ES2255052T3 - Celulas modificadas al nivel del catabolismo de la betaina, preparacion y utilizaciones, especialmente para la produccion de metabolitos o de enzimas. - Google Patents
Celulas modificadas al nivel del catabolismo de la betaina, preparacion y utilizaciones, especialmente para la produccion de metabolitos o de enzimas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS QUE PRESENTAN UNA MODIFICACION AL MENOS EN UN GEN IMPLICADO EN EL CATABOLISMO DE LA BETAINA. SE REFIERE TAMBIEN A SU PREPARACION Y SU UTILIZACION, PARTICULARMENTE PARA LA PRODUCCION DE METABOLITOS Y/O ENZIMAS.
Description
Células modificadas al nivel del catabolismo de
la betaína, preparación y utilizaciones, especialmente para la
producción de metabolitos o de enzimas.
La presente invención se refiere a células
modificadas al nivel del catabolismo de la betaína, su preparación
y su utilización, principalmente para la producción mejorada de
metabolitos y/o de enzimas. La invención se refiere igualmente a
fragmentos de ADN que contienen genes del catabolismo de la
betaína.
La glicina betaína
(N,N,N-trimetilglicina) se conoce generalmente por
sus propiedades osmoprotectoras que confieren a las bacterias una
tolerancia al estrés osmótico (Csonka, 1989). Para explicar el
origen de esta propiedad, se ha propuesto que los efectos
moleculares de la glicina betaína sobre la actividad del agua y
sobre la presión osmótica del citoplasma en la Escherichia
coli eran mayores que los de las disoluciones a las que
reemplaza (Cayley et al, 1992). Además, aparte de sus
potencialidades osmoprotectoras, se ha descrito que la glicina
betaína podía igualmente favorecer la producción de enzimas (JP
8260709) o de metabolitos, tales como aminoácidos (patente JP
202703); antibióticos (patente AU 825513) y vitaminas (White et
al, 1971). Sin embargo, la mayoría de las bacterias, salvo las
cianobacterias y otras procariotas que fijan el CO_{2}, no
sintetizan la glicina betaína, la cual es sintetizada principalmente
por las plantas. Por lo tanto, ésta debe añadirse a los medios de
producción en los fermentadores, lo que genera un gasto
suplementario en un proceso industrial. La presente invención
aporta una solución a este problema.
La solicitante ha demostrado en efecto que es
posible, modificando el catabolismo de la betaína de las células,
principalmente por medios genéticos, potenciar el efecto de este
compuesto sobre la producción de enzimas o de metabolitos, sin
afectar a la velocidad de crecimiento de las células, su viabilidad,
etc., en condiciones industriales de fermentación. Igualmente, la
solicitante ha identificado, aislado y caracterizado fragmentos de
ADN que contienen genes implicados en el catabolismo de la betaína,
que permiten principalmente preparar células específicamente
modificadas al nivel del catabolismo de la betaína y cuyas
modificaciones son segregacionalmente estables y/o no reversibles.
Estos fragmentos permiten igualmente estimular el catabolismo de la
betaína por amplificación de las actividades enzimáticas
apropiadas. La presente invención permite, por lo tanto, potenciar
los efectos de la betaína y, debido a ello, utilizar este compuesto
de manera económica en procedimientos industriales de
fermentación.
Un primer objetivo de la invención se refiere por
lo tanto a una célula modificada que presenta una modificación al
menos al nivel de un gen implicado en el catabolismo de la
betaína.
En un primer modo de realización particular, la
expresión célula modificada se refiere más particularmente a
cualquier célula que presenta una sustitución y/o una deleción y/o
una inserción de una o varias bases en el o los genes considerados
y que degrada menos rápidamente la betaína. Tales modificaciones se
pueden obtener in vitro (sobre los fragmentos de ADN
aislados que contienen genes del catabolismo de la betaína) o in
situ, por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética o
también exponiendo a dichas células a un tratamiento mediante
agentes mutágenos.
Como agentes mutágenos se pueden citar, por
ejemplo, los agentes físicos tales como las radiaciones energéticas
(rayos X, g, ultravioleta, etc.), o los agentes químicos capaces de
reaccionar con distintos grupos funcionales de las bases del ADN y,
por ejemplo, los agentes alquilantes [sulfonato de etilmetano (EMS),
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
N-nitroquinoleina-1-óxido (NQO)],
los agentes bi-alquilantes, los agentes
intercalantes, etc.
Por deleción se entiende la supresión de todo o
parte del gen considerado. Se puede tratar principalmente de una
parte de la región codificadora y/o toda o una parte de la región
promotora de la transcripción.
Las modificaciones genéticas pueden obtenerse
igualmente por ruptura genética, por ejemplo según el protocolo
inicialmente descrito por Rothstein (1983). En este caso, todo o
parte del gen se perturba preferentemente para permitir el
reemplazo, por recombinación homóloga, de la secuencia genómica
natural por una secuencia no funcional o mutante preparada in
vitro.
La o las modificaciones mencionadas pueden
localizarse en la parte codificadora del gen o en las regiones
responsables de la expresión y/o de la regulación transcripcional de
dichos genes. La incapacidad (total o parcial) de dichas células
para degradar la betaína se puede manifestar bien por la producción
de enzimas inactivas debido a las modificaciones estructurales o
conformacionales, bien por la ausencia de producción, bien por la
producción de enzimas que tengan una actividad alterada o también
por la producción de enzimas naturales con un nivel atenuado o
según un modo de regulación deseado.
Además, algunas modificaciones, tales como las
mutaciones puntuales, son capaces por naturaleza de ser corregidas
o atenuadas mediante mecanismos celulares, por ejemplo durante la
replicación del ADN que precede a la división celular. Tales
modificaciones genéticas tienen por lo tanto un interés limitado a
nivel industrial, ya que las propiedades fenotípicas que resultan
de ellas no son totalmente estables. Según la presente invención,
ahora es posible, gracias a la identificación de fragmentos de ADN
que contienen genes del catabolismo de la betaína, preparar células
modificadas en las que la o las modificaciones mencionadas sean
estables segregacionalmente y/o no reversibles. Las células que
presentan tales modificaciones son particularmente ventajosas como
huéspedes celulares para la producción de metabolitos y/o de
enzimas.
Según los estudios realizados esencialmente en
Rizobium meliloti, la degradación de la glicina betaína se
realiza en medios de baja osmolaridad por tres desmetilaciones
sucesivas (véase la figura 1). La primera etapa está catalizada por
la betaína-homocisteína metiltransferasa E.C.
2.1.1.5. y lleva a la dimetilglicina; la segunda está catalizada
por la dimetilglicina deshidrogenasa E.C. 1.5.99.2. y produce la
monometilglicina o sarcosina; por último, la tercera está
catalizada por la sarcosina deshidrogenasa E.C. 1.5.99.1 y el
producto de la reacción es la glicina (Smith et al,
1988).
Preferentemente, las modificaciones que presentan
las células de la invención afectan a una de las dos primeras
etapas del catabolismo de la betaína u opcionalmente a las dos
primeras etapas simultáneamente.
Preferentemente, las células de la invención son
células productoras de metabolitos y/o de enzimas. En este aspecto,
se puede tratar igualmente de células recombinadas productoras de
metabolitos y/o de enzimas, es decir de células modificadas por
técnicas de ADN recombinante con el fin de mejorar su capacidad de
producción (Cf. principalmente WO 91/11518 y EP 346000). Aún más
preferentemente, las células de la invención se eligen entre las
células del género Pseudomonas, Streptomyces, actinomycètes,
Propionibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia,
Salmonella, Rhizobium, Agrobacterium, Rhodopseudomonas, Xanthomonas,
Clostridium y Methanobacterium.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento de preparación de células que presentan una
modificación de un gen al menos implicado en el catabolismo de la
betaína, utilizables en condiciones industriales de
fermentación.
La presente invención describe en efecto la
identificación, el aislamiento y la caracterización de fragmentos
de ADN que contienen genes implicados en el catabolismo de la
betaína. Estos fragmentos permiten ahora preparar células
específicamente modificadas al nivel del catabolismo de la betaína.
En efecto, es posible modificar in vitro los fragmentos
descritos para hacerlos no funcionales y volverlos a introducir en
una célula determinada, en la que van a sustituir por recombinación
homóloga doble a la copia genómica funcional correspondiente.
Igualmente es posible, sobre la base de los fragmentos aislados de
esta forma, elaborar sondas que se integrarán en el genoma de una
célula deseada, específicamente en el gen correspondiente.
Más particularmente, el procedimiento de la
invención consiste en reemplazar el o los genes cromosómicos
considerados por versiones modificadas in vitro.
Otro objetivo de la invención se refiere a un
fragmento de ADN que contiene un gen al menos del catabolismo de la
betaína.
Más particularmente, la presente invención se
ilustra por el aislamiento y la caracterización de fragmentos de
ADN de la Pseudomonas denitrificans que complementan los
mutantes bloqueados en el catabolismo de la glicina betaína en
dimetilglicina y los bloqueados en el catabolismo de la
dimetilglicina en sarcosina; es decir, los fragmentos de ADN que
contienen genes implicados en la degradación de la glicina betaína
en dimetilglicina y de la dimetilglicina en sarcosina. Los
fragmentos de ADN según la presente invención se han aislado a
partir de una cepa de Pseudomonas denitrificans SC510,
derivada de la cepa MB580 (patente US 3.018.225). Estos fragmentos
se obtienen por:
(i) preparación de mutantes bloqueados en el
catabolismo de la betaína. A este respecto se pueden utilizar
diferentes técnicas ya mencionadas anteriormente. La selección de
los mutantes se hace por cultivo en un medio apropiado y
dosificación, según las técnicas clásicas conocidas por el experto,
de la betaína o de los productos de su catabolismo,
(ii) complementación de estos mutantes con el
ácido nucleico de un microorganismo capaz de catabolizar la
betaína,
(iii) selección de los mutantes complementados y
luego aislamiento y caracterización del ácido nucleico que haya
permitido esta complementación, que contiene por lo tanto genes del
catabolismo de la betaína.
Es evidente que, a partir de los fragmentos de
ADN identificados y aislados en la presente solicitud, el experto
puede, principalmente mediante experimentos de hibridación, aislar y
clonar genes del catabolismo de la betaína a partir de otras
fuentes celulares.
Más preferentemente, se trata por lo tanto del
gen que codifica para la betaína-homocisteína
metiltransferasa, en el que una modificación según la invención
induce en la célula una disminución de la actividad
betaína-homocisteína metiltransferasa. Siempre
preferentemente, se trata del gen que codifica para la
dimetilglicina deshidrogenasa, en el que una modificación según la
invención induce en la célula una disminución de la actividad
dimetilglicina deshidrogenasa.
Otro objetivo de la invención se refiere a un
procedimiento mejorado de producción de metabolitos o de enzimas
por cultivo de una célula productora de dicho metabolito o enzima,
modificada a nivel de su catabolismo de la betaína, en condiciones
de producción y luego recuperación de dicho metabolito o enzima.
Según un primer modo de realización, la célula
productora presenta una modificación al menos al nivel de un gen
implicado en el catabolismo de la betaína y degrada menos
rápidamente la betaína.
Preferentemente, según el primer modo de
realización, la o las modificaciones son estables segregacionalmente
y/o no reversibles.
En una variante preferida de la invención, la o
las modificaciones son deleciones y/o inserciones mutacionales.
Según un segundo modo de realización, se
amplifica al menos un gen de la célula productora, implicado en el
catabolismo de la betaína, y dicha célula degrada más rápidamente la
betaína.
El procedimiento de la invención está
particularmente adaptado para la producción de metabolitos, tales
como los aminoácidos, las vitaminas, los antibióticos y sus
derivados o sus precursores.
El procedimiento de la invención puede permitir
principalmente la producción mejorada de cobalamina y
preferentemente de vitamina B12.
La presente invención se completa mediante los
ejemplos dados más adelante que deben considerarse ilustrativos y
no limitativos.
Los métodos utilizados clásicamente en biología
molecular tales como extracciones preparativas de ADN plasmídico,
centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio,
electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, purificación de
fragmentos de ADN mediante electroelución, extracción de proteínas
con fenol o con fenol-cloroformo, precipitación de
ADN en medio salino con etanol o isopropanol, transformación en
Escherichia coli, etc. son muy conocidos por el experto en
la técnica y están descritos ampliamente en la bibliografía
[Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.
Y., 1982; Ausubel F. M. et al. (eds), "Current Protocols in
Molecular Biology", John Wiley & Sons, Nueva York,
1987].
1987].
Las enzimas de restricción fueron suministradas
por New England Biolabs (Biolabs) o Pharmacia y se utilizan según
las recomendaciones de los proveedores.
Los plásmidos del tipo pBR322 y pUC son de origen
comercial (Bethesda Research Laboratories).
Para las uniones, los fragmentos de ADN se
separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa
o de acrilamida, se extraen con fenol o con una mezcla de
fenol/cloroformo, se precipitan con etanol y después se incuban en
presencia de la ADN ligasa del fago T4 (Boehringer) según las
recomendaciones del proveedor.
El relleno de los extremos 5' prominentes se
realiza mediante el fragmento de Klenow de la ADN Polimerasa I de
E. coli según las especificaciones del proveedor. La
destrucción de los extremos 3' prominentes se realiza en presencia
de la ADN polimerasa del fago T4 utilizada según las recomendaciones
del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se
realiza mediante un tratamiento dirigido por la nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por
oligodesoxinucleótidos sintéticos se realiza según el método
desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13
(1985) 8749-8764].
La amplificación enzimática de los fragmentos de
ADN mediante la técnica denominada PCR [Polymerase-
catalyzed Chain Reaction, Saiki R. K. et al.,
Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis
K. B. y Faloona F. A., Meth. Enzym. 155 (1987)
335-350] se realiza utilizando un "DNA thermal
cycler" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del
fabricante.
La verificación de las secuencias nucleotídicas
se realiza mediante el método desarrollado por Sanger et al.
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977)
5463-5467].
Betaína: glicina betaína o
N,N,N-trimetilglicina
CLHP: cromatografía de líquidos de alta
presión
DMG: dimetilglicina
kb: kilobase
Figura 1: Vía de degradación de la glicina
betaína en glicina. Tienen lugar tres desmetilaciones sucesivas, la
glicina betaína se cataboliza en dimetilglicina que se degrada en
sarcosina, ella misma degradada en glicina.
Figura 2: Curva de crecimiento en medio mínimo M.
La cepa no mutada SBL27 Rif^{r} y las mutantes G3728 y G3900 se
cultivan en medio mínimo M en presencia de glicina betaína como
fuente de carbono, su crecimiento se representa en el eje de
ordenadas en número de células por ml, en función del tiempo en días
descrito por el eje de abscisas.
Figura 3: Cartografía del fragmento de ADN de la
P. denitrificans que complementa los mutantes G3728, G3736,
G3899 y G3900. Sobre el fragmento de ADN se indican los sitios de
restricción y la posición de la inserción del transposón de los
mutantes correspondientes G3728, G3899 y G3900. Por debajo del
fragmento se representan las inserciones de los plásmidos pXL2100,
pXL2101, pXL2105 y pXL2107 que se han utilizado para complementar
los mutantes. + complementación, - sin complementación.
Figura 4: Cartografía del fragmento de ADN de la
P. denitrificans que complementa los mutantes G3727 y G3738.
Sobre el fragmento de ADN se indican los sitios de restricción y la
posición de la inserción del transposón de G3738. Por debajo del
fragmento figura una parte de las inserciones de los plásmidos
pXL19E2, pXL17A10 y pXL13C5 que se han utilizado para complementar
los mutantes. + complementación, - sin complementación.
Ejemplo
1
Este ejemplo describe el aislamiento de mutantes
de Pseudomonas denitrificans bloqueados en el catabolismo de
la glicina betaína en dimetilglicina y sarcosina. Estos mutantes se
han aislado a partir de un banco de mutantes en el que el transposón
Tn5Sp^{r} se inserta en el genoma de la cepa de
Pseudomonas denitrificans SBL27 Rif^{r}. Este banco se ha
realizado de la manera siguiente: se ha construido un plásmido,
denominado pRK2013::Tn5Sp^{r}, insertando el gen de la
resistencia a la espectinomicina Sp^{r} obtenido a partir del
plásmido pHP45\Omega, (Prentki et al., 1984) en el sitio
BamHI del transposón Tn5 (Berg et al., 1983) clonado
en el plásmido pRK2013::Tn5 (Ditta et al., 1980). A
continuación se ha realizado una conjugación mezclando los cultivos
en fase exponencial de SBL27Rif^{r} y E. coli MC1060
(pRK2013::Tn5Sp^{r}). Los transconjugantes
Rif^{r}Sp^{r} se han obtenido después de incubación a 30ºC
durante 5 días, a una frecuencia de 10^{-8} clones por célula
receptora. En 12 clones se ha verificado que el plásmido introducido
se había perdido (el ADN plasmídico ha sido preparado y después
introducido en la E. coli por trasformación; no se ha
obtenido ningún clon que presente la resistencia del plásmido) y que
el transposón Tn5Sp^{r} estaba bien integrado en el genoma
de SBL27Rif^{r} (por transferencia de Southern como se describe en
el ejemplo 2).
Se han vuelto a aislar aproximadamente 3000
mutantes de este banco en el medio mínimo M (1 g/l de NH_{4}Cl, 7
g/l de Na_{2}HPO_{4}, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de
NaCl, MgSO_{4} 1mM, CaCl_{2} 0,1mM y 10 mg/l de tiamina) sólido
(15 g/l de agar Difco) en el que la fuente de carbono es la glicina
betaína a 10 g/l y luego se han incubado a 30ºC durante 3 días. A
continuación, se han dosificado la betaína, la dimetilglicina y la
sarcosina en el sobrenadante del cultivo después de separación por
CLHP (columna: Shodex Ionpak S 801 P, longitud 50 cm, diámetro 8
mm; temperatura: 70ºC; fase móvil: nitruro de sodio) y detección por
refractometría diferencial.
Se ha demostrado que dieciocho mutantes ya no
utilizan la betaína como fuente de carbono, son G3727 a G3731,
G3733 a G3742 y G3897, G3899 y G3900.
Por otra parte, cuando estos mutantes se cultivan
según el protocolo ya descrito (Cameron et al, 1989) en 10
ml de medio PS4 durante 5 días a 30ºC, se pueden medir la betaína,
la dimetilglicina o la sarcosina en el sobrenadante del cultivo
después de separación por CLHP y detección por refractometría
diferencial. La betaína se detecta en el sobrenadante del mosto de
los mutantes G3728, G3736, G3897, G3899 y G3900 (entre 53 y 98% de
la betaína contenida en el medio inicial); mientras que con los
mutantes G3727, G3738 y G3742 es la dimetilglicina (aproximadamente
88 a 97% de la betaína contenida en el medio inicial); con los
mutantes G3729, G3730, G3731, G3733, G3737 y G3741 es la sarcosina
(aproximadamente 64 a 75% de la betaína introducida en el medio);
con los otros mutantes, G3734, G3735, G3739 y G3740 y con la cepa no
mutada no se observa ninguno de los tres productos, véase la tabla
1.
Además, solo el SBL27 Rif^{r} y los mutantes
G3728, G3736, G3897, G3899 y G3900 crecen en el medio mínimo M
sólido en el que la fuente de carbono es la dimetilglicina (10 g/l).
Los cultivos en medio mínimo M líquido en el que la fuente de
carbono es la glicina betaína a 10 g/l se realizan como sigue: a
partir de un re-aislamiento en un medio LB rico
(Cameron et al, 1989), se cultiva la cepa en 5 ml de medio LB
a 30ºC durante 12 horas; las células de este
pre-cultivo se lavan en un medio mínimo M y luego se
siembran inóculos de 0,2% en ocho matraces Erlenmeyer de 250 ml que
contienen 25 ml de medio mínimo M en el que la fuente de carbono es
la glicina betaína (10 g/l) y se incuban con agitación a 250 rpm, a
30ºC. Los días 3, 4, 5, 6, 10, 14 y 21, las células contenidas en
un matraz Erlenmeyer se cuentan después de la extensión y
crecimiento en medio mínimo sólido en el que la fuente de carbono
es la glicina betaína. Cuando los mutantes G3728 y G3900 se cultivan
en medio mínimo líquido en el que la fuente de carbono es la
glicina betaína (10 g/l), durante los tres primeros días no se
observa ningún crecimiento, mientras que con la cepa SBL27 Rif^{r}
ya se ha alcanzado la fase estacionaria, véase la figura 2; sin
embargo al sexto día se observa una fase estacionaria comparable a
la de SBL27 Rif^{r}. Este resultado demuestra que los mutantes
que no degradan toda la betaína (10 g/l) contenida en el medio PS4,
véase la tabla 1, son capaces de utilizarla como fuente de carbono
en un medio mínimo que contiene 10 g/l de betaína, pero después de
una fase de latencia de 3 días en comparación con la cepa no
mutada.
Estos datos fisiológicos permiten poner en
evidencia en Pseudomonas denitrificans SBL27 Rif^{r} una
vía de degradación de la glicina betaína en dimetilglicina y
sarcosina, en la que:
1) la etapa de degradación de la glicina betaína
en dimetilglicina está bloqueada (o parcialmente bloqueada) en los
mutantes G3728, G3736, G3897, G3899 y G3900;
2) la etapa de degradación de la dimetilglicina
en sarcosina está bloqueada en los mutantes G3727, G3738 y
G3742;
G3742;
3) la etapa de degradación de la sarcosina está
bloqueada en los mutantes G3729, G3730, G3731, G3733, G3737 y
G3741.
Ejemplo
2
Este ejemplo describe las experiencias de
biología molecular que permiten clasificar y caracterizar los
mutantes por medio de su transposón. El genotipo de cada mutante se
analiza por transferencia de Southern (Maniatis et al, 1982)
de la forma siguiente: se prepara el ADN genómico de cada mutante
(G3727 a G3731, G3733 a G3742 y G3897, G3899 y G3900) y después se
digiere una alícuota por la enzima de restricción EcoRI; los
fragmentos así obtenidos se separan por electroforesis sobre un gel
de agarosa y luego se transfieren sobre una membrana de Biodyne;
esta membrana se hibrida entonces con uno de los plásmidos
siguientes marcado con \alpha^{32}P-dCTP. Estos
plásmidos son pT27, pT28, pT30, pT31, pT34, pT35, pT36, pT37, pT38,
pT39, pT40, pT42, pT97 y pT00. Estos plásmidos se han obtenido por
inserción en el sitio EcoRI del vector pRK290 del único
fragmento EcoRI genómico en el que está insertado el
transposón Tn5Sp^{r} de los mutantes G3727, G3728, G3730, G3731,
G3734, G3735, G3736, G3737, G3738, G3739, G3740, G3742, G3897 y
G3900 respectivamente. Los plásmidos pT que contienen el fragmento
EcoRI buscado se eligen por su resistencia a la
espectinomicina, conferida por el transposón. Hibridando la
membrana, por ejemplo con el plásmido pT27, el ADN genómico de los
mutantes G3727 y G3738 no presenta más que una única banda
radiactiva que corresponde a un fragmento EcoRI de peso
molecular de aproximadamente 16 kb, lo que indica que en estos
mutantes el transposón está insertado en el mismo lugar. En cambio,
en la cepa no mutada el fragmento hibridante es de 8 kb y con todos
los otros mutantes hibridan dos fragmentos, uno
co-emigra con la cepa no mutada y el otro tiene un
tamaño variable superior al tamaño del transposón (8 kb) (de Bruijn,
1987; Prentki, 1984). Las hibridaciones sucesivas con cada uno de
los plásmidos han permitido reagrupar los mutantes por clases de
hibridación de la 1 a la 12, véase la tabla 1.
Por otra parte, se han utilizado los plásmidos
pT27, pT28, pT30, pT31, pT34, pT36, pT37, pT38, pT97 y pT00 para
volver a introducir por doble recombinación homóloga la mutación que
proviene de la inserción del transposón en la cepa no mutada SBL27
Rif^{r}, según un protocolo ya descrito (Cameron et al,
1991). Para las cepas así obtenidas por ruptura genética, se ha
verificado el genotipo por análisis de transferencia de Southern
como acaba de describirse en el párrafo precedente; y se ha
determinado el fenotipo después de análisis de los compuestos
detectados en el sobrenadante de los cultivos en medio PS4 como se
ha descrito en el ejemplo 1.
Las cantidades de los compuestos detectados son
comparables para todas las cepas obtenidas por ruptura genética que
llevan al mismo fenotipo que las cepas mutadas iniciales, véase la
tabla 1. Estas cepas pertenecen:
1) bien a la clase de hibridación 5 y acumulan
betaína,
2) bien a la clase de hibridación 2 y acumulan
dimetilglicina,
3) o bien a la clase de hibridación 4 y acumulan
sarcosina.
Además, se ha realizado una deleción de un
fragmento genómico BglII de 10 kb e inserción de una casete
de resistencia a la espectinomicina a partir del plásmido pT28. La
cepa cuyo genotipo se ha verificado por transferencia de Southern
(como se ha descrito en el primer párrafo de este ejemplo) presenta
el mismo fenotipo de acumulación de betaína que las cepas descritas
en la clase de hibridación 5.
| Cepa nº | Clase de | Compuestos detectados en las cepas | |
| G | hibridación | mutantes iniciales | Agentes de ruptura genética |
| 3727 | 2 | DMG 88% | DMG: |
| 3728 | 5 | Betaína 53% | Betaína |
| 3729 | 3 | Sarcosina 68% | ND |
| 3730 | 3 | Sarcosina 69% | 0 |
| 3731 | 4 | Sarcosina 64% | Sarcosina |
| 3733 | 4 | Sarcosina 69% | ND |
| 3734 | 7 | 0 | 0 |
| 3735 | 8 | 0 | ND |
| 3736 | 1 | Betaína 62% | 0 |
| 3737 | 4 | Sarcosina 75% | Sarcosina |
| 3738 | 2 | DMG 91% | DMG |
| 3739 | 9 | 0 | ND |
| 3740 | 10 | 0 | ND |
| 3741 | 4 | Sarcosina 64% | ND |
| 3742 | 11 | DMG 97% | ND |
| 3897 | 12 | Betaína 96% | 0 |
| 3899 | 5 | Betaína 95% | ND |
| 3900 | 5 | Betaína 98% | Betaína |
Ejemplo
3
Este ejemplo describe el aislamiento de los
fragmentos de ADN de la P. denitrificans que contienen genes
implicados en la degradación de la betaína en sarcosina. Estos
fragmentos se han identificado mediante experiencias de hibridación
utilizando la inserción de los plásmidos pT28 o pT38 como sonda y el
banco de plásmidos que contienen fragmentos Sau3AI del ADN de
la P. denitrificans clonados en pXL59 (Cameron et al,
1989). Se han cartografiado las inserciones de los plásmidos que
hibridan con la sonda. Se han introducido clones o
sub-clones, que se han construido (Maniatis et
al, 1982) en los vectores derivados de RSF1010 (Cameron et
al, 1989), por conjugación (Cameron et al, 1989) en los
mutantes bloqueados en el catabolismo de la betaína en
dimetilglicina o en los mutantes bloqueados en la degradación de la
dimetilglicina en sarcosina. Se ha determinado la complementación
de los mutantes por los clones o los sub-clones por
la ausencia de acumulación de la betaína, dimetilglicina o sarcosina
en el sobrenadante del cultivo de las cepas transconjugantes
cultivadas en medio PS4 como se ha descrito en el ejemplo 1.
Los clones que hibridan con el pT28 se han
introducido en los mutantes G3728, G3736, G3897, G3899 y G3900
bloqueados en el catabolismo de la betaína en dimetilglicina. Como
se representa en la figura 2, dos sub-clones pXL2105
y pXL2107 contenidos en el fragmento EcoRI de 12 kb
complementan cuatro mutantes entre los cinco, G3728, G3736, G3899 y
G3900. Uno de los sub-clones, pXL2105, contiene un
fragmento SstI-XhoI de 3,4 kb clonado en el vector
pXL435 (Cameron et al, 1989) y complementa dos mutantes,
G3900 y G3899; el otro, pXL2107, contiene un fragmento
BamHI-EcoRI de 4 kb clonado en pKT230 (Cameron et
al, 1989) y complementa los mutantes G3728 y G3736. Por otra
parte, la inserción del transposón en los mutantes G3728, G3899 y
G3900 se ha cartografiado sobre este fragmento EcoRI de 12
kb; la cual no se observa en el mutante G3736, puede ser que el
fenotipo de este mutante no se correlacione con la posición del
transposón, ya que el mutante obtenido después de genética inversa
no acumula betaína, véase el ejemplo 2. Por consiguiente, al menos
dos genes están implicados en la etapa de degradación de la betaína
en dimetilglicina.
Los clones que hibridan con el pT38 se han
introducido en los mutantes G3727 y G3738 bloqueados en el
catabolismo de la dimetilglicina en sarcosina. Como se representa
en la figura 4, dos clones obtenidos del banco y que se
cartografían sobre un fragmento
EcoRI-EcoRI-EcoRI de 14,5 kb complementan el
G3727 y G3738. Uno de los sub-clones, pXL19E2,
contiene un fragmento EcoRI de 6,6 kb y el otro, pXL13C5,
contiene el fragmento EcoRI-EcoRI-EcoRI de
14,5 kb. Por consiguiente, al menos un gen cartografiado sobre el
fragmento descrito en la figura 4 está implicado en la etapa de
degradación de la dimetilglicina en sarcosina.
Ejemplo
4
Este ejemplo ilustra la mejora de la producción
de cobalaminas de una cepa productora de cobalaminas por la ruptura
de genes implicados en el catabolismo de la betaína en
dimetilglicina.
La mutación que es responsable del fenotipo del
mutante G3728 (o G3900) está generada por el transposón que está
cartografiado sobre el fragmento EcoRI, clonado en el pT28 (o
pT00) y descrito en el ejemplo 2. Esta mutación ha sido introducida
por doble recombinación homóloga en la cepa de P.
denitrificans SC510 Rif^{r}, productora de cobalaminas.
(Cameron et al, 1991). Para las dos cepas obtenidas por
genética inversa de esta forma, SC510 Rif^{r}::pT28 y SC510
Rif^{r}::pT00, el genotipo ha sido verificado por transferencia de
Southern como se ha descrito en el ejemplo 2, y se ha determinado
la producción de cobalaminas mediante análisis por CLHP (columna:
Asahibak OD50, longitud: 15 cm, diámetro: 6 mm, fase móvil:
acetonitrilo/cianuro de potasio 0,1M) y detección ultravioleta
(longitud de onda: 365 nm) de la vitamina B_{12} contenida en los
cultivos de las cepas cultivados durante siete días a 30ºC en
matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 25 ml de medio PS4 en el
que la glicina betaína está a una concentración de 2 mg/l, según un
protocolo ya descrito (Cameron et al, 1989). Los resultados
de estas dosificaciones se indican en la tabla 2, representan un
valor medio obtenido a partir de dos cultivos en las cuatro
experiencias hechas independien-
temente.
temente.
En las condiciones de cultivo utilizadas, la
producción de cobalaminas aumenta en un factor de 10, con respecto a
la cepa SC510Rif^{r}, en la cepas mutadas en un fragmento genómico
EcoRI de 13 kb, véase la figura 3, cuyo ADN codifica para los
genes implicados en el catabolismo de la betaína en dimetilglicina.
Estos resultados demuestran claramente que modificando el
catabolismo de la betaína de las cepas de la invención aumenta su
capacidad de producción de metabolitos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cepas/Experiencia | 1 | 2 | 3 | 4 |
| Sc510 Rif^{r} | 1 | 1 | 1 | 1 |
| SC510 Rif^{r}::pT28 | 10,5 | 11 | 22 | 14,5 |
| SC510 Rif^{r}::pT00 | 11 | 8 |
\vskip1.000000\baselineskip
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Biochim Biophys Acta. 237: 112-119.
Claims (9)
1. Procedimiento microbiológico de producción de
metabolitos y/o de enzimas por cultivo de una célula productora de
dicho metabolito y/o enzima en condiciones de producción y luego
recuperación de dicho metabolito y/o enzima, caracterizado
porque la célula productora presenta una modificación al menos al
nivel de un gen implicado en el catabolismo de la betaína y porque
la célula degrada la betaína menos rápidamente.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la o las modificaciones son
sustituciones y/o inserciones y/o deleciones de una o varias bases
y/o rupturas.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque la modificación es estable
segregacionalmente y/o no reversible.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3, caracterizado porque la o las modificaciones se dirigen
sobre la parte codificadora de dicho o dichos genes y/o sobre las
regiones responsables de la expresión y/o de la regulación
transcripcional de dichos genes.
5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
4, caracterizado porque la célula se elige entre las células
del género Pseudomonas, Streptomyces, Actinomycetes,
Propionibacterium, Corynebacterium, Bacillus, Escherichia,
Salmonella, Rhizobium, Agrobacterium, Rhodopseudomonas, Xanthomonas,
Clostridium y Methanobacterium.
6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a
5, caracterizado porque el metabolito se elige entre los
aminoácidos, las vitaminas, los antibióticos, sus derivados o sus
precursores.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado porque el metabolito es una cobalamina, y
preferentemente la vitamina B_{12}.
8. Célula caracterizada porque se trata de
una célula recombinada productora de metabolitos y/o de enzimas y
porque presenta una modificación al menos al nivel de un gen
implicado en el catabolismo de la betaína y porque la célula degrada
la betaína menos rápidamente.
9. Utilización de una célula productora de
metabolitos y/o de enzimas que presentan una modificación al menos
al nivel de un gen implicado en el catabolismo de la betaína, para
la producción de metabolitos y/o de enzimas, y porque la célula
degrada la betaína menos rápidamente.
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