DE69231898T2

DE69231898T2 - Verfahren zur herstellung von 29-desmethylrapamycin und seine verwendung als fungizid oder immunosuppressiva

Info

Publication number: DE69231898T2
Application number: DE69231898T
Authority: DE
Inventors: Rhona Mary Banks; Peter Robin Shelley
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1991-02-19
Filing date: 1992-02-14
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2012-02-15
Also published as: DE69231898D1; EP0572454B1; EP0572454A1; US6358969B1; JPH06505150A; WO1992014737A1; JP2001226380A; JP3245158B2; GB9103430D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung und deren Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere bei der Behandlung von bakteriellen und Pilz-Infektionen, und ebenso deren Verwendung als Immunsuppressiva.
Rapamycin ist eine bekannte Verbindung und wurde erstmals als ein Extrakt aus dem Pilz Streptomyces hygroscopicus isoliert, und es wurde gezeigt, dass es Antipilz-Aktivität besitzt (Britisches Patent 1436447). Demgemäss wurde Rapamycin als ein Immunsuppressivum eingeordnet (Martel R. R. et al. Can. J. Physiol. Pharmacol. 55, 48-51, 1977).
Von einer großen Anzahl Mikroorganismen ist nachgewiesen worden, dass sie in der Lage sind, eine Vielzahl von Metaboliten zu produzieren, die darauffolgend isoliert wurden und von denen gezeigt wurde, dass sie nützliche therapeutische Eigenschaften besitzen. 29-Demethylrapamycin ist eine solche Verbindung. Man geht davon aus, dass es sich um eine neue Verbindung handelt, und es zeigte sich, dass sie nützliche Antipilz-Aktivität und auch immunsuppressive Eigenschaften besitzt.
Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 29-Demethylrapamycin, welches die Züchtung eines produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces und die nachfolgende Isolierung von 29-Demethylrapamycin umfasst.
Man geht davon aus, dass 29-Demethylrapamycin die folgende Struktur besitzt:
Es besitzt die folgenden Eigenschaften:
i) es hat gemäss der Massenspektroskopie durch Beschuss mit schnellen Atomen (FAB) ein offensichtliches Molekulargewicht von 899,
ii) es kann durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces erhalten werden,
iii)¹³C-NMR-Spektroskopie ergibt 50 Kohlenstoffatome im Molekül,
iv) es zeigt Antipilz-Wirkung gegen Candida albicans,
v) es zeigt immunsuppressive Eigenschaften.
29-Demethylrapamycin kann durch die Züchtung eines produzierenden Organismus und dessen Isolierung aus der Kultur erhalten werden.
Der Begriff 'Züchtung' (und Derivate dieses Begriffes), wie er hierin verwendet wird, bedeutet das vorsätzliche aerobe Wachstum eines Organismus in Anwesenheit assimilierbarer Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Mineralsalzen. Ein solches aerobes Wachstum kann in einem festen oder halbfesten Nährmedium stattfinden, oder in einem flüssigen Medium, in welchem die Nährstoffe aufgelöst oder suspendiert vorliegen. Die Züchtung kann auf einer aeroben Oberfläche oder durch untergetauchte Kultivierung stattfinden. Das Nährmedium kann aus komplexen Nährstoffen zusammengesetzt oder chemisch definiert sein. Mikroorganismen
Es zeigte sich, dass bakterielle Stämme, welche zu der Gattung Streptomyces gehören und die in der Lage sind, 29- Demethylrapamycin herzustellen, für die Verwendung in dem erfindungsgemässen Züchtungsprozess geeignet sind. Es zeigte sich weiter, dass sp. NCIB 40319, welcher aus der Natur isoliert wurde, und ebenso Mutanten davon, ein Beispiel für solch einen Stamm darstellen.
Der Begriff 'Mutante', wie er hierin verwendet wird, beinhaltet jeden mutierten Stamm, der spontan oder durch die Wirkung eines externen Mittels, unabhängig davon, ob dieses Mittel vorsätzlich oder anders zugegeben wurde, entstanden ist. Geeignete Verfahren zur Herstellung von mutierten Stämmen, einschließlich derjenigen, welche von H. I. Adler in Techniques for the Development of Microorganisms' in 'Radiation and Radioisotopes for Industrial Microorganisms', Proceedings of a Symposium, Vienna, 1973, Seite 241, International Atomic Energy Authority aufgeführt sind, beinhalten:
i) ionisierende Strahlung (z. B. Röntgenstrahlen und γ- Strahlen), UV-Licht, UV-Licht in Verbindung mit photosensibilisierenden Mitteln (z. B. 8-Methoxypsoralen), salpetrige Säure, Hydroxylamin, Pyrimidinbasen-Analoge (z. B. 5-Bromuracil), Acridin, alkylierende Mittel (z. B. Senfgas, Ethylmethansulfonat), Wasserstoffperoxid, Phenole, Formaldehyd, Hitze und
ii) genetische Verfahren, welche zum Beispiel Rekombination, Transformation, Transduktion, Lysogenisierung, lysogene Umwandlung, Protoplastenfusion und selektive Verfahren zur Generierung spontaner Mutanten beinhalten.
Unter Verwendung der Verfahren von Becker B., Lechevalier M. P., Gordon R. E., Lechevalier H. A., 1964, Appl. Microbiol. 12, 421-423 und Williams S. T., Goodfellow M., Wellington E. M. H., Vickers J. C., Alderson. G., Sneath P. H. A., Sackin M. J., und Mortimer M. 1983 J. Gen. Microbiol. 129, 1815-1830, ist Sp. NCIB 40319 als ein atypischer Stamm von Streptomyces identifiziert worden, welcher zuvor noch nicht beschrieben wurde, und dieser stellt deshalb ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung dar, insbesondere in biologisch reiner Form. Dieser wurde bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (N.C.I.B), Aberdeen, Schottland mit der Nummer 40319 am 14. September 1990 hinterlegt.
Der Stamm NCIB 40319 wurde wie folgt charakterisiert:
Das angewendete Verfahren der Ganzzell-Aminosäureanalyse war dasjenige, welches von Becker et al. (1964) beschrieben wurde. Die Nachweismedien, welche zur Charakterisierung der Kultur verwendet wurden, waren, wie bei Williams et al. (1983) beschrieben. Zusätzlich wurde zur morphologischen Beschreibung der Kultur Stärke-Casein-Agar (Waksman S. A., 1961. The Actinomycetes Bd. 2 Williams and Wilkins Co. Baltimore S.l- 363) verwendet.
Der Mikroorganismus wurde durch Überimpfung von Agarblöcken von einer gut gewachsenen Platte in Y-Brühe (siehe Tabelle 1) und Inkubation für drei Tage bei 28ºC auf einem Schüttler charakterisiert. Das Ganze wurde dann 20 Minuten bei 3660 UpM zentrifugiert, zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen, und danach abschließend in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (Dulbecco A) resuspendiert. Dieses Inoculum wurde auf Medien ausplattiert, welche für die Identifizierung von Mitgliedern der Actinomycetales, wie vorstehend beschrieben, allgemein verwendet werden. Die Platten wurden bei 28ºC inkubiert, und die Ergebnisse wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten abgelesen, wobei im Allgemeinen die meisten jedoch nach 14 Tagen ausgewertet wurden. Die Farben werden in üblicher Terminologie beschrieben, die genauen Farben wurden allerdings durch Vergleich mit Farbsplitter aus dem Methuen-Handbuch der Farben (3. Ausgabe) bestimmt.

Ergebnisse:

Zellwand-Analyse

Die Gesamtzell-Hydrolysate enthielten LL- Diaminopimelinsäure. Die Wachstumsbeobachtungen und die Erscheinung des Organismus waren wie folgt:

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP 2 Difco)

- Wachstum: gut, cremig (2 2a), mit einem weißen pudrigen Zentrum. Die Kolonien wuchsen in die Höhe und waren ziemlich runzelig; keine Sporulation.

Anorganischer Salz-Stärke-Agar (ISP 4 Difco)

- Wachstum: gut, weißes mit blassgrauem bis grauem (1 1b, 1 1c) Luftmycel. Die Kolonien waren ziemlich flach mit etwas in die Höhe gewachsenem Zentrum. Rückseite cremig (2 2a).
Glycerin-Asparagin-Agar (S. A. Waksman, 1961, S.328). Medium Nr. 2. - Wachstum: moderat bis gut, weiß mit grauem Zentrum (1 1d). Die Kolonien waren flach, Rückseite cremig (2 2a).

Stärke-Mineralsalz-Agar

- Wachstum: sehr schlecht, trübe, kleine Kolonien. Kein Luftmycel.

Stärke-Casein-Agar

- Wachstum: gut, weiß mit leicht grauem bis grauem Zentralbereich (1 1c, 1 1d), gelegentlich kleine Stelle von weißem nicht-sporulierendem Mycel in grauen sporulierenden Bereichen. Winzige farblose Tröpfchen auf den grauen Bereichen. Die Kolonien sind ziemlich flach und sanft abgerundet. Nach 4 Wochen Inkubation können kleine schwarze hygroskopische Flecken auftreten.

Morphologische Eigenschaften

Diese wurden zwei Wochen nach Inkubation auf Stärke-Casein- Agar beobachtet: Sporenmasse in der Graufarben-Reihe; Sporenketten in spiraligen Ausschnitten, eng gewunden oder leicht geöffnet, von kleinem Durchmesser, im Allgemeinen 2- 6 Windungen, gelegentlich mehr, kann in eine hygroskopische Masse aggregieren. Es gab keine Fragmentation eines vegetativen Mycels.

Biochemische Eigenschaften

Siehe Tabelle 2 für alle Einzelheiten. Zusammengefasst; es wird kein Melanin hergestellt; Nitrat wird in organischer Nitrat-Brühe nicht zu Nitrit reduziert; in Pepton-Hefe- Extrakt-Eisen-Brühe wird H&sub2;S hergestellt; kein Wachstum auf Inhibitoren; Degradation nur von Arbutin, Antibiose nur gegen Bacillus subtilis. Kohlenhydratverwendung: Glucose, Cellobiose, Fructose, Inosit, Mannit, Raffinose, Rhamnose und Xylose. Verwendete Stickstoffquellen: Asparagin, Histidin und Hydroxyprolin, α-Aminobuttersäure wird nur geringfügig verwendet.

Bestimmung von Identifikationsbewertungen

Diese wurden unter Verwendung des Matiden-Programms (Sneath P. H. A., 1979. Computers and Geosciences 5 195-213) erhalten, welches die beste Identifikations-Bewertung für bekannte oder unbekannte Stämme in Beziehung zu der Prozent- Wahrscheinlichkeits-Matrix von Williams et al. (1983), bereitstellt. Willcox-Wahrscheinlichkeit: je näher die Punkteskala an den Wert 1,0 heranreicht, umso besser ist die Übereinstimmung eines unbekannten Stammes mit einer Gruppe innerhalb der Matrix (Bewertungen von > 0,85 sind akzeptabel). Taxonomische Distanz: niedrige Werte geben den Verwandtschaftsgrad an (Werte < 0,3 sind akzeptabel). Der Organismus zeigte akzeptable Identifikationsbewertungen in Übereinstimmung mit, der Gruppe 32 (Violaceoniger), welche die Art Streptomyces hygroscopicus enthält.

Schlußfolgerung:

Die Kultur wird durch die grauen Sporen in der Masse, die negative Melaninreaktion und die Anordnung der Sporen in spiralig gewundenen Ketten charakterisiert. Die Spoxenketten können in eine hygroskopische Masse verschmelzen. Die Kultur verwendete einen großen Bereich an Kohlenhydratquellen. Das Gesamtzell-Hydrolysat zeigt die Anwesenheit von LL- Diaminopimelinsäure an.

Tabelle 1

1. Y-Brühe
g/l
Spezialpepton (Oxoid) 2,5
Lab Lemco-Pulver (Oxoid) 2,5
Trypton (Oxoid) 2,5
Neutralisiertes Sojapepton (Oxoid) 2,5
Stärke (BDH) 2,5
Glucose (BDH) 2,5
Malzextrakt (Oxoid) 2,5
Glycerin (Fisons) 2,5
CaCl&sub2;.2H&sub2;O (BDH) 0,05
MgCl&sub2;.6H&sub2;O (Sigma) 0,05
NaCl (BDH) 0,05
FeCl&sub3; (Sigma) 0,015
ZnCl&sub2; (Sigma) 0,0025
CuCl&sub2;.2H&sub2;O (Sigma) 0,0025
MnSO&sub4;.4H&sub2;O (Sigma) 0,0025
CoCl&sub2;.6H&sub2;O (BDH) 0,025

Tabelle 2

Biochemische Charakteristika von NCIB 40319

Test Ergebnis
Melanin-Herstellung -
Verwendung von Kohlenhydraten:
Adonit -
Cellobiose +
D-Fructose +
Meso-Inosit +
Inulin -
Mannit +
Raffinose +
L-Rhamnose + Willcox-Wahrscheinlichkeit
D-Xylose +
D-Clucose + Gruppe 32 Violaceoniger = 0,936
Verwendung von Stickstoffquellen:
DL-α-Aminobuttersäure +/-
L-Histidin + Taxonomischer Unterschied
L-Hydroxyprolin +
Asparagin + Gruppe 32 Violaceoniger = 0,284
Degradation von:
Allantoin -
Arbutin +
Xanthin -
Pectin -
Lecithin -
Nitrat-Reduktion -
H&sub2;S-Produktion +
Wachstum in Anwesenheit von Inhibitoren:
Natriumacid (0,01% Gew./Vol.) -
NaCl (7,0% Gew./Vol.) -
Phenol (0,1% Gew./Vol.) -
Wachstum bei 45ºC -
Antibiose bei:
Aspergillus niger -
Bacillus subtilus +
Streptomyces murinus -
Das Fermentationsmedium zur Züchtung von sp. NCIB 40319 enthält geeigneterweise Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und assimilierbarem Stickstoff zusammen mit anorganischen Salzen. Geeignete Quellen für Stickstoff sind Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Baumwollsamen, Mehl, Malz, im Destillationsapparat getrocknetes Lösliches, Aminosäuren, Protein-Hydrolysate und Ammonium- und Nitrat- Stickstoff. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Laktose, Maltose, Stärke und Glycerin. Geeigneterweise beinhaltet das Kulturmedium auch Alkalimetall-Ionen (zum Beispiel Natrium), Halogen-Ionen (zum Beispiel Chlorid) und Erdalkalimetall-Ionen (z. B. Calcium und Magnesium) sowie Spurenelemente, wie Eisen und Kobalt.
Die Züchtung kann geeigneterweise bei einer Temperatur von etwa 20-35ºC, bevorzugt von 20-30ºC durchgeführt werden, und die Kultur kann geeigneterweise bis zu 7 Tage, bevorzugt 3 bis 5 Tage, nach Beginn der Fermentation geerntet werden, um einen optimalen Gehalt des gewünschten Produkts zu erzielen.
Das gewünschte Produkt kann dann aus dem Kulturmedium isoliert und aufgearbeitet werden und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren für solche Verbindungen gereinigt werden. Alle diese Isolierungs- und Reinigungsverfahren können leicht bei kühler bis Umgebungstemperatur, zum Beispiel bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von 4-40ºC, am geeignetsten von 20-35ºC durchgeführt werden.
Die gewünschte Verbindung kann in einem Routineverfahren durch Testen auf Antipilz-Aktivität und/oder durch Überwachen der HPLC-Retentionszeit einfach identifiziert werden.
Geeigneterweise kann das Separationsverfahren einen Hochleistungsflüssigchromatographie-Schritt beinhalten, vorzugsweise als den letzten Schritt. Die Elution kann unter Verwendung von wässrigem Methanol durchgeführt werden.
29-Demethylrapamycin kann kristallin oder nicht-kristallin vorliegen und kann, falls es kristallin vorliegt, gegebenenfalls hydratisiert oder solvatisiert sein.
Die erfindungsgemäße Verbindung wird geeigneterweise in im wesentlichen reiner Form bereitgestellt, zum Beispiel mindestens 50% rein, geeigneterweise mindestens 60% rein, vorteilhafterweise mindestens 75% rein, vorzugsweise mindestens 85% rein, mehr bevorzugt mindestens 95% rein, insbesondere mindestens 98% rein, wobei alle Prozentangaben als Gewicht/Gewicht kalkuliert sind. Eine unreine oder weniger reine Form einer erfindungsgemäßen Verbindung kann beispielsweise für die Herstellung einer reineren Form der gleichen Verbindung oder einer verwandten Verbindung (zum Beispiel ein entsprechendes Derivat), welche für pharmazeutische Zwecke geeignet ist, verwendet werden.
29-Demethylrapamycin und seine pharmazeutisch verträglichen Derivate, insbesondere Salze mit pharmazeutisch verträglichen Gegenionen, zeigen Antipilz-Wirkung und immunsuppressive Eigenschaften und sind für die Behandlung von Pilzinfektionen in Tieren, insbesondere Säugern, einschließlich Menschen, in bestimmten Menschen und Haustieren (einschließlich Tiere der Landwirtschaft) zweckmäßig. Die Verbindungen können dazu verwendet werden, topische Pilzinfektionen in Menschen, welche neben anderen Organismen durch die Arten Candida, Trichophyton, Microsporum oder Epidermophyton verursacht werden, oder Infektionen der Mukosa, die durch Candida albicans (z. B. Candidose der Mundschleimhaut und vaginale Candidose) verursacht werden, zu behandeln. Sie können auch zur Behandlung von systemischen Pilzinfektionen verwendet werden, die zum Beispiel von Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Coccidioden, Paracoccidioden, Histoplasma oder Blastomyces spp. verursacht werden. Sie können auch für die Behandlung des eumykotischen Mycetoms, der Chromoblastomycose und der Phycomycose verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Verbindung ist als ein immunmodulatorisches Mittel aktiv. Der Begriff "immunmodulatorisches Mittel" bedeutet, dass die erfindungsgemäße Verbindung in der Lage ist, Immunsuppression durch Hemmung von T (und B)-Zellantworten in vitro und/oder durch Bewirken einer statistisch signifikanten Verminderung der durch die Reaktion des Entzündungssystems vermittelten sekundären Läsion bei der durch ein Adjuvans induzierten Arthritis zu induzieren. Indikationen zur Behandlung unter Verwendung eines immunomodulatorischen Mittels beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Behandlung der nachfolgenden Krankheitsstadien:
Rheumatoide Arthritis
Systemischer Lupus erythematosus
Multiple Sklerose
Akute Transplantation/Transplantatabstoßung
Myasthenia gravis
Progressive systemische Sklerose
Multiples Myelom
Atopische Dermatitis
Hypoimmunoglobulin E
Hepatitis B Antigen-negative chronische aktive Hepatitis
Hashimoto Thyreoiditis
Familiäres Mittelmeerfieber
Basedow'-Krankheit
Autoimmune hämolytische Anämie
Primäre biliäre Zirrhose
Entzündliche Darmerkrankung
Insulin-abhängiger Diabetes mellitus
Für die Verwendung beim Menschen können 29- Demethylrapamycin oder Derivate davon alleine verabreicht werden; sie werden aber im Allgemeinen vermischt mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, welcher hinsichtlich dem ausgewählten Verabreichungsweg und gemäß dem Standard pharmazeutischer Praxis ausgewählt wurde, verabreicht. Sie können zum Beispiel oral in Form einer Tablette verabreicht werden, welche solche Excipienten, wie Stärke oder Lactose, enthält oder in einer Kapsel oder einem Ovulum entweder alleine oder vermischt mit Excipienten oder in Form eines Elixiers oder einer Suspension, enthaltend eine geschmacksverstärkende oder farbgebende Substanz. Sie können parenteral injiziert werden, zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan. Zur parenteralen Verabreichung werden sie am besten in Form von sterilen Lösungen verwendet, welche andere Substanzen enthalten können, zum Beispiel genügend Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen.
Für die orale und parenterale Verabreichung an menschliche Patienten, die an einer Pilzinfektion leiden, geht man davon aus, dass die tägliche Dosierung der Antipilz-Verbindung im Bereich von 0,1 bis 10 mg/kg (in aufgeteilten Dosen) liegen wird, wenn sie entweder durch die orale oder parenterale Route verabreicht werden. So kann erwartet werden, dass die Tabletten oder Kapseln mit der Verbindung 5 mg bis 0,5 g Wirkstoff zur einmaligen Verabreichung oder zwei- oder mehrfachen Verabreichung pro Zeiteinheit, wie es angemessen ist, enthalten. In jedem Fall wird der Arzt die aktuelle Dosierung bestimmen, welche für einen bestimmten Patienten am besten geeignet ist, und diese wird in Abhängigkeit von dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des jeweiligen Patienten variieren. Die vorstehenden Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich vereinzelt Umstände geben, in welchen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche wünschenswert sind.
Gleichermaßen liegt das tägliche parenterale oder orale Dosierungsschema der Verbindung oder des Derivates davon für einen menschlichen Patienten, der einer Immunmodulation bedarf, vorzugsweise zwischen 0,1 mg/kg bis 30 mg/kg.
Wenn die Verbindung in den vorstehend erwähnten Dosierungsbereichen verabreicht wird, werden keine nicht- tolerierbaren toxikologischen Wirkungen erwartet.
Die Verbindungen und Zusammensetzungen können zur Verabreichung auf jede herkömmliche Art und Weise der Verwendung in der Human- oder Veterinärmedizin in Analogie mit anderen Antipilz- oder immunmdulatorischen Mitteln formuliert werden.
Die Verbindungen und Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können in einheitlichen Dosierungsformen vorliegen und können herkömmliche Excipienten enthalten, einschließlich zum Beispiel Bindemittel, zum Beispiel Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Tragant, oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, zum Beispiel Laktose, Zucker, Mais-Stärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin; Gleitmittel für Tabletten, zum Beispiel Magnesiumstearat, Talkum, Polyethylenglycol oder Kieselerde; Zerfallsmittel, zum Beispiel Kartoffelstärke; und pharmazeutisch verträgliche Befeuchtungsmittel, zum Beispiel Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können nach Verfahren, welche in der normalen pharmazeutischen Praxis gut bekannt sind, beschichtet werden.
Flüssige Präparationen zur oralen Verabreichung können in Form von beispielsweise wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirups oder Elixieren vorliegen oder können als Trockenprodukt zur Wiederauflösung in Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung angeboten werden. Solche flüssigen Präparationen können herkömmliche Zusätze enthalten, einschließlich zum Beispiel suspendierende Mittel, zum Beispiel Sorbit, Methylcellulose, Glucosesirup, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearat-Gel oder hydrierte Speisefette; emulgierende Mittel, zum Beispiel Lecithin, Sorbitan-Monooleat oder Gummi arabicum; nicht-wässrige Trägersubstanzen (welche Speiseöle beinhalten können), zum Beispiel Mandelöl, ölige Ester (zum Beispiel Glycerin), Propylenglycol, Ethylalkohol; Konservierungsmittel, zum Beispiel Methyl- oder Propyl-p- Hydroxybenzoat oder Sorbinsäure; und, falls gewünscht, herkömmliche geschmacksgebende und farbgebende Mittel.
Zusammensetzungen, welche zur topischen Verabreichung verwendet werden sollen, können zum Beispiel in Form von Salben, Cremes, Lotionen, Augensalben, Augentropfen, Ohrentropfen, imprägnierten Verbänden und Aerosolen vorliegen und können geeignete herkömmliche Zusätze enthalten, einschließlich zum Beispiel Konservierungsmittel, Lösungsmittel, welche bei der Penetration des Arzneimittels unterstützen, und erweichende Mittel in Salben und Cremes. Solche topischen Formulierungen können auch verträgliche herkömmliche Träger, zum Beispiel Creme- oder Salben- Grundlagen, und Ethanol- oder Oleyl-Alkohol für Lotionen enthalten. Solche Träger können von etwa 1 bis etwa 98 Gewichtsprozent der Formulierung ausmachen; im Allgemeinen werden sie etwa bis zu 80 Gewichtsprozent der Formulierung ausmachen.
Die Zusammensetzungen können als Zäpfchen formuliert sein, welche herkömmliche Zäpfchengrundlagen enthalten können, zum Beispiel Kakao-Butter oder andere Glyceride.
Die Verbindungen, die parenteral verabreicht werden sollen, können geeigneterweise in flüssigen Einheitsdosierungsformen vorliegen, welche unter Verwendung der Verbindung und des sterilen Trägers Propylenglycol hergestellt werden. Die Verbindung kann in Abhängigkeit von dem Träger und der verwendeten Konzentration entweder in dem Träger suspendiert oder aufgelöst vorliegen. Die parenteralen Suspensionen können im Wesentlichen auf die gleiche Art und Weise hergestellt werden, mit der Ausnahme, dass die Verbindung in dem Träger suspendiert anstelle gelöst vorliegt und dass die Sterilisation nicht durch Filtration durchgeführt werden kann. Die Verbindung kann stattdessen durch Behandeln mit Ethylenoxid sterilisiert werden, bevor sie in dem sterilen Träger suspendiert wird. Es ist von Vorteil, ein grenzflächenaktives Mittel oder ein Befeuchtungsmittel in eine solche Suspension einzuschließen, um die einheitliche Verteilung der Verbindung zu erleichtern.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Illustration der vorliegenden Erfindung.

Herstellung von 29-Demethylrapamycin

Eine Kultur, welche 29-Demethylrapamycin produziert, wurde als Streptomyces sp. klassifiziert und ist bei der National Collection of Industrial ard Marine Bacteria, 23, St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, UK, mit der Hinterlegungsnummer NCIB 40319 hinterlegt worden.
Die Kultur wurde aus einem Termitenhügel bei Abuke, Gambia, isoliert.

Beispiel 1

Inokulum-Herstellung

Sporulierende Kulturen, welche auf Stärke/Casein-Agar (SCA) [lösliche Stärke (BDH) 10 g/l; Casein (weiß löslich), 1 g/l; K&sub2;HPO&sub4;, 0,5 g/l; MgSO&sub4;.7H&sub2;O), 0,5 g/l; technischer Agar (Oxoid No.3) 18 g/1] in Roux-Flaschen gewachsen waren, wurden mit 50 ml 0,02% Tween 80 behandelt, um eine Sporen-Suspension zu bilden. 7,5 ml Sporensuspension wurden in 400 ml RS1-Medium (Sojapepton 10 g/l; Glucose-Monohydrat 20 g/l; Bäckerhefe 5 g/l; NaCl 2 g/l; ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,05 g/l; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,125 g/l; MnSO&sub4;.4H&sub2;O, 0,01 g/l; FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02 g/l], das mit 5N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7 eingestellt war, inokuliert. Es wurde ein 21-Schüttelkolben verwendet und bei 25ºC und 240 UpM (50 mm Ausschlag) inkubiert.

Abschließende Fermentationsstufe

15 l RP2-Medium [Sojapepton, 10 g/l; Glucose, 20 g/l; Bäckerhefe, 6 g/l; NaCl, 5 g/l; L-Lysin-Monohydrochlorid, 6 g/l; K&sub2;HPC&sub4;, 2,5 g/l; KH&sub2;PO&sub4;, 2,5 g/l; MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,125 g/l; ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,05 g/l; MnSO&sub4;.4H&sub2;O, 0,01 g/l; FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,02 g/l; Glycerin, 30,0 g/l; Sojabohnenöl, 20 g/l] wurden in situ in einem 20 l-Fermenter bei 121ºC für 45 Minuten zusammen mit 0,5 g/l NOPCO Foamaster-Antischäumungsmittel sterilisiert. Der pH-Wert wurde nach der Sterilisation mit 50% NH&sub3;-Lösung auf 6,4 eingestellt, dann wurde das Medium mit einer 72 Stunden-Aussaat-Kultur auf 4% inokuliert. Der Fermenter wurde mit einer Luftzufuhr von 7,5 l/min. und 0,2 bar Überdruck bei 25ºC und 480 UpM betrieben. Der pH-Wert durfte dabei bis auf 6,0 abfallen und wurde dann durch Zugabe von 50% NH&sub3;-Lösung auf dieser Stufe gehalten. Die Schaumbildung wurde durch Zugabe von Pluronic L81- Antischäumungsmittel (20%ige Lösung in Sojabohnenöl) gesteuert. Nach 118 Stunden wurde die Brühe geerntet.

Isolierungsverfahren

Zur Ernte wurde die ganze Brühe (15 l) mit Schwefelsäure auf pH 4 eingestellt und das Ergebnis in Portionen für 20 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Die mycelialen Feststoffe wurden durch Einweichen in Dichlormethan über Nacht bei 5ºC, gefolgt von einer Durchmischung für eine Stunde unter Verwendung eines Schaufelrührers, extrahiert.
Feststoffe wurden durch Filtration (Whatman GFD-Papier) entfernt, und die flüssige Phase wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers zu einem dicken Öl konzentriert. Das Öl wurde unter Verwendung von Methanol extrahiert, und die methanolische Phase wurde zu einem leichten Öl konzentriert. Vor der Silika-Chromatographie wurden 60 ml Aceton-Hexan, 15 : 85, zugegeben.

Chromatographische Reinigung

Die Lösung wurde über eine Säule von 30 · 2,5 cm aus Kieselgel (Sorbsil C60 Rhone-Poulenc, Manchester), gepackt in Aceton-Hexan (15 : 85), wobei mit einem Stufengradienten von Aceton in Hexan eluiert wurde, chromatographiert. Die Fraktionen, welche unter Verwendung von Aceton in einer Konzentration von mehr als 30% erhalten wurden und welche 29- Demethylrapamycin enthielten, wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei 333 mg eines Öls erhalten wurden. Andere Fraktionen, welche Rapamycin enthielten, wurden zur Seite gestellt.
Das Öl, welches 29-Demethylrapamycin enthielt, wurde in 2,2 ml Methanol gelöst und durch Zentrifugation bei 2000 UpM geklärt. Der Überstand wurde über präparative Umkehrphasen- Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) gereinigt. Eine Dynamax 60A C&sub1;&sub8;-Säule (41,4 · 250 mm) und eine Vorsäule (41,4 · 50 mm) (Rainin Instruments Woburn, MA 01801, USA) wurden verwendet. Die Säule wurde mit Methanol-Wasser (72 : 28) bei 50 ml/min eluiert. Die Elution wurde bei 275 nm beobachtet. Die Fraktionen, welche 29-Demethylrapamycin enthielten, wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft, wobei 23 mg eines weißen Pulvers erhalten wurden. Die Fraktionen, welche die gegenständige Verbindung enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Microsorb 5 um C&sub1;&sub8;-Säule, 4,6 · 250 mm, (Rainin Instruments) mit einer 2,0 · 20 mm Vorsäule (Upchurch Scientific Ltd., Oak Habour, Washington, 98277, USA), welche bei 30ºC betrieben und durch Ultraviolett-Absorption bei 275 nm überprüft wurde, analysiert. Die Säule wurde mit Methanol-Wasser (78 : 22) bei 1 ml/Minute eluiert. Unter diesen Bedingungen hatte die gegenständige Verbindung, welche mit 29-Demethylrapamycin bezeichnet wird, eine Retentionszeit von 10,84 Minuten, welche sich von der des Rapamycin unterscheidet.
Die resultierende Verbindung wurde durch Massenspektroskopie (FAB) [M + Na)&spplus; = 922 und durch magnetische Protonen- und ¹³C-Kernresonanzspektroskopie (siehe Beispiel 2, nachfolgend) charakterisiert, UV-Spektroskopie zeigt UVλmax in wässrigem Methanol bei 269, 278 und 291 nm.

Beispiel 2

Inokulum-Herstellung

Das in Beispiel 1 ausgeführte Verfahren wurde verwendet.

Abschließender Fermentationsschritt

300 l RP2-Medium (plus NOPCO Foamaster- Antischäumungsmittel, 0,5 g/l) wurden in situ in einem 450 l- Fermenter bei 121ºC für 60 Minuten sterilisiert. Der pH-Wert wurde mit 50% NH&sub3;-Lösung auf 6,4 eingestellt, und dann wurde das Medium mit einer 48 Stunden-Aussaatkultur auf 4% inokuliert. Der Fermenter wurde bei 25ºC, 220 UpM (110 UpM zwischen 1 und 18 Stunden) mit einer Luftzufuhr von 150 l/min bei 0,5 bar Überdruck betrieben. Der pH-Wert durfte dabei bis auf 6,0 herabfallen und wurde dann auf dieser Stufe durch Zugabe von 50% NH&sub3;-Lösung gehalten. Die Schaumbildung wurde durch Zugabe von Pluronic L81-Antischäumungsmittel (20%- Lösung in Sojabohnenöl) gesteuert. Die Brühe wurde nach 137 Stunden abgeerntet.

Isolierungsverfahren

Zur Ernte wurde die gesamte Brühe (320 l) mit Salzsäure auf pH 4 eingestellt, und das Ergebnis wurde in Mengen von 3 l/Minute einem Westfalia SA7-03-076 flüssig/fest- Zentrifugalseparator (Westfalia Separator Ltd., Oelde W.- Deutschland) zugeführt. Die angesammelten Feststoffe wurden periodisch abgeführt, wobei eine eingedickte Aufschwemmung gebildet wurde. Diese wurde durch Rühren mit 120 l Dichlormethan für eine Stunde extrahiert. Die Lösungsmittelphase wurde durch Zentrifugation gewonnen (Sharples Superzentrifuge), und die Feststoffe wurden nochmals mit 100 l Dichlormethan durch gemeinsames Rühren für 12 Stunden extrahiert. Die Lösungsmittelphase der zweiten Extraktion wurde durch Schwerkraft abgetrennt und mit dem ersten Lösungsmittelextrakt vereint. Der vereinte Extrakt wurde im Vakuum konzentriert, wobei die Temperatur unterhalb von 35ºC gehalten wurde, wobei 4 l eines schwarzen Öls und einige suspendierte Feststoffe erhalten wurden. Große Unreinheiten wurden durch zahlreiche Trennschritte (11) des Öls und der Feststoffe gegen Methanol entfernt. Insgesamt wurden 62,4 l der reichen Methanolphase durch die Trennung über Schwerkraft gewonnen. Diese wurden konzentriert, wobei 0,65 l schwarzes Öl erhalten wurden.

Anfängliche chromatographische Aufreinigung

Ein gleiches Volumen Aceton-Hexan (15 : 85) wurde zu dem Öl zugegeben, und das Ergebnis wurde auf eine Silikasäule (10 · 30 cm Sorbsil C60-Silika 40-60 um (Rhone-Poulenc), gepackt mit Aceton-Hexan (15 : 85), aufgetragen. Die Fraktionen, welche Aceton in einer höheren Konzentration als 20% verwendeten, enthielten Rapamycin und wurden zur Seite gestellt. Die Fraktionen, welche unter Verwendung von Aceton in einer höheren Konzentration als 25% erhalten wurden und welche 29-Demethylrapamycin enthielten, wurden vereint und verdampft, wobei ein Öl erhalten wurde. Dieses wurde in Diethylether gelöst, und einige Unreinheiten wurden bei 5ºC ausgefällt. Die verbleibende Lösung wurde zu einem Öl verdampft und über Kieselgel chromatographiert.

Chromatographische Reinigung

Nach Auftragen des Öls auf eine Kieselgelsäule (2,5 · 25 cm), welche mit Sorbsil C60-Silika 40-60 um (Rhone- Poulenc) in Aceton-Hexan (15 : 85) bepackt war, wurde die Elution mit Aceton-Hexan (25 : 75) fortgeführt. Die Fraktionen, welche 29-Demethylrapamycin enthielten, wurden vereint und im Vakuum konzentriert, wobei ein Rest erhalten wurde. Dieser wurde in Methanol gelöst, und eine weitere Reinigung wurde über präparative HPLC erzielt. Eine Dynamax-60 Å-C&sub1;&sub8;-Säule (41,4 · 250 und eine Vorsäule, 41,4 · 50 mm, Rainin Instruments) wurden verwendet. Die Säule wurde mit Methanol- Wasser (72 : 28) bei 50 ml/min eluiert. Die Elution wurde bei 275 nm überprüft. Die Fraktionen, welche die gegenständige Verbindung enthielten, wurden vereint und im Vakuum konzentriert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde.
Die abschließende Reinigung wurde durch präparative HPLC, unter Verwendung einer Microsorb C&sub1;&sub8; 5 um-Säule (21,4 · 250 mm) (Rainin Instruments) erzielt. Die Säule wurde mit Methanol- Wasser (74 : 26) eluiert, und wiederholte Injektion wurde verwendet, um das ganze Produkt aus der vorhergehenden Säule zu reinigen. Die Fraktionen, welche reines 29- Demethylrapamycin enthielten, wurden vereint und im Vakuum konzentriert, wobei ein weißer Feststoff erhalten wurde. Nach weiterem Trocknen im Vakuum wurden 198,9 mg 29- Demethylrapamycin erhalten. Die Fraktionen, welche die gegenständige Verbindung enthielten, wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Microsorb 5 um C&sub1;&sub8;- Säule (4,6 · 250 mm) (Rainin Instruments) und einer Upchurch Vorsäule (2,0 · 20 mm) analysiert. Das System wurde bei 30ºC betrieben und durch Ultraviolett-Absorption bei 275 nm überprüft. Die Säule wurde mit Methanol-Wasser (76 : 24) bei 1 ml/Minute eluiert. Unter diesen Bedingungen hatte die gegenständige Verbindung, welche als 29-Demethylrapamycin bezeichnet wird, eine Retentionszeit von 13,8 Minuten, welche sich von der von Rapamycin unterscheidet.
29-Demethylrapamycin wurde durch Massenspektroskopie-FAB [M + Na]&spplus; = 922 und durch magnetische Protonen- und ¹³C- Kernresonanzspektroskopie charakterisiert.

Antipilz-Aktivität von 29-Demethylrapamycin

Aktivitätsspektrum

Verfahren - Das Aktivitätsspektrum wurde dadurch bestimmt, dass Lösungen der Verbindung, welche in Natriumphosphatpuffer pH 6,6 hergestellt wurden, in Vertiefungen mit beimpften Sabouraud's Dextrose-Agar gegeben wurden. Die Aktivität wurde durch Messen des Bereichs einer Hemmung nach Inkubation bei 37ºC (Hefen und Aspergillus niger) oder 30ºC (andere filamentöse Pilze) für 24 Stunden getestet.
Ergebnisse - (Tabelle 1) Die erfindungsgemäße Verbindung hat in dem Agar-Diffusionstest ein breites Spektrum an Aktivität.

MIC-Daten

Verfahren - Die minimale Hemmkonzentration (MHK) wurde durch Verdünnen der Verbindung in einem Brühe-Medium in einer Microtiterschale bestimmt. Die Organismen wurden verdünnt und in die Vertiefungen gegeben, wobei schließlich ein Inokulat von etwa 10&sup5; Zellen/ml oder 10&sup4; Pilzsporen/ml bereitgestellt wurde. Die Schalen wurden bei 37ºC inkubiert und in Intervallen wurde die Trübung von jeder Vertiefung festgestellt. Die (MHK) wurde als die niedrigste Konzentration (in mg/ml) angenommen, welche in der Lage war, signifikantes Wachstum zu verhindern.
Ergebnisse - Siehe Tabelle 2. TABELLE 1 Bereich der Hemmung - (Durchmesser in mm) Durchmusterungstyp 107
a = Bereich mit trübem Rand
b = ganzer Bereich trüb TABELLE 2 Minimale Hemmkonzentration (ug/ml) (bestimmt 1 und 2 Tage nach Inkubation)
*Inokulum 10&sup5; Zellen/ml bzw. 10&sup4; Sporen/ml

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I), die 29- Demethylrapamycin ist, wobei das Verfahren die Züchtung eines produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces und die anschließende Isolierung von 29-Demethylrapamycin aus der Kultur umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (I) gemäß der Definition in Anspruch 1 die folgenden Merkmale hat:

(1) ein offensichtliches Molekulargewicht von 899 gemäß Massenspektroskopie durch Beschuß mit schnellen Atomen (FAB);

(ii) sie kann durch Züchtung eines Mikroorganismus der Gattung Streptomyces erhalten werden;

(iii) 13C-NMR-Spektroskopie ergibt 50 Kohlenstoffatome im Molekül;

(iv) sie zeigt Antipilz-Wirkung gegen Candida albicans, und

(v) sie zeigt immunosuppressive Eigenschaften.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Abtrennung der Verbindung von der Lösung davon im Gemisch mit anderen antibakteriell wirksamen Stoffen und/oder inaktiven Stoffen durch Adsorption an ein adsorbierendes Polymer.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der produzierende Mikroorganismus Streptomyces sp. NCIB 40319 ist.

5. Streptomyces sp. NCIB 40319 in einer biologisch seinen Form.