DE69424051T2

DE69424051T2 - Rapamycin-derivat mit antimikrobe, antikrebs und immunomodulatorischer aktivität

Info

Publication number: DE69424051T2
Application number: DE69424051T
Authority: DE
Inventors: Douglas Ford
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1993-07-31
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 2000-09-14
Anticipated expiration: 2014-07-26
Also published as: US5712129A; JPH09501563A; DE69424051D1; EP0711297A1; EP0711297B1; WO1995004060A1; GB9315914D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verbindung sowie Derivate davon, Verfahren zu deren Herstellung, pharmazeutische Formulierungen, die diese enthalten, deren Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere bei der Behandlung mikrobieller Infektionen, und auch deren Verwendung als immunmodulatorische Mittel.
Rapamycin ist eine bekannte Verbindung, sie wurde zuerst als ein Extrakt des Pilzes Streptomyces hygroscopicus isoliert und es wurde berichtet, dass sie eine antimycotische Wirkung besitzt (Britisches Patent 1436447). Später wurde Rapamycin als ein Immunsuppressivum erkannt (Martel R. R. et al. Can. J. Physiol. Pharmacol. 55. 48-51, 1977).
Es wurde von einer großen Anzahl von Mikroorganismen gefunden, dass sie eine Reihe von Verbindungen erzeugen, die später isoliert wurden und von denen gezeigt wurde, dass nützliche therapeutische Eigenschaften besitzen. Ebenso wurden neue Verbindungen durch Inkubierung oder Kultivierung eines Mikroorganismus in Gegenwart von bekannten Verbindungen erhalten. Eine solche neue Verbindung ist 42-O-Demethylrapamycin. Von dieser neuen Verbindung wurde gefunden, dass sie nützliche antimikrobielle, Antikrebs- und immunmodulatorische Wirkung besitzt.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung 42-O-Demethylrapamycin und Derivate davon bereit.
Die Erfindung stellt in einer zweiten Ausführungsform ferner ein Verfahren zur Herstellung von 42-O-Demethylrapamycin bereit, das das Inkontaktbringen eines Mikroorganismus mit Rapamycin und anschließend das Isolieren von 42-O-Demethylrapamycin oder Derivaten davon aus dem Inkubationsmedium umfasst.
Gegebenfalls umfasst das Verfahren die Trennung der Substanz oder Verbindung oder eines Derivates davon von einer Lösung derselben im Gemisch mit anderen antibakteriellen Wirkstoffen und/oder inaktiven Substanzen durch Adsorption an ein absorbierendes Harz.
Es wird angenommen, dass 42-O-Demethylrapamycin die in der Formel (I) angegebene Struktur besitzt:
Diese Verbindung wird hier nach dem Nummerierungssystem von J. Findlay et al., Can. J. Chem. (1980) 58, 579 als 42-O-Demethylrapamycin bezeichnet. Nach dem jüngeren Nummerierungssystem von J. Mc Alpine et al. J. Antibiotics (1991) 44, 688 wäre sie jedoch als 39-O-Demethylrapamycin bekannt.
In Anlehnung an das Nummerierungssystem gemäß den Chemical Abstracts (11th Cumulative Index 1982-86, Seite 60719CS) würde die erfindungsgemäße Verbindung 41-O- Demethylrapamycin genannt werden.
Die Verbindung in Formel (I) weist folgende Merkmale auf:
(i) sie besitzt ein durch schnelle Atombeschuss-Massenspektroskopie (fast atom bombardment (FAB) mass spectroscopy) bestimmtes offensichtliches Molekulargewicht von 899;
(ii) sie ist durch Kultivierung von Streptomyces NCIMB 40515 in Gegenwart von Rapamycin und Gewinnung von 42-O-Demethylrapamycin oder eines Derivates davon aus dem Kulturmedium erhältlich;
(iii) die ¹³C-NMR-Spektroskopie zeigt 50 Kohlenstoffatome im Molekül;
(iv) sie zeigt antimycotische Wirkung;
(v) sie zeigt immunmodulatorische Wirkung.
Die Bezeichnung "Kultivierung" (sowie Ableitungen dieser Bezeichnung), wie sie hier verwendet wird, bedeutet das absichtliche aerobe Wachsen eines Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Mineralsalzen. Ein solches aerobes Wachsen kann in einem festen oder halbfesten Nährmedium oder in einem flüssigen Medium stattfinden, in dem die Nährstoffe gelöst oder suspendiert sind. Die Kultivierung kann an einer aeroben Oberfläche oder durch eine Suspensionskultur stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt oder chemisch definiert sein.
Es wurde gefunden, dass für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Mikroorganismen Bakterienstämme einschließen, die zu der Gattung Streptomyces gehören und die 42-O-Demethylrapamycin erzeugen können. Weiterhin wurde gefunden, dass ein Beispiel für einen solchen Stamm die aus der Natur isolierte Spezies NCIMB 40515 sowie auch deren Mutanten ist.
Die Bezeichnung "Mutant", wie sie hier verwendet wird, schließt jeden Mutantenstamm ein, der sich spontan oder durch eine Wirkung eines externen Mittels bildet, unabhängig davon, ob dieses Mittel absichtlich oder anderweitig angewendet wird. Zu geeigneten Verfahren für die Erzeugung von Mutantenstämmen gehören die von H. I. Adler in "Techniques for the Development of Microorganisms" in "Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms", Proceedings of a Symposium, Wien, 1973, S. 241, International Atomic Energy Authority, dargelegten Verfahren, einschließlich:
(i) Ionisierende Bestrahlung (z. B. Röntgen- und Gammastrahlung), UV-Licht, UV-Licht plus photosensibilisierendes Mittel (z. B. 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidinbasenanaloga (z. B. 5-Bromuracil), Acridine, Alkylierungsmittel (z. B. Senfgas, Ethylmethansulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Hitze und
(ii) genetische Techniken, einschließlich zum Beispiel Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogensierung, lysogene Überführung, Protoplastenfusion und selektive Verfahren für Spontanmutanten.
Unter Verwendung von Verfahren von Becker B., Lechevalier M. P., Gordon R. E., Lechevalier H. A., 1964, Appl. Microbiol., 12, 421-423 und Williams S. T., Goodfellow M., Wellington E. M. H., Vickers J. C., Alderson G., Sneath P. H. A., Sackin, M. J. und Mortimer M., 1983, J. Gen. Microbiol. 129, 1815-1830 wurde die Spezies NCIMB 40515 als ein zuvor unveröffentlichter atypischer Stamm von Streptomyces identifiziert und stellt daher einen Teil der vorliegenden Erfindung dar, insbesondere in biologisch reiner Form. Sie wurde in den National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (N. C. I. M. B.), Aberdeen, Scotland unter der Nr. NCIMB 40515 am 7. Juli 1992 hinterlegt.
Das Medium für die Kultivierung der Spezies NCIMB 40515 enthält geeigneterweise Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff zusammen mit anorganischen Salzen. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Fleischextrakte, Baumwollsamen, Mehl, Malz, getrocknete Brennereilösungen, Aminosäuren, Proteinhydrolysate, sowie Ammonium- und Nitratstickstoff. Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Glukose, Lactose, Maltose, Stärke und Glycerin. Ein geeignetes Kulturmedium enthält sowohl Alkalimetallionen (zum Beispiel Natrium), Halogenionen (zum Beispiel Chlorid) und Erdalkalimetallionen (zum Beispiel Calcium und Magnesium) als auch Spurenelemente, wie Eisen und Kobalt.
Die Kultivierung kann geeigneterweise bei einer Temperatur von etwa 20 bis 35ºC, vorteilhafterweise von 20 bis 30ºC ausgeführt werden und die Kultur kann geeigneterweise bis zu 7 Tagen, vorteilhafterweise etwa 3 bis 5 Tage mit Rapamycin in Kontakt gebracht werden, um nach der Isolierung, zum Beispiel wie nachstehend beschrieben, eine optimale Ausbeute des gewünschten Produkts zu erhalten.
Das gewünschte Produkt oder ein Derivat davon kann aus dem Kulturmedium gewonnen, aufgearbeitet und gereinigt werden, indem herkömmliche Techniken für solche Verbindungen verwendet werden. Alle solche Isolierungs- und Reinigungsverfahren können günstigerweise bei kühlen bis Umgebungstemperaturen ausgeführt werden, zum Beispiel bei einer Temperatur innerhalb des Bereichs von 4 bis 40ºC, günstigerweise bei 20 bis 35ºC.
Das gewünschte Produkt kann ohne weiteres auf eine routinemäßige Art und Weise durch Testen der biologischen Wirksamkeit und/oder durch Überwachung der HPLC- Retentionszeiten identifiziert werden.
Geeigneterweise kann das Trennverfahren die Stufe einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie einschließen, vorzugweise als letzte Stufe. Die Elution kann unter Verwendung von wässrigem Methanol ausgeführt werden.
42-O-Demethylrapamycin und seine Derivate können kristallin oder nicht-kristallin sein, und falls sie kristallin sind, können sie gegebenenfalls hydratisiert oder solvatisiert sein. Die Derivate sind vorzugsweise pharmazeutisch verträgliche Derivate. Die Derivate können Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen einschließen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden geeigneterweise in einer im Wesentlichen reinen Form bereitgestellt, zum Beispiel mindestens 50% rein, geeigneterweise mindestens 60% rein, vorteilhafterweise mindestens 75% rein, vorzugsweise mindestens 85% rein, stärker bevorzugt mindestens 95% rein und insbesondere mindestens 98% rein, wobei alle Prozentangaben als Gewicht/Gewicht berechnet sind. Eine unreine oder weniger reine Form einer erfindungsgemäßen Verbindung kann zum Beispiel bei der Herstellung einer reineren Form der gleichen Verbindung oder einer verwandten Verbindung (zum Beispiel ein entsprechendes Derivat), die für die pharmazeutische Anwendung geeignet ist, verwendet werden.
42-O-Demethylrapamycin und seine pharmazeutisch verträglichen Derivate haben eine antimycotische Wirkung und sind für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von Pilzinfektionen in Tieren, insbesondere Säugern, einschließlich Menschen, insbesondere bei Menschen und Haustieren (einschließlich Tieren auf dem Bauernhof) geeignet. Die Verbindungen können für die Behandlung von topischen Pilzinfektionen bei Menschen verwendet werden, die neben anderen Organismen durch Spezies von Candida (z. B. Candida Albicans), Trichophyton (z. B. Trihophyton mentagrophytes), Microsporum (z. B. Microsporum gypseum) oder Epidermophyton verursacht werden, oder von Schleimhautinfektionen, die durch Candida Albicans verursacht werden (z. B. Soor und Vaginalcandidiasis). Sie können auch bei der Behandlung von systemischen Pilzinfektionen, die zum Beispiel durch Candida, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Coccidiodes, Paracocciciodes, Histoplasma oder Blastomyces spp. verursacht werden. Sie können auch bei der Behandlung von eumycotischen Mycetomen, Chromoblastenmycose und Phycomycose von Nutzen sein.
42-O-Demethylrapamycin und seine pharmazeutisch verträglichen Derivate sind ebenso als immunmodulatorische Mittel wirksam. Die Bezeichnung "immunmodulatorische Mittel", wie sie hier verwendet wird, bedeutet, dass die erfindungsgemäße Verbindung eine Immunsuppression herbeiführen kann, indem die T- (und B-)Zellenreaktion in vitro gehemmt wird und/oder indem eine statistisch signifikante Abnahme der durch die Reaktion des Entzündungssystems vermittelten, sekundären Läsion bei der durch Adjuvantien hervorgerufenen Arthritis erzeugt wird. Indikationen für eine Therapie umfassen, sind jedoch nicht darauf begrenzt, die Behandlung der folgenden Krankheitszustände: rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematosis, multiple Sklerose, akute Transplantatabstoßung (tranplantation/graft rejection), Myasthenia gravis, fortschreitende systemische Sklerose, multiples Myelom, atopische Dermatitis, Hyperimmunglobulin E, Hepatitis B-Antigen negative chronische aktive Hepatitis, Hashimoto-Thyroiditis, familiengebundenes mediterranes Fieber, Basedow-Krankheit, autoimmune hämolytische Anämie, primäre biliäre Leberzirrhose, entzündliche Darmerkrankung, Insulin abhängiger Diabetes Mellitus.
42-O-Demethylrapamycin und seine pharmazeutisch verträglichen Derivate besitzen ebenso eine Wirksamkeit gegen carcinogene Tumore. Insbesondere sollten die Verbindungen zur Verminderung der Tumorgröße, Hemmung des Tumorwachstums und/oder Verlängerung der Überlebenszeit von Tumor tragenden Tieren geeignet sein.
Demgemäß stellt die Erfindung 42-O-Demethylrapamycin oder Derivate davon für die Verwendung in der medizinischen Therapie bereit, insbesondere für die Verwendung als ein antimycotisches oder immunmodulatorisches Mittel oder als ein Antikrebsmittel.
Für die Verwendung beim Menschen kann 42-O-Demethylrapamycin oder Derivate davon alleine verabreicht werden, es wird jedoch im Allgemeinen im Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden, der im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und Standardpraktiken in der Pharmazie ausgewählt wird. Zum Beispiel können sie oral in der Form einer Tablette, die solche Excipienten wie Stärke oder Lactose enthält, oder in einer Kapsel oder einem Ovulum, entweder alleine oder im Gemisch mit Excipienten, oder in der Form eines Elixirs oder einer Suspension, die ein Geschmacks- oder Färbemittel enthält, verabreicht werden. Sie können parenteral, zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziert werden. Für die parenterale Verabreichung werden sie am besten in der Form steriler Lösungen verwendet, die andere Substanzen enthalten können, zum Beispiel genügend Salze oder Glukose, um die Lösung isotonisch zu machen.
Es wird angenommen, dass für die orale und parenterale Verabreichung an menschliche Patienten, die an einer Pilzinfektion leiden, der tägliche Dosisspiegel der antimycotischen Verbindungen der Formel (I) von 0,05 bis 100, vorzugsweise 0,1 bis 10 mg/kg (in aufgeteilen Dosen) betragen wird, wenn sie entweder oral oder auf parenteralem Weg verabreicht werden. So kann angenommen werden, dass die Tabletten oder Kapseln der Verbindungen 5 mg bis 0,5 g des Wirkstoffs für eine einfache, zweifache oder mehrfache Verabreichung zum gegebenen Zeitpunkt enthalten. Der Arzt wird die aktuelle Dosis, die für den einzelnen Patienten am besten geeignet ist und mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten variiert, in jedem Einzelfall bestimmen. Die vorstehenden Dosierungen sind für den Durchschnittsfall beispielhaft. Es können natürlich Einzelfälle auftreten, in denen höhere oder niedrigere Dosierungen erforderlich sind, und solche sind im Anwendungsbereich dieser Erfindung eingeschlossen.
Entsprechend wird für einen menschlichen Patienten, der eine Immunmodulation benötigt, das tägliche parenterale oder orale Dosierungsschema für die Verbindung oder ein Derivat davon vorzugsweise von 0,1 mg/kg bis 30 mg/kg betragen.
Ein Fachmann sollte durch Routineexperimente bestimmen können, was eine wirksame nicht toxische Menge der Verbindung oder des Derivates davon für den Zweck der Behandlung carcinogener Tumore sein würde. Im Allgemeinen jedoch wird erwartet, dass eine wirksame Dosis in dem Bereich von etwa 0,05 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag beträgt.
Es werden keine nicht akzeptierbaren, toxikologischen Wirkungen erwartet, wenn die Verbindung in den vorstehend erwähnten Dosierungsbereichen verabreicht wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen und Zusammensetzungen können zur Verabreichung auf jedem herkömmlichen Weg für die Anwendung bei Menschen oder in der Veterinärmedizin analog zu anderen antimycotischen, Antikrebs- oder immunmodulatorischen Mitteln formuliert werden.
Die Verbindungen und Tabletten und Kapseln für die orale Verabreichung können in einer Einheitsdosierungsform vorliegen und können herkömmliche Excipienten enthalten, einschließlich zum Beispiel Bindemittel, z. B. Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Tragacantha oder Polyvinylpyrrolidon; Füllmittel, zum Beispiel Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit und Glycin; Tablettiergleitmittel, zum Beispiel Magnesiumstearat, Talkum, Polyethylenglykol oder Kieselerde; Sprengmittel, zum Beispiel Kartoffelstärke; und pharmazeutisch verträgliche Benetzungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können nach in der normalen pharmazeutischen Praxis bekannten Verfahren überzogen werden.
Orale Flüssigzubereitungen können in Form beispielsweise von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren vorliegen oder als ein Trockenprodukt zur Rekonstitution mit Wasser oder anderen geeigneten Trägem vor der Verwendung dargereicht werden. Solche Flüssigzubereitungen können herkömmliche Zusätze enthalten einschließlich, zum Beispiel Suspensionsmittel, zum Beispiel Sorbit, Methylcellulose, Glucosesirup, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte essbare Fette; Emulgatoren, zum Beispiel Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummi arabicum; nicht-wässrige Träger (die essbare Öle einschließen können), zum Beispiel Mandelöl, ölige Ester (zum Beispiel Glycerin), Propylenglykol oder Ethylalkohol; Konservierungsmittel, zum Beispiel Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure; und, falls erwünscht, herkömmliche Geschmacks- oder Färbemittel.
Die für die topische Verabreichung vorgesehenen, erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können zum Beispiel in Form von Salben, Cremes oder Lotionen, Augensalben, Augentropfen, Ohrentropfen, imprägnierten Verbänden und Aerosolen vorliegen und können geeignete herkömmliche Zusätze, wie Konservierungsstoffe, Lösungsmittel zur Unterstützung der Arzneimittelpenetration und Emollientien in den Salben und Cremes enthalten. Solche topischen Formulierungen können auch verträgliche herkömmliche Träger enthalten, wie Creme- oder Salbengrundlagen und Ethanol oder Oleylalkohol für Lotionen. Solche Träger können von etwa 1% bis zu etwa 98% der Formulierung ausmachen. Normalerweise machen sie bis zu etwa 80% der Formulierung aus.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können als Zäpfchen formuliert werden, die herkömmliche Zäpfchengrundlagen, z. B. Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.
Die für die parenterale Verabreichung vorgesehenen, erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können geeigneterweise in flüssigen Einheitsdosierungsformen vorliegen, die dargestellt werden, indem die Verbindung und ein steriler Träger, Propylenglykol, verwendet wird. Die Verbindung kann, in Abhängigkeit von dem Träger und der verwendeten Konzentration, entweder in dem Träger suspendiert oder gelöst sein. Parenterale Suspensionen werden auf die im Wesentlichen gleiche Art und Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Verbindung in dem Träger suspendiert anstatt gelöst wird und die Sterilisation nicht durch Filtration erfolgen kann. Statt dessen kann die Verbindung sterilisiert werden, indem sie Ethylenoxid ausgesetzt wird, bevor sie in einem sterilen Träger suspendiert wird. Vorteilhafterweise wird in solche Suspensionen ein oberflächenaktives Mittel oder ein Benetzungsmittel eingeschlossen, um eine gleichmäßige Verteilung der Verbindung zu erleichtern.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch durch Inhalation verabreicht werden. "Inhalation" bedeutet die intranasale oder orale Inhalationsverabreichung. Passende Dosierungsformen für eine solche Verabreichung, wie eine Aerosolformulierung oder ein Inhalator mit abgemessener Dosis, können nach herkömmlichen Techniken hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNG VON 42-O-DEMETHYLRAPAMYCIN

Eine Kultur, die 42-O-Demethylrapamycin aus Rapamycin herstellen kann, ist als Streptomyces sp. klassifiziert und in den National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 23, St. Machar Drive, Aberdeen AB 1RY, Scotland unter der Zugangsnummer NCIMB 40515 hinterlegt worden.

Kultivierung

Jeder von fünf 500 ml-Kolben, der 100 ml M2-Medium ["arkasoy", 10 g/l; Glycerin 20 g/l; CoCl&sub2; · 6H&sub2;O, 0,005 g/l; MgCl&sub2; · 2H&sub2;O, 0,1 g/l; FeCl&sub3;, 0,03 g/l; ZnCl&sub2;, 0,005 g/l; CuCl&sub2; · 2H&sub2;O, 0,005 g/l; MnSO&sub4; · 4H&sub2;O, 0,005 g/l; pH 6,6 nicht eingestellt] enthielt, wurde mit 2 Pfropfen Agar aus gut wachsenden Kulturen auf A3-Agar [Hefeextrakt, 5 g/l; Malzextrakt, 10 g/l; Glycerin, 10 g/l; Peptonsoja, 5 g/l; Agar Nr. 3, 20 g/l; pH 6,5] in Petrischalen geimpft.
Alternativ wurde eine große Öse voll mit einer gutwachsenden Kultur aus einer Petrischale mit 3 ml Tween 80 gemischt und der Gesamtinhalt wurde zu 100 ml M2-Medium in einem 500 ml- Kolben gegeben, bei 28ºC und 240 UpM 3 Tage wachsen gelassen, dann wurde 1 ml der Bouillionkultur verwendet, um 100 ml M2-Medium in jedem der fünf 500 ml-Kolben zu impfen. Der Inhalt der Kolben wurden dann bei 28ºC bei 240 UpM wachsen gelassen.

Inkubation

Nach 5 Tagen wurde Rapamycin (20 mg) in Form einer Lösung in Aceton (3,5 ml) in jeden Kolben gegeben. Rapamycin kann aus einer Rapamycin erzeugenden Kultur NCIMB 40319, hinterlegt am 14. September 1990, oder durch Kultivieren eines Rapamycin erzeugenden Organismus eg NRRL 5491, offenbart im US-Patent 3,929,992, erteilt am 30. Dezember 1975, erhalten werden. Die Kolben wurden bei 28ºC und 240 UpM etwa 20 h inkubiert.

Isolierungsverfahren

Lösungsmittelextraktion

Die Inhalte der Kolben wurden gemischt und mit verdünnter Schwefelsäure auf pH 4 eingestellt. 500 ml Dichlormethan wurden zugegeben und das Gemisch wurde 2 Stunden gerührt, die organische Phase wurde wiedergewonnen, indem die Phasen durch Zentrifugieren getrennt wurden, weitere 200 ml Dichlormethan zugegeben wurden und 1 Stunde gerührt wurde. Die organischen Lösungsmittelphasen wurden vereinigt und unter Vakuum zu einem Öl konzentriert. Zu dem Öl wurden 100 ml Methanol gegeben, der Methanolextrakt wurde filtriert und das Filtrat unter Vakuum zu einem Öl konzentriert.

Chromatographie über Silicagel

Das Öl wurde auf eine Kieselgel 60 (70-230 Mesh)-Säule (25 · 50 mm) gegeben, die mit Aceton : Hexan (15 : 85) gepackt wurde. Nach dem Aufbringen wurde die Säule mit einem Stufengradienten aus Aceton-Hexan eluiert. Die Fraktionen, die nach 35 : 65 Aceton : Hexan eluiert wurden, enthalten 42-O-Demethylrapamycin. Diese wurden vereinigt, unter Vakuum zur Trockne eingeengt und bei 20ºC aufbewahrt.

Präparative HPLC

Der aufbewahrte Feststoff wurde in 500 ul Methanol gelöst und 100 ul Portionen wurden getrennt auf eine Microsorb C-18-Säule mit umgekehrter Phase und auf eine Vorsäule (21,4 mm · 25 cm und 21,4 mm · 5 cm) (Rainin Instruments USA) injiziert. Nach der Injektion wurde die Elution mit 78 : 22 Methanol : H&sub2;O bei 6 ml/Minute fortgesetzt und bezüglich der UV- Absorption bei 278 nm überwacht. Die Fraktionen aus ingesamt 5 Injektionen, die die Zielverbindung enthielten, wurden zusammengefasst, zur Entfernung des Methanols unter Vakuum konzentriert und gefriergetrocknet.
Fraktionen, die die Zielverbindung enthielten, wurden durch HPLC mit umgekehrter Phase unter Verwendung einer Spherisorb S100DS2 (PhaseSep)-Säule (25 cm · 4,6 mm) und einer Waters-Vorsäule analysiert. Die Säule wurde durch UV-Absorption bei 278 nm überwacht und mit 78 : 22 Methanol : Wasser bei 2 ml/Minute eluiert. Unter diesen Bedingungen wies die Zielverbindung eine Retentionszeit von 6,8 Minuten auf (abweichend von Rapamycin, Retentionszeit von 8,4 Minuten).

Spektroskopische Daten

Die erhaltene Verbindung wurde durch Massenspektroskopie (FAB) [M + Na]&spplus; = 922 sowie durch Protonen und ¹³C-Nuclear Magnetic Resonance-Spektroskopie (siehe nachstehende Tabelle 1) charakterisiert. Die UV-Spektroskopie zeigt ein UV λmax in Aceton bei 275 nm.

Tabelle 1

Spektroskopische Daten für 42-O-Demethylrapamycin

MS (FAB/NaCl) m/z 922 (M + Na)&spplus;
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz, 4 : 1 Gemisch aus trans : cis-Amidrotameren; Daten für trans- Rotamer):

BEISPIEL 2

BIOAKTIVITÄT VON 42-O-DEMETHYLRAPAMYCIN

Die Verbindung wurde unter Verwendung der folgenden Biotests bezüglich der antimycotischen und immunsuppressiven Wirkung analysiert.

A. Test der antimycotischen Wirkung

Der Hefeorganismus Saccharomyces cerevisiae in logarithmischem Wachstum wurde auf einem kompletten Agarmedium ausgestrichen. Die in einem passenden wässrigen oder organischen Lösungsmittel gelösten Verbindungen wurden in Vertiefungen gebracht, die in das Agar gestanzt waren. Die Platten wurden 48 Stunden inkubiert und die Inhibitionszonen wurden gemessen. Die Wirkungsstärke der Verbindungen wurde durch Regressionsanalyse der Kurven der Inhibitionszonen gegen den Logarithmus der Arzneimittelkonzentration quantifiziert.

B. Mitogenesetest der immunsuppresiven Wirkung

Milzzellen von weiblichen BDF1-Mäusen wurden in RPMI mit 10% fötalem Kalbsserum bei 5 · 10&sup6;/ ml angelegt. Einhundert ml-Aliquote (aliquote Mengen von 1 ml) dieser Suspension wurden in 96er-Mikrotiterplatten mit Vertiefung (Linbro, Flow Laboratories) mit rundem Boden verteilt. Concanavalin A (5 ug/ml) wurde als der mitogene Stimulus zugegeben und das Endvolumen in den Mikrotitervertiefungen wurde mit RMPI auf 200 ul eingestellt. Die Zellkultur wurde 72 Stunden bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert und in den letzten 18 Stunden der 72stündigen Kultur pulsweise mit 0,5 uCi ³H-Thymidin (spezifische Aktivität 2,00 Ci/mol) versetzt. Die Zellen wurden in einer automatischen Mehrfachprobenerntemaschine geerntet und die mit Zellen verbundene Radioaktivität wurde in einem Beckman Flüssigszintillationszähler gezählt. Die Ergebnisse wurden als die Durchschnittswerte ausgedrückt, die aus vier Messungen abgeleitet wurden. Die Lebensfähigkeit der Zelle wurde über den Ausschluss von Tryptophanblau nach 72 Stunden Inkubation bestimmt. Die zu testenden Verbindungen wurden in den passenden Verdünnungen vor der Zugabe von Zellen auf die Mikrotiterplatte gegeben.
Die Ergebnisse dieser beiden Tests für die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in Tabelle 2 bereitgestellt. Tabelle 2
a Test: (IC&sub1;&sub2;, ug/ml)
b Test: (IC&sub5;&sub0;, nM)

BEISPIEL 3

ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE A-H

A - KAPSELZUSAMMENSETZUNG

Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel in Form einer Kapsel wird hergestellt, indem eine harte zweiteilige Standardgelatinekapsel mit 50 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung in pulverisierter Form, 100 mg Lactose, 32 mg Talkum und 8 mg Magnesiumstearat gefüllt wird.

B - INJIZIERBARE PARENTERALE ZUSAMMENSETZUNG

Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel in einer für die Verabreichung durch Injektion geeigneten Form wird hergestellt, indem 1,5 Gewichtsprozent einer erfindungsgemäßen Verbindung in 10 Volumenprozent Propylenglykol und Wasser gerührt wird. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert.

C - SALBENZUSAMMENSETZUNG

Erfindungsgemäße Verbindung 1,0 g
Weißes weiches Paraffin auf 100,0 g
Die erfindungsgemäße Verbindung wird in einem kleinen Volumen des Trägers dispergiert und granular in die Hauptmenge des Trägers eingearbeitet, wobei ein glattes, homogenes Produkt hergestellt wird. Ausdrückbare Metalltuben werden dann mit der Dispersion gefüllt.

D - TOPISCHE CREMEZUSAMMENSETZUNG

Erfindungsgemäße Verbindung 1,0 g
Polawax GP 200 20,0 g
Wasserfreies Lanolin 2,0 g
Weißes Bienenwachs 2,5 g
Methylhydroxybenzoat 0,1 g
Destilliertes Wasser auf 100 g
Das Polawax, Bienenwachs und Lanolin werden zusammen auf 60ºC erhitzt. Die erfindungsgemäße Verbindung wird dann dazugegeben und durch und durch dispergiert, man lässt die Zusammensetzung unter Rühren bei langsamer Geschwindigkeit abkühlen.

E - TOPISCHE LOTIONZUSAMMENSETZUNG

Erfindungsgemäße Verbindung 1,0 g
Sorbitanmonolaurat 0,6 g
Polysorbate 20 0,6 g
Cetostearylalkohol 1,2 g
Glycerin 6,0 g
Methylhydroxybenzoat 0,1 g
Gereinigtes Wasser B. P. auf 100,00 ml
Das Methylhydroxybenzoat und Glycerin werden bei 75ºC in 70 ml des Wassers gelöst. Das Sorbitanmonolaurat, Polysorbate 20 und Cetostearylalkohol werden bei 75ºC zusammengeschmolzen und zu der wässrigen Lösung gegeben. Die erhaltene Emulsion wird homogenisiert, man lässt sie unter dauerndem Rühren abkühlen und die erfindungsgemäße Verbindung wird als eine Suspension in dem verbleibenden Wasser zugegeben. Die gesamte Suspension wird gerührt bis sie homogenisiert ist.

F - AUGENTROPFENZUSAMMENSETZUNG

Erfindungsgemäße Verbindung 0,5 g
Methylhydroxybenzoat 0,01 g
Propylhydroxybenzoat 0,04 g
Gereinigtes Wasser B. P. auf 100,00 ml (B. P. = British Pharmacopia)
Die Methyl- und Propylhydroxybenzoate werden bei 75ºC in 70 ml des gereinigten Wassers gelöst und man lässt die erhaltene Lösung abkühlen. Die erfindungsgemäße Verbindung wird dann zugegeben und die Lösung wird durch Filtrieren durch einen Membranfilter (0,22 um Porengröße) sterilisiert und antiseptisch in geeignete sterile Behälter verpackt.

G - ZUSAMMENSETZUNG FÜR DIE VERABREICHUNG DURCH INHALATION

Für einen Aerosolbehälter mit einer Kapazität von 15-20 ml: Mische 10 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung mit 0,2-0,2% eines Schmiermittels, wie Polysorbate 85 oder Oleinsäure, und dispergiere ein solches Gemisch in einem Treibmittel, wie Freon, vorzugsweise in Kombination von 1,2-Dichlortetrafluorethan und Difluorchlormethan und gib es in ein passendes Aerosolbehälterverbindungsstück entweder für tranasale oder orale Verabreichung.

H - ZUSAMMENSETZUNG FÜR DIE VERABREICHUNG DURCH INHALATION

Für einen Aerosolbehälter mit einer Kapazität von 15-20 ml: Löse 10 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung in Ethanol (6-8 ml), gib mit 0,1-0,2% eines Schmiermittels, wie Polysorbate 85 oder Oleinsäure, dazu und dispergiere ein solches Gemisch in einem Treibmittel, wie Freon, vorzugsweise in Kombination von 1,2-Dichlortetrafluorethan und Difluorchlormethan und gib es in ein passendes Aerosolbehälterverbindungsstück entweder für intranasale oder orale Verabreichung.

A. NATIONAL COLLECTION OF INDURSTRIAL AND MARINE BACTERIA LIMITED

Torry Research Station, P. O. Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom
Datum des Hinterlegens: 7. Juli 1992
Zugangsnummer: NCIMB 40515
B. Im Hinblick auf diejenigen Bezeichnungen, in denen ein europäisches Patent beantragt wird, wird eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus bis zur Veröffentlichung der Erwähnung der Erteilung des europäischen Patents oder bis zu dem Datum, an dem die Anmeldung zurückgewiesen oder zurückgezogen wird, zugänglich gemacht, und zwar nur durch Herausgabe einer solchen Probe an einen Experten, der durch die Person, die die Probe anfordert, benannt wird.

Claims

1. Verbindung der Formel (I):

welche 42-O-Demethylrapamycin ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, welche folgende Merkmale aufweist:

i) sie besitzt ein durch schnelle Atombeschuss-Massenspektroskopie (fast atom bombardment (FAB) mass spectroscopy) bestimmtes offensichtliches Molekulargewicht von 899;

ii) sie ist durch Kultivierung von Streptomyces NCIMB 40515 in Gegenwart von Rapamycin und Gewinnung von 42-O-Demethylrapamycin oder eines Derivates davon aus dem Kulturmedium erhältlich;

iii) ¹³CNMR-Spektroskopie zeigt 50 Kohlenstoffatome im Molekül,

iv) sie zeigt antimycotische Wirkung;

v) sie zeigt immunmodulatorische Wirkung.

3. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend das Inkontaktbringen eines Mikroorganismuses Streptomyces NCIMB 40515 mit Rapamycin und nachfolgendes Isolieren von 42-O-Demethylrapamycin aus der Inkubation.

4. Verfahren nach Anspruch 3, umfassend die Trennung der Substanz oder Verbindung oder eines Derivates davon von einer Lösung derselben im Gemisch mit anderen antibakteriellen Wirkstoffen und/oder inaktiven Substanzen, durch Adsorbtion an ein adsorbierendes Harz.

5. Arzneimittel, umfassend eine Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Gemisch davon oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipient.

6. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Gemisch davon oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon zur therapeutischen Verwendung.

7. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Gemisch davon oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon, zur Verwendung als immunmodulatorisches Mittel oder Antikrebsmittel oder in der Behandlung von mikrobiellen Infektionen in Tieren, einschließlich Menschen.

8. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 oder eines Gemisches davon oder eines pharmazeutisch verträglichen Derivats davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Antikrebsmittel oder immunmodulatorisches Mittel oder in der Behandlung von mikrobiellen Infektionen in Tieren, einschließlich Menschen.

9. Streptomyces NCIMB 40515.