DE69333962T2

DE69333962T2 - Modifizierte zellen auf der basis des betain-katabolismus, herstellung und verwendung insbesondere zur herstellung von metaboliten oder enzymen

Info

Publication number: DE69333962T2
Application number: DE69333962T
Authority: DE
Inventors: Bωatrice CAMERON; Joel Crouzet
Original assignee: Rhone Poulenc Biochimie SA
Current assignee: Rhone Poulenc Biochimie SA
Priority date: 1992-12-09
Filing date: 1993-12-07
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2013-12-08
Also published as: EP0673422B1; USRE38331E1; ES2255052T3; FR2698879A1; DE69333962D1; CA2151123C; DK0673422T3; US5691163A; JPH08505286A; EP0673422A1; CA2151123A1; JP3488924B2; FR2698879B1; ATE315091T1; WO1994013813A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zellen, die auf dem Level des Katabolismus von Betain modifiziert sind, ihre Herstellung und ihre Verwendung, insbesondere zur verbesserten Herstellung von Metaboliten und/oder Enzymen. Die Erfindung betrifft auch DNA-Fragmente, die Gene des Katabolismus des Betains tragen.
Glycinbetain (N,N,N-Trimethylglycin) ist allgemein wegen seiner osmoprotektiven Eigenschaften bekannt, indem es Bakterien Toleranz gegen osmotischen Stress verleiht (Csonka, 1989). Um den Ursprung dieser Eigenschaft zu erklären, wurde vorgeschlagen, dass die molekularen Effekte des Glycinbetains auf die Aktivität des Wassers und den osmotischen Druck des Cytoplasmas bei Escherichia coli wichtiger sind als die der gelösten Stoffe, die es ersetzt (Cayley et al., 1992). Es wurde außerdem beschrieben, dass Glycinbetain über seine osmoprotektiven Fähigkeiten hinaus, auch die Produktion von Enzymen ( JP 8260709 ) oder Metaboliten, wie Aminosäuren (JP-Patent 202703); von Antibiotika (AU-Patent 825513) und Vitaminen (White et al., 1971) begünstigen kann. Jedenfalls synthetisiert die Mehrzahl der Bakterien, außer Cyanobakterien und anderen Prokaryoten, die CO₂ fixieren, kein Glycinbetain, das hauptsächlich durch die Pflanzen synthetisiert wird. Dieses muss demnach den Produktionsmedien in den Fermentern zugesetzt werden, was zusätzliche Kosten in einem industriellen Verfahren erzeugt.
Die vorliegende Erfindung bietet eine Lösung für dieses Problem.
Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass es möglich ist, durch Modifizierung des Katabolismus des Betains der Zellen, insbesondere durch genetische Mittel, den Effekt dieser Verbindung auf die Produktion von Enzymen oder Metaboliten zu steigern, ohne die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen, ihre Lebensfähigkeit usw. unter den industriellen Fermentationsbedingungen zu beeinträchtigen. Die Anmelderin hat auch DNA-Fragmente identifiziert, isoliert und charakterisiert, die Gene enthalten, die im Katabolismus des Betains involviert sind, die es insbesondere ermöglichen, Zellen herzustellen, die auf dem Level des Katabolismus des Betains spezifisch modifiziert sind, und deren Modifikationen segregationsstabil sind und nicht reversibel sind. Diese Fragmente ermöglichen es auch, den Katabolismus des Betains durch Amplifikation der geeigneten enzymatischen Aktivitäten zu stimulieren. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es somit, die Effekte des Betains zu verstärken und somit diese Verbindung in ökonomischer Weise in den industriellen Fermentationsverfahren zu nutzen.
Eine erste Aufgabe der Erfindung betrifft demnach eine modifizierte Zelle, die eine Modifikation wenigstens auf dem Level eines Gens aufweist, das im Katabolismus des Betains beteiligt ist.
In einer ersten besonderen Ausführungsform bezeichnet der Ausdruck "modifizierte Zelle" insbesondere jede Zelle, die eine Substitution und/oder eine Deletion und/oder eine Insertion einer Base oder mehrerer Basen in dem Gen oder denen Genen, die in Betracht gezogen werden, aufweist und die das Betain weniger schnell abbaut. Derartige Modifikationen können in vitro (an den isolierten DNA-Fragmenten, die Gene des Katabolismus des Betains tragen) oder in situ beispielsweise mit Hilfe der Gentechnologie oder auch indem die genannten Zellen einer Behandlung mit mutagenen Mitteln unterzogen werden werden, erhalten werden.
Unter den mutagenen Mitteln kann man z.B. die physikalischen Mittel, wie energetische Strahlen (Röntgenstrahlen, g-Strahlen, ultraviolette Strahlen usw.) oder chemische Mittel, die fähig sind, mit verschiedenen funktionellen Gruppierungen der DNA-Basen zu reagieren und z.B. die Alkylierungsmittel [Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, N-Nitrochinolin-l-oxid (NQO)], Bialkylierungsmittel, Interkalationsmittel usw. nennen.
Unter Deletion versteht man die Unterdrückung des betrachteten Gens ganz oder teilweise. Es kann sich insbesondere um einen Teil der codierenden Region und/oder der ganzen Promotorregion der Transkription oder einen Teil davon handeln.
Die genetischen Modifikationen können auch durch Genunterbrechung erhalten werden, z.B. nach dem Protokoll, das zuerst von Rothstein (1983) beschrieben wurde. In diesem Fall ist das ganze Gen oder ein Teil des Gens vorzugsweise gestört, um durch homologe Rekombination den Ersatz der genomischen Wildsequenz durch eine nicht-funktionelle oder mutante Sequenz, die in vitro hergestellt wurde, zuzulassen.
Die Modifikation (en) kann (können) im codierenden Teil des Gens oder in den Regionen, die für die Expression und/oder Transkriptionsregulation der Gene verantwortlich sind, lokalisiert sein. Die Unfähigkeit (ganz oder partiell) der genannten Zellen, Betain abzubauen, kann sich entweder durch die Produktion von inaktiven Enzymen infolge von strukturellen oder Konformationsmodifikationen oder durch Fehlen der Produktion oder durch Produktion von Enzymen, die veränderte Aktivität haben, oder auch durch Produktion von natürlichen Enzymen auf einem geschwächten Niveau oder nach einem gewünschten Regulationsmodus zeigen.
Im Übrigen können bestimmte Modifikationen, wie z.B. Punktmutationen, von Natur aus durch Zellmechanismen korrigiert oder abgeschwächt werden, beispielsweise während der Replikation der DNA, die der Zellteilung vorausgeht. Solche genetischen Modifikationen haben dann auf industriellem Niveau ein begrenztes Interesse, denn die phänotypischen Eigenschaften, die daraus resultieren, sind nicht vollkommen stabil. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es jetzt dank der Identifizierung von DNA-Fragmenten, die Gene des Katabolismus des Betains tragen, möglich, modifizierte Zellen herzustellen, in denen die Modifikation (en) segregationell stabil ist (sind) und/oder nicht reversibel ist (sind). Die Zellen, die solche Modifikationen zeigen, sind als Wirtszelle für die Produktion von Metaboliten und/oder Enzymen besonders vorteilhaft.
Nach den im Wesentlichen an Rizobium meliloti durchgeführten Studien erfolgt der Abbau des Glycinbetains auf Medien mit schwacher Osmolarität durch drei sukzessive Demethylierungen (siehe 1). Die erste Stufe wird durch die Betain-Homocystein-Methyltransferase E.C.2.1.1.5. katalysiert und führt zu Dimethylglycin; die zweite wird durch die Dimethylglycindehydrogenase E.C. 1.5.99.2. katalysiert und bildet Monomethylglycin oder Sarcosin; schließlich wird die dritte durch die Sarcosindehydrogenase E.C. 1.5.99.1. katalysiert, und das Produkt der Reaktion ist Glycin (Smith et al., 1988).
Vorzugsweise beeinflussen die Modifikationen, die die Zellen der Erfindung zeigen, einen der zwei ersten Stufen des Katabolismus des Betains oder gegebenenfalls die zwei ersten Stufen gleichzeitig.
Vorzugsweise sind die Zellen der Erfindung Produzentenzellen von Metaboliten und/oder Enzymen. In dieser Hinsicht kann es sich auch um rekombinante Produzentenzellen für Metaboliten und/oder Enzyme handeln, d.h. Zellen, die durch DNA-Rekombinationstechniken im Hinblick auf die Verbesserung ihrer Produktionskapazität modifiziert wurden (siehe insbesondere WO 91/11518, EP 0 346 000 ). Noch bevorzugter werden die Zellen der Erfindung unter den Zellen der Gattung Pseudomonas, Streptomyces, Actinomycetes, Propionibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Rhizobium, Agrobacterium, Rhodopseudomonas, Xanthomonas, Clostridium und Methanobacterium ausgewählt.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die eine Modifikation eines Gens zeigen, das wenigstens im Katabolismus des Betains involviert ist, wobei diese unter industriellen Fermentationsbedingungen verwendbar sind.
Die vorliegende Erfindung beschreibt in der Tat die Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von DNA-Fragmenten, die Gene enthalten, die im Katabolismus des Betains impliziert sind. Diese Fragmente ermöglichen es nun, Zellen herzustellen, die spezifisch auf dem Level des Katabolismus des Betains modifiziert sind. Es ist in der Tat möglich, die beschriebenen Fragmente in vitro zu modifizieren, um sie nichtfunktionell zu machen und sie wieder in eine bestimmte Zelle einzuführen, in der sie durch homologe doppelte Rekombination in die entsprechende funktionelle genomische Kopie eintreten. Auf der Basis der so isolierten Fragmente ist es auch möglich, Sonden zu entwickeln, die sich in das Genom einer gewünschten Zelle spezifisch in dem entsprechenden Gen integrieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht insbesondere darin, das in Betracht gezogene chromosomale Gen oder die in Betracht gezogenen chromosomalen Gene durch in vitro-modifizierte Versionen zu ersetzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein DNA-Fragment, das ein Gen wenigstens des Katabolismus des Betains trägt.
Die vorliegende Erfindung wird insbesondere durch die Isolierung und die Charakterisierung von DNA-Fragmenten von Pseudomonas denitrificans veranschaulicht, welche die Mutanten, welche im Katabolismus des Glycinbetains zu Dimethylglycin blockiert sind, und die, die im Katabolismus des Dimethylglycins in Sarcosin blockiert sind, ergänzen; das heißt, die DNA-Fragmente, die die Gene enthalten, welche im Abbau des Glycinbetains zu Dimethylglycin und des Dimethylglycins zu Sarcosin involviert sind. Die DNA-Fragmente gemäß der vorliegenden Erfindung wurden ausgehend von einem Stamm Pseudomonas denitrificans SC510 isoliert, der von dem Stamm MB580 (US-Patent 3 018 225) abgeleitet ist. Diese Fragmente wurden erhalten durch:

(i) Herstellung von Mutanten, die im Katabolismus des Betains blockiert sind. Zu diesem Zweck sind verschiedene, weiter oben bereits genannte Techniken einsetzbar. Die Selektion der Mutanten erfolgt auf geeignetem Medium und mit geeigneter Dosierung des Betains oder der Produkte seines Katabolismus nach für den Fachmann klassischen Techniken.
(ii) Komplementierung dieser Mutanten mit der Nucleinsäure eines Mikroorganismus, der fähig ist, das Betain zu katabolisieren,
(iii) Selektion der komplementierten Mutanten, dann Isolierung und Charakterisierung der Nucleinsäure, die diese Komplementierung erlaubt, die daher Gene des Katabolismus des Betains trägt.

Es ist klar, dass der Fachmann, ausgehend von den in der vorliegenden Anmeldung identifizierten und isolierten DNA-Fragmenten, insbesondere durch Hybridisierungsexperimente, Gene des Katabolismus des Betains, ausgehend von anderen zellulären Quellen, isolieren und klonieren kann.
Bevorzugter handelt es sich demnach um das Gen, das für die Betain-Homocystein-Methyltransferase codiert, auf dem eine erfindungsgemäße Modifikation in der Zelle eine Verringerung der Betain-Homocystein-Methyltransferase-Aktivität induziert. Noch bevorzugter handelt es sich um das Gen, das für die Dimethylglycindehydrogenase codiert, auf dem eine Modifikation gemäß der Erfindung in der Zelle eine Verringerung der Dimethylglycindehydrogenase-Aktivität induziert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Produktion von Metaboliten oder Enzymen durch Kultur einer Produzentenzelle für den Metaboliten oder das Enzym, die auf dem Level ihres Katabolismus des Betains modifiziert ist, unter Produktionsbedingungen, dann Isolierung des Metaboliten oder des Enzyms.
Nach einer ersten Ausführungsform weist die Produzentenzelle eine Modifikation wenigstens auf dem Level eines Gens auf, das beim Katabolismus des Betains beteiligt ist, und baut Betain weniger schnell ab.
Nach der ersten Ausführungsform ist die Modifikation (sind die Modifikationen) segregationell stabil und/oder nicht reversibel.
In einer bevorzugten Variante der Erfindung ist die Modifikation oder sind die Modifikationen Deletions- und/oder Mutationsinsertionen.
Nach einer zweiten Ausführungsform wird ein Gen wenigstens der Produzentenzelle, das im Katabolismus des Betains impliziert ist, amplifiziert und die genannte Zelle baut das Betain schneller ab.
Das Verfahren der Erfindung ist insbesondere an die Produktion von Metaboliten, wie z.B. Aminosäuren, Vitamine, Antibiotika, ihre Derivate oder Vorläufer, angepasst.
Das Verfahren der Erfindung kann insbesondere die verbesserte Produktion von Cobalamin und vorzugsweise von Vitamin B12 ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele vervollständigt, die lediglich als erläuternd und nicht als beschränkend anzusehen sind.
Allgemeine Techniken der Molekularbiologie
Die klassischerweise verwendeten Methoden der Molekularbiologie, z.B. präparative Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugation von Plasmid-DNA mit Cäsiumchloridgradienten, Elektrophorese auf Agarosegel oder Acrylamidgel, Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, Extraktion von Proteinen in Phenol oder Phenol-Chloroform, DNA-Präzipitation in Salzmedium durch Ethanol oder Isopropanol, Transformation in Escherichia coli usw., sind dem Fachmann gut bekannt und in der Literatur ausgiebig beschrieben [T. Maniatis et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; F.M. Ausubel et al. (Herausg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs) oder Pharmacia geliefert und wurden nach den Empfehlungen der Lieferanten verwendet.
Die Plasmide des Typs pBR322 und pUC sind kommerziellen Ursprungs (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligationen werden die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe durch Elektrophorese an Agarosegel oder Acrylamidgel getrennt, in Phenol oder durch ein Phenol/Chloroform-Gemisch extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, dann in Gegenwart der DNA-Ligase des Phagen T4 (Boehringer) nach den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert.
Die Auffüllung der vorstehenden 5'-Enden erfolgt durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli entsprechend den Spezifikationen des Lieferanten. Die Zerstörung der vorstehenden 3'-Enden erfolgt in Gegenwart der DNA-Polymerase des Phagen T4, die entsprechend den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Der Abbau der vorstehenden 5'-Enden erfolgt durch eine schonende Behandlung durch Nuclease S1.
Die ortsspezifische in vitro-Mutagenese durch synthetische Oligodesoxynucleotide wird nach dem Verfahren durchgeführt, das von Taylor et al. entwickelt worden war [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764].
Die enzymatische Amplifikation der DNA-Fragmente durch die PCR genannte Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, R.K. Saiki et al., Science 230 (1985) 1350-1354; K.B. Mullfis und F.A. Faloona, Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] wird unter Verwendung eines "DNAthermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) nach den Beschreibungen des Herstellers durchgeführt.
Der Beweis der Nucleotidsequenzen erfolgt durch das von Sanger et al. entwickelte Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467].

Betain:: Glycinbetain oder N,N,N-Trimethylglycin
HPLC:: Hochdruckflüssigkeitschromatographie
DMG:: Dimethylglycin
kb:: Kilobase

Legende der Figuren:
1: Abbauweg des Glycinbetains zu Glycin. Es finden drei aufeinander folgende Demethylierungen statt, das Glycinbetain wird zu Dimethylglycin katabolisiert, das zu Sarcosin abgebaut wird, das selbst zu Glycin abgebaut wird.
2: Wachstumskurve in Minimalmedium M. Der nichtmutierte Stamm SBL27 Rif^τ und die Mutanten G3728 und G3900 werden in Minimalmedium M in Gegenwart von Glycinbetain als Kohlenstoffquelle kultiviert, ihr Wachstum wird auf der X-Achse als Anzahl der Zellen pro ml in Funktion der Zeit in Tagen, die auf der Abszisse aufgetragen ist, dargestellt.
3: Kartographie des DNA-Fragments von P. denitrificans, das die Mutanten G3728, G3736, G3899 und G3900 komplementiert. Auf dem DNA-Fragment sind die Restriktionsstellen und die Position der Insertion des Transposons der entsprechenden Mutanten G3728, G3899 und G3900 angegeben. Unter dem Fragment sind die Inserts der Plasmide pXL2100, pXL2101, pXL2105 und pXL2107 dargestellt, die verwendet werden, um die Mutanten zu komplementieren. + Komplementierung, – keine Komplementierung.
4: Kartographie des DNA-Fragments von P. denitrificans, das die Mutanten G3727 und G3738 komplementiert. Auf dem DNA-Fragment sind die Restriktionsstellen und die Position der Insertion des Transposons von G3738 angegeben. Unterhalb des Fragments tritt eine Reihe der Inserts der Plasmide pXL19E2, pXL17A10 und pXL13C5 auf, die verwendet wurden, um die Mutanten zu komplementieren.
+ Komplementierung, – keine Komplementierung.
Beispiel 1 – Isolierung von Mutanten von Pseudomonas denitrificans, die im Katabolismus des Glycinbetains blockiert sind.
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung von Mutanten von Pseudomonas denitrificans, die im Katabolismus des Glycinbetains zu Dimethylglycin und Sarcosin blockiert sind. Diese Mutanten wurden ausgehend von einer Mutantenbank, in der das Transposon Tn5Sp^r in das Genom des Stamms Pseudomonas denitrificans SBL27 Rif^r insertiert ist, isoliert. Diese Bank wurde in folgender Weise verwirklicht: ein Plasmid, das pRK2013::Tn5Sp^r genannt wird, wurde konstruiert, indem das Gen für Resistenz gegen Spectinomycin Sp^r aus dem Plasmid pHP45Ω (Prentki et al., 1984) in die BamHI-Stelle des Transposons Tn5 (Berg et al., 1983), das in das Plasmid pRK2013::Tn5 kloniert war (Ditta et al., 1890) insertiert wurde. Danach wurde eine Konjugation durchgeführt, indem die Kulturen von SBL27Rif^τ und E. coli MC1060 (pRK2013::Tn5Sp^r) in exponentieller Phase gemischt wurden. Die Transkonjuganten Rif^rSp^r wurden nach Inkubation während 5 Tagen bei 30°C mit einer Häufigkeit von 10^–8 Klone pro Empfängerzelle erhalten. Für 12 Klone wurde bestätigt, dass das eingeführte Plasmid verloren gegangen war (die Plasmid-DNA war hergestellt worden, dann durch Transformation in E. coli eingeführt worden; es wurde kein Klon erhalten, der die Resistenz des Plasmids trägt) und dass das Transposon Tn5Sp^r gut in das Genom von SBL27Rif^τ integriert worden war (durch Southern, wie in Beispiel 2 beschrieben).
Ungefähr 3000 Mutanten dieser Bank wurden auf festem Minimalmedium M (1 g/l NH₄Cl, 7 g/l Na₂HPO₄, 3 g/l KH₂PO₄, 0, 5 g/l NaCl, 1 mM MgSO₄, 0,1 mM CaCl₂, 10 mg/l Thiamin) (15 g/l Difco-Agar), in dem die Kohlenstoffquelle Glycinbetain, 10 g/l ist, wieder isoliert, dann für 3 Tage bei 30°C inkubiert. Danach wurden Betain, Dimethylglycin und Sarcosin nach Abtrennung durch HPLC (Säule: Shodex Ionpak S 801 P, Länge: 50 cm, Durchmesser: 8 mm, Temperatur: 70°C, mobile Phase: 0,01 M Natriumnitrid) und Detektion durch differenzielle Refraktometrie bestimmt.
18 Mutanten wurden nachgewiesen, die Betain nicht mehr als Kohlenstoffquelle verwenden; diese sind G3727 bis G3731, G3733 bis G3742 und G3897, G3899 und G3900.
Wenn andererseits diese Mutanten nach dem bereits beschriebenen Protokoll (Cameron et al., 1989) in 10 ml PS4-Medium 5 Tage lang bei 30°C kultiviert werden, können Betain oder Dimethylglycin oder Sarcosin im Kulturüberstand nach Abtrennung durch HPLC und Detektion durch differenzielle Refraktometrie nachgewiesen werden. Betain wird im Überstand der Brühe der Mutanten G3728, G3736, G3897, G3899 und G3900 (zwischen 53 und 98% des Betains, das im Anfangsmedium enthalten ist) detektiert; bei den Mutanten G3727, G3738 und G3742 ist es dagegen das Methylglycin (ungefähr 88 bis 97% des Betains, das im Anfangsmedium enthalten ist); bei den Mutanten G3729, G3730, G3731, G3733, G3737 und G3741 ist es das Sarcosin (ungefähr 64 bis 75% des in das Medium eingeführten Betains); bei den anderen Mutanten G3734, G3735, G3739 und G3740 und bei dem nicht-mutierten Stamm wird keines der drei Produkte beobachtet, siehe Tabelle 1.
Darüber hinaus sprießen SBL27 Rif^r und die Mutanten G3728, G3736, G3897, G3899 und G3900 auf festem Minimalmedium M, indem die Kohlenstoffquelle Dimethylglycin ist (10 g/l). Kulturen in flüssigem Minimalmedium M, bei dem die Kohlenstoffquelle das Glycinbetain mit 10 g/l ist, werden wie folgt durchgeführt: ausgehend von einer Wiederisolierung auf reichhaltigem LB-Medium (Cameron et al., 1989) wird der Stamm in 5 ml LB-Medium mit 30°C während 12 Stunden kultiviert; die Zellen dieser Vorkultur werden in Minimalmedium M gewaschen, dann werden Inoculi mit 0,2% in acht 250 ml-Erlenmeyer-Kolben, die 25 ml Minimalmedium M, in dem die Kohlenstoffquelle des Glycinbetains ist (10 g/l), eingeimpft und unter Rühren bei 250 U/min bei 30°C inkubiert. An den Tagen 3, 4, 5, 6, 10, 14, 21 werden die Zellen, die in einem Erlenmeyer-Kolben enthalten sind, nach Ausbreitung und Wachstum auf festem Minimalmedium, in dem die Kohlenstoffquelle das Glycinbetain ist, gezählt. Als die Mutanten G3728 und G3900 in flüssigem Minimalmedium, in dem die Kohlenstoffquelle das Glycinbetain ist (10 g/l), kultiviert wurden, wurde während der ersten drei Tage kein Wachstum beobachtet, während mit dem Stamm SBL27 Rif^r die stationäre Phase schon erreicht war; siehe 2; dagegen wurde am 6. Tag eine stationäre Phase vergleichbar der von SBL27 Rif^r beobachtet. Dieses Resultat zeigt, dass die Mutanten, die nicht das ganze Betain (10 g/l), das im Medium PS4 enthalten ist, abbauen, siehe Tabelle 1, fähig sind, nach einer Latenzphase von 3 Tagen im Vergleich zu dem nicht-mutierten Stamm Betain als Kohlenstoffquelle in einem Minimalmedium, das 10 g/l Betain enthält, zu verwenden.
Diese physiologischen Angaben ermöglichen es, bei Pseudomonas denitrificans SBL27 Rif^r einen Abbauweg für das Glycinbetain in Dimethylglycin und Sarcosin zu zeigen, wobei:

1) Die Stufe des Abbaus des Glycinbetains in Dimethylglycin blockiert ist (oder teilweise blockiert ist) bei den Mutanten G3728, G3736, G3987, G3899 und G3900;
2) die Stufe des Abbaus des Dimethylglycins zu Sarcosin bei den Mutanten G3727, G3738 und G3742 blockiert ist;
3) die Stufe des Abbaus des Sarkosins bei den Mutanten G3729, G3730, G3731, G3733, G3737 und G3741 blockiert ist.

Beispiel 2 – Genetische Charakterisierung der Mutanten von Pseudomonas denitrificans, die bezüglich des Katabolismus des Betains blockiert sind.
Dieses Beispiel beschreibt die molekularbiologischen Experimente, die es ermöglichen, die Mutanten mit Hilfe ihres Transposons zu klassifizieren und zu charakterisieren. Der Genotyp jeder Mutante wird durch Southern (Maniatis et al., 1982) wie folgt analysiert:
die genomische DNA jeder Mutante (G3727 bis 3731, G3733 bis G3742 und G3897, G3899 und G3900) wurde präpariert, dann wurde ein Aliquot durch das Restriktionsenzym EcoRI verdaut; die so erhaltenen Fragmente wurden durch Elektrophorese an einem Agarosegel getrennt, dann auf eine Biodyne-Membran transferiert; diese Membran wurde dann mit einem der folgenden Plasmide, das mit α³²P-dCTP markiert war, hybridisiert. Diese Plasmide waren pT27, pT28, pT30, pT31, pT34, pT35, pT36, pT38, pT39, pT40, pT42, pT97, pT00. Diese Plasmide wurden durch Insertion an der EcoRI-Stelle des Vektors pRK290 des eindeutigen genomischen EcoRI-Fragments, in das das Transposon Tn5Sp^r der Mutanten G3727, G3728, G3730, G3731, G3734, G3735, G3736, G3737, G3738, G3739, G3740, G3742, G3897, G3900 insertiert war, erhalten. Die Plasmide pT, die das gesuchte EcoRI-Fragment trugen, wurden durch ihre Resistenz gegenüber Spectinomycin, die durch das Transposon verliehen wurde, selektioniert. Indem die Membran z.B. mit dem Plasmid pT27 hybridisiert wird, wies die genomische DNA der Mutanten G3727 und G3738 nur eine einzige radioaktive Bande auf, die ein EcoRI-Fragment mit einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kb entspricht, was anzeigt, dass in diesen Mutanten das Transposon am selben Ort insertiert wurde. Dagegen ist für den nicht-mutierten Stamm das hybridisierende Fragment 8 kb und bei allen anderen Mutanten hybridisieren zwei Fragmente, das eine wandert zusammen mit dem des nicht-mutierten Stamms und das andere besitzt eine variable Größe über der Größe des Transposons (8 kb) (de Bruijn, 1987; Prentki, 1984). Die sukzessiven Hybridisierungen mit jedem der Plasmide hat es erlaubt, die Mutanten in Hybridisierungsklassen 1 bis 12 einzuteilen; siehe Tabelle 1.
Andererseits wurden die Plasmide pT27, pT28, pT30, pT31, pT34, pT36, pT37, pT38, pT97, pT00 verwendet, um durch homologe doppelte Rekombination die Mutation, die aus der Insertion des Transposons stammt, wieder in den nicht-mutierten Stamm SBL27 Rif^r nach einem bereits beschriebenen Protokoll (Cameron et al., 1991) wieder einzuführen. Für die Stämme, die so durch genetische Unterbrechung erhalten wurden, wurde der Genotyp durch Southern bestätigt, wie es bereits in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben worden war; der Phenotyp wurde nach Analyse der in den Überstand der Kulturen in PS4-Medium detektierten Verbindungen wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt.
Für alle Stämme, die durch Genunterbrechung erhalten wurden, die zum selben Phenotyp führen wie die anfänglichen mutierten Stämme, siehe Tabelle 1, sind die Mengen der detektierten Verbindungen vergleichbar. Diese Stämme gehören:

1) entweder zur Hybridisierungsklasse 5 und akkumulieren Betain,
2) oder zur Hybridisierungsklasse 2 und akkumulieren Dimethylglycin,
3) oder zur Hybridisierungsklasse 4 und akkumulieren Sarcosin.

Darüber hinaus wurde eine Deletion eines genomischen BglII-Fragments mit 10 kb und die Insertion einer Kassette für Resistenz gegen Spectinomycin, ausgehend vom Plasmid pT28, durchgeführt. Der Stamm, dessen Genotyp durch Southern bestätigt wurde (wie es im ersten Abschnitt dieses Beispiels beschrieben wurde), zeigt den selben Phenotyp der Akkumulation von Betain wie die in der Hybridisierungsklasse 5 beschriebenen Stämme.
Tabelle 1: Klassifizierung der Mutanten, die im Katabolismus von Betain zu Sarcosin blockiert sind
Beispiel 3 – Komplementierung der Mutanten von Pseudomonas denitrificans, die in den Stufen der Demethylierungen von Glycinbetain zu Sarcosin blockiert sind.
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung von DNA-Fragmenten von P. denitrificans, die Gene tragen, die beim Abbau des Betains zu Sarcosin involviert sind. Diese Fragmente wurden durch Hybridisierungsexperimente bewiesen, in denen das Insert der Plasmide pT28 oder pT38 als Sonde der Bank von Plasmiden verwendet wurde, die Sau3AI-Fragmente der DNA von P. denitrificans, kloniert in pXL59, enthalten (Cameron et al., 1989). Die Inserts der Plasmide, die mit der Sonde hybridisieren, wurden kartographiert. Klone oder Sub-Klone, die in den Vektoren, die von RSF1010 (Maniatis et al., 1982) abgeleitet wurden, konstruiert wurden, wurden durch Konjugation (Cameron et al., 1989)(bei den Mutanten, die im Katabolismus des Betains zu Dimethylglycin blockiert waren, oder bei den Mutanten, die im Abbau des Dimethylglycins zu Sarcosin blockiert waren, eingeführt. Die Komplementierung der Mutanten durch die Klone oder Sub-Klone wurde durch Fehlen einer Akkumulation des Betains, die Methylglycin oder Sarcosin im Kulturüberstand der kultivierten transkonjugierten Stämme in PS4-Medium bestimmt, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde.
3-1 DNA-Fragment von P. denitrificans, das Gene trägt, die im Abbau von Betain zu Dimethylglycin involviert sind.
Die Klone, die mit pT28 hybridisieren, wurden bei den Mutanten G3728, G3736, G3897, G3899 und G3900, die im Katabolismus des Betains zu Dimethylglycin blockiert waren, eingeführt. Wie in 3 gezeigt ist, komplementieren zwei Sub-Klone pXL2105 und pXL2107, die auf dem EcoRI-Fragment mit 12 kb enthalten sind, vier Mutanten unter den fünf, G3728, G3736, G3988 und G3900. Einer der Sub-Klone, pXL2105, enthält ein SstI-XhoI-Fragment mit 3,4 kb, kloniert in den Vektor pXL435 (Cameron et al., 1989), und komplementiert bei Mutanten, G3900 und G3899; der andere, pXL2107, enthält ein BamHI-EcoRI-Fragment mit 4 kb, kloniert in pKT230 (Cameron et al., 1989) und komplementiert die Mutanten G3728 und G3736. Andererseits war die Insertion des Transposons bei den Mutanten G3728, G3899 und G3900 auf diesem EcoRI-Fragment mit 12 kb kartographiert; da dies bei der Mutante G3736 nicht beobachtet wird, kann es sein, dass der Phenotyp dieser Mutante nicht mit der Position des Transposons in Korrelation steht, da die nach genetischer Umkehr erhaltene Mutante kein Betain akkumuliert; siehe Beispiel 2. Folglich sind wenigstens zwei Gene in der Stufe des Abbaus des Betains in Dimethylglycin involviert.
3-2 DNA-Fragment von P. denitrificans, das Gene trägt, die im Abbau des Dimethylglycins zu Sarcosin beteiligt sind.
Die Klone, die mit pT38 hybridisieren, wurden bei den Mutanten G3727, G3738, die im Katabolismus des Dimethylglycins zu Sarcosin blockiert sind, eingeführt. Wie in 4 gezeigt wird, komplementieren zwei Klone, die aus der Bank stammen und auf dem EcoRI-EcoRI-EcoRI-Fragment mit 14,5 kb kartographiert sind, G3727 und G3738. Einer der Sub-Klone, pXL19E2, enthält ein EcoRI-Fragment mit 6,6 kb, und der andere, pXL13C5, enthält das EcoRI-EcoRI-EcoRI-Fragment mit 14,5 kb. Folglich ist wenigstens ein Gen, das auf dem in 4 beschriebenen Fragment kartographiert ist, bei der Stufe des Abbaus von Dimethylglycin in Sarcosin beteiligt.
Beispiel 4 – Verbesserung der Produktion von Vitamin B₁₂ bei einem Pseudomonas denitrificans-Stamm, der im Katabolismus des Glycinbetains modifiziert ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verbesserung der Produktion von Cobalaminen eines Produzentenstamms für Cobalamine durch Unterbrechung von Genen, die im Katabolismus des Betains zu Dimethylglycin involviert sind.
Die Mutation, die für den Phenotyp der Mutante G3728 (oder G3900) verantwortlich ist, wird durch das Transposon erzeugt, das auf dem EcoRI-Fragment, kloniert in pT28 (oder pT00) und beschrieben in Beispiel 2, erzeugt. Diese Mutation wurde durch homologe Doppelrekombination in den P. denitrificans-Stamm SC510 Rif^r, Produzent von Cobalaminen, eingeführt (Cameron et al., 1991). Für die zwei Stämme, die so durch genetische Umkehr erhalten wurden, SC510 Rf^r::pT28 und SC510 Rif^r::pT00, wurde der Genotyp durch Southern wie in Beispiel 2 beschrieben bewiesen und die Produktion von Cobalaminen wurde nach Analyse durch HPLC (Säule: Asahibak OD50, Länge: 15 cm, Durchmesser: 6 mm, mobile Phase: Acetonitril/0,1 M Kaliumcyanid) und Ultraviolett-Detektion (Wellenlänge: 365 nm) des Vitamin B₁₂ bestimmt, das in den Kulturen der Stämme enthalten ist, die während 7 Tagen bei 30°C in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben wachsen, welche 25 ml PS4-Medium enthalten, wobei das Glycinbetain mit 2 mg/l enthalten ist und nach einem bereits beschriebenen Protokoll gearbeitet wird (Cameron et al., 1989). Die Resultate dieser Bestimmungen sind in Tabelle 2 angegeben; sie stellen den Mittelwert dar, der für zwei Kulturen in vier unabhängig durchgeführten Experimenten erhalten wurde.
Unter den angewendeten Kulturbedingungen wird die Produktion an Cobalaminen bei den Stämmen, die in einem genomischen EcoRI-Fragment mit 13 kb mutiert sind, im Vergleich zu dem Stamm SC510Rif^r um einen Faktor 10 erhöht; siehe 3, wobei die DNA dieses Fragments für Gene codiert, die im Katabolismus von Betain zu Dimethylglycin involviert sind. Diese Resultate zeigen klar, dass durch Modifizierung des Katabolismus des Betains bei den Stämmen der Erfindung ihre Fähigkeit zur Produktion von Metaboliten erhöht wurde.
Tabelle 2. Produktion von Vitamin B₁₂ bei den Stämmen, die im EcoRI-Fragment mutiert sind, welches Gene trägt, die beim Katabolismus des Betains in Dimethylglycin involviert sind. Die Produktionsniveaus der modifizierten Stämme sind im Vergleich zur Produktion des Stamms Sc510 Rif^r, die willkürlich auf 1 festgestellt wurde, angegeben.
Literaturstellen

Berg D. et al., 1983, Bio/Technology, 1:417-435. F. de Bruijn. 1987. Methods in Enzymology, 154: 175-156.
B. Cameron, K. Briggs, S. Pridmore, G. Brefort und J. Crouzet. 1989., J. Bacteriol. 171: 547-557.
B. Cameron, C. Guilhot, F. Blanche, L. Cauchois, M. Rouyez, S. Rigault, S. Levy-Schil und Crouzet. 1991, J. Bacteriol. 173: 6058-6065.
S. Cayley, B. Lewis und T. Record, 1992, J. Bacteriol. 174: 1586-1595.
L. Csonka. 1989. Microbiol. Rev. 53: 121-147. Ditta, G. et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77: 7347-7351.
J. Graham und B. Wilkinson, 1992, J. Bacteriol., 174: 2711-2716.
T. Maniatis, E. Fritsch and J. Sambrook, 1982, Molecular cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
A. Oren, 1990, Antonie van Leeuwenhoek, 58: 291-298. P. Prentki und H. Krisch, 1984, Gene, 29: 303-313. Rothstein 1983, Meth. Enzymol. 101 202.
L. Smith, J. Pocard, T. Bernard, D. Le Rudulier, 1988, J. Bacteriol. 170: 3142-3149.
R. White und A. Demain, 171, Biochim. Biophys. Acta. 237: 112-119.

Claims

Mikrobiologisches Verfahren zur Produktion von Metaboliten und/oder Enzymen durch Kultur einer Produzentenzelle für den Metaboliten und/oder das Enzym unter Produktionsbedingungen, dann Gewinnung des Metaboliten und/oder des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass die Produzentenzelle eine Modifikation wenigstens auf dem Niveau eines Gens, das beim Katabolismus von Betain beteiligt ist, aufweist und dass die Zelle das Betain weniger schnell abbaut.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation (en) Substitutionen und/oder Insertionen und/oder Deletionen einer Base oder mehrerer Basen und/oder Durchtrennungen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation (en) stabil segregierend und/oder nicht reversibel ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation (en) auf dem codierenden Teil des Gens und der Gene und/oder auf den für die Expression und/oder die Transkriptionsregulation der Gene verantwortlichen Regionen getragen werden.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle unter den Zellen der Gattung Pseudomonas, Streptomyces, Actinomycetes, Propionibacterium, Corynebaceterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Rhizobium, Agrobacterium, Rhodopseudomonas, Xanthomonas, Clostridium und Methanobacterium ausgewählt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Metabolit unter den Aminosäuren, den Vitaminen, den Antibiotika, ihren Derivaten oder ihren Vorläufern ausgewählt wird,
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Metabolit ein Cobalamin und vorzugsweise Vitamin B12 ist.
Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine rekombinante Produzentenzelle für Metaboliten und/oder Enzyme handelt und dass sie eine Modifikation wenigstens auf dem Niveau eines Gens, das beim Katabolismus von Betain beteiligt ist, aufweist, und dass die Zelle Betain weniger schnell abbaut.
Verwendung einer Produzentenzelle für Metaboliten und/oder Enzyme, die eine Modifikation wenigstens auf dem Niveau eines Gens aufweist, welches beim Katabolismus des Betains beteiligt ist, für die Herstellung von Metaboliten und/oder Enzymen, wobei die Zelle das Betain weniger schnell abbaut.