JPH09508118A - 水性持続放出性処方 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 望ましい効果レベルで生物活性ウシ・ソマトトロピンを乳牛の循環系に持続して非経口放出させることは、少なくとも約１５０ｍｇの用量で、かつ、少なくとも約５０ｍｇ/ｍlの濃度でウシ・ソマトトロピンが水性液体中に存在する新規な組成物を用いて達成できる。水性ウシ・ソマトトロピン処方は、３日を超える期間、動物の循環系へウシ・ソマトトロピンの徐放を供する。

Description

【発明の詳細な説明】 水性持続放出性処方 発明の背景 本発明は、生物活性蛋白質を徐放させるのに有用な新規な組成物に関する。さ らに特には、本発明は、ウシ・ソマトトロピンの優れた水性の徐放性注射処方を 提供する。また、ウシ・ソマトトロピンを徐々に、かつ持続して放出させるため にこの新規な組成物を使用する方法を提供する。 遺伝子工学の出現により、多種の生物活性ペプチドおよび蛋白質の大スケール の入手が達成された。しかしながら、これらの組換え産生ペプチドおよび蛋白質 の投与には、独特の一連の問題が存在する。多くの場合、これらの蛋白質の生物 学的効果を維持するには、長期の投与を要する。これらの剤の毎日の投与は不便 であるため、徐々に、かつ持続して放出させることが好ましい。 多くの理由のため、担体としての生体適合性油を使用して、蛋白質、詳細には ソマトトロピンを含む多くの薬剤を徐放させることに、技術は長い間焦点を当て てきた。この技術に向けた特許の中には、ミッチェル(Ｍitchell)への米国特許 第５,０１３,７１３号、およびファーガソン(Ｆurguson)らへの米国特許第４,９ ７７,１４０号がある。ミッチェル(Ｍitchell)は、少なくとも約１０重量％の生 物学的に活性なソマトトロピン、および組成物の連続相としてのコーン油のごと き生体適合性油よりなる実質的に非-水性の組成物を用いて、望ましい効果レベ ルのウシ・ソマトトロピン(ｂＳｔ；ＢＧＨ)の持続した非経口放出が達成できる ことを報告している。ファーガソン(Ｆurguson)らは、ｂＳｔ、ワックスおよび 油性物よりなる徐放性処方を注射することにより、長時間にわたって乳牛におけ る毎日の牛乳生産が増加することを報告している。 前記特許は、ソマトトロピンを持続して放出させるために非水性デリバリーシ ステムを用いることに技術が重きを置いていることを説明している。該技術に顕 著に欠けているのは、ｂＳｔを持続して放出させるために、水性処方を使用する ことである。蛋白質、特にソマトトロピンの徐放デリバリー用に水系を用いるこ とを技術が避けてきた理由の中には、長時間水性環境に暴露すると蛋白質は非常 に不安定であるという一般概念がある(ピット(Ｐitt)インターナショナル・ジャ ーナル・オブ・ファーマシューティクス(Ｉnt.Ｊ.Ｐharmaceutics)第５９巻：１７ ３-１９６頁(１９９０年))。また、例えば、吸収モディフィアーおよび粘度誘導 剤によって分子の溶解性を変化させたり、分子の吸収性を変化させる努力をせず には、水性処方を用いて蛋白質またはペプチドを持続して放出させることができ ないと一般的に考えられている。油性物を用いる場合でさえも、ミッチェル(Ｍi tchell)は、生物活性蛋白質のデリバリーシステムに非水和剤をしばしば添加す るか、または該蛋白質を金属または金属化合物と複合体形成させて、動物の血流 への蛋白質の放出を改善させることを報告している。しかしながら、これらの吸 収改善剤の使用は、蛋白質溶解性を変化させ、または粘性を誘導して、組成物の 簡便な注射性を減じ得、かつ/または注射部位における重篤な組織炎症を誘導し 得る。 水性処方の使用に対する技術の偏見の原因を決定して、ｂＳｔのごとき蛋白質 を持続して放出させることは困難であるが、それは、ジェイ・ビイ・ハットン( Ｊ.Ｂ.Ｈutton)(ジャーナル・オブ・エンドクライノロジー(Ｊ.Ｅndocrin.)第１ ６巻、１１５-１２５頁(１９５７年))により行われた研究に基づくことができる 。彼の研究において、ハットン(Ｈutton)は、乳牛の牛乳の収量および組成に対 する、５ｍlセーライン中に溶解した等級付け用量(６.２５、１２.５、２５.０、５ ０.０、１００.０および２００.０ｍｇ)のウシ成長ホルモン(ｂＳｔ)(各々、１. ２５、２.５、５、１０、２０および４０ｍｇ/ｍlの濃度)の皮下注射の効果を研 究している。ハットン(Ｈutton)により研究された主要な指標は牛乳収量におけ る増加であった。ハットン(Ｈutton)は、４日間にわたる平均牛乳収量が投与し たｂＳｔ用量により影響されることを報告した。しかしながら、ハットン(Ｈutt on)は、牛乳収量の増加が全４日間にわたって維持されたといういずれのデータ も示していない。ハットン(Ｈutton)は、単一の５０ｍｇ(１０ｍｇ/ｍl)ｂＳｔ 注射で、４日間牛乳収量が増加すると主張した。しかしながら、ハットン は、この主張がある種の仮定を要する計算に基づいていることを承知していた。 これらの仮定の性質は開示されておらず、彼の主張に関してサポートするいずれ のデータも供されていない。また、ハットン(Ｈutton)は、ｂＳｔ血清レベルに 対する等級付けｂＳｔ用量の影響に関するいずれのデータも示しておらず、高用 量のｂＳｔを高濃度で投与することが、乳牛の循環系へのｂＳｔの徐放性に作用 し得ることも示さなかった。 エル・ジェイ・マックリン(Ｌ.Ｊ.Ｍachlin)が、ハットンおよび他のものの研 究の上に重ねて、乳牛の牛乳生産に対するチロトロフィン(ＴＳＨ)およびプロラ クチンの混入が比較的に無い高い潜在性ｂＳｔ調製物の効果を研究していた際に 、水性処方を使用してｂＳｔの持続した放出を達成するという技術の偏見を克服 する機会が起きた(ジャーナル・オブ・ダイアリー・サイエンス(Ｊ.Ｄairy Ｓci .)第５６巻、５号、５７５-５８０頁(１９７２年))。マックリン(Ｍachlin)は、 ３日毎にｂＳｔを注射する(６０ｍｇ用量、未知濃度、全３回注射)ことが、毎日 同一の全用量を投与した(２０ｍｇ用量、未知濃度、毎日９回注射)のと同様に大 きく牛乳生産を改善することを見い出した。しかしながら、マックリン(Ｍachlin) は、水性の高い潜在性のｂＳｔ調製物の使用が、乳牛の循環系への成長ホルモン の徐放性を起こすか否かは考慮しなかった。事実、マックリン(Ｍachlin)は、「 ホルスタイン乳牛におけるＢＧＨの半減期は１９-２０分間である。したがって 、注射の皮下部位からの吸収において幾分かの遅れがあるにせよ、内因的レベル を超える血漿ＢＧＨの上昇は、注射１２時間後を超えて期待できなかった。かく して、循環するＢＧＨの持続した上昇は、恐らく、該効果を説明していない。」 と述べている。また、マックリン(Ｍachlin)は、水性処方からのｂＳｔの徐放性 に影響するｂＳｔの用量および濃度の間の相互関連も認識しなかった。 マックリン(Ｍachlin)の知見をよりよく理解するために、ボーネ(Ｂourne)ら 、ジャーナル・オブ・ダイアリー・サイエンス(Ｊ.Ｄairy Ｓci.)第６０巻:１６２ ９-１６３５頁(１９７７年)は、同様の用量を皮下注射した後の血清ｂＳｔレベ ルを測定した。ボーネ(Ｂourne)らは、平均血清ｂＳｔ濃度が注射１〜３時間後 に最大に達し、２４時間以内に注射前の濃度に戻ることを観察した。ボーネ(Ｂo urne) らによるこのデータは、２４時間を超えるウシ循環系へのＢＧＨの徐放性に反論 しており、内因的レベルを超える血漿ＢＧＨ中の上昇が注射１２時間後を超えて 期待できないというマックリン(Ｍachlin)による示唆と合致する。 ハットン(Ｈutton)、マックリン(Ｍachlin)およびボーネ(Ｂourne)らの研究の 結果、技術は彼らの研究から焦点をはずした。多くの研究は、一般的に１-１０ ｍｇ/ｍlで５-４５ｍｇの用量の範囲のｂＳｔ濃度で日様式用の水溶液を用いて いた。しかしながら、４８-６０時間を超える顕著なｂＳｔ血清レベルのケース は全く報告されなかった。よって、乳牛の循環系にｂＳｔを持続して放出させる には水性処方は不適当な担体であると技術は仮定し続けた。 本発明は、技術によるこの間違った概念を克服し、かつ、ｂＳｔの徐放性水性 注射処方、および動物の循環系へｂＳｔを徐放または持続して放出させるために この処方を使用する方法を提供する。 情報開示 マックリン,エル・ジェイ(Ｍachlin,Ｌ.Ｊ.)(ジャーナル・オブ・ダイアリー ・サイエンス(Ｊ.Ｄairy Ｓci.)第５６巻、５号、５７５-５８０頁(１９７５年) )マックリン(Ｍachlin)は、９日間にわたって、３日毎にウシ成長ホルモンを注 射(６０ｍｇ用量、全１８０ｍｇ)することにより、同一の全用量を毎日投与した (２０ｍｇ用量、全１８０ｍｇ)のと同しくらい大きく牛乳生産が改善されること を報告している。しかしながら、マックリン(Machlin)は、「ＢＧＨの半減期は 、ホルスタイン乳牛においては１９-２０分である。したがって、注射の皮下部 位からの吸収に幾分遅れがあるにせよ、内因性レベルを超える血漿ＢＧＨの上昇 は注射１２時間後を超えて期待できなかった」と報告している。さらに、マック リン(Ｍachlin)は、動物の循環系への蛋白質の持続して放出させる担体として水 性処方を使用できるか否かという問題は考慮していない。 ハットン,ジェイ・ビイ(Ｈutton,Ｊ.Ｂ.)(ジャーナル・オブ・エンドクライノ ロジー(Ｊ.Ｅndocrin.)第１６巻、１１５-１２５頁(１９５７年))は、乳牛の牛 乳の収量および組成に対して成長ホルモンが作用し得ることを報告している。ハ ッ トン(Ｈutton)は、４日間にわたる平均牛乳収量が、投与したｂＳｔの用量によ って影響されることを報告した。しかしながら、ハットン(Ｈutton)は全４日間 にわたって牛乳収量の増加が維持されたといういずれのデータも示さなかった。 また、ハットン(Ｈutton)は、ｂＳｔ血清レベルに対する等級付けｂＳｔ用量の 影響に関するいずれのデータも示しておらず、あるいは、高濃度で投与した高用 量のｂＳｔが乳牛の循環系へのｂＳｔの徐放性に作用し得ることも示さなかった 。 ヘイジマン(Ｈageman)ら、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・ フード・ケミストリー(Ｊ.Ａgric.Ｆood Ｃhem.)第４０(２)巻、３４８頁(１９ ９２年)は、ソマトトロピンを効率的にデリバリーするための徐放性投与量形態 の開発は、水、特にｐＨ７.４で３７℃の生理条件に暴す際の蛋白質の不安定性 によって複雑になることを報告している。 ボーネ(Ｂourne)ら、ジャーナル・オブ・ダイアリー・サイエンス(Ｊ.Ｄairy Ｓci.)第６０巻：１６２９-１６３５頁(１９７７年)は、５ｍl水性媒質中の１０ 、５０および１００ｍｇ用量の皮下注射後の平均血清ｂＳｔレベルが、注射１〜 ３時間後に最大レベルに達し、２４時間以内に注射前の濃度に戻ることを報告し ている。 ピット(Ｐitt)、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ファーマシューティ クス(Ｉnt.Ｊ.Ｐharmaceutics)第５９巻：１７３-１９６頁(１９９０年)は、高 蛋白質濃度の水性環境下で非常に不安定であるソマトトロピンのごとき蛋白質の 非経口徐放性デリバリー・システムの開発における困難性を報告している。 １９９１年５月７日に発行されたミッチェル(Ｍitchell)への米国特許第５,０ １３,７１３号は、少なくとも約１０重量％の生物学的に活性なソマトトロピン および組成物の連続相として生体適合性油の実質的に非-水性の組成物の動物へ の非経口投与によって、動物の循環系に生物学的に活性なソマトトロピンを持続 して放出させる方法を開示している。ミッチェル(Ｍitchell)は、放出を加速さ せないためには彼の組成物が非水性でなければならないことを強調している。 １９９０年１２月１１日に発行されたファーガソン(Ｆerguson)への米国特許 第４,９７７,１４０号は、８-２０％のワックスおよび８０-９２％の油性物より なる担体中に懸濁した１０-２５％ウシ・ソマトトロピンよりなる処方２〜１０ ｇを乳牛に注射することによって、乳牛からの日牛乳生産を２８日間増加させる 方法を開示している。ファーガソン(Ｆerguson)らは、持続して放出させる担体 として水性処方を用いることができるか否かの問題は考慮していない。 １９８７年２月２５日に公開された欧州特許出願第０ ２１１ ６０１号は、水 、成長促進ホルモン(例えば、ウシ成長ホルモン)および安定化剤としてのポリオ キシエチレンブロック共重合体の混合物よりなる、動物投与用の動物成長促進組 成物を開示している。好ましい組成物は、５０-９９.９重量％の水、０.０５-１ ０重量％の成長ホルモンおよび０.０５-５０重量％のブロック共重合体を含んで いる。この参照は、ブロック共重合体が組成物中に存在することによって、保存 の間の固形物沈殿およびホルモンの失活が阻害されるということを報告している 。また、該共重合体は、注射部位の３７℃に暴した場合によく知られているゾル -ゲル転移を起こすその能力により、成長ホルモンを徐放させ；よって、蛋白質 を徐々に放出させるためのイン・サイチュ(in situ)形成マトリックスを供する 。 アレンド(Ａrendt)への(南アフリカ国特許第９１２２３９号と同様の)米国特 許第５,１６９,８３４号は、８１-９６.５重量％の生物学的に活性な薬剤（例え ば、ソマトトロピン)よりなる凍結乾燥生成物、ならびに全緩衝系濃度が１５.２ 重量％を超えずに、０.１-７.６重量％の炭酸ナトリウムおよび７.６-１５重量 ％の重炭酸ナトリウムよりなる緩衝系を開示している。処方化粉末は、小バイア ル中のセーライン溶液で復元して、所望の濃度を形成させる。この特許は、毎日 投与する観点からのみ水溶液の有用性を記載しており、生物活性薬剤の持続した 放出への潜在的使用は全く示唆していない。 ジャンスキ(Ｊanski)への米国特許第４,８８８,４１６号は、強く結合したイ オン性洗剤でコートした乾燥安定化生物活性蛋白質生成物を開示している。報告 によれば、イオン性洗剤で蛋白質をコートすることにより、体液と接触した場合 にその生物活性および溶解性が維持されるように、該蛋白質が安定化される。 １９８６年９月１０日に公開された欧州特許第０ １９３ ９１７号は水-溶性 または水-分散性の炭化水素ポリマー(例えば、デキストラン；デキストリン；ア ルギン酸；植物性ガム；もしくはセルロース、またはそれらの混合物)、および ウシ・ソマトトロピンのごとき生物学的に活性な高分子よりなり、徐々に放出す る特性を有する生物学的に活性な組成物を開示している。これらの水性調製物が ソマトトロピンの血液レベルを持続させるには、炭化水素ポリマーとの複合体形 成を使用することを要する。 タイル(Ｔyle)への米国特許第４,８５７,５０６号は、多層乳化、すなわち、 油/水/油乳化へ取り込ませる際に徐放性が得られるソマトトロピンを含有する水 性内部相(internal phase)を記載している。 １９９０年１月３１日に公開された欧州特許第０ ３５３ ０４５号は、安定化 剤を含む水溶液の使用を報告しているが、徐放性には、それらが速度制御装置、 すなわち、浸透ポンプ(osmotic pump)/貯蔵系(reservoir sustem)に取り込まれ ることを要する。また、非経口組成物として、ゲル、ペースト、マイクロスフェア 、マイクロカプセル、注入他の潜在的な使用についても記載している。 「成長ホルモンの安定化(Ｓtabilization of growth hormones)」なる標題のハ ミルトン(Ｈamilton)への米国特許第４,８１６,５６８号は、水性環境下で成長 ホルモンの分解生物活性を維持するには種々の安定化剤が必要であることを記載 しており、再度、安定化剤の必要性を強調している。 １９９０年６月２０に公開された欧州特許第０ ３７４ １２０号は、水溶液を 含有する注入制御デリバリー装置の安定化が、ポリオールおよび緩衝液を該溶液 に取り込ませることによって達成できることを報告しているが、かかる安定化剤 なしに該水溶液を注射の際に徐放させることができたという事実は全く供されて いない。 「ソマトスタチンのデカペプチド・アナログ(Ｄecapeptide analogs of somatost atin)」なる標題の米国特許第４,１１８,３８０号は、ソマトスタチンの貯蔵ま たは徐放効果を供するには、低溶解性の塩または医薬上許容される担体を水溶液 で用いることが必要であることを報告している。 「担体蛋白質としてコラーゲン、ゼラチンおよび/またはアルブミンを含む成 長促進または骨代謝ペプチドを徐々に放出する調製物(Ｓlow release preparati on of growth promoting or bony metabolism peptide- with collagen,gelatin and/or albumin as carrier protein)」なる標題の(米国特許第４,７７４,０９ １号および第５,０２１,２４１号に関連する)オーストラリア国特許第８６５５ ９８３号は、蛋白質注射物からの徐放性を得るには担体蛋白質が必要であると論 じている。 「徐放性注射物(Ｓustained-release injections)」なる標題の(オーストラリ ア国特許第８６５５９８３号と同様の)欧州特許第１４０ ２５５号は、蛋白質注 射物から徐放性を得るのに、蛋白質担体が必要であるのみならず、蛋白質/担体 組成物の懸濁には、粘性溶媒、非水物(unlike water)も必要であることを報告し ている。 発明の概要 本発明は、実質的に水性のウシ・ソマトトロピン組成物、ならびに動物に該実 質的に水溶のウシ・ソマトトロピン組成物を非経口投与、好ましくは、皮下もし くは筋肉内注射することによって、生物学的に活性なソマトトロピンを動物の循 環系に持続して放出させる方法を提供する。該組成物は、少なくとも約５０ｍｇ/ ｍlの濃度にて、水性担体中の少なくとも約１５０ｍｇの生物学的に活性なウシ ・ソマトトロピンよりなる。水性ｂＳｔ処方は、約７２時間を超えて、動物の循 環系にｂＳｔを徐放する。 図面の簡単な説明 図１は、表１に掲載した１０群のｂＳｔ処理群の時間にわたる平均血清ｂＳｔ 濃度を図示している。 図２は、表１に掲載した１０群の各ｂＳｔ処理群が対照雌ウシのものを超えて 血清ｂＳｔ濃度を上昇できた時間の長さを図示している。 詳細な説明 本明細書全体を通して、特に指摘しない限り、組成物の％は重量％であり、温 度は℃である。 本明細書に用いるごとく、明細書中の「生物学的に活性な」または「生物活性 」ポリペプチドなる語は、動物に適当に非経口投与した後、その動物の生物学的 プロセスに対して明白な効果を有するポリペプチドを意味する。該効果とは、ホ ルモン的、栄養的、治療的、予防的他となり得、自然に起こる生物学的プロセス を模倣、補強または阻害し得る。膨大な種類のかかる効果およびプロセスがある が、食品用動物における成長、泌乳、産卵もしくは繁殖の刺激および/または食 餌効率を例示的に記載できる。他の例には、羊毛、毛皮または非-食品動物産物 の生産が含まれる。ポリペプチドは、動物に投与する前は本発明の組成物中にそ の活性形態で存在し得るが、本明細書中の該語には、かかる投与後に生物活性を 発揮するポリペプチドも含まれる。 本発明の組成物は、子ウシにおけるウシ・ソマトトロピンの持続した放出に用 いる。ウシ・ソマトトロピンは、子ウシ(例えば、乳牛)における赤身肉-脂肪比 、食餌効率、成長速度および牛乳生産を向上するのに有用なホルモンである。本 明細書で用いるごとく、「ウシ・ソマトトロピン」なる語は、乳牛の下垂体で産 生されるソマトトロピンと実質的に同様な生物学的活性および化学構造を有する ポリペプチドを意味する。かかるウシ・ソマトトロピンには、ウシ下垂体の身体 親和性細胞によって産生される天然のソマトトロピン、および別法として、イー ・コリ(Ｅ.coli)、他の細菌もしくは酵母のごとき遺伝的に形質転換した微生物 によって発現されたウシ・ソマトトロピンが含まれる。かかる別法として産生さ れたソマトトロピンは、天然ソマトトロピンと同一のアミノ酸配列を有し得、あ るいは、生物学的活性の向上または他の利点を供し得るアミノ酸配列中に１また はそれを超える変形を有するアナログとなり得る。 本発明の組成物には、少なくとも約５０ｍｇ/ｍlの濃度にて、少なくとも約１ ５０ｍｇの生物学的に活性なｂＳｔを水に溶解した用量レベルのウシ・ソマトト ロピン(ｂＳｔ)が含まれる。また、より高用量のｂＳｔ、例えば、少なくとも約 ３００ｍｇ、または６００ｍｇもの生物学的に活性なｂＳｔを水に溶解して、 少なくとも約５０ｍｇ/ｍlの濃度とするのが望ましい。くわえて、５０ｍｇ/ｍl を超えて濃度を増加させることも、(子ウシの血流中で測定して)非経口注射した 場合のｂＳｔを持続して放出させるのに有利である。 本発明の組成物の特性の中には、それが、生物学的に有効な速度で生物活性ポ リペプチドを持続して放出させるために、吸収改善剤を要しないことがある。こ れらの組成物が都合よく長時間にわたって徐放性を供すること、およびかかる量 が投与する者または乳牛に不都合を生じるほど多くないことが判明した。子ウシ へ特許請求する組成物を注射すると、非-水性ＢＧＨ徐放性処方に比して、極め て低い組織炎症を注射部位に引き起こす。本発明の水性徐放性処方にあっては、 ほとんどないしは全く組織炎症が記録されていない。 前記したごとく、本発明の組成物は、例えば皮下または筋肉内注射による、非 経口投与に魅力ある有用性を有する。持続した放出の期間は、典型的には、動物 の循環する血流中のポリペプチドの濃度によって示される所望の生物学的効果に 要する速度でポリペプチドがデリバリーされる間の時間である。持続した放出の 期間は、望ましくは少なくとも約７２時間より長い。他の場合においては、少な くとも約１２０時間となり得、またはさらに望ましくは多くの適用に少なくとも 約１４４時間となり得る。 ｂＳｔは、プロペラ撹拌機他でのごとく、水性担体と比較的温和に混合した粉 末形態(例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥)で提供できる。好ましい具体例におい て、凍結乾燥または噴霧乾燥する前に、蛋白質安定化剤(例えば、ポリソルベー ト(polysorbate 80))および増量剤(例えば、マンニトール)をｂＳｔ/水溶液に溶 解する。ついで、このｂＳｔ組成物を水と温和に混合して、本発明の持続して放 出する組成物を形成させる。ポリソルベート８０とは、大スケールの加工または 復元の間に発生し得る、界面変性してゆくウシ・ソマトトロピンを安定化するた めに用いる非イオン性界面活性剤である。例えば、ウシ・ソマトトロピンを溶解 し凍結乾燥して該ソマトトロピンを保護する前の水に、０.１２５％(ｗ/ｖ)のポ リソルベート８０を水に添加することができる。マンニトールのような増量剤は 復元を促進することができる。緩衝剤(例えば、重炭酸ナトリウム)のごとき他の 処方賦形剤、または張力改善剤(例えば、塩化ナトリウム)も添加できるが、必要 ない。 本発明による徐放性処方の以下の特定の例は、本発明およびその処方の製法を 読者に十分に理解させるために供するものであって、本発明の範囲を限定するこ とを意図するものではない。 実施例１-ウシ・ソマトトロピンの調製 ウシ・ソマトトロピンは、ｐＨ９-１０.５の非常に希薄なＮａＯＨ溶液に対し て溶液を透析し、クロスフロー(crossflow)マイクロ濾過して１０-１５０ｍｇ/ ｍlの範囲の蛋白質溶液を得る精製/単離の最終工程について、ＷＯ８７/００２ ０４号に従って調製し単離した。これらの溶液を滅菌濾過し、凍結乾燥してバル ク粉末を得た。 実施例２-処方の調製 実施例１からのバルク凍結乾燥ソマトトロピンを水に溶解し、１００ｍlバイ アルに入れ、凍結乾燥した。適量の水をバイアルに添加し、新たに凍結乾燥した ソマトトロピンを溶解して、バイアル中に５０、１５０または２５０ｍｇ/ｍlの いずれかの濃度を有するソマトトロピン溶液を製造した。これらの異なる濃度の ソマトトロピンを注射器に充填し、注射器当たり１５０、３００または６００ｍｇ のいずれかの用量を得た(表１)。別法として、実施例１からのバルク薬剤溶液を バイアルに直接充填して、重複する凍結乾燥工程を回避することができた。 実施例３-注射 非-妊娠、非-泌乳のホルスタイン雌ウシ(４７５ｋｇ体重と実質的に概算され る)を草木のない家畜の囲い地で飼育し、３５ｋｇ/頭/日のアルファルファ・サ イレージを摂取させた；水は自由に消費できた。雌ウシを無作為に群(群当たり ６匹)に割り当てて、皮下注射を介した以下の処理を受けさせた(ＳＲ＝徐放性) ： １）１５０ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/５０、３．０ｍl用量； ２）１５０ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/１５０、１.０ｍl用量； ３）１５０ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/２５０、０.６ｍl用量； ４）３００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/５０、６.０ｍl用量； ５）３００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/１５０、２.０ｍl用量； ６）３００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/２５０、１.２ｍl用量； ７）６００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/５０、１２.０ｍl用量； ８）６００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/１５０、４.０ｍl用量； ９）６００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/２５０、２.４ｍl用量； １０）注射せず(対照) 全ての処方は、注射容量に応じて、３〜１０ｍlのディスポーザブル注射器と ２.５ｃｍディスポーザブル注射針による１８ゲージを用いて肋骨、尾部から左 肩上にわたって皮下注射した。注射する前に注射部位の毛を刈り取ることにより 、組織反応をモニターすることができた。注射部位は、実験の最初の１０日間は 毎日１回評価した。注射部位のモニターは、注射１０日後にいずれのＳＲ-ソマ トトロピン注射動物にも反応が全く認められない場合に打ち切った。 実施例４−血清アッセイ 注射後１４日間、尾部血管を介して血液(７ｍl)を１０ｍl真空管に採取した。 注射は０時間に投与し、血液試料は注射０、１２、２４、３６、４８、７２、９ ６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４、２８８および ３１２時間後に採取した。血液を常温にて１時間凝固させ、１５０×ｇにて遠心 し、その血清をデカンテーションして-２０℃にて保存した。ジイ・ディ・ニス ワンダー(Ｇ.Ｄ.Ｎiswander)ら、エンドクライノロジー(Ｅndocrinol.)第８４巻 ：１１６６頁(１９６９年)の方法に従うラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって 、全ての血清試料をｂＳｔにつきアッセイした。 実施例５−血清ｂＳｔ上昇の期間 表１の１０処理群の時間にわたる平均血清ｂＳｔ濃度を図１に掲載する。対照 雌ウシのものを超えて血清ｂＳｔ濃度を上昇できる種々の各ＳＲ-ｂＳｔ処方の 時間の長さを図２に図示する。特定のｂＳｔ濃度内で用量を増加させるに従って 、血清ｂＳｔが対照を超えて上昇したままの時間数も増加することが明らかであ る(表２、図２)。同様にして、特定の用量内でｂＳｔ濃度を５０ｍｇ ｂＳｔ/ｍ lから２５０ｍｇ ｂＳｔ/ｍlに上昇するに従って、血清ｂＳｔが対照を超えて上 昇する時間数も増加した(表２、図２)。試験した全ての処方は、７２時間よりも 長い間平均血清ｂＳｔを上昇させた(表２、図２)。平均血清ｂＳｔを１４４時間 上昇させることができた最低用量/濃度の組合せは、３００ｍｇＳＲ-ｂＳｔ/１ ５０(表２、図２)であった。用量および濃度の両方を増加させる（６００ｍｇＳ Ｒ-ｂＳｔ/２５０)と、血清ｂＳｔの時間の延長も２１６時間まで増加した(表２ 、図２)。 これらの結果は、用量および濃度の間の相互作用がｂＳｔ上昇の期間の増加を 起こしたことを示している(表２)。特に、用量および濃度の両方の増加の効果は 、各々１つを別々に増加させた相加的な効果によって予想されるよりも、期間に 対してより大きな影響を有している。したがって、該結果は、乳牛の循環系への ｂＳｔの予想された徐放性よりも大きくなる、用量と濃度の増加の間の相乗的な 相互作用効果が存在することを示している。 実験したｂＳｔ用量および濃度の全ての組合せ(処理群１-９、表１)を用いて 、血清ｂＳｔ濃度を顕著に上昇させることができ、徐放性を供することができた 。１８０ｍｇ/ｍl未満の濃度は、特に好ましい復元特性、相乗特性および注射特 性を有していた。 いずれかの理論によって束縛されることは望まないが、イン・ビボ(in vivo) におけるウシ・ソマトトロピン(ｂＳｔ)の水溶液の徐放性は、乳牛の生理条件( ｐＨ７．４および３９℃)により注射部位に形成される「ゲル様」ｂＳｔ貯留槽 内の分解の拮抗的プロセスおよび該貯留槽からの分離によって記録されるという ことが本発明者らの信条である。得られたこの信条、蛋白質濃度およびｂＳｔ用 量のごとき因子は、血症ｂＳｔレベルの期間に劇的に影響すると予想されよう。 例えば、ｂＳｔ濃度を増加すると、恐らく、より迅速なｂＳｔ貯留槽の形成を導 き、かつ続いてｂＳｔの分離が起こるより小さな全体表面積を導くであろう(す なわち、より長い期間を導く)少量の注射容量とすることができる。ｂＳｔ用量 を増加させると、部位からｂＳｔが放出される期間にわたって注射部位に生じ得 るｂＳｔの分解を補う過剰量のｂＳｔを供するであろう。事実、過剰性は、検出 可能な量のｂＳｔが放出され続ける時間増加した。 本発明の特定の具体例を記載したが、当業者であれば、本発明の真の趣旨およ び範囲から離れることなしに、その種々の変形を創製できることは自明であるに ちがいない。したがって、以下の請求の範囲は、十分に発明概念内のかかる全て の変形をカバーすることを意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも約５０ｍｇ/ｍl濃度にて、水中の少なくとも約１５０ｍｇの生 物学的に活性なウシ・ソマトトロピンよりなる実質的に水性のウシ・ソマトトロ ピン組成物の皮下または筋肉内注射によって動物に非経口投与することを特徴と する動物の循環系へ生物学的に活性なソマトトロピンを約７２時間を超えて持続 して放出させる方法。 ２．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約３００ｍｇのウシ・ソ マトトロピンよりなる請求項１記載の方法。 ３．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約６００ｍｇのウシ・ソ マトトロピンよりなる請求項２記載の方法。 ４．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約１５０ｍｇ/ｍlの濃度 を有する請求項１記載の方法。 ５．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも３００ｍｇ用量のウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項４記載の方法。 ６．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも６００ｍｇ用量のウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項５記載の方法。 ７．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約２５０ｍｇ/ｍlの濃度 を有する請求項１記載の方法。 ８．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも３００ｍｇ用量のウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項７記載の方法。 ９．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも６００ｍｇ用量のウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項８記載の方法。 １０．水性のウシ・ソマトトロピン溶液が吸収改善剤を実質的に欠いている請 求項１記載の方法。 １１．少なくとも約１５０ｍｇ/ｍl濃度にて、水中の少なくとも約１５０ｍｇ の生物学的に活性なウシ・ソマトトロピンよりなる実質的に水性のウシ・ソマト トロピン組成物の皮下または筋肉内注射によって動物に非経口投与することを特 徴とする動物の循環系へ生物学的に活性なソマトトロピンを約１２０時間を超え て持続して放出させる方法。 １２．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約３００ｍｇのウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項１１記載の方法。 １３．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約６００ｍｇのウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項１２記載の方法。 １４．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約２５０ｍｇ/ｍlの濃 度を有する請求項１１記載の方法。 １５．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも３００ｍｇ用量のウシ ・ソマトトロピンよりなる請求項１４記載の方法。 １６．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも６００ｍｇ用量のウシ ・ソマトトロピンよりなる請求項１５記載の方法。 １７．水性のウシ・ソマトトロピン溶液が吸収改善剤を実質的に欠いている請 求項１１記載の方法。 １８．少なくとも約１５０ｍｇ/ｍl濃度にて、水中の少なくとも３００ｍｇの 生物学的に活性なウシ・ソマトトロピンよりなる実質的に水性のウシ・ソマトト ロピン組成物の皮下または筋肉内注射によって動物に非経口投与することを特徴 とする動物の循環系へ生物学的に活性なソマトトロピンを約１４４時間を超えて 持続して放出させる方法。 １９．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約６００ｍｇのウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項１８記載の方法。 ２０．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約２５０ｍｇ/ｍlの濃 度を有する請求項１８記載の方法。 ２１．水性のウシ・ソマトトロピン組成物が少なくとも約６００ｍｇのウシ・ ソマトトロピンよりなる請求項２０記載の方法。 ２２．水性のウシ・ソマトトロピン溶液が吸収改善剤を実質的に欠いている請 求項１８記載の方法。 ２３．少なくとも５０ｍｇ/ｍlの濃度を有する注射性水性ウシ・ソマトトロピ ン溶液を乳牛に非経口投与することよりなるウシへのソマトトロピンの単一投与 により、少なくとも約１２０時間の期間乳牛の循環系に生物学的に活性なソマト トロピンを持続して放出させることによって乳牛の牛乳生産または食餌-牛乳変 換効率を向上させる方法。 ２４．組成物を皮下また筋肉内注射によって投与する請求項２３記載の方法。 ２５．単一投与により少なくとも約７日間乳牛の牛乳生産が向上する請求項２ ４記載の方法。 ２６．注射用水性ウシ・ソマトトロピン溶液を形成するために、少なくとも約 ５０ｍｇ/ｍlの濃度にて、水中の少なくとも約１５０ｍｇの生物学的に活性なウ シ・ソマトトロピンよりなり、該溶液が吸収改善剤および緩衝化剤を実質的に欠 いている医薬組成物。 ２７．溶液が少なくとも約３００ｍｇの生物学的に活性なウシ・ソマトトロピ ンを含んでいる請求項２６記載の組成物。 ２８．溶液が少なくとも約６００ｍｇの生物学的に活性なウシ・ソマトトロピ ンを含んでいる請求項２７記載の組成物。 ２９．注射用水性ウシ・ソマトトロピン溶液を形成するために、少なくとも約 １５０ｍｇ/ｍlの濃度にて、水中の少なくとも約１５０ｍｇの生物学的に活性な ウシ・ソマトトロピンよりなり、該溶液が吸収改善剤を実質的に欠いている医薬 組成物。 ３０．溶液が少なくとも約３００ｍｇの生物学的に活性なウシ・ソマトトロピ ンを含んでいる請求項２９記載の組成物。 ３１．溶液が少なくとも約６００ｍｇの生物学的に活性なウシ・ソマトトロピ ンを含んでいる請求項３０記載の組成物。 ３２．注射用水性ウシ・ソマトトロピン溶液を形成するために、少なくとも約 ２５０ｍｇ/ｍlの濃度にて、水中の少なくとも約１５０ｍｇの生物学的に活性な ウシ・ソマトトロピンよりなり、該溶液が吸収改善剤を実質的に欠いている医薬 組成物。 ３３．溶液が少なくとも約３００ｍｇの生物学的に活性なウシ・ソマトトロピ ンを含んでいる請求項３２記載の組成物。 ３４．該溶液が少なくとも約６００ｍｇの生物学的に活性なウシ・ソマトトロ ピンを含んでいる請求項３３記載の組成物。