KR100355517B1 - 수성의지속성방출제제 - Google Patents

수성의지속성방출제제 Download PDF

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마이클 제이 해지맨
마가레트 엘 포서트
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파마시아 앤드 업존 캄파니
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Abstract

본 발명은 상기 소 소마토트로핀이 약 150 mg 이상의 투여량 및 약 50 mg/ml 이상의 농도로 수성 액체중에 존재하는 신규한 조성물을 사용하여 바람직한 효과량으로 생리 활성 소 소마토트로핀을 소의 순환계중에 비경구적으로 지속성 방출시키는 방법에 관한 것이다. 수성 소 소마토트로핀 제제는 3일을 초과하는 시간동안 동물의 순환계중에 소 소마토트로핀을 지속성 방출시킨다.

Description

수성의 지속성 방출 제제
유전공학의 출현으로 인해, 많은 생리 활성 펩티드 및 단백질을 대규모로 이용하는 것이 가능하게 되었다. 그러나, 이들 재조합 방법에 의해 생성된 펩티드 및 단백질의 투여는 독특한 문제를 안고 있다. 많은 경우, 이들 단백질의 생물학적 효과를 지속시키기 위해서는 장기간의 투여를 필요로 한다. 이들 제제의 매일 투여는 불편하기 때문에, 지속성 또는 연장성 방출이 바람직하다.
다양한 이유로, 당분야는 단백질, 특히 소마토트로핀을 포함한 많은 약물의 지속성 방출을 이루기 위해 비히클로서 생체적합성 오일의 사용에 대해 오랫동안 초점을 맞추어 왔다. 이 기술에 관련된 특허중에는 미첼(Mitchell)의 미국 특허 제 5,013,713 호 및 퍼거슨(Ferguson) 등의 미국 특허 제 4,977,140 호가 있다. 미첼은 바람직한 효과량 수준으로 소의 소마토트로핀(bSt;BGH)을 비경구적 지속성 방출시키기 위해서는 약 10 중량% 이상의 생물학적으로 활성인 소마토트로핀, 및 조성물의 연속상으로서 옥수수유와 같은 생체적합성 오일을 포함하는 실질적으로 비수성 조성물을 사용할 수 있다고 보고하고 있다. 퍼거슨 등은 bSt, 왁스 및 오일을 포함하는 지속성 방출 제제의 주사로 연장된 기간동안 소의 우유 생산을 증가시킨다고 보고하고 있다.
상기 특허는 소마토트로핀의 지속성 방출을 위해 당분야에서는 비수성 전달 시스템의 사용에 중점을 두었음을 보여주고 있다. 당분야에서는 bSt의 지속성 방출을 이루기 위한 수성 제제의 사용은 전혀 존재하지 않았다. 당분야에서 단백질, 특히 소마토트로핀의 지연 전달을 위한 수성 시스템을 사용하지 않은 이유중에는 단백질이 장기간 수성 환경에 노출되는 경우 상당히 불안정해진다는 일반적인 관점에 있다 (참고, 핏트(Pitt)의 문헌 [Int. J. Pharmaceutics59:173-196 (1990)]). 또한, 예를 들면 흡수 개질제 및 점도 유도제에 의해 분자의 가용성 또는 분자의 흡수성을 변경시키려는 임의의 노력없이는 수성 제제를 사용하여 단백질 또는 펩티드의 지속성 방출을 달성할 수는 없다고 일반적으로 인식하고 있기 때문이다. 심지어 오일을 사용하는 경우, 미첼은 통상 수화방지제를 생활성 단백질의 전달 시스템에 첨가하거나 또는 단백질을 금속 또는 금속 화합물과 착체화시킴으로써, 동물의 혈류중으로의 단백질 방출을 변화시킨다고 보고하고 있다. 그러나, 이들 흡수 개질제의 사용은 단백질의 가용성을 변경시키거나 또는 조성물의 용이한 주사가능성을 감소시키고/시키거나 주사 부위에서 조직을 상당히 자극시킬 수 있다.
bSt와 같은 단백질의 지속성 방출을 이루기 위한 수성 제제의 용도에 대한당분야의 편견의 근원을 판단하기는 어렵지만, J.B. 헛튼(Hutton) (문헌 [J. Endocrin.(1957) 16, 115-125])에 의해 수행된 연구에 근거를 둘 수 있다. 그의 연구에서, 헛튼은 5 ml 염수(각각 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40 mg/ml의 농도)중에 용해된 소 성장 호르몬(bSt)의 구배 투여량 (6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 및 200.0 mg)의 피하 주사에 의한 소의 우유 생산 및 조성에 대한 효과를 연구하였다. 헛튼에 의해 연구된 기본 변수는 우유 생산량의 증가이었다. 헛튼은 4일 동안의 평균 우유 생산량이 투여된 bSt의 투여량에 의해 영향을 받았다고 보고하고 있다. 그러나, 보다 높은 우유 생산량이 전체 4일 동안 지속되었다는 어떠한 결과도 존재하지 않았다. 헛튼은 50 mg (10 mg/ml) bSt의 1회 주사가 4일 동안에 우유 생산의 향상을 제공할 것이라고 주장하였다. 그러나, 헛튼은 상기 주장이 특정한 가설을 필요로 하는 계산을 기초로 한 것임을 알았다. 이들 가설의 근원은 설명되지도 않았고, 또한 그의 주장에 관련되어 제공된 임의의 지지 결과도 없었다. 헛튼은 또한 bSt 혈청량에 대한 구배 bSt 투여량의 효과에 관련되거나 고농도로 투여된 보다 높은 투여량의 bSt가 소의 순환계중으로 bSt의 지속성 방출에 효과를 줄수 있다고 암시하는 임의의 데이타도 갖지 않았다.
당분야가 bSt의 지속성 방출을 이루기 위한 수성 제제의 사용에 대한 편견을 극복할 기회는, 헛튼 등의 연구를 이어나가는 L.J. 마클린(Machlin)이 소에서 우유 생산에 대한 티로트로핀(Thyrotropin, TSH) 및 프로락틴 오염이 비교적 존재하지 않는 고효능의 bSt 제제의 효과를 조사하였을 때 일어났다 ([J. Dairy Sci.(1972) Vol. 56, No. 5, 575-580]). 마클린은 3일째 마다 bSt를 주사하는 것(60 mg 투여량, 미지의 농도, 총 3회 주사)이 동일한 총 투여량을 매일 투여하는 것(20 mg, 미지의 농도, 9일동안 주사) 만큼 우유 생산을 개선시킨다는 것을 발견해내었다. 그러나, 마클린은 고효능의 수성 bSt 제제를 사용하는 것이 성장 호르몬을 소의 순환계중으로 지속 방출시키는 것인지의 여부를 고려하지 않았다. 사실상, 마클린은 "BGH의 반감기는 홀스타인(Holstein) 소에서 19 내지 20분이다. 따라서, 피하의 주사 부위로부터 흡수가 일부 지연되는 경우에도, 혈장에서 BGH가 내인성 수준보다 증가되는 것은 주사후 12시간이상 기대될 수 없다. 따라서, 순환되는 BGH의 지속적 증가는 아마도 상기 효과를 설명하지 못한다"라고 언급하고 있다. 마클린은 또한 수성 제제로부터 bSt의 지속성 방출에 효과적인 bSt의 투여량 및 농도 사이의 상호관계를 인식하지 못하였다.
마클린의 관찰을 더욱 이해하기 위하여, 보른(Bourne) 등 (문헌 [J. Dairy Sci.,Vol. 60:1629-1635 (1977)])은 유사 투여량의 피하 주사에 이어 혈청 bSt 양의 측정을 수행하였다. 보른 등은 혈청 bSt 평균 농도가 주사 1 내지 3시간후 최대에 이르고 24시간내에 주사전의 농도로 되돌아간다는 것을 관찰하였다. 보른등에 의한 이 데이타에 의하면 24시간이 넘도록 BGH가 소의 순환계로 지속적으로 방출된다는 것에 부정적이고, 내인성 수준보다 혈장 BGH가 증가되는 것이 주사후 12시간이후에는 기대될 수 없다는 마클린의 제안과 일치하였다.
헛튼, 마클린 및 보른 등의 연구에 이어서 당분야에서는 이들의 연구와는 다른 각도로 초점을 맞추었다. 수많은 연구자들은 일반적으로 1 내지 10 mg/ml 및 5 내지 45 mg의 투여량에 상응하는 bSt를 갖는 일일 섭생용 수용액을 사용하였다. 그러나, 어떠한 경우에도 48 내지 60시간을 초과하여 임의의 믿을 수 있는 bSt 혈청 농도에 대해서도 보고하지 않았다. 따라서, 당분야는 수성 제제가 소의 순환계중에 bSt를 지속적 방출하는데 부적당한 비히클이었다고 여전히 여겼다.
본 발명은 당분야의 이러한 잘못된 인식을 극복하고, bSt의 수성 주사용 지속성 방출 제제 및 상기 제제를 사용하는 방법을 제공하여 동물의 순환계중에서 bSt의 지속성 또는 연장성 방출을 달성할 수 있도록 한다.
[정보 개시]
마클린, L.J. ([J. Dairy Sci.(1972) Vol. 56, No. 5, 575-580]). 마클린은 9일동안 3일째마다 소 성장 호르몬을 주사하는 경우(60 mg 투여량, 총 180 mg) 동일한 총 투여량을 매일 투여하는 경우(20 mg 투여량, 총 180 mg)와 동일한 정도로 우유 생산을 개선시킨다고 보고하고 있다. 그러나, 마클린은 "BGH의 반감기는 홀스타인(Holstein) 소에서 19 내지 20분이다. 따라서, 피하의 주사 부위로부터 흡수가 일부 지연되는 경우에도, 혈장에서 BGH가 내인성 수준보다 증가되는 것은 주사후 12시간이상 기대될 수 없다."고 보고하고 있다. 또한, 수성 제제가 동물의 순환계중에 단백질의 지속성 방출을 이루기 위한 비히클로서 사용할 수 있는지에 대한 문제는 고려하지 않았다.
헛튼([J. Endocrin.(1957) 16, 115-125])은 성장 호르몬이 소의 우유의 생산 및 조성에 대해 영향을 갖는다고 보고하고 있다. 헛튼은 4일동안의 평균 우유 생산량이 bSt의 투여량에 의해 영향을 받았다고 보고하였다. 그러나, 헛튼은 보다 높은 수준의 우유 생산이 총 4일보다 오래 지속되었다는 어떠한 데이타도 제시하지못하였다. 헛튼은 또한 bSt 혈청 농도에 대하여 구배된 bSt 투여량의 영향에 관련되거나 또는 고농도로 투여된 bSt의 보다 높은 투여량이 소의 순환계중으로 bSt를 지속적 방출하는 것에 영향을 주는지를 나타내는 어떠한 데이타도 제시하지 않았다.
헤지만(Hageman) 등 ([J. Agric. Food Chem., 40(2), 348 (1992)])은 소마토트로핀의 효과적인 전달을 위한 지속성 방출 투여 형태의 개발은 특히 pH 7.4 및 37℃의 생리 조건에서 물에 노출되는 경우 단백질의 불안정성에 의해 복잡해진다고 보고하고 있다.
보른 등 ([J. Dairy Sci., Vol. 60:1629-1635 (1977)])은 5 ml의 수성 매질중의 10, 50 및 100 mg 투여량의 피하 주사에 따른 평균 혈청 bSt량은 주사후 1 내지 3시간후 최대량에 이르고 24시간내에 주사전 농도로 되돌아간다고 보고하고 있다.
핏트 ([Int. J. Pharmaceutics59:173-196 (1990)])는 높은 단백질 농도로 수성 환경에서 상당히 불안정한 소마토트로핀과 같은 단백질의 비경구적 지속성 방출 전달 시스템을 개발하는데 있어서의 문제점에 대해 보고하고 있다.
1991년 5월 7일자로 미첼에게 허여된 미국 특허 제 5,013,713 호는 약 10 중량% 이상의 생물학적 활성 소마토트로핀의 실질적으로 비수성인 조성물, 및 상기 조성물의 연속상으로서 생체적합성 오일을 동물에게 비경구 투여하므로써 동물의 순환계중에 생물학적으로 활성인 소마토트로핀을 지속성 방출시키기 위한 방법을 개시하고 있다. 미첼은 그의 조성물이 방출을 가속시키기 않도록 비수성이어야 함을 강조하고 있다.
1990년 12월 11일자로 피거슨 등에게 허여된 미국 특허 제 4,977,140 호는 8내지 20%의 왁스 및 80 내지 92%의 오일을 포함하는 담체중에 현탁시킨 10 내지 25%의 소의 소마토트로핀을 포함하는 제제 2 내지 10 g을 소에게 주사하므로써 소에서 우유 생산량의 증가를 28일동안 달성하기 위한 방법을 개시하고 있다. 퍼거슨 등은 수성 제제가 지속성 방출 비히클로서 사용될 수 있는지에 대한 문제를 고려하지 않았다.
1987년 2월 25일자로 공개된 유럽 특허원 제 0 211 601 호는 물, 성장-촉진호르몬 (예, 소의 성장 호르몬) 및 안정화제로서의 폴리옥시에틸렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 동물에게 투여하기 위한 성장-촉진용 조성물에 대해 개시하고 있다. 바람직한 조성물은 50 내지 99.9 중량%의 물, 0.05 내지 10 중량%의 성장 호르몬 및 0.05 내지 50 중량% 블록 공중합체를 함유한다. 상기 특허는 조성물중의 블록 공중합체의 존재가 저장시 고체 침전 및 호르몬의 활성 손실을 억제한다고 보고하고 있다. 공중합체는 또한 주사 위치에서 37℃로 노출되는 경우 공지된 졸-겔 전이를 수행하는 이들의 능력으로 인해 성장 호르몬의 지속성 방출을 제공하며; 이로써 단백질의 서방성 방출을 위한 동일계내에서 형성된 매트릭스를 제공한다.
아렌트(Arendt)의 미국 특허 제 5,169,834 호 (남아프리카 특허 제 912239호와 유사하다)는 81 내지 96.5 w/w%의 생물학적으로 활성인 약물 (예, 소마토트로핀)을 포함하는 동결건조 생성물 및 0.1 내지 7.6 w/w%의 탄산나트륨과 7.6 내지 15 w/w%의 중탄산나트륨을 포함하며 전체 완충 시스템 농도가 15.2 w/w%를 초과하지 않는 완충 시스템을 개시하고 있다. 제형화 분말은 작은 바이알중에서 염수용액으로 원하는 농도에 맞게 재구성된다. 상기 특허는 매일 투여의 관점에서만 수성 용액의 용도를 설명하고 있으며 생활성 약물의 지속성 방출을 위한 사용가능성에 대해서는 어떠한 암시도 하지 않았다.
잰스키(Janski) 등의 미국 특허 제 4,888,416 호는 강하게 결합된 이온성 세정제로 코팅된 건조 및 안정화된 생활성 단백질을 개시하고 있다. 단백질을 이온성 세정제에 의해 코팅시키는 것에 의해 단백질을 안정화시켜, 체액과 접촉하는 경우에도 그의 생활성 및 가용성이 유지될 수 있도록 하였다.
1986년 9월 10일자로 공개된 유럽 특허 제 0 193 917 호는 수용성 또는 수분산성 탄수화물 중합체 (예, 덱스트란; 덱스트린; 알기네이트; 식물성 고무; 또는 셀룰로즈, 또는 이들의 혼합물) 및 소의 소마토트로핀과 같은 생물학적으로 활성인 거대분자를 포함하며 서방성 방출 특성을 갖는 생물학적으로 활성인 조성물을 개시하고 있다. 이들 수성 제제는 소마토트로핀의 지속적 혈중 농도를 제공하기 위해 탄수화물 중합체와의 착화를 필요로 한다.
타일(Tyle)의 미국 특허 제 4,857,506 호는 다중 에멀젼, 즉 오일/물/오일 에멀젼중으로 도입하여 지속성 방출을 얻는 소마토트로핀을 함유하는 수성 내부상을 기재하고 있다.
1990년 1월 31일자로 공개된 유럽 특허 제 0 353 045 호는 안정화제를 갖는 수성 용액의 용도를 보고하고 있지만, 지속성 방출을 위해서는 삼투압 펌프/저장 시스템과 같은 속도 조절 장치중에 이들을 도입시킬 필요가 있다. 또한 비경구 조성물로서 겔, 페이스트, 미소구, 마이크로캡슐, 이식물 등의 사용가능성이 언급되어 있다.
"성장 호르몬의 안정화"란 명칭의 해밀톤(Hamilton) 등의 미국 특허 제 4,816,568 호는 또한 안정화제의 필요성을 강조하면서 수성 환경에서 성장 호르몬의 가용성 생활성의 보존을 위해 다양한 안정화제가 필요하다고 기재하고 있다.
1990년 6월 20일자로 공개된 유럽 특허 제 0 374 120 호는 수성 용액을 함유하는 조절된 이식가능한 전달 장치의 안정화가 상기 용액중에 폴리올 및 완충제를 혼입시키므로써 달성될 수 있음을 보고하고 있지만, 상기 안정화제가 없는 수성 용액이 주사시 지속성 방출을 제공한다는 증거는 전혀 없었다.
"소마토스타틴의 데카펩티드 유사체"란 명칭의 미국 특허 제 4,118,380 호는 수성 용액중의 가용성이 낮은 염 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 소마토스타틴의 저장 또는 지속성 방출 효과를 제공할 필요성에 대해 보고하고 있다.
"담체 단백질로서 콜라겐, 젤라틴 및/또는 알부민을 갖는 성장 촉진 또는 골대사 펩티드의 지속성 방출 제제"란 명칭의 호주 특허 제 8655983 호 (미국 특허 제 4,774,091 호 및 제 5,021,241 호와 관련)는 단백질 주사제에서 지속성 방출을 얻기 위해서는 담체 단백질이 필요함을 논의하고 있다.
"지속성 방출 주사"란 명칭의 유럽 특허 제 140 255 호 (호주 특허 제 8655983 호와 유사하다)는 단백질 주사로부터 지속성 방출을 얻기 위해 필요한 담체 단백질 뿐만 아니라 물과는 다른, 점성의 용매가 단백질/담체 조성물의 현탁화에 필요하다고 보고하고 있다.
[발명의 개요]
본 발명은 실질적으로 수성인 소의 소마토트로핀 조성물을 당분야에 제공하고, 동물에게 실질적으로 수성인 소의 소마토트로핀 조성물의 비경구 투여, 바람직하게는 피하 또는 근육내 주사에 의해 동물의 순환계중에 생물학적으로 활성인 소마토트로핀을 지속적 방출시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 조성물은 수성 담체중에 약 50 mg/ml 이상의 농도로 생물학적-활성인 소의 소마토트로핀 약 150 mg이상을 포함한다. 수성 bSt 제제는 약 72시간을 초과하는 기간동안 동물의 순환계중에 bSt를 지속적 방출시킨다.
본 발명은 생리 활성 단백질의 지속성 방출을 위해 유용한 신규한 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 소(bovine) 소마토트로핀(somatotropin)의 탁월한 수성의 주사용 지속성 방출 제제를 제공한다. 또한 본 발명은 소 소마토트로핀의 지속성 또는 연장성 방출을 위해 이들 신규한 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
도 1은 표 1에 예시된 10개의 bSt 처리 그룹의 시간에 대한 평균 혈청 bSt의 농도를 나타내고;
도 2는 표 1에 예시된 10개의 bSt 처리 그룹 각각에서 대조군의 암소의 값보다 높게 혈청 bSt 농도를 상승시킨 시간을 나타낸다.
달리 언급하지 않으면, 본 명세서를 통해 조성물의 퍼센트는 중량을 기준으로 하고, 온도는 섭씨를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 "생물학적으로 활성인" 또는 "생활성" 폴리펩티드란 용어는, 동물에 적당한 비경구 투여로 상기 동물의 생물학적 과정에 대해 인식할만한 효과를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 효과는 호르몬적, 영양적, 치료적, 예방적 등일 수 있으며, 자연발생적인 생물학적 과정을 모방하거나 보충하거나 또는 억제할 수 있다. 이러한 효과 및 과정은 아주 상당히 다양하지만, 예로서 식용 동물에서의 성장, 유즙 분비, 알 또는 자손 생산의 자국 및/또는 사료 효율을 언급할 수 있다. 기타 예로는 울, 모피 또는 기타 식용 이외의 동물의 생산물의 생산을 포함한다. 폴리펩티드는 동물에 투여하기 전에 본 발명의 조성에서 활성형태로 존재할 수 있지만, 본원에서 상기 용어는 이러한 투여 이후에 생활성을 전개시키는 폴리펩티드도 또한 포함한다.
본 발명의 조성물은 소에서 소의 소마토트로핀을 지속성 방출시키는데 사용한다. 의 소마토트로핀은 소(예, 소)에서 살코기 대 지방의 비율(lean to fat ratio), 사료 효율, 성장 속도 및 우유 생산을 향상시키는데 유용한 호르몬이다. 본원에서 사용되는 "소의 소마토트로핀"이란 용어는 소의 뇌하수체에서 생성된 소마토트로핀과 거의 유사한 생물학적 활성 및 화학 구조를 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 소의 소마토트로핀은 소의 뇌하수체 소마토트로핀 세포에 의해 생성된 천연 소마토트로핀 및 다르게는 대장균, 기타 박테리아 또는 효모와 같은 유전적으로 형질전환된 미생물에 의해 발현된 소마토트로핀을 포함한다. 이러한 달리 생성된 소마토트로핀은 천연 소마토트로핀과 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 향상된 생물학적 활성 또는 기타 잇점을 제공할 수 있도록 아미노산 서열에서 하나 이상의 변형을 갖는 유사체일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 수중에 약 50 mg/ml 이상의 농도로 용해된 생물학적으로 활성인 소의 소마토트로핀 약 150 mg 이상의 용량으로 bSt를 함유한다. 수중에 약 50 mg/ml 이상의 농도로 용해된 생물학적으로 활성인 bSt의 보다 높은 bSt 용량, 예를 들어 300 mg 또는 심지어 600 mg가 또한 바람직하다. 추가로, 50 mg/ml을 초과하도록 농도를 증가시키는 것은 비경구적으로 주사하는 경우(소의 혈류에서 측정하는 경우) bSt의 지속성 방출을 제공하는데 또한 유리하다.
본 발명의 조성물의 특성중 하나는 생물학적으로 유효한 속도로 생활성 폴리펩티드의 지속성 방출을 제공하는데 흡수 개질제를 필요로 하지 않는다는 것이다. 이들 조성물이 편리하게 장기간 지속성 방출을 제공하고, 상기 양은 관리자 또는 소에게 불편함을 초래할 정도로 크지 않다는 것이 밝혀졌다. 청구된 조성물을 소에 주사하는 것은 비수성 BGH 지속성 방출 제제에 비하여 주사 위치에서 상당히 낮은 조직 자극을 일으킨다. 본 발명의 수성 지속성 방출 제제는 거의 조직을 자극하지 않는 것으로 보고되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 예를 들면 피하 또는 근육내 주사에 의한 비경구 투여에 상당히 유용하다. 지속성 방출의 지속 시간은 폴리펩티드가 목적하는 생물학적 효과에 필요한 속도로 전달되는 시간으로, 통상 동물 순환 혈류중 폴리펩티드의 농도로 표시된다. 지속성 방출의 기간은 약 72시간을 초과하는 것이 바람직하다. 다른 경우, 약 120시간 이상일 수 있으며, 또는 많은 용도를 위해서 보다 바람직하게는 약 144시간 이상일 수 있다.
bSt는 프로펠러 교반기 등으로 수성 담체와 비교적 부드럽게 혼합되는 분말(예, 동결건조되거나 분무건조된)의 형태로 제공될 수 있다. 바람직한 실시태양에서는, 동결건조 또는 분무 건조 전에 단백질 안정화제(예, 폴리소르베이트 80) 및 벌크화제(예, 만니톨)를 bSt/수 용액중에 용해시킨다. 이어서, 이 bSt 조성물을 물과부드럽게 혼합하여 본 발명의 지속성 방출 조성물을 제조한다. 폴리소르베이트 80은 대규모의 가공 또는 재구성시 발생할 수 있는 접촉 변성에 대해 소의 소마토트로핀을 안정화시키기 위해 사용되는 비이온성 계면활성제이다. 예를 들면, 소의 소마토트로핀을 용해 및 동결건조시키기 전에 0.125% w/v의 폴리소르베이트 80을 물에 첨가하여 소마토트로핀을 보호한다. 만니톨과 같은 벌크화제는 재구성을 촉진시킬 수 있다. 완충제(예, 중탄산나트륨) 또는 삼투압 개질제(예, 염화나트륨)와 같은 다른 제제 부형제를 첨가할 수 있지만, 필수 구성성분은 아니다.
본 발명에 따르는 지속성 방출 제제의 하기 특정 실시예는 본 발명을 완전히 이해하도록 돕고, 동 제제의 제조 방법을 제공하지만, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하지않는다.
실시예 1 - 소의 소마토트로핀의 제조 방법
소의 소마토트로핀은 제 WO 87/00204 호에 따라 제조 및 단리시키고, 정제/단리의 최종 단계에서 pH 9 내지 10.5의 상당히 희석된 NaOH 용액에 대해 용액을 투석시키고 교차유동 마이크로여과하여 10 내지 150 mg/ml의 단백질 용액으로 제조하였다. 이들 용액을 멸균 여과시키고, 동결건조시켜 벌크 분말을 제조하였다.
실시예 2 - 제제의 제조 방법
실시예 1의 벌크 동결건조된 소마토트로핀을 수중에 용해시키고, 100 ml 바이알에 넣어 동결건조시켰다. 적당한 양의 물을 바이알에 첨가하여 새로 동결건조된 소마토트로핀을 용해시켜서 바이알중 각 50, 150 또는 250 mg/ml의 농도를 갖는소마토트로핀 용액을 제조하였다. 이들 다른 농도의 소마토트로핀을 주사기중에 충전시켜 주사기당 각 150, 300 또는 600 mg (표 1)의 투여량을 제공하도록 하였다. 다르게는, 실시예 1의 벌크 약물 용액을 직접 바이알에 충전시켜 반복적인 동결건조 단계를 피하였다.
실시예 3 - 주사
임신하지 않고 젖을 분비하지 않는 홀스타인 암소 (가시적으로 평가된 체중 475 kg)를 건조한 부지에서 키우고, 매일 마리수당 35 kg의 알팔파 실리지(alfalfa silage)를 주고; 물은 무제한으로 섭취할 수 있게 하였다. 암소를 무작위로 그룹(그룹당 6마리)으로 나누어 피하 주사를 통해 하기 처리를 하였다 (SR=지속성 방출):
1) 150 mg SR-bSt/50, 3.0 ml 투여량;
2) 150 mg SR-bSt/150, 1.0 ml 투여량;
3) 150 mg SR-bSt/250, 0.6 ml 투여량;
4) 300 mg SR-bSt/50, 6.0 ml 투여량;
5) 300 mg SR-bSt/150, 2.0 ml 투여량;
6) 300 mg SR-bSt/250, 1.2 ml 투여량;
7) 600 mg SR-bSt/50, 12.0 ml 투여랑;
8) 600 mg SR-bSt/150, 4.0 ml 투여량;
9) 150 mg SR-bSt/250, 2.4 ml 투여량;
10) 비주사 (대조군).
모든 제제를 주사량에 따라 3 내지 10 ml의 일회용 주사기와 2.5 cm의 일회용 바늘에 의한 18 게이지를 사용하여 왼쪽 어깨 미부인 늑골상에 피하 주사하였다. 주사하기 전에 주사 부위의 털을 뽑아 조직 반응의 모니터링을 하게 하였다.
주사 부위는 시험 기간중 첫 10일 동안 매일 한 번씩 평가하였다. 주사 부위 모니터링은 주사 후 10일 동안 SR-소마토트로핀이 주사된 동물에서 아무 반응도 관찰되지 않았을 때 중단되었다.
실시예 4 - 혈청 분석
주사후 14일동안 꼬리 정맥을 통해 10 ml 배출관중으로 혈액 (7 ml)을 수집하였다. 주사는 시간 0에서 수행하고, 혈액 샘플을 주사후 0, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 264, 288 및 312 시간에 수집하였다. 혈액을 1시간동안 주위 온도에서 응고시켜 1500X g으로 원심분리시킨 후, 혈청을 분리하여 -20℃에서 저장하였다. 모든 혈청 샘플을 방사능면역분석(RIA) 및 이어서 G.D. 니스완더(Niswander) 등의 문헌 [Endocrinol.84:1166 (1969)]의 절차에 따라 bSt에 대한 분석을 실시하였다.
실시예 5 - 혈청 bSt 상승의 지속시간
표 1에서 10개의 처리 그룹의 시간에 따른 평균 혈청 bSt 농도를 도 1에 예시한다. 다양한 SR-bSt 제제 각각이 대조 암소의 것보다 혈청 bSt 농도를 상승시킬 수 있는 시간을 도 2에 예시한다. 특정한 bSt 농도에서 투여량을 증가시킴에 따라, 혈청 bSt가 대조군보다 높은 채로 유지되는 시간도 증가하는 것이 명백하다(표 2, 도 2). 마찬가지로, bSt 농도를 특정 투여량에서 50 mg bSt/ml부터 250 mg bSt/ml까지 증가시킴에 따라, 역시 혈청 bSt가 대조군보다 높은채로 유지되는 시간 수도 증가하였다 (표 2, 도 2). 시험한 모든 제제는 72시간을 초과한 시간 동안 상승된 평균 혈청 bSt를 제공하였다 (표 2, 도 2). 평균 혈청 bSt를 144시간동안 상승시킬 수 있는 최저 투여량/농도의 조합은 300 mg SR-bSt/150이었다 (표 2, 도 2). 투여량 및 농도 모두를 증가시킨 경우(600 mg SR-bSt/250), 혈청 bSt가 상승된 시간이 216시간까지 연장되었다 (표 2, 도 2).
결과는 투여량 및 농도 사이의 상호작용이 bSt 상승의 지속적 증가로 나타남을 보여준다 (표 2). 구체적으로는 투여량 및 농도 모두의 증가에 대한 효과는 각각 따로 증가되는 경우의 부가 효과에 의해 예견될 수 있는 지속시간에 대한 영향보다 크다. 따라서, 결과는 투여량 및 농도의 증가 사이에는 상승적 상호작용이 있으며, 이것은 소의 순환계중으로의 기대되는 bSt의 지속성 방출보다 훨씬 더 크다는 것을 보여준다.
연구된 bSt 투여량 및 농도의 모든 조합 (처리 그룹 1 내지 9, 표 1)을 사용하여 혈청 bSt 농도를 상당히 상승시키고, 지속성 방출을 제공할 수 있다. 180 mg/ml 미만의 농도는 특히 바람직한 재구성, 주사가능성 및 주입가능 특성을 갖는다.
임의의 이론에 의해 제한되지 않고도, 생체 내에서의 소 소마토트로핀(bSt)의 수성 용액의 지속성 방출은 소의 생리 조건 (pH 7.4 및 39℃)으로 인해 주사 부위에 형성되는 "겔형" bSt 축적질 내에서의 분해와 상기 축적질로부터의 용해의 경쟁적 과정으로 유발되는 것으로 믿어진다. 이러한 믿음으로 단백질 농도 및 bSt의투여량과 같은 인자는 혈청 bSt 농도의 지속에 상당한 영향을 줄 것으로 기대된다. 예를 들어, bSt 농도를 증가시키면 주사용적을 보다 작게 할 수 있는데, 주사용적을 작게 하면 bSt 축적질의 형성을 보다 빠르게 하고 이어서 bSt의 용해가 일어나는 전체 표면적이 보다 작아지도록(즉, 보다 긴 지속시간으로) 유도할 수 있다. bSt 투여량을 증가시키면 주사 부위로부터 bSt 방출의 지속시간동안 주사 부위에서 발생할 수 있는 bSt의 분해를 보충할 수 있도록 여분의 bSt를 제공할 수 있다. 사실상, 이러한 여분은 검출가능한 양의 bSt가 계속 방출되는 시간을 증가시킬 것이다.
본 발명의 특수한 실시태양을 설명하였지만, 당분야의 숙련자는 본 발명의 진의 및 범위에서 벗어나지 않고도 다양한 변형을 이룰 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 하기 특허청구범위는 완전한 발명의 개념 내에서 이러한 모든 변형을 포함하도록 의도된다.
[표 1]
기본 구성 및 제제 설명
a모든 제제는 주사를 위해 수중에 용해된 동결건조 bSt를 포함한다.
b주사하지 않음.
[표 2]
다양한 농도 및 투여량의 SR-bSt의 주사후 방혈 시간에 의한 암소의 혈청bSt 농도(최소 제곱 평균값 (bSt(ng)/혈청(ml))).
ns이 윗첨자가 있는 평균값은 모든 대조군의 평균값 (1.8 ng bSt/ml 혈청)과 크게(P>0.05) 다르지 않다. 대조군의 평균값은 12시간 내지 312시간의 모든 표본 시간에 대한 bSt의 평균 농도이다.

Claims (24)

  1. 수중에 50 mg/ml 이상의 농도로 생물학적 활성의 소(bovine)의 소마토트로핀 150 mg 이상을 포함하는 수성 조성물을 피하 또는 근육내 주사하므로써 소에게 비경구적으로 투여하는 것을 포함하는, 생물학적 활성의 소마토트로핀을 소의 순환계중으로 72시간 초과의 시간동안 지속 방출시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물이 300 mg 이상의 소마토트로핀을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물이 600 mg 이상의 소마토트로핀을 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 농도가 150 mg/ml 이상인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 농도가 250 mg/ml 이상인 방법.
  6. 50 mg/ml 이상의 농도를 갖는 주사가능한 소의 소마토트로핀 수성 용액으로서 소의 소마토트로핀 투여량 150 mg 이상을 소에게 비경구 투여하는 것을 포함하는, 생물학적 활성의 소마토트로핀을 소의 순환계중으로 120시간 이상의 시간동안 지속 방출시키므로써 소의 우유 생산 또는 사료-대-우유 전환 효능을 향상시키는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 투여가 피하 또는 근육내 주사에 의한 것인 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 소의 우유 생산을 7 일 이상의 시간동안 향상시키는 방법.
  9. 50 mg/ml 이상의 농도로 수중의 생물학적 활성의 소의 소마토트로핀 150 mg 이상을 포함하고, 흡수 개질제 및 완충제가 없는, 소의 우유 생산 또는 사료-대-우유 전환 효율을 향상시키기 위한 주사용 약학 조성물.
  10. 150 mg/ml 이상의 농도로 수중의 생물학적 활성의 소의 소마토트로핀 150 mg 이상을 포함하고, 홀수 개질제가 없는, 소의 우유 생산 도는 사료-대-우유 전환 효율을 향상시키기 위한 주사용 약학 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 농도가 250 mg/ml 이상인 조성물.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액이 상기 소마토트로핀 30 mg 이상을 함유하는 조성물.
  13. 제 11 항 항에 있어서,
    상기 용액이 상기 소마토트로핀 600 mg 이상을 함유하는 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서,
    조성물이 150mg/ml 이상의 농도로 소마토트로핀 300mg 이상을 함유하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    조성물이 600mg 이상의 소마토트로핀을 함유하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    농도가 250mg/ml이상인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    농도가 250mg/ml이상인 방법.
  18. 제 4 항, 제 5 항 및 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용액이 흡수 변화성이 없이 120시간 이상 방출되는 방법.
  19. 제 4 항, 제 5 항 및 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용액이 흡수 변화성이 없이 144시간 이상 방출되는 방법.
  20. 제 4 항, 제 5 항 및 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    120시간이 초과되는 시간동안 방출되는 방법.
  21. 제 4 항, 제 5 항 및 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 2 항 또는 제 3 항에 따르는 경우, 144시간이 초과되는 시간동안 방출되는 방법.
  22. 제 1 항 내지 제 5 항 및 제 14 항 및 제 17 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액이 흡수-개질제가 없는 방법.
  23. 50 mg/ml 이상의 농도로 수중의 생물학적 활성의 소의 소마토트로핀 150 mg 이상을 포함하고, 흡수 개질제 및 완충제가 없는, 살코기 대 지방의 비율(lean to fat ratio), 사료 효율, 성장 속도 및 우유 생산을 향상시키기 위한 주사용 약학조성물.
  24. 150 mg/ml 이상의 농도로 수중의 생물학적 활성의 소의 소마토트로핀 150 mg 이상을 포함하고, 흡수 개질제가 없는, 살코기 대 지방의 비율, 사료 효율, 성장 속도 및 우유 생산을 향상시키기 위한 주사용 약학 조성물.
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