DE69419131T2 - Verfahren zur Desaktivierung von Enzymen und Mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur Desaktivierung von Enzymen und MikroorganismenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Desaktivierung von Enzymen und Mikroorganismen, das insbesondere in der Nahrungsmittelverarbeitung anwendbar ist.
- Die erfolgreiche Anwendung technischer Enzyme in der Nahrungsmittelverarbeitung erfordert im allgemeinen einen spezifischen Desaktivierungsschritt, nicht nur um die Reaktion auf einer bestimmten Stufe anzuhalten, sondern auch, um minimale bzw. nicht auffindbare Enzym-Restkonzentrationen im Endprodukt zu gewährleisten. Dies ist eine Grundbedingung für die Gewährleistung einer guten Qualität und Haltbarkeit (Lagerfähigkeit) der Erzeugnisse. Bezüglich der Lagerfähigkeit trifft die gleiche Bedingung auch auf endogene Enzyme in zahlreichen Nahrungsmittelerzeugnissen und -rohmaterialien zu, bei denen Restaktivitäten von Enzymen (zum Beispiel Lipasen und oxidierenden Enzymen) ernste Probleme im Ver auf der Verarbeitung und Lagerung hervorrufen können.
- Die Enzymdesaktivierung erfolgt normalerweise durch thermische Behandlung bei geeigneter Temperatur und geeignetem pH-Wert. Jedoch kann die zur völligen Beseitigung der Enzymaktivität erforderliche Behandlung negative Auswirkungen auf wichtige Eigenschaften (zum Beispiel Farbe, Geschmack, Konsistenz und Nährwert) der Erzeugnisse haben. Daher besteht ein allgemeines Interesse an der Entwicklung neuer Technologien, die zu einer erhöhten Enzymdesaktivierung bei niedrigeren Temperaturen führen.
- Die Entwicklung solcher Technologien ist besonders wichtig, da sie auch auf die Denaturierung vitaler Eiweissstoffe in lebenden Mikroorganismen, bei denen sie die Abtötungsraten während der Hitzebehandlung erhöhen könnten (nämlich in Verbindung mit der Sterilisierung von Nahrungsmittelerzeugnissen), und insbesondere auf die Desaktivierung von mikrobiellen Sporen der wichtigsten Nahrungsmittelverunreinigungen (Bakterien, Hefepilze, Schimmelpilze usw.) anwendbar sein sollten.
- Denaturierung und der Verlust der biologischen Aktivität von Eiweissstoffen werden durch Erhitzen erzielt. Die Wirkung wird besonders durch die Einwirkung von Säuren, Basen, organischen Lösungsmitteln, Detergentien sowie hohen Konzentrationen von Harnstoff oder Guanidin erhöht (d. h. immer dann, wenn die elektrische Ladung, die Wasseraktivität oder die Wasserstoffbrückenbindungen bezüglich der optimalen Bedingungen für höchste Enzymstabilität negativ beeinflusst werden). Jedoch sind die erwähnten Agentien mit Ausnahme von geringfügigen pH-Anpassungen durch Säure- oder Laugenzugabe in der Nahrungsmittelverarbeitung nicht anwendbar.
- Die Anwendung von hydrostatischen Drücken von mehr als 1000 bar ist als besondere Bedingung für die Konservierung und Sterilisierung von Milch bereits 1899 berichtet worden. Die Wirkung von Drücken bis zu 10 000 bar ist bei Temperaturen, die im Bereich von -25ºC bis 100ºC variiert wurden, umfassend von Timson und Short in "Resistance of Microorganisms to Hydrostatic Pressure" (Widerstand von Mikroorganismen gegenüber hydrostatischem Druck), Biotechnol. Bioeng. Band 7, Seiten 139-159 (1965), untersucht worden. Diese Autoren schlagen vor, dass Druck die Ionensolvatation und somit die Dissoziation schwacher Elektrolyte erhöht. Oberhalb von 2000 bar verändern die Dissoziation und Bildung von Tonenbindungen zwischen geladenen Gruppen auf Eiweissmolekülen deren Löslichkeit und führen zu deren Ausfällung und irreversibler Denaturierung (Desaktivierung von Enzymen). Es ist von Interesse zu vermerken, dass im Falle von Sporen bei sehr niedrigen Überlebensraten der Mikroorganismen die Dauer der Druckeinwirkung unwichtig ist, während oberhalb von 2000 bar die Temperatur verhältnismässig unwichtig ist. Druck hemmt Reaktionen, deren Endprodukte mehr Raum beanspruchen, und Drücke von mehr als 1000 bar scheinen der Hitze-Denaturierung der Eiweissstoffe entgegenzuwirken. Timson und Short schliessen, dass die Mechanismen der Druck-Denaturierung von Eiweissstoffen sich von denen der Hitze-Denaturierung unterscheiden.
- Darüber hinaus offenbart FR-A-2 650 942 ein Verfahren zur Desaktivierung von Enzymen in Nahrungsmitteln durch Erhitzen unter einem CO&sub2;- und/oder N&sub2;O- Druck, wobei die Temperatur und Dauer der Behandlung herabgesetzt werden können.
- Es ist daher ein erstes Ziel der vorliegenden Erfindung, dieses Verfahren durch Anwendung einer niedrigeren Temperatur und einer kürzeren Dauer der Behandlung zu verbessern und dabei noch eine wirksamere Desaktivierung zu erzielen.
- Auf einer rein theoretischen Grundlage wird vermutet, dass Kohlendioxid dazu tendiert, an Plätzen gelockerter Wasserstoffbrückenbindung einzudringen, während ein Enzym bei kritischen Temperaturen destabilisiert wird. Eine weitere Öffnung des Eiweissmoleküls erfolgt mit steigender Temperatur und steigendem Druck, und die Konformationsänderung kann zu einem Verlust von Enzymaktivität führen. Jedoch ist ein solcher Mechanismus sehr wahrscheinlich reversibel, so dass die Enzymaktivität wiederkehren sollte, wenn der CO&sub2;-Druck abgelassen ist.
- Es ist daher ein weiterer Zweck der vorliegenden Erfindung, das Problem der Reversibilität zu überwinden und ein Verfahren zu schaffen, das zu vollständiger und irreversibler Desaktivierung der Enzyme oder Mikroorganismen führt.
- Unerwartet haben nun die gegenwärtigen Erfinder gefunden, dass bei Durchführung der kombinierten Hitze- und CO&sub2;- oder N&sub2;O-Druckbehandlung des oben erwähnten französischen Dokuments in Gegenwart eines schwefelhaltigen Reduktionsmittels wie SO&sub2;, Cystein, Glutathion usw. die reaktiven Gruppen der Eiweissmoleküle, insbesondere -SH, jedoch auch -S-S-, -OH, -NH&sub2; usw., die gleichzeitig dem öffnenden Einfluss der Temperatur und des CO&sub2;- oder N&sub2;O-Drucks ausgesetzt sind, mit dem benannten Reduktionsmittel in irreversibler Weise reagieren.
- Folglich besteht der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der die oben erwähnten Ziele erreichen soll, in einem wie in Anspruch 1 beanspruchten Verfahren zur Desaktivierung von Enzymen oder Mikroorganismen insbesondere in Nahrungsmittelerzeugnissen, das die Hitzebehandlung der Enzyme oder Mikroorganismen in wässrigen Medien unter CO&sub2;- oder N&sub2;O-Druck und in Gegenwart eines unter aktiven, schwefelhaltigen Verbindungen ausgewählten Reduktionsmittels umfasst.
- Es sei zunächst festgehalten, dass mit dem Begriff "wässrige Medien" gemeint ist, dass ein Wassergehalt von zumindest 10% vorhanden sein sollte, und dass die zu desaktivierenden Mikroorganismen sowohl in ihrer vegetativen wie in ihrer Sporenform existieren.
- Als aktive, schwefelhaltige Verbindungen kann man zum Beispiel ein Sulfit einsetzen, das vorzugsweise als SO&sub2;-Gas in einer Entsprechung von etwa 10 bis 1000 ppm SO&sub2; und vorzugsweise 30 bis 100 ppm hinzugefügt wird. Gasförmiges SO&sub2; kann auch in der geeigneten Menge unter der Wirkung des CO&sub2;-Drucks aus einer verdünnten wässrigen Lösung von Natriumhydrogensulfit (NaHSO&sub3;) freigesetzt werden. Aktive Thiolverbindungen können ebenfalls vorteilhaft eingesetzt werden, zum Beispiel Glutathion, Cystein oder Thiamin in der reduzierten Form und in Konzentrationen zwischen etwa 0,05 und 0,5%.
- Natürlich sollte das Reduktionsmittel bevorzugt unter den für einen Einsatz in der Nahrungsmittelindustrie genehmigten Mitteln ausgewählt werden.
- Die Behandlungstemperatur entspricht den üblichen Nahrungsmittelverarbeitungstemperaturen, nämlich 50ºC bis 120ºC. Der Kohlendioxid- bzw. Distickstoffoxiddruck kann im Bereich von 5 bis 1000 bar und vorzugsweise zwischen 50 und 500 bar gewählt werden, so dass zum Beispiel eine CO&sub2;-Konzentration von mindestens 5 g/l, vorzugsweise 20 g/l oder mehr erreicht wird.
- Das Erzeugnis, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden soll, kann als Flüssigkeit oder Paste vorliegen; in diesem Falle kann die gasförmige, schwefelhaltige Verbindung, zum Beispiel SO&sub2;, direkt unter Rühren in die Flüssigkeit oder Paste eingespritzt werden. Wenn das Erzeugnis in fester Form vorliegt, zum Beispiel als festes Nahrungsmittel wie Kartoffeln, Gewürze oder sogar eine gekochte Speise, kann vorteilhafterweise das vorher erwähnte Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Einwirkung des CO&sub2;-Drucks und von SO&sub2; (zum Beispiel aus einer Lösung von Natriumhydrogensulfit) auf das Erzeugnis ohne jedes Rühren von aussen erfolgt.
- Die vorliegende Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die sich auf die beigefügten Zeichnungen beziehen.
- Fig. 1 bis 4 sind grafische Darstellungen, die die Ergebnisse der Beispiele berichten, und zwar insbesondere die Auswirkungen von CO&sub2; und 502 bzw. Glutathion auf die Desaktivierung zweier verschiedener Enzyme (Galactosidase und Lipase) und von Mikrobensporen (B. subtilis); die Grösse D ist diejenige Enzymdesaktivierungsdauer, die der Zeit entspricht, die erforderlich ist, um entsprechend der Gleichung
- D = t/(log[E]&sub0; - log[E]t)
- einen Abfall der Enzymaktivität um einen Faktor von zehn zu erzielen, wobei [E]0 die anfängliche Enzymkonzentration und [E]t die Enzymkonzentration nach einer Zeit t ist.
- 1,5 l einer Pufferlösung (0,1 M Natriumacetat, 0,02 M Galactose, pH 4,5) wurden unter Rühren bei 55ºC in einem 2-1-Glasautoklaven (Büchi, Höchstdruck 12 bar) thermostatisiert.
- Eine Lösung von Lactase (β-Galactosidase) von A. oryzae wurde mit einer Druckpumpe in das System eingespritzt, um darin eine Enzymendkonzentration von etwa 5 U/ml zu erreichen. Proben der Reaktionsmischung wurden in regelmässigen Abständen entnommen und auf Lactaseaktivität analysiert.
- Die genannte Prozedur wurde wiederholt, wobei jedoch die Pufferlösung zuerst bei einem Druck von 5 bar mit Kohlendioxid gesättigt wurde. Die ganze Folge wurde dann nochmals wiederholt, aber zuerst wurde der Pufferlösung so viel Natriumsulfit zugegeben, dass die 300 ppm SO&sub2; entsprechende Konzentration erreicht wurde. Die in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse erweisen die verstärkte Lactasedesaktivierung, die verzeichnet wird, wenn CO&sub2; mit SO&sub2; kombiniert wird. Die Lactase-Restaktivität in den durchreagierten Mustern wurde durch 30- minütige Inkubation mit p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid bei 30ºC und kolorimetrische Prüfung bei 410 nm bestimmt.
- Die in Beispiel 1 beschriebene Prozedur wurde unter Benutzung von Glutathion (reduzierte Form, 2 g/l) anstelle von Sulfit wiederholt. Die Kohlendioxidsättigung erfolgte bei 5,8 bar. Die in Fig. 2 berichteten Ergebnisse weisen ebenfalls deutlich die verstärkte Lactasedesaktivierung nach, die zu verzeichnen ist, wenn CO&sub2;-Druck mit einer aktiven Thiolverbindung kombiniert wird.
- 1,5 l einer 24 mg/l Ölsäure enthaltenden, 0,08 M Natriumcitrat-Pufferlösung (pH 6,5) wurden wie in Beispiel 1 in einem 2-1-Glasautoklaven auf 55ºC thermostatisiert. Mit einer Druckpumpe wurde eine Lipaselösung (M10 Amano) in das System eingespritzt, um darin eine Enzymendkonzentration von etwa 0,5 U/ml zu erreichen. Proben der Reaktionsmischung wurden in regelmässigen Zeitabständen abgezogen und auf Lipaseaktivität analysiert.
- Die genannte Prozedur wurde wiederholt, wobei aber die Pufferlösung bei einem Druck von 8 bar mit Kohlendioxid gesättigt war. Letztere Prozedur wurde nochmals wiederholt, wobei aber zuerst so viel Natriumsulfit zu der Pufferlösung gegeben wurde, dass die 500 ppm SO&sub2; entsprechende Konzentration erreicht wurde. Die in Fig. 3 dargestellten Ergebnisse erweisen wiederum die Verstärkung der Lipasedesaktivierung, die zu verzeichnen ist, wenn CO&sub2;-Druck mit SO&sub2; kombiniert wird.
- Die Lipase-Restaktivität wurde durch Inkubation der Reaktionsmischung mit Olivenöl bei 37ºC bestimmt. Die freien Fettsäuren wurden mit einer Abwandlung der von Koops und Klomp in Neth. Milk Dairy J., Band 31, Seiten 56-74 (1977) beschriebenen kolorimetrischen Kupferseifenmethode bestimmt.
- 3,5 l sterilen, entmineralisierten Wassers wurden mit 0,5 l einer Aufschlämmung von B. subtilis-Sporen (die als eine hitzeresistente Nahrungsmittelverunreinigung isoliert worden waren) angeimpft, um eine CFU-Zählung (CFU = colony forming units, koloniebildende Einheiten) von etwa 1 · 10&sup6;/ml zu erreichen, und in einem rostfreien 5-Liter-Stahlautoklaven (Brignole-Nova, Höchstdruck 300 bar) rasch unter Rühren auf eine Temperatur von 100ºC thermostatisiert. Proben wurden in regelmässigen Zeitabständen unter Druck abgezogen. Lebensfähige Zellen wurden mit der standardisierten Plattenprüfmethode ausgezählt.
- Die genannte Prozedur wurde wiederholt, wobei jedoch die Aufschlämmung der Mikrobensporen mittels eines Membrankompressors mit Kohlendioxid aus einer Gasflasche auf 150 bar aufkomprimiert wurde. Proben wurden in regelmässigen Zeitabständen durch eine Druckdichtung hindurch abgezogen. Nach 60 min wurden 60 ml Sulfit in das System eingespritzt, um eine 15 ppm SO&sub2; entsprechende Konzentration zu erzielen. Die in Fig. 4 dargestellten Ergebnisse weisen ebenfalls die Erhöhung der Desaktivierungsgeschwindigkeit von Mikrobensporen unter der Einwirkung von SO&sub2; nach.
- Die nach der Druckbehandlung verbleibende restliche Mikrobenzahl wurde in koloniebildenden Einheiten (CFU pro ml) sowohl direkt in unbehandelten Proben wie in für 10 min bei 80ºC behandelten Proben bestimmt. Die Prüfung erfolgte durch Aufgabe von jeweils 0,1 ml durch Verdünnungsreihen der Proben mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewonnener Lösungen auf Nähragar und mehr als dreitägige Inkubation bei 37ºC. Die Desaktivierungszeit D wurde mit der Gleichung
- D = t/(log[CFU]&sub0; - log[CFU]t)
- bestimmt, worin [CFU]&sub0; und [CFU]t die (nicht bei 80ºC desaktivierten) Mikrobensporenzahlen bei den Zeiten 0 und t sind.
- Ganze rohe, in einem Nylonnetz befindliche Kartoffeln wurden in den in Beispiel 4 beschriebenen Autoklaven eingehängt. Der Autoklav wurde mit einer Geschwindigkeit von 3,2 bar/min auf einen Kohlendioxidenddruck von 165 bar gebracht, gleichzeitig wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,75ºC/min Wärme zugeführt, um im Gefäss eine Temperatur von 55ºC zu erreichen. Die Kartoffelprobe wurde für 20 min bei 165 bar und 55-60ºC gehalten. Entspannung und Abkühlung auf 10ºC erfolgten über eine Zeitdauer von 40 min mit einer Geschwindigkeit von -4 bar/min. Ausgeschwitzte Flüssigkeit von einer Probe der in Scheiben geschnittenen, druckbehandelten Kartoffeln zeigte fortschreitende Bräunung beim Stehen, was auf die Gegenwart restlicher Polyphenoloxidase hinweist.
- Wenn die gleichen Behandlungsbedingungen in Gegenwart einer verdünnten Lösung von Natriumhydrogensulfit (in Wasser), die auf den Boden des Druckgefässes gesetzt wurde, angewendet werden, erweist sich das Produkt als gegen die Bräunungsreaktion stabilisiert, während die natürlichen Merkmale der rohen Kartoffel bewahrt werden. Der Eindringeffekt beim kombinierten Einsatz von Schwefeldioxid und überkritischem Kohlendioxid wird hier im Falle eines typischen "festen Nahrungsmittelerzeugnisses" durch die vollständige Desaktivierung der Polyphenoloxidase demonstriert.
Claims (9)
1. Verfahren zur Desaktivierung von Enzymen und Mikroorganismen
insbesondere in Nahrungsmittelerzeugnissen, das die Hitzebehandlung der benannten
Enzyme oder Mikroorganismen bei 50 bis 120ºC in einem wässrigen Medium unter
einem Kohlendioxid- oder Distickstoffoxiddruck im Bereich von 5 bis 1000 bar und
in Gegenwart eines unter aktiven, schwefelhaltigen Verbindungen ausgewählten
Reduktionsmittels umfasst.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Reduktionsmittel ein Sulfit ist.
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, worin das Sulfit flüssiges oder gasförmiges
SO&sub2; in einer Entsprechung von 10 bis 1000 ppm SO&sub2;, bevorzugt 30 bis 500 ppm ist.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, worin das gasförmige SO&sub2; aus einer
verdünnten wässrigen Lösung von Natriumhydrogensulfit freigesetzt wird.
5. Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Reduktionsmittel eine aktive
Thiolverbindung ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin die Thiolverbindung Glutathion oder
Cystein oder Thiamin in der reduzierten Form in Konzentrationen in Bereich von
0,05 bis 0,5% ist.
7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der CO&sub2;- oder N&sub2;O-
Druck im Bereich von 50 bis 500 bar liegt, so dass die CO&sub2;- oder N&sub2;O-Konzentration
wenigstens 5 g/l, vorzugsweise etwa 20 g/l beträgt.
8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung von
Erzeugnissen in flüssiger oder pastöser Form, worin die aktive, schwefelhaltige
Verbindung als ein Gas unter Rühren direkt in die benannte Flüssigkeit oder Paste
eingespritzt wird.
9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung fester
Nahrungsmittelerzeugnisse, worin die Wirkung des CO&sub2;- oder N&sub2;O-Druckes und der
gasförmigen schwefelhaltigen Verbindung von aussen her ohne Rühren ausgeübt
wird.
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