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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Herstellung einer wäßrigen Polyacrylamidgelplatte zur Verwendung bei der
Elektrophorese, und mehr im einzelnen ein Verfahren zum Herstellen einer
großen Menge von wäßrigen Polyacrylamidgelplatten mit homogener und
hoher Qualität in einem einfachen Herstellungsverfahren.
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Wäßrige Polyacrylamidgels wurden in weitem Umfang zur
Analyse durch Elektrophorese von Komponenten in vivo mit hohem
Molekulargewicht verwendet, beispielsweise Protein, Nukleinsäure und dergleichen.
Herkömmlicherweise werden wäßrige Polyacrylamidgels als Medium für die
Elektrophorese benutzt. Sie werden aus einer gelbildenden Lösung in
einen Gelträger in Form eines Zylinders, einer Platte oder Folie oder
dergleichen aufgegeben oder auf diesen als Beschichtung aufgetragen; auf
diesem wird die Lösung durch Vernetzung polymerisiert, um ein wäßriges
Gel zu bilden. Üblicherweise werden plattenförmige Gels (Gelplatten),
die verhältnismäßig einfach herzustellen sind, einfach zu handhaben sind
und zur Analyse der Mehrzahl von Proben unter denselben Bedingungen
geeignet sind, am meisten verwendet.
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Wenn man eine Gelplatte herstellt, insbesondere im Fall
einer Gelplatte, die einen Konzentrationsgradienten aufweist, wird die
gelbildende Lösung üblicherweise und in den meisten Fällen in jeden Satz
eines Gelträgers separat und individuell aufgegeben. Gemäß diesem
Verfahren ist es jedoch schwierig, reproduzierbar eine Vielzahl von
Gelplatten herzustellen, die ein spezifizierte, analytische Leistung
aufweisen, wegen des Problems in der Reproduzierbarkeit bei der
wiederholten Aufgabe. Es nimmt außerdem eine lange Zeit in Anspruch und erfordert
komplizierte Schritte, um eine große Menge solcher Gelplatten
herzustellen. Um diese Probleme zu vermeiden, ist es notwendig, eine teure
Einheit zum Aufgeben der Lösung einzuführen und eine spezielle Mischmethode
für die Herstellung der gelbildenden Lösungen zu verwenden. Somit wird
die Methode nicht notwendigerweise als vorteilhaft für die industrielle
Produktion angesehen.
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Andererseits kann das Chargenverfahren, das einen
gelbildenden Behälter benutzt, in den eine Vielzahl von Gelträgern Seite an Seite
eingesetzt werden und die gelbildende Lösung in diesen hinein aufgegeben
wird, um zu gelieren, eine Vielzahl von Gelplatten, die dieselbe
Qualität aufweisen, durch eine einfachere Vorgehensweise erbringen,
verglichen mit der vorher erwähnten, individuellen, wiederholten
Aufgabemethode.
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Ein solches Chargenverfahren macht es jedoch erforderlich,
eine Wasserschicht, eine Schicht aus organischem Lösungsmittel oder
dergleichen auf der Oberseite der gelbildenden Lösung als Schicht
aufzubringen, um die gelbildende Lösung daran zu hindern, unmittelbar in
Berührung mit Luft (Sauerstoff) zu gelangen, die bzw. der es verhindert,
daß die polymerisierende Reaktion voranschreitet. Die aufgebrachte
Schicht kann sich jedoch mit der gelbildenden Lösung vermischen und
dabei unhomogene Schichten mit unterschiedlichen Gelkonzentrationen
erzeugen, oder ein Teil des als Schicht aufgebrachten organischen
Lösungsmittels kann in der Gelplatte verbleiben. Diese können der Grund einer
Verformung der Elektrophoresebilder oder einer Beeinträchtigung der Proben
sein.
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Zusätzlich erfolgt in einem herkömmlichen Chargenverfahren,
weil die Gelträger der Länge nach in einem Behälter angeordnet sind und
gelbildende Lösung dann voll in den Behälter hinein aufgegeben wird, die
Gelierung nicht nur im Inneren der Gelträger, sondern auch längs ihrer
Umfangsabschnitte. Dies macht es oft schwierig, die gebildeten
Gelplatten aus dem Behälter zu entnehmen oder die Gelplatten voneinander
abzuschälen.
Deshalb können die Gelträger zu Bruch gehen oder ein Gelträger
und das Gel können abgelöst werden, wenn sie aus dem gelbildenden
Behälter entnommen werden. Somit gelingt es einem solchen, herkömmlichen
Chargenverfahren oft nicht, eine erwartete Menge an Gelplatten in einem
einzigen Vorgang zu erzeugen. Ferner sind bei dem herkömmlichen
Chargenverfahren die Größe des Behälters oder die Anzahl der Träger, die in
einem Behälter anzuordnen sind, wegen der exothermen Wärme der
Polymerisierung und dergleichen beschränkt. Dies verschlechtert nicht nur den
Produktionsertrag und die Verarbeitbarkeit, sondern beschränkt auch das
Ausmaß der Chargengröße.
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Dementsprechend ist es die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die oben erwähnten Probleme bei den herkömmlichen
Chargenverfahren zu lösen und ein Verfahren zur Herstellung wäßriger
Polyacrylamidgels für die Elektrophorese vorzusehen, die eine hohe und
gleichförmige Qualität in einer großen Menge durch eine einfache und leichte
Vorgehensweise ermöglicht.
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Das Dokument US-A-4 169 036 betrifft ein Chargenverfahren
zum Herstellen von Polyacrylamidgelplatten zur Elektrophorese in einem
Behälter mit einer Vielzahl von Gelplattenträgern.
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Als Ergebnis intensiver Untersuchungen haben die
vorliegenden Erfinder herausgefunden, daß ein homogenes Gel erzielt werden kann
und die Verformung der Elektrophoresebilder vermieden werden kann, indem
man den gelbildenden Behälter als luftdichten Aufbau ausbildet und das
Eindringen von Sauerstoff in den Behälter unterbindet oder
sauerstofffreies Gas in den Behälter einleitet, bevor man die gelbildende Lösung
aufgibt. Zusätzlich können Schäden der Gelträger und die Abtrennung von
Gel und Trägern zum Zeitpunkt, wenn sie aus dem Behälter entnommen
werden, verhindert werden, und die exotherme Wärme der
Polymerisierungsreaktion kann unterdrückt werden, indem man jeden Gelträger individuell
mit Unterteilungsgliedern abtrennt. Diese Erkenntnisse haben zur
Fertigstellung der vorliegenden Erfindung geführt.
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Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung,
ein Chargenverfahren zur Herstellung wäßriger Polyacrylamidgelplatten
für die Elektrophorese in einem Behälter vorzusehen, mit den Schritten,
eine Vielzahl von Gelplattenträgern Seite an Seite im genannten Behälter
vorzusehen, eine gelbildende Lösung in den genannten Behälter hinein
aufzugeben und die genannte Lösung zu gelieren, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß der Behälter ein luftdichter Behälter ist, und dadurch, daß
das Verfahren auch darin besteht, Sauerstoff im Behälter zu unterdrücken
oder sauerstofffreies Gas in den genannten Behälter einzuleiten, bevor
man die gelbildende Lösung aufgibt.
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Andere Ziele, Merkmale und Vorzüge der Erfindung werden
nachfolgend noch besser aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
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Fig. 1 ist eine Ansicht, die eine Ausführungsform eines
Dekkels und eines Kastens eines gelbildenden Behälters darstellt.
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Fig. 2 ist eine Ansicht, die eine Ausführungsform eines
Gestells für die Unterteilungsglieder darstellt.
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Fig. 3 ist eine Zeichnung, die ein Unterteilungsgestell
zeigt, worin Gelplattenträger Seite an Seite eingesetzt sind.
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Fig. 4 ist eine Zeichnung, die einen zerlegten
Gelplattenträger zeigt.
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Der gelbildende Behälter 1, der in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, ist aus einem Kasten 1a, in dem Gelträger
eingesetzt sind, und einem Deckel 1b zusammengesetzt, der den Behälter
luftdicht abdichtet, und ist bevorzugt, wie in Fig. 1 dargestellt, mit einer
oder mehreren Einlaßöffnungen 3 für eine gelbildende Lösung und einer
oder mehreren Auslaßöffnungen 4 zum Aufgeben von Gas oder zum Auslassen
von Gas aus dem Behälter 1 ausgestattet. Die Größe des gelbildenden
Behälters 1 ist entsprechend der Größe der Gelplattenträger 6 und der
Anzahl der Gelplattenträger 6, die zu verwenden sind, bestimmt. Der
Gelplatten bildende Behälter 1 muß einen luftdichten Aufbau haben, weil es
notwendig ist, Sauerstoff vom Behälter 1 fernzuhalten oder in diesen
sauerstofffreies Gas einzuleiten. Dieser luftdichte Aufbau kann mühelos
dadurch sicher erreicht werden, daß man eine Dichtung 5 unter dem Deckel
1b aufbringt und eine Stange oder dergleichen vorsieht, um den Deckel 1b
und den Kasten 1a fest zu verbinden. Die Gaseinlaß- oder -auslaßöffnung
4 kann nach dem Gas-Aufgabe- oder -Entnahmevorgang durch einen Stopfen
verschlossen werden.
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In der Praxis der vorliegenden Erfindung werden
Unterteilungsglieder 7 verwendet, um die Gelplattenträger 6 abzutrennen. Die
Gelplattenträger 6 haften durch das Anordnen der Unterteilungsglieder 7
nicht durch das Gel aneinander. Zusätzlich kann die Erzeugung von Wärme
infolge der Polymerisierungsreaktion unterdrückt werden, da die
Unterteilungsglieder 7 als ein Isolator wirksam sind. Die
Unterteilungsglieder 7 sind Platten, die bevorzugt aus einem Wasser nicht absorbierenden
Material hergestellt sind, wie etwa einem Harz, z.B. Polyethylen,
Polypropylen, Gummi, z.B. Silikongummi, Urethangummi oder einem Polymerharz,
das im "Chemiehandbuch - Teil angewandte Chemie", herausgegeben von der
Chemischen Gesellschaft von Japan, oder dergleichen, beschrieben ist.
Insbesondere bevorzugte Materialien sind poröse Materialien, die rund um
ihre Oberfläche eine große Menge an Luft (Sauerstoff) festhalten können,
Materialien mit hoher Absorptionsfähigkeit von Radikalen, weiche
Harzplatten, die ohne weiteres an der Oberfläche von Gelträgern anhaften
können, oder dergleichen. Insbesondere sind eine Polystyrolplatte, eine
Styrolschaumplatte und eine Platte aus fluoriertem Harz am meisten
bevorzugt.
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Die Unterteilungsglieder 7 können so eingesetzt werden, daß
sie einzelne Gelplattenträger 6 getrennt in dem Gelplatten bildenden
Behälter 1 anordnen. Es ist mehr bevorzugt, ein Gestell 10 für die
Unterteilungsglieder 7 vorzusehen, wie in Fig. 2 gezeigt, worin die Gelträger
6 Seite an Seite angeordnet sind, wie in Fig. 3 gezeigt, und das Gestell
10 als ein Ganzes im Behälte 1 anzuordnen. Dieser Aufbau sichert ein
leichtes und einfaches Vorgehen zur Entnahme der gebildeten Gelplatten.
Der Abstand zwischen jedem Unterteilungsglied 7 ist nicht in
spezifischer Weise beschränkt, vorausgesetzt, daß die Gelträger 6 individuell
stehen können. Die Unterteilungsglieder 7 haben irgendeine Dicke, solang
sie in geeigneter Weise das Anhaften der Gelträger 6 durch eine
ausreichende Menge an Gel verhindern können, für eine ausreichende
Wärmeisolierungswirkung sorgen können und die analytische Leistung der Gelplatte
sowie die Durchführbarkeit des Verfahrens nicht verschlechtern.
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Die Gelplattenträger 6, die in der vorliegenden Erfindung zu
benutzen sind, brauchen nicht in spezieller Weise beschränkt zu sein,
vorausgesetzt, daß ein gewöhnlicher Träger ausgewählt ist.
Beispielsweise kann eine Form, die aus zwei Bahnen von Platten besteht, die
aus einem elektrischen nicht-leitfähigen Material (beispielsweise Glas,
Kunststoff usw.) hergestellt sind, die mit einem bestimmten Abstand
zwischeneinander durch einen Rahmen (Distanzstück) angeordnet sind,
verwendet werden. Die Form muß mit mindestens zwei Öffnungen zum Aufgeben und
Entnehmen der gelbildenden Lösung und dergleichen versehen sein.
Insbesondere, wie in Fig. 4 dargestellt, kann eine Einheit, die aus zwei
Bahnen 6a von Gelplatten 6 besteht, mit einem Kamm 8, der zwischen ihnen
eingefügt ist, um für einen Probenschlitz zu sorgen, verwendet werden.
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Bei der vorliegenden Erfindung muß Sauerstoffgas aus dem
gelbildenden Behälter 1 nach dem Einsetzen einer Vielzahl von
Gelplattenträgern 6 in den Behälter 1 entfernt oder sauerstofffreies Gas muß in
diesen eingeleitet werden. Sauerstoff kann aus dem Behälter 1 durch
Abpumpen der Luft, die hierin eingeschlossen ist, durch eine
Saugvorrichtung oder dergleichen entfernt werden. Stickstoffgas, Heliumgas oder
dergleichen ist als sauerstofffreies Gas bevorzugt.
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Die Gelplatte für Elektrophorese, auf die abgezielt wird,
kann dadurch hergestellt werden, daß man eine gelbildende Lösung in
diesem gelbildenden Behälter aufgibt, sowie durch Gelieren. Die gelbildende
Lösung, die hier verwendet wird, kann eine solche sein, die in bekannten
Fundstellen über Elektrophorese beschrieben ist, beispielsweise
"Elektrophorese - Grundlagen und Experimente", herausgegeben von H.
Terada, oder dergleichen. Spezifische Beispiele umfassen, ohne hierauf
beschränkt zu sein, eine Monomerlösung, die ein Acrylamid-Monomer
enthält, und erforderlichenfalls ein Vernetzungsmittel , ein anionisches,
oberflächenaktives Mittel (beispielsweise SDS) und ein pH-Puffermittel;
ein Gemisch aus einer Peroxidlösung und einer Lösung mit einem
Reduziermittel; und dergleichen.
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Die Elektrophoresegelplatten, die durch die vorliegende
Erfindung hergestellt sind, können bei der horizontalen oder vertikalen
Elektrophorese und dergleichen entsprechend einer bekannten Methode
angewandt werden, die in Fundstellen über Elektrophorese offenbart ist
("Elektrophorese - Grundlagen und Experimente", herausgegeben von H.
Terada; oder dergleichen). Sie ist am meisten geeignet zur Verwendung
bei der Geltafel-Elektrophorese.
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Andere Merkmale der Erfindung werden im Verlauf der
folgenden Beschreibung beispielhafter Ausführungsbeispiele ersichtlich, die
hier zur Darstellung der Erfindung vorgelegt werden und nicht deren
Begrenzung bedeuten sollen.
Beispiel 1
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50 Teile von Gelplattenträgern 6 (Fig. 4) wurden in einen
gelbildenden Behälter 1 (Fig. 1) unter Verwendung eines
Unterteilungsgestells 10 (Fig. 2) eingesetzt, wie in Fig. 3 dargestellt. Bei dieser
Anordnung wurden die Träger 6 voneinander durch die Polymerisierung
verhindernde Platten getrennt. Nach Schließen des Behälters 1 mit einem
Deckel 1b wurde Sauerstoffgas in den Behälter durch die Einlaßöffnung 3
für die gelbildende Lösung oder die Gasabgabe-Auslaßöffnung 4
eingeblasen, um die Innenseite des Behälters 1 zu einer Atmosphäre mit niedrigem
Sauerstoffgehalt umzuwandeln. Der Zustand des Gases im Behälter 1 wurde
durch Messen der Menge gelösten Sauerstoffs im Gas, das aus dem Behälter
ausgeblasen wurde, durch ein Meßgerät für gelösten Sauerstoff bestätigt.
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Dann wurde die gelbildende Lösung mit nachfolgender
Rezeptur in den Behälter durch die Einlaßöffnung 3 für gelbildende Lösung
aufgegeben.
< Rezeptur der gelbildenden Lösung>
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1,5 M Tris-Hydrochlorid (pH 8.8) 250 ml
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Acrylamid 97,5 g
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N,N'-Methylenbisacrylamid 2.5 g
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1% Ammoniumperoxysulfat 3,0 g
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N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin 0,05 g
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Wasser (zum Erreichen eines Gesamtvolumens
von 1000 ml) Rest
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Nachdem eine gewünschte Menge der gelbildenden Lösung in
dem Behälter 1 aufgegeben wurde, wurde eine 50%ige wäßrige
Glyzerinlösung in den Behälter bis zum Boden der Träger 6 eingefüllt und die
Einlaßöffnung 3 wurde so verstopft, daß die Lösung nicht
zurückfließenkonnte. Der Behälter 1 wurde für einen festgelegten Zeitraum ruhig
stehengelassen, bis der Inhalt voll geliert war. Nach Entfernen des
Deckels 1b wurden die Gelplatten, die geformt waren, gemeinsam mit dem
Gestell 10 herausgenommen und einer automatischen Waschmaschine
ausgesetzt. Räume zwischen den Trägern 6 waren mit der Anordnung der
Unterteilungsglieder 7 nicht geliert und somit wurde jeder Satz einer
Gelplatte mühelos aus dem Behälter 1 entnommen. Die Ablösung von Gelen
und Trägern 6 oder Schäden an den Gelplatten wurden kaum beobachtet,
wenn sie aus dem Behälter 1 entnommen wurden, so daß alle der
hergestellten Gelplatten für die Elektrophorese benutzt werden konnten. Da
ferner die gelbildende Lösung sich nicht mit Luft oder mit der
aufgeschichteten Flüssigkeitsschicht vermischte, wenn die Lösung in dem
Behälter 1 aufgegeben wurde, wurden Gelplatten hoher Qualität ohne
Schlieren oder Streifen erhalten.
Vergleichsbeispiel 1
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50 Gelplatten wurden in derselben Weise wie im Beispiel 1
unter Verwendung desselben gelbildenden Behälters 1 hergestellt, wie er
im Beispiel 1 verwendet wurde, mit der Ausnahme, daß die Verwendung von
Unterteilungsgliedern 7 weggelassen wurde und eine Wasserschicht auf die
gelbildende Lösung zum Verhindern, daß die Lösung mit Luft in Berührung
kam, nicht hergestellt wurde.
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Gelplatten, die im Beispiel 1 und im Vergleichsbeispiels 1
hergestellt wurden, wurden hinsichtlich der folgenden Punkte geprüft:
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(1) Zeit, die zum Bearbeiten und zur Entnahme von 50 Stück
Gelplatten verbraucht wurde. Die Waschzeit, die für die automatische
Waschmaschine im Verfahren der vorliegenden Erfindung (A) erforderlich
war, wurde auch berechnet und mit eingeschlossen.
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(2) Die Anzahl von Gelplatten, die für Elektrophorese
benutzt werden können, ohne Ablösung von Träger-Gel , ohne Schlieren oder
Streifen und ohne Gelverfärbung.
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(3) Analyse der Anzahl schadhafter Gels, ausgedrückt durch
verschiedenartige Fehler.
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Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
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Wie aus der Tabelle 1 ersichtlich ist, nahm das Verfahren
der vorliegenden Erfindung (A) weniger als ein Fünftel der
Bearbeitungszeit in Anspruch. die für das herkömmliche Verfahren erforderlich war,
da das Verfahren automatisiert war, wie im Beispiel 1 beschrieben,
während das herkömmliche Verfahren (B) im Vergleichsbeispiel 1 viel Zeit
und Arbeit erforderte, um die Gelplatten aus dem Behälter zu entnehmen
oder die Gelplatten voneinander abzuschälen. Während ferner das
herkömmliche Verfahren mehr als 3/4 unannehmbare Erzeugnisse aus 50 Stück nach
der Überprüfung auf das äußerliche Aussehen erzeugt, konnte das
Verfahren der vorliegenden Erfindung Gelplatten mit hoher Qualität bei einem
Ertrag von dem Vierfachen oder noch mehr als dem des herkömmlichen
Verfahrens erzeugen, wobei nur eine fehlerhafte Gelplatte mit Absplitterung
und eine andere fehlerhafte Gelplatte mit Streifen erzeugt wurde, von
denen jede an jedem Ende des Behälters gefunden wurde. Dieses
befriedigende Ergebnis lag in den Tatsachen begründet, daß keine übermäßige
Kraft erforderlich war, um jede geformte Gelplatte abzutrennen, keine
Vermischung der gelbildenden Lösung mit der Lösung der aufgebrachten
Schicht rund um ihre Übergangsfläche vorlag, und dergleichen.
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Wie oben dargestellt, kann eine große Menge von
Polyacrylamidgelplatten für Elektrophorese mit hoher Qualität, die in den
Eigenschaften homogen sind und ein hohes Auflösungsvermögen aufweisen,
mühelos in einem Chargenverfahren in einem kurzen Verfahrenszeitraum gemäß
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Zusätzlich
können die Arbeitsvorgänge zum Entnehmen der Gelplatte nach der
Gelierung, für das Waschen der Endprodukte und dergleichen, die
herkömmlicherweise auf Handarbeit beruhten, durch geeignete Konstruktion des
Aufbaus des gelbildenden Behälters, der Unterteilungsglieder und
dergleichen automatisiert werden.
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Ersichtlicherweise sind weitere Anpassungen und Änderungen
der vorliegenden Erfindung im Lichte der obigen Lehre möglich. Es wird
deshalb darauf hingewiesen, daß innerhalb des Umfangs der beigefügten
Ansprüche die Erfindung auch anders umgesetzt werden kann, als es hier
im einzelnen beschrieben ist.