DE69533036T2

DE69533036T2 - Adenovirus e1a polypeptid kodierende nukleinsäure zur sensibilisierung von tumorzellen für chemotherapie oder radiotherapie

Info

Publication number: DE69533036T2
Application number: DE69533036T
Authority: DE
Inventors: Steven M. Frisch
Original assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; La Jolla Cancer Research Foundation
Current assignee: JOLLA CANCER RES FOUNDATION LA; La Jolla Cancer Research Foundation
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2015-09-06
Also published as: EP0781092B1; DK0781092T3; AU693604B2; DE69533036D1; US5776743A; ES2216018T3; WO1996007322A1; US6100243A; EP0781092A1; AU3627895A; PT781092E; US6544955B1; CA2199265A1; ATE266425T1; JP2000510435A; EP0781092A4

Description

Die Erfindung wurde mit teilweiser Unterstützung aus dem "National Institutes of Health Grant" R29GM44573-05 gemacht. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann bestimmte Rechte an der Erfindung haben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Molekularbiologie und genauer die Wirkung von Adenovirus-E1A auf Tumorzellen.
HINTERGRUNDINFORMATIONEN
Sowohl Bestrahlung als auch Chemotherapie haben signifikant zur Behandlung von Krebs beigetragen. Jedoch gibt es nach wie vor Hindernisse für eine erfolgreiche Therapie durch jede der beiden Behandlungsformen. Beispielsweise sprechen einige Tumorarten weder auf Bestrahlung noch auf Chemotherapie an. In anderen Fällen können ursprünglich ansprechende maligne Zellen einen Relaps erfahren und gegenüber der Behandlung resistent werden.
Es gibt Beweise dafür, dass die Expression von bestimmten Proteinen, wie verschiedenen Onkogenen, die Empfindlichkeit von Zellen hinsichtlich Apoptose, welche auch als programmierter Zelltod bekannt ist, erhöhen kann. Ferner gibt es Beweise dafür, dass einige von diesen Proteinen auch Empfindlichkeit hinsichtlich Apoptose, welche durch Antikrebsmittel induziert wird, verleihen können. Es sind jedoch relativ wenig Untersuchungen vorgenommen worden, um diese Wirkungen an humanen Tumorzellen zu beobachten, und es gab keine Berichte über die Wirkung von Adenovirus-E1A auf die Empfindlichkeit von humanen Tumorzellen und die Antwort bzw. das Ansprechen von diesen E1A-exprimierenden Zellen auf chemotherapeutische Agentien oder Bestrahlung.
Lowe, S. W., et al. (Cell, Band 74, 957–967, 1993) lehrt, dass die Expression des E1A-Gens Fibroblasten gegenüber einer Apopto se, welche durch ionisierende Bestrahlung, 5-Fluoruracil, Etoposid und Adriamycin induziert wird, sensitivieren kann, obwohl die Ausgangs-Fibroblasten gegen diese Agentien in großem Umfang resistent waren.
Frisch, S. M., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 88, 9077–9081, 1991, Cell Biology) lehrt, dass eine stabile Expression des Adenovirus-E1A-Gens bei drei humanen Tumorzelllinien Verankerungsunabhängige Vermehrung und tumorigenes Potential verringerte, eine Reorganisation des Zytoskeletts bewirkte, eine flache Morphologie induzierte und Kontakthemmung wiederherstellte. Frisch schließt daraus, dass E1A in jenem Kontext funktional von einem Tumorsuppressorgen ununterscheidbar zu sein scheint.
Angesichts der Unzulänglichkeiten der gegenwärtigen Chemotherapie und Bestrahlung, nämlich fehlende Antwort bzw. fehlendes Ansprechen auf und Resistenz oder Toleranz gegenüber chemotherapeutische(n) Agentien, gibt es einen Bedarf, zusätzliche Behandlungsformen zu entwickeln, die eine Antwort auf Chemotherapie oder Bestrahlung verstärken können.
Die Erfindung befriedigt diesen Bedarf und stellt ebenso damit in Verbindung stehende Vorteile bereit. Die Erfindung macht neue Verfahren zur Behandlung einer Tumorzelle und zur Verstärkung der Antwort eines Patienten auf Bestrahlung und Chemotherapie verfügbar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist auf die Verwendung einer für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments, welches in Kombination mit einem chemotherapeutischen Agens oder Bestrahlen zur Behandlung einer humanen Tumorzelle oder zur Behandlung von Krebs in einem humanen Patienten bestimmt ist, durch Einführen der Nukleinsäure in die und Expression des Polypeptids in der Tumorzelle, gefolgt von dem Kontaktieren der Tumorzelle mit einem chemotherapeutischen Agens oder dem Bestrahlen der Zelle, gerichtet.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung einer für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung einer Antwort auf Chemotherapie oder Bestrahlung bei einem humanen Patienten oder zum Sensitivieren einer humanen Tumorzelle gegenüber einem chemotherapeutischen Agens oder gegenüber Bestrahlung durch Einführen der Nukleinsäure in die und Expression des Polypeptids in den Tumorzellen des Patienten, gefolgt von dem Kontaktieren des Patienten mit einem chemotherapeutischen Agens oder von dem Bestrahlen des Patienten, bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt Etoposid-Zytotoxizitäts-Dosis-Wirkungs-Kurven von verschiedenen Tumorzelllinien oder E1A-exprimierenden Abkömmlingen davon, einschließlich HT 1080-Fibrosarkom (FS), A2058 Melanom (ML), SaoS-2-Osteosarkom (OS) und nicht-kleinzelliges NCI-H23-Lungenkarzinom (LC).
2 liefert zusätzliche Beweise für die Wirkung von E1A-exprimierenden humanen A2058-Melanomzellen gegenüber Etoposid. Vergleiche wurden durch Agarosegelelektrophorese von aus A2058-Melanomzellen extrahierter DNA in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von E1A und in Abwesenheit (–) oder Anwesenheit (+) von Etoposid vorgenommen.
3 liefert einen Beweis für eine stabile Transfektion und Expression von E1A in verschiedenen Tumorzellen durch Immunpräzipitation von E1A-Proteinen aus stabil transfizierten und Ausgangs-Zelllinien. Die E1A-Proteinspezies entsprechenden Banden sind in Klammern gesetzt.
4 zeigt die Struktur eines revers transformierenden E1A-Retrovirus-Konstrukts.
5 liefert die DNA-Sequenz von für E1A kodierenden Sequenzen (cDNA). Untere Zeile: Sequenz von 243 Aminosäuren. Obere Zeile: Sequenz von 289 Aminosäuren.
6 liefert einen Beweis für die E1A-Proteinexpression in abgeleiteten E1A+ HT1080-Fibrosarcom (FS)-Zellen verglichen mit der HT1080-Ausgangszelllinie (E1A–).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Adenovirus ist ein großes DNA-Virus, dessen natürlicher Wirt humane Zellen sind. Praktisch jeder Erwachsene ist zu irgendeinem Zeitpunkt mit Adenovirus infiziert worden, wobei die Hauptauswirkungen erkältungsähnliche Symptome sind. Adenovirus wird aufgrund seiner onkogenen Wirkung bei Nagetieren als "DNA-Tumorvirus" bezeichnet. Die Expression des Adenovirusgenoms erfolgt in zwei Stufen. Zuerst werden die frühen Genprodukte, für die die E1A- und die E1B-Gene kodieren, exprimiert. Diese Produkte sind für die Expression der späten Genprodukte erforderlich. Späte Genprodukte kodieren Proteine, welche für die Replikation erforderlich sind, wie auch die viralen Strukturproteine.
Die durch das E1A-Gen von Adenovirus kodierten Proteine sind primär aus zwei Gesichtspunkten untersucht worden. Zuerst sind sowohl die 243 Aminosäuren-Form als auch die 289 Aminosäuren-Form von E1A (welche aus einem alternativen Spleißen der Vorläufer-RNA resultieren, so dass das 243 Aminosäuren-Protein eine Teilmenge des 289 Aminosäuren-Proteins ist) transkriptionsregulatorische Proteine, J. Flint, T. Shenk, Ann. Rev. Gen., 23: 141–161 (1989). Zweitens vereinfachen diese Proteine die onkogene Transformation von bestimmten Nagetierzellen durch andere Onkogene, H. E. Ruley, Nature, 304: 602–606 (1983) und als solches wird E1A allgemein als ein Onkogen eingestuft.
Es gibt Beweise dafür, dass die Expression von Onkogenen die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Apoptose, welche auch als programmierter Zelltod bekannt ist, erhöhen kann. Lowe et al., Cell, 74: 957–967 (1993). Das E1A-Gen kann beispielsweise die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber einer Apoptose bei primären Nagetierzellen erhöhen. Roa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7742–7746 (1992). Andere Onkogene, wie c-myc, können die Empfindlichkeit von Zellen gegenüber dem programmierten Zelltod ebenfalls erhöhen, Evan et al., Cell, 69: 119–128 (1992), und eine Überexpression von c-myc kann auch Empfindlichkeit gegenüber einer Apoptose, die durch Antikrebsmittel, wie Tumornekrosefaktor α, Chen et al., Nature, 330: 581–583 (1987), oder Etoposid, Fanidi et al., Nature, 359: 554–556 (1992) und Lowe et al., a. a. O., induziert wird, verleihen. Zusätzlich erforschen Lowe et al., a. a. O., die Wirkungen von p53 in Kombination mit E1A auf die Empfindlichkeit von Mäuseembryo-Fibroblasten (MEFs) gegenüber chemotherapeutischen Arzneimitteln.
Interessanterweise und im Gegensatz zu den onkogenen und apoptotischen Wirkungen von E1A bei Nagetierzellen wirkt E1A im humanen Kontext als Tumorsuppressorgen. Steven M. Frisch, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 9077–9081 (1991), welche unter Bezugnahme in diese Unterlagen aufgenommen wird, liefert einen Beweis für die antionkogene Wirkung von Adenovirus-E1A bei humanen Tumorzellen. Noch wichtiger, ist es überraschend und unerwartet, dass E1A menschliche Tumorzellen sensitiviert und die Antwort von Tumorzellen auf Chemotherapie und Bestrahlungsbehandlung verstärkt. Die Wirkung ist von p53 unabhängig.
Diese unerwarteten Beobachtungen liefern die Grundlage für diese Erfindung, die Verfahren zur Sensitivierung einer humanen Tumorzelle mit Adenovirus-E1A verfügbar macht. Die Verfahren umfassen, eine humane Tumorzelle zu behandeln, indem zuerst in die Tumorzelle Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit Adenovirus-E1A-Aktivität kodiert, eingeführt wird, das Polypeptid mit E1A-Aktivität in der Zelle exprimiert wird und dann entweder die E1A-exprimierende Tumorzelle mit einem chemotherapeutischen Agens kontaktiert wird oder die E1A-exprimierende Tumorzelle bestrahlt wird. Die Verfahren können in vitro oder in vivo praktisch ausgeführt werden.
Diese Erfindung macht auch Verfahren zur Verbesserung der Antwort eines Patienten auf Chemotherapie oder Bestrahlung verfügbar, indem in Tumorzellen eines Patienten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit Adenovirus-E1A-Aktivität kodiert, eingeführt wird, das Polypeptid mit E1A-Aktivität in den Zellen exprimiert wird und schließlich entweder ein chemotherapeutisches Agens oder Bestrahlung verabreicht wird.
Die Erfindung macht auch Verfahren zur Behandlung von Krebs, welcher für eine Behandlung empfänglich ist, verfügbar, indem in Tumorzellen eines Patienten Nukleinsäure, die für ein Polypeptid mit Adenovirus-E1A-Aktivität kodiert, eingeführt wird, das Polypeptid in den Tumorzellen exprimiert wird und schließlich entweder die Tumorzellen mit einem chemotherapeutischen Agens in Kontakt gebracht werden oder die Tumorzellen bestrahlt werden. Dementsprechend kann ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodiert, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verbesserung der Antwort eines Patienten auf Chemotherapie oder Bestrahlung und zur Behandlung von Krebs nützlich sein.
Die Behandlung von humanen Tumorzellen mit E1A sensitiviert die Zellen. Die Sensitivierung führt zu einer Verstärkung der Empfindlichkeit einer Tumorzelle, auf chemotherapeutische Agentien oder Bestrahlung anzusprechen. Wie in den nachfolgenden Beispielen nachgewiesen wird, sensitivieren Zellen, die durch die vorliegenden Verfahren E1A exprimieren, humane Tumorzellen leichter und machen sie empfänglicher gegenüber einer Abtötung durch Chemotherapie oder Bestrahlung verglichen mit Zellen, denen E1A fehlt. Es versteht sich selbstverständlich, dass chemotherapeutische Agentien oder Bestrahlung Tumorzellen auf verschiedenartige Weisen beeinflussen können, einschließlich Abtötung oder verringerte Lebensfähigkeit, beispielsweise durch Apoptose oder andere Mechanismen, Vergiftung, Inaktivierung des Tumors und dergleichen. Unabhängig von den Mechanismen, durch die die toxischen Agentien (chemotherapeutische Agentien oder Bestrahlung) wirken, wird erwartet, dass eine E1A-Expression die Zellen sensitiviert und deren Antwort auf Chemotherapie oder Bestrahlung verbessert. Obwohl wir nicht auf irgendeine Theorie oder irgendeinen Mechanismus festgelegt werden wollen, wird postuliert, dass die vorliegende Erfindung möglicherweise aufgrund der Fähigkeit von E1A, humane Tumorzellen revers zu transformieren und diese in Epithelzellen umzuwandeln, funktioniert. Eine reverse Transformation durch E1A verleiht Empfindlichkeit gegenüber Anoikis (einer Art von programmiertem Zelltod). Frisch und Francis, J. Cell Biology, 124: 619–626 (Feb. 1994).
Man kann leicht auf eine Sensitivierung durch in diesem Fachgebiet wohlbekannte und leicht verfügbare Assays testen, wie beispielsweise durch einen Dosis-Wirkungs-Assay, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu bestimmen, oder durch Agarosegelelektrophorese von DNA-Extraktionen, um DNA-Fragmentierung, ein Charakteristikum für Zelltod, zu bestimmen. Diese beiden Assays werden in den nachfolgenden Beispielen detaillierter beschrieben. Andere Assays, wie ein Chromatin-Assay, der in diesem Fachgebiet wohlbekannt ist, oder Arzneimittelresistenz-Assays (wie beispielsweise in Lowe et al., Cell, 74: 957–967 (1993), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben), können ebenfalls verwendet werden, um die Wirkung von E1A auf die Empfindlichkeit von Tumorzellen und deren Antwort auf E1A und chemotherapeutische Agentien oder Bestrahlung zu bestimmen.
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Nukleinsäure" DNA, einschließlich cDNA, oder RNA. Isolierte Nukleinsäuren, die im Rahmen dieser Erfindung nützlich sind, sind jene, die für ein Polypeptid kodieren, welches zu einem durch die E1A-Region des Adenovirus-Genoms kodierten Polypeptid funktional äquivalent ist. Unter einem Aspekt dieser Erfindung ist die isolierte Nukleinsäure die Adenovirus-E1A-Region. Diese Region wird durch die Fachleute auf diesem Gebiet so definiert, dass sie sich von Nukleotid 560 bis Nukleotid 1542 erstreckt. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von E1A wird in 5 angegeben.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff "Einführen" in Bezug auf Nukleinsäure ein jegliches Verfahren zum Insertieren oder Einschleusen eines exogenen Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle und umfasst Transduktion, Transfektion, Mikroinjektion und virale Infektion von Wirtszellen, ist aber nicht auf diese beschränkt. Verfahren zum Ausführen dieser Prozeduren sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt. Die Nukleinsäure kann beispielsweise eingeführt werden, indem die Zelle mit einem Adenovirus-Vektor oder einem retroviralen Vektor kontaktiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure in die Zelle eingeführt, indem eine Zelle mit einem retroviralen Vektor, welcher die Nukleinsäure enthält, unter solchen Bedingungen kontaktiert wird, dass die Nukleinsäure in die Zelle inseriert oder eingeschleust wird. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung ist das Virus ein Replikations-inkompetentes Retrovirus. Ein Replikations-inkompetentes Retrovirus ist als ein Virus definiert, welches nicht die Fähigkeit hat, virale Proteine zu produzieren, was die Verbreitung des Vektors in den infizierten Wirtszellen ausschließt. Beispiele von solchen Vektoren, die für die praktische Ausführung dieser Erfindung nützlich sind, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und für diese leicht verfügbar.
Das E1A-Genprodukt hat die Fähigkeit, nachdem es in einer humanen Tumorzelle exprimiert worden ist, die Tumorzelle zu sensitivieren und die Antwort der Zelle auf ein chemotherapeutisches Agens oder Bestrahlung zu verbessern. Eine solche Fähigkeit wird hier als "E1A-Aktivität" bezeichnet. Ein "Polypeptid mit E1A-Aktivität" wird in seinem breitesten Sinne verwendet, so dass die Struktur von nativem Adenovirus-E1A, dessen funktionale Untereinheiten und Fragmente und Modifikationen der nativen Sequenz, die nach wie vor E1A-Aktivität aufweisen, mit umfasst werden. Unter einem Aspekt der Erfindung ist diese Aminosäuresequenz das 243 Aminosäuren-Polypeptidprodukt des Adenovirus-E1A-Gens, wie in 5 angegeben. Funktionale Äquivalente des 243 Aminosäuren-Polypeptids sind Polypeptide, die humane Tumorzellen ebenfalls sensitivieren und deren Empfindlichkeit gegenüber einer Behandlung durch chemotherapeutische Agentien oder Bestrahlung erhöhen können. Zellen, die ein Polypeptid mit E1A-Aktivität exprimieren, werden hier wiederholt als "E1A-exprimierende" Zellen bezeichnet. Die Aktivität eines E1A-Polypeptids kann routinemäßig durch einen beliebigen der Tests auf Empfindlichkeit gegenüber und/oder Antwort auf eine(r) Krebsbehandlung, wie weiter oben und weiter unten beschrieben, bestimmt werden.
Die Erfindung macht allgemein ein Verfahren zur Sensitivierung einer humanen Tumorzelle verfügbar, welches auf der Wirkung von E1A und der Antwort von E1A-exprimierenden Zellen auf ein toxisches Agens, d. h. ein chemotherapeutisches Agens oder Bestrahlung, basiert. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "chemotherapeutisches Agens" ein jegliches chemisches Agens oder Medikament, welches bei einer Chemotherapie-Behandlung, die selektiv Tumorzellen angreift, verwendet wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf solche Agentien wie Adriamycin, Amsacrin, Etoposid, Actinomycin D, VP 16, Camptothecin, Colchicin, Taxol, Cisplatin, Vincristin, Vinblastin, Methotrexat. Andere derartige Agentien sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt. Wie oben beschrieben, sind die von dieser Erfindung umfassten Agentien nicht darauf beschränkt, dass sie durch irgend einen Mechanismus wirken, und können beispielsweise durch direktes Vergiften, Apoptose oder andere Mechanismen von Zelltod oder -abtötung, Tumorinaktivierung oder andere bekannte oder unbekannte Mechanismen wirksam sein. Die Mittel oder Maßnahmen zum Kontaktieren von Tumorzellen mit diesen Agentien und zur Verabreichung eines chemotherapeutischen Agens an einen Patienten sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und für diese leicht verfügbar.
Wie hier verwendet, soll der Ausdruck "Bestrahlung" oder "Bestrahlen" in seinem breitesten Sinne eine jegliche Behandlung einer Tumorzelle oder eines Patienten durch Photonen, Elektronen, Neutronen oder andere ionisierende Strahlungen umfassen. Diese Strahlungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Röntgenstrahlung, Gammastrahlung oder schwere Ionenteilchen, wie α- oder α-Teilchen. Darüber hinaus kann die Bestrahlung radioaktiv sein, wie sie bei der Krebsbehandlung üblicherweise verwendet wird, und kann interstitielle Bestrahlung umfassen. Die Mittel oder Maßnahmen zum Bestrahlen von Tumorzellen und einem Patienten sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt und für diese leicht verfügbar.
Die hier beschriebenen Verwendungen können nützlich sein zum Sensitivieren von Krebs einer Anzahl von Arten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Brustkrebs, Sarkomen und anderen Neoplasmen, Blasenkrebs, Kolonkrebs, Lungenkrebs, verschiedenen Leukämien und Lymphomen. Die Tumorzellen der Erfindung stammen aus humanen Tumoren oder bösartigen Geschwulsten. Unter einem Aspekt dieser Erfindung exprimieren humane Tumorzellen kein funktionales p53. Humane Tumorzellen, die kein funktionales p53 exprimieren, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf HT1080-Fibrosarkom, Saos2-Osteosarkom, nicht-kleinzelliges NCI-H23-Lungenkarzinom und RD-Rhabdomyosarkom. Beweise dafür, dass diese Zelltypen kein funktionales p53 exprimieren, können, wie folgt, gefunden werden: HT1080: Anderson et al., Genes, Chromosomes & Cancer, 9: 266–281 (1994), welche in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird; Saos-2: Subler und Martin, J. of Virology, 68: 103–110 (1994), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird; RD: Felix et al., Cancer Research, 52: 2243–2247 (1992), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird; und NCI-H23: Takahashi et al., Cancer Research, 52: 2340–2343 (1992), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird. Man würde erwarten, dass eine jegliche andere humane Tumorzelle und insbesondere diejenigen, die kein funktionales p53 exprimieren, durch E1A sensitiviert werden würde und die Antwort der Zellen auf chemotherapeutische Medikamente oder Bestrahlung verbessern würde.
Der Ausdruck "funktionales p53" bedeutet eine jegliche Struktur, die im wesentlichen dem nativen p53-Protein entspricht und welche die Funktion von nativem p53, welche allgemein als Tumorsuppression bekannt ist, hat. Dementsprechend würden Mutationen in p53, welche zu einem Fehlen von p53-Aktivität oder -Funktion führen, von "funktionalem p53" nicht umfasst werden. Man kann durch routinemäßige und wohlbekannte Vorgehensweisen leicht bestimmen, ob eine Zelle überhaupt p53 exprimiert oder nicht. Darüber hinaus kann man durch die gleichen oder ähnliche bekannte Vorgehensweisen leicht bestimmen, ob eine Zelle p53 exprimiert, sei es ein funktionales p53 oder eine mutierte, nicht-funktionale Version von p53.
Ein mutmaßlicher Hinweis auf das Vorhandensein von mutiertem, nicht-funktionalem p53 kann beispielsweise durch Western blot-Analyse unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers PAb1801 (Oncogene Science; New York) erhalten werden. Ein solcher Assay zieht Nutzen aus der Tatsache, dass mutierte Formen von p53 stabiler sind als (funktionales) Wildtyp-p53 und sich dementsprechend zu viel höheren Proteinkonzentrationen anhäufen als Wildtyp-p53. Ausgangs-Zelllinien, wie HT1080-Zellen, können als eine Positivkontrolle verwendet werden und es können beispielsweise FM 0097-Zellen als eine Negativkontrolle verwendet werden. Diese Materialien und Methoden werden in Anderson et al., a. a. O., wel che in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Die Anwesenheit von Wildtyp- oder nicht-funktionalen mutierten Formen von p53 kann bestätigt werden, indem ein p53-cDNA-Klon aus der ausgewählten Zelllinie hergestellt wird, gefolgt von der Bestimmung von dessen primärer DNA-Sequenz unter Verwendung von Standardverfahren, welche in diesem Gebiet wohlbekannt und verfügbar sind.
Die Erfindung macht auch Verfahren zum Verbessern der Antwort eines Patienten auf Chemotherapie oder Bestrahlung verfügbar, indem in Tumorzellen eines Patienten Nukleinsäure, welche für ein Polypeptid mit Adenovirus-E1A-Aktivität kodiert, eingeführt wird, das Polypeptid mit E1A-Aktivität in den Zellen exprimiert wird und schließlich entweder ein chemotherapeutisches Agens oder Bestrahlung verabreicht wird.
Zur Verbesserung der Antwort eines Patienten auf Chemotherapie oder Bestrahlung kann eine Population von Tumorzellen durch verschiedene Vorgehensweisen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, isoliert werden. Die Isolierung erfolgt am üblichsten chirurgisch durch eine Biopsie. Nach Einführung und Expression von E1A in die bzw. den Zellen wird die neue Population von E1A-exprimierenden Zellen dann zurück in den Patienten transferiert, im allgemeinen durch Reinjektion oder andere Maßnahmen, die in diesem Fachgebiet wohlbekannt sind. Danach können Tumorregression und/oder -progression durch Standardmethodiken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, überwacht werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.
BEISPIEL I
HERSTELLUNG VON STABILEN ZELLLINIEN, WELCHE E1A EXPRIMIEREN
Es wurden stabile E1A-exprimierende Zelllinien ausgehend von HT1080-Fibrosarkomzellen und A2058-Melanomzellen unter Verwendung des Plasmids p1Aneo konstruiert, wie in Frisch et al., Oncogene, 5: 75–83 (1990), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, Franza et al., Cell, 44: 408–418 (1988), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, und Maruyama et al., Oncogene, 1: 361–367 (1987), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Als HT1080neo^r und A2058neo^r bezeichnete Zellen resultierten aus einer Transfektion mit Bluescript-Plasmid (Stratagene, La Jolla, CA), welches das aph-Gen (welches Resistenz gegen G418 kodiert) unterstützt durch den frühen Enhancer des Simian-Virus 40 enthielt.
Die Expression des E1A-Gens wurde auf der RNA-Ebene durch Northern Blot-Analyse dokumentiert, ebenfalls wie in Frisch et al., a. a. O., beschrieben. Die Proteinexpression wurde des weiteren durch Immunpräzipitation mit E1A-spezifischen monoklonalen Antikörpern, wie folgt, dokumentiert. Konfluente Kulturen von Zelllinien (welche 2 × 10⁶ Zellen enthielten) wurden 5 h in 35 mm-Vertiefungen mit 0,4 mCi (1 Ci = 37 GBq) [³⁵S]-Methionin (Tran³⁵S-label, ICN) in Methionin-freiem "Dulbecco's modified Eagle's"-Medium, welches 5% (vol./Vol.) dialysiertes fötales Kälberserum enthielt, markiert. Die Zellen wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 1,0 ml RIPA-1- [50 mM Tris-HCl, pH 7,5/0,1% Nonidet P-40/250 mM NaCl/Aprotinin (10 μg/ml) Leupeptin (5 μg/ml) 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid/5 mM EDTA/Sojabohnen-Trypsininhibitor (10 μg/ml)] abgeschabt. Nach Zugabe von Rinderserumalbumin bis zu einer Konzentration von 0,5 mg/ml wurden die Lysate mit 100 μl einer 50%-igen (Gew./Vol.) Protein A-Sepharose (Pharmacia; Indianapolis, IN)-Aufschlämmung (hergestellt in RIPA-1, welches Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 0,5 mg/ml enthielt) durch Mischen bei 4°C für 30 min und Zentrifugieren für 10 min bei 14000 Upm in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge vorabsorbiert und 0,5 ml-Proben wurden dann mit 1,5 μg monoklonalem anti-E1A-Antikörper M73 (Narlow et al., J. Virol., 3: 533–546 (1985)) oder Kontroll-Antikörper [anti-fos Ab-1 (Oncogene Sciences, Mineola, NY)] 2 h bei 0°C inkubiert. Dann wurden 25 μl 50%-ige Protein A-Sepharose-Aufschlämmung zugesetzt und die Röhrchen wurden 20 min bei 4°C gemischt, gefolgt von einer zweiminütigen Zentrifugation und fünfmaligem Waschen mit 0,5 ml RIPA-1. Die Pellets wurden dann in 60 μl Probenpuffer resuspendiert und mittels SDS/PAGE analysiert. E1A-Protein wurde auf dem Gel detektiert, wie in 3 nachgewiesen, welche die [³⁵S]Methioninmarkierten Proteine aus E1A-exprimierenden Klonen, abgeleitet von HT1080-Zellen (Bahnen 1–5), HeLa-Zellen (Bahnen 6–8) und A2058-Zellen (Bahnen 9–11), immunpräzipitiert mit anti-E1A-Antikörpern (E) oder Kontroll-Antikörpern (C) zeigt. Bahnen: 1–5, HT1080, p2AHT2a, p1-Aneo3, p1Aneo15 bzw. p1Aneol6: 6–7, HeLa, Medg18 bzw. Medg28: 9–11, A2058, 1A58c8-1 bzw. 1A58c11-1. Die Banden, welche E1A-Proteinspezies entsprechen, sind in Klammern gesetzt.
Zusätzlich wurde die Konstruktion von viralen E1A-Expressionsvektoren durch Subklonieren von cDNAs, welche die 243 Aminosäuren- oder 289 Aminosäuren-E1A-Proteine von Adenovirus Typ 5 kodierten, in den retroviralen Vektoren: LNCX, LNSX, erzielt. Die 243 Aminosäuren-Form von E1A (12S-cDNA) wurde an der Adenovirus-Kartenposition 610 mit BstX1 geschnitten und das 5'-Ende wurde mit einem doppelsträngigen Oligonukleotid umkonstruiert, wodurch alle 5'-nichtkodierenden Sequenzen von E1A entfernt wurden. Das HindIII-Ende dieses Oligonukleotids wurde mit stumpfen Enden versehen und das 3'-Ende von E1A wurde mit HpaI geschnitten (Kartenposition 1575), um die polyA-Additionsstelle zu entfernen. Die resultierende E1A-Sequenz wurde in den Retrovirusvektor LNSX (beschrieben in Miller und Rosman, Biotechniques, 7: 980–990 (1989), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird) subkloniert (das retrovirale Plasmidkonstrukt ist in 4 schematisch gezeigt).
Die ökotrope Verpackungszelllinie gpE86 (aufrechterhalten in Hygromycin/Mycophenolsäure-Selektionsmedium) wurde mit zehn μg von diesen Plasmid-DNAs transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden unselektierte Virus-Stammlösungen hergestellt, indem konditioniertes Medium gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und eingefroren wurde. Diese Virus-Stammlösungen wurden verwendet, um die amphotrope Verpackungszelllinie gpEam12 (Zellen erhältlich von der ATCC) in 35 mm-Vertiefungen durch Inkubation für 12 h in DME/10% fötales Kälberserum-Medium, welches 4 μg/ml Polybren enthielt, zu infizieren. 24 h nach der Infektion wurden die Zellen in Verhältnissen zwischen 1 : 100–1 : 300 aufgeteilt und infizierte Zellen wurden in 500 μg/ml G418 3 Wochen selektiert. Virus-produzierende Zelllinien wurden in 35 mm-Vertiefungen vermehrt und für jede Linie wurde Virus enthaltendes konditionier tes Medium hergestellt. Virus-Stammlösungen wurden ausgehend von Produzenten-Zelllinien, welche entweder E1A mit 243 Aminosäuren oder E1A mit 289 Aminosäuren in den Vektoren LNCX und LNXS (welche die Transkription unter Verwendung der internen frühen Enhancer aus CMV bzw. SV40 fördern) enthielten, hergestellt.
Diese Stammlösungen wurden verwendet, um die humane Fibrosarkom-Linie HT1080 zu infizieren, indem 0,4 ml Virus-Stammlösung in einer 35 mm-Vertiefung mit HT1080-Zellen 8 h in Polybren enthaltendem Medium inkubiert wurde; infizierte Zellen wurden 24 h nach der Infektion in verschiedenen Verhältnissen aufgeteilt und es wurden entweder G418-resistente Klone oder gemischte Populationen von infizierten Zellen weiter analysiert. Diese Materialien und Methoden zum Infizieren von HT1080-Zellen mit retroviralen E1A-Vektoren werden auch in Frisch und Francis, J. Cell Biology, 124: 619–626 (1994), die in diese Unterlagen unter Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben. Die E1A-Proteinexpression wurde durch Western blot-Analyse bestätigt, wie in 6 gezeigt (HT1080-Fibrosarkom (FS)-Zellen, welche E1A exprimieren (E1A+), verglichen mit dem HT1080-Ausgangs-Subklon (E1A–)).
Andere Zelllinien wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung der oben beschriebenen, retrovirale Vektoren einsetzenden Infektionsmethoden dazu gebracht, E1A zu exprimieren, einschließlich Saos-2-Osteosarkom- und nicht-kleinzelliges NCI-H23-Lungenkarzinom-Zellen.
Abkürzungen für die Zelllinien, die nachfolgend und in den 1 und 6 verwendet werden, sind, wie folgt: FS: HT1080-Fibrosarkom (Subklon H4), ML: A2058-Melanom, OS: Saos-2-Osteosarkom, LC: nicht-kleinzelliges NCI-H23-Lungenkarzinom, RM: A204-Rhabdomyosarkom, RM2: RD-Rhabdomyosarkom, FB: Fibroblast.
BEISPIEL II
Dieses Beispiel demonstriert die Wirkungen von E1A hinsichtlich einer Sensitivierung gegenüber chemotherapeutischen Medikamenten in Bezug auf Etoposid. Es werden Etoposid-Zytotoxizitäts-Dosis-Wirkungs-Kurven von Tumorzellen und E1A-exprimierenden Abkömmlingen davon bereitgestellt.
Platten mit zwölf Vertiefungen wurden mit FS-, ML-, OS- und LC-Zellen und deren E1a-exprimierenden Gegenstücken inokuliert. Subkonfluente Einzelschichten wurden mit Etoposid in einer Konzentration von 0, 1, 2, 5 und 10 μM (1, 2, 5, 10 und 20 μM für LC-Zellen) 24 h behandelt. Lebensfähige Zellen wurden durch MTT-Assays quantifiziert. Diese wurden ausgeführt, wie von dem Hersteller (Sigma, St. Louis, Missouri) beschrieben. Kurz zusammengefasst, wurden die Zellen bei 37°C in Medium, welches MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) enthielt, 1 bis 3 h inkubiert. Die Farbstoffkristalle wurden dann mit 0,1 N HCl in Isopropanol solubilisiert. Die Lebensfähigkeit wurde durch Messen der Absorption bei 570 nm quantifiziert.
Wie in 1 gezeigt, verursachte E1A ein bemerkenswertes Ausmaß von Sensitivierung gegenüber einer Abtötung durch Etoposid; es wurden signifikant mehr E1A-exprimierende Tumorzellen durch Etoposid abgetötet als Ausgangszellen, denen E1A fehlt. Da zumindest FS-, OS- und LC-Zellen kein funktionales p53 exprimieren, Anderson et al., a. a. O., Subler und Martin, a. a. O., bzw. Takahashi et al., a. a. O., ist die beobachtete Wirkung einer verstärkten Sensitivierung von dem p53-Protein unabhängig.
BEISPIEL III
Dieses Beispiel demonstriert die Wirkung von E1A auf die Empfindlichkeit von humanen A2058-Melanomzellen und die Antwort der E1A-exprimierenden Zellen auf Etoposid weiter. Hier wird das Ausmaß der Sensitivierung gegenüber einer Abtötung durch dieses Medikament durch Gelelektrophorese von DNA-Extraktionen bestimmt.
Humane A2058-Melanom-Ausgangszellen, denen E1A fehlte (E1A–), und die davon abgeleitete E1A-exprimierende Zelllinie 1A58c8-1 (E1A+) wurden beide in 60 mm-Platten ausplattiert und bis zur Konfluenz vermehrt. Etoposid (Sigma, St. Louis, Missouri) wurde bis zu einer Endkonzentration von 25 μM zugesetzt und die Inkubation wurde weitere 24 h fortgesetzt. DNA mit niedrigem Molekulargewicht wurde mit 0,5% Triton X-100, 10 mM EDTA und 10 mM Tris, pH 7,4 (0,6 ml) extrahiert, dreimal mit Phenol-Chloroform extrahiert, mittels Ethanol präzipitiert und auf einem 1,5%-igen Agarosegel in TBE-Puffer analysiert.
Wie in 2 gezeigt, gibt es keinen DNA-Abbau, welcher einen Zelltod anzeigen würde, bei Zellen, denen E1A fehlte, sogar wenn Etoposid anwesend war (E1A–, Etoposid–; E1A–, Etoposid+). Und obwohl es Beweise für ein gewisses Ausmaß von DNA-Abbau und Abtötung mit E1A allein gibt (E1A+, Etoposid–), gibt es bei den Verfahren dieser Erfindung eine überraschende Zunahme des DNA-Abbaus und folglich der Antwort von humanen Melanomzellen auf Etoposid in Gegenwart von E1A (E1A+; Etoposid+). Dementsprechend wandelt E1A teilweise oder vollständig arzneimittelresistente Tumore, wie das A2058-Melanom, in Arzneimittel-empfindliche Tumore um.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf die offenbarten Ausführungsformen beschrieben worden ist, werden die Fachleute auf diesem Gebiet leicht erfassen, dass die detailliert dargelegten speziellen Beispiele die Erfindung lediglich veranschaulichen. Dementsprechend wird die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung einer für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer humanen Tumorzelle in Kombination mit einem chemotherapeutischen Agens oder Bestrahlung, durch Einführen der Nukleinsäure in die und Expression des Polypeptids in der Tumorzelle, gefolgt von dem Kontaktieren der Tumorzelle mit einem chemotherapeutischen Agens oder von dem Bestrahlen der Zelle.
Verwendung einer für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung einer Antwort auf Chemotherapie oder Bestrahlung bei einem humanen Patienten durch Einführen der Nukleinsäure in die und Expression des Polypeptids in den Tumorzellen des Patienten, gefolgt von dem Kontaktieren des Patienten mit einem chemotherapeutischen Agens oder von dem Bestrahlen des Patienten.
Verwendung einer für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zum Sensitivieren einer humanen Tumorzelle gegenüber einem chemotherapeutischen Agens oder gegenüber Bestrahlung.
Verwendung einer für ein Polypeptid mit E1A-Aktivität kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Krebs in einem humanen Patienten durch Einführen der Nukleinsäure in die und Expression des Polypeptids in den Tumorzellen des Patienten, gefolgt von dem Kontaktieren der Tumorzellen mit einem chemotherapeutischen Agens oder von dem Bestrahlen der Tumorzellen.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 4, bei der die Nukleinsäure für Adenovirus E1A Polypeptid kodiert.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 5 bei der die Nukleinsäure in der Form eines geeigneten retroviralen Vektors vorliegt, der die Nukleinsäuresequenz enthält, und bei der die Nukleinsäure in die Tumorzelle durch Kontaktieren der Zelle mit dem Vektor eingeführt wird.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 6, bei der das chemotherapeutische Agens aus der Gruppe bestehend aus Etoposid, Adriamycin, Amsacrin, Actinomycin D, VP16, Camptothecin, Colchicin, Taxol, Cisplatin, Vincristin, Vinblastin und Methotrexat ausgewählt ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 7, bei der die Nukleinsäure für das 243 Aminosäure-Polypeptidprodukt des Adenovirus E1A Genes, wie in 5 gezeigt, kodiert.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 3 und 5 bis 8, bei der die Tumorzelle eine Brustkrebs-, Sarkom-, Blasenkrebs-, Darmkrebs-, Lungenkrebs-, Leukämie-, Lymphom-, Fibrosarkom-, Osteosarkom-, nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom-, Rhabdomyosarkom- oder Melanomzelle ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 1, 3 und 5 bis 9, bei der die Tumorzelle kein funktionelles p53 exprimiert.
Die Verwendung nach den Ansprüchen 2 oder 4, bei der die Tumorzellen Brustkrebs-, Sarkom-, Blasenkrebs-, Darmkrebs-, Lungenkrebs-, Leukämie-, Lymphom-, Fibrosarkom-, Osteosarkom-, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom-, Rhabdomyosarkom- oder Melanomzellen sind.
Verwendung nach den Ansprüchen 2 oder 4, bei der die Tumorzellen kein funktionelles p53 exprimieren.