WO2014128324A1 - Método para detectar inserciones de espaciadores en estructuras crispr - Google Patents

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crispr
spacers
spacer
leader
cas
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PCT/ES2014/070093
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César DÍEZ VILLASEÑOR
Noemí MARCO GUZMÁN
Francisco J. MARTÍNEZ MÓJICA
Cristóbal ALMENDROS ROMERO
Jesús GARCÍA MARTÍNEZ
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Universidad De Alicante
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention is generally framed in the field of genetics and in particular refers to a method for detecting insertions of spacers by independent selection of interference from artificial structures based on CRISPR.
  • CRISPR-Cas systems have been identified in most archaea and approximately half of the bacterial genomes. Each system consists of one or several clusters of DNA repeats called CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) and a set of genes that encode Cas (CRISPR associated) proteins functionally related to the activity of CRISPR. Such repetitions are regularly spaced within each cluster by non-repeated sequences called spacers, at least some of which derive from fragments located in mobile genetic elements, such as plasmids and viruses. Adjacent to each repeater-spacer cluster is a sequence called leader where the promoter responsible for transcription of said cluster is located in a primary RNA (pre-crRNA) that encompasses all of it.
  • pre-crRNA primary RNA
  • the identity of the cas genes associated with a CRISPR cluster can vary considerably between systems, on the basis of which the CRISPR-Cas are classified into 3 main types, each of which includes several subtypes. Only almost and cas2 are present in all subtypes identified to date.
  • CRISPR-Cas systems cause degradation (interference) of exogenous DNA containing sequences complementary to the spacers.
  • An active CRISPR-Cas system can insert new spacers (a process known as acquisition and catalyzed by Casi and Cas2) between the leader and the adjacent repetition. Insertion involves duplication of the repetition adjacent to the insertion site.
  • the acquisition of a new spacer provides immunity against molecules containing the sequence from which it is derived.
  • the pre-crRNAs are processed giving rise to crRNA molecules containing a single spacer
  • Each of these crRNAs pairs with its complementary sequence in a DNA molecule then recruiting specific Cas proteins that cause its degradation.
  • an implication of CRISPR-Cas in gene regulation and nucleic acid repair has been proposed.
  • the present invention in a first aspect relates to a method for detecting insertions of spacers, hereafter the method of the present invention, by independent selection of interference from artificial structures based on short palindromic repeats grouped regularly spaced ( CRISPR) comprising the insertion of at least one CRISPR-spacer unit, in the artificial structure within the sequence encoding a control gene, which restores the translation reading pattern, where the expression of the control gene is indicative of the insertion of the spacer
  • CRISPR grouped regularly spaced
  • the inserted CRISPR-spacer unit comprises a number of nucleotides not multiple of 3.
  • the spacer of the CRISPR-spacer unit of the method of the present invention comprises a termination codon. More particularly the termination codon is cryptic.
  • the artificial structure of the method of the present invention comprises the sequence identified as SEQ ID NO: 103, in a more particular embodiment, the artificial structure of the method of the present The invention corresponds to the translational fusion of a CRISPR-spacer-CRISPR-leader cassette and the coding sequence of the chloramphenicol acetyl transferase ⁇ ca ⁇ ) gene, where nucleotides of 96-124 and 156-165 correspond to the CRISPR units and the leading region (nucleotides 165-234) of the 5 'inserted cassette of the coding region of the CAT protein (nucleotides 275-953) that is out of phase with respect to the start of translation.
  • the spacer is selected from the sequences identified as SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 89.
  • the present invention relates to an artificial structure, hereinafter referred to as an artificial structure of the present invention) characterized in that it comprises the sequence identified as SEQ ID NO: 103.
  • the present invention relates to the use of the artificial structure of the present invention for the detection of insertion of spacers.
  • FIG. 1 Schematic representation of the integration in the control cassettes cloned in the pCSIR plasmids and the strategy used for specific integration detection.
  • A. Integration cassette in pCSIR-A or pCSIR-T consists of a leader and two CRISPR (CR) duplicates interspersed by a spacer (Sp-1) fused upstream to a fragment of the gene of lacZ-ct (lacZct ') and , downstream the complete sequence of the out of phase cat gene (cat +2).
  • the ribosome binding point (rbs) and the translation start codon lacZ-ct (white arrowhead) are indicated.
  • thymine at positions 42 and 70 of the pCSIR-T leader were replaced with cytosine and adenine respectively (see TLR primer in Table 2).
  • the translation of P / ac generated transcript ends in the leader in case of deletion (cat would remain out of phase, caf + 1) (B), in the duplicated spacer (Sp-1) in case of CRISPR-spacer duplication (C), or in the termination codon of the coffee coding sequence in the case of insertion (D) of a new spacer (Sp-2).
  • Figure 2 Distribution, in pCas1-2 [K], of the sequences corresponding to spacers sampled in the acquisition tests.
  • the spacers are shown as black arrows pointing to the leader as they were inserted into the integration cassette.
  • CDF ori origin of replication
  • the origin of replication CDF ori
  • the genes encoding the lac operon repressor (Lacl), streptomycin resistance protein (SmR), and the T7-lac promoter (P T7 ) that promotes transcription of the variant are shown K of the cas1-2 genes (cas1-K and cas2-K).
  • Figure 3 WebLogos generated by the alignment of the CRISPR2 proto-spacer regions of E. coli.
  • the proto-spacer sequences (positions -1 to -33) and the two adjacent nucleotides of the PAM region (positions 0 and 1) were oriented in the same way as the corresponding spacers in the CRISPR cluster (the 3 'end toward the leader).
  • the logos were obtained from non-CRISPR sequences with an identity greater than 90% to E. coli genome spacers, associated with the T-leader (A) or the A-leader (B), as well as spacers corresponding to spacers found in the acquisition experiments performed on strains housing the Cas-EK (C) or Cas-EO (D) genes.
  • Figure 4 Hypothetical mechanism of insertion of spacers.
  • the three main steps are distinguished in the process of integration of spacers: (i) cut at the insertion point, (ii) integration of the spacer and (iii) CRISPR duplication.
  • A. The aberrant insertions (atypical CRISPR-spacer sequences) obtained in acquisition tests with pCSIR-A and plasmid pCas1-2 [K] can be explained with an initial nickname (black triangle; our data does not allow us to specify in which chain) between the first and second positions of the leader (italic) and a secondary cut (white triangle) in the complementary strand at a fixed distance (28 nt) to the adjacent CRISPR duplex (shaded positions).
  • the gaps are filled by polymerization of the DNA (bold), generating the 26 bp CRISPR duplices (cut in 2 pb) maintaining the typical periodicity of 61 bp.
  • the first cut-off point occurs at the junction between the CRISPR and the leader, and the second at a fixed distance of 28 nt (that is, at the boundary between the spacer and the CRISPR) , which leads to the duplication of a complete CRISPR unit and maintains the periodicity of 61 bp. Relevance lengths are indicated.
  • FIG. 5 shows CRISPR2.1 groupings of E.coli.
  • the E. coli strains used as hosts in the integration trials were K12 str. MG1655, 0157: H7 str. EDL931 (Spanish Type Culture Collection, CECT 4267) and BL21-AI (Novagen).
  • the three strains contain the CRISPR2.2 and CRISPR2.3-leader loci.
  • K12 strains also contain a CRISPR2.1 cluster composed of CRISPR-T duplicons associated with a T-type leader and the entire set of cas-EK genes.
  • the E. coli 0157: 1-17 CRISPR2.1 locus is composed of repeats and type A leader, and attaches the complete set of cas-EO genes.
  • the CRISPR2.1 locus of strains derived from BL21 consists of CRISPR-A duplicates, and lacks both leader and cas genes.
  • the BL21-AI genome encodes arabinose-inducible T7 RNA polymerase, while the other strains lack homologous genes to it.
  • the E. coli ECOR69 CRISPR2.1 locus used as a template for PCR amplification of the cloned integration control cassette in pCSIR-A, contains CRISPRs and type A leader (Ten-Villasenor C, Almendros C, Garcia-Martinez J, Mojica FJ. Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli. Microbiology 2010).
  • the 9Kb plasmid pWUR339 (provided by the John van der Oost laboratory) is derived from the low copy vector pCDF-1 b (Novagen) and contains the E. coli K12 Cascade-cas 1-casperon operon under the promoter l-lac.
  • the constructs were made by cloning DNA fragments obtained by PCR with primers containing restriction enzyme cut points (see Tables 1 and 2) or by the method of ends with 3'-T protruding. Table 1. Plasmids constructed during the study.
  • Plasmid pCR2.1-Cm was obtained by cloning the chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene of pKK232-8 into the high copy vector vector pCR2.1 (Invitrogen; origin of pUC replication).
  • pCSIR-A is derived from pCR2.1-Cm by inserting a sequence containing 43 bp of the Leader 2.1 and the adjacent CRISPR-spacer-CRISPR fragment of strain ECOR69.
  • pCSIR-T a protruding 69 bp segment of the Leader 2.1 and the adjacent amplified CRISPR-spacer-CRISPR fragment of the leader 3'-T was cloned into the pCR®2.1 vector by the 3'-T protrusion method.
  • E. coli K12 str. MG1655 and the subsequent insertion of an amplicon containing the cat gene in the same manner as for the construction of pCR2.1-Cm.
  • pCas1-2 [K] and pCas1-2 [0] were obtained by insertion into the pCDF-1b vector of amplicons containing the almost and cas2 genes of pWUR399 and those of E. coli 0157: 1-17 str. EDL931 respectively.
  • the PCR products were amplified with recombinant Taq polymerase (Invitrogen). For the rest of the cases (Table S4) they were obtained with Expand High Fidelity PCR System (Roche). A Mastercycler Gradient thermocycler (Eppendorf) was used to perform the PCRs. The PCR products were purified and subsequently digested with Thermo Scientific enzymes according to the recommendations of the Double Digest web tool. The ligaments were performed with T4 DNA ligase (New England Biolabs).
  • strain TOP10 Invitrogen
  • NovaBlue Novagen
  • the leaders of the ECOR strains were determined by sequencing PCR products as described in Diez-Villasenor C et al. Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli. Microbiology 2010. The CRISPR and available E. coli genome leaders were identified with the CRISPRFinder program.
  • the regions of the proto-spacers with an identity of at least 30 nt with spacers of the CRISPR-Cas lE systems of E. coli strains are they searched with the BLASTn program against the Nucleotide Collection database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) and aligned using the proximal end to the leader as a reference.
  • experimental PAM motifs were determined by sequence alignment with 100% similarity to spacers acquired in the integration assays and detected in the corresponding host replicons using BLASTn or Geneious R6 created by Biomatters Ltd.
  • DNA strands Carriers of the sequence complementary to that of the corresponding spacer in the crRNA were aligned using WebLogo to obtain sequence logos as described in Mojica FJM, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defense system. Microbiology 2009; 155: 733-40.
  • Genomic and plasmid DNA was purified from cells grown in LB medium (10 g / l tryptone, 5 g / l yeast extract, and 10 g / l NaCI) using Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) and High Puré Plasmid Isolation Kit (Roche) respectively. PCR products and restriction fragments were purified with GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare).
  • TATA -10 box required for the transcription of the grouping is present in pCSI RT but absent in pCSI RA (Pougach K, Semenova E, Bogdanova E, Datsenko KA, Djordjevic M, Wanner BL, Severinov K. Transcription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coli Molecular Microbiology 2010; 77: 1367-79; Pul U, Wurm R, Arslan Z, Geissen R, Hofmann N, Wagner R. Identification and characterization of E. coli CRISPR-cas promoters and their silencing by H-NS Molecular Microbiology 2010; 75: 1495-512).
  • the repetitions and leader in pCSIR-A belong to variant A (CRISPR-A and leader-A respectively), while pCSI RT contains the T variants of both elements (CRISPR-T and leader T).
  • the CRISPR-spacer-CRISPR-leader cassette is translationally merged at the start of lacZ-ct (lacZ-ct) and the chloramphenicol protein gene (cat) acetyltransferase (or CAT) that is out of phase (+2 of the start codon of lacZ-a (Fig. 1A).
  • lacZ-ct lacZ-ct
  • cat chloramphenicol protein gene
  • CAT chloramphenicol protein gene
  • the translation would stop at another triplet in the leading region (See Figure 1B).
  • the existing spacer contains an out-of-phase termination triplet that would be in phase in the case of its duplication (Fig. 1 C).
  • the insertion experiments were performed with several strains of E. coli with different combinations of pCSIR and plasmids containing cas genes.
  • the cas genes the TI-lac promoters, inducible by IPTG are located upstream of the cas operons and the lac repressor coding lacl gene is included in the constructions ( see Figure 2), all the trials were carried out in the absence of IPTG, so small levels of expression of the cas genes are expected (as in the case of 'drip' of the promoter).
  • Timina in position 4 behind the proto-spacer, resulting in displacement in a position of the putative CAT PAM.
  • Timina in position 4 behind the proto-spacer, resulting in displacement in a position of the putative CTT PAM.
  • Table 5 Integrated spacers in pCSIR-A during propagation in 0157: 1-17 housing pCas1-2 [0].
  • Timina in position 4 behind the proto-spacer, giving rise to displacement in a position of the putative CTT PAM.
  • the frequency of the CWT trinucleotide in the constructs does not justify the underrepresentation of proto-spacers observed in control plasmids (CTT is more frequent in pCSIR than in plasmids pCas1-2 and the incidence of CAT is similar for all of them; Table 1).
  • CTT is more frequent in pCSIR than in plasmids pCas1-2 and the incidence of CAT is similar for all of them; Table 1).
  • the similar CTT / CAT ratio in plasmids pCas1-2 (0.93-0.99; Table 1) provides additional support to the preference for the reason for CTT acquisition by cas-EK and CWT after cas systems -EO. Therefore, either some replicons are less likely to contribute with spacers or there is some preference for certain molecules as donors.
  • CRISPR-Cas type I The PAMEs (spacers end equivalent to the edge of the proto-spacer adjacent to the PAM motif -spacers ends equivalent to the protospacer edges adjacent to the PAM-) of CRISPR-Cas type I are oriented towards the leader. This implies that the acquisition genes (almost and / or cas2) together with elements of the spacer integration region (either in the leader or the adjacent CRISPR sequence) are involved in determining the direction of insertion.
  • Table 6 Integrated spacers in pCSIR-A during propagation in K12 housing pCas1-2 [K].
  • Spacers identified with # ' are differentiated with the corresponding spacer # (integrated in this or another experiment) by the presence of the AC dinucleotide at the 5' end. Spacers identified with #R are identical to their respective spacer # integrated in the reversed orientation in this or another experiment. b The mismatches in the most similar sequence (putative proto-spacer) are represented by lowercase letters.
  • Trinucleotide 5'-CTT-3 ' is adjacent to the opposite end of the proto-spacer in the complementary chain.
  • Timina at position 4 behind the proto-spacer, resulting in displacement in a position of the putative CTT PAM.
  • Three CRISPR-spacer inserts contained spacers (identified in Table 6 as spacers identified as SEQ ID NO: 76, 79 and 88) with two additional nucleotides, and the duplicated CRISPR with two fewer nucleotides (see Figure 4), and
  • CRISPR-spacer integration control plasmids allowed sensitive detection of inserts without high production of Cas proteins, or without selection of adapted cells depending on the interference phenotype provided by the new spacer. Detectable additions were restricted to sequences that led to the synthesis of functional CAT proteins. Therefore, the 34 nt spacers, observed in CRISPR clusters in a proportion of around 4%, were excluded, since only the integration of fragments of 3n + 1 bp, such as the CRISPR-spacer unit of the canonical length of 61 bp, can be selected (Fig. 1 D). Around 62% of them were detected due to the absence of termination codons in phase with the control gene.
  • results obtained demonstrate the rejection / preference for certain replicons as donors of spacers and the existence of a measuring mechanism to cut at the insertion point during the spacer integration process.
  • the spacers were preferably obtained from plasmids containing the almost and cas2 genes. An overrepresentation of plasmid sequences containing cas genes in the obtained proto-spacers (120/132) was given. The fact that most of the putative proto-spacers of the chromosome are also found in these plasmids (43/48), even if the shared sequences were less than 0.1% of the chromosome, provide additional support for the plasmid origin of these spacers.
  • cas genes involved in the acquisition was responsible for a more efficient acquisition of the sequences close to their coding regions by coupling the translation and transcription. This was corroborated by the detection of spacers in CRISPR clusters, as well as RNAs, in the Cascada ribonucleoproteic complex, whose sequences correspond to regions in the vicinity of the CRISPR-Cas loci, including cas genes.
  • the spacers were 35 bp (instead of 33) containing AC at the end distal to the leader (Fig. 4), regardless of the sequence at the corresponding positions of the putative proto-spacer (see Table 6).
  • acquisitions must require protein No Cas with activities such as DNA ligation and polymerization. This could be achieved through the involvement of DNA repair mechanisms, which expands the possible implications of the known interactions of Almost with key components of repair systems, including RecB, RecC and RuvB.

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para detectar inserciones de espaciadores mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR) que comprende la inserción de al menos una unidad CRISPR-espaciador,en la estructura artificial dentro de la secuencia que codifica un gen testigo, que restaura la pauta de lectura de traducción, donde la expresión del gen testigo es indicativo de la inserción del espaciador. También se refiera a la estructura artificial utilizada.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR INSERCIONES DE ESPACIADORES EN ESTRUCTURAS CRISPR
Campo de la invención
La presente invención se encuadra en general en el campo de la genética y en particular se refiere a un método para detectar inserciones de espaciadores mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en CRISPR.
Estado de la técnica
Los sistemas CRISPR-Cas se han identificado en la mayoría de las arqueas y aproximadamente la mitad de los genomas de bacterias. Cada sistema está constituido por una o varias agrupaciones de repeticiones de ADN denominadas CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) y un conjunto de genes que codifican las proteínas Cas (CRISPR associated) funcionalmente relacionados con la actividad de las CRISPR. Dichas repeticiones se encuentran regularmente espaciadas dentro de cada agrupación por secuencias no reiteradas denominadas espaciadores, al menos algunas de las cuales derivan de fragmentos localizados en elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y virus. Adyacente a cada agrupación de repeticiones-espaciadores hay una secuencia denominada líder donde se localiza el promotor responsable de la transcripción de dicha agrupación en un RNA primario (pre-crRNA) que abarca la totalidad de la misma.
La identidad de los genes cas asociados a una agrupación CRISPR puede variar de manera considerable entre sistemas, en base a la cual los CRISPR-Cas se clasifican en 3 tipos principales, cada uno de los cuales incluye varios subtipos. Tan solo casi y cas2 están presentes en todos los subtipos identificados hasta la fecha.
Los sistemas CRISPR-Cas producen la degradación (interferencia) de ADN exógeno conteniendo secuencias complementarias a los espaciadores. Un sistema CRISPR- Cas activo puede insertar nuevos espaciadores (proceso conocido como adquisición y catalizado por Casi y Cas2) entre el líder y la repetición contigua. La inserción conlleva la duplicación de la repetición adyacente al sitio de inserción. La adquisición de un nuevo espaciador proporciona inmunidad frente a moléculas conteniendo la secuencia de la cual deriva. Para ello, en un primer paso del proceso de interferencia los pre-crRNAs son procesados dando lugar a moléculas crRNA conteniendo un único espaciador. Cada uno de estos crRNAs aparea con su secuencia complementaria en una molécula de ADN reclutando a continuación proteínas Cas específicas que producen su degradación. Además de una función como sistema inmune, se ha propuesto una implicación de los CRISPR-Cas en regulación génica y reparación de ácidos nucleicos.
La inserción de nuevas unidades CRISPR-espaciador es un evento poco frecuente y cuya detección requiere realizar un escrutinio al azar de las agrupaciones CRISPR de un gran número de clones (por ejemplo mediante amplificación por PCR). Tan solo cuando dicha adquisición produzca un nuevo patrón de interferencia se podrían seleccionar las células adaptadas, requiriendo para ello condiciones experimentales que permitan dicha interferencia y excluyendo la detección de inserciones "silenciosas".
La disponibilidad de una herramienta para detectar inserciones de espaciadores mediante una selección independiente de la interferencia resulta por tanto ventajosa respecto a sistemas no seleccionares.
Descripción de la invención
Así pues la presente invención en un primer aspecto se refiere a un método para detectar inserciones de espaciadores, de ahora en adelante método de la presente invención, mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR) que comprende la inserción de al menos una unidad CRISPR- espaciador, en la estructura artificial dentro de la secuencia que codifica un gen testigo, que restaura la pauta de lectura de traducción, donde la expresión del gen testigo es indicativo de la inserción del espaciador.
En una realización más en particular la unidad CRISPR-espaciador insertada comprende un número de nucleótidos no múltiplo de 3.
En una realización más en particular, el espaciador de la unidad CRISPR-espaciador del método de la presente invención comprende un codón de terminación. Más en particular el codón de terminación es críptico.
En una realización más en particular, la estructura artificial del método de la presente invención comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103, en una realización más en particular, la estructura artificial del método de la presente invención se corresponde con la fusión traduccional de un cassette CRISPR- espaciador-CRISPR-líder y la secuencia codificante del gen de la cloranfenicol acetil-transferasa {caí), donde los nucleótidos del 96-124 y 156-165 se corresponden con las unidades CRISPR y la región líder (nucleótidos 165-234) del cassette insertado 5' de la región codificante de la proteína CAT (nucleótidos 275-953) que se encuentra fuera de fase respecto al inicio de la traducción.
En una realización más en particular de la presente invención, el espaciador es seleccionado de entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 89.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una estructura artificial, de ahora en adelante, estructura artificial de la presente invención) identificada caracterizada por que comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de la estructura artificial de la presente invención para la detección de inserciones de espaciadores.
Descripción de las figuras
Figura 1 : Representación esquemática de la integración en los cassettes testigo clonados en los plásmidos pCSIR y la estrategia usada para detección específica de integración. A. Cassette de integración en pCSIR-A o pCSIR-T consta de un líder y dos duplicones CRISPR (CR) interespaciados por un espaciador (Sp-1) fusionado aguas arriba a un fragmento del gen of lacZ-ct (lacZct') y, aguas abajo la secuencia completa del gen cat fuera de fase (cat +2). Se indican el punto de unión al ribosoma (rbs) y el codón de inicio de la traducción lacZ-ct (punta de flecha blanca). La traducción de los transcritos generados desde el promotor lac (P/ac, representado con una flecha) termina en el líder (punta de flecha negra). Aguas abajo del gen cat se localiza un promotor de T7 (Ρτ7), que inicia la transcripción en sentido opuesto (la flecha apunta en el sentido de la transcripción). Se muestran las secuencias de los fragmentos en la región líder-caf de pCSIR-T y pCSIR-A. Los nucleótidos idénticos a la variante de líder T o A correspondiente están sombreados, los codones de terminación y la caja -10 subrayados y etiquetados (el punto de inicio se indica con una flecha que apunta en la dirección de transcripción). Para evitar codones de terminación, se reemplazaron las timinas en las posiciones 42 y 70 del líder de pCSIR-T por citosina y adenina respectivamente (ver el cebador TLR en la Tabla 2). La traducción del transcrito generado de P/ac acaba en el líder en caso de deleción (cat seguiría fuera de fase, caf+1) (B), en el espaciador duplicado (Sp-1) en caso de duplicación CRISPR-espaciador (C), o en el codón de terminación de la secuencia codificante de caf en el caso de la inserción (D) de un espaciador nuevo (Sp-2).
Figura 2: Distribución, en pCas1-2[K], de las secuencias correspondientes a espaciadores muestreados en los ensayos de adquisición. Los espaciadores se muestran como flechas negras apuntando al líder tal y como se insertaron en el cassette de integración. Se muestra el origen de replicación (CDF ori), los genes codificando el represor del operón lac (Lacl), la proteína de resistencia a estreptomicina (SmR), y el promotor T7-lac (PT7) que promueve la transcripción de la variante K de los genes cas1-2 (cas1-K y cas2-K).
Figura 3: WebLogos generados por el alineamiento de las regiones de protoespaciadores de CRISPR2 de E. coli. Las secuencias conteniendo protoespaciadores (posiciones -1 a -33) y los dos nucleótidos adyacentes de la región PAM (posiciones 0 y 1) estaban orientados del mismo modo que los espaciadores correspondientes en la agrupación CRISPR (el extremo 3' hacia el líder). Los logos se obtuvieron a partir de secuencias no CRISPR con una identidad mayor al 90% a espaciadores de genomas de E. coli, asociados con el líder-T (A) o el líder-A (B), así como protoespaciadores correspondientes a espaciadores encontrados en los experimentos de adquisición realizados en cepas alojando los genes Cas-EK (C) o Cas-EO (D).
Figura 4: Mecanismo hipotético de inserción de espaciadores. Se distinguen los tres pasos principales en el proceso de integración de espaciadores: (i) corte en el punto de inserción, (ii) integración del espaciador y (iii) duplicación CRISPR. A. Las inserciones aberrantes (secuencias CRISPR-espaciador atípicas) obtenidas en ensayos de adquisición con pCSIR-A y el plásmido pCas1-2[K] pueden explicarse con un nick inicial (triángulo negro; nuestros datos no permiten precisar en qué cadena) entre las posiciones primera y segunda del líder (cursiva) y un corte secundario (triángulo blanco) en la hebra complementaria a una distancia fija (28 nt) hacia el duplicón CRISPR adyacente (posiciones sombreadas). Después se produce la ligación del espaciador entrante de 33 pb (indicado con letras N) a los extremos libres de los puntos de inserción, los huecos se rellenan por polimerización del DNA (negrita), generándose los duplicones CRISPR de 26 pb (recortados en 2 pb) manteniéndose la periodicidad típica de 61 pb. B. En un proceso normal de inserción, el primer punto de corte se produce en la unión entre la CRISPR y el líder, y el segundo a una distancia fija de 28 nt (es decir, en el límite entre el espaciador y la CRISPR), lo que conduce a la duplicación de una unidad CRISPR completa y mantiene la periodicidad de 61 pb. Se indican las longitudes de relevancia.
Figura 5: muestra agrupaciones CRISPR2.1 de E.coli.
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1: Ensayo de adquisición de espaciadores
Las cepas de E. coli utilizadas como hospedadores en los ensayos de integración fueron K12 str. MG1655, 0157:H7 str. EDL931 (Colección Española de Cultivos Tipo, CECT 4267) y BL21-AI (Novagen). Las tres cepas contienen los loci CRISPR2.2 y CRISPR2.3-líder. Las cepas de K12 contienen además una agrupación CRISPR2.1 compuesta de duplicones CRISPR-T asociados con una líder de tipo T y todo el conjunto de genes cas-EK. El locus CRISPR2.1 de E. coli 0157:1-17 se compone de repeticiones y líder tipo A, y adjunta el conjunto completo de genes cas-EO. El locus CRISPR2.1 de cepas derivadas de BL21 consta de duplicones CRISPR-A, y carece tanto de líder como de genes cas. El genoma de BL21-AI codifica la RNA polimerasa de T7 inducible por arabinosa, mientras que las otras cepas carecen de genes homólogos a ella.
El locus CRISPR2.1 de E. coli ECOR69, usado como molde para la amplificación por PCR del cassette testigo de integración clonado en pCSIR-A, contiene CRISPRs y líder tipo A (Diez-Villasenor C, Almendros C, Garcia-Martinez J, Mojica FJ. Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli. Microbiology 2010).
Los plásmidos desarrollados en este estudio y los detalles de su construcción están indicados en la Tabla 1 y los cebadores respectivos utilizados en la Tabla 2.
El plásmido de 9Kb pWUR339 (proveído por el laboratorio de John van der Oost) se deriva del vector de bajo número de copias pCDF-1 b (Novagen) y contiene el operón Cascada-cas 1-cas2 de E. coli K12 bajo el promotor l-lac. Las construcciones se realizaron clonando fragmentos de DNA obtenidos por PCR con cebadores conteniendo puntos de corte de enzimas de restricción (ver Tablas 1 y 2) o mediante el método de extremos con 3'-T sobresalientes. Tabla 1. Plásmidos construidos durante el estudio.
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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Tabla 2. Cebadores usados en la presente invención.
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El plásmido pCR2.1-Cm se obtuvo clonando el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (cat) de pKK232-8 en el vector de alto número de copias pCR2.1 (Invitrogen; origen de replicación pUC). pCSIR-A deriva de pCR2.1-Cm mediante la inserción de una secuencia que contiene 43 pb del Iíder2.1 y el fragmento CRISPR-espaciador-CRISPR adyacente de la cepa ECOR69. Para construir pCSIR-T se clonó en el vector pCR®2.1 por el método de 3'-T sobresalientes (TA Cloning® Kit de Invitrogen) un segmento de 69 pb del Iíder2.1 y el fragmento CRISPR-espaciador-CRISPR adyacente amplificados de E. coli K12 str. MG1655, y la subsecuente inserción de un amplicón conteniendo el gen cat del mismo modo que para la construcción de pCR2.1-Cm. pCas1-2[K] y pCas1-2[0] se obtuvieron mediante inserción en el vector pCDF-1 b de amplicones conteniendo los genes casi y cas2 de pWUR399 y los de E. coli 0157:1-17 str. EDL931 respectivamente.
Para clonar en los extremos 3'-T sobresalientes del vector pCR®2.1 linearizado, los productos de PCR se amplificaron con Taq polimerasa recombinante (Invitrogen). Para el resto de los casos (Tabla S4) se obtuvieron con Expand High Fidelity PCR System (Roche). Para realizar las PCRs se utilizó un termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf). Los productos de PCR se purificaron y digirieron posteriormente con enzimas de Thermo Scientific según las recomendaciones de la herramienta web Double Digest. Las ligaciones se realizaron con DNA ligase de T4 (New England Biolabs). Tras la ligación, se transformó la cepa TOP10 (Invitrogen) o NovaBlue (Novagen) con los plásmidos derivados de pCR2.1 o pCDF-1 b respectivamente, y se verificaron las construcciones mediante secuenciación con los cebadores T7 (pCR2.1 y pCDF-1 b) y M13R (pCR2.1) o T7t (pCDF-1 b).
Los líderes de las cepas ECOR se determinaron mediante secuenciación de productos de PCR como se describe en Diez-Villasenor C et al. Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli. Microbiology 2010. Las CRISPR y los líderes de genomas de E. coli disponibles se identificaron con el programa CRISPRFinder.
Para la identificación de los motivos PAM de las CRISPR2 asociados con las variantes CRISPR-líder A o T, las regiones de los protoespaciadores con una identidad de al menos 30 nt con espaciadores de los sistemas CRISPR-Cas l-E de cepas de E. coli se buscaron con el programa BLASTn contra la base de datos Nucleotide Collection (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y alineadas usando el extremo proximal al líder como referencia. De modo similar, los motivos PAMs experimentales se determinaron mediante alineamiento de secuencias con un 100% de similitud a espaciadores adquiridos en los ensayos de integración y detectados en los replicones del hospedador correspondiente usando BLASTn o Geneious R6 creado por Biomatters Ltd. Las hebras de DNA portadoras de la secuencia complementaria a la del espaciador correspondiente en el crRNA se alinearon usando WebLogo para obtener logos de secuencia como se describe en Mojica FJM, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology 2009; 155:733-40.
El DNA genómico y plasmídico se purificó de células crecidas en medio LB (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, y NaCI 10 g/l) usando Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega) y High Puré Plasmid Isolation Kit (Roche) respectivamente. Los productos de PCR y fragmentos de restricción se purificaron con GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare).
Las secuenciaciones se realizaron con el Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit en un secuenciador ABI PRISM 310 DNA Sequencer (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante (Servicios Técnicos de Investigación, Universidad de Alicante, Spain). Las transformaciones se efectuaron por electroporación (2.45 KV, 25 μΡ, 200Ω) en un Electroporator 2510 (Eppendorf). Las células electrocompetentes se prepararon siguiendo el procedimiento descrito por Shi et al. Enhancing Escherichia coli electrotransformation competency by invoking physiological adaptations to stress and modifying membrane integrity. Anal Biochem 2003; 320: 152-5. Las colonias transformadas se seleccionaron en placas de LB con agar conteniendo los antibióticos apropiados.
Como paso previo a los ensayos de adquisición, para confirmar la sensibilidad a cloranfenicol, se sembraron placas Petri de LB suplementadas con 25 μg/ml de cloranfenicol (Sigma) con colonias de E. coli llevando el plásmido testigo de integración y otro con gen(es) cas. Para cada ensayo de adquisición se utilizó un clon sensible distinto, que se creció 12 h a 37°C con agitación (150 rpm) en LB líquido suplementado con los antibióticos necesarios para la selección de plásmidos (ampicilina 100 μg/ml - Sigma - o estreptomicina 20 μg/ml - Sigma - para pCSIR y los plásmidos conteniendo genes cas respectivamente). Si fue necesario se realizaron ciclos adicionales (máximo de seis) de 12h de crecimiento (diluciones 1 :300 del cultivo en medio fresco e incubación en las mismas condiciones), hasta que aparecieran colonias resistentes a cloranfenicol (en expectativa con una unidad espaciador-CRISPR extra) tras sembrar muestras en medio LB sólido conteniendo cloranfenicol 25 μg/ml. Para evitar muestrear colonias descendientes de la misma célula adaptada, solo se seleccionó para su posterior análisis una colonia resistente en cada ensayo. La inserción se valoró en primera estancia mediante PCR del cassette integrado con los cebadores T7 y M13 que hibridan en las secuencias flanqueantes del vector (ver Tabla S7). Normalmente se observan fragmentos de PCR de mayor tamaño junto con amplicones del tamaño original, estos últimos se deben a copias de la construcción inicial. En estos casos, para seleccionar células enriquecidas con el plásmido portador de la inserción, se realizaron tres ciclos adicionales de crecimiento (diluciones 1 :5000, incubadas a 37° con agitación 24h) en medio LB con concentraciones crecientes de cloranfenicol (75 μg/ml, 150 μg/ml and 200 μg/ml). Finalmente se extrajeron los plásmidos y se secuenciaron con el cebador M13R. El primer ciclo de crecimiento en el que se detectan clones adaptados proporciona una estimación de la eficiencia de adquisición. Para calcular la probabilidad de que una integración no permita la traducción del gen cat debido a la presencia de codones de terminación en fase con el codón de inicio ATG en los plásmidos testigo se asumió que la frecuencia de los cuatro nucleotidos en el DNA donador es equivalente. Por ello la probabilidad de los tripletes de terminación (TA A, TAG o TGA) es 3 x 1/43 = 3/64 y de que un codón no sea de terminación 1 - 3/64 = 61/64. En cada espaciador de 33 nt insertado hay 10 trinucleótidos que pueden ser de parada de la traducción. Por ejemplo, en el caso de una única inserción, los tres nucleotidos que restan completarían tripletes en la CRISPR adyacente: el nucleótido en el extremo distal al líder del espaciador contribuye con el triplete TCN y el opuesto con 2 nucleotidos al codón NCG en los extremos de los duplicones CRISPR flanqueantes (nucleotidos subrayados). Por tanto la probabilidad de n inserciones sin que se interrumpa la traducción es (61/64)10" (es decir, 0,62 para una sola inserción). Si se tiene en cuenta que solo el 95% de los espaciadores encontrados en la naturaleza tienen 33 nt de longitud, para una única inserción (n=1), la probabilidad de detección de la integración es (61/64)10 x 0.95 = 0.59.
Para comprobar la adquisición de espaciadores en el sistema CRISPR-Cas l-E de E. coli, desarrollamos un ensayo basado en la selección positiva de clones que se vuelven resistentes a cloranfenicol tras la expansión de una agrupación CRISPR en plásmidos recombinantes (pCSI R-A y pCSI R-T; ver Figural ). Ambos plásmidos llevaban un cassette consistente en una agrupación CRISPR2 de dos repeticiones seguidos por un fragmento del líder asociado (las 43 y 69 bases proximales en pCSI R-A y pCSI R-T respectivamente; ver Figura 1A). Por tanto la caja TATA -10 requerida para la transcripción de la agrupación está presente en pCSI R-T pero ausente en pCSI R-A (Pougach K, Semenova E, Bogdanova E, Datsenko KA, Djordjevic M, Wanner BL, Severinov K. Transcription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coli. Molecular Microbiology 2010; 77: 1367-79; Pul U, Wurm R, Arslan Z, Geissen R, Hofmann N, Wagner R. Identification and characterization of E. coli CRISPR-cas promoters and their silencing by H-NS. Molecular Microbiology 2010; 75: 1495-512). Las repeticiones y líder en pCSIR-A pertenecen a la variante A (CRISPR-A y líder-A respectivamente), mientras que pCSI R-T contiene las variantes T de ambos elementos (CRISPR-T y líder T). El cassette CRISPR-espaciador-CRISPR-líder está traduccionalmente fusionado al comienzo de lacZ-ct (lacZ-ct) y al gen (cat) de la proteína cloranfenicol acetiltransferasa (o CAT) que se encuentra fuera de fase (+2 del codón de inicio de lacZ-a (Fig. 1A). La traducción iniciada en el codón AUG de lacZ-a se detiene en el líder. De modo similar, en el caso de una deleción producida por recombinación entre las dos unidades CRISPR la traducción se pararía en otro triplete de la región líder (Ver Figura 1 B). Para impedir la traducción de CAT debido a una duplicación (en vez de una inserción nueva) de una unidad espaciador-CRISPR, el espaciador existente contiene un triplete de terminación fuera de fase que estaría en fase en el caso de su duplicación (Fig. 1 C).
Los experimentos de inserción se realizaron con varias cepas de E. coli con distintas combinaciones de pCSIR y plásmidos conteniendo genes cas. Para evitar la posibilidad de una adquisición aberrante debido a una gran sobreexpresión de los genes cas (los promotores TI -lac, inducibles por IPTG se encuentran localizados aguas arriba de los operones cas y el gen lacl codificante del represor lac está incluido en las construcciones (ver Figura 2), todos los ensayos fueron llevados a cabo en la ausencia de IPTG. Por ello, como mucho se esperan pequeños niveles de expresión de los genes cas (como en el caso de 'goteo' del promotor).
Los ensayos iniciales de inserción se realizaron con la cepa BL21-AI llevando pCSIR-T y el plásmido pCas1-2[K] (contiene los genes casi y cas2 de K12). Las cepas derivadas de BL21 carecen de genes cas propios y aunque BL21-AI aloja al gen de la RNA polimerasa de T7 bajo el control de un promotor inducible por arabinosa, no se añadió arabinosa al medio de cultivo. En estas condiciones, se encontró un único clon adaptado (la secuencia del espaciador es la SEQ ID NO: 104 idéntica a una secuencia cromosómica adyacente a CTT) tras varios intentos y crecimiento prolongado (seis ciclos de crecimiento). Sin embargo, cuando se utilizó el plásmido pWUR399 (el mismo vector que pCas1-2[K] pero con los genes de la Cascada fusionados transcripcionalmente a cas1-cas2) en vez de pCas1-2, se aislaron nueve clones adaptados tras 12 horas de incubación (un ciclo de crecimiento) (Tabla 3).
La combinación de estos resultados indicaron que los genes cas se transcribieron en ambas construcciones a pesar de la ausencia de inducción. Tabla 3: Espaciadores integrados en pCSIR-T durante la propagación en BL21-AI que alberga a pWUR399.
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aEncontramos Timina en la posición 4 detrás del protoespaciador, dando lugar al desplazamiento en una posición de la PAM putativa CAT.
En un análisis previo comparando el líder con las PAMs de 15 protoespaciadores putativos del CRISPR2 de E. coli, se propuso una preferencia por CAT o CTT para las agrupaciones CRISPR asociados con líderes A o T respectivamente. Ahora hemos confirmado este sesgo mediante un estudio similar in silico realizado con 76 protoespaciadores putativos con identidad superior al 90% a espaciadores CRISPR2 de cepas ECOR (Ochman H, Selander RK. Standard reference strains of Escherichia coli from natural populations. J Bacteriol 1984; 157:690-3.) y genomas de E. coli secuenciados: 11 protoespaciadores de un total de 21 asociados con el líder-T mantienen el motivo PAM CTT y solo uno CAT, respetando la secuencia CTT en la PAM y 34 de los 55 protoespaciadores predichos asociados con un líder A se encuentran junto a la secuencia CAT, mientras que 9 lo están junto al triplete CTT, confirmando CWT como consenso PAM (Fig. 3B).
Aunque parece haber una conexión entre PAM y líder, sugiriendo que este último puede tomar parte en el reconocimiento del motivo específico durante la adquisición de espaciadores, también podrían estar implicados otros elementos del sistema CRISPR-Cas. Como se muestra en la Figura 6, en agrupaciones CRISPR2.1 de E. coli, repeticiones del tipo A coexisten con un líder-A, y CRISPR-T con un líder-T. Además, en un estudio independiente (datos sin publicar) encontramos que cada tipo de líder se corresponde con una determinada variante de genes cas-E, diferenciando dos grupos en la especie definidos por la variante aquí referida como cas-EK (por la cepa K12), con CRISPR/líder tipo T, y la variante cas-EO (por 0157:1-17) asociada con el tipo A respectivamente.
Para identificar experimentalmente el verdadero motivo de adquisición (denominado SAM, spacer acquisition motif) reconocido por cada variante CRISPR/líder/Cas, realizamos ensayos de integración de espaciadores con combinaciones naturales de los elementos respectivos en cepas alojando un sistema CRISPR-Cas equivalente (de este modo se evitan interacciones entre elementos CRISPR-Cas de variantes distintas). Primero se valoró inserción en K12 conteniendo un plásmido testigo de integración (pCSIR-T) con líder-T y CRISPR-T, y un segundo plásmido recombinante con casi (pCasl K), cas2 (pCas2K) o casi y cas2 (pCas1-2[K]) de la misma cepa. Se observó integración eficiente de espaciadores (59 inserciones) con pCas1-2[K] (Tabla 4) con 12h de incubación, pero no con pCasl K o pCas2K tras 6 ciclos de crecimiento, probando que se requieren ambos genes cas en un plásmido multicopia para detectar adquisición de K12 en nuestro sistema.
Tabla 4: espaciadores integrados en pCSIR-T
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Encontramos Timina en la posición 4 detrás del protoespaciador, dando lugar al desplazamiento en una posición de la PAM putativa CTT.
Además, el análisis de los precursores putativos de los nuevos espaciadores mostró que los plásmidos pCSIR-T tienden a adquirir espaciadores de secuencias junto al triplete CTT (42 inserciones de 59; nótese que no se detectó CAT; Tabla 4). Esta preferencia se ve apoyada por los experimentos descritos en la sección previa realizados en BL21-AI con pCSIR-T y pWUR399: 6 inserciones de 9 tenían CTT como PAM y sin observarse CAT.
Cabe destacar que cuando la adquisición se realizó en la cepa 0157:1-17 con pCSIR-A y pCas1-2[0] (contiene casi y cas2 de esa misma cepa), a diferencia de K12, se reveló la presencia de ambos CTT y CAT como motivo junto al protoespaciador (detectados 26 y 11 respectivamente en 45 inserciones; ver Tabla 5 y Figura 3D).
Tabla 5: Espaciadores integrados en pCSIR-A durante la propagación en 0157:1-17 que alberga a pCas1-2[0].
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Encontramos Timina en la posición 4 detrás del protoespaciador, dando ugar al desplazamiento en una posición de la PAM putativa CTT.
Por lo tanto, nuestros datos demostraron que CTT es el motivo dominante (no se detectó CAT) reconocido para adquisición por el subtipo CRISPR-Cas l-E de K12 (comparar Figura 3A con 3C), pero CTT y CAT para las proteínas Cas-EO de 0157:1-17 (comparar Figura 3B con 3D), coincidiendo con motivos PAMs revelados por alineamientos de precursores putativos de espaciadores encontrados en las agrupaciones CRISPR2 de la especie. Estos resultados revelan que ambas variantes del sistema pueden diferir mecanisticamente, al menos en esta etapa de la expansión CRISPR.
A pesar de que el contenido de DNA por célula y la cantidad del trinucleotido CTT por Kb (Tabla 1) es mayor para pCSIR-T que para pWUR399, los nueve espaciadores adquiridos en células de BL21-AI alojando ambos plásmidos eran idénticos a secuencias presentes en pWUR399 pero ausentes en pCSIT-T (Tabla 3). De modo similar, aunque el DNA cromosómico es mucho más abundante que pWUR399, ninguno de los espaciadores se corresponde con un fragmento cromosómico (Tabla 3).
Al igual que con BL21-AI, los experimentos realizados con las cepas K12 o 0157:1-17 revelaron una preferencia por plásmidos conteniendo genes cas como fuente de espaciadores. Una razón de 39/104 espaciadores insertados eran idénticos a secuencias cromosómicas, y sólo 4 de ellos no se encuentran presentes en los plásmidos pCas1-2 (Tablas 4 y 5). Aunque el contenido de DNA por célula de plásmidos con genes cas era menor que el de los plásmidos testigo de integración (las 4 construcciones tienen un tamaño similar, y tanto pCas1 -2 como pWUR399 tienen un origen de replicación CDF; Tabla 1), 7 inserciones eran idénticas a fragmentos de pCSIR frente a 94 que lo eran de pCas1-2 (Tablas 4 y 5). Además, la frecuencia del trinucleotido CWT en las construcciones no justifica la infrarrepresentacion de protoespaciadores observada en los plásmidos testigo (CTT es más frecuente en pCSIR que en los plásmidos pCas1-2 y la incidencia de CAT es similar para todos ellos; Tabla 1). En este contexto, la similar relación CTT/CAT en los plásmidos pCas1-2 (0,93-0,99; Tabla 1) proporciona apoyo adicional a la preferencia por el motivo de adquisición CTT por cas-EK y CWT pos los sistemas cas-EO. Por tanto, o algunos replicones son menos propensos a contribuir con espaciadores o existe alguna preferencia por ciertas moléculas como donadoras.
Implicación de los elementos CRISPR-Cas en la orientación del espaciador
Los espaciadores en una agrupación CRISPR tienden a estar igualmente orientados con respecto al motivo PAM. Además, esta conservación de la orientación se aplica al tipo de CRISPR-Cas: Los PAMEs (extremo de los espaciadores equivalente al borde del protoespaciador adyacente al motivo PAM -spacers ends equivalent to the protospacer edges adjacent to the PAM-) de CRISPR-Cas del tipo I están orientados hacia el líder. Ello implica que los genes de adquisición (casi y/o cas2) junto con elementos de la región de integración de espaciadores (bien en el líder o la secuencia CRISPR adyacente) están implicados en la determinación de la dirección de inserción.
A continuación se comprobó la inserción de espaciadores en K12 llevando una combinación CRISPR/líder/cas no convencional: pCSIR-A y pCas1-2[K]. Se obtuvieron adiciones de espaciadores (Tabla 6), mostrando que las proteínas Cas de K12 son capaces de funcionar con la variante CRISPR/líder2.1 alternativa.
Tabla 6: Espaciadores integrados en pCSIR-A durante la propagación en K12 que alberga a pCas1-2[K].
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3 Espaciadores identificados con #' se diferencian con el correspondiente espaciador # (integrado en este u otro experiment) por la presencia del dinucleótido AC en el extremo 5'. Espaciadores identificados con #R son idénticos a su respectivo espaciador # integrado en la orientación invertida (reversed) en este u otro experimento. bLos desajustes en la secuencia más parecida (protoespaciador putative) se encuentran representados por letras minúsculas.
c El trinucleótido 5'-CTT-3' se encuentra contiguo al extreme opuesto del protoespaciador en la cadena complementaria.
d Encontramos Timina en la posición 4 detrás del protoespaciador, dando lugar al desplazamiento en una posición de la PAM putativa CTT.
A diferencia de lo que sucede en todas las inserciones convencionales con las combinaciones pCSIR y pCas1-2 nativas, 7 de 18 adiciones eran anómalas:
I. tres insertos CRISPR-espaciador contenían espaciadores (identificados en la Tabla 6 como espaciadores identificados como SEQ ID NO: 76, 79 y 88) con dos nucleótidos adicionales, y la CRISPR duplicada con dos nucleótidos menos (ver Figura 4), y
II. cuatro espaciadores se encontraban en orientación opuesta con respecto al líder (es decir, el PAME estaba localizado distal al líder, ver espaciadores etiquetados con #R en la Tabla 6).
Estos resultados indican un funcionamiento anómalo en la combinación lider-Cas artificial y la existencia de espaciadores invertidos apoya la implicación de tanto las proteínas Cas como del líder en la orientación del espaciador. Adicionalmente sugieren que, mientras se da una flexibilidad en el reconocimiento del líder por las proteínas Cas para producir la adquisición, la orientación del espaciador requiere interacciones específicas entre una variante determinada de proteínas Cas y los CRISPR/líder correspondientes. No obstante, el hecho de que los espaciadores de sistemas CRISPR-Cas l-E residentes en E. coli estén insertados adecuadamente en sus agrupaciones con líderes distintos (por ejemplo Iíder2.1 y 2.3) indica que se tolera cierta variabilidad en la secuencia líder. De acuerdo con estos resultados, se puede concluir que aunque Cas1-2K pueden producir la adición de espaciadores en la variante CRISPR2/líder2 alternativa, el reconocimiento está afectado. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de que las inserciones anómalas sean debidas a un desequilibrio como consecuencia de la presencia de múltiples cassettes de inserción presentes en nuestro sistema experimental.
En concordancia con el reconocimiento de CTT por el sistema de K12, aunque el cassette testigo portara un líder tipo A, 15 de 18 espaciadores integrados corresponden a protoespaciadores con este motivo y, además, no se observó CAT (Tabla 6). Ello evidencia que son los genes cas en vez del líder el principal factor implicado en la selección de PAM.
Al igual que en los ensayos realizados con la combinación silvestre de CRISPR, líder y Cas, la mayoría de los espaciadores (17/18) pertenecen a secuencias que se corresponden con fragmentos de pCas1-2 (7 de ellas presentes también en el cromosoma), y solo una exclusiva del cromosoma, mientras que ningún espaciador se originó de pCSIR-A (Tabla 6).
Los ensayos realizados demostraron que los plásmidos testigo de integración CRISPR-espaciador permitieron una detección sensible de insertos sin una elevada producción de proteínas Cas, o sin selección de células adaptadas dependiente del fenotipo de interferencia proporcionado por el espaciador nuevo. Las adiciones detectables estaban restringidas a secuencias que conducían a la síntesis de proteínas CAT funcionales. Por tanto, los espaciadores de 34 nt, observados en agrupaciones CRISPR en una proporción de entorno al 4%, quedaron excluidos, ya que sólo la integración de fragmentos de 3n+1 pb, como la unidad CRISPR-espaciador de la longitud canónica de 61 pb, pueden ser seleccionados (Fig. 1 D). En torno al 62% de ellos fueron detectados debido a la ausencia de codones de terminación en fase con el gen testigo. Solo se obtuvieron adiciones simples lo cual se explica considerando que las integraciones deben ser secuenciales, un plásmido con múltiples espaciadores nuevos estaría en minoría con respecto a los que alojan un número más pequeño (debido a un mayor número de ciclos de replicación para este último). El aumento de la probabilidad de encontrar codones de terminación (0,38 para una inserción frente a 0,85 para cuatro) también puede contribuir a ello. Teniendo en cuenta estas consideraciones, se pueden sacar conclusiones sólidas sobre el proceso de adaptación.
Los datos demostraron que la PAM dominante en nuestros ensayos con el sistema CRISPR-Cas de K12 fue CTT, de acuerdo con las predicciones de análisis comparativos de las regiones de los protoespaciadores y con los estudios de adquisición dependientes de interferencia realizados bajo niveles altos de proteínas Cas. Por el contrario, en otro análisis con sobreexpresión de casi y cas2 de K12 no relacionado con interferencia, sólo 36 protoespaciadores de 94 adjuntaban CTT, posiblemente fue debido a los elevados niveles de Casi y Cas2 utilizados (Yosef I, Goren MG, Qimron U. Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 2012 40(12):5569-76).
Por otro lado, en contraste con el sistema de K12 y en coincidencia con predicciones in silico, identificamos como PAM el triplete CWT para el sistema CRISPR-Cas l-E de E. coli 0157:1-17, revelándose diferencias en el mecanismo entre variante de un subtipo CRISPR-Cas dentro de una especie. A pesar de ello, el trinucleótido CAT es el motivo PAM observado en espaciadores presentes en agrupaciones CRISPR asociadas a un líder-A, pero CTT también es seleccionado por proteínas Cas-EO. La combinación de nuestros resultados bioinformáticos y experimentales demostraron que se requieren PAMs específicos para el reconocimiento del protoespaciador independientemente de las consecuencias en la interferencia, siendo los espaciadores más eficientes seleccionados subsecuentemente durante una carrera armamentística con el DNA invasor.
Los resultados obtenidos también demuestran el rechazo/preferencia por ciertos replicones como donadores de espaciadores y la existencia de un mecanismo de medición para cortar en el punto de inserción durante el proceso de integración del espaciador.
Los espaciadores se obtuvieron preferentemente de plásmidos conteniendo los genes casi y cas2. Se dio una sobrerrepresentación de secuencias de plásmidos conteniendo genes cas en los protoespaciadores obtenidos (120/132). El hecho de que la mayoría de los protoespaciadores putativos del cromosoma también se encuentren en estos plásmidos (43/48), incluso aunque las secuencias compartidas fueran inferiores al 0,1 % del cromosoma, proporcionan apoyo adicional al origen plasmídico de estos espaciadores.
La presencia de genes cas implicados en la adquisición, en los replicones preferidos como donadores de espaciadores, fue responsable de una adquisición más eficiente de las secuencias cercanas a sus regiones codificantes mediante el acoplamiento de la traducción y la transcripción. Esto fue corroborado por la detección de espaciadores en agrupaciones CRISPR, al igual que RNAs, en el complejo ribonucleoproteico Cascada, cuyas secuencias se corresponden con regiones en la proximidad de los loci CRISPR-Cas, incluyendo a los genes cas. Con el uso de una combinación CRISPR/líder/cas no convencional (es decir CRISPR-A/líder-A/cas-EK) se observaron inserciones anómalas (cuatro casos de espaciadores invertidos y tres secuencias CRISPR-espaciador atípicas; ver Tabla 6), seguramente debidas a interacciones líder/Cas erróneas.
Sorprendentemente, las tres inserciones atípicas compartían las mismas características:
(i) se pierde el dinucleótido GG del extremo de la CRISPR duplicada adyacente al espaciador (Fig. 4) y
(ii) los espaciadores eran de 35 pb (en vez de 33) conteniendo AC en el extremo distal al líder (Fig. 4), independientemente de la secuencia en las posiciones correspondientes del protoespaciador putativo (ver Tabla 6).
Estas observaciones demostraron que la integración sucedió entre el segundo y tercer nucleótidos del líder (A1 C2-T3) en vez de en la unión CRISPR-líder (C--A1 ; Figs. 1A y 4A). Como consecuencia de la inserción incorrecta, el extremo del líder proximal a la CRISPR incorpora el dinucleótido extra AC (Fig. 4A).
El hecho de que se recorte la nueva CRISPR en el extremo adyacente al espaciador sugiere que tras un corte inicial en el líder, el duplicón nuevo se genera tras un nick subsecuente a una distancia fija (a 28 nt del primer corte) en la CRISPR adyacente sin necesidad de reconocer la secuencia del extremo CRISPR (la incorporación de AC en el duplicón distal al líder se compensa con la pérdida de GG de la CRISPR proximal; ver Figura 4A). De todos modos, dado que una inserción de 63 pb no pudo ser detectada en los pCSIR (no restaura la fase de caí), no se puede descartar un segundo corte a esta distancia del primer nick. Sin embargo, las tres adiciones observadas demostraron que el extremo distal al líder de la CRISPR era innecesario para el corte, y la existencia de insertos de 61 pb, pero no de 58 o 64 pb apoya la hipótesis del corte a una distancia medida. Por tanto, teniendo en cuenta estas consideraciones, concluimos que el primer paso de la integración consistió en un corte secuencial en los puntos de inserción.
El primer corte, en el límite CRISPR/líder, depende de la secuencia (probablemente reconocido por Casi o Cas2). El segundo nick tuvo lugar en el extremo de la CRISPR distal al líder, muy probablemente en un punto determinado por la distancia al corte previo (Fig. 4B). A parte de Casi y Cas2, las adquisiciones deben requerir proteínas no Cas con actividades como ligación de DNA y polimerización. Esto podría conseguirse mediante la implicación de mecanismos de reparación del DNA, lo que amplía las posibles implicaciones de las interacciones conocidas de Casi con componentes clave de sistemas de reparación, incluyéndose RecB, RecC y RuvB. Aunque hemos considerado un modelo de inserción de un espaciador de doble cadena, no es descartable la integración de un protoespaciador monocatenario y su consiguiente replicación.
También se ha sugerido un mecanismo de corte a una distancia fija para la escisión del protoespaciador en otro sistema CRISPR-Cas de tipo I. Como consecuencia de esta estrategia común dirigiendo las dos etapas de la adquisición (escisión del protoespaciador e integración del espaciador) se conserva la periodicidad CRISPR.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método para detectar inserciones de espaciadores mediante selección independiente de la interferencia a partir de estructuras artificiales basadas en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente espaciadas (CRISPR) que comprende la inserción de al menos una unidad CRISPR-espaciador, en la estructura artificial dentro de la secuencia que codifica un gen testigo, que restaura la pauta de lectura de traducción, donde la expresión del gen testigo es indicativo de la inserción del espaciador.
2. Método según la reivindicación 1 , caracterizado por que la unidad CRISPR- espaciador insertada comprende un número de nucleótidos no múltiplo de 3.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el espaciador comprende un codón de terminación críptico.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la estructura artificial comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el espaciador es seleccionado de entre las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 89.
6. Estructura artificial identificada caracterizada por que comprende la secuencia identificada como SEQ ID NO: 103.
7. Uso de la estructura artificial según la reivindicación 6 para la detección de inserciones de espaciadores.
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Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104504304A (zh) * 2014-11-03 2015-04-08 深圳先进技术研究院 一种成簇的规律间隔的短回文重复序列识别方法及装置
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9322006B2 (en) 2011-07-22 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2341149A1 (en) * 2005-08-26 2011-07-06 Danisco A/S Use of CRISPR associated genes (CAS)

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2341149A1 (en) * 2005-08-26 2011-07-06 Danisco A/S Use of CRISPR associated genes (CAS)

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALMENDROS, C. ET AL.: "Target motifs affecting natural immunity by a constitutive CRISPR-Cas system in Escherichia coli", PLOS ONE, no. 7, 11, 2012, pages E50797 *
DÍEZ- VILLASEÑOR, C. ET AL.: "Diversity of CRISPR loci in Escherichia coli", MICROBIOLOGY, vol. 156, no. PT 5, 2010, pages 1351 - 1361, XP055039931, DOI: doi:10.1099/mic.0.036046-0 *
DÍEZ-VILLASEÑOR, C. ET AL.: "CRISPR-spacer integration reporter plasmids reveal distinct genuine acquisition specificities among CRISPR-Cas I-E variants of Escherichia coli.", RNA BIOLOGY, vol. 10, no. 5, May 2013 (2013-05-01), pages 1 - 11 E *
MOJICA, F.J. ET AL.: "Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system", MICROBIOLOGY, vol. 155, no. PT 3, 2009, pages 733 - 740, XP055118633, DOI: doi:10.1099/mic.0.023960-0 *
POUGACH, K. ET AL.: "Transcription, processing and function of CRISPR cassettes in Escherichia coli", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 77, no. 6, 2010, pages 1367 - 1379 *
SEMENOVA, E. ET AL.: "Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA, vol. 108, no. 25, 2011, pages 10098 - 10103, XP055118370, DOI: doi:10.1073/pnas.1104144108 *
SWARTS, D.C. ET AL.: "CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition", PLOS ONE, vol. 7, no. 4, 2012, pages E35888 *

Cited By (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9322006B2 (en) 2011-07-22 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US11920181B2 (en) 2013-08-09 2024-03-05 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US10508298B2 (en) 2013-08-09 2019-12-17 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a CAS9 nuclease
US10954548B2 (en) 2013-08-09 2021-03-23 President And Fellows Of Harvard College Nuclease profiling system
US11046948B2 (en) 2013-08-22 2021-06-29 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US10227581B2 (en) 2013-08-22 2019-03-12 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US11299755B2 (en) 2013-09-06 2022-04-12 President And Fellows Of Harvard College Switchable CAS9 nucleases and uses thereof
US10597679B2 (en) 2013-09-06 2020-03-24 President And Fellows Of Harvard College Switchable Cas9 nucleases and uses thereof
US10912833B2 (en) 2013-09-06 2021-02-09 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US10858639B2 (en) 2013-09-06 2020-12-08 President And Fellows Of Harvard College CAS9 variants and uses thereof
US9999671B2 (en) 2013-09-06 2018-06-19 President And Fellows Of Harvard College Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US10682410B2 (en) 2013-09-06 2020-06-16 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US10190137B2 (en) 2013-11-07 2019-01-29 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US10640788B2 (en) 2013-11-07 2020-05-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAs
US11390887B2 (en) 2013-11-07 2022-07-19 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US9834791B2 (en) 2013-11-07 2017-12-05 Editas Medicine, Inc. CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAS
US10465176B2 (en) 2013-12-12 2019-11-05 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11124782B2 (en) 2013-12-12 2021-09-21 President And Fellows Of Harvard College Cas variants for gene editing
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US11578343B2 (en) 2014-07-30 2023-02-14 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
US10704062B2 (en) 2014-07-30 2020-07-07 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN104504304B (zh) * 2014-11-03 2017-08-25 深圳先进技术研究院 一种成簇的规律间隔的短回文重复序列识别方法及装置
CN104504304A (zh) * 2014-11-03 2015-04-08 深圳先进技术研究院 一种成簇的规律间隔的短回文重复序列识别方法及装置
US10167457B2 (en) 2015-10-23 2019-01-01 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US11214780B2 (en) 2015-10-23 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US10113163B2 (en) 2016-08-03 2018-10-30 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US10947530B2 (en) 2016-08-03 2021-03-16 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11702651B2 (en) 2016-08-03 2023-07-18 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11306324B2 (en) 2016-10-14 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US11820969B2 (en) 2016-12-23 2023-11-21 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR2 receptor gene to protect against HIV infection
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11932884B2 (en) 2017-08-30 2024-03-19 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
US11643652B2 (en) 2019-03-19 2023-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11795452B2 (en) 2019-03-19 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11447770B1 (en) 2019-03-19 2022-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing nucleotide sequences
US11912985B2 (en) 2020-05-08 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

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ES2522765A1 (es) 2014-11-17
ES2522765B2 (es) 2015-03-18

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