WO1992004625A1 - Proteintrennung durch sds-elektrophorese in einem homogenen gel unter verwendung eines tris-formiat-taurinat-puffersystems und dafür geeignete homogene elektrophoreseplatten - Google Patents

Proteintrennung durch sds-elektrophorese in einem homogenen gel unter verwendung eines tris-formiat-taurinat-puffersystems und dafür geeignete homogene elektrophoreseplatten Download PDF

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WO1992004625A1
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Definitions

  • the invention relates to protein separation by SDS electrophoresis in a homogeneous gel using a new tris-formate taurinate buffer system and the homogeneous electrophoresis plates suitable for this
  • SDS electrophoresis which uses the sodium dodecyl sulfate (SDS) detergent, is a relatively simple and extremely informative method for separating proteins by their molecular mass.
  • SDS ready gels consist of a bulk gel (with a
  • Range continuously changes from 8 to 18 g / dl, and a degree of crosslinking of 0.03).
  • this gradient 8-18 polyacrylamide SDS precast • have the disadvantage that their production great care and requires a lot of time, so that these products are expensive, and that it also irregular dry, with the result that the Gel deformed together with the carrier or the supporting tissue to which it is applied.
  • the offered tris-acetate-tricinate buffer system which contains the Excel gels, has a low buffer capacity because its functional pH value of 7.1 is far from the pK values of the trision (8.2), the acetic acid (4 , 6) and tricine (8.0).
  • the object of the invention was therefore to develop SDS electrophoresis further by using homogeneous gels, which are simpler and cheaper to produce, and a buffer system with a higher buffer capacity.
  • the SDS electrophoresis is carried out using homogeneous samel and separating gels with a specific polyacrylamide content within the range from 4 to 24 g / dl and with a degree of crosslinking of 0.02 to 0.05, preferably 0.04, in combination with a tris-for-iat taurinate buffer system, the functional pH of which is in the range from 8.0 to 9.0, preferably at 8.5, and is thus much closer to the pKc values of the trision (8.2) and the taurine (8.9), so that it has a significantly higher buffer capacity.
  • the new method described here for performing SDS electrophoresis using homogeneous finished gels in a novel tris formate taurinate buffer system avoids the labor-intensive and costly gradient concentration of the known SDS ready gels and improves the separation of proteins. Since the homogeneous gels used according to the invention are easy and technically simple to produce, the SDS electrophoresis process becomes considerably cheaper.
  • the concentration of the polyacrylic acid (a polymer composed of acrylamide and bisacrylamide) in the homogeneous bulk and separating gels used according to the invention is 4 to 5, preferably 5, g / dl or 8 to 24, preferably 12, g / dl, and its degree of crosslinking is 0.02 to 0.05, preferably 0.04.
  • a tris formate taurinate buffer system was developed in which the for ion (the ion of formic acid) as the leading ion, the taurination (the ion of taurine) as the subsequent ion, and the trision as Counterion act.
  • the functional pH of this buffer system is 8.0 to 9.0, preferably 8.5, and thus close to the pKc value of the trision (8.2) and the taurine (8.9).
  • a strong acid for example hydrochloric acid
  • taurine taurine derivatives and other structurally similar compounds (for example amino ethanesulfonic acid, 3-aminopropanoic acid, alanine, ⁇ -alanine, 2-aminoethanephosphonic acid,
  • 2-aminoethylsulfuric acid, cysteine, serine and threonine can be used.
  • the invention relates to a method for performing protein separation by SDS electrophoresis, which is characterized in that an aqueous solution of the protein mixture to be separated is applied to a support or support fabric on a homogeneous gel layer of an electrophoresis plate, consisting of a homogeneous collecting gel layer and a homogeneous separating gel layer, both of which contain a tris-formate-taurinate buffer system and after the application of two paper electrode strips by applying a direct current in a manner known per se, an SDS electrophoresis is carried out.
  • Another object of the invention is a homogeneous electrophoresis plate for performing a protein separation by SDS electrophoresis using the method described above, which consists of a support or a support fabric with a collecting gel layer applied thereon and a separating gel layer, both of which are trisformate taurinate -Buffer system included and each carry a paper electrode strip.
  • An approximately 0.2 mm thick film made of polyester or a mesh made of polyester or glass fibers is preferably used as the carrier or support fabric, in which the surface facing the gel layer is hydrophilic.
  • Separating gel layer consists in each case of 0.1 to 0.6 mol / 1 (1.21 to 7.27 g / dl), preferably 0.389 mol / 1 (4.71 g / dl), tris
  • (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), 0.1 to 0.4 mol / 1 (0.38 to 1.52 ml / dl), preferably 0.3 mol / 1 (1.14 ml / dl), formic acid and 0.001 to 0.004 mol / 1 (0.03 to 0.12 g / dl), preferably 0.002 mol / 1 (0.06 g / dl), sodium dodecyl sulfate (SDS) and each has a pH of 7.0 to 8.5, preferably 7.8.
  • TIS hydroxymethyl aminomethane
  • the paper electrode strips contain a buffer system
  • SDS electrophoresis can be carried out as horizontal or vertical or else as two-dimensional electrophoresis. It can be used analytically or as blotting electrophoresis, the proteins separated from one another being fixed in a manner known per se after the SDS electrophoresis has been carried out and stained by means of a staining solution. SDS electrophoresis is carried out at a voltage of 50 to 600 V within 0.5 to 2 hours.
  • the novel process can be, for example, liver, muscle, marker, spleen, peanut, globulin, 'snake venom, Escherichia coli, WE_. ..-, rice, onion, bean, lentil, pea, sunflower, hazelnut proteins in a concentration of preferably Reliably separate 0.250 to 0.125 mg / ml.
  • the proteins are used in a form denatured with SDS.
  • the separated proteins are fixed after performing the SDS electrophoresis 2 to 3 times for 10 to 15 min each with 0.5 g / dl glutardialdehyde in 50 ml / dl ethanol at 60 ° C. or room temperature.
  • the staining to make the proteins visible is carried out in a manner known per se using a coloring solution, preferably a solution of Coomassie Brillantblau R 250 or a silver coloring solution.
  • samples with the proteins to be separated are applied to the stacking gel with the help of an applicator strip, sample volumes of 1 to 20 ⁇ l being able to be applied. Up to 50 samples can be separated on one gel.
  • the SDS electrophoresis according to the invention allows a rapid and effective separation of proteins in the molecular range from 6,000 to 450,000.
  • the bands obtained are sharper than in the known SDS electrophoresis systems and there is a significantly higher resolution (formation of more separation zones ) obtained from protein mixtures.
  • the homogeneous electrophoresis plates according to the invention can be produced in a technically simple manner, for example as follows (see Figs. 1 and 2 of the accompanying drawing):
  • a clear plexiglass box (Fig. 1), glass plates with vertically glued 0.25 to 1.0 mm, preferably 0.5 mm thick spacing strips and gel-fix foils or gel-fix nets (other next glass plate loosely fixed) until the box is completely full.
  • a hose (Fig. 2) first pour a buffer solution (water) and then, under the buffer solution, a bulk gel solution is introduced. After the polymerization of the bulk gel, which in the usual way using known catalysts such as
  • TEDA Tetramethylethylenedia in (TMEDA, TEMED)
  • ammonium peroxydisulfate (NHiJ.SzO ⁇ ] is carried out within 15 min, a stacking gel with a very smooth upper limit is obtained
  • Gel-Fix films or with the Gel-Fix nets, detached and each gel layer can be welded into plastic film using a welding machine.
  • the homogeneous gels obtained can be stored for at least 12 months if stored at room temperature.
  • the paper electrode strips each have the same thickness of 6 mm, but different lengths and widths, e.g. 260 mm x 12.5 mm.
  • the cathode paper electrode strips contain cathode buffers and the
  • Anode paper electrode strips contain anode buffers (see above). When stored at room temperature, the paper electrode strips can be kept for at least 12 months.
  • the base fabric of the SDS The finished gel is a polyester film (0.2 mm) or a polyester mesh (80 ⁇ m).
  • the gel layers can be stored at room temperature and their shelf life is at least 12 months.
  • the buffers in the collecting gel layer and in the separating gel layer each have the composition shown in the table below (Tab. I):
  • the cathode and Anod ⁇ npuffer the paper electrode strips each have the compositions and III mentioned in the following Tables II ':

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese unter Verwendung eines neuartigen Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystems.

Description

B e S c h r e i b u n g
PROTEINTRENNUNG DURCH SDS-ELEKTROPHORESE IN EINEM HOMOGENEN
GEL UNTER VERWENDUNG EINES TRIS-FORMIAT -TAURINAT-
PUFFERSYSTE.BUND DAFÜR GEEIGNETE HOMOGENE
ELEKTROPHORESEPLATTEN
Die Erfindung betrifft die Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese in einem homogenen Gel unter Verwendung eines neuen Tris-Formiat-Taurinat-Puffersyste s und die dafür geeigneten homogenen Elektrophoreseplatten
Die SDS-Elektrophorese, bei der das Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) verwendet wird, ist eine relativ einfach durchzuführende und außerordentlich informative Methode zur Trennung von Proteinen nach ihrer Molekularmasse.
Es sind bereits verschiedene SDS-Elektrophoreseverfahren bekannt. Von der Firma Pharmacia LKB werden beispielsweise SDS-Gradienten-Fertiggele und Elektrodenstreifen aus Polyacrylamid mit einem Tris-Acetat-Tricinat-Puffersystem (ExcelGele) für die Durchführung einer SDS-Elektrophorese
ERSATZBLATT auf den Markt gebracht. Die von dieser Firma vertriebenen
SDS-Fertiggele bestehen aus einem Sammelgel (mit einer
Gesamtpolyacrylamidkonzentration von 5 g/dl und einem
Vernetzungsgrad von 0,03) und einem Trenngel (mit einer
Gesamtpolyacrylamidkonzentratiσn, die sich über einen
Bereich von 8 bis 18 g/dl kontinuierlich ändert, und einem Vernetzungsgrad von 0,03).
Diese Gradienten-8-18-Polyacrylamid-SDS-Fertiggele • haben jedoch den Nachteil, daß ihre Herstellung große Sorgfalt und viel Zeit erfordert, so daß diese Produkte teuer sind, und daß sie außerdem unregelmäßig trocknen, was zur Folge hat, daß sich das Gel, zusammen mit dem Träger bzw. dem Stützgewebe, auf den (das) es aufgebracht wird, verformt. Außerdem hat das angebotene Tris-Acetat-Tricinat- Puffersyste , das die Excelgele enthalten, eine niedrige Pufferkapazität, weil sein funktioneller pH-Wert von 7,1 weit entfernt von den pK -Werten des Trisions (8,2) , der Essigsäure (4,6) und des Tricins (8,0) ist.
Aufgabe der Erfindung war es daher, die SDS-Elektrophorese weiterzuentwickeln durch Verwendung homogener Gele, die einfacher und billiger herzustellen sind, und eines Puffersystems mit einer höheren Pufferkapazität.
Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst werden kann, daß die SDS-Elektrophorese durchgeführt wird unter Verwendung homogener Sa mel- und Trenngele mit einem spezifischen Gehalt an Polyacrylamid innerhalb des Bereiches von 4 bis 24 g/dl und mit einem Vernetzungsgrad von 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04, in Kombination mit einem Tris-For iat-Taurinat-Puffersystem, dessen funktioneller pH-Wert in dem Bereich von 8,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 8,5, und damit wesentlich näher bei den pKc -Werten des Trisions (8,2) und des Taurins (8,9) liegt, so daß es eine deutlich höhere Pufferkapazität aufweist. Die hier beschriebene neue Methode zur Durchführung der SDS- Elektrophorese unter Verwendung homogener Fertiggele in einem neuartigen Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem, vermeidet die arbeitsintensive und kostspielige Gradiεntenkonzentration der bekannten SDS-Fertiggele und verbessert die Trennung von Proteinen. Da die erfindungsgemäß verwendeten homogenen Gele leicht und technisch einfach herstellbar sind, verbilligt sich dadurch ganz erheblich das SDS-Elektrophoreseverfahren.
Die Konzentration des Polyacryla ids (ein Polymer aus Acrylamid und Bisacrylamid) in den erfindungsgemäß verwendeten homogenen Sammel- und Trenngelen beträgt 4 bis 5, vorzugsweise 5, g/dl, bzw. 8 bis 24, vorzugsweise 12, g/dl, und sein Vernetzungsgrad liegt bei 0,02 bis 0,05, vorzugsweise bei 0,04.
Zur Erhöhung der niedrigen Kapazität des bekannten ExcelGel- Puffersystems wurde ein Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem entwickelt, bei dem das For iation (das Ion der Ameisensäure) als Leition, das Taurination (das Ion des Taurins) als Folgeion, und das Trision als Gegenion fungieren. Der funktioneile pH-Wert dieses Puffersystems liegt bei 8,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 8,5, und damit nahe bei dem pKc -Wert des Trisions (8,2) und des Taurins (8,9) .
Anstelle der Ameisensäure kann auch eine starke Säure (beispielsweise Salzsäure) verwendet werden. Anstelle des Taurins können auch Taurinderivate und andere strukturähnliche Verbindungen (beispielsweise Amino ethansulfonsäure, 3-Aminopropansäure, Alanin, ß-Alanin, 2-Aminoethanphosphonsäure,
2-Aminoethylschwefelsäure, Cystein, Serin und Threonin) verwendet werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine wäßrige Lösung des zu trennenden Proteingemisches auf eine homogene Gelschicht einer Elektrophoreseplatte, bestehend aus einer homogenen Sammeigelschicht und einer homogenen Trenngelschicht, die beide ein Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem enthalten, auf einem Träger bzw. Stützgewebe, aufgebracht und nach dem Auflegen von zwei Papierelektrodenstreifen durch Anlegen eines Gleichstromes in an sich bekannter Weise eine SDS- Elektrophorese durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, die aus einem Träger bzw. einem Stützgewebe mit einer darauf aufgebrachten Sammeigelschicht und einer Trenngelschicht besteht, die beide ein Tris- Formiat-Taurinat-Puffersystem enthalten und jeweils einen aufgelegten Papierelektrodenstreifen tragen.
Vorzugsweise wird eine Elektrophoreseplatte verwendet, deren Sammeigelschicht Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C = 0,04 in einer homogenen Konzentration T = 5 g/dl sowie 30 g/dl Glycerin in einem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem enthält. Ihre Trenngelschicht enthält vorzugsweise Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C = 0,04 in einer homogenen Konzentration T = 12 g/dl sowie 10 g/dl Glycerin in einem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem.
Als Träger bzw. Stützgewebe wird vorzugsweise eine etwa 0,2 mm dicke Folie aus Polyester bzw. ein Netz aus Polyester¬ oder Glasfasern verwendet, in der (dem) die der Gelschicht zugewandte Oberfläche hydrophil ist.
Das Puffersystem der Sammeigelschicht und der
Trenngelschicht besteht jeweils aus 0,1 bis 0,6 mol/1 (1,21 bis 7,27 g/dl), vorzugsweise 0,389 mol/1 (4,71 g/dl) , Tris-
(hydroxymethyl) -aminomethan (TRIS) , 0,1 bis 0,4 mol/1 (0,38 bis 1,52 ml/dl), vorzugsweise 0,3 mol/1 (1,14 ml/dl), Ameisensäure und 0,001 bis 0,004 mol/1 (0,03 bis 0,12 g/dl), vorzugsweise 0,002 mol/1 (0,06 g/dl), Natriumdodecylsulfat (SDS) und hat jeweils einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8.
Die Papierektrodenstreifen enthalten ein Puffersystem aus
0,2 bis 1,2 mol/1 (2,42 bis 12,11 g/dl), vorzugsweise 0,589 mol/1 (7,13 g/dl), TRIS, 0,2 bis 1,6 mol/1 (2,50 bis 15,02 g/dl), vorzugsweise 0,802 mol/1 (10,04 g/dl), Taurin
(2-Amino-ethansulfonsäure) und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl), SDS mit einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0, vorzugsweise von 8,5
(Kathodenpuffer), bzw. aus 0,4 bis 1,6 mol/1 (4,85 bis 19,38 g/dl), vorzugsweise 1,295 mol/1 (15,69 g/dl), TRIS, 0,25 bis
1,50 mol/1 (0,95 bis 5,72 ml/dl), vorzugsweise 1,0 mol/1
(3,81 ml/dl), Ameisensäure und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl), SDS mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8
(Anodenpuffer) .
Die SDS-Elektrophorese kann erfindungsgemäß als horizontale oder vertikale oder auch als zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt werden. Sie kann analytisch oder als Blotting- Elektrophorese eingesetzt werden, wobei nach der Durchführung der SDS-Elektrophorese die voneinander getrennten Proteine auf an sich bekannce Weise fixiert und mittels einer Färbelösung angefärbt werden. Die SDS- Elektrophorese wird bei einer Spannung von 50 bis 600 V innerhalb 0,5 bis 2 Stunden durchgeführt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich beispielsweise Leber-, Muskel-, Marker-, Milz-, Erdnuß-, Globulin-, ' Schlangengift-, Escherichia-coli-, We_. ..-, Reis-, Zwiebel-, Bohnen-, Linsen-, Erbsen-, Sonnenblumen-, Haselnußproteine in einer Konzentration von vorzugsweise 0,250 bis 0,125 mg/ml zuverlässig voneinander trennen. Die Proteine werden in mit SDS denaturierter Form eingesetzt.
Die Fixierung der voneinander getrennten Proteine nach Durchführung der SDS-Elektrophorese erfolgt 2 bis 3 mal je 10 bis 15 min mit 0,5 g/dl Glutardialdehyd in 50 ml/dl Ethanol bei 60 ° C oder Raumtemperatur.
Die Anfärbung zur Sichtbarmachung der Proteine erfolgt in an sich bekannter Weise unter Verwendung einer Färbelδsung, vorzugsweise einer Lösung von Coomassie Brillantblau R 250 oder einer Silberfärbungslδsung.
Das Aufbringen der Proben mit den voneinander zu trennenden Proteinen erfolgt auf das Sammelgel mit der Hilfe eines Applikatorstreifens, wobei Probenvolumina von 1 bis 20 μl aufgegeben werden können. Auf einem Gel können bis zu 50 Proben auf einmal getrennt werden.
Die erfindungsgemäße SDS-Elektrophorese erlaubt eine schnelle und wirksame Trennung von Proteinen im Molekular assenbereich von 6 000 bis 450 000. Die dabei erzielten Banden sind schärfer als bei den bekannten SDS- Elektrophorese-Systemen und es wird eine deutlich höhere Auflösung (Ausbildung von mehr Trennzonen) von Proteingemischen erzielt.
Die erfindungsgemäßen homogenen Elektrophoreseplatten lassen sich auf technisch einfache Weise, beispielsweise wie folgt, herstellen (vgl. Abb. 1 und 2 der beiliegenden Zeichnung) :
In einem durchsichtigen Plexiglaskasten (Abb. 1) werden vertikal und nacheinander Glasplatten mit vertikal aufgeklebten 0,25 bis 1,0 mm, vorzugsweise 0,5 mm dicken Abstandsstreifen, und Gel-Fix-Folien oder Gel-Fix-Netzen (an -der nächsten Glasplatte locker fixiert) angeordnet, bis der Kasten ganz voll ist. Mit einem Schlauch (Abb. 2) wird zuerst eine Pufferlösung (Wasser) eingegossen und dann wird, unter die Pufferlösung eine Sammelgellösung eingeführt. Nach der Polymerisation des Sammelgels, die auf übliche Weise unter Verwendung von bekannten Katalysatoren wie
Tetramethylethylendia in (TMEDA, TEMED) und
Ammoniumperoxydisulfat [(NHiJ.SzOβ] innerhalb 15 min durchgeführt wird, erhält man ein Sammelgel mit einer ganz glatten oberen Grenze. Die überstehende Pufferlösung
(Wasser) wird abgesaugt, z. B. mit einer Wasserstrahlpumpe und dann wird eine Trenngellösung zur Herstellung des
Trenngels von oben her eingegossen. Nach der Durchführung der Polymerisation des Trenngels auf die vorstehend beschriebene Weise werden die Gelschichten zusammen mit den
Gel-Fix-Folien bzw. mit den Gel-Fix-Netzen, herausgelöst und jede Gelschicht kann unter Verwendung eines Schweißgerätes in Kunststoffolie eingeschweißt werden. Die dabei erhaltenen homogenen Gele sind bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur mindestens 12 Monate haltbar.
Die Papierelektrodenstreifen haben jeweils die gleiche Stärke von 6 mm, aber verschiedene Längen und Breiten, z.B. 260 mm x 12,5 mm. Die Kathodenpapierelektrodenstreifen enthalten Kathodenpuffer und die
Anodenpapierelektrodenstreifen enthalten Anodenpuffer (s.o.) . Bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur sind die Papierelektrodenstreifen mindestens 12 Monate haltbar.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert, in denen Rezepte für homogene SDS-Fertiggele mit verschiedener Konzentration des Trenngels (T, g/dl) angegeben sind.
In den Beispielen 1 bis 7 haben die Gelschichten unterschiedliche Maße, die Matrix besteht aus Polyacrylamid, die Sammeigelschicht (T = 5 g/dl, C = 0,04) macht 1/4 bis 1/3 der gesamten Gelschicht aus, die Trenngelschicht (T = 8, 10, 12, 14, 16, 18 oder 20 g/dl, C = 0,04) macht 3/4 bis 2/3 der gesamten Gelschicht aus. Das Trägergewebe der SDS- Fertiggele ist eine Polyesterfolie (0,2 mm) oder ein Polyesternetz (80 um) . Die Gelschichten können bei Raumtemperatur gelagert werden und ihre Haltbarkeit beträgt mindestens 12 Monate. Im übrigen haben die Puffer in der Sammeigelschicht und in der Trenngelschicht jeweils die nachstehend tabellarisch angegebene Zusammensetzung (Tab. I) :
Tab. I. Zusammensetzung der Gelschichtpuffer
Figure imgf000010_0001
PH 8,19 8,07 7,93 7,78 7,61 7,40 7,14
Die Kathoden- und Anodεnpuffer der Papierelektrodenstreifen haben jeweils die in den folgenden Tabellen II und III angegebene Zusammensetzungen':
Tab. II. Zusammensetzung der Kathodenpuffer
T, g/dl 8 10 12 14 16 18 20
TRIS, g 15,04 11,96 9,35 7,13 5,26 3,69 2,40
Taurin, g 10,04 10,04 10,04 10,04 10,04 10,04 10,04
SDS, g 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 Dest. H2O ad 100 ml pH 8,70 8,63 8,55 8,47 8,38 8,27 8,13
Tab. III. Zusammensetzung der Anodenpuffer
T, g/dl 8 10 12 14 16 18 20
TRIS, g 21,29 19,01 17,17 15,69 14,51 13,61 12,94
Ameisensäure, ml 3,81 3,81 3,81 3,81 3,81 3,81 3,81
SDS, g 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 Dest. H2O ad 100 ml pH 8,19 8,07 7,93 7,78 7,61 7,40 7,14

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß eine wäßrige Lösung des zu trennenden Proteingemisches auf eine homogene Gelschicht einer Elektrophoreseplatte, bestehend aus einer homogenen Trenngelschicht und einer homogenen Sammeigelschicht, die beide ein Tris-Formiat- Taurinat-Puffersystem enthalten, auf einem Träger bzw. Stützgewebe, aufgebracht und nach dem Auflegen von zwei Papierelektrodenstreifen durch Anlegen eines Gleichstromes in an sich bekannter Weise eine SDS-Elektrophorese durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophoreseplatte verwendet wird, deren Sammeigelschicht Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad von 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04, in einer homogenen Konzentration von 4 bis 5, vorzugsweise 5, g/dl, sowie 30 g/dl Glycerin in dem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophoreseplatte verwendet wird, deren Trenngelschicht Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C = 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04 in einer homogenen Konzentration T = 8 bis 24, vorzugsweise 12, g/dl, sowie 10 g/dl Glycerin in dem Tris-Formiat-Taurinat-Puffersystem enthält.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichn'et, daß eine Elektrophoreseplatte mit einer etwa 0,2 mm dicken Trägerfolie aus Polyester oder einem Trägernetz aus Polyester- oder Glasfasern verwendet wird, deren (dessen) der Gelschicht zugewandte Oberfläche hydrophil ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Puffersystem der Sammelgelschicht und der Trenngelschicht jeweils besteht aus 0,1 bis 0,6 mol/1 (1,21 bis 7,27 g/dl), vorzugsweise 0,389 mol/1 (4,71 g/dl) , Tris (hydroxymethyl)a inomethan (TRIS), 0,1 bis 0,4 mol/1 (0,38 bis 1,52 ml/dl), vorzugsweise 0,3 mol/1 (1,14 ml/dl) , Ameisensäure und 0,001 bis 0,004 mol/1 (0,03 bis 0,12 g/dl) , vorzugsweise 0,002 mol/1 (0,06 g/dl), Natriumdodecylsulfat (SDS) und jeweils einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8, hat.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Papierelektrodenstreifen ein Puffersystem aus 0,2 bis 1,2 mol/1 (2,42 bis 12,11 g/dl), vorzugsweise 0,589 mol/1 (7,13 g/dl), TRIS, 0,2 bis 1,6 mol/1 (2,50 bis 15,02 g/dl), vorzugsweise 0,802 mol/1 (10,04 g/dl) , Taurin und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl) , SDS mit einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0, vorzugsweise von 8,5 (Kathodenpuffer) , bzw. aus 0,4 bis 1,6 mol/1 (4,85 bis 19,38 g/dl), vorzugsweise 1,295 mol/1 (15,69 g/dl), TRIS, 0,25 bis 1,50 mol/1 (0,95 bis 5,72 ml/dl), vorzugsweise 1,0 mol/1 (3,81 ml/dl) , Ameisensäure und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl) , vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl), SDS mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8 (Anodenpuffer) enthalten.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die SDS-Elektrophorese als horizontale oder vertikale Elektrophorese, oder als zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die SDS-Elektrophorese bei einer Spannung von 50 bis 600 V innerhalb 0,5 bis 2 Stunden durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die SDS-Elektrophorese als analytische oder Blotting-Elektrophorese durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß nach Durchführung der SDS-Elektrophorese die voneinander getrennten Proteine 2 bis 3 mal je 10 bis 15 min mit 0,5 g/dl Glutardialdehyd in 50 ml/dl Ethanol bei 60 °C oder Raumtemperatur fixiert und dann mittels einer Färbelösung angefärbt werden.
11. Homogene Elektrophoreseplatte zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese, insbesondere nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Träger, bzw. Stützgewebe und einer darauf aufgebrachten Sammelgelschicht und einer Trenngelschicht besteht, die beide ein neuartiges Tris- Formiat-Taurinat-Puffersystem enthalten und jeweils einen aufgelegten Papierelektrodenstreifen tragen.
12. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelgelschicht Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C = 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04, in einer homogenen Konzentration T = 4 bis 5, vorzugsweise 5, g/dl, sowie 30 g/dl Glycerin in dem Tris-Formiat- Taurinat-Puffersystem enthält.
13. Elektrophoreseplatte nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Trenngelschicht Polyacrylamid mit einem Vernetzungsgrad C = 0,02 bis 0,05, vorzugsweise 0,04, g/dl in einer homogenen Konzentration T = 8 bis 20, vorzugsweise 12, g/dl, sowie 10 g/dl Glycerin in dem Tris- Formiat-Taurinat-Puffersystem enthält. 14. Elektrophoreseplatte nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Puffersystem der Sammelgelschicht und der Trenngelschicht jeweils besteht aus 0,1 bis 0,6 mol/1 (1,21 bis 7,27 g/dl), vorzugsweise 0,389 mol/1 (4,71 g/dl) TRIS, 0,1 bis 0,4 mol/1 (0,38 bis 1,52 ml/dl), vorzugsweise 0,3 mol/1 (1,
14 ml/dl) Ameisensäure und 0,001 bis 0,004 mol/1 (0,03 bis 0,12 g/dl) , vorzugsweise 0,002 mol/1 (0,06 g/dl) SDS und jeweils einen pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise von 7,8 hat.
15. Elektrophoreseplatte nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Papierelektrodenstreifen jeweils ein Puffersystem aus 0,2 bis 1,2 mol/1 (2,42 bis 12,11 g/dl), vorzugsweise 0,589 mol/1 (7,13 g/dl) TRIS, 0,2 bis 1,6 mol/1 (2,50 bis 15,02 g/dl) , vorzugsweise 0,802 mol/1 (10,04 g/dl) Taurin und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl), vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl) SDS mit einem pH-Wert von 8,0 bis 9,0, vorzugsweise 8,5 (Kathodenpuffer), bzw. aus 0,4 bis 1,6 mol/1 (4,85 bis 19,38 g/dl), vorzugsweise 1,295 mol/1 (15,69 g/dl) TRIS, 0,25 bis 1,50 mol/1 (0,95 bis 5,72 ml/dl), vorzugsweise 1,0 mol/1 (3,81 ml/dl) Ameisensäure und 0,002 bis 0,01 mol/1 (0,06 bis 0,29 g/dl) , vorzugsweise 0,007 mol/1 (0,20 g/dl) SDS mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5, vorzugsweise 7,8 (Anodenpuffer) enthalten.
16. Verwendung der homogenen Elektrophoreseplatte nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Durchführung einer Proteintrennung durch SDS-Elektrophorese.
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