
anteriormente) o inmediatamente después de la mezcla, la mezcla de
sangre diluida y reactivo retic se transporta a la celda de flujo
óptico 170. Este proceso de transporte puede ser temporizado para
proporcionar suficiente tiempo de incubación para la tinción de los
reticulocitos, es decir, 25 segundos, si no se necesitan procesos de
incubación separados.
Cuando la población que incluye glóbulos rojos
maduros y reticulocitos pasa por el volumen iluminado por láser en
la celda de flujo 170, se miden las propiedades de dispersión y
fluorescencia de la muestra utilizando el fotodiodo 384 y el tubo
fotomultiplicador 400, que está configurado para FL1 con un filtro
de fluorescencia verde 430. Las amplitudes de los pulsos son
filtradas, amplificadas, digitalizadas y almacenadas como datos en
modo de lista en el espacio bidimensional de características de IAS
y FL1. El tiempo de medición a través de la celda de flujo es
aproximadamente 8 segundos con un caudal de muestra de
aproximadamente 2 microlitros por segundo. A aproximadamente
5.000.000 RBC de paciente por microlitro de sangre, una realización
preferida mide aproximadamente 50.000 eventos, que corresponde a
500 eventos de reticulocito en un paciente con una concentración de
reticulocitos de 1%.
Se aplica un algoritmo que excluye WBCs y
plaquetas y cuenta reticulocitos por medio de eventos de
fluorescencia positivos superpuestos en el histograma RBC negativo.
Este método también caracteriza un índice de madurez de
reticulocitos, RMI, por medio de intensidad de fluorescencia. El
tiempo para procesar una muestra que incluye pruebas hematológicas
estándar y reticulocitos en la realización preferida es
aproximadamente 45 segundos. Los parámetros siguientes se refieren
a la prueba de reticulocitos: Concentración de reticulocitos
(RETC), porcentaje de reticulocitos (%R de RBC) e Índice de madurez
de reticulocitos (RMI).
También se puede utilizar otro método que usa
incubación prolongada del colorante nuclear para medir
reticulocitos utilizando la sonda de incubación 160 y la sonda de
aspiración 156 en un método similar al utilizado en procesado de
subconjuntos de linfocitos, como se explica anteriormente.
Por razones de ilustración, aquí se presentan
varios usos de una realización explicada. La explicación siguiente
se expone a efectos ejemplificativos solamente y esta explicación
no es exhaustiva. A continuación se explican específicamente formas
de usar una realización descrita para efectuar un análisis
integrado de células sanguíneas, un análisis de hemoglobina, un
análisis de glóbulos rojos y plaquetas, un análisis diferencial de
glóbulos blancos, un análisis de reticulocitos, análisis de
inmunofenotipo de linfocitos, medición de un conjunto T helper,
medición de un subconjunto T supresor y medición de linfocitos T y
B.
Sigue un ejemplo de análisis celular de muestras
de sangre entera. Los pasos del procesado de muestra son
controlados por software. Los pasos del análisis de datos son
controlados por software.
1 - El operador coloca un tubo de muestra
conteniendo una muestra de sangre entera en el soporte de tubo de
muestra.
2 - El conjunto de ventilación baja y perfora el
tapón del tubo de muestra (Paso A1).
3 - La sonda de aspiración se baja al tubo de
muestra (Paso A2).
4 - Se aspira 75 \mul de sangre a la sonda de
aspiración (Paso A3).
5 - La sonda de aspiración se eleva y saca del
tubo, limpiándose mientras sube (Paso A4).
6 - Se lleva a cabo una verificación para
garantizar que la sonda de aspiración se ha elevado completamente
(Paso A5).
7 - La sonda de aspiración se mueve a un punto
directamente sobre la copa HGB (Paso A6).
8 - El conjunto de ventilación sube para
retirarse del tapón del tubo de muestra (terminación del paso
A7).
9 - La sonda de aspiración se baja ligeramente
hacia la copa HGB (Paso A8).
10 - Se deposita 18,75 \mul de sangre en la
copa HGB para análisis HGB (Paso A9).
11 - La sonda de aspiración se mueve a una
posición directamente sobre la copa WBC (Paso A10).
12 - Se deposita 18,75 \mul de sangre en la
copa WBC para análisis WBC (Paso A11).
13 - La sonda de aspiración se mueve a una
posición directamente sobre la copa RBC (Paso A12).
14 - La sonda de aspiración se baja a la copa RBC
(Paso A13).
15 - Se abre una válvula que suministra diluyente
a la sonda de aspiración (Paso A14).
16 - Se dispensa 2000 \mul de diluyente
mediante la sonda de aspiración, junto con los 18,75 \mul de
sangre restantes, a la copa RBC para análisis de RBC y plaquetas
(Paso A15).
17 - Se aspira 1000 \mul de la mezcla de
sangre/diluyente a la sonda de aspiración desde la copa RBC (Paso
A16).
18 - La sonda de aspiración se eleva y limpia
(Paso A17).
19 - La sonda de aspiración se desplaza a una
posición directamente sobre la copa RETIC (Paso A18).
20 - La sonda de aspiración se baja ligeramente
hacia la copa RETIC (Paso A19).
21 - Se dispensa 200 \mul de la mezcla de
sangre/diluyente de la sonda de aspiración a la copa RETIC para
análisis de reticulocitos (Paso A20). Se deposita simultáneamente
600 \mul de reactivo retic en la copa RETIC desde un orificio
fijo.
18 - El conjunto de ventilación se vuelve a su
posición inicial (Paso A21).
19 - La sonda de aspiración se desplaza a la copa
de lavado (Paso A22).
20 - La sonda de aspiración se baja a la copa de
lavado (Paso A23).
21 - La sonda de aspiración se lava (Paso
A24).
22 - La sonda de aspiración se eleva (Paso
A25).
23 - La sonda de aspiración se vuelve a su
posición inicial (Paso A26).
24 - El instrumento ejecuta el procesado de
muestra y análisis de datos para análisis de HGB, WBC, RBC,
plaquetas y reticulocitos, como se describe con detalle en los
ejemplos siguientes.
25 - Los resultados de los análisis se almacenan
y presentan, tal como se ilustra en las figuras 45A a 45F.
Sigue un ejemplo de análisis de hemoglobina de
muestras de sangre entera. Los pasos del procesado de muestra son
controlados por software. Los pasos del análisis de datos son
controlados por software.
1 - Se dispensa 1590 \mul de agente lisante de
HGB a la copa HGB.
2 - Se deposita 18,75 \mul de sangre entera en
la copa HGB desde la sonda de aspiración, como parte de la
secuencia del Ejemplo 1 (Paso A9).
3 - Se dispensa 4273 \mul de agente lisante de
HGB a la copa HGB de manera que produzca mezcla de fluidos (Paso
H2).
4 - Pueden transcurrir aproximadamente 7 segundos
para permitir la lisis celular.
5 - La muestra HGB lisada se desplaza a través de
los tubos del instrumento para facilitar la transferencia al
transductor HGB (Paso H3).
6 - Se bombea la muestra HGB lisada al
transductor HGB (Paso H4).
7 - Se drena y enjuaga la copa HGB (Paso H5).
8 - la copa HGB se llena de agente lisante de HGB
para formar la muestra de referencia (Paso H6).
9 - Se lee la transmisión de luz en el
transductor HGB (Paso H7). El transductor contiene la muestra HGB
lisada, y este paso se produce aproximadamente
15-20 segundos después de la mezcla de la muestra de
sangre y agente lisante.
10 - La muestra de referencia se desplaza a
través de los tubos del instrumento para facilitar la transferencia
al transductor HGB.
11 - La muestra de referencia se fuerza al
transductor HGB (paso H9).
12 - Se reposiciona la bomba de jeringa usada
para dispensar agente lisante de HGB (Paso H10).
13 - Se drena la copa HGB (Paso H11).
14 - Se quita holgura de la bomba de jeringa de
agente lisante HGB (Paso H 12).
15 - Se lee la transmisión óptica de la muestra
de referencia en el transductor HGB (Paso H13).
16 - Los datos de la muestra y muestra de
referencia se almacenan en un archivo para análisis siguiente
descrito en los pasos 17-22.
17 - Se inicializan las variables de análisis y
los señalizadores.
18 - Los datos HGB son transferidos desde un
archivo de datos a dispositivo de almacenamiento local.
19 - La concentración de hemoglobina se calcula
como HGB = log (medición de ref/medición de muestra) * 0,64 *
(factores de calibración) (subrutina DoHGBAnalysis).
20 - Calcular parámetros HGB celulares usando
parámetros RBC (concentración de glóbulos rojos) y HCT
(hematocrito) determinados por análisis RBC descrito más
adelante:
- Hemoglobina celular media
- MCH = HGB / RBC * (factor de conversión unitario)
- Concentración celular media de hemoglobina
- MCHC = HGB * (factor de conversión unitario) / HCT
21 - Poner señalizadores HGB si algunos
resultados son anormales o sospechosos.
22 - Devolver resultados de análisis y
señalizadores para el almacenamiento y presentación en el
dispositivo de visualización.
Se mezcla rápidamente 17,5 microlitros de una
muestra de sangre con 7400 microlitros del reactivo (dilución
1:420), y se pasa 0,5 microlitro de la muestra diluida por un
transductor de impedancia enfocado hidrodinámicamente (envuelto)
174 durante 12 segundos para recuento de glóbulos rojos y medición
de volumen así como recuentos de plaquetas. Además, se pasa 2,5
microlitros de la muestra diluida por una celda de flujo óptico
envuelta 170 durante 6 segundos para recuentos exactos y precisos
de plaquetas. Las señales de ruido de fragmentos de células
anormales frágiles se excluyen del recuento óptico de plaquetas
delimitando con precisión la población de plaquetas por un algoritmo
de plaquetas.
Sigue a continuación un ejemplo de análisis de
glóbulos rojos (RBS) y plaquetas (PLT) de muestras de sangre
entera. Los pasos del procesado de muestra son controlados por
software. Los pasos del análisis de datos son controlados por
software.
1 - Se drena la copa RBC (Paso RBC1).
2 - Se dispensa 2,2 ml de diluyente RBC a la copa
RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC2).
3 - Se dispensa 18,75 \mul de sangre entera y
2000 \mul de diluyente RBC mediante la sonda de aspiración a la
copa RBC, como se describe en el Ejemplo 1 (Paso A15).
4 - Se dispensa 3,2 ml de diluyente a la copa RBC
con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC3).
5 - La mezcla de sangre y diluyente se desplaza a
la proximidad del transductor de impedancia con la bomba
peristáltica de RBC (Paso RBC4).
6 - Se llena la jeringa de distribución de RBC
(Paso RBC5).
7 - Se inicia el flujo de diluyente a través del
transductor óptico (Paso RBC6).
8 - La mezcla de sangre y diluyente se desplaza a
la proximidad del transductor óptico con la bomba peristáltica
óptica (Paso RBC7).
9 - Se aproxima la mezcla de sangre y diluyente
al transductor de impedancia con la jeringa de distribución de RBC
(Paso RBC8).
10 - La mezcla de sangre y diluyente se envía
mediante el transductor óptico a aproximadamente 52 \mul/s con la
jeringa de distribución óptica (Paso RBC9).
11 - El flujo a través del transductor óptico se
reduce a aproximadamente 2,5 \mul/segundo (Paso RBC10).
12 - La mezcla de sangre y diluyente se envía a
través del transductor de impedancia a aproximadamente 0,5
\mul/segundo con la jeringa de distribución de RBC (Paso
RBC11).
13 - Se recogen datos del transductor óptico
(Paso RBC12). Se aplica una puerta de hardware para recoger
solamente datos correspondientes a plaquetas.
14 - Se recogen datos del transductor de
impedancia (Paso RBC13). Se utiliza una puerta de hardware para
recoger y datos separados referentes a plaquetas (< 35 fL) y
datos relativos a glóbulos rojos (> 30 fL), en base a la
magnitud de los picos de impedancia.
15 - Se drena la copa RBC (Paso RBC14).
16 - Se reposiciona la jeringa de diluyente RBC
(Paso RBC15).
17 - La copa RBC se llena de diluyente (Paso
RBC16).
18 - Se drena la copa RBC (Paso RBC17).
19 - Se quita holgura de la jeringa de diluyente
RBC (Paso RBC1 8).
20 - Se enjuagan las líneas RBC al transductor
óptico (Paso RBC19).
21 - Se lava el transductor de impedancia en
contracorriente (Paso RBC20).
22 - Se lavan otras líneas RBC (Paso RBC21).
23 - Se reposiciona la jeringa de distribución de
RBC (Paso RBC22).
24 - Se quita holgura de la jeringa de
distribución RBC.
25 - Los datos del transductor de impedancia y el
transductor óptico se guardan en un archivo para uso en análisis de
RBC y análisis de plaquetas siguientes.
26 - Se inicializan señalizadores y
parámetros.
27 - Se recuperan datos de impedancia RBC de un
archivo y almacenan localmente.
28 - Se genera un histograma de 256 rectángulos
de valores de impedancia RBC.
29 - Los umbrales de rectángulo para el
histograma se ponen de la siguiente manera:
a. Se determina el modo de histograma.
b. A ambos lados del modo, se identifica el
primer rectángulo con una población inferior a 0,04 veces la
población del modo. Estos límites se denominan los discriminantes,
y solamente se utilizan valores entre ellos para calcular los
parámetros de distribución RDW (Anchura de distribución RBC) y MCV
(Volumen medio de células).
c. A la izquierda (es decir, para valores
inferiores de volumen RBC) del umbral de rectángulo inferior, se
identifica el primer valle o rectángulo de recuento cero, si está
presente, y se pone como el umbral de recuento. Se considera que
los valores superiores a este umbral son debidos a RBCs.
30 - Se calcula RBC (concentración de glóbulos
rojos).
RBC = (número de eventos) * (proporción que son
RBCs) * (relación de dilución) * (factor de corrección de
coincidencia) * (factores de calibración)/(velocidad de flujo *
tiempo de medición);
Donde número de eventos es el número de células
detectado por la puerta de hardware en el paso 14;
Proporción que son RBCs es el recuento de
histograma a la derecha del umbral de recuento dividido por el
recuento de histograma total.
El factor de corrección de coincidencia explica
el recuento de células dobles y es igual a 2 - exp (concentración
RBC no corregida * volumen del transductor/relación de
dilución).
31 - Calcular MCV y RDW
MCV = (media del histograma entre discriminantes)
* (0,8 fL por rectángulo) * (factor de calibración)
RDW = desviación estándar de volumen RBC/volumen
medio de células (dentro de discriminantes).
32 - Poner señalizadores asociados RBC para
indicar resultados anormales del análisis.
33 - Los resultados numéricos y de señalizador
RBC son devueltos al sistema para almacenamiento y visualización.
Ejemplos de resultados numéricos RBC se muestran en las figuras
45A-45F.
34 - Se genera un histograma para el
almacenamiento y visualización de valores de volumen RBC. Ejemplos
de histogramas de volumen RBC se muestran en las figuras
45A-45F y la figura 46.
35 - Se inicializan señalizadores y
parámetros.
36 - Se recuperan datos ópticos y de impedancia
de plaquetas de un archivo y se almacenan localmente. Los datos de
impedancia constan de valores de impedancia que representan
volúmenes de plaquetas. Los datos ópticos constan de valores
ópticos de dispersión lateral polarizada (PSS) y dispersión de
ángulo intermedio (IAS).
37 - Se genera un histograma de 256 rectángulos
de datos de impedancia de plaquetas). Esto representa valores de
volumen del orden de 0 a 35 fL.
38 - se ponen umbrales de rectángulo a ambos
lados del modo de histograma de la siguiente manera:
a. Se identifican los primeros rectángulos a
ambos lados del modo cuyo recuento es inferior a 0,04 veces el
recuento del modo.
b. Se identifica, si existe, un segundo pico más
allá del umbral original, junto con el valle entre dicho pico y el
modo.
c. Si existe un segundo pico y el recuento en el
valle es inferior a 0,02 veces el recuento del modo, el umbral se
desplaza al valle.
39 - PLTi, la concentración de plaquetas basada
en valores de impedancia:
PLTi = (número de eventos) * (proporción que son
plaquetas) * (relación de dilución) * (factores de
calibración)/(velocidad de flujo * tiempo de medición);
donde el número de eventos es el número de
células detectado por la puerta de hardware en el paso 14;
la proporción que son plaquetas es el recuento de
histograma a la derecha del umbral izquierdo dividido por el
recuento de histograma total.
40 - Se calculan los parámetros de distribución
de plaquetas MPV (volumen medio de plaquetas) y PDW (anchura de
distribución de plaquetas) (subrutina CalcPLTDist):
MPV = (número de rectángulos de la media de los
valores de histograma entre umbrales) * (0,137 fL por rectángulo) *
(factores de calibración)
PDW = (desviación estándar de valores de volumen
de plaquetas entre umbrales)/(volumen medio de plaquetas)
41 - Los señalizadores de plaquetas asociados con
impedancia se ponen a resultados anormales del análisis.
42 - Se aplica una puerta de ruido a los datos
ópticos de plaquetas en log(PSS) = 8,0.
43 - Se aplican puertas de banda de regresión a
los datos ópticos restantes de plaquetas como sigue:
a. Se calcula una regresión lineal para los datos
ópticos de plaquetas encima de la puerta de ruido en el plano de
análisis log (IAS) en función de log(PSS), junto con una
estimación de error estándar para esta regresión.
b. La puerta de banda de regresión superior se
traza paralela a y a una distancia de 2,0 errores estándar encima
de la línea de regresión.
c. La puerta de banda de regresión inferior se
traza paralela a y a una distancia de 2,5 errores estándar por
debajo de la línea de regresión.
44 - Los datos ópticos de plaquetas encima de la
puerta de ruido y entre las puertas de banda de regresión se
verifican en busca de una población superior:
a. Los puntos restantes se proyectan en la línea
de regresión del paso 43.
b. Se genera un histograma de 256 rectángulos, se
reduce a 64 rectángulos por promediado, se filtra con un filtro
vagón de 7 patillas, y se expande a 256 rectángulos por
interpolación.
c. Se identifica un modo en los 2/3 inferiores
del histograma.
d. Se busca un segundo pico en el 1/4 superior
del histograma.
e. Si existe un segundo pico en el 1/4 superior,
la puerta de población superior se pone al valle entre el modo y el
segundo pico. De otro modo, la puerta de población superior se pone
en el borde derecho del histograma. Las células no excluidas
previamente que están por encima de esta puerta son la "población
superior". Las células no excluidas previamente que están por
debajo de esta puerta son la "población inferior".
f. La población superior se compara con un
conjunto de criterios para determinar si incluye RBCs microcíticos.
Si es así, se pone un señalizador de aviso.
45 - Se calcula la concentración de plaquetas
determinada ópticamente (PLTo:
PLTo = (número de eventos) * (proporción que son
plaquetas) * (relación de dilución)/(velocidad de flujo * tiempo de
medición)
donde el número de eventos es el número de
eventos ópticos contados por hardware que caen dentro de la puerta
de hardware cuadrada en el espacio log(IAS) en función de
log(PSS);
la proporción que son plaquetas es el recuento de
la población superior dividida por la suma del recuento de las
poblaciones superior e inferior.
46 - Se calcula el plaquetocrito (PCT, o fracción
de sangre entera compuesta de plaquetas):
PCT = PLTo * MPV *(factor de conversión
unitario)
47 - Se ponen señalizadores asociados con
parámetros de plaquetas determinados ópticamente para indicar
resultados anormales.
48 - Los resultados numéricos y señalizadores
asociados con parámetros de plaquetas determinados ópticamente son
devueltos al sistema para el almacenamiento y visualización.
Ejemplos de resultados numéricos de plaquetas se muestran en las
figuras 45A-45F, las figuras 47 y 48.
49 - Se genera un histograma de valores de
impedancia de plaquetas para el almacenamiento y visualización. Se
representa un ejemplo de histograma de impedancia de plaquetas en
la figura 47.
50 - Se genera un diagrama de dispersión de
valores ópticos de plaquetas y puertas para el almacenamiento y
visualización. Ejemplos de diagramas de dispersión de plaquetas se
muestran en las figuras 45A-45F, las figuras 47 y
48.
Se puede usar una realización de la invención
para realizar un ejemplo de análisis diferencial de glóbulos
blancos (WBC) de muestras de sangre entera de la siguiente manera.
Los pasos del procesado de muestra son controlados por software.
Los pasos del análisis de datos son controlados por software.
1 - El motor de copa WBC comienza el movimiento
de mezcla de la copa (Paso W1).
2 - Se dispensa 1275 \mul de agente lisante WBC
a la copa WBC con la jeringa de diluyente WBC.
3 - Se deposita 37,5 \mul de sangre entera en
la copa WBC con la sonda de aspiración (Paso A9 del Ejemplo 1).
4 - Se reposiciona la jeringa de diluyente WBC
(Paso W3).
5 - La jeringa de diluyente WBC se desplaza para
quitar holgura (Paso W4).
6 - Se deja transcurrir aproximadamente 9,4
segundos después de la mezcla de la muestra de sangre y agente
lisante WBC.
7 - Se inicia flujo envolvente en el transductor
óptico (Paso RBC6 del Ejemplo 3).
8 - La mezcla de sangre y agente lisante se
desplaza a la línea de transductor óptico usando la bomba
peristáltica HGB (Paso W5).
9 - Se drena y enjuaga la copa WBC (Paso W6).
10 - La realineación de la válvula permite el
flujo de muestra WBC mediante el transductor óptico (Paso W7).
11 - El flujo de muestra WBC comienza mediante el
transductor óptico a aproximadamente 27,6 \mul/s con la jeringa de
distribución óptica (Paso W8).
12 - El caudal de muestra WBC se reduce a
aproximadamente 2,5 \mul/segundo (Paso W9).
13 - El transductor óptico recoge datos ópticos
WBC (Paso W10).
14 - Se reposiciona la jeringa de distribución
óptica (Paso W11).
15 - Se quita holgura de la jeringa de
distribución óptica (Paso W12).
16 - Los datos del transductor óptico se guardan
en un archivo para uso en análisis WBC diferencial siguiente (pasos
17 - XX, ejecutados por el archivo de algoritmo
mcWBCAlgorithm.cc).
17 - Se recupera datos WBC de un archivo y
almacenan localmente. Estos datos constan de valores de pérdida de
luz axial (ALL), dispersión de ángulo intermedio (IAS), dispersión
lateral polarizada (PSS), dispersión lateral despolarizada (DSS), y
fluorescencia roja (FL3) para cada evento detectado.
Los pasos 18-22 identifican
glóbulos rojos nucleados (NRBCs).
18 - Se genera un histograma de 256 rectángulos
de valores FL3.
19 - Los eventos se dividen en "FL3 alto" o
"FL3 bajo" identificando un valle cerca de log(FL3) =
100. Un ejemplo de esta división se ilustra en las figuras 49A y
49B.
20 - Se genera un histograma de los valores ALL
de las células FL3 altas. Un ejemplo de este histograma se ilustra
en las figuras 50A y 50B.
21 - Se identifica un pico a un valor de menos de
ALL = 75; si existe. Si no existe, no se refieren NRBCs.
22 - Si existe un pico a ALL<75, los eventos
con un valor PSS mayor que el umbral PSS (aproximadamente 45) se
clasifican como NRBCs y no experimentan análisis adicional.
Los pasos 23-26 identifican
neutrófilos y eosinófilos.
23 - Se utiliza un gráfico de todos los eventos
en el plano PSS en función de ALL para identificar los dos picos
más grandes, que son el pico de neutrófilos y el pico de
monocitos.
24 - Se traza una línea entre los dos picos.
Comenzando en el valor mínimo a lo largo de esta línea, se traza
una línea divisoria entre los granulocitos (por encima de la línea)
y células mononucleares (por debajo de la línea). Un ejemplo de la
línea divisoria se ilustra en las figuras 51A y 51B.
25 - Para los granulocitos (por encima de la
línea), se genera un histograma de los valores de arctan
(DSS/PSS).
26 - Se busca en el histograma del paso 25 un
valle entre los valores angulares de 10º y 31º. Las células con un
valor angular de arctan(DSS/PSS) mayor que este valle se
clasifican como eosinófilos, y las células con valores angulares
inferiores a este valle se clasifican como neutrófilos. Un ejemplo
de este histograma y línea divisoria angular se ilustra en las
figuras 52A y 52B.
Los pasos 27-28 identifican
monocitos y estroma.
27 - A partir de las células restantes se genera
un histograma de 256 rectángulos de valores ALL.
28 - En el histograma ALL se buscan dos valles,
en la región alta (rectángulos 100-160) y en la
región baja (rectángulos 45-75). Las células encima
del valle superior se clasifican como monocitos. Las células por
debajo del valle más bajo se clasifican como estroma. Un ejemplo
del histograma ALL y líneas divisorias se ilustra en la figura
53.
Los pasos 29-30 se utilizan para
identificar linfocitos.
29 - A partir de las células restantes se genera
un histograma de 256 rectángulos de valores IAS.
30 - Se identifica un valle, si existe, entre los
rectángulos 70 y 110. Si tal valle no existe, se traza una línea
divisoria a un valor igual a la media de los valores IAS más 2,5
veces la desviación estándar de los valores IAS. Las células a la
izquierda de este valle o línea se clasifican como linfocitos. Un
ejemplo de esta división se ilustra en la figura 54.
Los pasos 31-32 se utilizan para
identificar basófilos.
31 - A partir de las células restantes se genera
un histograma de 256 rectángulos de valores ALL.
32 - Se identifica un valle en el histograma ALL,
si existe, entre 1/4 y 3/4 de la distancia de las líneas de
separación linfocito-estroma y
linfocito-monocito determinadas en el paso 28. Si no
existe tal valle, se traza una línea divisoria por defecto a la
mitad de esta distancia. Las células con valores ALL por encima de
esta línea se clasifican como basófilos. Los eventos con valores
ALL por debajo de esta línea se clasifican como ruido. Un ejemplo de
esta división se ilustra en la figura 55.
33 - Se generan histogramas y estadísticas para
cada población clasificada.
34 - Se ponen señalizadores de alerta para
resultados anormales del análisis. En particular, este paso incluye
realizar una comprobación estadística de la presencia de RBCs
resistentes a lisis y de blastos. Se pone un señalizador de alerta
de blasto si una combinación ponderada de las estadísticas
siguientes es superior a un valor umbral (aproximadamente
3,874):
Estadística de población | Factor de ponderación |
Porcentaje de monocitos | 0,030352 |
Media de linfocitos ALL | 0,013182 |
Media de monocitos ALL | 0,016766 |
Coeficiente de variación de monocitos ALL | 0,152739 |
Coeficiente de variación de monocitos IAS | -0,041058 |
Media de monocitos PSS | -0,051015 |
Coeficiente de variación de monocitos PSS | 0,028661 |
Coeficiente de variación de linfocitos y monocitos PSS | -0,02960 |
Media de todos WBC FL3 | 0,024813 |
35 - Todos los resultados numéricos y
señalizadores de alerta son devueltos al sistema para
almacenamiento y visualización.
36 - Se genera un conjunto de diagramas de
dispersión y envía al sistema para almacenamiento y visualización.
Una pantalla típica presentará ALL en función de IAS, DSS en
función de PSS, y ALL en función de FL3, como se ilustra en las
figuras 45A-45F.
Sigue un ejemplo de análisis de reticulocitos de
muestras de sangre entera. Los pasos del procesado de muestra son
controlados por software. Los pasos del análisis de datos son
controlados por software. Los diagramas de dispersión generados por
este análisis se ejemplifican en las figuras 14A y 14B.
1 - El análisis comienza con una copa RBC
vacía.
2 - Se dispensa 2200 \mul de diluyente RBC a la
copa RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC2).
3 - Se dispensa 18,75 \mul de sangre entera y
2000 \mul de diluyente RBC mediante la sonda de aspiración a la
copa RBC, como se describe en el Ejemplo 1 (Paso A15).
4 - Se dispensa 3656 \mul de diluyente a la
copa RBC con la jeringa de diluyente RBC (Paso RBC3). Se produce
una relación de dilución de aproximadamente 420:1.
5 - Se aspira 500 \mul de la mezcla de
sangre/diluyente a la sonda de aspiración desde la copa RBC (Paso
A16).
6 - La sonda de aspiración se eleva y limpia
(Paso A17).
7 - La sonda de aspiración se desplaza a una
posición directamente sobre la copa RETIC (Paso A18).
8 - La sonda de aspiración se baja ligeramente
hacia la copa RETIC (Paso A19).
9 - Se dispensa 200 \mul de la mezcla de
sangre/diluyente de la sonda de aspiración a la copa RETIC para
análisis de reticulocitos (Paso A20).
10 - Se dispensa 600 \mul de colorante de
reticulocito mediante un orificio fijo a la copa RETIC con la
jeringa de diluyente de reticulocito (Paso R1). Se produce una
relación de dilución de aproximadamente 1680:1.
11 - Se reposiciona la jeringa de diluyente de
reticulocito (Paso R2).
12 - La muestra de reticulocitos se transfiere a
cerca de la celda de flujo óptico con la bomba peristáltica de RBC
(Paso R3).
13 - Se inicia un breve contraflujo en la línea
de muestra WBC a la celda de flujo óptico para evitar transferencia
(Paso R4).
14 - La copa RETIC se drena (Paso R5).
15 - El flujo de la muestra de reticulocitos se
inicia mediante la celda de flujo óptico a 78 \mul/s usando la
jeringa de distribución óptica (Paso R6) para desplazar el volumen
muerto de la línea de fluido.
16 - El flujo de la muestra de reticulocitos
mediante la celda de flujo óptico se reduce a aproximadamente 2,0
\mul/s (Paso R7).
17 - La copa RETIC se llena de diluyente para
enjuague (Paso R8).
18 - Se recogen datos de reticulocitos en el
transductor óptico (Paso R9). Una puerta de hardware recoge datos
para cada evento óptico con un valor de dispersión de ángulo
intermedio (IAS) mayor que un cierto valor umbral.
19 - La copa RETIC se drena, enjuaga y drena
(Paso R10).
20 - Se reposiciona la jeringa de distribución
óptica (Paso R11).
21 - Se enjuagan las líneas de distribución de
muestra de reticulocitos (Paso R12).
22 - Se quita holgura de la jeringa de
distribución óptica (Paso R13).
23 - Se almacenan datos ópticos de reticulocitos
en un archivo para análisis siguiente. El análisis de los pasos
24-33 se controla por un algoritmo.
24 - Se recuperan datos de un archivo y almacenan
localmente. Estos datos constan de valores de dispersión de ángulo
intermedio (IAS) y fluorescencia verde (FL1).
25 - Se genera un histograma de 256 rectángulos
de valores log(IAS).
26 - Se identifica un valle entre los canales 150
y 190, si existe. Las células con valores log(IAS)
inferiores a este valle (o 170, si no existe valle) se consideran
plaquetas y quitan del análisis posterior. Un ejemplo de este
histograma y línea divisoria se ilustra en la figura 56.
27 - A partir de las células restantes se genera
un histograma de 256 rectángulos de valores log(FL1).
28 - Se identifica un valle, si existe, en la
región superior de este histograma (entre los rectángulos 175 y
225). Las células con valores log(FL1) mayores que este
valle (o 200, si no existe valle) se consideran WBCs y quitan del
análisis.
29 - Se busca en el histograma log(FL1) un
valle a la derecha del pico mayor (RBC). Si existe tal valle, las
células a la derecha se clasifican como reticulocitos. Si no existe
valle, se pone una línea divisoria en el canal 120 (cursor de
reticulocitos por defecto). Las células a la derecha de esta línea
divisoria se clasifican como reticulocitos. Ejemplos de este
histograma y las líneas divisorias se ilustran en las figuras 45F y
57.
30 - Se calcula el índice de madurez de
reticulocitos (RMI). Este valor es igual al porcentaje de
reticulocitos que caen en una región de "FL1 alto", definida
como la que tiene rectángulos de histograma log(FL1) más
altos que el límite inferior de reticulocitos (establecido en el
paso 29) más un valor fijo (aproximadamente 24).
31 - Los resultados numéricos son devueltos al
sistema para el almacenamiento y visualización.
32 - Se genera un diagrama de dispersión para
almacenamiento y visualización. Un ejemplo de un diagrama de
dispersión de reticulocito se ilustra en las figuras 14A y 58.
33 - Se genera un histograma de valores
log(FL1) para visualización y almacenamiento. Ejemplos de
histogramas de reticulocitos se ilustran en las figuras 14B, 45F y
59.
Sigue un ejemplo de análisis de
inmunofenotipificación del linfocito de muestras de sangre entera.
Los pasos del procesado de muestra son controlados por
software.
1. Se aspiran 100 \mul de sangre entera por la
sonda de aspiración y se depositan en la copa de transferencia.
Este volumen se puede ajustar si necesario para proporcionar
suficiente sangre para ejecutar todos los ensayos de
inmunofenotipificación deseados para dicha muestra.
2. La sonda de incubación aspira aproximadamente
70 \mul de la copa de transferencia y los deposita en el número
apropiado de copas de incubación.
3. Se aspira reactivos, tal como reactivos de
anticuerpos para inmunofenotipificación, por la sonda de incubación
y depositan en las copas de incubación apropiadas.
4. Se produce un retardo de tiempo apropiado para
incubación.
5. Se añade aproximadamente 670 \mul de
diluyente WBC a la copa WBC. Este paso y los pasos de procesado de
muestra siguientes (5 a 8) son controlados por software.
6. Después de la incubación, se aspiran
aproximadamente 30 \mul de la muestra por la sonda de incubación
y depositan en la copa WBC.
7. La mezcla de muestra y diluyente es mezclada
por la copa WBC durante aproximadamente 5 segundos.
8. La mezcla se envía mediante el transductor
óptico para la medición de propiedades ópticas. Las propiedades
medidas pueden incluir pérdida de luz axial (ALL), dispersión de
ángulo intermedio (IAS), y dos valores de fluorescencia (FL1 y
FL2).
9. Los datos se almacenan para análisis
siguiente. Los pasos de análisis generales pueden incluir los aquí
indicados.
10. Se crea un gráfico de valores ALL en función
de IAS dividido en regiones bivariantes polares. Tales regiones
están delimitadas por radios y arcos que derivan de un origen. El
origen se puede variar, pero por lo general está colocado en el
límite ALL máximo y el punto IAS cero. Véase la figura 60A.
11. Se crea un segundo gráfico de log(FL2)
en función de log(FL1) y divide en regiones bivariantes
polares. El origen para esta división está por lo general en (0,0).
Una ilustración de un ejemplo del gráfico de ALL en función de IAS
y el gráfico de log(FL2) en función de log(FL1) se
presenta en las figuras 60A y 60D.
12. En ambos gráficos se busca picos de linfocito
hacia la izquierda y después radialmente hacia fuera. Los umbrales
se ponen a 1/10 de las alturas de pico. Las células cuyos puntos de
datos asociados están dentro de los umbrales se consideran
linfocitos.
13. El número de eventos de linfocito en cada
gráfico se cuenta y comparan entre sí y con el recuento de
linfocitos hematológicos para detectar posibles errores. Véase las
figuras 60B, 60C, 60E y 60F.
14. El análisis estadístico puede refinar más los
límites de los valores IAS y ALL que identifican más
específicamente linfocitos. Esta delineación puede formar
elipsoides, polígonos, u otras zonas geométricas dentro del espacio
del análisis de ALL en función de IAS.
15. Puede proseguir el análisis de la misma
muestra tratada con diferentes reactivos de anticuerpos. Las
células se consideran para análisis solamente si sus valores IAS y
ALL caen dentro de los límites determinados por la identificación
de linfocitos (pasos 10 a 14).
La fracción de linfocitos que son células T
Helper se puede medir siguiendo un procedimiento similar al
siguiente:
1. Se incuba una porción de una muestra de sangre
entera con una mezcla de reactivo incluyendo anticuerpos marcados
con fluorescencia que se unirán a receptores CD45 en WBCs y
emitirán fluorescencia detectable por uno de los dos detectores de
fluorescencia (FL1 o FL2) y anticuerpos marcados con fluorescencia
que se unirán a ambos receptores CD13 y CD14 en WBCs y emitirán
fluorescencia detectable por el otro de los dos detectores de
fluorescencia. En este Ejemplo, el anticuerpo CD45 se une a
isotiocianato de fluoresceína (FITC) y los anticuerpos CD13 y CD14
se unen a ficoeritrina (PE). Se produce incubación típica durante
aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
2. Se incuba una segunda porción de la misma
muestra de sangre entera con una mezcla de reactivo incluyendo
anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores
CD3 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por uno de los dos
detectores de fluorescencia (FL1 o FL2) y anticuerpos marcados con
fluorescencia que se unirán a receptores CD4 en WBCs y emitirán
fluorescencia detectable por el otro de los dos detectores de
fluorescencia. En este Ejemplo, los anticuerpos CD3 se unen a FTC y
los anticuerpos CD4 se unen a PE.
3. La primera muestra de sangre incubada se
analiza de forma parecida a la descrita en el Ejemplo 6. Este
análisis produce una región de valores IAS y ALL (la puerta de
linfocito) que corresponde a linfocitos, que se caracterizan por la
presencia de receptores CD45 y la ausencia de receptores CD13 y
CD14. En la figura 61A se presenta un gráfico de niveles de
fluorescencia correspondientes a actividad CD13/CD14 y actividad
CD45 y la designación resultante de linfocitos. Un gráfico de los
valores IAS y ALL para las mismas células y la puerta de linfocitos
resultante se presenta en 61B.
4. La pureza de la puerta de linfocitos
procedimiento se puede determinar calculando la fracción de todas
las células dentro de la puerta de linfocitos que demuestran la
presencia de receptores CD45 y la ausencia de receptores CD13 y
CD14, como se indica con los niveles de fluorescencia detectados por
los detectores FL1 y FL2. Un gráfico de los niveles de
fluorescencia correspondientes a actividad CD13/CD14 y actividad
CD45 para células dentro de la puerta de linfocitos se presenta en
la figura 61C.
5. La segunda muestra de sangre incubada se
analiza de forma parecida a la descrita en los pasos 1 a 8 del
Ejemplo 6. Cada célula cuyos valores de IAS y ALL caen dentro de la
puerta de linfocitos se caracteriza como positiva o negativa para
cada uno de los dos anticuerpos dentro de la mezcla de reactivo
(CD3 y CD4), en base a una comparación de los niveles detectados de
FL1 y FL2 con los niveles de fluorescencia de células de control
incubadas con una mezcla de anticuerpos considerada no de unión y
marcada con PE y FITC. Los niveles de fluorescencia de las células
de control (que representan reacciones negativas) se ilustran en la
figura 61D.
6. La fracción de linfocitos que son células T
Helper se determina como la fracción de células dentro de la puerta
de linfocitos que son positivas para CD3 y positivas para CD4. Un
gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a
actividad CD3 y actividad CD4 para células dentro de la puerta de
linfocitos, mostrando la fracción que es positiva para ambos, se
presenta en la figura 61E.
7. La concentración de células T Helper se puede
determinar como la fracción de linfocitos que son positivos para
CD3 y positivos para CD4 (determinada en el paso 6) por el recuento
de linfocitos determinado en el análisis diferencial WBC descrito
en el Ejemplo 4.
Se puede usar un procedimiento similar para
cuantificar el subconjunto de linfocitos de células T supresoras,
caracterizado por ser positivo para CD3 y CD8.
1. Se incuba una porción de una muestra de sangre
entera con una mezcla de reactivo incluyendo anticuerpos marcados
con fluorescencia que se unirán a receptores CD45 en WBCs y
anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores
CD13 y CD14 en WBCs, como en el paso 1 del Ejemplo 6A. El análisis
de esta muestra incubada se ejecuta como se describe en los pasos 3
y 4 del Ejemplo 6A, produciendo una puerta de linfocitos. Se
produce incubación típica durante aproximadamente 15 minutos a
temperatura ambiente.
2. Se incuba una segunda porción de la misma
muestra de sangre entera con una mezcla de reactivo incluyendo
anticuerpos marcados con fluorescencia que se unirán a receptores
CD3 en WBCs y emitirán fluorescencia detectable por uno de los dos
detectores de fluorescencia (FL1 o FL2) y anticuerpos marcados con
fluorescencia que se unirán a CD8 receptores en WBCs y emitirán
fluorescencia detectable por el otro de los dos detectores de
fluorescencia. En este Ejemplo, los anticuerpos CD3 se unen a FITC
y los anticuerpos CD8 se unen a PE.
3. La segunda muestra de sangre incubada se
analiza de forma parecida a la descrita en los pasos 1 a 8 del
Ejemplo 6. Cada célula cuyos valores de IAS y ALL caen dentro de la
puerta de linfocitos se caracteriza como positiva o negativa para
cada uno de los dos anticuerpos dentro de la mezcla de reactivo
(CD3 y CD8), en base a una comparación de los niveles detectados de
FL1 y FL2 para controlar los niveles de fluorescencia.
4. La fracción de linfocitos que son células T
supresoras se determina como la fracción de células dentro de la
puerta de linfocitos que son positivas para CD3 y positivas para
CD8. Un gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a
actividad CD3 y actividad CD8 para células dentro de la puerta de
linfocitos, mostrando la fracción que es positiva para ambos, se
presenta en la figura 61F.
5. La concentración de células T supresoras se
puede determinar como la fracción de linfocitos que son positivas
para CD3 y positivas para CD8 (determinado en el paso 5) por el
recuento de linfocitos determinado en el análisis WBC diferencial
descrito en el Ejemplo 4.
El número de linfocitos T y B se puede medir
usando un procedimiento similar al descrito en los Ejemplos 6A y
6B. La primera muestra incubada, utilizada para establecer la
puerta de linfocitos, es la misma mezcla de anticuerpos marcados
CD45 y CD13/CD14 como en los Ejemplos 6A y 6B. La segunda porción
de la muestra de sangre se incuba con una mezcla de anticuerpos CD3
(marcados con FITC) y anticuerpos CD19 (marcados con PE). Las
fracciones de células T y células B se determinan a partir de la
fracción de células que son positivas CD3 y negativas CD19 (células
T) y la fracción que son negativas CD3 y positivas CD19 (células B).
Un gráfico de los niveles de fluorescencia correspondientes a
actividad CD3 y actividad CD19, indicando las fracciones de células
T y células B, se presenta en la figura 61G.
La validez de las mediciones de subconjuntos de
linfocitos descritas en estos Ejemplos se demuestra comparando los
resultados del análisis con resultados de ensayos de citometría de
flujo manual convencional. Los resultados de tal comparación con
análisis convencional en un sistema FACScan de Becton Dickinson
Immunocytometry Systems, se presentan en las figuras
62A-62D.
Los gráficos de las figuras
62A-62D ilustran la correlación entre fracciones de
linfocitos que son positivas para CD3 y CD4 (figura 62A), positivas
para CD3 y CD8 (figura 62B), positivas para CD19 (figura 62C), y
positivas para CD3 solo (figura 62D).
Se mezclan veinticinco (25) \mul de una muestra
clínica de sangre entera en línea en el sistema instrumental
analítico celular descrito anteriormente, con 675 \mul del
reactivo multipropósito, precalentados a 42ºC en la copa WBC 138.
La muestra/reactivo se mezcla e incuba durante 11 segundos. Esta
mezcla es transportada después a la celda de flujo 170 que tarda
aproximadamente 8 1/2 segundos en un análisis WBC/Dif/NRBC. Las
figuras 40A-40C y 41A y 41B muestran el resultado
de este análisis en muestra conteniendo 56NRBC/10OWBC y 140
NRBC/100 WBC, respectivamente.
Claims (10)
1. Un método para preparar una solución hecha de
un primer volumen predeterminado de un primer fluido y un segundo
volumen predeterminado de un segundo fluido, incluyendo el método
los pasos de:
a) poner en funcionamiento un calentador unido a
una primera carcasa y móvil con la primera carcasa para recibir el
primer fluido y el segundo fluido para aplicar energía térmica a la
primera carcasa, estando conectada la primera carcasa
operativamente con y dispuesta sustancialmente dentro de una segunda
carcasa;
b) introducir el segundo volumen predeterminado
del segundo fluido en la primera carcasa;
c) hacer vibrar la primera carcasa con un motor
principal para mover el segundo volumen predeterminado del segundo
fluido en la primera carcasa durante un primer período de tiempo
predeterminado mientras la segunda carcasa permanece
sustancialmente estacionaria con respecto al motor principal;
d) introducir el primer volumen predeterminado
del primer fluido en la primera carcasa;
e) hacer vibrar la primera carcasa con el motor
principal para mover el primer volumen predeterminado del primer
fluido y el segundo volumen predeterminado del segundo fluido en la
primera carcasa durante un segundo período de tiempo predeterminado
para hacer la solución mientras la segunda carcasa permanece
sustancialmente estacionaria con respecto al motor principal; y
f) sacar de la primera carcasa la solución hecha
del primer volumen predeterminado del primer fluido y el segundo
volumen predeterminado del segundo fluido.
2. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde la relación de primer fluido a segundo
fluido es de 1 a 35.
3. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde el primer fluido es una muestra de sangre
entera.
4. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde el segundo fluido es un diluyente de
sangre.
5. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde el primer período de tiempo predeterminado
es 5 segundos.
6. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde el segundo período de tiempo predeterminado
es 11 segundos.
7. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde el primer fluido es sangre entera
incluyendo glóbulos rojos y glóbulos blancos y el segundo fluido es
un diluyente de sangre e incluyendo además los pasos de:
g) lisar los glóbulos rojos; y
h) fijar los glóbulos blancos.
8. Un método como el definido en la
reivindicación 1, incluyendo además el paso de:
i) almacenar la solución hecha del primer volumen
predeterminado del primer fluido y el segundo volumen
predeterminado del segundo fluido sacado de la primera carcasa.
9. Un método como el definido en la
reivindicación 1, donde la temperatura de la primera carcasa es 43
\pm1,5 grados Celsius.
10. Un método como el definido en la
reivindicación 1, incluyendo además el paso de:
j) aplicar energía térmica desde la primera
carcasa a al menos uno del primer fluido y el segundo fluido.
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---|---|---|---|
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US08/488,532 US5631165A (en) | 1994-08-01 | 1995-06-07 | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
US08/482,678 US5656499A (en) | 1994-08-01 | 1995-06-07 | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
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Families Citing this family (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5891734A (en) * | 1994-08-01 | 1999-04-06 | Abbott Laboratories | Method for performing automated analysis |
US5817519A (en) * | 1995-12-28 | 1998-10-06 | Bayer Corporation | Automated method and device for identifying and quantifying platelets and for determining platelet activation state using whole blood samples |
US6025201A (en) * | 1995-12-28 | 2000-02-15 | Bayer Corporation | Highly sensitive, accurate, and precise automated method and device for identifying and quantifying platelets and for determining platelet activation state using whole blood samples |
US6280967B1 (en) * | 1996-08-02 | 2001-08-28 | Axiom Biotechnologies, Inc. | Cell flow apparatus and method for real-time of cellular responses |
US6008010A (en) | 1996-11-01 | 1999-12-28 | University Of Pittsburgh | Method and apparatus for holding cells |
US5917584A (en) * | 1997-11-21 | 1999-06-29 | Coulter International Corp. | Method for differentiation of nucleated red blood cells |
DE19850841A1 (de) * | 1998-11-04 | 2000-05-25 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Verfahren zum Betreiben eines elektronischen Dosiersystems und Dosiersystem zur Durchführung des Verfahrens |
JP4101994B2 (ja) | 1999-01-21 | 2008-06-18 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置および自動粒子分析方法 |
US6228652B1 (en) * | 1999-02-16 | 2001-05-08 | Coulter International Corp. | Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample |
JP2002537557A (ja) * | 1999-02-19 | 2002-11-05 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッド | 高開口数流れ血球計算器及びその使用方法 |
US6369894B1 (en) * | 2000-05-01 | 2002-04-09 | Nalco Chemical Company | Modular fluorometer |
US7283223B2 (en) * | 2002-08-21 | 2007-10-16 | Honeywell International Inc. | Cytometer having telecentric optics |
JP2002202241A (ja) | 2000-10-30 | 2002-07-19 | Sysmex Corp | 粒子計測装置用電解液 |
US20030109067A1 (en) | 2001-12-06 | 2003-06-12 | Immunetech, Inc. | Homogeneous immunoassays for multiple allergens |
WO2003090897A1 (en) | 2002-04-26 | 2003-11-06 | Abbott Laboratories | Structure and method for handling magnetic particles in biological assays |
US7110192B2 (en) * | 2005-01-12 | 2006-09-19 | Dako Denmark A/S | System and method for a composite lens for a flow cytometer |
US7846131B2 (en) * | 2005-09-30 | 2010-12-07 | Covidien Ag | Administration feeding set and flow control apparatus with secure loading features |
DE102005048807B3 (de) * | 2005-10-10 | 2006-11-16 | Johann Wolfgang Goethe-Universität | Vorrichtung für die qualitative und/oder quantitative Bestimmung von IR-aktiven Inhaltsstoffen in Flüssigkeiten sowie ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von IR-aktiven Inhaltsstoffen in Flüssigkeiten |
US7763005B2 (en) * | 2006-03-02 | 2010-07-27 | Covidien Ag | Method for using a pump set having secure loading features |
US7927304B2 (en) | 2006-03-02 | 2011-04-19 | Tyco Healthcare Group Lp | Enteral feeding pump and feeding set therefor |
US8021336B2 (en) | 2007-01-05 | 2011-09-20 | Tyco Healthcare Group Lp | Pump set for administering fluid with secure loading features and manufacture of component therefor |
US7722562B2 (en) * | 2006-03-02 | 2010-05-25 | Tyco Healthcare Group Lp | Pump set with safety interlock |
US7758551B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-07-20 | Covidien Ag | Pump set with secure loading features |
US7722573B2 (en) | 2006-03-02 | 2010-05-25 | Covidien Ag | Pumping apparatus with secure loading features |
CN101336386A (zh) | 2006-03-31 | 2008-12-31 | 深圳Tcl新技术有限公司 | 投影透镜系统及方法 |
ITUD20060111A1 (it) * | 2006-04-28 | 2007-10-29 | Sire Analytical Syst Srl | Metodo per la rilevazione di stati di anemia presenti in un campione ematico |
JP4304633B2 (ja) | 2006-10-23 | 2009-07-29 | ソニー株式会社 | 標識検出装置及び標識検出方法 |
JP4304634B2 (ja) | 2006-10-23 | 2009-07-29 | ソニー株式会社 | 標識検出装置及び標識検出方法 |
WO2008061058A2 (en) * | 2006-11-10 | 2008-05-22 | Luminex Corporation | Flow cytometer and fluidic line assembly with multiple injection needles |
US7560686B2 (en) * | 2006-12-11 | 2009-07-14 | Tyco Healthcare Group Lp | Pump set and pump with electromagnetic radiation operated interlock |
CN101652764B (zh) * | 2007-03-23 | 2013-05-01 | 贝克曼考尔特公司 | 流式细胞仪中使用的多增益自适应线性处理和门控数字系统 |
US20090027998A1 (en) * | 2007-07-25 | 2009-01-29 | Abbott Laboratories | Magnetic mixer |
US7787197B2 (en) * | 2007-09-14 | 2010-08-31 | Becton, Dickinson And Company | Beam-adjusting optics |
US20090129990A1 (en) * | 2007-11-16 | 2009-05-21 | Abbott Laboratories | Rack for sample containers for clinical analyzer |
US7678331B2 (en) * | 2007-12-20 | 2010-03-16 | Abbott Laboratories Inc. | Automatic loading of sample tubes for clinical analyzer |
WO2009133928A1 (ja) * | 2008-05-02 | 2009-11-05 | アークレイ株式会社 | 白血球の分析方法およびそれに使用する分析試薬 |
US8148101B2 (en) * | 2008-07-22 | 2012-04-03 | Abbott Laboratories | Method for classifying and counting bacteria in body fluids |
HU227875B1 (en) | 2008-10-13 | 2012-05-29 | Diatron Medicinai Instr Laboratoriumi Diagnosztikai Fejlesztoe Gyarto Zartkoerueen Muekoedoe Reszven | Optical circulation cytometer furthermore testing method |
US8481302B2 (en) * | 2008-11-03 | 2013-07-09 | General Electric Company | Total bacteria monitoring system |
US9464978B2 (en) | 2009-03-04 | 2016-10-11 | Beckman Coulter, Inc. | Cross-instrument method and system for cell population discrimination |
ES2387368B1 (es) * | 2009-05-15 | 2013-08-08 | Universidad De Barcelona | Metodo y aparato de medida de las fuerzas opticas que actuan sobre una particula |
US20100329927A1 (en) * | 2009-06-26 | 2010-12-30 | Perez Carlos A | Pipelining Assembly For A Blood Analyzing Instrument |
US8154274B2 (en) | 2010-05-11 | 2012-04-10 | Tyco Healthcare Group Lp | Safety interlock |
US8645306B2 (en) * | 2010-07-02 | 2014-02-04 | Idexx Laboratories, Inc. | Automated calibration method and system for a diagnostic analyzer |
JP6166716B2 (ja) * | 2011-05-04 | 2017-07-19 | アボット・ラボラトリーズAbbott Laboratories | 好塩基球分析システムおよび方法 |
US9091624B2 (en) * | 2011-05-04 | 2015-07-28 | Abbott Laboratories | White blood cell analysis system and method |
ES2902648T3 (es) * | 2011-05-04 | 2022-03-29 | Abbott Lab | Método de análisis de glóbulos rojos nucleados y analizador hematológico automatizado |
AU2012271330B2 (en) * | 2011-06-17 | 2015-04-02 | Roche Diagnostics Hematology, Inc. | Solutions for histoprocessing of biological samples |
CN104024831B (zh) * | 2011-12-29 | 2017-03-29 | 雅培制药有限公司 | 用于阻止衍射图样的流式细胞仪系统和方法 |
EP3650853A1 (en) * | 2013-03-12 | 2020-05-13 | Abbott Laboratories | Reagents, systems and methods for analyzing erythrocytes and platelets |
JP6692743B2 (ja) * | 2013-03-12 | 2020-05-13 | アボット・ラボラトリーズAbbott Laboratories | 白血球を分析するための試薬、システム、及び方法 |
JP2016515211A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-26 | ベックマン コールター, インコーポレイテッド | フローサイトメーター用の光学系 |
WO2015130423A1 (en) * | 2014-02-28 | 2015-09-03 | Life Technologies Corporation | Systems, methods, and apparatuses for optical systems in flow cytometers |
DE102015007029A1 (de) | 2015-06-02 | 2016-12-08 | Fachhochschule Lübeck | Fluidprobenvorrichtung und deren Herstellung, Fluidanalysevorrichtung und optisches Messverfahren |
HU230997B1 (hu) * | 2015-11-12 | 2019-09-30 | Norma Instruments Zrt | Javított mérési jellemzőkkel rendelkező mérőegység |
EP3392645A1 (en) * | 2016-01-22 | 2018-10-24 | Sony Corporation | Microparticle measurement device, information processing device, and information processing method |
JP6454313B2 (ja) * | 2016-09-16 | 2019-01-16 | 太平電業株式会社 | コンクリート構造物への穿孔方法および装置 |
KR102644216B1 (ko) * | 2017-01-10 | 2024-03-05 | 엘지이노텍 주식회사 | 입자 센싱 장치 |
WO2018217923A1 (en) * | 2017-05-25 | 2018-11-29 | Abbott Laboratories | Methods and systems for sample analysis |
EP3634528B1 (en) | 2017-06-07 | 2023-06-07 | Shifamed Holdings, LLC | Intravascular fluid movement devices, systems, and methods of use |
WO2019067185A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Becton, Dickinson And Company | METHODS OF ALIGNING A LASER WITH A FLOW FLOW AND CORRESPONDING SYSTEMS |
JP7319266B2 (ja) | 2017-11-13 | 2023-08-01 | シファメド・ホールディングス・エルエルシー | 血管内流体移動デバイス、システム、および使用方法 |
CN117959583A (zh) | 2018-02-01 | 2024-05-03 | 施菲姆德控股有限责任公司 | 血管内血泵以及使用和制造方法 |
CN111656188B (zh) * | 2018-04-28 | 2021-10-12 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 试剂、分析血小板的方法及血液细胞分析仪 |
WO2019206300A1 (zh) * | 2018-04-28 | 2019-10-31 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种血液检测方法及血液分析系统 |
WO2019206297A1 (zh) * | 2018-04-28 | 2019-10-31 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种血液分析仪及分析方法 |
JP7201297B2 (ja) * | 2018-09-26 | 2023-01-10 | シスメックス株式会社 | フローサイトメーター、データ送信方法及び情報処理システム |
DE102019204668A1 (de) * | 2019-04-02 | 2020-10-08 | Qundis Gmbh | Messvorrichtung zur Erfassung von Partikeln in einer Rohrleitung und Rohrleitung |
JP2022540616A (ja) | 2019-07-12 | 2022-09-16 | シファメド・ホールディングス・エルエルシー | 血管内血液ポンプならびに製造および使用の方法 |
US11654275B2 (en) | 2019-07-22 | 2023-05-23 | Shifamed Holdings, Llc | Intravascular blood pumps with struts and methods of use and manufacture |
US11724089B2 (en) | 2019-09-25 | 2023-08-15 | Shifamed Holdings, Llc | Intravascular blood pump systems and methods of use and control thereof |
US11846578B2 (en) * | 2020-09-28 | 2023-12-19 | Lighthouse Worldwide Solutions | Apparatus and method for characterization of particles |
EP4226142A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-08-16 | Becton, Dickinson and Company | Methods for flow cytometry panel design based on modeling and minimizing spillover spreading, and systems for practicing the same |
DE102021134368B4 (de) | 2021-12-22 | 2023-09-21 | Hochschule Reutlingen Körperschaft des öffentlichen Rechts | Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von markierten Tumorzellen eines Gewebes in einer strömenden Flüssigkeit |
WO2023146658A1 (en) * | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Becton, Dickinson And Company | Methods and systems for identifying a fluorochrome panel |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3770349A (en) * | 1969-03-17 | 1973-11-06 | Sanchez G Legorreta | Method and apparatus for automatically classifying complex, microscopic particles such as human cells |
US3586859A (en) * | 1970-02-16 | 1971-06-22 | Irwin J Katz | Fluorescent cell viability counter |
US4054151A (en) * | 1974-05-20 | 1977-10-18 | Buchler Instruments, Division Of Searle Diagnostics Inc. | Concentrating vortex shaker |
NL180704C (nl) * | 1976-06-14 | Coulter Electronics | Inrichting voor gelijktijdige optische meting van kenmerken van zich in een suspensie bevindende deeltjes. | |
US4463708A (en) * | 1980-05-27 | 1984-08-07 | Gerry Martin E | Fuel and water homogenizer |
DE3220879A1 (de) * | 1982-06-03 | 1983-12-08 | Gebr. Liebisch, 4800 Bielefeld | Reagenzglasschuettler zum mischen und aufwirbeln von analysenfluessigkeiten |
US4599307A (en) * | 1983-07-18 | 1986-07-08 | Becton, Dickinson And Company | Method for elimination of selected cell populations in analytic cytology |
US4751179A (en) * | 1984-05-31 | 1988-06-14 | Coulter Electronics, Inc. | Method and reagents for differential determination of four populations of leukocytes in blood |
JPS61153546A (ja) * | 1984-12-26 | 1986-07-12 | Canon Inc | 粒子解析装置 |
US4690561A (en) * | 1985-01-18 | 1987-09-01 | Canon Kabushiki Kaisha | Particle analyzing apparatus |
US4989977A (en) * | 1985-07-29 | 1991-02-05 | Becton, Dickinson And Company | Flow cytometry apparatus with improved light beam adjustment |
US5238812A (en) * | 1987-03-13 | 1993-08-24 | Coulter Corporation | Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions |
DE3885021T2 (de) * | 1987-07-14 | 1994-05-19 | Kyoto Daiichi Kagaku Kyoto Kk | Automatische Messmethode für Glycohämoglobin. |
JPH01132932A (ja) * | 1987-11-18 | 1989-05-25 | Omron Tateisi Electron Co | 流れ式粒子分析装置の信号光検出光学系 |
JP2674705B2 (ja) * | 1988-06-10 | 1997-11-12 | 東亜医用電子株式会社 | 一次元分布分画方法 |
US4848917A (en) * | 1988-08-26 | 1989-07-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Automatic vortex mixer |
JPH0663945B2 (ja) * | 1988-08-26 | 1994-08-22 | 株式会社日立製作所 | 攪拌装置 |
JPH0718785B2 (ja) * | 1988-09-19 | 1995-03-06 | 株式会社日立製作所 | フローセル装置 |
BE1002614A6 (nl) * | 1988-11-24 | 1991-04-09 | Labotics Bv Met Beperkte Aansp | Werkwijze en inrichting voor het verdunnen van samenstellingen. |
JPH0738839Y2 (ja) * | 1990-05-15 | 1995-09-06 | オムロン株式会社 | 流れ式粒子分析装置 |
US5204884A (en) * | 1991-03-18 | 1993-04-20 | University Of Rochester | System for high-speed measurement and sorting of particles |
JP3213334B2 (ja) * | 1991-05-14 | 2001-10-02 | シスメックス株式会社 | 尿中の細胞分析装置 |
JP3048260B2 (ja) * | 1991-07-29 | 2000-06-05 | シスメックス株式会社 | 白血球分類計数用試料調製方法 |
US5360739A (en) * | 1991-12-05 | 1994-11-01 | Miles Inc. | Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood |
JP3232145B2 (ja) * | 1991-12-27 | 2001-11-26 | シスメックス株式会社 | 網赤血球測定方法 |
EP0626067A4 (en) * | 1992-02-07 | 1997-06-25 | Abbott Lab | METHOD FOR ACCURATELY COUNTING AND SENSITIVELY CLASSIFYING HETEROGENEOUS CELL POPULATIONS UNDER CYTOLYTIC PROCESSING CONDITIONS. |
JPH05340866A (ja) * | 1992-06-05 | 1993-12-24 | Anelva Corp | 塵粒子検出器 |
JPH0697241A (ja) * | 1992-09-09 | 1994-04-08 | Tokyo Electron Yamanashi Kk | プローブ装置 |
US5589394A (en) | 1994-08-01 | 1996-12-31 | Abbott Laboratories | Cell suspension preparation apparatus and method |
-
1995
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-
1997
- 1997-05-02 JP JP9114923A patent/JP2863511B2/ja not_active Expired - Fee Related
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