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Diese Erfindung bezieht sich auf Halichondrine, die aus einem Meeresschwamm der Gattung
Lissodendryx Sp. isoliert werden können. Halichondrine werden zum Beispiel beschrieben in Pure & Appl.
Chem., Vol. 58, Nr. 5, Seiten 701-710, 1986.
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Gewisse Halichondrine, wie dies nachstehend spezieller beschrieben wird, sind aus einem
Meeresschwamm der Gattung Lissodendryx Sp. isoliert worden, und es stellte sich heraus, dass dieselben
eine zytotoxische Wirksamkeit zeigten, wie dies durch Versuche in vitro nachgewiesen worden ist.
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Dementsprechend liefert die Erfindung Halichondrinderivate mit der Formel:
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in welcher R¹ und R² gemeinsam ein bi- oder trizyklisches, Sauerstoff enthaltendes, kondensiertes
Ringsystem bilden, das mit einer hydroxylierten Alkylkette substituiert ist, und das folgende Formeln
aufweist:-
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oder
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen, wie oben bemerkt worden ist, eine zytotoxische
Wirksamkeit und die Erfindung liefert ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die
obengenannten Verbindungen enthalten, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger- oder
Verdünnungsmittel. Diese Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung einer zytotoxischen
Verbindung unter Benutzung, als den aktiven Bestandteilen, einer Verbindung wie sie oben beschrieben
worden ist. Schlussendlich liefert die Erfindung ein zytotoxisches Verfahren unter Einsatz der
erfindungsgemäßen Verbindungen.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind isoliert worden aus einem Schwamm der Gattung
Lissodendryx, welche in mäßigen Tiefen auf dem Kontinentalsockel vor der Kalkoura-Halbinsel (z. B. an
dem Standort 42º 26.20'S; 173º 44.30'E) vorkommt. In diesem Gebiet ist dies ein Schwamm der in mäßiger
Menge vorkommt und der in einer Tiefe von ungefähr 100 m gefunden wird.
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Lissodendryx n.sp. 1 ist ein Myxillidschwamm der durch das Spezimen der Originalsammlung
U228-10 dargestellt ist, welche in der Universität von Canterbury, Neuseeland, Sammlung der Chemischen
Abteilung, untergebracht ist. Der Schwamm ist in lebendiger Form massiv und bildet amorphe
Anhäufungen mit bis zu 50 cm Durchmesser. Die Oberfläche ist klumpig und leicht durchscheinend. Der
Schwamm ist außen und innen gelb, und wenn er der Luft ausgesetzt wird scheidet er Schleim aus.
Mikrosklere sind Sigmas und bogenförmige Isochelae. Megasklere sind Akanthostyle und Tylote von nur
einer einzigen Klasse. Man hat gefunden, dass der Schwamm in enger Zugehörigkeit zu einer Forcepia sp
steht.
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Die Halichondrine wurden aus dem Schwamm isoliert, in Übereinstimmung mit dem in dem
beigefügten Schema gezeigten allgemeinen Verfahren, wie es nachfolgend eingehender beschrieben ist.
EXTRAKTION UND TRENNUNGEN
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Die Extraktion wurde mit etwa 4 l/kg von 10 bis 20% H&sub2;O in MeOH und 4 l/kg von CH&sub2;Cl&sub2;
durchgeführt, um auf diese Weise, nachdem die zusammengelegten Extrakte eingedampft worden waren,
ungefähr 0,5 bis 0,8 Liter einer wässrigen Lösung zu erzielen. Der Einsatz einer minimalen Menge an
Methanol erleichtert die erste Trennung.
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Die erste Trennung gibt bessere Resultate mit EtOAc als mit CH&sub2;Cl&sub2; (die Emulsion bereitet ein
geringeres Problem).
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Die zweite Trennung gibt bessere Resultate mit Hexan oder Heptan als mit Pet-Ether. Während der
Eindampfung des wässrigen Methanols, unter Einsatz eines rotierenden Eindampfers, treten einige
Probleme auf (Blasen) wenn der Anteil an Methanol so um 10% liegt. Um dieses Problem zu vermeiden, ist
es nützlich kleine Volumina des Lösungsmittels in großen Rundkolben (200 ml in einem 1000 ml Kolben
zum Beispiel) einzudampfen und es ist nützlich während dieses Stadiums etwas Dichlormethan beizufügen,
um ein Azeotrop mit dem Methanol zu bilden und schlussendlich den Kolben schneller drehen zu lassen,
um die Blasen zusammenfallen zu lassen.
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Die IC&sub5;&sub0; (folglich die Anzahl an Einheiten), welche in diesen Fraktionen gefunden worden sind
und welche aus diesen Stufen herrühren, können wesentlich durch die Salze oder die Fette beeinflusst
werden.
REINIGUNG DURCH CHROMATOGRAPHIE
C18
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Das rohe Extrakt (gewöhnlich von einigen Grammen bis zu einigen Zehner Grammen) wird in
Lösung gebracht einen Tag vor der Durchführung der Chromatographie auf einer C18 Kolonne, dann wird
ein identisches Volumen an destilliertem Wasser aufgegeben bevor man die Lösung in die Kolonne geladen
wird (um auf diese Weise eine 1/1 Lösung H&sub2;O / MeOH zu erzielen). Die Lösung kann ebenfalls auf
Kieselgur absorbiert und verdampft werden, um ein Pulver oder einen Schlamm zu ergeben, welche auf die
Kolonne geladen werden können.
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10 bis 20 g des Material C18/g Extrakt reichen aus. Ein Gradient von MeOH/Wasser zu
MeOH/CH&sub2;Cl&sub2;(1/1) wird für die Eluierung benutzt. Ungefähr 25 ml an Lösungsmittel pro Gramm des rohen
Extrakts werden eingesetzt für 50, 40 und 30% Wasser in Methanol, ungefähr 50 ml/g für 20 und 10% und
20 bis 40 ml/g für MeOH 100% und MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1/1).
SEPHADEX LH20
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Das Permeationsgel wird in CH&sub2;Cl&sub2; in Lösung gebracht. Ungefähr 200 bis 250 g Sephadex werden
benutzt (gesamtes Volumen von 800 ml) für jede Kolonne (Dimension 4,5 · 50 cm), 200 bis 800 mg
Extrakt können auf die Kolonne geladen werden. Das weniger polare Halichondrin (LP1, LP2, LP3 und
Isohomohalichondrin B) gelangten zuerst durch die Kolonne, assoziiert mit einem sehr polaren Material
(wahrscheinlich große Polymere, die beim Trocknen einen Film in dem Glasfläschchen bilden), dann
werden die polaren Halichondrine (Hb, HoB, die untergeordnete Verbindung 1 und die untergeordnete
Verbindung 2) eluiert, zusammen mit etlichen Fettsäuren und einigen Sterolen. Wenn die Kolonne
erschöpft ist (nur 4 oder 5 der 100 ml Fraktionen genügen um die Halichondrine zu sammeln), wird das
Sephadex LH20 gewaschen mit Hilfe von MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; 1/1 (100 ml) bis alle unerwünschten
Verbindungen entfernt sind, was unter Einsatz eines gesinterten Trichters erzielt werden kann.
SILIKA
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Eine zusätzliche Stufe auf einer Silikakolonne kann vor der endgültigen Reinigung durch die
HPLC (high power liquid chromatography = Hochleistungsflüssigchromatographie) eingesetzt werden.
Ungefähr 30 mal die Masse des Extraktes muss für das Silika eingesetzt werden (ø 1,6 · 115 cm = 30 cm³,
Davisil 35-70u für ein Extrakt von 50-100 mg Gewicht). Ein Gradient von 0 bis 5% an MeOH in CH&sub2;Cl&sub2;
wird benutzt, um die weniger polaren Halichondrine zu reinigen und von 2 bis 15% für die polaren
Halichondrine. Diese zusätzliche Stufe ist besonders nützlich wenn gewisse Fettsäuren oder Sterolen in der
Fraktion enthalten sind. (Es war keine weitere Reinigung notwendig, um nach dieser Stufe das LP1 zu
erzielen).
HPLC, VORBEREITENDE C19 KOLONNE
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Der UV Nachweis erfolgt bei einer Wellenlänge von 200 nm, wobei die gewöhnlich benutzten
Dämpfungen 0,64 oder 1,28 sind, oder 2,56 wenn die Menge eines jeden Halichondrins um etwa 1 bis 2
mg/Injektion liegt.
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Die Merkmale der Kolonne sind: Kolonne + Vorkolonne, 25 + 5 cm L · 21,4 mm ID, 60 A
Partikel von 8 u.
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Die mobile Phase wird gewählt in Bezug auf die Polarität der Verbindungen. Eine Mischung von
55% ACN in H&sub2;O, welche für die polaren Halichondrine (Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min) benutzt wird,
führt zu Verweilzeiten von 17, 22, 23, 26 und 40 min für die untergeordnete Verbindung 2, die
untergeordnete Verbindung 1, das Halichondrin B, das Homohalichondrin B und beziehungsweise das
Isohomohalichondrin B. Eine Mischung von 80% ACN in H&sub2;O, welche für die weniger polaren
Verbindungen benutzt wird, führt zu Verweilzeiten von 24, 34, 40 und 50 min für Isohomohalichondrin B,
beziehungsweise LP3, LP2 und LP1.
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Nicht mehr als 10 mg (400 für einen Umlauf) wird auf einmal eingespritzt. Um die Umwandlung
der weniger polaren Verbindungen (LP1 oder LP3) in Isohomohalichondrin B zu vermeiden, wird die Probe
vor der Injektion in Acetonitril aufgelöst, eher als in Methanol. Eine einfache Filtration der Probe auf
Baumwolle vor der Injektion ist ausreichend. Um mehr von den untergeordneten Verbindungen zu erzielen,
wird das Sammeln der Fraktionen wie folgt durchgeführt:
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- für die polaren Verbindungen, alle 3 oder 4 Minuten von der Spitze des Lösungsmittels bis zu der ersten
Hauptverbindung (die Halichondrin B ist, die untergeordnete Verbindung 1 kann ebenfalls gesondert
gesammelt werden), und es wird eine Fraktion zwischen dem Homohalichondrin B und dem
Isohomohalichondrin B gewonnen. - für die weniger polaren Verbindungen, alle 4 oder 5 Minuten zwischen
Isohomohalichondrin B und LP1. Alsdann, wenn verschiedene Injektionen vorgenommen worden sind,
werden die Fraktionen, welche dieselben Retentionszeiten aufweisen, kombiniert und erneut injiziert, wobei
man dieselbe mobile Phase aber eine geringere Dämpfung (des UV Detektors) einsetzt, um kleinere Spitzen
ausmachen zu können.
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24,5 kg der ursprünglichen 47 kg sind behandelt worden, und es sind isoliert worden 52,8, 53,5
und 65,8 mg (Ausbeuten von 5,06 · 10&supmin;&sup5;%, 5,22 · 10&supmin;&sup5;% und 6,31 · 10&supmin;&sup5;% des feuchten Schwammes)
Halichondrin B, Homohalichondrin B, beziehungsweise Isohomohalichondrin B. Untergeordnete
Verbindungen sind isoliert worden und die Strukturen von sechs davon sind nachgewiesen worden.
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Die Strukturen der Verbindungen sind festgelegt worden auf der Basis von verschiedenen NMR
Techniken: ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY, 1D und 2D TOCSY, HMQC und HMBG, gemessen an
einem 300 MHz Instrument (außer für Isohomohalichondrin B), einige NMR Experimente sind an einem
500 MHz Instrument durchgeführt worden) in CDCl&sub3;/Pyridine 0,1%, CDCl&sub3; und CD&sub3;OD. Alle bisher
untersuchten Verbindungen gehören zu den B Serien, die gekennzeichnet sind durch die Abwesenheit von
Hydroxylgruppen in den Positionen 12 und 13, gemäß der Nomenklatur die von Uemura adoptiert worden
ist. Die Unterschiede zwischen den Verbindungen treten an den Endteilen der Molekel auf (von der Position
44 an), wobei δer restliche Teil unverändert bleibt.
ISOHOMOHALICHONDRIN B (ML1 43.3)
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Isohomohalichondrin B wurde in der Form eines weißen amorphen Pulvers gewonnen; kein UV
Maximum über 210 nm; IR (NaCl Pellet) 3450, 1732, 1695 (sh), 1648 cm&supmin;¹ zeigen hin auf die Anwesenheit
von Hydroxylgruppen, eines Lactons, größer als ein fünfgliedriger Ring, wie für das vorher erwähnte
Norhalichondrin A, eines aliphatisches Ketons und von Exomethylenen. Die Massenspektrometrie zeigt
MNa&spplus; und MK&spplus; bei m/z Werten von 1145 und 1161 in dieser Reihenfolge, was zu einem Molekulargewicht
von 1122 führt. Das beobachtete HRFABMS Spektrum liegt bei einem m/z Wert von 1161,5395 (MK&spplus;,
berechnet: 1161,53999; Fehler -0,4 ppm) entsprechend einer elementaren Zusammensetzung von
C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub6;O&sub1;&sub9;, welche 19 Stellen an Ungesättigtheit verlangt, wie für Homohalichondrin B.
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Die Struktur wurde hauptsächlich festgelegt auf der Basis von ¹H-¹H COSY Spektren, gemessen
mit einem 300 MHz Instrument in zwei verschiedenen Lösungsmitteln; CD&sub3;OD und CDCl&sub3;/Pyridin-d&sub5; 0,1%
und mit einem 500 MHz Instrument in CDCl&sub3;/Pyridin-d&sub5; 0,1% bloß. Die Protonverbindungen von C1 bis
C46 waren identisch mit denjenigen von Halichondrin B oder Homohalichondrin B. Andrerseits sind drei
Spinsysteme (siehe TABELLE 1 unten) neu aufgrund der Tatsache, dass sie in den Spektren kein
offensichtliches Äquivalent zu irgendwelchen Molekülen des Halichondrins vom Typ "B" zeigen.
TABELLE 1
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Darüber hinaus sind die den H47 bis H51 zugewiesenen Signale vergleichbar mit denjenigen die
bei Norhalichondrin A beobachtet worden sind, und die chemische Verschiebung für die Protonen an C52
und C54 legte nahe, dass diese Protonen mit einem Carbonylkohlenstoff benachbart sind (siehe Tabelle ¹H
NMR).
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Einundsechzig Kohlenstoffe wurden in dem ¹³C NMR Spektrum von Isohomohalichondrin B
beobachtet. Ein HMQC Versuch bestätigte die Anwesenheit von 4 Methinen (CH trägt ein O) und von 4
Methylenen für das Seitenkettenende "zur linken Hand" (von C47 bis C55). Ein HMBC Versuch, gemessen
mit dem 500 MHz Instrument, bestätigte die Sequenz C52 bis C55 durch die Beobachtung von
Korrelationen in einem langen Bereich zwischen den drei Methylenen 52, 54 und 55 und dem Kohlenstoff
bei 209,5 ppm, wie in Fig. 1 gezeigt. Die Stereochemie von Isohomohalichondrin B wurde ebenfalls
bestätigt durch ein NOESY Versuch (Fig. 2), dieser zeigte dass Kohlenstoff 47 und 48, 50 sowie 51 alle
cis gelagert waren (Sessel-Konformation), und dass im Anschluss daran die Hydroxylgruppe an C50 und
die Seitenkette unterhalb der Ebene liegen.
Fig. 1: HMBC Verknüpfungen
Fig. 2: NOESY Verknüpfungen
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Eine wahrscheinliche Wasserstoffbindung zwischen dem Carbonyl 53 und dem von dem
Kohlenstoff 50 getragenen Hydroxyl erklären den Unterschied der chemischen Verschiebung der zwei
Protonen des Methylens 52 und auch des Methylens 54, die als ein Quadruplett erscheinen (Dublett des
Tripletts mit der 300 MHz Messung). In Wirklichkeit ist das Quadruplett ein Teil eines komplizierteren
Systems das durch Modelieren beobachtet worden ist. Die Messung der Relaxationszeit des CH&sub2; 54 und 55
ergibt zweimal im Durchschnitt die t1 Werte der anderen Protonen, was durch eine größere Bewegung der
Seitenendkette der Verbindung verursacht werden könnte.
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(Schlussendlich ist es beobachtet worden, auf der Basis der ¹H NMR Spektren von verschiedenen
Proben (in CDCl&sub3;), dass das Isohomohalichondrin B in zwei verschiedenen Konformationen bestehen kann.
Das scharfe Triplett bei δ 3,84 ppm verschwindet aus irgendwelchen nicht geklärten Ursachen, um ein
breites Signal zu ergeben, wobei das Triplett bei δ 2,74 ppm unverändert bleibt).
CHEMISCHE UMWANDLUNG
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Es ist interessant festzustellen, dass sich diese Verbindung, wenn man sie während mehreren
Wochen in Methanol in einem NMR Rohr zurücklässt, in eine andere Verbindung umwandelt mit einem
Acetalkohlenstoff wie LP1 oder LP3 (siehe weniger polare Halichondrine) oder einem
Hemiacetalkohlenstoff (in Position 53), Verbindung die besonders gekennzeichnet ist durch die
Verschiebung von H47 von 3,27 zu 3,13 ppm (in CD&sub3;OD) und das Verschwinden der drei Methylene 52, 54
und 55. Diese Beobachtung ist von R. Lake gemacht worden und teilweise reproduziert worden (zwei
Drittel der Probe, die dem Tageslicht bei Zimmertemperatur ausgesetzt worden sind, waren nach 12
Wochen umgewandelt). Verschiedene NOE Versuche sind durchgeführt worden, in CD&sub3;OD, um die
Umwandlung zu beweisen. Die Bestrahlung des neuen Signals bei δ 3,13 pp m (H47) führte zu der
Anreicherung von zwei Protonen bei δ 3,62 und 4,00 ppm und umgekehrt, welche, im Vergleich mit
denjenigen von Homohalichondrin B, wahrscheinlich H48 und H51 sind, die in einem 6-gliedrigen Ring
impliziert sind, welcher an einem endständigen 5-gliedrigen Ring sitzt. Ferner hat die Bestrahlung des H51
bei δ 4,00 ppm zu der Anreicherung von Protonen bei δ 3,90 und 2,20 ppm (H50 und CH&sub2; 52 in dieser
Reihenfolge) geführt. Es ist ein HMQC Versuch durchgeführt worden und gemäß den chemischen
Verschiebungen des Kohlenstoffs, die von Uemura für Homohalichondrin A gegeben worden sind, steht er
vollkommen im Einklang mit einer "Halichondrin-Homotyp-" Struktur (siehe TABELLE 2 unten).
TABELLE 2
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* Überlappen mit anderem Kohlenstoff
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Schlussendlich wurde eine Dünnschichtchromatographie durchgeführt, um die Polarität der
verschiedenen Verbindungen (Silika, Eluierungsmittel Methanol 5% in Dichlormethan) miteinander zu
vergleichen. Die eine zeigt klar zwei Flecken für die Probe welche das Isohomohalichondrin B und die
umgewandelte Verbindung enthält; diese letzte, welche dasselbe rf aufweist wie LP1, ist wahrscheinlich
LP1.
WENIGER POLARE HALICHONDRINE
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Diese Verbindungen sind, auf der Basis ihrer Retentionszeiten auf einer C-18
Vorbereitungskolonne für HPLC, weniger polar als das Isohomohalichondrin B. Sie haben alle nur eine
Hydroxylgruppe.
LP1, ML1 154.8 und ML1 173.13
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LP1 ist die am wenigsten polare Verbindung der Halichondrin Familie die je isoliert worden ist.
Um 12 mg dieser Verbindung sind aus einer Silikakolonne isoliert worden und um 3 mg sind aus der letzten
HPLC Stufe isoliert worden; sie ist vollkommen unstabil und ergibt Isohomohalichondrin B durch
chemische Umwandlung. Diese Umwandlung kann während des Reinigungsverfahrens vor sich gehen oder
auf der Matrize der Massenspektrometrie oder in der NMR Röhre innerhalb von 4 oder 5 Tagen. Das
FABMS Spektrum (NOBA + KCL) von geringer Auflösung zeigt zwei Hauptspitzen bei einem m/z Wert
von 1175,4 (MK&spplus;) und 1159,5 (MNa&spplus;) und führt zu der Masse von 1136. Das FABMS mit hoher Auflösung
für die am ergiebigsten Spitze ist, nach der Umwandlung, 1297,57984 (Masse + NOBA + K - OCH&sub3;,
berechnet für C&sub6;&sub8;H&sub9;&sub2;NO&sub2;&sub1;K, 1297,5755 ppm). Auf dieser Basis ist die Molekularformel C&sub6;&sub2;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub9;.
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Die Hauptunterschiede mit der vorhergehenden Verbindung bei δem ¹H NMR Versuch sind die
Abwesenheit der beiden Tripletts bei δ 2,71 und 3,86 ppm, CH&sub2; 54 und 55 in dieser Reihenfolge, aber die
Anwesenheit von zwei breiten Dubletts bei δ 3,1 und 3,96 ppm (1H jedes, H47 beziehungsweise H51) und
einem scharfen Singlett bei δ 3,23 ppm (3H, CH&sub3;&sub0; 53). Die chemische Verschiebung von H47 ist sehr
spezifisch, da seine Position die drei Haupttypen des Halichondrins unterscheidet. In der "Nor" Serie ist
H47 bei δ 3,35 ppm, während in den "Halichondrin" Serien es bei δ 3,56 ppm liegt. In unserem Fall spricht
3,1 ppm zu Gunsten einer Molekel vom "Homohalichondrin-Typ", die mit einem fünf-gliedrigen Ring
endet, welcher an einen sechs-gliedrigen Ring angeschlossen ist.
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Die HMQC und ¹³C NMR Versuche, die vor und nach der Umwandlung vorgenommen worden
sind, stellten den Drehpunkt beim Herausfinden der Struktur dar. Der Ketalkohlenstoff 53 bei einem 6
von 109,3 ppm verschwindet um das Keton bei δ 3,209 ppm zu ergeben. Die beiden Methylene 52 und 54
waren bei δ 45,2 beziehungsweise 35,5 ppm vor der Umwandlung, chemische Verschiebungen,
vergleichbar mit denjenigen von C13 und C15 (48,3 beziehungsweise 34,4 ppm), sind in einer ähnlichen
Weise impliziert in Bezug auf das Ketalkohlenstoff.
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Alle diese Daten erlaubten es die nachfolgende Struktur vorzuschlagen (nachstehende Figur). Die
¹H NMR und ¹³C NMR Tabellen werden am Ende des Berichtes gegeben.
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Verschiedene NOE Versuche sind mit LP1 durchgeführt worden und sie stimmen mit der
vorgeschlagenen Sesselkonformation für den endständigen Ring (ab C44) überein; dies hat man beobachten
können für Isohomohalichondrin B wo H 47, 48, 50 und 51 sich alle in der cis Position befinden. Die
Bestrahlung von H 47 führte zu einer Anreicherung der 4 Signale H 46, CH&sub3; 46, H 48 und H 51, während
die Bestrahlung des Signals bei δ 3,96 ppm (H 51) zu einer Anreicherung von bloß zwei Signalen bei δ 2,24
und 3,08 ppm (CH&sub3;52 beziehungsweise H47) führte. Schlussendlich hat die Bestrahlung des H50 (bei einem
δ Wert von 3,88 ppm) zu der Anreicherung des Signals bei δ 3,96 (H51), 2,20 ppm (H49) und des
Methoxyls bei δ 3,23 ppm geführt, was uns erlaubte die relative Konfiguration des Kohlenstoffs 53 (S) zu
bestimmen. Die Bestrahlung des Methoxyls, welche zu einer Anreicherung von H50 und 52 führte, bestätigt
die vorgeschlagene Konfiguration.
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Die Acetalhydrolyse und folglich die Bildung des Ketons konnten durch den Verlust des
Methoxyls erklärt werden, nach dem Angriff auf eine Base B, was zu einem Carbocation und zu einem
Öffnen des Ringes führte, dies gemäß dem nachfolgenden Schema. Dieselbe Reaktion erfolgt ebenfalls an
LP3. Die umgekehrte Reaktion, obschon viel langsamer, ist an einer Probe Isohomohalichondrin B in
Methanol durchgeführt worden.
ABSCHLIESSENDE BEMERKUNGEN
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Das Problem besteht nun darin, festzulegen welche Verbindung die natürliche Verbindung ist. Es
ist beobachtet worden, dass die Umwandlung von LP1 (oder LP3) in Isohomohalichondrin B
verhältnismäßig schnell vor sich geht, während die umgekehrte Reaktion viel langsamer ist, was eine viel
größere Stabilität von Isohomohalichondrin B impliziert. Jedoch neigt das Bestehen von LP3 dazu zu
beweisen, dass die umgekehrte Reaktion (iso B → LP1 + LP3) während des Vorganges der Extraktion oder
der Reinigung stattfindet, dies je nach den Bedingungen. Die wahrscheinliche Hypothese um diese
Beobachtungen zu erklären besteht darin, eine verhältnismäßig unstabile Verbindung mit einem Acetal-
oder einem Hemiacetal-Kohlenstoff in der Position 53 bei Beginn der Bildung des Isohomohalichondrins B
in Betracht zu ziehen, welche in geringen Mengen LP1 und LP3 zurück ergibt. Die Entdeckung einer
Verbindung mit einem Hemiacetal-Kohlenstoff in Position 53 ist noch nicht nachgewiesen worden, obschon
einige andere untergeordnete Verbindungen gefunden worden sind.
LP2; ML1 200.5
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Es sind nur 0,7 mg dieser Verbindung isoliert worden. Das beobachtete HRFABMS liegt bei einem
m/z Wert von 1137,6018 (MH&spplus;, berechnet: 1137,5998; Fehler 1,8 ppm) entsprechend einer elementaren
Zusammensetzung von CH&sub6;&sub2;H&sub8;&sub9;O&sub1;&sub9;. Bei der Prüfung des Proton NMR Spektrums dieser Verbindung ist
gefunden worden, dass es sehr ähnlich ist mit demjenigen von Isohomohalichondrin B, aber die
Anwesenheit eines scharfen Singletts bei δ 3,34 ppm (3 Protone) und die Verschiebung des Tripletts von
3,85 ppm bis zu 3,62 ppm sprechen zu Gunsten eines Methoxyls, das an das Methylen 55 gebunden ist,
anstatt an ein Hydroxyl im Falle von Isohomohalichondrin B. Es werden jedoch NOE Anreicherungen
beobachtet, nach einer Bestrahlung des Methylens in der Position 55, des endständigen Methoxyls und der
beiden Methylene 52 und 54, was die vorgeschlagene Sequenz unterstützt und was eine wahrscheinliche
Wasserstoffbindung zwischen dem Carbonyl und dem Hydroxyl in Position 50 impliziert, wie in der
untenstehenden Figur gezeigt wird.
ENDTEIL VON LP2
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Es ist ein 2D TOCSY Versuch durchgeführt worden, und die Daten stimmen voll mit der
vorgeschlagenen Struktur überein, besonders die Korrelationen zwischen den beiden Methylenen 54 und
55, den beiden Protonen des Methylens 52 und die in dem Spinsystem von H47 bis H50 implizierten
Korrelationen werden gut gelöst.
LP3 (ISOMER VON LP1); ML1 173.11
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Es sind nur 1,5 mg dieser Verbindung isoliert worden. Wie LP1 ist diese Verbindung seht unstabil
und unterliegt einer sehr schnellen Umwandlung, um Isohomohalichondrin B zu ergeben.
Isohomohalichondrin B ist identifiziert worden nach der Prüfung der ¹H NMR Versuchsergebnisse in
CDCl&sub3;, welche besonders gekennzeichnet sind durch die beiden scharfen Tripletts bei δ 2,74 und 3,85 ppm
(CH&sub2; 54 beziehungsweise 55). Das ¹H NMR von LP3, außer einer unterschiedlichen chemischen
Verschiebung für das Methoxyl an C 53 bei δ 3,40 ppm und möglicherweise des Protons H51 bei δ 3,91
ppm (3,23 ppm und 3,96 ppm in dieser Reihenfolge bei LP1), zeigt keinen Unterschied mit dem Spektrum
des LP1 an. Diese Daten implizieren die Konfiguration R für das Kohlenstoff 53; dementsprechend ist LP3
das Enantiomer von LP1.
ANDERE WENIGER POLARE HALICHONDRINE
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Zwei, möglicherweise drei, andere weniger polare Verbindungen sind isoliert worden. Das ¹H
NMR für die Fraktion ML1 173.7, welche aus der Kolonne C18 eluiert worden ist, genau nach dem
Isohomohalichondrin B (das Chromatogramm zeigt 2 Spitzen), zeigt ein Signal bei δ 3,08 ppm wie LP1
(wahrscheinlich H47) jedoch kein Methoxyl. Darüber hinaus sieht der Methylbereich stärker nach
Homohalichondrin B als nach Isohomohalichondrin B aus, was zu Gunsten eines Halichondrins vom
"Homotyp" spricht, mit möglicherweise einem Hydroxyl in Position 53.
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Das ¹H NMR der Fraktion ML1 173.8 (welche, auf der Basis des Chromatogramms, LP1, iso B
und 2 andere Verbindungen enthält) zeigt 2 Signale in der Nachbarschaft von 3,1 ppm, was angibt, dass
eines dieser Signale zu einer Verbindung gehört die eine andere ist als LP1 (wobei 3,09 ppm wahrscheinlich
H47 von LP1 ist). Ein ähnliches Signal, bei δ 3,11 ppm, wird erneut in dem NMR Spektrum der Proben
ML1 196.7 und RT 1 158.8 gefunden, welche gar kein Methoxyl anzeigen.
POLARE HALICHONDRINE
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Diese Verbindungen sind polarer als Halichondrin B, und zeigen kürzere Verweilzeiten auf einer
HPLC Kolonne mit dem Präparat C-18. Zwei untergeordnete Verbindungen sind bis jetzt isoliert worden
(die untergeordneten Verbindungen 1 und 2), beide sind vollständig beschrieben worden, obschon einige
Ungewissheiten bestehen bleiben.
UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 1, ML1 138.2
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Diese Verbindung hat eine ähnliche Polarität wie Halichondrin B (das Chromatogramm zeigt
üblicherweise eine sehr schmale Spitze vor dem Halichondrin B); um 7 mg sind gereinigt und isoliert
worden. Das beobachtete HRFABMS liegt bei einem Wert m/z von 1163,5553 (MK&spplus;, berechnet:
1163,5550; Fehler ~0.3 ppm) entsprechend einer elementaren Zusammensetzung von C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub8;O&sub1;&sub9; (ein
zusätzliches CH&sub2; im Vergleich zu Halichondrin B).
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Eine sorgfältige Prüfung des HMQC Spektrums unterstreicht die Ähnlichkeit mit einem der
Halichondrine B, außer einigen kleinen Unterschieden (siehe TABELLE 3).
TABELLE 3
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Außer diesen Unterschieden sind alle anderen Korrelationen die gleichen wie bei Halichondrin B.
Das ¹³C NMR Spektrum zeigt 61 Kohlenstoffe an und ist erneut sehr nahe bei Halichondrin B, außer einem
zusätzlichen Kohlenstoff von dem man annimmt, dass es ein CH&sub2; ist und eine chemische Verschiebung von
31,1 ppm besitzt.
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Diese Daten sprechen zu Gunsten eines endständigen 5-gliedrigen Ringes wie er bei Halichondrin
B beobachtet worden ist, gefolgt von einer Seitenkette, die ein zusätzliches CH&sub2; enthalten könnte. Weil das
COSY Spektrum eine Korrelation zwischen 3,45 und 3,70 ppm (H55 beziehungsweise H54) zeigt, können
wir annehmen, dass die Seitenkette mit -CHOH-CH&sub2;OH endet. Es bleiben drei verschiedene Möglichkeiten
bezüglich der Position für die zusätzlichen Methylene. Die Prüfung von Querschnitten aus den 2D TOCSY
Spektren, die mit zwei verschiedenen Mischungszeiten durchgeführt worden sind, entfernten die
Zweideutigkeit. Nimmt man die Spur bei δ 3,70 ppm (welche unzweideutig dem H 54 zuzuordnen ist), aus
dem "20 ms 2D TOCSY", dann ersieht man drei Korrelationen bei δ 3,45 (Triplett) und 3,63 ppm (CH&sub2; 55)
und bei δ 1,6 ppm (breites Signal, CH&sub2; 53). Nimmt man dieselbe Spur aus dem "100 ms 2D TOCSY", dann
werden zusätzliche Korrelationen beobachtet bei δ 1,4 ppm (breites Signal, CH&sub2; 52) und bei δ 3,85 ppm
(Dublett, CH 51) und es wird angegeben, dass diese zwei Signale weiter entfernt von dem Originalsignal
angeordnet waren. Schlussendlich wurde aus der Spur δ 4,05 ppm (CH 50) eine Korrelation beobachtet bei
δ 3,85 ppm (Dublett, CH 51), während die Korrelationen bei δ 1,4 und 1,6 ppm sehr schwach waren, was
die nachfolgende Sequenz -CHO(50)-CHOH(51)-CH2(52)- unterstützt. Eine bedeutende Kopplungskonstante
(Dublett, J = 11,1 Hz) des Signals bei δ 3,85 ppm steht in Übereinstimmung mit diesem Vorschlag
(andernfalls, wenn dieses Methin zwischen den zwei Methylenen angeordnet wäre, hätten wir ein Triplett
erwartet). Ein HMBC Versuch (JNXH = 4,5 Hz) ist durchgeführt worden, aber er erlaubte es nicht die
vorgeschlagene Seitenkette zu bestätigen oder zu verneinen.
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Die vorgeschlagene endständige Hälfte wird nachfolgend gezeigt.
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(Um die Chiralität des Methinkohlenstoffs zu bestimmen sind einige NOE Differenzspektren durchgeführt
worden.).
UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 2, ML1 200.4
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Diese Verbindung ist die am polarsten unter den bisher isolierten Verbindungen. Nur 0,9 mg sind
isoliert worden. Eine FAB Massenspektrometrie mit geringer Auflösung ist durchgeführt worden und sie
ergab zwei Spitzen bei Werten von mlz 1097 und 1135 (MH&spplus; beziehungsweise MK&spplus;). Das beobachtete
HRFABMS liegt bei einem Wert m/z von 1097,5690 (MH&spplus;, berechnet: 1097,5685, Fehler 0,4 ppm)
entsprechend einer elementaren Zusammensetzung von C&sub5;&sub9;H&sub8;&sub5;O&sub1;&sub9;
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Das ¹H NMR Spektrum zeigt einige sehr ungewöhnliche Merkmale im Vergleich zu Halichondrin
B oder der untergeordneten Verbindung 1. In dem Methylbereich sind nur drei Dubletten um etwa 1 ppm
anwesend, ein viertes Methyl scheint ein Singlett bei δ 1,35 ppm zu sein, was die wahrscheinliche
Anwesenheit eines ein Sauerstoff tragenden Kohlenstoffs anzeigt, anstatt des gewöhnlich auf der Position
vorgefundenen Methins. Zwei Dubletten (bei δ 2,86 ppm, J = 11,2 Hz und δ 3,73 ppm, J = 4,9 Hz) scheint
auch kennzeichnend für diese Verbindung zu sein.
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Die sorgfältige Prüfung eines 2D TOCSY (durchgeführt mit einer 100 ms Mischzeit) und ein
HMQC Versuch erlaubten es uns den Hauptteil der Verbindung herauszufinden, unverändert bis zu
Kohlenstoff 44, verglichen mit dem Halichondrinskelett (außer einer kleinen Verschiebung für H 40 bei δ
4,18 ppm, üblicherweise 4,0 ppm). Jedoch zeigt der HMQC Versuch sechs neue Kohlenstoffe in dem
Bereich des "Kohlenstoff tragenden Sauerstoffs" und vier (einschließlich des neuen Methyls) in dem
Methylenbereich. Unter diesen ist ein Methylen besonders ungeschützt (bei δ 54,2 ppm) in Anbetracht der
chemischen Verschiebung der 2 Protone (1,86 und 2,11 ppm), was nahelegt dass es nahe bei einem
Ketalkohlenstoff liegt mit einem zusätzlichen b Effekt eines Sauerstoffatoms; die 2 Protone die in dem
sekundären Methylen impliziert sind (bei δ 37 ppm) zeigen eine ganz verschiedene chemische
Verschiebung (1,52 und 2,86 ppm), das Proton bei δ 2,86 ppm könnte nahe bei dem Sauerstoffatom
angesiedelt sein. Gemäß den chemischen Verschiebungen von Protonen und Kohlenstoffen (und verglichen
mit denjenigen von Halichondrin B und der untergeordneten Verbindung 1) und auf der Basis der Resultate
aus dem 2D TOCSY Versuch, können wir den folgenden Bruchteil vorschlagen; HOCH&sub2;-C(52)HOH-CHOH-
CH&sub2;-C(49)HO-CHO-CHr. Zusätzlich nehmen wir an, dass das Methin 49 zu einem 5-gliedrigen Ring gehört
(gemäß der chemischen Verschiebung von C49 bei 81,7 ppm, fast identisch mit demjenigen von
Halichondrin B oder der untergeordneten Verbindung 1).
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Ein HMBC Versuch ist durchgeführt worden (JNXH = 6 Hz) und ergab die nachfolgenden sehr
nützlichen Informationen. An erster Stelle ergab er Korrelationen zwischen dem Methyl bei δ 1,35 ppm und
3 Kohlenstoffen bei δ 36,8, 52,4 und 80,2 ppm (C 47, 45 beziehungsweise 46) zweitens 2 zusätzliche
Korrelationen mit dem Kohlenstoff bei δ 80,2 ppm und Protonen bei δ 4,28 (H 48) und 1,88 (H49) ppm.
Diese Korrelationen werden nachfolgend gezeigt.
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NOE Versuche (oben gezeigt) sind durchgeführt worden und stimmen vollkommen überein mit
einer endständigen Hälfte, die aufgebaut ist aus einem 5-gliedrigen Ring der verbunden ist mit einem 6-
gliedrigen Ring (H48 und H49 sind in cis Position und implizieren eine Bootkonformation für den 6-
gliedrigen Ring). Die Anreicherungen sind besonders stark zwischen H48 und beiden Protonen aus CH&sub2; 47,
sowie H48 und H49, während dieselben zwischen einem Proton aus dem Methylen 47 (bei δ 15 ppm) und
H49 weniger intensiv sind.
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Die ungewöhnliche Anordnung neigt dazu, ein Proton des CH&sub2; 47 und das von dem Kohlenstoff 44
getragene Sauerstoffatom näher zu ziehen, und dies könnte den sehr ungeschützten Wert (bei δ 2,86 ppm)
erklären.
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Alle die vorangegangenen Informationen erlauben es uns die folgende Struktur für die
untergeordnete Verbindung 2 vorzuschlagen.
ANDERE HALICHONDRINE
NORHALICHONDRIN B, ML1 201.4
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Nur 0,6 mg dieser Verbindung sind isoliert worden. Die Polarität dieser Verbindung ist nicht klar,
obschon sie ein klein wenig polarer erscheint als Isohomohalichondrin B auf der Basis einer TLC auf Silika.
Das beobachtete HRFABMS liegt bei m/z 1095,5574 (MH&spplus;, berechnet: 1095,5529; Fehler 4,1 ppm)
entsprechend einer elementaren Zusammensetzung von C&sub5;&sub9;H&sub8;&sub3;O&sub1;&sub9;
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¹H NMR, HMQC, 2D TOCSY und NOE Versuche sind an dieser Probe vorgenommen worden.
Alle diese Versuche erlauben es uns den endständigen Teil der Molekel endgültig zu bestimmen. Dieser
wird gebildet aus einem 6-gliedrigen Ring, wie Isohomohalichondrin B, mit einem CH&sub2;-COOH Endteil, der
an der Position 51 hängt (das Methylen 52 liegt bei δ 2,60/2,89 ppm). Die chemischen Verschiebungen der
Protone, die zu diesem letzten Ring gehören, zeigen einige sehr geringe Unterschiede gegenüber iso B:
H47, 48, 50, 51 und CH&sub2; 49 haben ein δ bei 3,37, 3,81, 3,60, 3,80 und 1,87/2,18 ppm in dieser Reihenfolge
(3,25, 3,75, 3,52 3,82, und 1,84/2,13 ppm bei Isohomohalichondrin B). Es ist interessant zu bemerken, dass
die 2 Protonen des Methylens 52 nicht äquivalent sind, wahrscheinlich auf Grund einer Wasserstoffbindung
zwischen dem Hydroxyl in Position 50 und dem CO der Carboxylsäure. Diese Unäquivalenz verschwindet
wenn Methanol als das Lösungsmittel benutzt wird (CH&sub2; 52 bei δ 2,47 ppm, siehe Uemura's Artikel). NOE
Versuche unterstützen den vorgeschlagenen endständigen Teil; die Anreicherung an H47 nach der
Bestrahlung von H51 + H48 und umgekehrt, die Anreicherung an H51 und H52' nach der Bestrahlung von
H52 bei δ 2,61 ppm, die Anreicherung an H51 und H49 nach der Bestrahlung von H50.
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Ein IR Spektrum ist durchgeführt worden und hat den Hinweis geliefert auf die Anwesenheit von
Hydroxylen (3470 cm&supmin;¹),einem Lacton größer als ein 5-gliedriger Ring (1735 cm&supmin;¹) und einem Carboxyl
(Ansatz an der vorherigen Spitze um 1700 cm&supmin;¹). Der Endteil von Norhalichondrin B wird in der
nachfolgenden Figur gezeigt.
ENDTEIL VON NORHALICHONDRIN B
ML1 206.5 und 206.6 (0,5 beziehungsweise 0,6 mg)
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Diese Proben, welche das Resultat sind aus dem Sammeln der Fraktionen die nach dem
Homohalichondrin B kommen und vor dem Isohomohalichondrin B bei einer HPLC anfallen, enthalten
neue Verbindungen. Wir können an dem ¹H NMR der ersten Verbindung ein ungewöhnliches Proton
beobachten bei δ 5,75 ppm, welches an ein Acetal- oder an ein Hemiacetalkohlenstoff gebunden sein könnte
(siehe Ref. Joc 1990, 55, 863-870). Zwei neue Protonen bei δ 5,9 und 6,4 ppm erschienen in dem ¹H NMR
der zweiten Probe; eines ist wahrscheinlich an ein Acetalkohlenstoff gebunden da wir ein Methoxyl bei δ
3,42 ppm beobachten können.
RT1 158,2 und 158,6
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Die erste Probe enthält wahrscheinlich ein wenig polares Halichondrin (stärker polar als die
untergeordnete Verbindung 2), die zweite enthält etwas intermediäres polares Halichondrin (zwischen
Homohalichondrin B und Isohomohalichondrin B).
BIOLOGISCHE STUDIEN
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Die meisten Verbindungen sind dem Bioversuch gegen das Tumor P388 unterzogen worden. Die
Tätigkeit gegen die P388 Zellenlinie wird unten wiedergegeben.
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Die Resultate des Bioversuches gegen das Tumor P388 streicht die hohe Wirksamkeit der meisten
der zu der Serie B gehörenden Verbindungen heraus.
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Isohomohalichondrin B zeigte eine starke zytotoxische Wirksamkeit gegen die Zellen der
Mäuseleukämie (P388 Zellenlinie), sie übersteigt diejenige von Halichondrin B und Homohalichondrin B
(IC&sub5;&sub0; : 0.8, 6,7 und 6,4 ng/ML in dieser Reihenfolge).
TABELLE 1. ¹H NMR DATEN VON LP1 (ML1 154.3)
UND ISOHOMOHALICHONDRIN B (ML1 43.3),
(300 MHz in CDCl&sub3;, 5 in ppm).
(Folge) TABELLE 1. ¹H NMR DATEN VON LP1 (ML1 154.8)
UND ISOHOMOHALICHONDRIN B (ML1 43.3),
(300 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
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* Zuordnungen sind versuchsweise
TABELLE 2. ¹³C NMR DATEN VON LP1 (ML1 154.8)
UND ISOHOMOHALICHONDRIN B (ML1 43.3),
(75 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
(Folge) TABELLE 1.¹H NMR DATEN VON LP2 (ML1 200.5)
UND ISOHOMOHALICHONDRIN B (ML1 43.3),
(300 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
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* Zuordnungen sind versuchsweise
TABELLE 1. ¹H NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 1 (ML1 138.2),
(300 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
(Folge) TABELLE 1. ¹H NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 1 (ML1 138.2).
(300 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
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* Zuordnungen sind versuchsweise
TABELLE 2. ¹³C NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 1 (ML1 138.2)
(75 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
(Folge) TABELLE 2. ¹³C NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 1 (ML1 138.2)
(75 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
TABELLE 1. ¹H NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 2 (ML1 200.5),
(300 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
(Folge) TABELLE 1. ¹H NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 2 (ML1 200.5),
(300 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
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*Zuordnungen sind versuchsweise
TABELLE 2. ¹³C NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 2 (ML1 200.5),
(75 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
(Folge) TABELLE 2.¹³C NMR DATEN VON HALICHONDRIN B (ML1 135.5)
UND UNTERGEORDNETE VERBINDUNG 2 (ML1 200.5),
(75 MHz in CDCl&sub3;, δ in ppm).
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Chemische Verschiebungen aus HMQC und HMBC Versuchen