DE9110289U1 - Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung .... - Google Patents
Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung ....Info
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Description
Hi &Ggr;)to.
Dr. Dr. Budin Michov, Kepserstraße 21 A,
8050 Freising, Deutschland
HOMOGENE ELEKTROPHORESEPLATTE ZUR DURCHFÜHRUNG EINER
PROTEINTRENNUNG DURCH SDS-ELEKTROPHORESE UNTER VERWENDUNG
EINES TRIS-FORMIAT-TAURINAT-PUFFERSYSTEMS
EINES TRIS-FORMIAT-TAURINAT-PUFFERSYSTEMS
Die Erfindung betrifft die Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung
eines neuen Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystems und die
dafür geeigneten homogenen Elektrophoreseplatten
Die SDS-Elektrophorese, bei der das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet wird, ist eine relativ
einfach durchzuführende und außerordentlich informative
Methode zur Trennung von Proteinen nach ihrer Molekularmasse.
Es sind bereits verschiedene SDS-Elektrophoreseverfahren
bekannt. Von der Firma Pharmacia LKB werden beispielsweise SDS-Gradienten-Fertiggele und Elektrodenstreifen aus
Polyacrylamid mit einem Tris-Acetat-Tricinat-Puffersystem
(ExcelGele) für die Durchführung einer SDS-Elektrophorese
auf den Markt gebracht. Die von dieser Firma vertriebenen
SDS-Fertiggele bestehen aus einem Sammelgel (mit einer
Gesamtpolyacrylamidkonzentration von 5 g/dl und einem
Vernetzungsgrad von 0,03) und einem Trenngel (mit einer
Gesamtpolyacrylamidkonzentration, die sich über einen
Bereich von 8 bis 18 g/dl kontinuierlich ändert, und einem Vernetzungsgrad von 0,03).
Diese Gradienten-S-lS-Polyacrylamid-SDS-Fertiggele haben
jedoch den Nachteil, daß ihre Herstellung große Sorgfalt und viel Zeit erfordert, so daß diese Produkte teuer sind, und
daß sie außerdem unregelmäßig trocknen, was zur Folge hat, daß sich das Gel, zusammen mit dem Träger bzw. dem
Stützgewebe, auf den (das) es aufgebracht wird, verformt.
Außerdem hat das angebotene Tris-Acetat-Tricinat-Puffersystem,
das die Excelgele enthalten, eine niedrige Pufferkapazität, weil sein funktioneller pH-Wert von 7,1
weit entfernt von den pKc-Werten des Trisions (8,2), der
Essigsäure (4,6) und des Tricins (8,0) ist.
Aufgabe der Erfindung war es daher, die SDS-Elektrophorese
weiterzuentwickeln durch Verwendung homogener Gele, die einfacher und billiger herzustellen sind, und eines
Puffersystems mit einer höheren Pufferkapazität.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß
dadurch gelöst werden kann, daß die SDS-Elektrophorese durchgeführt wird unter Verwendung homogener Sammel- und
Trenngele mit einem spezifischen Gehalt an Polyacrylamid innerhalb des Bereiches von 4 bis 24 g/dl und mit einem
Vernetzungsgrad von 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04, in Kombination mit einem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem,
dessen funktioneller pH-Wert in dem Bereich von 8,0 bis 9,0,
vorzugsweise bei 8,5, und damit wesentlich näher bei den
.7<.r. pKc -Werten des Trisions (8,2) und des Taurins (8,9) liegt,
so daß es eine deutlich höhere Pufferkapazität aufweist.
Die hier beschriebene neue Methode zur Durchführung der SDS-Elektrophorese
unter Verwendung homogener Fertiggele in einem neuartigen Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem,
vermeidet die arbeitsintensive und kostspielige Gradientenkonzentration der bekannten SDS-Fertiggele und
verbessert die Trennung von Proteinen. Da die erfindungsgemäß verwendeten homogenen Gele leicht und
technisch einfach herstellbar sind, verbilligt sich dadurch ganz erheblich das SDS-Elektrophoreseverfahren.
Die Konzentration des Polyacrylamids (ein Polymer aus Acrylamid und Bisacrylamid) in den erfindungsgemäß
verwendeten homogenen Sammel- und Trenngelen beträgt 4 bis 5, vorzugsweise 5, g/dl, bzw. 8 bis 24, vorzugsweise 12,
g/dl, und sein Vernetzungsgrad liegt bei 0,02 bis 0,05, vorzugsweise bei 0,04.
Zur Erhöhung der niedrigen Kapazität des bekannten ExcelGel-Puffersystems
wurde ein Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem entwickelt, bei dem das Formiation (das Ion der
Ameisensäure) als Leition, das Taurination (das Ion des Taurins) als Folgeion, und das Trision als Gegenion
fungieren. Der funktionelle pH-Wert dieses Puffersystems liegt bei 8,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 8,5, und damit nahe
bei dem pKc-Wert des Trisions (8,2) und des Taurins (8,9).
Anstelle der Ameisensäure kann auch eine starke Säure (beispielsweise Salzsäure) verwendet werden. Anstelle des
Taurins können auch Taurinderivate und andere TC strukturähnliche Verbindungen (beispielsweise
Aminomethansulfonsäure, 3-Aminopropansäure, Alanin,
&bgr;-Alanin, 2-Aminoethanphosphonsäure,
2-Aminoethy!schwefelsäure,
Cystein, Serin und Threonin) verwendet werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine wäßrige Lösung des zu trennenden Proteingemisches auf eine homogene Gelschicht
einer Elektrophoreseplatte, bestehend aus einer homogenen Sammeigelschicht und einer homogenen Trenngelschicht, die
beide ein Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem enthalten, auf
einem Träger bzw. Stützgewebe, aufgebracht und nach dem Auflegen von zwei Papierelektrodenstreifen durch Anlegen
eines Gleichstromes in an sich bekannter Weise eine SDS-Elektrophorese durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung
durch SDS-Elektrophorese unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, die aus einem Träger bzw. einem
Stützgewebe mit einer darauf aufgebrachten Sammeigelschicht und einer Trenngelschicht besteht, die beide ein Tris-Formiat-Taurinat-Puf
f ersystem enthalten und jeweils einen aufgelegten Papierelektrodenstreifen tragen.
Vorzugsweise wird eine Elektrophoreseplatte verwendet, deren Sammelgelschicht Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C =
0,04 in einer homogenen Konzentration T = 5 g/dl sowie 30 g/dl Glycerin in einem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem
enthält. Ihre Trenngelschicht enthält vorzugsweise Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C = 0,04 in einer
homogenen Konzentration T = 12 g/dl sowie 10 g/dl Glycerin in einem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem.
Als Träger bzw. Stützgewebe wird vorzugsweise eine etwa 0,2 mm dicke Folie aus Polyester bzw. ein Netz aus Polyesteroder
Glasfasern verwendet, in der (dem) die der Gelschicht zugewandte Oberfläche hydrophil ist.
Das Puffersystem der Sammelgelschicht und der
Trenngelschicht besteht jeweils aus 0,1 bis 0,6 mol/1 (1,21
bis 7,27 g/dl), vorzugsweise 0,389 mol/1 (4,71 g/dl), Tris-
(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), 0,1 bis 0,4 mol/1 (0,38
bis 1,52 ml/dl), vorzugsweise 0,3 mol/1 (1,14 ml/dl),
Ameisensäure und 0,001 bis 0,004 mol/1 (0,03 bis 0,12 g/dl), vorzugsweise 0,002 mol/1 (0,06 g/dl), Natriumdodecylsulfat
(SDS) und hat jeweils einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8.
Die Papierektrodenstreifen enthalten ein Puffersystem aus 0,2 bis 1,2 mol/1 (2,42 bis 12,11 g/dl), vorzugsweise 0,589
mol/1 (7,13 g/dl), TRIS, 0,2 bis 1,6 mol/1 (2,50 bis 15,02 g/dl), vorzugsweise 0,802 mol/1 (10,04 g/dl), Taurin
(2-Amino-ethansulfonsäure) und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl), SDS
mit einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0, vorzugsweise von 8,5 (Kathodenpuffer), bzw. aus 0,4 bis 1,6 mol/1 (4,85 bis 19,38
g/dl), vorzugsweise 1,295 mol/1 (15,69 g/dl), TRIS, 0,25 bis 1,50 mol/1 (0,95 bis 5,72 ml/dl), vorzugsweise 1,0 mol/1
(3,81 ml/dl), Ameisensäure und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl), SDS
mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8 (Anodenpuffer).
Die SDS-Elektrophorese kann erfindungsgemäß als horizontale
oder vertikale oder auch als zweidimensional Elektrophorese
durchgeführt werden. Sie kann analytisch oder als Blotting-Elektrophorese eingesetzt werden, wobei nach der
Durchführung der SDS-Elektrophorese die voneinander getrennten Proteine auf an sich bekannte Weise fixiert und
mittels einer Färbelösung angefärbt werden. Die SDS-Elektrophorese wird bei einer Spannung von 50 bis 600 V
innerhalb 0,5 bis 2 Stunden durchgeführt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich
beispielsweise Leber-, Muskel-, Marker-, Milz-, Erdnuß-, Globulin-, Schlangengift-, Escherichia-coli-, Weizen-,
Reis-, Zwiebel-, Bohnen-, Linsen-, Erbsen-, Sonnenblumen-, Haselnußproteine in einer Konzentration von vorzugsweise
0,250 bis 0,125 mg/ml zuverlässig voneinander trennen. Die
Proteine werden in mit SDS denaturierter Form eingesetzt.
Die Fixierung der voneinander getrennten Proteine nach Durchführung der SDS-Elektrophorese erfolgt 2 bis 3 mal je
10 bis 15 min mit 0,5 g/dl Glutardialdehyd in 50 ml/dl
Ethanol bei 6O0C oder Raumtemperatur.
Die Anfärbung zur Sichtbarmachung der Proteine erfolgt in an sich bekannter Weise unter Verwendung einer Färbelösung,
vorzugsweise einer Lösung von Coomassie Brillantblau R 250 oder einer Silberfärbungslösung.
Das Aufbringen der Proben mit den voneinander zu trennenden Proteinen erfolgt auf das Sammelgel mit der Hilfe eines
Applikatorstreifens, wobei Probenvolumina von 1 bis 20 &mgr;&idiagr;
aufgegeben werden können. Auf einem Gel können bis zu 50 Proben auf einmal getrennt werden.
Die erfindungsgemäße SDS-Elektrophorese erlaubt eine
schnelle und wirksame Trennung von Proteinen im Molekularmassenbereich von 6 000 bis 450 000. Die dabei
erzielten Banden sind schärfer als bei den bekannten SDS-Elektrophorese-Systemen
und es wird eine deutlich höhere Auflösung (Ausbildung von mehr Trennzonen) von Proteingemischen erzielt.
Die erfindungsgemäßen homogenen Elektrophoreseplatten lassen
sich auf technisch einfache Weise, beispielsweise wie folgt, herstellen (vgl. Abb. 1 und 2 der beiliegenden Zeichnung):
In einem durchsichtigen Plexiglaskasten (Abb. 1) werden vertikal und nacheinander Glasplatten mit vertikal
aufgeklebten 0,25 bis 1,0 mm, vorzugsweise 0,5 mm dicken ■7cj Abstandsstreifen, und Gel-Fix-Folien oder Gel-Fix-Netzen (an
der nächsten Glasplatte locker fixiert) angeordnet, bis der Kasten ganz voll ist. Mit einem Schlauch (Abb. 2) wird
zuerst eine Pufferlösung (Wasser) eingegossen und dann wird, unter die Pufferlösung eine Sammelgellösung eingeführt. Nach
der Polymerisation des Sammelgels, die auf übliche Weise unter Verwendung von bekannten Katalysatoren wie
Tetramethylethylendiamin (TMEDA, TEMED) und Ammoniumperoxydisulfat [(NH4)2S2Oe] innerhalb 15 min
durchgeführt wird, erhält man ein Sammelgel mit einer ganz glatten oberen Grenze. Die überstehende Pufferlösung
(Wasser) wird abgesaugt, z. B. mit einer Wasserstrahlpumpe und dann wird eine Trenngellösung zur Herstellung des
Trenngels von oben her eingegossen. Nach der Durchführung der Polymerisation des Trenngels auf die vorstehend
beschriebene Weise werden die Gelschichten zusammen mit den Gel-Fix-Folien bzw. mit den Gel-Fix-Netzen, herausgelöst und
jede Gelschicht kann unter Verwendung eines Schweißgerätes in Kunststoffolie eingeschweißt werden. Die dabei erhaltenen
homogenen Gele sind bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur mindestens 12 Monate haltbar.
Die Papierelektrodenstreifen haben jeweils die gleiche
Stärke von 6 mm, aber verschiedene Längen und Breiten, z.B. 260 mm &khgr; 12,5 mm. Die Kathodenpapierelektrodenstreifen
enthalten Kathodenpuffer und die
Anodenpapierelektrodenstreifen enthalten Anodenpuffer
(s.o.). Bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur sind die Papierelektrodenstreifen mindestens 12 Monate haltbar.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert, in denen Rezepte für homogene SDS-Fertiggele mit verschiedener
Konzentration des Trenngels (T, g/dl) angegeben sind.
In den Beispielen 1 bis 7 haben die Gelschichten unterschiedliche Maße, die Matrix besteht aus Polyacrylamid,
die Sammeigelschicht (T = 5 g/dl, C = 0,04) macht 1/4 bis 3&Ggr;· 1/3 der gesamten Gelschicht aus, die Trenngelschicht (T = 8,
10, 12, 14, 16, 18 oder 20 g/dl, C = 0,04) macht 3/4 bis 2/3 der gesamten Gelschicht aus. Das Trägergewebe der SDS-
Fertiggele ist eine Polyesterfolie (0,2 mm) oder ein
Polyesternetz (80 \im) . Die Gelschichten können bei
Raumtemperatur gelagert werden und ihre Haltbarkeit beträgt mindestens 12 Monate. Im übrigen haben die Puffer in der
Sammelgelschicht und in der Trenngelschicht jeweils die nachstehend tabellarisch angegebene Zusammensetzung (Tab.
D :
Tab. I. Zusammensetzung der Gelschichtpuffer
| T, g/dl | , ml | 8 | 10 | 12 | 4 | 14 | 16 | 4 | 18 | 20 |
| TRIS, g | 6,39 | 5,70 | 5,15 | 1 | ,71 | 4, 36 | 1 | ,08 | 3,88 | |
| Ameisensäure | 100 ml | 1,14 | 1,14 | 1,14 | 0 | ,14 | 1,14 | 0 | ,14 | 1,14 |
| SDS, g | 0,06 | 0,06 | 0,06 | ,06 | 0,06 | , 06 | 0.06 | |||
| Dest. H2O ad | 7 | 7 | ||||||||
| PH | 8,19 | 8,07 | 7,93 | ,78 | 7,61 | ,40 | 7,14 | |||
Die Kathoden- und Anodenpuffer der Papierelektrodenstreifen
haben jeweils die in den folgenden Tabellen II und III angegebene Zusammensetzungen:
Tab. II. Zusammensetzung der Kathodenpuffer
T, g/dl 8 10 12 14 16 18 20
TRIS, g 15,04 11,96 9,35 7,13 5,26 3,69 2,40
Taurin, g 10,04 10,04 10,04 10,04 10,04 10,04 10,04
öü SDS, g 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Dest. H2O ad 100 ml
pH 8,70 8,63 8,55 8,47 8,38 8,27 8,13
Tab. III. Zusammensetzung der Anodenpuffer
T, g/dl 8 10 12 14 16 18 20
TRIS, g 21,29 19,01 17,17 15,69 14,51 13,61 12,94
&ohacgr;&thgr; Ameisensäure, ml 3,81 3,81 3,81 3,81 3,81 3,81 3,81
SDS, g 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Dest. H2O ad 100 ml
pH 8,19 8,07 7,93 7,78 7,61 7,40 7,14
Claims (5)
1. Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese, dadurch
gekennzeichnet, daß sie aus einem Träger, bzw.
Stützgewebe und einer darauf aufgebrachten Sammeigelschicht und einer Trenngelschicht besteht, die beide ein neuartiges
Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem enthalten und jeweils
einen aufgelegten Papierelektrodenstreifen tragen.
2. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammeigelschicht Polyacrylamid mit
einem Vernetzungsgrad C = 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04,
in einer homogenen Konzentration T = 4 bis 5, vorzugsweise 5, g/dl, sowie 30 g/dl Glycerin in dem Tris-Formiat-Taurinat-Puf
f ersystem enthält.
3D
3D
3. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trenngelschicht Polyacrylamid mit
einem Vernetzungsgrad C = 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04, g/dl in einer homogenen Konzentration T = 8 bis 20,
3&Ggr;· vorzugsweise 12, g/dl, sowie 10 g/dl Glycerin in dem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem
enthält.
4. Elektrophoreseplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Puffersystem der
Sammelgelschicht und der Trenngelschicht jeweils besteht aus 0,1 bis 0,6 mol/1 (1,21 bis 7,27 g/dl), vorzugsweise 0,389
mol/1 (4,71 g/dl) TRIS, 0,1 bis 0,4 mol/1 ' (0,38 bis 1,52
ml/dl), vorzugsweise 0,3 mol/1 (1,14 ml/dl) Ameisensäure und 0,001 bis 0,004 mol/1 (0,03 bis 0,12 g/dl), vorzugsweise
0,002 mol/1 (0,06 g/dl) SDS und jeweils einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8 hat.
10
10
5. Elektrophoreseplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Papierelektrodenstreifen
jeweils ein Puffersystem aus 0,2 bis 1,2 mol/1 (2,42 bis 12,11 g/dl), vorzugsweise 0,589 mol/1 (7,13 g/dl) TRIS, 0,2
bis 1,6 mol/1 (2,50 bis 15,02 g/dl), vorzugsweise 0,802 mol/1 (10,04 g/dl) Taurin und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis
0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl) SDS mit einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0, vorzugsweise 8,5
(Kathodenpuffer), bzw. aus 0,4 bis 1,6 mol/1 (4,85 bis 19,38 g/dl), vorzugsweise 1,295 mol/1 (15,69 g/dl) TRIS, 0,25 bis
1,50 mol/1 (0,95 bis 5,72 ml/dl), vorzugsweise 1,0 mol/1 (3,81 ml/dl) Ameisensäure und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis
0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl) SDS mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise 7,8
(Anodenpuffer) enthalten.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE9110289U DE9110289U1 (de) | 1990-08-29 | 1991-08-20 | Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung .... |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4027333 | 1990-08-29 | ||
| DE9110289U DE9110289U1 (de) | 1990-08-29 | 1991-08-20 | Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung .... |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE9110289U1 true DE9110289U1 (de) | 1991-12-19 |
Family
ID=25896349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE9110289U Expired - Lifetime DE9110289U1 (de) | 1990-08-29 | 1991-08-20 | Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung .... |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE9110289U1 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0555143A1 (de) * | 1992-02-07 | 1993-08-11 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von wässrigen Polyacrylamidgelplatten für Elektrophorese |
-
1991
- 1991-08-20 DE DE9110289U patent/DE9110289U1/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0555143A1 (de) * | 1992-02-07 | 1993-08-11 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Verfahren zur Herstellung von wässrigen Polyacrylamidgelplatten für Elektrophorese |
| US5350552A (en) * | 1992-02-07 | 1994-09-27 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method for preparing polyacrylamide aqueous gel plate for electrophoresis |
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