Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung von hochreinem Cholesterin aus Verunreinigungen
enthaltendem rohem Cholesterin durch selektive Reduktion
dieser Verunreinigungen zu Cholesterin.
Stand der Technik
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Cholesterin, das im Bereich der Medizin, Kosmetik und
Tierfutter in großem Umfang verwendet wird, wird aus
Wolifett, Fischölen oder Gehirnen höherer Tiere und vor allem
aus Wollfett hergestellt.
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Bekannte Verfahren zur Herstellung von Cholesterin aus
Wollfett umfassen eine auf einem Unterschied in der
Löslichkeit basierenden Lösungsmittelextraktion, ein
Adduktverfahren, das eine niedrige Löslichkeit eines Addukts
von Cholesterin mit einem Metall verwendet,
Säulenchromatographie usw. Da durch diese Verfahren, wenn
sie einzeln angewendet werden, jedoch das Herstellen von
vollständig gereinigten Erzeugnissen nicht gelingt, wird
derzeit das Cholesterin, das durch jedes dieser Verfahren
hergestellt wird, konzentriert und schließlich zur
Verbesserung der Reinheit rekristallisiert.
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Die Reinheit dieses Cholesterins wird in der japanischen
Pharmacopoeia und in der U.S. NF. als äquivalent zu einem
Schmelzpunkt von 147 bis 150ºC angegeben. Gewerblich
erhältliche Cholesterine (24 Proben) haben eine Reinheit im
Bereich von 90,7 bis 96,3 % wie durch ein GLC-Assay bestimmt
ist.
Frantz et al. (Progr. biochem. Pharmacol., Bd. 5 (1969), S.
24-34) beschreiben die Synthese von Cholesterin aus
Desmosterin und seine Verwendung.
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In den letzten Jahren wurden im medizinischen Bereich aktiv
Forschungsarbeiten über Systeme der Zuführung von
Arzneimitteln durchgeführt. Derzeit werden Untersuchungen
unter Verwendung von Liposomen, die eines dieser Systeme
darstellen, mit einem Arzneimittel, das mit einer Membran,
die sich aus aus Phospholipid und Cholesterin zusammensetzt,
umhüllt ist, durchgeführt. In diesem Zusammenhang ist die
Reinheit von Cholesterin, das als Ausgangsmaterial nützlich
ist, gefragt. Jetzt besteht ein erhöhter Bedarf an
Cholesterin mit höherer Reinheit. Gleichermaßen wie bei
Cholesterin zur Verwendung als Materialien für die Synthese
von Pharmazeutika oder als Reagenz für die biochemische
Forschung, werden die gegenwärtig akzeptablen
Reinheitsgehalte als nicht zufriedenstellend angesehen.
Folglich besteht ein immer größer werdendes starkes Bedürfnis
für Cholesterin mit hoher Reinheit.
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Zur Verbesserung der Reinheit von Cholesterin durch
herkömmliche Verfahren wird die wiederholte Rekristallisation
durchgeführt. Auf diese Weise können die Reinheit und
Ausbeute jedoch nicht gleichzeitig verbessert werden. Wenn
zum Beispiel die Rekristallisation unter Verwendung eines
95,5 % reinen, geweblich erhältlichen Cholesterins als
Ausgangscholesterin dreimal wiederholt wird, wird die
Reinheit auf 98,8 % erhöht, aber die Ausbeute wird ziemlich
verringert, nämlich auf 42 %. Dies ist unpraktikabel.
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Im Hinblick auf einen solchen Stand der Technik ist die
Aufgabe dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von
Cholesterin mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute zur
Verfügung zu stellen.
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Um die obige Aufgabe zu erfüllen, haben die Erfinder dieser
Erfindung gewerblich erhältliche Cholesterine (hiernach
"gewerbliches Cholesterin") durch GLC untersucht und
festgestellt, daß sie eine Reinheit von 90,7 bis 96,3 %
besaßen. Es wurde auch festgestellt, daß die gewerblichen
Cholesterine 5,1 bis 2,6 % Desmosterin als
Hauptverunreinigung, das Doppelbindungen in der 5-Position
des Sterolskeletts und in der 24-Position der Seitenkette
aufweist, enthielten. Es wurde bestätigt, daß Desmosterin
nicht entfernt werden kann, außer nach und nach durch
Rekristallisation.
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Die Erfinder führten weitere, ausführliche Untersuchungen
durch, wobei Aufmerksamkeit auf Desmosterin als
Hauptverunreinigung gerichtet wurde, und stellten fest, daß
durch Reduktion der Doppelbindung in der Seitenkette von
Desmosterin dieses in Cholesterin umgewandelt wird. Genauer
gesagt, stellten die Erfinder nicht nur fest, daß Desmosterin
in Cholesterin umgewandelt werden kann, sondern daß
Cholesterin auch mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute durch
ein selektives Reduktionsverfahren erhalten werden kann,
wobei dies im wesentlichen frei ist vom Verlust von
Cholesterin (Verlust durch die Reduktion). Diese Erfindung
wurde auf der Grundlage dieser neuen Festellungen ausgeführt.
Offenbarung der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung von
hochreinem Cholesterin zur Verfügung gestellt, worin das
Verfahren selektives Reduzieren der in rohem Cholesterin
enthaltenden Verunreinigungen umfaßt, wobei diese Reduktion
unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß die Menge
des hergestellten Dihydrocholesterins auf 0,5 % oder weniger
und die des Restdesmosterols auf 0,3 % oder weniger gebracht
wird, worin die Reduktion durch katalytische Hydrierung bei
einer Temperatur innerhalb eines Bereiches von der
niedrigesten Temperatur, bei der die katalytische Aktivität
entfaltet wird, bis zu der Temperatur, bei der
Dihydrocholesterin nicht hergestellt wird, durchgeführt wird.
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Herkömmliche Hydrierungskatalysatoren können zur Reduktion in
dieser Erfindung verwendet werden. Beispiele solcher
Katalysatoren sind Nickel, Platin, Palladium, Kupfer und
ähnliche Metallkatalysatoren, Raney-Legierungskatalysatoren,
Kupferchromoxid und ähnliche metallische Oxidkatalysatoren
usw.
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Gewöhnlich wird die Reduktionsreaktion dieser Erfindung unter
Verwendung von Ausgangscholesterin, das in einem
Lösungsmittel gelöst ist, durchgeführt. Beispiele nützlicher
Lösungsmittel sind Lösungsmittel, die der Hydrierung
widerstehen, wie Methylalkohol, Ethylalkohol, Propylalkohol,
Isopropylalkohol und ähnliche Alkohole, Hexan, Heptan,
Cyclohexan und ähnliche Kohlenwasserstoffe und Mischungen aus
diesen Lösungsmitteln usw.
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Die Reaktionstemperatur hängt von der Art und Menge des
verwendeten Katalysators, der Art und Konzentration des
verwendeten Lösungsmittels, der Reaktionszeit, des
Wasserstoffdrucks und anderen Faktoren ab. Die
Reaktionstemperatur wird über den Bereich von der niedrigsten
Temperatur, bei der die katalytische Aktivität entfaltet
wird, bis zu der Temperatur, bei der Dihydrocholesterin nicht
hergestellt wird, durch Zugabe von Wasserstoff zu der
Doppelbindung im Sterolskelett ausgewählt. Wenn ein Raney-
Nickelkatalysator verwendet wird, ist die geeignete
Reaktionstemperatur ungefähr 25 bis ungefähr 100ºC, bevorzugt
ungefähr 30 bis ungefähr 60ºC.
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Der Wasserstoffdruck hängt ebenfalls von der
Reaktionstemperatur, der Art und Menge des verwendeten
Katalysators, der Art und Konzentration des verwendeten
Lösungsmittels und anderen Faktoren ab, aber ist gewöhnlich
im Bereich von ungefähr 0,5 bis ungefähr 10 Kgf/cm² Gauge.
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In der Praxis der Erfindung können die Bedingungen für die
selektive Reduktionsreaktion gemäß dem Folgenden festgelegt
werden. Bei übermäßig abgeschwächten Hydrierungsbedingungen
bleibt Desmosterin in einem höheren Verhältnis zurück. Bei
übermäßig verstärkten Hydrierungsbedingungen wird Desmosterin
vollständig hydriert und die Doppelbindung im Sterolskelett
wird auch hydriert, jedoch zur Herstellung von
Dihydrocholesterin als Nebenprodukt. Das als Nebenprodukt so
hergestellte Dihydrocholesterin kann jedoch leicht durch
Rekristallisation entfernt werden und stellt kein besonderes
Problem für die Reinheit des erhaltenen Cholesterins dar. Es
ist notwendig, daß die obengenannten Reduktionsbedingungen
festgelegt werden, so daß die Menge des Dihydrocholesterins
auf 0,5 % oder weniger und die des Restdesmosterins auf 0,3 %
oder weniger gebracht wird.
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Es ist aufgrund seines hohen Schmelzpunktes schwierig, das
von der Reduktion resultierende Cholesterin in der Lösung
direkt zu trocknen. Gewöhnlich wird Cholesterin durch
Rekristallisation aus der Lösung ausgefällt und filtriert.
Anschließend wird der durch das Filtrieren erhaltene
Naßfilterkuchen getrocknet. Folglich ist es in der Praxis
der Erfindung bevorzugt, die Rekristallisation zur Reinigung
des gewünschten Cholesterins nach der Reduktion
durchzuführen, gefolgt von Trocknen. Dies ist ein
rationelles Verfahren.
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Das als Verunreinigung in gewöhnlich erhältlichem Cholesterin
vorhandene Desmosterin ist nur durch die Gegenwart der
Doppelbindung in der 24-Position der Seitenkette strukturell
unterschiedlich zu Cholesterin. Erfindungsgemäß kann
aufgrund von selektiver Reduktion Desmosterin jedoch durch
Sättigung der Doppelbindung der Seitenkette zu Cholesterin
umgewandelt werden, wobei im Vergleich zum
Ausgangscholesterin der Cholesteringehalt auf 2 bis 5 %
erhöht wird. Da es schwierig ist, Desmosterin auf
herkömmliche Weise durch Rekristallisation vollständig zu
entfernen, wurde es erfindungsgemäß durch Reduktion in
Cholesterin umgewandelt, so daß Lathosterin und andere
Verunreinigungen nach der selektiven Reduktion nur durch
Rekristallisation leicht entfernt werden können, wobei
Cholesterin mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute erhalten
werden kann.
Beste Ausführungsform der Erfindung
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Zur Verdeutlichung der Erfindung werden unten Beispiele
angegeben. Die Reinheit der in den Beispielen hergestellten
Produkte wurde durch Gasflüssigchromatographie (GLC) unter
Verwendung einer Vorrichtung, die unten gezeigt ist, gemessen
und wurde als Gebiet (%) berechnet. Die angegebenen Prozente
beziehen durch die Beschreibung hinweg auf das Gleiche.
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Vorrichtung: GC-8A (Shimadzu Corp.), Nachweisinstrument: FID
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Säule : Chemisch-gebundene Säule (GASUKURO KOGYO INC., JAPAN)
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Flüssigphase: SE52 gebunden, 0,3 um-50 m-0,25 mm ID
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Temperaturbedingungen: Säulentemperatur: 300ºC,
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Injektionstemperatur: 330ºC
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Temperatur des Nachweisinstruments: 330ºC
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Trägergas: Stickstoffgas, 1 ml/min, Spiritusverhältnis: 61:1
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Probe: 0,1 % Heptanlösung, injiziert 1 ul
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Die Reduktionstemperatur wurde unter Verwendung einer 500 ml
Autoklave des Vertikaltyps, die mit einem bei 100 upm
betriebenem elektromagnetischen Rührer (Nitto Koatsu Co.,
Ltd.) ausgestattet war, durchgeführt. Der Druck wurde als
Überdruck gemessen. Die folgenden Abkürzungen wurden zum
Anzeigen der Ergebnisse verwendet.
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Cholesterin CHOL
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Dihydrocholesterin DHC
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Desmosterin DSMO
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Lathosterin LATO
Beispiel 1
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Ein Reaktor wurde mit einer Ausgangslösung aus 20 g
gewerblichem Cholesterin in 400 ml normalem Heptan und 0,5 g
Raney-Nickel als Katalysator (NDHT 90, Kawaken Fine Chemical
Co., Ltd., berechnet als Nickel) geladen. Wasserstoffgas
wurde in den Reaktor geleitet, so daß ein anfänglicher Druck
von 1 kg/cm² erreicht wurde. Die Reaktion wurde bei 50ºC für
1 Stunde durchgeführt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen
war, wurde der Katalysator abfiltriert. Ein Teil des Restes
wurde gesammelt und durch GLC untersucht. Die
Zusammensetzungen von Cholesterin vor und nach der Reaktion
sind wie folgt:
Beispiel 2
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Ein Reaktor wurde mit einer Ausgangslösung aus 20 g
gewerblichem Cholesterin in 400 ml Isopropylalkohol und 0,5 g
Raney-Nickel als Katalysator (NDHT 90, Kawaken Fine Chemical
Co., Ltd., berechnet als Nickel) geladen. Wasserstoffgas
wurde in den Reaktor geleitet, so daß ein anfänglicher Druck
von 1 kg/cm² erreicht wurde. Die Reaktion wurde bei 30ºC für
1 Stunde durchgeführt. Nachdem die Reaktion abgeschlossen
war, wurde der Katalysator abfiltriert. Ein Teil des Restes
wurde gesammelt und durch GLC untersucht. Die
Zusammensetzungen von Cholesterin vor und nach der Reaktion
sind wie folgt:
Beispiel 3
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Ein Reaktor wurde mit einer Ausgangslösung aus 60 g
gewerblichem Cholesterin in einer Lösungsmischung aus 282 ml
normalem Heptan und 18 ml Methylalkohol und 1 g Raney-Nickel
als Katalysator (NDHT 90, Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.,
berechnet als Nickel) geladen. Wasserstoffgas wurde in den
Reaktor auf einen anfänglichen Druck von 1 kg/cm² geleitet.
Die Reaktion wurde bei 60ºC für 5 Stunden durchgeführt.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde der Katalysator
abfiltriert. Ein Teil des Restes wurde gesammelt und durch
GLC untersucht. Die Zusammensetzungen von Cholesterin vor
und nach der Reaktion sind wie folgt:
Beispiel 4
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Die Cholesterinproben wurden einmal aus den Lösungen, die
durch die Reaktion in Beispielen 1, 2 und 3 erhalten wurden,
mit den untenstehenden Ergebnissen kristallisiert. Die
Ausbeuten der so kristallisierten Cholesterinproben sind auch
gezeigt. Bei den Cholesterinproben wurden
Bestätigungsuntersuchungen bezüglich anderer Eigenschaften
als der Reinheit, wie Schmelzpunkt, spezifische Rotation,
Löslichkeit usw. durchgeführt. Die Testergebnisse zeigen,
daß jede Cholesterinprobe den jeweiligen Bereichen, die in
der japanischen Pharmacopoiea und den NF-Standards, usw.
spezifiziert sind, entsprach.
Vergleichsbeispiel 1
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Die Rekristallisation wurde dreimal unter Verwendung von
gewerblichem Cholesterin durchgeführt. Die Veränderung der
Zusammensetzung und die Aggregatausbeute nach jeder
Rekristallisation sind unten gezeigt.
Möglichkeit der industriellen Verwendung
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Erfindungsgemäß kann Cholesterin durch ein einfaches
Reduktionsverfahren mit hoher Reinheit von mindestens 98 %
und durch weitere Rekristallisation mit einer Reinheit von
mindestens 99 % und einer Ausbeute von mindestens 85 %
erhalten werden. Dieses Ergebnis kann durch einfache
Rekristallisation von gewerblichem Cholesterin im Fall von
herkömmlichen Verfahren nicht erreicht werden.
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Das Cholesterin mit hoher Reinheit, das durch das Verfahren
der Erfindung erhalten wird, erfüllt die Erfordernisse
medizinischer und anderer Bereiche und ist als
Ausgangsmaterial für die Synthese von Arzneimitteln und als
Reagenz für die biochemische Forschung nützlich.