DE69513635T2

DE69513635T2 - Wässrige zubereitung mit verzögerter wirkstofffreigabe

Info

Publication number: DE69513635T2
Application number: DE69513635T
Authority: DE
Inventors: Michael J. Hageman; Margaret L. Possert
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co; Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1995-01-09
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2015-01-10
Also published as: ATE187077T1; DK0741579T3; DE69513635D1; LV12627B; CA2178610A1; JPH09508118A; KR100355517B1; EP0741579A1; AU699746B2; US20030092625A1; US6471977B1; LV12627A; US6699490B2; SI0741579T1; AU1521395A; EP0741579B1; ZA949350B; WO1995019787A1; NZ278770A; ES2139881T3

Description

Diese Erfindung betrifft für die verzögerte Freisetzung biologisch aktiver Proteine geeignete neue Zusammensetzungen. Insbesondere erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung einer höherwertigen wäßrigen injizierbaren Zubereitung von Rindersomatotropin mit verzögerter Freisetzung. Des weiteren werden Verfahren zur Verwendung dieser neuen Zusammensetzungen für die verzögerte oder verlängerte Freisetzung von Rindersomatotropin bereitgestellt.
Mit dem Aufkommen der Gentechnologie wurde die Verfügbarkeit vieler biologisch aktiver Peptide und Protein in großem Maßstab erreicht. Die Verabreichung dieser rekombinant erzeugten Peptide und Proteine ergibt jedoch eine ungewöhnliche Reihe von Problemen. In vielen Fällen erfordert die Aufrechterhaltung der biologischen Wirkung dieser Proteine eine Langzeitverabreichung. Da die tägliche Verabreichung dieser Mittel unbequem ist, ist eine verzögerte oder verlängerte Freisetzung bevorzugt.
Aus zahlreichen Gründen konzentrierte sich die einschlägige Technik langfristig auf die Verwendung biologisch kompatibler Öle als Vehikel, um die verzögerte Freisetzung vieler Arzneimittel, einschließlich von Proteinen und speziell Somatotropinen zu erreichen. Patente, die sich mit dieser Technologie befassen, sind die US-A-S 013 713 von Mitchell und die US-A-4 977 140 von Ferguson et al. Mitchell berichtet, daß eine verlängerte parenterale Freisetzung von Rindersomatotropin (bSt; BGH) mit erwünscht wirksamen Konzentrationen erreicht werden kann, indem im wesentlichen nicht-wäßrige Zusammensetzungen, die mindestens etwa 10 Gew.-% eines biologisch aktiven Somatotropins und als kon tinuierliche Phase der Zusammensetzung ein biologisch kompatibles Öl, wie Maiskeimöl, umfassen, verwendet werden. Ferguson et al. berichten, daß die Injektion einer Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, die bSt, Wachs und ein Öl umfaßt, die tägliche Milchproduktion in einer Kuh während eines erweiterten Zeitraums erhöht.
Die genannten Patente erläutern die Betonung der einschlägigen Technik bezüglich der Verwendung nicht-wäßriger Zufuhrsysteme für die verlängerte Abgabe Freisetzung von Somatotropinen. In der einschlägigen Technik fehlt deutlich die Verwendung einer wäßrigen Zubereitung, um die verzögerte Freisetzung von bSt zu erreichen. Einer der Gründe, weshalb die einschlägige Technik die Verwendung wäßriger Systeme zur verzögerten Abgabe von Proteinen, insbesondere Somatotropinen, vermieden hat, ist die allgemeine Ansicht, daß Proteine hoch instabil sind, wenn sie über lange Zeiträume hinweg wäßrigen Umgebungen ausgesetzt werden. (Pitt, Int. J. Pharmaceutics 59: 173-196 (1990)). Man ist auch allgemein der Meinung, daß man eine verlängerte Freisetzung von Proteinen oder Peptiden unter Verwendung einer wäßrigen Zubereitung ohne Anstrengungen zur Änderung der Löslichkeit des Moleküls oder Änderung der Absorption des Moleküls durch beispielsweise Absorptionsmodifizierungsmittel und Viskositätsinduktionsmittel nicht erreichen könnte. Mitchell berichtet, daß selbst bei Verwendung von Ölen zur Modifizierung der Freisetzung des Proteins in den Blutstrom eines Tiers dem Zufuhrsystem für biologisch aktive Proteine häufig Antihydratationsmittel zugesetzt werden oder das Protein mit Metallen oder Metallverbindungen komplexiert wird. Die Verwendung dieser Absorptionsmodifizierungsmittel ändert jedoch die Proteinlöslichkeit oder induziert Viskosität und kann die bequeme Injizierbarkeit einer Zusammensetzung verringern und/oder zu einer deutlichen Gewebereizung an der Injektionsstelle führen.
Es ist zwar schwierig, die Herkunft der Voreingenommenheit der einschlägigen Technik gegenüber der Verwendung wäßriger Zubereitungen zum Erzielen der verlängerten Freisetzung von Proteinen, wie bSt, zu bestimmen, doch kann diese auf von J. B. Hutton durchgeführten Untersuchungen (J. Endocrin. (1957) 16, 115-125) beruhen. In seiner Forschungsarbeit untersuchte Hutton die Wirkung subkutaner Injektionen abgestufter Dosen (6,25, 12,5 25,0, 50,0, 100,0 und 200,0 mg) von in 5 ml Kochsalzlösung gelöstem Rinderwachstumshormon (bSt) (Konzentrationen von 1,25, 2,5, 5, 10, 20 bzw. 40 mg/ml) auf die Ausbeute und Zusammensetzung von Kuhmilch. Der primäre Parameter, der von Hutton untersucht wurde, war eine Zunahme der Milchausbeute. Hutton berichtete, daß die mittlere Milchausbeute über eine Zeitspanne von 4 Tagen durch die verabreichte Dosis von bSt beeinflußt war. Hutton gab jedoch keine Daten an, daß die höhere Milchausbeute über den gesamten Zeitraum von 4 Tagen aufrechterhalten wurde. Hutton erklärte, daß eine einzige 50-mg(10 mg/ml)- bSt-Injektion 4 Tage lang eine erhöhte Milchausbeute liefern würde. Hutton bestätigte jedoch, daß diese Behauptung auf Berechnungen beruhte, die bestimmte Annahmen erforderten. Die Natur dieser Annahmen war nicht offenbart noch wurden irgendwelche unterstützenden Daten hinsichtlich dieser Behauptungen geliefert. Hutton präsentierte ferner keinerlei Daten hinsichtlich der Wirkung der abgestuften bSt- Dosen auf die bSt-Serumkonzentrationen oder Angaben, daß in höheren Konzentrationen verabreichte höhere Dosen von bSt die verzögerte Freisetzung von bSt in das Kreislaufsystem einer Kuh bewirken können.
Eine Gelegenheit für die einschlägige Technik zur Überwindung ihrer Voreingenommenheit gegen die Verwendung wäßriger Zubereitungen zum Erzielen der verlängerten Freisetzung von bSt ergab sich, als L. J. Machlin, der auf der Arbeit von Hutton und anderen aufbaute, die Wirkungen hochwirksamer bSt-Präparate, die relativ frei von einer Kontamination durch Thyrotrophin (TSH) und Prolactin waren, auf die Milchproduktion in Kühen untersuchte (J. Dairy Sci. (1972) Band 56, Nr. 5, 575-580). Machlin fand heraus, daß eine Injektion von bSt alle drei Tage (60-mg-Dosis, unbekannte Konzentration, insgesamt drei Injektionen) die Milchproduktion ebenso verbesserte wie die gleiche Gesamtdosis bei täglicher Gabe (20-mg-Dosis, unbekannte Konzentration, neun Tagesinjektionen). Machlin bedachte jedoch nicht, ob die Verwendung wäßriger hochwirksamer bSt-Präparationen zur verzögerten Freisetzung des Wachstumshormons in das Kreislaufsystem einer Kuh führen würde. Tatsächlich stellt Machlin fest, daß "die Halbwertszeit von BGH in Holstein- Kühen 19-20 min beträgt. Deshalb konnte selbst bei einer gewissen Verzögerung der Absorption von der subkutanen Injektionsstelle eine Zunahme bezüglich Plasma-BGH auf mehr als endogene Konzentrationen mehr als 12 h nach der Injektion nicht erwartet werden. Daher ist eine verlängerte Zunahme an zirkulierendem BGH wahrscheinlich nicht für den Effekt verantwortlich." Machlin erkannte auch nicht die Beziehung zwischen der Dosis und Konzentration von bSt beim Bewirken einer verzögerten Freisetzung von bSt aus einer wäßrigen Zubereitung.
Zum besseren Verständnis der Beobachtungen von Machlin unternahm Bourne et al., J. Dairy Sci., Band 60: 1629-1635 (1977) die Messung der Serumkonzentrationen von bSt im Anschluß an eine subkutane Injektion ähnlicher Dosen. Bourne et al. beobachteten, daß die mittleren Serumkonzentrationen von bSt 1-3 h nach der Injektion ein Maximum erreichten und innerhalb von 24 h zu Konzentrationen vor der Injektion zurückkehrten. Diese Daten von Bourne et al. sprechen gegen die verzögerte Freisetzung von BGH in das Rinderkreislaufsystem jenseits von 24 h und sind mit dem Vorschlag von Machlin konsistent, daß eine Zunahme des Plasma-BGH auf mehr als endogene Konzentrationen mehr als 12 h nach der Injektion nicht erwartet werden könnte.
Anschließend an die Untersuchungen von Hutton, Machlin und Bourne et al., konzentrierte sich die einschlägige Technik abseits ihrer Arbeit. Zahlreiche Forscher verwendeten wäßrige Lösungen für tägliche Diäten mit bSt-Konzentrationen, die allgemein im Bereich von 1-10 mg/ml und einer Dosis von 5-45 mg lagen. In keinem dieser Fälle wurde jedoch über deutliche Serumkonzentrationen von bSt, die mehr als 48-60 h vorlagen, berichtet. Daher wurde auf dem einschlägigen Fachgebiet weiterhin angenommen, daß wäßrige Zubereitungen ungeeignete Vehikel zum Erreichen der verlängerten Freisetzung von bSt in das Kreislaufsystem einer Kuh waren.
Die vorliegende Erfindung beseitigt diese Falschannahme durch das einschlägige Fachgebiet und liefert eine wäßrige injizierbare Zubereitung von bSt mit verzögerter Freisetzung und Verfahren zur Verwendung dieser Zubereitung zum Erreichen der verzögerten oder verlängerten Freisetzung von bSt in das Kreislaufsystem eines Tiers.

Informationsbeschreibung

L. J. Machlin (J. Dairy Sci. (1972) Band 56, Nr. 5, 575- 580). Machlin berichtet, daß die Injektion von Rinderwachstumshormon alle drei Tage über einen Zeitraum von neun Tagen hinweg (60-mg-Dosis, 180 mg insgesamt) die Milchproduktion ebenso verbessert wie die gleiche Gesamtdosis bei täglicher Verabreichung (20-mg-Dosis, 180 mg insgesamt). Machlin berichtet jedoch, daß "die Halbwertszeit von BGH in Holstein-Kühen 19-20 min beträgt. Daher könnte selbst bei einer gewissen Verzögerung der Absorption von der subkutanen Injektionsstelle eine Zunahme des Plasma-BGH auf mehr als endogene Konzentrationen mehr als 12 h nach der Injektion nicht erwartet werden". Des weiteren bedenkt Machlin die Frage nicht, ob wäßrige Zubereitungen als Vehikel zum Erreichen der verlängerten Freisetzung von Proteinen in das Kreislaufsystem eines Lebewesens verwendet werden können.
J. B. Hutton (J. Endocrin. (1957) 16, 115-125) berichtet über die Wirkung, die Wachstumshormon auf die Ausbeute und Zusammensetzung von Kuhmilch hat. Hutton berichtete, daß die mittlere Milchausbeute über einen Zeitraum von vier Tagen durch die verabreichte Dosis von bSt beeinflußt war. Hutton präsentierte jedoch keine Daten, daß die höhere Milchausbeute über den gesamten Zeitraum von vier Tagen aufrechterhalten wurde. Hutton präsentierte ferner keinerlei Daten hinsichtlich der Wirkung der abgestuften bSt- Dosen auf die Serumkonzentrationen von bSt oder Angaben, daß in höheren Konzentrationen verabreichte höhere Dosen von bSt die verzögerte Freisetzung von bSt in das Kreislaufsystem einer Kuh bewirken können.
Hageman et al., J. Agric. Food Chem., 40(2), 348 (1992) berichten, daß die Entwicklung von Dosierungsformen mit verzögerter Freisetzung für die effiziente Zufuhr von Somatotropinen durch die Instabilität der Proteine beim Zusammentreffen mit Wasser, insbesondere bei physiologischen Bedingungen eines pH-Werts von 7,4 und einer Temperatur von 37 ºC kompliziert wird.
Bourne et al., J. Dairy Sci., Band 60: 1629-1635 (1977) berichten, daß die mittleren Serumkonzentrationen von bSt nach einer subkutanen Injektion von 10-, 50- und 100-mg- Dosen in 5 ml wäßrigen Medien 1-3 h nach der Injektion eine maximale Höhe erreichten und innerhalb von 24 h zu den Konzentrationen vor der Injektion zurückkehrten.
Pitt, Int. J. Pharmaceutics 59: 173-196 (1990) berichtet über die Schwierigkeiten zur Entwicklung von parenteralen Zufuhrsystemen mit verzögerter Freisetzung für Proteine, wie die Somatotropine, die in wäßrigen Umgebungen bei hohen Proteinkonzentrationen hoch instabil sind.
Die am 7. Mai 1991 erteilte US-A-5 013 713 von Mitchell offenbart ein Verfahren zum Erreichen einer verlängerten Freisetzung eines biologisch aktiven Somatotropins in das Kreislaufsystem eines Tiers durch die parenterale Verabreichung einer im wesentlichen nicht-wäßrigen Zusammensetzung aus mindestens etwa 10 Gew.-% eines biologisch aktiven Somatotropins und als kontinuierliche Phase der Zusammensetzung einem biologisch kompatiblen Öl an das Tier. Mitchell betont, daß diese Zusammensetzung nicht-wäßrig sein sollte, um die Freisetzung nicht zu beschleunigen.
Die am 11. Dezember 1990 erteilte US-A-4 977 140 von Ferguson et al. offenbart ein Verfahren zum Erreichen einer erhöhten täglichen Milchproduktion bei einer Milchkuh über 28 Tage durch Injizieren von 2 bis 10 g einer Zubereitung mit 10-25% Rindersomatotropin, suspendiert in einem Träger, der zu 8-20% ein Wachs und 80-92% ein Öl umfaßt, in die Kuh. Ferguson et al. stellen nicht die Frage, ob wäßrige Zubereitungen als Vehikel mit verzögerter Freisetzung verwendet werden können.
Die europäische Patentanmeldung 0211601, veröffentlicht am 25. Februar 1987, offenbart das Tierwachstum fördernde Zusammensetzungen, die ein Gemisch aus Wasser, einem Wachstum fördernden Hormon (z. B. Rinderwachstumshormon) und ein Polyoxyethylen-Blockcopolymer als Stabilisator umfassen, zur Verabreichung an Tiere. Bevorzugte Zusammensetzungen enthalten 50-99,5 Gew.-% Wasser, 0,05-10 Gew.-% Wachstumshormon und 0,05-50 Gew.-% Blockcopolymer. Die Literaturstelle berichtet, daß das Vorhandensein des Blockcopolymers in der Zusammensetzung das Ausfallen von Feststoffen und Aktivitätsverlust des Hormons während der Lagerung hemmt. Die Copolymere schaffen auch die verzögerte Freisetzung von Wachstumshormon aufgrund ihrer Fähigkeit zur Durchführung eines bekannten Sol-Gel-Übergangs, wenn sie an der Injektionsstelle einer Temperatur von 37ºC ausgesetzt werden; sie liefern daher eine in situ gebildete Matrix zur langsamen Freisetzung von Protein.
Die US-A-5 169 834 von Arendt (ähnlich dem südafrikanischen Patent 912239) offenbart ein lyophilisiertes Produkt, das 81-96,5% (G/G) biologisch aktiven Wirkstoff (z. B. Somatotropin) und ein Puffersystem mit 0,1-7,6% (G/G) Natriumcarbonat und 7,6-15% (G/G) Natriumbicarbonat, wobei die Gesamtpuffersystemkonzentration 15,2% (G/G) nicht übersteigt, umfaßt. Das Zubereitungspulver wird mit Kochsalzlösung in einer kleinen Phiole zur Bildung der gewünschten Konzentration wiederhergestellt. Das Patent beschreibt die Nutzbarkeit der wäßrigen Lösungen nur in Form täglicher Verabreichung und macht keine Angabe über eine mögliche Verwendung zur verlängerten Freisetzung des biologisch aktiven Wirkstoffs.
Die US-A-4 888 416 von Janski et al. offenbart ein getrocknetes stabilisiertes biologisch aktives Proteinprodukt, das mit einem stark gebundenen ionischen Detergens überzogen ist. Das Überziehen des Proteins mit dem ionischen Detergens stabilisiert entsprechend dem Bericht die Proteine, so daß sie ihre biologische Aktivität und Löslichkeit bei Kontakt mit Körperflüssigkeit beibehalten.
Das am 10. September 1986 veröffentlichte europäische Patent 0193917 offenbart eine biologisch aktive Zusammensetzung mit den Eigenschaften einer langsamen Freisetzung, die ein wasserlösliches oder -dispergierbares Kohlehydratpolymer (z. B. Dextran, Dextrin, Alginat, Pflanzengummis oder Cellulose oder deren Gemische) und ein biologisch aktives Makromolekül, wie Rindersomatotropin, umfaßt. Diese wäßrigen Präparationen erfordern die Verwendung einer Komplexierung mit Kohlehydratpolymeren, um anhaltende Blutkonzentrationen von Somatotropinen zu liefern.
Die US-A-4 857 506 von Tyle beschreibt eine somatotropinhaltige wäßrige innere Phase, für die eine verzögerte Freisetzung durch Einarbeiten in eine Mehrfachemulsion, d. h. Öl/Wasser/Öl-Emulsion erhalten wird.
Das am 31. Januar 1990 veröffentlichte europäische Patent 0353045 berichtet die Verwendung wäßriger Lösungen mit Stabilisatoren, jedoch erfordert eine verzögerte Freisetzung deren Einarbeiten in eine Mengensteuerungsvorrichtung, d. h. ein osmotische Pumpe/Reservoir-System. Ebenfalls erwähnt wird die mögliche Verwendung von Gelen, Pasten, Mikrokügelchen, Mikrokapseln, Implantaten und dgl. als parenterale Zusammensetzungen.
Die US-A-4 816 568 von Hamilton et al. mit dem Titel "Stabilization of growth hormones" beschreibt die Notwendigkeit verschiedener Stabilisatoren zur Konservierung einer löslichen biologischen Aktivität des Wachstumshormons in wäßrigen Umgebungen, wobei wiederum die Notwendigkeit von Stabilisatoren betont wird.
Die EP-A-0374120 berichtet, daß die Stabilisierung implantierbarer, wäßrige Lösungen enthaltender Einrichtungen der gesteuerten Zufuhr durch das Einarbeiten von Polyol und Puffer in die Lösung erreicht werden kann. Es gibt keinen Beleg dafür, daß wäßrige Lösungen ohne derartige Stabilisatoren bei Injektion eine verzögerte Freisetzung liefern könnten.
Die US-A-4 118 380 mit dem Titel "Decapeptide analogs of somatostatin" berichtet die Notwendigkeit einer Verwendung von Salzen oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern geringer Löslichkeit in wäßrigen Lösungen zur Bereitstellung eines Depots oder Effekts der verzögerten Freisetzung des Somatostatins.
Die AU-A-8655983 (verwandt mit US-A-4 774 091 und US-A-5 021 241) mit dem Titel "Slow release preparation of growth promoting or bony metabolism peptide with collagen, gelatin and/or albumin as carrier protein" erörtert die Notwendigkeit eines Trägerproteins, um eine verzögerte Freisetzung bei Proteininjektionen zu erhalten. Die verwandte EP-A- 0140255 mit dem Titel "Sustained-release injections" berichtet, daß nicht nur ein Trägerprotein zum Erhalt einer verzögerten Freisetzung bei Proteininjektionen notwendig ist, sondern auch ein von Wasser verschiedenes, viskoses Lösungsmittel zur Suspension der Protein/Träger- Zusammensetzung erforderlich ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Steigerung der Milchproduktion oder des Futter-in-Milch-Umwandlungsgrades einer Kuh durch Herbeiführung einer mehr als 72 h dauernden, verlängerten Freisetzung eines biologisch aktiven Somatotropins in das Kreislaufsystem der Kuh die parenterale Verabreichung einer Dosis von mindestens 150 mg Rindersomatotropin als injizierbare wäßrige Lösung, die mindestens 50 mg/ml des Somatotropins enthält, an die Kuh. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise durch subkutane oder intramuskuläre Injektion.
Eine neue injizierbare pharmazeutische wäßrige Lösung enthält mindestens 150 mg eines biologisch aktiven Rindersomatotropins; das Somatotropin liegt entweder in einer Konzentration von mindestens 50 mg/ml vor und die Lösung ist im wesentlichen frei von absorptionsmodifizierenden Mitteln und Puffern oder die Konzentration beträgt mindestens 150 mg/ml und die Lösung ist im wesentlichen frei von absorptionsmodifizierenden Mitteln.

1 Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die mittleren Serumkonzentrationen von bSt über die Zeit für die in Tabelle 1 angegebenen 10 bSt- Behandlungsgruppen und
Fig. 2 zeigt die Zeitdauer, über die jede der in Tabelle 1 angegebenen 10 bSt-Behandlungsgruppen die Serumkonzentration von bSt über die von Kontrollfärsen erhöhen konnte.

Detaillierte Beschreibung

Durchgängig durch diese Beschreibung sind - falls nicht anders angegeben - die Prozentangaben der Zusammensetzungen auf das Gewicht bezogen und die Temperaturen in. Grad Celsius angegeben.
Der in dieser Beschreibung verwendete Ausdruck "biologisch aktives" oder "bioaktives" Polypeptid bedeutet ein Polypeptid, das anschließend an eine entsprechende parenterale Verabreichung an ein Tier eine nachweisliche Wirkung auf einen biologischen Prozeß des Tieres hat. Die Wirkung kann hormonal, ernährungsbezogen, therapeutisch, prophylaktisch oder eine sonstige sein und kann einen natürlich vorkommenden biologischen Prozeß nachahmen, ergänzen oder hemmen. Obwohl es eine enorme Vielzahl derartiger Wirkungen und Prozesse gibt, können die Stimulation des Wachstums, der Milchbildung, der Erzeugung von Eiern oder Nachkommen und/oder der Futterwirkungsgrad bei Nahrungstieren als Beispiele genannt werden. Andere Beispiele umfassen die Erzeugung von Wolle, Pelzen oder anderen Nicht-Nahrung- Tierprodukten. Obwohl das Polypeptid in Zusammensetzungen dieser Erfindung vor der Verabreichung an ein Tier in der aktiven Form vorliegen kann, umfaßt der Ausdruck hier auch Polypeptide, die eine biologische Aktivität nach dieser Verabreichung entwickeln.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden zur verlängerten Freisetzung von Rindersomatotropin bei Rindern verwendet. Rindersomatotropin ist ein Hormon, das zur Steigerung des Mager/Fett-Verhältnisses, des Futterwirkungsgrads, der Wachstumsrate und der Milchproduktion bei Rindern (z. B. Milchkühen) brauchbar ist. Der hier verwendete Ausdruck "Rindersomatotropin" bedeutet ein Polypeptid, das eine biologische Aktivität und chemische Struktur besitzt, die im wesentlichen ähnlich dem in der Hypophyse einer Kuh erzeugten Somatotropin ist. Dieses Rindersomatotropin umfaßt das natürliche Somatotropin, das von Rinderhypophysesomatotropinzellen erzeugt wird, und alternativ Rindersomatotropin, das durch genetisch transformierte Mikroorganismen, wie E. coli, andere Bakterien oder Hefen, exprimiert wird. Derartige alternativ erzeugte Somatotropine können eine zum natürlichen Somatotropin identische Aminosäuresequenz besitzen oder Analoga mit einer oder mehr Variationen in der Aminosäuresequenz sein, die eine erhöhte biologische Aktivität oder einen sonstigen Vorteil liefern.
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung enthalten Rindersomatotropin (bSt) mit einer Dosismenge von mindestens etwa 150 mg von biologisch aktivem bSt, das in Wasser mit einer Konzentration von mindestens etwa 50 mg/ml gelöst ist. Hö here Dosen von bSt, beispielsweise mindestens etwa 300 mg oder sogar 600 mg von biologisch aktivem bSt, das in Wasser mit einer Konzentration von mindestens etwa 50 mg/ml gelöst ist, sind ebenfalls günstig. Ferner ist eine Erhöhung der Konzentration über 50 mg/ml zur Schaffung einer verlängerten Freisetzung des bSt bei parenteraler Injektion (im Blutstrom der Rinder gemessen) ebenfalls vorteilhaft.
Eine der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist, daß sie zur Schaffung einer verlängerten Freisetzung des biologisch aktiven Polypeptids mit biologisch wirksamen Raten keine absorptionsmodifizierenden Mittel benötigen. Es zeigte sich, daß diese Zusammensetzungen eine verzögerte Freisetzung über eine passend lange Zeitspanne liefern und daß diese Mengen nicht so groß sind, als daß sie dem Verabreicher oder der Kuh Unbequemlichkeiten verursachen. Die Injektion der beanspruchten Zusammensetzungen in Rinder verursacht im Vergleich zu nicht-wäßrigen BGH- Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung eine äußerst geringe Gewebereizung an den Injektionsstellen. Eine allenfalls geringe Reizung wird mit den erfindungsgemäßen wäßrigen Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung festgestellt.
Wie im vorhergehenden angegeben, sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung, z. B. durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, in attraktiver Weise geeignet. Die Dauer der verlängerten Freisetzung ist die Zeitspanne, während der das Polypeptid mit der für die gewünschte biologische Wirkung erforderlichen Menge geliefert wird, die typischerweise durch die Konzentration des Polypeptids im zirkulierenden Blutstrom des Tiers angezeigt wird. Die Dauer der verlängerten Freisetzung beträgt mindestens mehr als 72 h. In sonstigen Fällen kann sie mindestens 120 h oder günstigerweise für viele Anwendungen mindestens 144 h betragen.
Das bSt kann in Form eines Pulvers (beispielsweise lyophilisiert oder sprühgetrocknet) bereitgestellt werden, das relativ leicht mit dem wäßrigen Träger, beispielsweise mit einem Propellerrührer, gemischt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vor der Lyophilisierung oder Sprühtrocknung Proteinstabilisatoren (z. B. Polysorbate 80) und Lockerungsmittel (z. B. Mannit) in einer bSt/Wasser-Lösung gelöst. Diese bSt-Zusammensetzung wird dann mit Wasser sanft gemischt, um die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit verlängerter Freisetzung zu bilden. Polysorbate 80 ist ein nichtionisches Netzmittel, das zur Stabilisierung des Rindersomatotropins gegenüber einer Grenzflächendenaturierung, die während einer Verarbeitung oder Wiederherstellung im großen Maßstab erfolgen kann, verwendet wird. Beispielsweise kann zum Schutze des Somatotropins vor dem Auflösen und Lyophilisieren 0,125% (G/V) Polysorbate 80 dem Wasser, in das das Rindersomatotropin gegeben wird, zugesetzt werden. Lockerungsmittel, wie Mannit, können eine Wiederherstellung erleichtern. Sonstige Zubereitungsstreckmittel, wie Puffer (z. B. Natriumbicarbonat) oder tonusmodifizierende Mittel (z. B. Natriumchlorid) können zugesetzt werden, sind jedoch nicht notwendig.

Beispiel 1 - Herstellung von Rindersomatotropin

Rindersomatotropin wurde gemäß der WO-87/00204 hergestellt und isoliert, wobei die Endstufen der Reinigung/Isolierung die Dialyse von Lösungen gegen sehr verdünnte NaOH-Lösungen eines pH-Werts von 9-10,5 und Querstrommikrofiltration waren, wobei Proteinlösungen im Bereich 10-150 mg/ml erhalten wurden. Diese Lösungen wurden sterilfiltriert und lyophilisiert, wobei ein loses Pulver erhalten wurde.

Beispiel 2 - Herstellung der Zubereitung

Loses lyophilisiertes Somatotropin aus Beispiel 1 wurde in Wasser gelöst, in 100-ml-Phiolen gegeben und lyophilisiert. Entsprechende Mengen Wasser wurden den Phiolen zugesetzt, um das neu lyophilisierte Somatotropin zu lösen, wobei Somatotropinlösungen mit Konzentrationen von entweder 50, 150 oder 250 mg/ml in den Phiolen hergestellt wurden. Diese unterschiedlichen Somatotropinkonzentrationen wurden in Spritzen gefüllt, wobei Dosen von entweder 150, 300 oder 600 mg pro Spritze geliefert wurden (Tabelle 1). Alternativ könnte man die volle Drogenlösung aus Beispiel 1 direkt in Phiolen füllen und die redundante Lyophilisierungsstufe weglassen.

Beispiel 3 - Injektion

Nicht-trächtige, nicht-milchbildende Holstein-Färsen (visuell geschätztes Körpergewicht von 475 kg) wurden in trockenen Ställen gehalten und erhielten pro Kopf und Tag 35 kg Luzernensilage; Wasser stand zu beliebigem Verbrauch zur Verfügung. Die Färsen wurden willkürlich Gruppen zugeordnet (6 pro Gruppe), die die folgenden Behandlungen durch subkutane Injektion erhielten (SR = verzögerte Freisetzung):
1) 150 mg SR-bSt/50, 3,0 ml Dosierungsvolumen;
2) 150 mg SR-bSt/150, 1,0 ml Dosierungsvolumen;
3) 150 mg SR-bSt/250, 0,6 ml Dosierungsvolumen;
4) 300 mg SR-bSt/50, 6,0 ml Dosierungsvolumen;
5) 300 mg SR-bSt/150, 2,0 ml Dosierungsvolumen;
6) 300 mg SR-bSt/250, 1,2 ml Dosierungsvolumen;
7) 600 mg SR-bSt/50, 12,0 ml Dosierungsvolumen;
8) 600 mg SR-bSt/150, 4,0 ml Dosierungsvolumen;
9) 600 mg SR-bSt/250, 2,4 ml Dosierungsvolumen;
10) keine Injektion (Kontrolle).
Alle Zubereitungen wurden subkutan über der Rippe caudal zur linken Schulter unter Verwendung einer 18er-Einmalnadel von 2,5 cm mit einer Einmalspritze von 3-10 ml in Abhängigkeit vom Injektionsvolumen injiziert. Das Haar an der Injektionsstelle wurde vor der Injektion geschoren, um eine Gewebereaktion überwachen zu können. Die Injektionsstellen wurden einmal täglich während der ersten 10 Tage der Untersuchung bewertet. Die Überwachung der Injektionsstelle wurde nicht fortgesetzt, wenn an Tieren mit Injektion von SR- Somatotropin 10 Tage nach der Injektion keine Reaktionen beobachtet wurden.

Beispiel 4 - Serumtest

Blut (7 ml) wurde in evakuierten 10-ml-Röhrchen über die Schwanzvene während 14d nach der Injektion gesammelt. Die Injektionen erfolgten zum Zeitpunkt 0 und Blutproben wurden 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288 und 312 h nach der Injektion gesammelt. Das Blut wurde bei Raumtemperatur 1 h lang gerinnen gelassen, mit 1500 · g zentrifugiert und das Serum wurde dekantiert und bei -20ºC gelagert. Alle Serumproben wurden bezüglich bSt durch Radioimmungssay (RIA) nach dem Verfahren von G. D. Niswander et al., Endocrinol. 84: 1166 (1969) getestet.

Beispiel 5 - Dauer der Serumerhöhung von bSt

Die mittleren Serumkonzentrationen von bSt über die Zeit für die 10 Behandlungsgruppen in Tabelle 1 sind in Fig. 1 angegeben. Die Zeitdauer, über die die verschiedenen SR- bSt-Zubereitungen die Serumkonzentration von bSt über die von Kontrollfärsen erhöhen konnten, ist in Fig. 2 angegeben. Es ist offenkundig, daß bei Zunahme der Dosis innerhalb einer speziellen Konzentration von bSt die Anzahl der Stunden, über die Serum-bSt über die Kontrollen erhöht blieb, ebenfalls zunahm (Tabelle 2, Fig. 2). In ähnlicher Weise nahm mit einer Zunahme der bSt-Konzentration von 50 mg bSt/ml auf 250 mg bSt/ml innerhalb einer speziellen Dosis die Anzahl der Stunden, über die Serum-bSt über die Kontrollen erhöht war, ebenfalls zu (Tabelle 2, Fig. 2). Alle getesteten Zubereitungen lieferten erhöhtes mittleres Serum-bSt während mehr als 72 h (Tabelle 2, Fig. 2). Die niedrigste Dosis/Konzentration-Kombination, die das mittlere Serum-bSt während 144 h erhöhte, war 300 mg SR-bSt/150 (Tabelle 2, Fig. 2). Eine Steigerung sowohl der Dosis als auch der Konzentration (600 mg SR-bSt/250) verlängerte die Zeit, während der Serum-bSt erhöht war, auf 216 h (Tabelle 2, Fig. 2).
Die Ergebnisse belegen, daß eine Wechselwirkung zwischen Dosis und Konzentration zu einer Zunahme der Dauer der bSt- Erhöhung führte (Tabelle 2). Insbesondere hat der Effekt der Steigerung sowohl der Dosis als auch der Konzentration auf die Dauer eine größere Wirkung als dies durch den additiven Effekt der getrennten Steigerung jedes einzelnen vorhergesagt würde. Die Ergebnisse belegen daher, daß eine synergistische Wechselwirkung zwischen einer Steigerung der Dosis und Konzentration besteht, die zu einer größeren verzögerten Freisetzung von bSt in das Kreislaufsystem der Kuh gegenüber der erwarteten führt.
Alle untersuchten Kombinationen von bSt-Dosis und -Konzentration (Behandlungsgruppen 1-9, Tabelle 1) konnten verwendet werden, um die Serumkonzentration von bSt signifikant zu erhöhen und eine verzögerte Freisetzung zu liefern. Konzentrationen unter 180 mg/ml besaßen besonders bevorzugte Eigenschaften bezüglich Wiederherstellung, Aufziehbarkeit und Injizierbarkeit.
Ohne dies theoretisch untermauern zu wollen, glauben wir, daß die verzögerte Freisetzung einer wäßrigen Lösung von Rindersomatotropin (bSt) in vivo durch die kompetitiven Prozesse der Zersetzung in und Auflösung aus einem "gelähnlichen" bSt-Depot, das sich an der Injektionsstelle aufgrund der physiologischen Bedingungen der Kuh (pH-Wert 7,4 und 39ºC) bildet, diktiert wird. Unter dieser Annahme sollten Faktoren, wie Proteinkonzentration und bSt-Dosis vermutlich die Dauer der Serumkonzentrationen von bSt dramatisch beeinflussen. Beispielsweise würde eine Steigerung der bSt-Konzentration ein kleineres Injektionsvolumen ermöglichen, das vermutlich zu einer schnelleren bSt- Depotbildung und einer kleineren Gesamtoberfläche zum Auftreten der anschließenden Auflösung von bSt (d. h. zu einer längeren Dauer führend) führen würde. Eine Erhöhung der bSt-Dosis würde überschüssiges bSt zur Kompensation der Zersetzung von bSt, die an der Injektionsstelle während der Dauer der bSt-Freisetzung von der Stelle auftreten kann, liefern. Tatsächlich würde der Überschuß die Zeit erhöhen, während der nachweisbare Mengen von bSt weiterhin freigesetzt würden. Tabelle 1. Experimentaufbau und Zubereitungsbeschreibung.
a Alle Zubereitungen enthielten lyophilisiertes bSt, das in Wasser zu Injektionszwecken gelöst wurde.
b Keine Injektion Tabelle 2. Serumkonzentration von bSt in Färsen bei Blutentnahmezeitpunkten nach der Injektion verschiedener Konzentrationen und Dosen von SR-bSt (Mittelwerte nach der Methode der kleinsten Quadrate (ng bSt/ml Serum)).
ns Mittelwerte mit diesem hochgestellten Index sind nicht signifikant (P> 0,05) verschieden vom Gesamtkontrollmittelwert (1,8 ng bSt/ml Serum). Der Kontrollmittelwert ist die mittlere Konzentration von bSt für alle Probeentnahmezeiten von 12 h bis 312 h.

Claims

1. Verfahren zur Steigerung der Milchproduktion oder des Futter-in-Milch-Umwandlungsgrades einer Kuh durch Herbeiführung einer mehr als 72 h dauernden, verlängerten Freisetzung eines biologisch aktiven Somatotropins in das Kreislaufsystem der Kuh durch parenterale Verabreichung einer Dosis von mindestens 150 mg Rindersomatotropin als injizierbare wäßrige, das Somatotropin in einer Konzentration von mindestens 50 mg/ml enthaltende Lösung an die Kuh.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung mindestens 300 mg des Somatotropins umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Lösung mindestens 600 mg des Somatotropins umfaßt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration mindestens 150 mg/ml beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration mindestens 250 mg/ml beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Periode mehr als 120 h dauert.

7. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5 bei Abhängigkeit von Anspruch 2 oder 3, wobei die Periode mehr als 144 h dauert.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo bei die Lösung praktisch keine absorptionsmodifizierenden Mittel und Puffer enthält.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verabreichung durch subkutane oder intramuskuläre Injektion erfolgt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Milchproduktion für mindestens 7 Tage erhöht wird.

11. Injizierbare, pharmazeutische, wäßrige Lösung mit mindestens 150 mg eines biologisch aktiven Rindersomatotropins in einer Konzentration von mindestens 50 mg/ml, welche praktisch keine absorptionsmodifizierenden Mittel und Puffer enthält.

12. Injizierbare, pharmazeutische, wäßrige Lösung mit mindestens 150 mg eines biologisch aktiven Rindersomatotropins in einer Konzentration von mindestens 150 mg/ml, wobei die Lösung praktisch keine absorptionsmodifizierenden Mittel und Puffer enthält.

13. Zubereitung nach Anspruch 12, wobei die Konzentration mindestens 250 mg/ml beträgt.

14. Zubereitung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Lösung mindestens 300 mg des Somatotropins enthält.

15. Zubereitung nach Anspruch 13, wobei die Lösung mindestens 600 mg des Somatotropins enthält.