DE69227181T2

DE69227181T2 - Polyacrylamid-Gel für Elektrophorese

Info

Publication number: DE69227181T2
Application number: DE1992627181
Authority: DE
Inventors: Takashi Hiratsuka-Shi Kanagawa-Ken Iizuka; Youichi Apt. Cesar Samukawa 304 Kouza-Gun Kanagawa-Ken 253-01 Koshiji; Hidehiro Yokohama-Shi Kanagawa-Ken Kubota; Hisao Zama-Shi Kanagawa-Ken Takeda
Original assignee: Atto Corp; Hymo Corp
Current assignee: Atto Corp; Hymo Corp
Priority date: 1992-04-21
Filing date: 1992-04-21
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2012-04-22
Also published as: DE566784T1; DE69227181D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Polyacrylamidgel für die Elektrophorese sowie auf ein Verfahren zum Herstellen desselben, das auf dem Gebiet der Biochemie und Medizin zum Abtrennen und Analysieren von Substanzen biologischen Ursprungs, beispielsweise Proteinen und Nukleinsäuren, verwendet werden soll.
Es wurden bisher in der Elektrophorese Papier, Agarose und Stärke als Gelmatrix verwendet. Diese Gelmatrizen haben jedoch eine schlechte Trennkraft und ergeben daher nur unklare Bänder.
In den letzten Jahren wurden Elektrophoreseverfahren entwickelt, bei denen Polyacrylamidgele als Gelmatrix verwendet werden. So ist zu erwarten, daß eine ausgezeichnete Trennkraft mittels eines höchst genauen molekularen Siebeffekts dadurch erzielt werden kann.
Insbesondere wird hauptsächlich ein Elektrophoreseverfahren unter Verwendung eines vernetzten Polyacrylamidgels, das eine elektrolytische Lösung enthält, in der elektrophoretischen Analyse gegenwärtig verwendet, da die Porengröße des Gels willkürlich gesteuert werden kann, indem die Acrylamidkonzentration und die Zusammensetzung des Vernetzungsmittels verändert werden. Ein für jeden Zweck geeignetes Gel kann nämlich in Abhängigkeit vom Molekulargewicht der zu trennenden Substanz, z. B. eines Proteins oder einer Nukleinsäure, hergestellt werden. Im allgemeinen kann ein Polyacrylamidgel mit einer verhältnismäßig hohen Konzentration zum Abtrennen von Proteinen und Nukleinsäuren mit verhältnismäßig niedrigen Molekulargewichten verwendet werden, während ein Polyacryl amidgel niedriger Konzentration zum Abtrennen von Proteinen und Nukleinsäuren mit verhältnismäßig hohen Molekulargewichten verwendet werden kann.
Diese Verfahren sind beispielsweise in den Japanischen Patent-Offenlegungsschriften Nr. 502456/1988, Nr. 91850/1987 und Nr. 22555/1990 beschrieben.
Die Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 502456/1988 beschreibt ein Verfahren zum Liefern einer Pufferlösung in einem Elektrophorese-Trennverfahren. Bei diesem Verfahren wird eine Elektrodenlösung, die allgemein in Form einer Flüssigkeit verwendet wird, zu einem Gel zusammengestellt, um den Kontakt derselben mit einem für die Trennung verwendeten Gel zu erleichtern. Eine Pufferlösung wird nämlich bei horizontaler Elektrophorese mit Verwendung einer Trägermatrix in Form einer Gelplatte zugeführt. Zwei Elektroden-Pufferlösungen werden jeweils in einen Gelteil eingebracht. Sodann werden diese Gelteile mit der Trägermatrix derart kontaktiert, daß die Matrix zwischen den Gelteilen den zur Verfügung stehenden Trennbereich ergibt. Die Gelteile bestehen aus Agarose oder Polyacrylamid. Der Gehalt des Elektrodenpuffers in jedem Gelteil liegt zwischen 80 und 99 Gew.-%.
Die Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 91850/1987 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines Mediums für wäßrige Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Dieses Verfahren bezieht sich auf die Vernetzungspolymerisierung eines Acrylamidmonomers in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels, Wasser und eines Polymerisierungs-Auslösemittels, wobei das Polymerisierungs-Auslösemittel aus einer Kombination eines Peroxids, eines Photosensibilisators und erregtem Licht besteht und keinerlei Reduktionsmittel enthält.
Die Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 22555/1990 beschreibt eine Elektrophorese-Gelmediumzusammenstellung, die zweckmäßigerweise zur Bildung eines polymeren. Polyacrylamid- Gelmediums verwendet wird.
Ferner wurden Verfahren vorgeschlagen, die sich auf ein Gradientengel beziehen, wobei die Acrylamidkonzentration gegen die Elektrophoreserichtung ständig verändert wird, um Proteine oder Nukleinsäuren mit einer weiten Molekulargewichtsverteilung zu trennen, z. B. in den Japanischen Patent- Offenlegungsschriften Nr. 28512/1986, Nr. 210654/1988 und Nr. 263548/1989.
Die Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 28512/1986 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Elektrophorese-Gelmaterials. Bei diesem Verfahren wird eine Polymerisierung in einem homogenen Photopolymerisationssystem ausgelöst, wobei ein wasserlöslicher organischer Initiator verwendet wird, oder in einem heterogenen Photopolymerisierungssystem, wobei ein organischer Initiator in einer wäßrigen Photopolymerisierungslösung suspendiert oder dispergiert wird, um ein Gradientengel mit einem kontinuierlichen Porengröße-Gradienten zu erzeugen.
Die Japanischen Patent-Offenlegungsschriften Nr. 210654/1988 und Nr. 263548/1989 beschreiben Medien für die Elektrophorese. Jedes dieser Patente sieht nämlich ein Gelmedium mit einem verbesserten Gradienten der wäßrigen Polyacrylamid-Gelkonzentration und einem im wesentlichen gleichen, ausgezeichneten Trennvermögen sowohl im Bereich niedrigen Molekulargewichts als auch im Bereich hohen Molekulargewichts vor.
Ferner beschreibt die Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 302153/1989 ein Verfahren zur Herstellung eines Gels für die Elektrophorese, wobei die Acrylamidkonzentration stufenweise geändert wird. Bei diesem Verfahren werden wäßrige Lösungen von Monomeren, deren Acrylamidkonzentration sich voneinander unterscheidet, nacheinander aufgeschichtet, gefolgt von Polymerisierung, wodurch sich ein Gel für die Elektrophorese ergibt.
Bei diesem bekannten Verfahren liegt die Konzentration des Polyacrylamids, das ein Gel bildet, praktisch zwischen 4 und 20 Gew.-%. Wenn die Acrylamidkonzentration niedriger liegt als 4 Gew.-%, kann keine ausreichende Gelstärke erzielt werden. Wenn sie andererseits 20 Gew.-% übersteigt, neigt das erhaltene Gel dazu, sich von der Innenwand eines Behälters abzuschälen.
Ferner ist es möglich, Proteine auf der Basis nur eines Unterschieds im Molekulargewicht zwischen demselben zu trennen, indem sie mit Natriumdodecylsulfat (nachfolgend als SDS bezeichnet) behandelt werden, um die Ladungen der Proteinmoleküle vor der Durchführung der Elektrophorese gleichmäßig zu machen. In dieser Hinsicht wird insbesondere Laemmlis Formulierung, wobei Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (nachfolgend als Tris bezeichnet), teilweise neutralisiert durch Salzsäure, als Gelpufferlösung und Tris-Glycinsalz als die Elektrophorese-Elektrodenlösung, verwendet wird, vorteilhafterweise auf Proteinanalyse angewendet (siehe U. K. Laemmli, Nature, 227, 680(1970)). In der in dieser Laemmlis-Formulierung zu verwendenden elektrolytischen Gellösung ist etwa 10 bis 20 Mol-% Tris neutralisiert, um einen pH-Wert von 8,8 zu erreichen.
Wie oben beschrieben, beträgt der pH-Wert der elektrolytischen Lösung, die in dem in der Laemmlis-Formulierung zu verwendenden Polyacrylamidgel enthalten ist, 8,8, und Amidgruppen werden mit dem Verstreichen der Zeit hydrolisiert. Die Hydrolyse kann auch bei einer niedrigen Temperatur fortschreiten, beispielsweise in einem Kühlschrank, und das Polyacrylamidgel erhält teilweise anionische Gruppen. Infolgedessen wird die Elektrophoresestrecke eines Proteins verkürzt und sein Elektrophoresemuster wird unscharf. Wenn die prozentuale Neutralisierung von Tris hoch ist und der pH-Wert der elektrolytischen Gellösung auf einen neutralen Wert oder niedriger eingestellt wird, um die Hydrolyse zu verhindern, wird das Trennvermögen der Proteine entsprechend der Differenz des Molekulargewichts verschlechtert, und das Polyacrylamidgel steht in der Praxis nicht mehr zur Verfügung.
Ferner wird der Molekulargewichtsbereich von Proteinen, die unter Verwendung eines Polyacrylamidgels mit einer Acrylamidkonzentration von 4-20 Gew.-% analysiert werden können, nämlich in einem praktisch anwendbaren Acrylamid-Konzentrationsbereich, wie oben beschrieben, eingeschränkt. Wenn Laemmlis elektrolytische Lösung verwendet wird, stehen Gele mit Acrylamidkonzentrationen von 4 Gew.-% und 20 Gew.-% jeweils für die Trennung von Proteinmolekülen von 500 000 und 20 000 Molekulargewicht höchstens zur Verfügung. So war es dringend erforderlich, den meßbaren Molekulargewichtsbereich ferner zu erweitern.
Es ist ein Ziel der Erfindung, die oben erwähnten Probleme zu lösen, indem ein Polyacrylamidgel für die Elektrophorese und ein Verfahren zur Herstellung desselben geschaffen wird, das stabil bleibt, auch wenn es über eine längere Zeit gelagert wird, und zum Analysieren von Substanzen eines extrem weiten Molekulargewichtsbereichs in der Elektrophorese zur Bestimmung des Molekulargewichts zur Verfügung steht.
Demgemäß schafft die Erfindung ein Polyacrylamidgel zur Verwendung bei der Elektrophorese, wobei das Polyacrylamidgel eine wäßrige Elektrolytlösung enthält, die eine Säure, ein Amin und einen Ampholyten enthält, wobei der Ampholyt die gleiche Anzahl von anionischen und kationischen Gruppen in einem einzelnen Molekül aufweist, der pH-Wert der Elektrolytlösung zwischen 4 und 7,5 liegt und das Verhältnis des Amins zu der Säure zwischen 1 : 0,6 und 1 : 1 Grammäquivalentteile beträgt, das Verhältnis der Säure zum Ampholyten zwischen 1 : 0,5 und 1 : 4 Grammäquivalentteile beträgt, der pKa-Wert des Amins zwischen 8 und 8,5 liegt, der pKa-Wert des Ampholyten zwischen 7 und 11 liegt und der pKa-Wert der Säure nicht höher als 5 liegt.
So wird ein Polyacrylamidgel geschaffen, das zur Bestimmung von Molekulargewichten in einem weiten Bereich geeignet ist, wobei der pH-Wert der elektrolytischen Lösung im Polyacrylamidgel soweit abgesenkt wird, daß er nicht irgendeine Hydrolyse der Amidgruppen bewirkt, während eine geeignete Potentialgradientenverteilung im Gel während der Elektrophorese erzielt wird.
Die Erfindung schafft ferner ein Medium für die Elektrophorese, das besteht aus einem Polyacrylamidgel wie oben beschrieben, und eine wäßrigen Elektrophorese-Elektrodenlösung, die ein Amin und einen Ampholyten enthält, wobei der pKa-Wert des Ampholyten in der Elektroylselösung nicht größer ist als derjenige des Ampholyten in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite, und nicht größer ist als derjenige des Ampholyten, der bei Betrieb von der Elektrodenlösung zum Gel wandert.
In dem Polyacrylamidgel/Elektrophoresemedium gemäß der Erfindung wird bevorzugt, daß das Amin in der Elektrophorese-Elektrodenlösung und das Amin in der elektrolytischen Lösung des Gels Tris-(hydroxymethyl)aminomethan ist.
In dem Polyacrylamidgel für die Elektrophorese gemäß der Erfindung liegt der pH-Wert der elektrolytischen Lösung des Gels zwischen 4 und 7,5.
Im Elektrophoresemedium gemäß der Erfindung wird bevorzugt, daß die Elektrophorese-Elektrodenlösung auf der Kathodenseite 0,01 Gew.-% oder mehr eines Salzes von Dodecylsulfat enthält.
Im erfindungsgemäßen Elektrophoresemedium wird bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welchem Dodecylsulfationen in der Elektrophorese zugefügt werden.
Im erfindungsgemäßen Elektrophoresemedium ist der pKa-Wert des in der elektrolytischen Lösung im Gel enthaltenen Ampholyten der gleiche und/oder niedriger als der pKa-Wert des in der Elektrophorese-Elektrodenlösung auf der Kathodenseite enthaltenen Ampholyten.
Im erfindungsgemäßen Elektrophoresemedium hat jeder der in der Elektrodenlösung und in der elektrolytischen Lösung im Gel verwendeten Ampholyten anionische Gruppen und kationische Gruppen der gleichen Anzahl in einem einzigen Molekül.
Im erfindungsgemäßen Elektrophoresemedium wird bevorzugt, daß der in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite verwendete Ampholyt aus Glycin, Serin, Asparagin, β-Alanin, N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure und N-tris(hydroxymethyl)-methylglycin ausgewählt ist.
Im erfindungsgemäßen Elektrophoresemedium wird bevorzugt, daß der in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite zu verwendende Ampholyt Glycin oder N-tris(hydroxymethyl)methylglycin ist.
In dem erfindungsgemäßen Polyacrylamidgel für die Elektrophorese wird bevorzugt, daß der in der elektrolytischen Lösung im Gel zu verwendende Ampholyt aus Glycin, Serin, Asparagin, β-Alanin, N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propansulfon säure, N-tris(hydroxymethyl)methylglycin, N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure und Mischungen derselben ausgewählt ist.
Im erfindungsgemäßen Polyacrylamidgel für die Elektrophorese wird bevorzugt, daß die in der elektrolytischen Lösung im Gel zu verwendende Säure eine einbasige Säure ist.
Im erfindungsgemäßen Polyacrylamidgel für die Elektrophorese wird insbesondere bevorzugt, daß die in der elektrolytischen Lösung im Gel zu verwendende Säure aus Salzsäure, Essigsäure und Mischungen derselben ausgewählt ist.
Ferner bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Polycarylamidgels, wobei das Verfahren das Polymerisieren von Acrylamid in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels, Wasser, einer Elektrolytlösung und eines die Polymerisierung auslösenden Mittels umfaßt, die Elektrolytlösung aus einer wäßrigen Lösung besteht, die eine Säure, ein Amin und einen Ampholyten enthält, der Ampholyt die gleiche Anzahl von anionischen und kationischen Gruppen in einem einzelnen Molekül aufweist, der pH-Wert der Elektrolytlösung zwischen 4 und 7,5 liegt und wobei das Verhältnis des Amins zur Säure zwischen 1 : 0,6 und 1 : 1 Grammäquivalentteile und das Verhältnis der Säure zum Ampholyten zwischen 1 : 0,5 und 1 : 4 Grammäquivalentteile beträgt, der pKa-Wert des Amins zwischen 8 und 8,5 liegt, der pKa-Wert des Ampholyten zwischen 7 und 11 liegt und der pKa-Wert der Säure nicht höher als 5 liegt.
Im Verfahren zu Herstellung eines erfindungsgemäßen Polyacrylamidgels für die Elektrophorese können 1 bis 10 Gew.-% auf der Basis der gesamten Monomeren einer Divinylverbindung copolymierisiert werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Poly acrylamidgels für die Elektrophorese wird bevorzugt, daß die Divinylverbindung N,N-methylenbisacrylamid ist.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Polyacrylamidgels für die Elektrophorese wird bevorzugt, daß das Polymerisierungs-Auslösemittel aus einem Redox-Initiator besteht.
Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Polyacrylamidgels für die Elektrophorese wird insbesondere bevorzugt, daß das Polymerisierungs-Auslösemittel aus einem Polymerisierungskatalysator besteht, der aus einem Peroxid und N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin besteht.
Die Erfindung wird nunmehr lediglich beispielhaft ausführlicher beschrieben.
Im erfindungsgemäßen Polyacrylamidgel für die Elektrophorese ist erwünscht, daß die die elektrolytische Lösung des Gels bildende Säure, welche den pH-Wert der elektrolytischen Lösung absenkt, auch wenn sie in einer kleinen Menge zugegeben wird, in einem solchen Ausmaß, daß sie die Hydrolyse der Amidgruppen nicht bewirkt, eine große Dissozierungskonstante und einen pKa-Wert von 5 oder darunter besitzt. Insbesondere umfassen bevorzugte Beispiele für dieselbe Salzsäure und einbasige wasserlösliche organische Säuren.
Der erfindungsgemäß zu verwendende Ampholyt hat anionische Gruppen und kationische Gruppen in der gleichen Anzahl in einem einzigen Molekül. Bei einem etwas niedrigeren pH-Wert als der pKa-Wert dissoziieren alle die anionischen Gruppen und alle die kationischen Gruppen, wodurch ein elektrisch neutraler Zustand erzielt wird. Bei einem pH-Wert, der etwas höher ist als der pKa-Wert, dissoziieren andererseits nur die anionischen Gruppen, während die Dissoziierung der kationi schen Gruppen unterdrückt wird. So wird der Ampholyt in diesem Fall negativ geladen.
So wirkt dementsprechend der oben erwähnte Ampholyt im wesentlichen als einbasige schwache Säure. So wird das oben als sein Gehalt angegebene Teile/Grammäquivalent als einbasige schwache Säure berechnet. Der pKa-Wert wird gewöhnlich bei 20ºC gemessen. Ein Ampholyt mit einem pKa-Wert von 11 oder darüber trägt nicht zur Reduzierung des Potentialgradienten bei, während einer mit einem pKa-Wert von 7 oder darunter zusammen mit leitenden Ionen abfließt (Säureradikalen mit einem pKa-Wert von 5 oder darunter, die in der elektrolytischen Lösung im Gel enthalten sind).
Beispiele für den erfindungsgemäß zu verwendenden Ampholyten umfassen Glycin, Serin, Asparagin, β-Alanin, N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure (nachfolgend einfach als TAPS bezeichnet), N-tris(hydroxymethyl)methylglycin (nachfolgend einfach als Tricin bezeichnet) und N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (nachfolgend einfach als TES bezeichnet).
Der pKa-Wert des die elektrolytische Lösung in dem Gel bildenden Ampholyten darf denjenigen des die Elektrodenlösung auf der Kathodenseite bildenden Ampholyten nicht übersteigen. Ferner muß der pKa-Wert des an der Reduzierung des elektrischen Potentialgradienten teilnehmenden Ampholyten der gleiche sein oder niedriger als derjenige des Ampholyten, der von der Elektrodenlösung zum Gel wandert, d. h. der Wanderionen. Entweder eine oder mehrere Substanzen können in Abhängigkeit vom Zweck als der die elektrolytische Lösung im Gel bildende Ampholyt gewählt werden. Wenn zwei oder mehr Ampholyten verwendet werden, wandern sie nacheinander zur Anodenseite in ihrer Reihenfolge des pKa-Werts, und infolgedessen wird der Potentialgradient im Gel allmählich verändert. So kann der Bereich des zu bestimmenden Molekulargewichts erweitert werden, ähnlich wie in dem Fall, wenn die Acrylamidkonzentration geändert wird.
Das erfindungsgemäße Polyacrylamidgel für die Elektrophorese kann durch das bekannte Verfahren hergestellt werden, mit der Ausnahme, daß der pH-Wert der elektrolytischen Lösung im Gel gesteuert und daß der Ampholyt oder die Ampholyten zugegeben werden. Beispielsweise wird am häufigsten N,N-methylenbisacrylamid (nachfolgend einfach als BIS bezeichnet) als wasserlösliche Divinylverbindung zur Vernetzung verwendet. Andere gewöhnliche Divinylverbindungen, wie N,N-diallyltartramid, können erfindungsgemäß verwendet werden. Die Divinylverbindung wird vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 bis 10 Gew.-% auf der Basis der gesamten Monomere copolymerisiert.
Um dem Gel eine Elastizität zu erteilen und seine Sprödigkeit zu verbessern, kann die wäßrige Monomerlösung ferner wasserlösliche Polymere enthalten, wie Agarose, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenoxid oder Polymethylvinylether. Alternativ können 20 Gew.-% oder weniger nichtionisches Monovinyl-Monomer außer Acrylamid damit copolymerisiert werden.
Die Polymerisierung der Monomere kann unter Verwendung eines Initiators oder eines Radikals durchgeführt werden, das durch UV-Strahlung gebildet wird. Es wird empfohlen, einen Initiator vom Redox-Typ zu verwenden, welcher aus einer Kombination eines Peroxids, wie Ammoniumpersulfat (nachfolgend einfach als APS bezeichnet) mit einem Reduktionsmittel, wie N,N,N', N'-tetramethylethylendiamin (nachfolgend einfach als TEMED bezeichnet) als Initiator besteht, obwohl die Erfindung nicht darauf eingeschränkt ist. Das oben erwähnte Peroxid und Reduktionsmittel werden in einer Menge von 0,05 bis 5 Gew.-% auf der Basis der gesamten Monomere angewendet. Die Polymeri sierungstemperatur ist nicht besonders eingeschränkt, soweit der Initiator seine Funktion ausüben kann. Es wird gewöhnlich bevorzugt, die Polymerisierung zwischen 15 und 50ºC durchzuführen.

WIRKUNGSWEISE:

Im erfindungsgemäßen Elektrophoresemedium wandern bei Benutzung Anionen zur Anodenseite, wenn der elektrische Strom eingeschaltet wird. Insbesondere wandern Anionen in der kathodischen Elektrodenlösung in das Gel, während Anionen im Gel in die anodische Elektrodenlösung wandern.
Wenn eine wäßrige Lösung eines stark sauren Salzes als elektrolytische Lösung des Gels verwendet wird und eine wäßrige Lösung eines schwach sauren Salzes als die Elektrodenlösung verwendet wird, wie im Fall der oben erwähnten Laemmlis-Formulierung, wandern stark saure Radikale im Gel zur Anodenseite, während schwach saure Radikale in der kathodischen Elektrodenlösung in das Gel wandern. Wenn eine schwache Basis, wie Tris, als Kationen gemeinsam in der elektrolytischen Lösung des Gels und in der Elektrodenlösung verwendet wird, verlieren einige der schwach sauren Salzmoleküle die Ladung und so wird die Menge an Ionen verringert. Infolgedessen wird der elektrische Widerstand (d. h. der Potentialgradient) im Gel erhöht und die Elektrophoresegeschwindigkeit von zu trennenden Proteinmolekülen wird erhöht.
So wird der stark saure Salzanteil des Tris in dem elektrophoretischen Gel klar unterschieden von dem schwach sauren Salzanteil des Tris darin, und eine Änderung des Potentialgradienten rings um die Eingrenzung mit einer Erhöhung in der prozentualen Neutralisierung von Tris infolge der starken Säure wird bemerkbar. Wenn das prozentuale Neutralisierungsverhältnis hoch ist, werden die zu trennenden Substanzen daher in die Lage versetzt, sich rings um die Begrenzung zu konzentrieren, was ihre Trennbarkeit, insbesondere der Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht, verschlechtert. Um diese Erscheinung zu verhindern, ist es nötig, den elektrischen Widerstand des schwach sauren Salzanteils im Gel zu erniedrigen.
Wenn eine schwache Säure vorher der elektrolytischen Lösung des Gels beigegeben wird, wie beim erfindungsgemäßen Verfahren, wird die Menge der Ionen des schwach sauren Salzanteils erhöht und infolgedessen wird der elektrische Widerstand abgesenkt. So kann der elektrische Widerstand durch Steuern des pKa-Werts und der Konzentration der schwachen Säure willkürlich gesteuert werden. In Anwesenheit von stark sauren Radikalen ist ferner der pH-Wert niedrig und so ist die schwache Säure elektrisch neutral, so daß es unnötig ist, den elektrischen Widerstand abzusenken.
Die pKa-Werte von schwachen Säuren, die zur Steuerung des elektrischen Widerstandsbereiches von 7 bis 11 geeignet sind, unterscheiden sich jedoch wesentlich von den Dissoziationskonstanten üblicher anionischer Gruppen.
Erfindungsgemäß wird daher ein Ampholyt mit kationischen Gruppen und anionischen Gruppen in der gleichen Anzahl als pseudo-schwache Säure verwendet, um den pKa-Wert von kationischen Gruppen innerhalb des oben angegebenen Bereichs zu steuern. So wird die Dissoziierung von kationischen Gruppen auf der alkalischen Seite unterdrückt und der Ampholyt wirkt als ein Anion. Auf der Säureseite dissoziieren andererseits die gleiche Anzahl von kationischen Gruppen und anionischen Gruppen, und daher ist der Ampholyt elektrisch neutral und trägt so nicht zur elektrischen Leitung bei.
So kann die Potentialgradientenverteilung im Gel während der Elektrophorese durch vorangehende Zugabe einer geeigneten Menge eines Ampholyten mit einem geeigneten pKa-Wert zur elektrolytischen Lösung des Gels gesteuert werden. Daher können elektrophoretische Verteilungen mit hoher Auflösung der verschiedenen Proben, die sich im Molekulargewicht voneinander unterscheiden, über einen weiten Bereich erhalten werden.
Wenn ein Ampholyt zur elektrolytischen Lösung des Gels beigegeben wird, wie im Fall der vorliegenden Erfindung, kann die Färbung von Proteinen mit einem sauren Farbstoff nach der Beendigung der Elektrophorese erleichtert werden. Dies kann der Fall sein, da die Dissoziierung von anionischen Gruppen im Ampholyten während der Färbung unter sauren Bedingungen infolge der Essigsäure unterdrückt wird und der Ampholyt als Kationen wirkt, welche die Störung der Färbung durch an Proteine gebundene anionische Substanzen verhindern.
Laemmlis Standardformulierung, in welcher die prozentuale Neutralisierung von Tris infolge einer Säure in der elektrolytischen Lösung im Gel niedrig ist, leidet an einer Abnahme der Beweglichkeit infolge des hohen pH-Werts, wenn sie lange Zeit gelagert wird. Infolgedessen wird die Trennkraft verschlechtert. Wenn die prozentuale Neutralisierung der elektrolytischen Lösung des Gels erhöht wird, um einen neutralen pH-Wert oder darunter zu erreichen, wird keine Verschlechterung auch nach einer längeren Lagerung beobachtet. In diesem Fall wird jedoch die Mobilität im Vergleich zu Laemmlis Standardformulierung stark erhöht.
Wenn im Gegensatz dazu ein Ampholyt der elektrolytischen Lösung im Gel zugegeben wird, wie im Fall des erfindungsgemäßen Polyacrylamidgels für die Elektrophorese, kann eine elektrophoretische Verteilung erreicht werden, die der bei Verwendung von Laemmlis Standardformulierung erreichten vergleichbar ist, auch wenn die Neutralisierung erhöht ist, um die Verschlechterung zu verhindern. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des Ampholyten in der elektrolytischen Lösung des Gels beeinflußt nicht die Elektrophorese, solange die Elektrodenlösung SDS enthält.
Darüber hinaus hat das erfindungsgemäße Polyacrylamidgel, welches Ampholyten enthält, deren pKa-Wert sich im Gel voneinander unterscheidet, eine gute Fähigkeit, Proben mit einem weiten Molekulargewicht-Verteilungsbereich zu trennen, und somit eine elektrophoretische Verteilung zu erreichen, die mit der vergleichbar ist, welche bei Verwendung eines Gradientengels erreicht werden kann, obwohl das Polyacrylamidgel ein gleichförmiges Gel mit einer Acrylamidkonzentration von 10% ist.
Ferner ermöglicht das erfindungsgemäße Polyacrylamidgel für die Elektrophorese, Polypeptide mit einem Molekulargewicht von nur 20 000 oder weniger leicht zu trennen, welche durch die bekannten Verfahren kaum getrennt werden können. Ferner erleichtert die Anwesenheit des Ampholyten die Färbung der Proteine nach Beendigung der Elektrophorese.

BEISPIEL:

Nunmehr werden Beispiele des Verfahrens zur Herstellung eines Polyacrylamidgels für die Elektrophorese gemäß der Erfindung angegeben.

BEISPIEL 1

Ein Abstandshalter mit einer Dicke von 1 mm wurde zwischen einer rechteckigen Glasscheibe (12 cm breit, 10 cm lang) und einr weiteren Glasscheibe der gleichen Größe mit einer Vertiefung auf der Oberseite eingelegt, wodurch eine Glasplatte hergestellt wurde. Eine Monomerlösung, die aus Acrylamid (Konzentration: 12,5% (%T)) BIS (Konzentration: 2,6 (%C)) und jeder elektrolytischen Lösungsverbindung gemäß Tabelle 1 bestand, wurde mit 400 ppm APS und 400 ppm TEMED vermischt. Die erhaltene Mischung wurde in die Platte gegossen und in der üblichen Weise polymerisiert. So wurde ein Polyacrylamidgel für die Elektrophorese erhalten.
Handelsübliche Proteine mit bekannten Molekulargewichten wurden der Elektrophorese unter Verwendung des oben erwähnten Polyacrylamidgels unterworfen und die Wanderungsstrecken wurden gemessen.
Jedes Markierungsprotein wurde mit β-Mercatoethanol und SDS behandelt, und 7% Glycerol sowie 0,05% Bromphenolblau (nachfolgend einfach als BPB bezeichnet) wurden vor der Verwendung im Test zugegeben.
Die Elektrodenlösung war Laemmlis Formulierung, die aus 0,025 mol/l Tris, 0,192 mol/l Glycin und 0,1 Gew.-% SDS bestand.
Die Elektrophorese wurde bei einem konstanten elektrischen Strom von 20 mA durchgeführt. Wenn das elektrophoretische Ende von BPB 5 mm oberhalb des Bodens erreichte, wurde der elektrische Strom abgeschaltet.
Das Färben wurde in einer Lösung von 0,25% Coomassie- Brilliantblau (nachfolgend einfach als CBB bezeichnet) G-250, 10% Essigsäure und 30% Methanol für 2 Stunden durchgeführt. Entfärbung wurde in einer Lösung von 7% Essigsäure und 3% Methanol über Tag und Nacht bewirkt, während die Lösung zu Zeiten ausgetauscht wurde.
Das Verhältnis der elektrophoretischen Strecke eines Proteins zu demjenigen von BPB wurde als Beweglichkeit oder Mobilität definiert. Tabellen 2 und 3 zeigen die Ergebnisse.
Tabelle 2 zeigt die Mobilitäten unmittelbar nach der Erzeugung des Polyacrylamidgels, während Tabelle 3 die Daten zeigt, welche nach der Lagerung des Polyacrylamidgels bei 5ºC für 120 Tage erhalten wurden. Tabelle 1: Zusammensetzung der elektrolytischen Lösung des Elektrophoresegels
In der obigen Tabelle sind die Proben 1 und 2 in mol/l ausgedrückt. Das Verhältnis von Grammäquivalent Glycin zur Säure (Chlorion) ist das folgende:
0,080 : 0,19 = 1 : 2,4. Tabelle 2: Mobilität (unmittelbar nach der Herstellung) Tabelle 3: Mobilität (nach 120 Tagen Lagerung bei 5ºC)

BEISPIEL 2

Durch Verwendung der gleichen Glasplatte wie in BEISPIEL 1 wurde ein Polyacrylamidgel gemäß jeder elektrolytischen Lösungszusammensetzung erzeugt, die in Tabelle 4 angegeben ist. Sodann wurde Elektrophorese unter den gleichen Bedingungen wie in BEISPIEL 1 durchgeführt. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse, wobei in jedem Fall die BIS-Konzentration 5,0% (%C) betrug. Tabelle 4: Zusammensetzung der elektrolytischen Lösung des Elektrophoresegels Tabelle 5: Mobilität

BEISPIEL 3

Durch Verwendung der gleichen Glasplatte wie in BEISPIEL 1 wurde ein Polyacrylamidgel entsprechend jeder in Tabelle 6 angegebenen elektrolytischen Lösungszusammensetzung erzeugt. Sodann wurde versucht, Proben mit niedrigen Molekulargewichten zu trennen. In jedem Fall betrug die BIS-Konzentration 5,0% (%C).
Als Molekulargewicht-Marker wurden von Pharmacia hergestellte Polypeptide verwendet. Jeder Marke wurde in einer 50 mM Tris-Salzsäure-Elektrolyselösung (pH: 6,8) gelöst, welche 2,5% SDS und 5% β-Mercaptoethanol enthielt. Nach der Zugabe von 0,01% CBB wurde die Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen und sodann dem Test unterworfen.
Die Elektrodenlösung für die Elektrophorese enthielt 0,025 mol/l Tris und 0,1 Gew.-% SDS. Ferner wurden Ampholyten für die Elektrophorese gemäß Tabelle 6 zugegeben.
Die Elektrophorese wurde mit einem konstanten elektrischen Strom von 20 mA durchgeführt. Wenn das elektrophoretische Ende von CBB 10 mm über dem Boden erreichte, wurde der elektrische Strom abgeschaltet. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel 45 Minuten in einer 50%-igen Methanol- und 10%igen Essigsäurelösung fixiert. Das Färben wurde in einer Lösung von 0,025% CBBG-250 und 10% Essigsäure für 2 Stunden durchgeführt. Eine Entfärbung wurde in einer Lösung von 10% Essigsäure über Nacht bewirkt, während die Lösung von Zeit zu Zeit ausgetauscht wurde.
Das Verhältnis der Elektrophoresestrecke jedes Proteins zu derjenigen von CBB wurde als Mobilität definiert. Tabelle 7 zeigt die Resultate. Tabelle 6: Zusammensetzung der elektrolytischen Lösung des Elektrophoresegels Tabelle 7: Mobilität

Claims

1. Polyacrylamidgel zur Verwendung bei der Elektrophorese, wobei das Polyacrylamidgel eine wäßrige Elektrolytlösung enthält, die eine Säure, ein Amin und einen Ampholyten enthält, wobei der Ampholyt die gleiche Anzahl von anionischen und kationischen Gruppen in einem einzelnen Molekül aufweist, der pH-Wert der Elektrolytlösung zwischen 4 und 7,5 liegt und das Verhältnis des Amins zu der Säure zwischen 1 : 0,6 und 1 : 1 Grammäquivalentteile beträgt, das Verhältnis der Säure zum Ampholyten zwischen 1 : 0,5 und 1 : 4 Grammäquivalentteile beträgt, der pKa-Wert des Amins zwischen 8 und 8,5 liegt, der pKa- Wert des Ampholyten zwischen 7 und 11 liegt und der pKa-Wert der Säure nicht höher als 5 liegt.

2. Polyacrylamidgel nach Anspruch 1, bei welchem das Amin Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist.

3. Polyacrylamidgel nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem der Ampholyt den Potentialgradienten steuert.

4. Polyacrylamidgel nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem der Ampholyt aus der Gruppe gewählt wird, die aus Glycin, Serin, Asparagin, β-Alanin, N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure und N-tris (hydroxymethyl)methylglycin, N-tris(hydroxmethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure und Mischungen derselben besteht.

5. Polyacrylamidgel nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchen der Ampholyt aus einer Mischung von mehreren Substanzen besteht.

6. Polyacrylamidgel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Säure eine monobasische Säure ist.

7. Polyacrylamidgel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei welchem die Säure aus Salzsäure, Essigsäure und Mischungen derselben ausgewählt wird.

8. Medium für die Elektrophorese, das besteht aus einem Polyacrylamidgel nach einem der vorangehenden Ansprüche und einer wäßrigen Elektrophorese-Elektrodenlösung, die ein Amin und einen Ampholyten enthält, wobei der pKa- Wert des Ampholyten in der Elektrolytlösung nicht größer ist als derjenige des Ampholyten in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite, und nicht größer ist als derjenige des Ampholyten, der bei Betrieb von der Elektrodenlösung zum Gel wandert.

9. Medium nach Anspruch 8, bei welchem das in der Elektrodenlösung enthaltene Amin Tris(hydroxymethyl)-aminomethan ist.

10. Medium nach Anspruch 8 oder 9, bei welchem die Elektrodenlösung ein Salz von Dodecylsulfat enthält.

11. Medium nach Anspruch 10, bei welchem die Elektrodenlösung auf der Kathodenseite nicht weniger als 0,01 Gew.-% des Salzes des Dodecylsulfats enthält.

12. Medium nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei welchem sowohl der Ampholyt in der Elektrodenlösung als auch der Ampholyt in der Elektrolytlösung die gleiche Anzahl von anionischen Gruppen und kationischen Gruppen in einem einzelnen Molkül aufweist.

13. Medium nach einem der Ansprüche 8 bis 12, bei welchem der Ampholyt in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Glycin, Serin, Asparagin, β-Alanin, N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure und N-tris(hydroxymethyl)-methylglycin.

14. Medium nach Anspruch 13, bei welchem der Ampholyt in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite Glycin ist.

15. Medium nach Anspruch 13, bei welchem der Ampholyt in der Elektrodenlösung auf der Kathodenseite N-tris(hydroxymethyl)methylglycin ist.

16. Verfahren zur Herstellung eines Polyacrylamidgels nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das Polymerisieren von Acrylamid in Anwesenheit eines Vernetzungsmittels, Wasser, einer Elektrolytlösung und eines die Polymerisierung auslösenden Mittels umfaßt, die Elektrolytlösung aus einer wäßrigen Lösung besteht, die eine Säure, ein Amin und einen Ampholyten enthält, der Ampholyt die gleiche Anzahl von anionischen und kationischen Gruppen in einem einzelnen Molekül aufweist, der pH-Wert der Elektrolytlösung zwischen 4 und 7,5 liegt und wobei das Verhältnis des Amins zur Säure zwischen 1 : 0,6 und 1 : 1 Grammäquivalentteile und das Verhältnis der Säure zum Ampholyten zwischen 1 : 0,5 und 1 : 4 Grammäquivalentteile beträgt, der pKa-Wert des Amins zwischen 8 und 8,5 liegt, der pKa-Wert des Ampholyten zwischen 7 und 11 liegt und der pKa-Wert der Säure nicht höher als 5 liegt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei welchem zwischen 1 und 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamten Monomere, einer Divinylverbindung copolymerisiert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, bei welchem die Divinylverbindung N,N-methylenbisacrylamid ist.

19. Verfahren nach Anspruch 16, 17 oder 18, bei welchem das die Polymerisierung auslösende Mittel aus einem Redox- Initiator besteht.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16, 17 oder 18, bei welchem der Polymerisierungskatalysator aus einem Peroxyd besteht und N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin als die Polymerisierung auslösendes Mittel verwendet wird.