DE69202357T2

DE69202357T2 - Verfahren zur Herstellung einer Gelscheibe für die Trennung und den Tranfer von Makromolekülen durch Elektrophorese und auf diese Weise hergestellte Gelscheiben.

Info

Publication number: DE69202357T2
Application number: DE69202357T
Authority: DE
Inventors: Jean Boquet
Original assignee: Bertin et Cie SA
Current assignee: Bertin Technologies SAS
Priority date: 1991-02-14
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1996-02-01
Anticipated expiration: 2012-02-14
Also published as: FR2672822A1; DE69202357D1; WO1992014538A1; ATE122263T1; EP0499546B1; CA2080236A1; AU651444B2; US5344543A; EP0499546A1; AU1348092A; FR2672822B1; JPH05506313A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Gelplatte zum Trennen und Überführen von Makromolekülen mittels Elektrophorese, sowie Gelplatten, die durch dieses Verfahren hergestellt sind.
Diese Platten besitzen eine Gelschicht, beispielsweise Agarose oder Polyacrylamid, welche mit einer Seite an einer mikroporösen Membran mit geringer Dicke, beispielsweise Nitrozellulose, Nylon, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder auch an einem besonderen Papier anhaftet.
Proben von Makromolekülen, wie Nucleinsäuren oder Proteine, werden in Schächte eingefüllt, die in der Gelschicht an einem Ende der Platte ausgebildet sind, wonach diese Platte zwischen zwei entgegengesetzten Elektroden in ein geeignetes Flüssigkeitsbad eingetaucht wird. Unter der Wirkung des elektrischen Feldes zwischen den Elektroden werden die Makromoleküle in Längsrichtung in der Gelschicht mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von der Molekularmasse abhängig ist. Nach Verstreichen einer bestimmten Zeit sind sie in Abhängigkeit von ihrer Molekularmasse unterschiedliche Wegstrecken oder Distanzen gewandert und können so voneinander getrennt werden. Danach werden sie in der Gelschicht zum Zweck ihrer Hybridisierung und ihrer abschließenden Detektion auf die an der Gelplatte anhaftende Membran übergeführt.
Die nach dem Stand der Technik verwendeten Gelplatten zum Trennen und Überführen von Makromolekülen (sogenannte "Multi-Blotter") müssen bestimmte Kriterien erfüllen, wie Ebenheit der Membran, Gleichmäßigkeit der Dicke des Gels, Homogenität des Gels, Nichtvorhandensein von Luftblasen im Gel und an der Grenzfläche Gel-Membran und Eigenschaften der freien Oberfläche der Membran, die der durch das Gel bedeckten gegenüberliegt.
Zur Herstellung dieser Platten kann man Membranen an ihrer Berandung in Rahmen einspannen und danach Gel in einem sehr flüssigen Zustand in diese Rahmen einfüllen, um die Membranen zu bedecken. Danach läßt man das Gel erstarren. Aufgrund seiner Natur haftet das Gel stark an den Membranen und neigt dazu, durch die Kapillarwirkung die Mikroporen der Membranen zu füllen.
Wenn die Membranen zum Einfüllen des Gels an einer ebenen Oberfläche angeordnet werden, erhält man Platten, deren Membranen eben sind, jedoch Spuren oder eine mehr oder weniger dicke Schicht des Gels an der Oberfläche aufweisen, welche jener gegenüberliegt, die normalerweise mit Gel bedeckt ist. In der Tat dringt das äußerst flüssige Gel nach dem Einfüllen in die Membranen ein und durchquert sie bis zu deren Oberfläche, wo es sich mehr oder weniger ansammelt. Weiters werden die vorhandenen Luftblasen zwischen der Membran und dem Gel oder im Gel eingefangen.
Wenn im Gegensatz dazu nur die Rahmen, an welchen die Membranen befestigt sind, an einer Halterung angeordnet werden, um das Gel einzufüllen, sind die Membranen nicht mehr durch eine ebene Oberfläche gestützt und bleiben an ihrer freien Oberfläche sauber, jedoch biegen sich die Membranen unter dem Gewicht des Gels und nehmen eine gekrümmte Form an, welche nach Erstarren des Gels erhalten bleibt.
Um diese Nachteile zu vermeiden, ist bereits vorgeschlagen worden, die Membranen vor dem Einfüllen des Gels mit Wasser zu sättigen, sie danach an einer ebenen Oberfläche anzuordnen und zu walzen, bis die Luftblasen entwichen sind, und die Membranen an der ebenen Oberfläche anhaften zu lassen. Danach wird das Gel über der an dieser Oberfläche aufliegenden Membran eingefüllt. Das in den Mikroporen vorhandene Wasser hindert das Gel am Durchdringen der Membranen und konserviert so die Eigenschaften der Oberfläche der Membran, die der durch das Gel bedeckten gegenüber liegt.
Dieses bekannte Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig und mühsam auszuführen und ermöglicht keine rasche Herstellung von Gelplatten.
In der WO-A-87/02132 ist ein Verfahren beschrieben, bei welchem ein Einfüllen des Gels im flüssigen Zustand über einer porösen Membran vorgesehen ist, die durch eine ebene Oberfläche einer porösen Unterlage gehalten wird.
Die EP-A-196 790 (Seiten 19-20) beschreibt ein Verfahren, bei welchem ein Gel vorerst im flüssigen Zustand über einer porösen, Membran eingefüllt wird, die durch einen starren Körper gehalten und gespannt wird, wonach eine zweite, vorgespannte Membran über dem Gel angeordnet wird.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die verschiedenen Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zu vermeiden.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, ein Herstellungsverfahren für Gelplatten zu schaffen, welches die oben genannten Kriterien erfüllt und welches einfach und rasch auszuführen ist.
Gegenstand der Erfindung ist es ebenso, Gelplatten der genannten Art zu schaffen, die qualitativ hochwertig und untereinander identisch sind.
Es wird daher ein Verfahren zur Herstellung einer Gelplatte zum Trennen und Überführen von Makromolekülen mittels Elektrophorese vorgeschlagen, wobei diese Platte eine Gelschicht mit gleichbleibender Dicke aufweist, die an einer Seite einer mikroporösen Membran anhaftet und das Verfahren ein Befestigen des Randes der Membran in einem Rahmen, ein Ausgießen des flüssigen Gels in den Rahmen und ein Erstarren desselben umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran bei dem Ausgießen des Gels in den Rahmen mittels eines Fluidums oder durch das flüssige Gel gehalten wird, wobei jeder Kontakt zu der freien Fläche der Membran, die der das Gel aufnehmenden Fläche gegenüber liegt, in der Weise vermieden wird, daß auf dieser freien Fläche keine Veränderung oder Störung der Oberflächenspannungen zwischen der Membran und dem die Mikroporen der Membran füllenden Gel auftreten, und sichergestellt wird, daß die Membran bis zum Erstarren des Gels eben bleibt.
Die Erfindung beruht auf der Grundlage, daß ein Gel, welches über eine Membran gegossen wird und in diese Membran über die gesamte Dicke eindringt, nicht aus der Membran herausfließt, wenn die freie Oberfläche derselben nicht mit einem festen Körper in Berührung steht. Die Kräfte der Oberflächenspannung, die ein Anhaften zwischen dem Gel und der Membran gewährleisten, sind ausreichend, um zu verhindern, daß das Gel über die freie Oberfläche der Membran hervortritt. Diese freie Oberfläche, die der mit dem Gel bedeckten gegenüberliegt, bleibt so absolut sauber.
Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung ist im Rahmen des Verfahrens vorgesehen, daß der die Membran haltende Rahmen umgedreht auf einer horizontalen ebenen Fläche angeordnet wird und sich die Membran über der Unterseite des Rahmens in einem Abstand von der ebenen Fläche befindet, wobei das flüssige Gel unter die Membran in das Innere des Rahmens gegossen wird, bis die freie Fläche des Gels eine vorbestimmte Höhe erreicht, bei welcher das Gel mit der Unterseite der Membran in Kontakt steht und diese in einer Horizontalebene hält.
Unter diesen Bedingungen wird die Membran durch das Gel in einer Ebene gehalten.
Die genannte Höhe wird in vorteilhafter Weise durch einen Überlauf bestimmt, welcher beispielsweise in Mitteln zur Zuführung des Gels in das Innere des Rahmens ausgebildet ist.
Auf diese Weise kann man die Höhe, welche eine gute Ebenheit der Membran ergibt, genau einstellen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Verfahren das Halten der Membran und ihres Rahmens mittels eines Luftpolsters mit einem gleichmäßigen Druck auf, welcher an der freien Fläche der Membran wirkt, und daß das flüssige Gel oberhalb der Membran in das Innere des Rahmens gegossen wird. Der Luftpolster wird so eingestellt, daß er das Gewicht der Membran, des Rahmens und des über der Membran in den Rahmen gegossenen Gels trägt. Die Gleichmäßigkeit dieses Polsters bewirkt eine besonders gute Ebenheit der Membran. Der genannte Luftpolster kann mittels eines durchströmten Tisches mit einer porösen oder feinperforierten Oberseite hergestellt werden, welche mit Druckluft beaufschlagt ist.
Durch die Erfindung wird weiters eine Gelplatte zum Trennen und Überführen von Makromolekülen mittels Elektrophorese vorgeschlagen, die eine Gelschicht mit gleichbleibender Dicke autweist, welche an einer Seite einer mikroporösen ebenen Membran anhaftet, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel die Mikroporen der Membran füllt ohne über die freie Fläche der Membran, die der mit dem Gel bedeckten Seite gegenüberliegt, hinauszuragen.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung bildet das Gel in den Poren, die zur freien Fläche der Membran führen, konkave Eintiefungen.
Diese Gelplatten besitzen identische Eigenschaften in bezug auf ihre Dicke der Gelschicht, ihre Ebenheit der Membran und die Durchdringung der Membran durch das Gel und ermöglichen ein reproduzierbares und verläßliches Trennen und Überführen von Makromolekülen.
Ein besseres Verständnis und weitere Merkmale, Details und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden, als Beispiel angegebenen Beschreibung, in welcher auf die beiliegenden Figuren Bezug genommen wird, die zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der Erfindung,
Figur 2 eine schematische Darstellung einer zweiten Ausführungsform der Erfindung,
Figur 3 eine äußerst schematische, vergrößerte Darstellung der freien Oberfläche einer Membran, deren Mikroporen mit Gel gefüllt sind.
Vorerst wird auf die Figur 1 Bezug genommen, die eine erste Ausführungsform der Erfindung zeigt.
Bei dieser Figur ist eine mikroporöse Membran 10, beispielsweise Nitrozellulose, Nylon, PVDF oder Spezialpapier, an der Berandung an einem Rahmen 12 befestigt, welcher eine Höhe aufweist, die gleich der Dicke der Gelschicht ist, welche über der Membran 10 gebildet werden soll. Der Rahmen wird umgedreht an einem Tisch 14 mit einer völlig ebenen Oberfläche angeordnet, sodaß die Membran 10 oberhalb des Rahmens und in einem Abstand von dem Tisch 14 befindet, welcher der Dicke des Rahmens entspricht.
Die Membran besitzt eine Dicke von beispielsweise 0,1 bis 0,2 mm und Poren mit einer mittleren Abmessung von ca. 0,5 um. Die über der Membran zu bildende Gelschicht besitzt eine Dicke von beispielsweise einigen mm.
Der beispielsweise rechteckige Rahmen 12 besitzt eine kontinuierliche Berandung, bis auf einen Bereich 16, der einer externen Leitung 18 zum Zuführen von flüssigem Gel zugeordnet ist. Das untere Ende der Leitung 18 wird dichtend an die Öffnung 16 des Rahmens 12 angeschlossen, wogegen das obere Ende mit Mitteln zum Zuführen von Gel verbunden ist.
Eine Wand der Leitung 18 weist eine Überlauf-Öffnung 20 auf, deren unterer Rand in einer Höhe angeordnet ist, welche genau für die untere Fläche 22 der Membran vorgesehen ist, welche mit Gel zu füllen ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in einfachster Weise auszuführen.
Es ist ausreichend, den die Membran 10 tragenden Rahmen 12 an dem Tisch in der in Figur 1 dargestellten Art und Weise anzuordnen, seine Öffnung 16 mit dem unteren Ende der Leitung 18 zu verbinden und das zum Beispiel durch Erhitzen auf eine Temperatur in der Größenordnung von 55ºC (falls es sich um Agarose handelt) verflüssigte Gel in die Leitung 18 einzufüllen. Das bei dieser Temperatur äußerst dünnflüssige Gel füllt sodann den Rahmen 12, bis es mit der unteren Fläche 22 der Membran in Berührung kommt und diese in einer exakten Horizontalebene hält. Nachdem das Gel im inneren des Rahmens 12 diese Höhe erreicht hat, fließt das durch die Leitung 18 zugeführte überschüssige Gel durch die Überlauf-Öffnung 20 ab. Zugleich durchdringt das Gel die Membran 10 und füllt durch die Kapillarwirkung die Mikroporen derselben.
Die Ebenheit der Membran entspricht der Ebenheit der freien Oberfläche des Gels im Inneren des Rahmens 12 und ist hervorragend.
Die genaue Positionierung der Überlauf-Öffnung 20 ermöglicht es, zu vermeiden, daß die Membran leicht konvex oder konkav gekrümmt ist und daß das die Membran durchdringende Gel an der Oberseite 24 derselben austritt.
Überdies werden die Luftblasen, die dazu neigen, unter der Membran eingefangen zu werden, nach und nach, wenn das Gel durch die Kapillarkraft die Mikroporen der Membran füllt, nach außen verdrängt.
Gegebenenfalls kann man zu Beginn des Einfüllens des Gels in das Innere des Rahmens den Tisch 14 so neigen, daß sich die Leitung 18 an dem höchsten Punkt befindet, wodurch ein Ausgasen des zugeführten Gels in dem Rahmen 12 und ein Entweichen der Luftblasen durch die Leitung 18 nach oben ermöglicht wird.
In Figur 2 ist eine Ausführungsvariante der Erfindung dargestellt.
Bei dieser Variante wird ein Luftpolster mit gleichmäßigen Druck verwendet, um die Membran 10 zu halten, welche an ihrer Berandung an dem Rahmen 12 befestigt ist, welcher so angeordnet wird, daß sich die Membran 10 unterhalb des Rahmens befindet.
Der Luftpolster wird durch einen durchströmten Tisch 26 der üblichen Bauart erzeugt, dessen Oberseite 28 mit einer exakt horizontalen und vollkommen ebenen Oberfläche porös oder mikroporös ausgebildet ist, um die Luft nach oben ausströmen zu lassen, wie durch die Pfeile angedeutet ist. Dieser Tisch wird durch ein schematisch mit 30 bezeichnetes Gebläse gespeist, welches einen Luftstrom mit vorbestimmtem Durchsatz und Druck liefert. Die Luftpfade durch die Wand 28 gewährleisten einen gleichmäßige Druckverteilung auf die freie Fläche 24 der Membran, die der Fläche 22 gegenüberliegt, welche mit dem Gel zu bedecken ist.
Die Wand 28 ist beispielsweise aus einem gesinterten Material, wie Bronze oder einem Verbundmaterial auf Glasfaserbasis hergestellt.
Nachdem der Tisch 26 durch das Gebläse 30 gespeist wird, kann die Membran und ihr Rahmen oberhalb der Oberfläche 28 angeordnet werden und wird sodann durch den Luftpolster in einer stabilen Position gehalten, welcher sich zwischen der Membran 10 und der Oberfläche 28 ausbildet. Danach wird das flüssige Gel in das Innere des Rahmens 12 eingefüllt, bis die Gelschicht die gewünschte Dicke aufweist (welche jene des Rahmens sein kann). Das Gel dringt in die Membran 10 ein, fließt jedoch nicht an der unteren Fläche 24 derselben aus, sondern bleibt im Inneren der Mikroporen der Membran.
Man kann die Luftversorgung des Tisches 26 anhalten, sobald das Gel, welches in die Membran 10 eingedrungen ist, sich verfestigt hat.
Wie bei der vorigen Ausführungsform erhält man Gelplatten, deren Membranen exakt eben sind und bei welchen die Dicke der Gelschicht konstant ist. Das die Membran durchdringende Gel hat die in den Mikroporen enthaltene Luft verdrängt.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Gelplatten stellen zumeist den folgenden Fall dar, der schematisch in Figur 3 dargestellt ist: Das Gel 32 füllt die Mikroporen der Membran und bildet, an der Mündung dieser Mikroporen 24 der Membran, die der mit dem Gel bedeckten gegenüberliegt, aufgrund der Oberflächenspannung zwischen dem Gel und dem Membranmaterial konkave Eintiefüngen 34.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Gelplatte zum Trennen und Überführen von Makromolekülen mittels Elektrophorese, wobei diese Platte eine Gelschicht mit gleichbleibender Dicke aufweist, die an einer Seite einer mikroporösen Membran anhaftet und das Verfahren ein Befestigen des Randes der Membran (10) in einem Rahmen (12), ein Ausgießen des flüssigen Gels in den Rahmen und ein Erstarren desselben umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran bei dem Ausgießen des Gels in den Rahmen mittels eines Fluidums oder durch das flüssige Gel gehalten wird, wobei jeder Kontakt zu der freien Fläche (24) der Membran, die der das Gel aufnehmenden Fläche (22) gegenüber liegt, in der Weise vermieden wird, daß auf dieser freien Fläche keine Veränderung oder Störung der Oberflächenspannungen zwischen der Membran und dem die Mikroporen der Membran füllenden Gel auftreten, und sichergestellt wird, daß die Membran bis zum Erstarren des Gels eben bleibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die Membran (10) haltende Rahmen (12) umgedreht auf einer horizontalen ebenen Fläche (14) angeordnet wird und sich die Membran über der Unterseite des Rahmens in einem Abstand von der ebenen Fläche (14) befindet, wobei das flüssige Gel unter die Membran in das Innere des Rahmens gegossen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgießen des Gels unter die Membran (10) solange erfolgt, bis die freie Fläche des Gels eine vorbestimmte Höhe erreicht, bei welcher das Gel mit der Unterseite (22) der Membran in Kontakt steht und diese in einer Horizontalebene hält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Höhe durch einen Überlauf (20) bestimmt wird, welcher beispielsweise in Mitteln (18) zur Zuführung des Gels in das Innere des Rahmens (12) ausgebildet ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran und ihr Rahmen mittels eines Luftpolsters mit gleichmäßigem Druck gehalten werden, welcher an der freien Fläche der Membran wirkt, und daß das flüssige Gel dserhalb der Membran in das Innere des Rahmens (12) gegossen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Luftpolster mittels eines durchströmten Tisches (26) mit einer porösen oder feinperforierten Oberseite (28) hergestellt wird, welche Oberseite eine horizontale und ebene Oberfläche besitzt, die mit Druckluft beaufschlagt ist.

7. Gelplatte zum Trennen und Überführen von Makromolekülen mittels Elektrophorese, die eine Gelschicht mit gleichbleibender Dicke aufweist, welche an einer Seite (22) einer mikroporösen ebenen Membran anhaftet, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel die Mikroporen der Membran füllt ohne über die freie Fläche (24) der Membran, die der mit dem Gel bedeckten Seite (22) gegenüber liegt, hinauszuragen.

8. Gelplatte nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel (32) in den Poren, die zur freien Fläche (24) der Membran führen, konkave Eintiefungen (34) bildet.