DE69104966T2 - Verfahren zur Herstellung einer mit einer Gelschicht versehenen Membran und Membran-Trägerrahmen für die Ausführung dieses Verfahrens. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer mit einer Gelschicht versehenen Membran und einen Trägerrahmen für eine derartige Membran zur Durchführung dieses Verfahrens, der an einer Membran montiert ist. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Anfertigung einer Einheit Gel/Membran, die zur Trennung von Makromolekülen durch Elektrophorese einsetzbar ist.
• Für diesen Anwendungsfall verwendet man eine Schicht aus einem Gel, beispielsweise aus Agarose oder einem Polyacrylamid, und man baut zwischen zwei gegenüberliegenden Rändern der Schicht ein elektrisches Feld auf. Proben von zu trennenden Makromolekülen, beispielsweise von Nukleinsäure, werden in im Gel ausgebildeten Löchern entlang einem der beiden Ränder der Schicht angeordnet. Die Einheit wird schließlich in eine für die Elektrophorese geeignete Flüssigkeit eingetaucht. Durch die Wirkung des elektrischen Feldes wandern die in den Löchern befindlichen Makromoleküle der Proben in Richtung auf den gegenüberliegenden Rand der Schicht quer durch das Gel, und zwar mit Geschwindigkeiten, die insbesondere von der Molekularmasse der Makromoleküle abhängig sind. Dies hat zur Folge, daß am Ende einer vorgegebenen Zeit Makromoleküle mit unterschiedlichen Molekularmassen im Gel unterschiedliche Strecken durchwandert haben.
• Die auf diese Weise getrennten Makromoleküle werden schließlich, sei es durch Mitführung in einem Fluid, sei es mit Hilfe eines elektrischen Feldes senkrecht zu Gelschicht, auf eine Membran übertragen, die gegen eine Seite der Schicht angeordnet ist, und zwar im Hinblick auf ihre Hybridisierung und ihre spätere Detektion. In der europäischen Patentschrift 358 556 der Patentinhaberin sind ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Elektrophorese beschrieben, die dazu dienen, eine derartige gesteuerte Wanderung von Makromolekülen in einem Stapel von rechteckförmigen Platten des Gels sicherzustellen.
• Wenn man eine Membran zur Lagerung der Gelschicht verwendet, ist die Anfertigung der Einheit Gel/Membran aufgrund der Feinheit und des Mangels an Steifigkeit der verwendeten Membran, bei der es sich normalerweise um ein dünnes Blatt aus Nitrozellulose handelt, das ggf. Nylon enthält, um den mechanischen Widerstand zu erhöhen, besonders schwierig.
• Aus der WO-A-87 02 132, der EP-A-O 196 790 und der DE-A- 30 32 070 sind Verfahren zur Herstellung von derartigen Einheiten Gel/Membran bekannt, bei denen man ein Gel auf eine flache Membran gießt, wobei die Gelschicht von einer Art Rahmen begrenzt wird.
• Die bekannten Rahmen zum Lagern einer solchen Membran haben jedoch den Nachteil, daß man hiermit die Membran nicht in einer Ebene unter gleichmäßiger Spannung halten kann. In der Membran bilden sich daher Falten, die aus einem Fehlen einer derartigen Spannung resultieren. Die Gelschicht, die man auf eine solche gefaltete Membran gießt, weist Verformungen auf, die einer gleichmäßigen Fortbewegung der Makromoleküle in der Schicht entgegenwirken und das Ergebnis dieser Wanderungsbewegung unauswertbar machen. Das Unterdrücken von derartigen Falten erfordert lange und unangenehme Manipulationen, die mit den Forderungen nach einer automatisierten industriellen Herstellung unverträglich sind.
• In der vorstehend erwähnten EP-A-0 196 790 ist eine dicke Gelscheibe beschrieben, die durch einen Umfangsring und durch zwei auf den Basisseiten des Ringes gespannte Filter begrenzt ist. Eine Wanderung von Molekülen findet senkrecht zur Oberfläche der Scheibe statt. Man trifft daher hierbei nicht auf das Problem einer Störung der Fortbewegung der Moleküle durch Falten, das sich bei der Verwendung von Gel/Membran-Einheiten der vorstehend beschriebenen Art stellt.
• Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer solchen mit einem Gel versehenen Membran und einen an einer Membran befestigten Rahmen zur Durchführung dieses Verfahrens zu schaffen, mit dem die Ausbildung von Falten in der Membran verhindert werden kann.
• Erfindungsgemäß soll ferner ein solches Verfahren und ein solcher Rahmen zur Verfügung gestellt werden, die für industrielle Einrichtungen zur Herstellung von mit einem Gel versehenen Membranen und zur Handhabung von Trägerrahmen für derartige Membranen geeignet sind.
• Diese Ziele der vorliegenden Erfindung sowie andere Ziele, die beim Lesen der nachfolgenden Beschreibung deutlich werden, werden durch ein Verfahren zur Herstellung einer mit einer Gelschicht versehenen Membran erreicht, bei dem man zuerst die Membran in einer Horizontalebene flach ausbreitet und danach ein Gel auf die Membran gießt, wobei man die Membran unter Spannung setzt. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man, um die Membran unter Spannung zu setzen, zuerst zwei im wesentlichen parallele gegenüberliegende Ränder der Membran durchlaufend entlang Schienen fixiert und danach die Schienen relativ zueinander in einer Richtung quer zu ihrer Richtung auseinanderbewegt.
• Dadurch, daß man die Membran unter Spannung setzt, werden Falten unterdrückt und das Gel breitet sich in einer Schicht mit einer gleichmäßigen Dicke auf der Membran aus.
• Zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens stellt die Erfindung einen Trägerrahmen zur Verfügung, der mindestens zwei parallele und mit einer Membran versehene Schienen aufweist, wobei die Membran mit Hilfe von Einrichtungen durchlaufend entlang zwei parallelen Rändern der Membran an den Schienen fixiert ist. Der Trägerrahmen ist dadurch gekennzeichnet, daß er Einrichtungen zum Verändern der Relativlage der beiden Schienen zwischen einer Position, in der die Membran entspannt ist, und einer Position, in der die Membran zwischen den Schienen gespannt ist, aufweist.
• Die Einrichtungen zum Verändern der Relativlage der Schienen umfassen mindestens zwei identische elastische Streifen, die jeweils über ihre Enden in zwei den an der Membran befestigten Schienen entsprechenden Enden verankert sind und die zur Annäherung der Schienen relativ zueinander im Hinblick auf die Befestigung der Membran an den Schienen durchgebogen werden können. Die Streifen wirken mit Steuereinrichtungen für ihre Durchbiegung zusammen.
• Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäß ausgebildeten Trägerrahmens umf aßt dieser zwei Paare von parallelen elastischen Streifen, die jeweils zwischen zwei den Schienen entsprechenden Enden verankert sind, und Steuereinrichtungen für die Durchbiegung der Streifen eines jeden Paares, um eine symmetrische Annäherung oder Entfernung voneinander durchzuführen. Die Steuereinrichtungen können vorteilhafter Weise durch einen Nocken gebildet sein, der drehbar zwischen die beiden Streifen eines Paares eingesetzt ist.
• Weitere Merkmale und Vorteile des Verfahrens und des Trägerrahmens der vorliegenden Erfindung werden durch das Lesen der nachfolgenden Beschreibung und die Überprüfung der beigefügten Zeichnungen deutlich. Hiervon zeigen:
• Figur 1 eine perspektivische Ansicht eines erfindungsgemäßen Rahmens in der Form, in die er zum Gießen einer Gelschicht auf die am Rahmen befestigte Membran gebracht worden ist,
• Figur 2 eine perspektivische Ansicht des gleichen Rahmens in der Form, die er einnimmt, nachdem die Membran, die er trägt, gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung unter Spannung gesetzt worden ist,
• Figur 3 eine Teilansicht des Rahmens der Figuren 1 und 2 im Schnitt entlang der Linie III-III in Figur 2 und
• Figur 4 eine entsprechende Schnittansicht wie Figur 3 einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäß ausgebildeten Rahmens.
• Wie die Figuren 1 und 2 der beigefügten Zeichnungen zeigen, umfaßt der erfindungsgemäß ausgebildete Trägerrahmen zwei symmetrische Schienen 1 und 2, die durch Paare von elastischen Streifen 3, 4, 5 und 6 versteift sind. Diese Streifen besitzen die gleiche Länge und sind senkrecht bei 7, 8, 9, 10 in entsprechenden Enden der beiden Schienen 1 und 2 derart verankert, daß sie mit den Schienen einen Rechteckrahmen bilden, an dessen beiden gegenüberliegenden Rändern die Schienen mit einem Paar von parallelen Streifen versehen sind, welche geringfügig auseinandergespreizt sind.
• Die Streifen bestehen aus einem Material, das weder metallisch noch leitend ist, jedoch flexibel, aber nicht so dehnbar ist wie ein Verbundmaterial, beispielsweise einem stranggepreßten Epoxidglas. Wenn man die Streifen verformt, wie in Figur 1 gezeigt, nimmt die Länge der Projektion eines Streifens auf eine senkrecht zu den beiden Schienen 1, 2 verlaufende Achse ab, so daß sich die Schienen einander nähern. Wenn die auf die vier Schienen aufgebrachten Verformungen identisch sind, verbleiben die Schienen darüber hinaus parallel zueinander.
• Erfindungsgemäß benutzt man diese mechanische Konstruktion, um eine Membran zu spannen, die eine Gelschicht aufnehmen muß. Um dies zu verwirklichen, fixiert man ein rechteckiges Stück dieser Membran unter dem Rahmen der Figuren 1 und 2, während die Steuereinrichtungen 11, 12 für die Durchbiegung der Streifen zwischen die Streifen 3, 4, 5 und 6 gesetzt werden. Diese Einrichtungen 11, 12 können beispielsweise die Form von Keilen oder, wie in Figur 1 gezeigt, von länglichen Nocken besitzen, die einstückig mit zylindrischen gerändelten Teilen 13, 14 ausgebildet sind, welche sich bequem zwischen einer Position, in der der Nocken die Streifen nicht beaufschlagt (Figur 2), und einer Position, in der er die Streifen beaufschlagt und diese so verformt, daß sich die Schienen 1, 2 parallel einander nähern (Figur 1), drehen lassen.
• Erfindungsgemäß fixiert man eine Membran 15 über zwei gegenüberliegende Ränder an den Schienen 1 und 2, während sich der Rahmen in der in Figur 1 dargestellten Lage befindet. Das verwendete Fixierungsmittel kann ein Klebemittel sein, beispielsweise ein Doppelklebeband 16 (siehe den Teilschnitt der Figur 3), das vorher mit zeitweisem Schutz auf die Membran aufgetragen wurde. Gemäß einer Variante können die beiden Ränder der Membran 15 zwischen einer Schiene 1, 2 und einer Gegenschiene 1', 2' (siehe den Teilschnitt der Figur 4) gequetscht werden, und es kann ein U- förmiges Klemmprofil 17 um die Einheit geführt werden, um die beiden Elemente gegeneinander zu pressen.
• Nach der Fixierung einer Membran 15 am Rahmen (1, 2, 3, 4, 5, 6) läuft das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer mit einer Gelschicht versehenen Membran in der folgenden Weise ab:
• Der die entspannte Membran tragende Rahmen wird auf einen vollkommen flachen und horizontalen Träger gelegt, auf den sich die Membran legt. Die waagrechte Lage wird mit Hilfe einer Wasserwaage sichergestellt. Ergänzungsschienen 18, 19 werden am Rahmen in der Nähe der elastischen Streifen so montiert, daß sie auf der darunterliegenden Membran mit den Schienen 1, 2 eine Fläche begrenzen, die eine Gelschicht aufnehmen muß.
• Eine 18 der Schienen 18, 19, die zu der umgrenzten Fläche weist, besitzt eine Fläche, die eine Vielzahl von ausgerichteten Auszahnungen 20 trägt, welche einen Kamm bilden.
• Danach wird eine vorgegebene Menge eines flüssigen Gels, das man beispielsweise nach und nach auf Umgebungstemperatur gebracht hat, auf die Membran 15 in das Innere des erfindungsgemäßen Rahmens gegossen. Das Gel breitet sich durch Schwerkraftwirkung auf der Membran zu einer Schicht 23 mit einer vollkommen gleichmäßigen Dicke aus (siehe die Figuren 3 und 4).
• Um gemäß einem wesentlichen Ziel der Erfindung das Auftreten von Falten an der Membran zu verhindern, kann diese unmittelbar vor dem Eingießen des Gels durch eine geeignete Drehung der Nocken 11, 12 zum Entspannen der elastischen Streifen 3, 4, 5, 6 (siehe Figur 2) und somit zum Auseinanderbewegen der Schienen 1, 2 gegen den Widerstand der Membran 15, die auf diese Weise unter Spannung gesetzt wird, gespannt werden.
• Während des Gießens des Gels dringt dieses langsam zwischen die Auszahnungen 20 der Schiene 18 ein, wodurch eine Reihe von Löchern 21 an einem Rand der Schicht ausgebildet wird, die dazu dienen, Proben der zu untersuchenden Makromoleküle aufzunehmen, wie in der Einleitung der vorliegenden Beschreibung ausgeführt ist, wenn die gesteuerte Wanderung dieser Makromoleküle durch Elektrophorese angestrebt wird.
• Die Schienen 18, 19 sind beweglich und vom Rahmen entfernbar, nachdem das Gel aufgebracht worden ist (siehe Figur 2). Der auf diese Weise freigelegte Rahmen trägt eine Gelschicht, deren Löcher 21 dann gelöst und zur Aufnahme der zu untersuchenden Makromoleküle bereit sind.
• Die Schienen 1, 2 sind aufihrer seitlichen Rahmeninnenfläche mit Reihen von abgerundeten Zähnen 22 versehen. Hierbei handelt es sich um eine Anordnung, die zur Verhakung der Gelschicht an den Schienen während der Entnahme derselben beiträgt. Die Figuren 3 und 4 zeigen ferner, daß die Ränder der Schicht oder Platte des Gels mit den Innenseiten der Schienen 1 und 2 in Kontakt bleiben.
• Der mit einer Membran versehene Rahmen, der eine geeignete Gelschicht mit einer auf ein genaues Maß gebrachten Dicke trägt, kann dann nach dem Ausfüllen der Löcher 21 in eine Anordnung eingebracht werden, wie sie in der vorstehend zitierten europäischen Patentschrift beschrieben ist und zum Aufnehmen einer Vielzahl von solchen Rahmen sowie zur Sicherstellung der erforderlichen elektrophoretischen Wanderungen in diesen dient.
• Man erkennt nunmehr, daß das erfindungsgemäße Verfahren die aufgezeigten Vorteile aufweist und daß man hiermit die Möglichkeit hat, eine Gelschicht mit einer Dicke von beispielsweise einigen Millimetern auf einer vollkommen gespannten Membran ohne Falten herzustellen.
• Für den Fachmann ist ferner ohne weiteres klar, daß die diversen Operationen zur Befestigung der Membran an ihrem Trägerrahmen, zum Eingießen des Gels und zum Spannen der Membran ohne besondere Schwierigkeiten automatisierbar und daher für eine Industrialisierung der Herstellung von solchen Gel/Membran-Einheiten geeignet sind. Dies stellt einen wichtigen Vorteil der Erfindung gegenüber den vorhandenen Techniken zur Herstellung von solchen Einheiten dar, die gleichzeitig Zeit und Geschicklichkeit erfordern, ohne daß sie immer die Klippe der Ausbildung von Falten überwinden können. Bei einem industriell gefertigten Rahmen ist es ferner möglich, die Spannung der Membran zu steuern, was zur Reproduzierbarkeit der Wanderungsspektren der auf die Membran überführten Makromoleküle beiträgt.
• Man erkennt ferner, daß die Membran vom erfindungsgemäßen Rahmen gelöst werden kann, wenn sie über die in Figur 3 oder in Figur 4 dargestellten Mittel am Rahmen fixiert ist. Der Rahmen ist daher wiederverwendbar, wodurch die Kosten des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere bei einer Industrialisierung dieses Verfahrens, weiter abgesenkt werden können.
• Die Erfindung ist nicht auf die beschriebene und dargestellte Ausführungsform, die lediglich beispielhaften Charakter besitzt, beschränkt. Der beschriebene Rahmen ist über zwei Paare von elastischen Streifen 3, 4 und 5, 6 versteift. Man kann auch einen Rahmen verwirklichen, der einen einzigen elastischen Streifen aufweist, wo zwei Streifen bei der beschriebenen Ausführungsform vorgesehen sind. Dennoch ist die Verwendung von Paaren von beabstandeten, parallelen und eingespannten Streifen vorteilhaft, da jedes Paar ein Rechteck bildet, das auf einfache Weise symmetrisch verformt werden kann, jedoch nur schwierig asymmetrisch verformt werden kann, das jeder Verformung des Rahmens in seiner Ebene entgegenwirkt und das darüber hinaus jedem Verspannen des Rahmens entgegenwirkt, da die Streifen in Ebenen angeordnet sind, die senkrecht zur Ebene des Rahmens verlaufen.
• Es ist ferner zu bemerken, daß die erfindungsgemäß verwendeten Mittel zum Spannen einer Membran zwischen zwei von ihren Rändern zwischen den beiden anderen Rändern verdoppelt werden können, um ein bidirektionales Spannen der Membran, das noch geeigneter ist, sicherzustellen und eine vollkommene Ebenheit der Membran zu begünstigen. Man kann die Membran auch in einer Richtung parallel zur Wanderungsrichtung der Makromoleküle spannen, eher als in einer Richtung senkrecht hierzu.

Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung einer mit einer Gelschicht (23) versehenen Membran (15), bei dem man zuerst die Membran in einer Horizontalebene flach ausbreitet und danach ein Gel auf die Membran gießt, wobei man die Membran unter Spannung setzt, dadurch gekennzeichnet, daß man, um die Membran unter Spannung zu setzen, zuerst zwei im wesentlichen parallele gegenüberliegende Ränder der Membran durchlaufend entlang Schienen (1, 2) fixiert und danach die Schienen relativ zueinander in einer Richtung quer zu ihrer Richtung auseinanderbewegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gelschicht auf die horizontale Membran gießt, während sich die Schienen (1, 2) in benachbarter Position befinden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine im wesentlichen rechteckige Fläche auf der nichtgespannten Membran mit Hilfe der Schienen (1, 2) und mit Hilfe von zwei anderen Querschienen (18, 19) begrenzt und daß man das Gel auf die auf diese Weise begrenzte Fläche gießt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Membran an den Lagerschienen (1, 2) mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes (16) fixiert.

5. Trägerrahmen zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit mindestens zwei parallelen und mit einer Membran (15) versehenen Schienen (1, 2), wobei die Membran mit Hilfe von Einrichtungen (2', 17; 16) durchlaufend entlang zwei parallelen Rändern der Membran an den Schienen fixiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß er Einrichtungen (3, 4, 5, 6, 11, 12) zum Verändern der Relativlage der beiden Schienen zwischen einer Position, in der die Membran (15) entspannt ist, und einer Position, in der die Membran (15) zwischen den Schienen gespannt ist, aufweist.

6. Trägerrahmen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtungen zum Verändern der Relativlage der Schienen mindestens zwei identische elastische Streifen (3, 4, 5, 6) umfassen, die jeweils über ihre Enden in zwei den an der Membran (15) befestigten Schienen (1, 2) entsprechenden Enden verankert sind und die zur Annäherung der Schienen relativ zueinander im Hinblick auf die Befestigung der Membran an den Schienen durchgebogen werden können.

7. Trägerrahmen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er mit Steuereinrichtungen (11, 12) für die Durchbiegung der elastischen Streifen zusammenwirkt.

8. Trägerrahmen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er zwei Paare von parallelen elastischen Streifen (3, 4) und (5, 6) umfaßt, die jeweils zwischen zwei den Schienen entsprechenden Enden verankert sind, und daß die Steuereinrichtungen (11, 12) für die Durchbiegung der Streifen eines jeden Paares durch einen Nacken gebildet sind, der zwischen zwei Streifen eines Paares drehbar eingesetzt ist.

9. Trägerrahmen nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er des weiteren zwei zusätzliche Schienen (18, 19) aufweist, die so dimensioniert sind, daß sie derart zwischen die beiden Lagerschienen der Membran installierbar sind, daß sie zusammen mit diesen auf der Membran eine Fläche begrenzen, auf der das auf die Membran zu gießende Gel bis zu seiner Verfestigung zurückgehalten werden soll.

10. Trägerrahmen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine (18) der zusätzlichen Schienen bewegbar ist und Auszahnungen (20) aufweist, die die Anordnung von Löchern (21) an einem Rand der Fläche der Membran ermöglichen, welche für das Gießen des Gels reserviert sind.

11. Trägerrahmen nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lagerschienen (1, 2) für die Membran (15) aufihren zum Einschließen des Gels auf der für das Gel reservierten Fläche der Membran bestimmten Flächen mit Zähnen (22) versehen sind.

12. Trägerrahmen nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß er ebenfalls Gegenschienen (2') aufweist, mit denen die Membran durch Quetschung zwischen einer Fläche der Schienen und einer Fläche der Gegenschienen (2') fixiert werden kann, wobei die Quetschung durch ein Profil (17) sichergestellt wird, das die Schiene und die zugehörige Gegenschiene umgreift.