DE69228077T2

DE69228077T2 - Synthetische, oberflächen aktive zusammensetzung für die lunge mit antioxidativen eigenschaften

Info

Publication number: DE69228077T2
Application number: DE69228077T
Authority: DE
Inventors: Larry R. Cincinnati Oh 45215 Mclean; Marguerite H. Madison Wi 53715 Payne
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-11-04
Filing date: 1992-10-13
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2012-10-14
Also published as: GR3029279T3; EP0666754A4; HUT66424A; FI942032A0; FI942032A; HU9401293D0; JPH07502500A; CA2121147A1; EP0666754B1; WO1993008824A1; EP0666754A1; NO941616D0; ES2127764T3; US5683982A; US5272252A; KR100250847B1; CA2121147C; DE69228077D1; AU667200B2; NO941616L

Description

Synthetische, oberflächenaktive Zusammensetzung für die Lunge mit antioxidativen Eigenschaften

Fachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Synthese einer Reihe von Polypeptiden mit antioxidativen Eigenschaften, die als synthetische Lungensurfactanten geeignet sind, die Herstellung von Gemischen dieser Polypeptide mit Lipiden, das Verfahren zur Herstellung derselben sowie Arzneimittel, die bei der Behandlung des Atemnotsyndroms bei Säugern wirksam sind.

Hintergrund der Erfindung

Die Lungen befinden sich in einem empfindlichen Gleichgewicht zwischen toxischen Oxidantien und den Schutzwirkungen von Antioxidantienabwehrsystemen. Ein gestörtes Gleichgewicht in diesem System, entweder durch einen Anstieg an Oxidantien oder eine Funktionsstörung der Antioxidantienabwehrsysteme, kann zu pathophysiologischen Vorfällen in der Lunge führen, die Lungenfunktionsstörungen verursachen können. Ein Typ von Lungenfunktionsstörung, zu der ein Anstieg an Antioxidantien beitragen kann, ist das Atemnotsyndrom (RDS).
Atemnotsyndrom bei Säuglingen ist der Hauptgrund für den Tod in den ersten 28 Lebenstagen. Es kommt weltweit bei einem von 100 Säuglingen vor und es sterben etwa 10 Prozent. Das Syndrom tritt selten bei ausgetragenen Säuglingen auf und ist im allgemeinen mit Unreife und niedrigem Geburtsgewicht (unter 2 kg) verbunden. RDS bei Erwachsenen weist ähnliche klinische Charakteristika und eine ähnliche Pathophysiologie wie die kindliche Erkrankung auf und wird im allgemeinen auf einer Intensivstation auf ähnliche Art und Weise behandelt. Die Erkrankung bei Erwachsenen hat verschiedene Krankheitsursachen und ist eine Folge von Lungenverletzungen, wie diffuse Infektionen, Aspiration des Mageninhalts, Inhalation von Reizmitteln oder Toxinen und Lungenödeme, als Folge solcher Quellen, wie Überdosierung bei der Narkose.
RDS steht in Wechselwirkung mit einem Fehlen oder einer Funktionsstörung des Lungensurfactants, das die Lungenbläschen, wo der Gasaustausch stattfindet, überzieht, und wird mit freien Radikalen von Sauerstoff in Zusammenhang gebracht, die als Oxidantien bekannt sind, wie Superoxidradikale, Hydroxylradikale, Wasserstoffperoxid, das Hydroxylradikale erzeugen kann, und Lipidperoxide, die mit zellulären Verletzungen in Verbindung gebracht werden (Heffner, et al., Am. Rev. Respir. Dis. 104: 531-554 1989); (Halliwell, FASEB J. 1: 358-364 1987).
Die synthetischen Lungensurfactanten aus erfindungsgemäßen Polypeptiden ohne die Antioxidationseinheiten wurden in den U. S.-Patentanmeldungen Seriennr. 282,795, eingereicht am 9. November 1988, und Seriennr. 214,228, eingereicht am 1. Juli 1988, beschrieben. Indes besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines wirksamen synthetischen Lungensurfactants mit antioxidativen Eigenschaften, d. h. mit der Fähigkeit, die Oxidation von empfindlichen Verbindungen zu Oxidantien zu hemmen.
Bei einigen Zubereitungen synthetischer Lungensurfactanten werden als weitere Komponenten therapeutische Mittel, wie Vitamin E, als eine separate Komponente zu den oberflächenaktiven Zubereitungen gegeben (U. S. Patent Nr. 4,765,987; PCT Publication Nr. WO 90/11768; PCT Publication Nr. WO 90/07469). In der vorliegenden Erfindung jedoch stellen die Antioxidantien keine getrennte Komponente dar, sondern sind sogar in ein Polypeptid eingebaut. Ein Vorteil des Einbaus des Antioxidationsmittels in das Polypeptid liegt darin, daß anstelle eines Dreikomponentengemischs (Lipid, Polypeptid und Antioxidationsmittel) ein Zweikomponentengemisch verfügbar ist. Das kann bei der Untersuchung der Wirksamkeit eines vermarktungsfähigen Arzneimittels, wo für jede einzelne Komponente eine Reihe von Dosierungen und Formulierungen untersucht werden muß, von bedeutendem Vorteil sein. Außerdem ist eine Zweikomponentenformulierung leichter herzustellen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können einzeln in Gemischen mit Lipiden oder in Kombination in Lipidgemischen vorliegen, wobei das Polypeptid einen kleineren Anteil des Surfactantgemisches darstellt. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in hoher Reinheit und auf standardisierte Art und Weise hergestellt werden, da es ein definiertes Gemisch synthetischer Komponenten darstellt. Desweiteren sind die Komponenten nicht auf tierische Quellen zurückzuführen, was die Gefahr einer Kontamination durch Viren und Bakterien möglichst gering hält.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt synthetische Lungensurfactanten, bestehend aus einem Komplex eines Polypeptides und Lipiden, wobei das Polypeptid die folgende Formel 1 hat:
X-Y-Z-Y'-Q 1
ein optisch aktives Isomer oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon; wobei
X ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylrest, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Acylrest, eine Aminosäure, Dipeptid oder Tripeptid darstellt;
Y und Y' jeweils unabhängig voneinander eine Bindung, -(Ser)n-, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, oder T darstellt,
wobei T:
bedeutet und n' eine ganze Zahl von 1-8 ist; W -NHC(O)-, -NHCH&sub2;-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)- oder -SS- darstellt;
und D:
darstellt, wobei B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;-Alkenylenrest darstellt und B&sub1; B oder
bedeutet, wobei jeder Rest R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest darstellt;
oder X und Y zusammengenommen den Rest Da-C(O)- oder Db-C(O)- wiedergeben;
Q eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe, einen Alkylaminorest, einen Alkoxyrest, -O-Da oder -O-Db darstellt;
Z einen Peptidrest von 8 bis 25 Aminosäureresten darstellt, bestehend aus einem Fragment des Oligomers mit der Sequenz
-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-A&sub1;&sub1;-A1'-A2'-A3'-A4'-A5'-A6'- A7'-A8'-A9'-A10'-A11'-A1"-A2"-A3"-A4"-A5"-A6"-A7"-A8"-A9"-A10"- A11"-A1'''-A2'''-
die mit irgendeiner der mit A&sub1; bis A&sub1;&sub1; bezeichneten Aminosäure beginnen kann,
wobei A&sub1;, A1', A1", A1''', A&sub4;, A4', A4", A&sub8;, A8' und A8" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der hydrophilen Aminosäurereste, bestehend aus -Glu-, -Asp-, -Ala-, -Gln-, -Asn-, -Gly-, -Ser-, -Thr-, -Lys-, -Arg-, -Orn- und -hArg-, ausgewählt sind;
A&sub2;, A2', A2", A&sub3;, A3', A3", A&sub6;, A6', A6", A&sub7;, A7', A7", A&sub1;&sub0;, A10' und A10" jeweils unbhängig voneinander aus der Gruppe der lipophilen Aminosäurereste, bestehend aus -Leu-, -Nle-, -Met-, -Ala-, -Val-, -Phe-, -Nva-, -Ile- und -Tyr-, oder dem Aminosäurederivat T ausgewählt sind;
A&sub5;, A5', A5", A&sub1;&sub1;, A11' und A11" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der basischen Aminosäurereste, bestehend aus -Lys-, -Orn-, -Arg- oder -hArg-, ausgewählt sind,
A&sub9;, A9' und A9" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der lipophilen, neutralen oder basischen Aminosäurereste, bestehend aus -Leu-, -Nle-, -Met-, -Ala-, -Val-, -Phe-, -Nva-, -Ile-, -Tyr-, -Thr-, -Ser-, -Gln-, -Asn-, -Gly-, -Lys-, -Arg-, -hArg-, -Trp-, -Orn- und -Trp(For)-, oder dem Aminosäurederivat T ausgewählt sind;
mit der Maßgabe, daß in der Formel 1 mindestens ein Rest T, -O-Da, -O-Db, Da-C(O) oder DB-C(O)- vorhanden ist.
Das Lipid umfaßt ein oder mehrere Lipide des mit natürlichen Lungensurfactanten verbundenen Typs.
Diese Polypeptid-Lipid-Komplexe und deren Arzneimittel sind für die Behandlung des Atemnotsyndroms bei Säugern geeignet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 gibt die erfindungsgemäßen Strukturen von WMAP10 und daraus abgeleiteten, erfindungsgemäßen Antioxidationspeptiden wieder.
Fig. 2 gibt die CD-Spektren von Peptiden und Antioxidationspeptiden in Trifluorethanol (TFE) und Wasser wieder.
Fig. 3 zeigt die Hemmung der Lipidperoxidation durch Peptide und Peptidantioxidantien. ( ) Kontrolle in allen Listen; WMAP 10-Liste: ( ) BHT (Butylhydroxytoluol) (1 ug/ml), ( ) 1,5% (1,5 TeilePeptid: 100 Teile DPPC), ( ) 4,5%; HBB-LysMAP10-Liste: ( ) 0,6%, ( ) 1,2%, ( ) 2,4%, ( ) 3,6%, (Δ) 4,8%; HBS-CysMAP10-Liste: ( ) 0,4%, ( ) 0,8%, ( ) 1,5%, ( ) 3%.
Fig. 4 zeigt beispielhafte Druck-Volumenverminderungskurven für die angegebenen Surfactantengemische ( ). Die Kurven ohne Punkte entsprechen der voll funktionsfähigen Lunge (linke Kurve) und der unzulänglichen, gespülten Lunge (rechte Kurve).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In der gesamten Beschreibung werden die folgenden allgemeinen Abkürzungen der natürlich vorkommenden Aminosäuren verwendet:
Ala oder A - Alanin
Val oder V - Valin
Leu oder L - Leucin
Ile oder I - Isoleucin
Phe oder F - Phenylalanin
Trp oder W - Tryptophan
Met oder M - Methionin
Ser oder S - Serin
Tyr oder Y - Tyrosin
Asp oder D - Asparaginsäure
Glu oder E - Glutaminsäure
Gln oder Q - Glutamin
Thr oder T - Threonin
Gly oder G - Glycin
Lys oder K - Lysin
Arg oder R - Arginin
Asn oder N - Asparagin
Nle - Norleucin
Orn - Ornithin
hArg - Homoarginin
Nva - Norvalin
Trp(For) - N-Formyl-Trp
Die natürlichen Aminosäuren enthalten mit Ausnahme von Glycin ein chirales Kohlenstoffatom. Sofern im einzelnen nicht anders angegeben, liegen die optisch aktiven Aminosäuren, auf die hier Bezug genommen wird, in der L-Konfiguration vor. Vorzugsweise liegen alle Aminosäuren im Polypeptid entweder in der D-Konfiguration oder alle in der L-Konfiguration vor. Sobald die erfindungsgemäße Antioxidationseinheit in das Peptid eingeführt wird, können Stereoisomere gebildet werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt sowohl Gemische dieser Stereoisomere als auch die isolierten Stereoisomere. Wie üblich, ist die Struktur der hier ausgeschrieben Peptide so, daß sich das Aminoende an der linken Seite der Kette befindet und das Carboxyende an der rechten Seite der Kette.
Wenn zwei oder mehr Aminosäuren unter Bildung eines Peptids miteinander kombiniert werden, werden Wassermoleküle freigesetzt und was von jeder Aminosäure verbleibt wird Aminosäurerest genannt. Ein "Aminosäurerest" stellt daher eine Aminosäure dar, der ein Wasserstoffatom an der endständigen Aminogruppe und/oder die Hydroxylgruppe der endständigen Carboxylgruppe fehlt. Unter Verwendung anerkannter Terminologie gibt ein Bindestrich (-) vor (was das Fehlen eines Wasserstoffatoms anzeigt) und/oder nach (was das Fehlen einer Hydroxylgruppe anzeigt) einer Dreibuchstabenabkürzung für eine Aminosäure oder für ein Aminosäurederivat einen Aminosäurerest an.
Wie hier verwendet, bedeutet "Alkyl" einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest, wie eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isopropyl-, tert-Butyl-, sec-Butyl-, iso-Pentyl-, 1-Methylbutylgruppe und so weiter, in Abhängigkeit von der bestimmten Anzahl an Kohlenstoffatomen. Wie hier verwendet, bedeutet "Acyl" einen Rest, der durch die Entfernung einer Hydroxylgruppe aus einer organischen Säure gebildet wird; die allgemeine Formel lautet RCO-, wobei R einen aliphatischen, alicyclischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffrest oder ein Wasserstoffatom (Formylgruppe) darstellt. Der Rest R kann substituiert sein. Ein Beispiel für einen Acylrest ist die Succinylgruppe.
Bei dem Rest X der vorliegenden Erfindung kann es sich um ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylrest, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Acylrest, eine Aminosäure, ein Dipeptid oder Tripeptid handeln. X kann jede Aminosäure, jedes Dipeptid oder Tripeptid sein, das die hier beschriebene Funktion des Polypeptids nicht beeinträchtigt. Die Aminosäure, das Dipeptid oder Tripeptid kann nach jedem geeigneten Verfahren, wie das nachstehend beschriebene, sequentielle Festphasenverfahren, an Y oder an Z, falls Y eine Bindung darstellt, gebunden werden. Wenn X einen C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylrest darstellt, kann der Alkylrest nach jedem geeigneten Alkylierungsverfahren an Y oder an Z, falls Y eine Bindung darstellt, gebunden werden. Wenn X einen C&sub1;&submin;&sub5;-Acylrest darstellt, kann der Acylrest nach jedem geeigneten Acylierungsverfahren an Y oder an Z, falls Y eine Bindung darstellt, gebunden werden.
Y und Y' stellen jeweils unabhängig voneinander entweder eine Bindung, einen bis drei Serinreste oder die derivatisierte Aminosäure T dar. Wenn Y oder Y' einen bis drei Serinreste darstellt, können die Serinreste nach jedem geeigneten Verfahren, wie das nachstehend beschriebene, sequentielle Festphasenverfahren, an Z gebunden werden. T kann ebenso als eine derivatisierte Aminosäure nach jedem geeigneten Verfahren, wie das sequentielle Festphasenverfahren an das Polypeptid Z gebunden werden.
T ist definiert als:
wobei n' eine ganze Zahl von 1-8 und vorzugsweise 1 bis 4 ist; W -NHC(O)-, -NHCH&sub2;-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-oder -SS- und vorzugsweise -NHC(O)- oder -SS- darstellt; und D:
darstellt, wobei B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;-Alkenylenrest darstellt und B&sub1; B oder
bedeutet, wobei jeder Rest R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest darstellt. Wie vorstehend angegeben, kann es sich bei dem Alkylrest um einen geradkettigen oder verzweigten Alkylrest handeln und bei jedem der Reste R&sub1;&submin;&sub7; kann es sich um einen anderen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handeln. Vorzugsweise handelt es sich bei R&sub1;, R&sub2;, R&sub6; und R&sub7; jeweils um eine tert-Butylgruppe und bei R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; jeweils um eine Methylgruppe. Da ist Db vorzuziehen und B ist B&sub1; vorzuziehen. B ist vorzugsweise eine Bindung.
D wird hier als "Antioxidationseinheit" bezeichnet, da man annimmt, daß es sich bei D um denjenigen Teil handelt, der die Antioxidationseigenschaften auf das Polypeptid überträgt. Es versteht sich jedoch, daß D Verbindungsglieder zu dem Polypeptid erfordert, so daß, wenn "Antioxidationseinheiten, die an das Polypeptid gebunden sind," beschrieben werden, auch die entsprechenden Verbindungsglieder z. B. W, -C(O)-, oder -O-, eingeschlossen sind.
Eine Möglichkeit zur Erzeugung von T ist es, die Seitenkette einer Aminosäure, die für die Verknüpfung mit einer Antioxidationsverbindung aufnahmefähig ist, abzuändern. Aminosäuren, die für die Verknüpfung zugänglich sind, haben typischerweise in ihrer Seitenkette eine funktionelle Gruppe. Einige Beispiele dieser Aminosäuren sind die Aminosäuren mit Aminogruppen als funktionelle Seitenketten (NE), wie Lysin und Ornithin; Aminosäuren mit Hydroxygruppen als funktionelle Seitenketten, wie Serin und Threonin; Aminosäuren mit Sulfhydrylgruppen als funktionelle Seitenketten, wie Cystein und Homocystein, und Aminosäuren mit Carboxylgruppen als funktionelle Seitenketten, wie Asparaginsäure und Glutaminsäure. Aminosäurederivate mit funktionellen Seitenkettengruppen können ebenfalls verwendet werden und es sind viele im Handel erhältlich.
Es gibt viele Wege zur Erzeugung von T. Zum Beispiel kann die Seitenkettenaminogruppe, die Seitenkettenalkoholgruppe oder die Seitenkettensulfhydrylgruppe einer Aminosäure oder eines Aminosäurederivats durch ein Acylierungsmittel, das aus Antioxidationsverbindungen hergestellt wird, acyliert werden. Um als Acylierungsmittel zu fungieren, können die Antioxidationsverbindungen zum Beispiel ein symmetrisches Anhydrid oder einen Aktivesten z. B. N- Hydroxybenzotriazolester (HOBt-Ester) bilden. Das Acylierungsmittel wird dann, damit die Umsetzung stattfinden kann, der Verbindung mit der ungeschützten funktionellen Gruppe am Zielort ausgesetzt. Dies wird vorzugsweise in der Festphasenpeptidsynthese durchgeführt, solange die Aminosäure, die die Antioxidationseinheit erhalten soll, einen Teil des an das Harz gebundenen Peptids bildet.
Ebenso können die einzelnen Aminosäuren vor dem Einbau in das Peptid modifiziert werden, zum Beispiel durch Veresterung, reduktive Alkylierung usw. Andere Modifikationen von Aminosäuren und Aminsäurederivaten, die funktionelle Gruppen enthalten, sind im Fachgebiet bekannt.
Bevorzugte Beispiele für Antioxidationsverbindungen, von denen gefunden wurde, daß sie für die Umsetzung mit Aminosäuren oder Aminosäurederivaten in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind folgende:
1) HBB 3,5-Di-t.-butyl-4-hydroxybenzoesäure
2) HBP 3-(3',5'-Di-t.-butyl-4-hydroxyphenyl)-propionsäure
3) HBC 3,5-Di-t.-butyl-4-hydroxyzimtsäure
4) HBA 2-(3',5'-Di-t.-butyl-4-hydroxyphenyl)-essigsäure
5) di-HBA 2,2-Di-(3',5'-di-t.-butyl-4-hydroxyphenyl)-essigsäure
6) Trl 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure - auch als Trolox bekannt
7) HBB-al 3,5-Di-t.-butyl-4-hydroxybenzaldehyd
8) HBB-ol 3,5-Di-t.-butyl-4-hydroxybenzylalkohol
9) HBS 3,5-Di-t.-butyl-4-hydroxythiophenol
Vorzugsweise werden HBS, HBB, HBP, di-HBA und Trl verwendet, wenn es sich bei der funktionellen Gruppe um eine Sulfhydrylgruppe handelt, und HBB, HBP, HBC, HBA, di-HBA und Trl werden vorzugsweise verwendet, wenn es sich bei der funktionellen Gruppe entweder um eine Alkohol- oder eine Aminogruppe handelt. HBB-al kann für die reduktive Alkylierung von Aminseitenketten verwendet werden, und HBB-ol kann für die Veresterung von sauren Seitenketten und des Carboxylendes verwendet werden.
Die vorstehenden Antioxidationsverbindungen sind im Handel erhältlich oder die Synthese ist im Fachgebiet bekannt, z. B. wird 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxyphenylessigsäure in Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim., 358 1965 und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzaldehyd in J. Org. Chem., 22, 1333 1957 beschrieben. Im allgemeinen kann jede Antioxidationsverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die (1) mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verknüpft werden kann, die (2) eine antioxidative Wirkung zeigt, wenn sie mit dem Polypeptid verknüpft ist und die (3) es dem Polypeptid ermöglicht, wie hier beschrieben zu funktionieren.
Wie vorstehend beschrieben wird, wenn die Antioxidationsverbindung und die Aminosäure oder das Aminosäurederivat wie hier beschrieben umgesetzt wird, ein Aminosäurederivat erzeugt, dessen Aminosäurerest durch T in der Formel 1 wiedergegeben wird. Beispiele für die Abkürzungen von T und anderer hier verwendeter Gruppen sind folgende:
-[N&epsi;-HBB-Lys]- bedeutet:
Es ist zu beachten, daß N&epsi; die Seitenkettenaminogruppe bedeutet, an die HBB (aufgrund der Umsetzung ohne die Hydroxylgruppe) gebunden ist;
-[S-HBS-Cys]- bedeutet HBS (ohne das Wasserstoffatom der Sulfhydrylgruppe), das an dem Schwefelrest an die Seitenkette des Cysteinrestes gebunden ist:
-[O-HBB-Ser]- bedeutet HBB (ohne die Hydroxylgruppe), das an das Sauerstoffatom in der Seitenkette eines Serinrestes gebunden ist:
HBC-Leu- bedeutet HBC (ohne die Hydroxylgruppe), das an die α-Aminogruppe eines Leucinrestes gebunden ist:
Nα-Fmoc-N&epsi;-Boc-Lys[Ne-HBB-al] bedeutet einen Lysinaminosäurerest, bei dem die Position Nα durch Fmoc geschützt ist, die Position N&epsi; durch Boc geschützt ist und HBB-al (ohne das Sauerstoffatom) an die Position N&epsi; gebunden ist:
Fmoc-Glu λ-HBB-ester] bedeutet einen Glutaminsäurerest, der an der Position Nα durch Fmoc geschützt ist und an den HBB-ol (ohne die Hydroxylgruppe) unter Bildung einer Estergruppe an die Seitenkettencarboxylgruppe von Glutaminsäure gebunden ist:
Trl-Leu- bedeutet eine Troloxgruppe (ohne die Hydroxylgruppe), die an die α-Aminogruppe eines Leucinrestes gebunden ist:
Wie für das Trl-Leu-Beispiel gezeigt, kann die Antioxidationseinheit, in diesem Fall stellt D = Db und B = eine Bindung dar, zusammen mit einer Carbonylgruppe (C(O)-) mit dem α-Aminoende des Polypeptids Z verknüpft werden, d. h. X und Y bilden zusammen Db-C(O)-. Zusätzlich kann die Antioxidationseinheit Da oder Db mit dem Carboxyende (-COOH) verknüpft werden, wobei endständig -C(O)-O-Da oder -C(O)-O-Db erhalten wird, d. h. Q = -O-Da oder -O-Db. Aus der Antioxidationverbindung kann wie vorstehend beschrieben ein Acylierungsmittel erzeugt werden und dieses kann an jedes Ende gekuppelt werden.
Die Antioxidationseinheit kann mit den Seitenketten zwischen den Enden des Polypeptids Z verknüpft werden, indem Aminosäuren unter Bildung von T abgeändert werden oder indem mindestens ein Ende abgeändert wird. Wenn die Antioxidationseinheit mit einer Seitenkette zwischen den Enden verknüpft ist, ist sie vorzugsweise mit einem lipophilen Teil des Peptids, wie A&sub2;, A2', A2", A2''', A&sub3;, A3', A3", A&sub6;, A6', A6", A&sub7;, A7', A7", A&sub9;, A9', A9" A&sub1;&sub0;, A10' oder A10", verknüpft, um die Konformation des Peptids beizubehalten. Es können eine oder mehrere Antioxidationseinheiten mit dem Polypeptid Z verknüpft sein.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können nach einer Reihe von Verfahren hergestellt werden, die einem Fachmann bekannt sind, wie die Flüssigphasenchemie. Ein bevorzugtes Verfahren ist das sequentielle Festphasenverfahren, das automatisierte Verfahren, wie den ABI Peptide Synthesizer, verwenden kann. In dem Festphasenverfahren treten die folgenden Stufen auf: (1) eine erste Aminosäure mit einer geschützen α-Aminogruppe wird an einen Harzträger gebunden; (2) die Carboxylgruppe einer zweiten Aminosäure mit einer geschützen α-Aminogruppe wird aktiviert; (3) von der ersten Aminosäure wird mit einem Reagenz, das den Verbleib der ersten Aminosäure an dem Harz ermöglicht, die Schutzgruppe entfernt, und (4) es findet eine Kupplung zwischen der α-Aminogruppe der ersten Aminosäure und der aktivierten Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure statt. Diese Stufen werden mit neuen Aminosäureresten wiederholt, was die Bildung des Peptids ermöglicht. Wenn die gewünschte Länge des Peptids gebildet wurde, wird das Peptid vom Harz abgespalten wird, die Schutzgruppen werden entfernt und das Peptid wird isoliert.
Bei dem verwendeten Harzträger kann es sich um jedes geeignete Harz handeln, das üblicherweise bei der Festphasenherstellung von Polypeptiden verwendet wird, wie ein Polystyrol, das mit 0,5 bis 3 Prozent Divinylbenzol quervernetzt ist und das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert ist, um Bindungsstellen für die Esterbildung mit der zuerst eingeführten, an der α-Aminogruppe geschützen Aminosäure bereitzustellen. Andere geeignete Harzträger sind pMHBA (Peptide International, Louisville, Ky), RINK (Calbiochem, LaJolla, Ca) und Sasrin (Biochem, Philadelphia, Pa). Für das Sasrin-Harz ist ein besonderer ABI-Cyclus für das Beladen mit der ersten Aminosäure erforderlich, der in dem Benutzerhandbuch des ABI Peptide Synthesizer beschrieben ist. Die erste Aminosäure mit einer geschützen α-Aminogruppe wird mit dem Harz verknüpft, wie es in dem Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer User's Manual, das hier als Ganzes eingeschlossen wird, beschrieben wird.
Zu bevorzugten Verfahren zur Aktivierung der zweiten Aminosäure gehört die Bildung eines symmetrischen Anhydrids oder Aktivesters von der zweiten an der α-Aminogruppe geschützen Aminosäure. Zum Beispiel kann eine an der α-Aminogruppe geschützte Aminosäure mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart von Dichlormethan (DCM) umgesetzt werden, wobei das symmetrische Anhydrid erzeugt wird. Alternativ kann ein HOBt-Aktivester erzeugt werden, indem eine Boc-Aminosäure (tert-Butyloxycarbonyl-aminosäure) und HOBt in DCC gelöst und abgekühlt werden, zusätzliches DCM dazugegeben wird und die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt wird. Diese Lösung wird dann zu der an das Harz gebundenen Aminosäure gegeben. Dieses Aktivierungsverfahren zur Bildung von Acylierungsmitteln kann auch für die Antioxidationsverbindungen verwendet werden.
Falls andere funktionelle Gruppen neben den α-Aminogruppen vorhanden sind, müssen diese Gruppen auch geschützt werden. Im allgemeinen können die α-Aminogruppe und jede funktionelle Gruppe in der Seitenkette durch verschiedene Schutzgruppen geschützt werden, so daß eine Schutzgruppe entfernt werden kann, ohne daß die anderen Schutzgruppen entfernt werden.
Zu den Klassen der α-Aminoschutzgruppen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung möglich sind, gehören die (I) Schutzgruppen vom Acyltyp, wie die Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl-), Benzolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und γ-Chlorbutyrylgruppe; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie die Benzyloxycarbonyl- und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, wie die p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p- Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-Biphenyl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonylgruppe; (3) aliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie die tert-Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppe; (4) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethantyp, wie die Cyclopentyloxycarbonyl- oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc) gruppe; (5) Schutzgruppen vom Alkyltyp, wie die Triphenylmethyl- (Trityl) und Benzylgruppe; (6) Trialkylsilylgruppen, wie Trimethylsilyl.
Die Auswahl der α-Aminoschutzgruppe hängt jedoch von dem verwendeten Harz, der funktionellen Gruppe am Zielort, anderen im Polypeptid vorhandenen funktionellen Gruppen und davon ab, ob das Aminosäurederivat T der Abspaltung vom Harz mit dem Abspaltungsreagenz standhalten kann. Zum Beispiel wird zur Herstellung von Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu- Leu-Glu-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 1) ein pMBHA-Harz verwendet, das eine C-terminale Aminogruppe erzeugt. Die α-Aminoschutzgruppe ist die Boc-Gruppe, die Aminoschutzgruppe für die Seitenkette (N&epsi;) am Zielort ist die Fmoc-Gruppe, die Aminoschutzgruppe für die Seitenketten (N&epsi;) am Nichtzielort ist die 2ClZ- (2-Chlorbenzyloxycarbonyl-) Gruppe, die Schutzgruppe für die COOH-Gruppe in der Seitenkette am Nichtzielort ist OBzl (Benzylester) und das Peptid wird unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie auf einem ABI430A Peptide Synthesizer aufgebaut. Die N&epsi;-Fmoc-Gruppe kann selektiv mit Piperidin entfernt werden und die HBB-Einheit kann als ein HOBt-Aktivester eingeführt werden, um HBB am Zielort, der Lysinseitenkette, anzubringen. Wasserfreie Fluorwasserstoffsäure (HF) kann verwendet werden, um gleichzeitig das Peptid von Harz abzuspalten und die verbliebenen Schutzgruppen zu entfernen.
Die Auswahl der passenden Kombination von Schutzgruppen und Reagenzien zur selektiven Entfernung der Schutzgruppen sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel M. Bodanszky PEPTIDE CHEMISTRY, A PRACTICAL TEXTBOOK, Springer Verlag 1988; J.
Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co. (1984),
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in einem etwa vierfachen. Überschuß in das Festphasenreaktiongefäß eingebracht und die Kupplung wird in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt, wie in einem Medium aus Dimethylformamid : Methylenchlorid (1 : 1) oder in Dimethylformamid alleine oder in Methylenchlorid alleine. In den Fällen, in denen eine unvollständige Kupplung erfolgt, wird das Kupplungsverfahren wiederholt, bevor die α-Aminoschutzgruppe entfernt wird und bevor die Kupplung der nächsten Aminosäure in dem Festphasenreaktiongefäß stattfindet. Der Erfolg der Kupplungsreaktion wird auf jeder Stufe der Synthese durch die Ninhydrinreaktion überwacht, wie von E. Kaiser, et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben.
Nach Erhalt der gewünschten Aminosäuresequenz wird das Peptid unter Verwendung eines geeigneten Reagenzes, das das Polypeptid nicht ungünstig beeinflußt, vom Harz entfernt. Zum Beispiel kann wasserfreie HF, die 5% Anisol und 5% Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure enthält, verwendet werden, um das Polypeptid von einem pMBHA-Harz abzuspalten.
Die Polypeptide der Formel 1 können pharmazeutisch verträgliche Salze mit jeder nichttoxischen, organischen oder anorganischen Säure bilden. Beispielhafte anorganische Säuren, die geeignete Salze bilden, sind Chlorwasserstoff-, Bromwassserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure sowie saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogen-orthosphosphat und Kaliumhydrogensulfat. Beispielhafte organische Säuren, die geeignete Salze bilden, sind Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispielhaft für solche Säuren sind zum Beispiel Essig-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Zu Salzen der Aminosäureeinheit am Carboxyende gehören die nicht-toxischen Carbonsäuresalze, die mit jeder geeigneten anorganischen oder organischen Base gebildet werden. Veranschaulichend gehören zu diesen Salzen diejenigen der Alkalimetalle, wie zum Beispiel Natrium und Kalium; diejenigen der Erdalkalimetalle, wie Calcium und Magnesium; diejenigen der Leichtmetalle der Gruppe IIIA, einschließlich Aluminium; sowie der organischen primären, sekundären und tertiären Amine, wie zum Beispiel der Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin, N-(Nieder)alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin.
Bei den Phospholipiden der erfindungsgemäßen Protein-Phospholipid-Komplexe kann es sich um irgendein Phospholipid handeln, und diese Bezeichnung umfaßt, wie hier verwendet, die Phosphoglyceride und die Sphingolipide. Phosphoglyceride sind diejenigen Difettsäureester von Glycerin, in denen die verbliebene Hydroxygruppe, eine endständige Hydroxygruppe, der Glycerineinheit einen Ester mit Phosphorsäure bildet. Normalerweise bildet die Phosphorsäureeinheit der Phosphoglyceride einen zweiten Ester mit einem Alkohol wie Ethanolamin, Serin, Cholin oder Glycerin. Sphingolipide sind diejenigen Monofettsäureester von Sphingosin oder Dihydrosphingosin, in denen die Hydroxygruppe in der Position 1 einen Ester mit dem Cholinester von Phosphorsäure bildet. Die bevorzugten Lipide der erfindungsgemäßen Protein- Phospholipid-Komplexe umfassen Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Phosphatidylcholinmoleküle mit Acylketten anderer Längen und Sättigungsgraden (PC), Cardiolipin (CL), Phosphatidylglycerine (PG), Phosphatidylserine (PS), Fettsäuren (FA) und Triacylglycerine (TG). DPPC bildet den größeren Anteil des Lungensurfactantgemisches, während PC, CL, PG, PS, FA und TG zu einem kleineren Anteil vorliegen. Geeignete Fettsäuren für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Phospholipiden sind langkettige Carbonsäuren (im allgemeinen mit acht oder mehr Kohlenstoffatomen), die typischerweise unverzweigt sind. Die Fettsäuren können gesättigt oder ungesättigt sein. Beispielhafte Fettsäuren sind Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Ölsäure.
Anmeimittel des Polypeptids oder des Protein-Phospholipid-Komplexes der vorliegenden Erfindung können als ein trockenes Gemisch oder in einer wäßrigen Suspension hergestellt werden, die in einigen Fällen kleine Mengen organischer Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethanol oder Trifluorethanol, Detergenzien, wie zum Beispiel Natriumdodecylsulfat oder Natriumdeoxycholat, Salze, wie Calciumchlorid oder Natriumchlorid, Kohlenhydrate, wie Glucose oder Mannit, und Aminosäuren, wie Glycin und Alanin, enthalten können. Wenn die Anmeimittel in eine flüssige Form gebracht werden, können Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Regulatoren des osmotischen Drucks, Puffer und Suspensionsmittel der Flüssigkeit zugegeben werden. Falls gewünscht können auch keimtötende Mittel zugegeben werden. Der pH-Wert der wäßrigen Suspension kann zwischen 2 und 10 liegen und kann mit Säuren und Basen, wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure, Natriumphosphat oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Das trockene Gemisch kann in einer wäßrigen Lösung, die pharmazeutisch verträgliche Salze, organische Lösungsmittel und Detergenzien enthält, wieder in flüssige Form gebracht werden. Die wäßrige Zubereitung kann dialysiert, filtriert oder chromatographiert werden, um vor der Verwendung das Suspensionsmedium durch ein pharmazeutisch verträgliches Medium auszutauschen. Die Zubereitung kann als ein trockenes Pulver, eine wäßrige Suspension oder als ein Aerosol direkt in die Lungen des Notfallpatienten verabreicht werden. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in hermetisch verschlossene Behältnisse, wie Phiolen und Ampullen, gefüllt und steril aufbewahrt werden. Die Zusammensetzung kann in einer Phiole oder Ampulle getrennt von einer Phiole oder Ampulle mit dem Suspensionspuffer gelagert werden, und die trockene oder hydratisierte Zusammensetzung kann vor der Verwendung mit dem Suspensionspuffer gemischt werden.
Das Lipid macht 50 bis 99,9% der Lungensurfactantzubereitung aus. Zu geeigneten Lipiden gehören DPPC, PC, CL, PG, PS, FA und TG. DPPC macht die Hauptlipidart aus und liegt in Konzentrationen von 60 bis 100% des Gesamtlipidgewichts vor. Die restlichen Lipide liegen in niedrigeren Konzentrationen vor. PC, CL, PG und PS können bis 30% der Lipide ausmachen, und FA und TG können bis zu 10% des Lipidgewichts umfassen. Die Fettsäureacylketten der Nebenkomponenten des Lipids können gesättigt oder ungesättigt sein und jede Kettenlänge umfassen. Kettenlängen von 12 bis 16 Kohlenstoffatomen und bis zu 2 ungesättigte Bindungen werden bevorzugt. Die bevorzugte Lipidzusammensetzung enthält 85-100% DPPC plus 0-15% PG.
Die Lipidkomponenten der synthetischen Lungensurfactanten werden gewöhnlich in den Lungensurfactanten von Säugern angetroffen und sind aus normalen industriellen Quellen in hoher Reinheit erhältlich. Die Polypeptidkomponenten werden durch Festphasenpeptidsynthese nach Methoden hergestellt, die einem Fachmann vertraut sind. Es wurde gezeigt, daß Gemische von erfindungsgemäßen Lipiden mit Proteinen, die aus Flüssigkeiten von Lungenspülungen bei Säugern isoliert wurden, bei der Behandlung von RDS bei Neugeborenen wirksam sind. Jedoch wurde noch nicht über Gemische dieser Lipide mit synthetischen Peptiden in Lungensurfactantzubereitungen berichtet.
Die Lipide werden in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemischen, wie Gemischen aus Chloroform und Methanol oder Trifluorethanol, gemischt. Das organische Lösungsmittel wird durch Verdampfen unter Stickstoff, Argon oder Vakuum entfernt. Eine wäßrige Lösung, die organische und anorganische Säuren, Basen und Salze sowie Saccharide, wie Dextrose, enthalten kann, wird zu dem trockenen Lipidgemisch gegeben, wobei man zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 100 mg DPPC pro ml kommt. Es ist im allgemeinen vorzuziehen, jedoch nicht notwendig, das Gemisch auf 35-50ºC zu erwärmen, kräftig zu mischen und bis zu 2 Stunden bei 25-50ºC zu inkubieren. Dann wird das Peptid oder ein Gemisch aus Peptiden in Form eines trockenen Pulvers oder in einer wäßrigen Lösung suspendiert, die in einigen Fällen ein geeignetes organisches Lösungsmittel, wie Ethanol oder Trifluorethanol, oder ein Denaturierungsmittel, wie Guanidiniumhydrochlorid oder Harnstoff enthält, was die Löslichkeit des Peptids in der wäßrigen Suspension verbessert, zugegeben. Die Assoziation von Peptid und Lipid kann bei einem bestimmten pH-Wert unterstützt werden, so daß der pH-Wert der wäßrigen Lösung von 2 bis 10 variieren kann. Das bevorzugte Verfahren zum Mischen von Peptid und Lipid ist die Zugabe von trockenem Peptid zu Lipid in Wasser bei 45-50ºC und 30-90minütigem Mischen bei 45-50ºC in einem Ultraschallbad, mit anschließender Gefriertrocknung und Lagerung bei -20ºC.
Die Lipide werden mit einem geeigneten Detergenz, wie Octylglucosid oder Natriumdeoxycholat, in einem Gewichtsverhältnis von 1 bis 20 Teile Detergenz pro Teil DPPC in Wasser, einem wäßrigen Puffer oder einer Salzlösung in Konzentrationen von 1 bis 100 mg DPPC/ml gemischt. Dann wird das Peptid als ein trockenes Pulver oder in einer wäßrigen Lösung suspendiert, mit oder ohne ein organisches Lösungsmittel, Denaturierungsmittel oder Detergenz, dazugegeben. Das Gemisch wird dann dialysiert, filtriert, zentrifugiert oder chromatographiert, wobei das Detergenz entfernt wird.
Vorzugsweise werden Lipide und Peptide in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel mit oder ohne eine kleine Menge Wasser gemischt. Das flüchtige organische Lösungsmittel wird unter einem Stickstoff- oder Argonstrom, in einem Vakuumofen oder über einen Rotationsverdampfer vor oder nach der Zugabe eines wäßrigen Lösungsmittels verdampft.
Das nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Gemisch aus Lipid und Peptid wird bis zu 2 Stunden inkubiert, vorzugsweise bei 35-50ºC unter Beschallung. Das Gemisch kann dann dialysiert, filtriert oder chromatographiert werden, wobei das wäßrige Medium durch ein pharmazeutisch verträgliches Medium ersetzt wird, obwohl dies nicht notwendig ist. In einigen Fällen wird die Wirksamkeit durch das Abtrennen von nicht umgesetztem Lipid oder Peptid von assoziiertem Lipid und Peptid durch Ultrazentrifugieren, Filtration oder Chromatographie verbessert. Das Gemisch kann dann lyophilisiert oder in Aerosolform gebracht werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Polypeptid-Phospholipid-Komplexe bei der Behandlung des Atemnotsyndroms bei Neugeborenen verwendet werden, einem physiologischen Zustand, der eine Folge von der Unfähigkeit der Lungen von Frühgeborenen ist, Lungensurfactanten zu erzeugen, wirken die Komplexe als Antioxidantien und synthetische Lungensurfactanten und ersetzen entweder das natürliche, fehlende Surfactant oder ergänzen den unzureichenden natürlichen Surfactant. Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Lungen des Säuglings eine ausreichende Menge an natürlichem Lungensurfactant erzeugen, und so eine weitere Behandlung unnötig machen.
Die Zubereitungen sind vorzugsweise diejenigen, die für endotracheale Verabreichung geeignet sind, das heißt eine flüssige Suspension, ein trockenes Pulver oder ein Aerosol. Für eine flüssige Suspension wird das trockene Gemisch oder das Gemisch in wäßriger Suspension mit geeigneten Mitteln, wie Wasser, Kochsalzlösungen, Dextrose und Glycerin gemischt, wobei ein pharmazeutisch wirksames Arzneimittel hergestellt wird. Bevorzugte flüssige Suspensionen enthalten 0,8 bis 1 Gewichtsprozent Natriumchlorid und sind 1-20 mM, vorzugsweise in einem Medium mit Calciumionen. Die Zubereitung wird dann einer Sterilfiltration unterzogen. Im allgemeinen umfaßt die Zubereitung 1 bis 100 mg DPPC pro ml und wird in einer Dosis von 0,2 bis 5 ml/kg verabreicht. Zur Herstellung eines trockenen Gemischs wird die wäßrige Suspension lyophilisiert. Das Aerosol wird aus einem fein verteilten trockenen Pulver, das in einem Treibmittel, wie den Niederalkanen und fluorinierten Alkanen, wie Freon, suspendiert ist, hergestellt. Das Aerosol wird in einem unter Druck gesetzten Behälter gelagert.
Zum Beispiel wird das Surfactant (erfindungsgemäßes Polypeptid und Lipidkomplex) je nach Dosierungsform durch einen Trachealtubus, durch Aerosolverabreichung oder durch Vernebelung der Suspension oder des trockenen Gemischs in das eingeatmete Gas verabreicht. Das Surfactant wird als Einzeldosis oder Mehrfachdosis von 10 bis 200 mg/kg verabreicht. Die bevorzugte Verabreichungsmethode ist eine Suspension aus Peptid und Lipid in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 5-10 mg Surfactant pro ml über einen Trachealtubus, wobei eine Dosis von 50-100 mg/kg erreicht wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird zur Behandlung eines Patienten verabreicht. "Patient" bedeutet einen Säuger, zum Beispiel, jedoch nicht darauf begrenzt, einen Menschen.
Die folgenden Beispiele zeigen einige Herstellungsverfahren für das Polypeptid, den Polypeptid/Lipid-Komplex und Ausgangsmaterialien der vorliegenden Erfindung. Die vorliegen de Erfindung ist weder auf die folgenden Beispiele noch auf diese Herstellungsverfahren beschränkt.
Die in den Beispielen verwendeten und nicht vorstehend definierten Abkürzung lauten wie folgt:
Standard-Boc-Chemie und Standard-Fmoc-Chemie: diese Chemie wird bei dem ABI Peptide Synthesizer für die Boc-Durchgänge beziehungsweise die Fmoc-Durchgänge verwendet.
TBDMS Tetrabutyldimethylsilyl-
SEt Ethylthio-
Suc Succinyl-
TFA Trifluoressigsäure
Bzl Benzyl-
Ot-Bu t-Butylether

Beispiel 1

1(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-Lys-NH&sub2; (HBB-Lys-MAP10)_(SEQ ID NO: 2)

Stelle Nα-Boc-N&epsi;-Fmoc-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz unter Verwendung von Standard-Boc-Chemie auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) her.
Stelle aus Nα-Boc-N&epsi;-Fmoc-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz unter Entfernung der Fmoc- Schutzgruppe mit Piperidin Nα-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz her.
Stelle aus dem Nα-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure in Form des N-Hydroxybenzotriazolaktivesters Nα-Boc-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-N&epsi;- 2ClZ-Lys-pMBHA-Harz her (2 mmol Säure, 4facher Überschuß an Aktivester für jede der beiden Kupplungen).
Stelle aus dem Nα-Boc-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ- Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 3) her.
Kupple Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 3) mit Bernsteinsäureanhydrid, wobei Suc-Leu-Leu- Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 4) erhalten wird.
Spalte Suc-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-HBB-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 4) vom Harz ab und entferne die Seitenkettenschutzgruppen in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthält, bei -5ºC 1 Stunde. Extrahiere mit 50%igem Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure vom Harz, friere und lyophilisiere. Reinige durch HPLC mit umgekehrter Phase auf einer Rainin 21,4 · 250 mm-C&sub1;&sub8;-Säule unter Verwendung eines linearen 39-46,5%igem Acetonitrilgradienten innerhalb von 15 Minuten in 0,1%iger wäßriger TFA (pH 2) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 40 ml/min unter Überwachung der Absorption bei 214 nm. Vereinige die reinen Fraktionen, friere und lyophilisiere, wobei die Titelverbindung erhalten wird. FAB-MS (M + H&spplus;) 1558,2.

1(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES MIT DEM IN BEISPIEL 1(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTID:

Das Peptid 1(A) wird wie vorstehend beschrieben hergestellt. DPPC (25 mg) in 1 ml Chloroform wird unter einem Stickstoffstrom und unter Vakuum getrocknet, wobei Spuren von organischem Lösungsmittel entfernt werden. Zu dem trockenen Lipid werden 3 ml Wasser gegeben. Die Zubereitung wird 1 Stunde bei 45ºC inkubiert. Dann werden 0,5 mg trockenes Peptid 1(A) zu der wäßrigen Zubereitung gegeben. Die Zubereitung wird in einem Ultraschallbad bei 45ºC 2 Stunden beschallt. Das erhaltene Lipid-Peptid-Gemisch wird lyophilisiert und bei 4ºC bis zu einem Monat gelagert. Vor dem Testen werden 9 ml 0,9%ige NaCl, 20 mM HEPES- Puffer, pH 7,40 dazugegeben. Die Zubereitung wird 1 Stunde unter wiederholtem Rühren bei 45ºC inkubiert.

Beispiel 2

2(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-S-HBS-Cys-Leu-Lys-NH&sub2; (HBS-Cys-MAP10) (SEQ ID NO: 5)

Stelle unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-Cys(SEt)-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA- Harz (SEQ ID NO: 6) her.
Kupple Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-Cys(SEt)-Leu-N&epsi;-2ClZ-LyspMBHA-Harz (SEQ ID NO: 6) mit Bernsteinsäureanhydrid, wobei Suc-Leu-Leu-Glu(OBzl)- N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-Cys(SEt)-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 7) erhalten wird.
Mische Suc-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-Cys(SEt)-Leu-N&epsi;-2ClZ- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 7) (0,263 g), wasserfreies Dimethylformamid (5 ml) und Methylthioglycolat (450 ul). Rühre über Nacht unter einer Argonatmosphäre, wobei Suc-Leu- Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-Cys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 8) erhalten wird.
Spalte Suc-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-Cys-Leu-N&epsi;-2ClZ-LyspMBHA-Harz (SEQ ID NO: 8) vom Harz ab und entferne die Seitenkettenschutzgruppen in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthält, bei -5ºC 1 Stunde. Extrahiere mit 50%igem Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure vom Harz, friere ein und lyophilisiere. Reinige durch HPLC mit umgekehrter Phase auf einer Rainin 21,4 · 250 mm-C&sub1;&sub8;-Säule unter Verwendung eines linearen 34-44%igem Acetonitrilgradienten innerhalb von 15 Minuten in 0,1%iger wäßriger TFA (pH 2) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 40 ml/min unter Überwachung der Absorption bei 214 nm. Vereinige die reinen Fraktionen, friere und lyophilisiere, wobei Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Cys-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 9) erhalten wird.
Vereinige 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxyphenol (751 mg), Diethylazodicarboxylat (496 ul, 3,15 mmol) und p-Dioxan (5 ml). Gib es unter eine Argonatmosphäre und rühre 2 Stunden, wobei ein Komplex aus 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxyphenol und Diethylazodicarboxylat erhalten wird. Behandle Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Cys-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 9) (32 mg) mit 1,1 Äquivalenten des hergestellten Komplexes aus 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxyphenol und Diethylazodicarboxylat in p-Dioxan (80 ul) und Dimethylformamid (40 ul). Gib es unter eine Argonatmosphäre und rühre über Nacht. Gieße in 25%iges Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure, friere und lyophilisiere. Reinige durch HPLC mit umgekehrter Phase auf einer Rainin 21,4 · 250 mm-C&sub1;&sub8;-Säule unter Verwendung eines linearen 44,5-52%igem Acetonitrilgradienten innerhalb von 15 Minuten in 0,1%iger wäßriger TFA (pH 2) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 41 ml/min unter Überwachung der Absorption bei 214 nm. Vereinige die reinen Fraktionen, friere und lyophilisiere, wobei die Titelverbindung erhalten wird. FAB-MS (M + H&spplus;) 1536,5

2(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES DES IN BEISPIEL 2(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTIDS:

Das Peptid 2(A) wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben mit DPPC gemischt, mit der Ausnahme, daß der abschließende Suspensionspuffer zusätzlich zu 0,9%igem NaCl und 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,40 5 mM CaCl&sub2; enthält.

Beispiel 3

3(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: HBC-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 10)

Stelle unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz und HOBT-Aktivestern auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc- Lys -Leu-N&epsi;-Boc-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 11) her.
Stelle aus Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 11) und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxyzimtsäure in Form des N- Hydroxybenzotriazolaktivesters HBC-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)- N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 12) her (2 mmol Säure, 4facher Überschuß an Aktivester für jede der beiden Kupplungen).
Spalte HBC-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 12) vom Hart ab und entferne die Schutzgruppen unter Verwendung von 50%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.

Beispiel 4

4(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys 3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzylester (SEQ ID NO: 13)

Stelle unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz und HOBT-Aktivestern auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc- Lys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Sasrin-Harz (SEQ ID NO: 14) her.
Kupple Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys- Sasrin-Harz (SEQ ID NO: 14) mit Bernsteinsäureanhydrid, wobei Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)- N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Sasrin-Harz (SEQ ID NO: 15) erhalten wird.
Spalte Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc- Lys-Sasrin-Harz (SEQ ID NO: 15) mit 1%iger Trifluoressigsäure in Methylchlorid, wobei Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys (SEQ ID NO: 15) erhalten wird.
Löse Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc- Lys (SEQ ID NO: 15) in Dimethylformamid und behandle mit Dicyclohexylcarbodiimid (1 Äquivalent) und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzylalkohol (2 Äquivalente). Gib das Gemisch dazu unter eine Argonatmosphäre und rühre über Nacht. Verdünne mit Ethylacetat, wasche mit kalter 1 N Chlorwasserstoffsäure und reinige durch HPLC, wobei Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc- Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzylester (SEQ ID NO: 16) erhalten wird.
Behandle Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N-Boc-Lys-Leu-N&epsi;- Boc-Lys 3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzylester (SEQ ID NO: 16) mit 50%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid. Gib das Gemisch dazu unter eine Argonatmosphäre und rühre 1 Stunde. Verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch HPLC, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

4(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES DES IN BEISPIEL 4(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTIDS:

Der DPPC-Komplex des Peptids 4(A) wird wie in Beispiel 1(B) beschrieben durch Mischen mit DPPC hergestellt.

Beispiel 5

5(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Trl-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 17)

Stelle unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-LyspMBHA-Harz (SEQ ID NO: 18) her.
Vereinige 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox) (27 mg), Dimethylformamid (30 ul) und Methylenchlorid (250 ul). Gib dazu Dicyclohexylcarbodiimid (200 ul einer 0,5 M Lösung in Methylenchlorid) und rühre 5 Minuten, wobei das symmetrische Anhydrid von 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox) erhalten wird.
Stelle aus Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 18) und dem symmetrischen Anhydrid von 6-Hydroxy- 2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox) Trl-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys- Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ-Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 19) her (2 mmol Säure, 10facher Überschuß an symmetrischem Anhydrid für jede der beiden Kupplungen).
Spalte Trl-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-Leu-Glu(OBzl)-N&epsi;-2ClZ-Lys-Leu-N&epsi;-2ClZ- Lys-pMBHA-Harz (SEQ ID NO: 19) vom Harz ab und entferne die Seitenkettenschutzgruppen in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthält, bei -5ºC innerhalb 1 Stunde. Extrahiere mit 50%igem Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure vom Harz, friere und lyophilisiere. Reinige durch HPLC mit umgekehrter Phase, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

5(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES DES IN BEISPIEL 5(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTIDS:

Das Peptid 5(A) wird wie in Beispiel 1(B) beschrieben mit DPPC gemischt.

Beispiel 6

6(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-O-HBB-Ser-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 20)

Stelle unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz und HOBT-Aktivestern auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Nα-Fmoc-O-TBDMS-Ser-Leu-NE-Boc-Lys-Rink-Harz (TBDSM ist an das Seitenkettensauerstoffatom des Serinrestes gebunden) her.
Behandle Nα-Fmoc-O-TBDMS-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz mit Essigsäure in Tetrahydrofuran/Wasser, wobei Nα-Fmoc-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz erhalten wird.
Stelle unter Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer aus dem Nα-Fmoc-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure in Form des N-Hydroxybenzotriazolaktivesters Nα-Fmoc-O-HBB-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink- Harz her (2 nunol Säure, 4facher Überschuß an Aktivester für jede der beiden Kupplungen). Stelle unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz und HOBT-Aktivestern auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer aus dem Nox-Fmoc-O-HBB-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz Leu- Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-O-HBB-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 21) her.
Kupple Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-O-HBB-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys- Rink-Harz (SEQ ID NO: 21) mit Bernsteinsäureanhydrid, wobei Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)- N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-O-HBB-Ser-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 22) erhalten wird.
Spalte Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-O-HBB-Ser-Leu-N&epsi;-Boc- Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 22) vom Harz ab und entferne die Seitenkettenschutzgruppen mit Trifluoressigsäure, Phenol, Dimethylsulfoxid und Wasser. Gib das Gemisch dazu unter eine Argonatmosphäre und rühre 1 Stunde. Verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch HPLC, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

6(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES DES IN BEISPIEL 6(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTIDS:

Das Peptid 6(A) wird wie in Beispiel 1(B) beschrieben mit DPPC gemischt.

Beispiel 7

7(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-S-HBB-Cys-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 23)

Stelle unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz und HOBT-Aktivestern auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-Cys(SEt)- Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 24) her.
Kupple Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-Cys(SEt)-Leu-N&epsi;-Boc-Lys- Rink-Harz (SEQ ID NO: 24) mit Bernsteinsäureanhydrid, wobei Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)- N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-Cys(SEt)-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 25) erhalten wird.
Mische Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-Cys(SEt)-Ser-Leu-N&epsi;- Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 25) (0,236 g), wasserfreies Dimethylformamid (5 ml) und Methylthioglycolat (450 ul). Rühre über Nacht unter einer Argonatmosphäre, wobei Suc-Leu- Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-Cys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 26) erhalten wird.
Stelle unter Verwendung von Standard-Fmoc-Chemie auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer aus Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-Cys-Leu-N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 26) und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure in Form des N-Hydroxybenzotriazolaktivesters Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-S-HBB-Cys-Leu- N&epsi;-Boc-Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 27) her (2 mmol Säure, 4facher Überschuß an Aktivester für jede der beiden Kupplungen).
Spalte Suc-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-N&epsi;-Boc-Lys-Leu-Leu-Glu(Ot-Bu)-S-HBB-Cys-Leu-N&epsi;-Boc- Lys-Rink-Harz (SEQ ID NO: 27) vom Harz ab und entferne die Seitenkettenschutzgruppen mit Trifluoressigsäure, Phenol, Dimethylsulfoxid und Wasser. Gib das Gemisch dazu unter eine Argonatmosphäre und rühre 1 Stunde. Verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch HPLC, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

7(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES DES IN BEISPIEL 7(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTIDS:

Das Peptid 7(A) wird wie in Beispiel 1(B) beschrieben mit DPPC gemischt.

Beispiel 8

8(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-N&epsi;-Trl-Lys-Leu-Lys-NH&sub2; (Trl-Lys-MAP10) (SEQ ID NO: 28)

Die Titelverbindung wird nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Ziellysinrest durch eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe (Fmoc) geschützt wird. Vor der Zugabe des nächsten Restes wird die N&epsi;-Fmoc-Gruppe mit Piperidin in Dimethylformamid (DMF) entfernt und die Trl-Gruppe über den zuvor hergestellten HOBT-Ester an die &epsi;-Aminogruppe von Lysin gekuppelt. Die Synthese wird mit Standard-Boc-Chemie fortgesetzt und, wie in Beispiel 1 beschrieben, wird das Peptid abgespalten, die Schutzgruppen werden entfernt und das Peptid wird gereinigt.

HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES DES POLYPEPTIDS AUS BEISPIEL (A):

Das Peptid 8(A) wird wie in Beispiel 1(B) beschrieben mit DPPC gemischt.

Beispiel 9

HERSTELLUNG DES ANTIOXIDATIONSAMINOSÄUREDERIVATS: Fmoc-Glu-[λ-HBB-ol-ester]

Mische fein vermahlene L-Glutaminsäure (2,0 g, 13,6 mmol), wasserfreies Natriumsulfat (2,0 g), 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzylalkohol (HBB-ol) (14 mmol) und Tetrahydrofuran (75 ml). Gib Tetrafluoroborsäure-Etherat (54%ig, 3,7 ml, 27,2 mmol) dazu und rühre 15 Stunden bei Raumtemperatur. Filtriere, behandle das Filtrat mit Triethylamin (4,1 ml, 29,6 mmol) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum. Reinige durch Chromatographie, wobei Glu-[λ- HBB-ol-ester] erhalten wird.
Löse Glu-[λ-HBB-ol-ester] (50 mmol) in 10%iger Natriumcarbonatlösung (100 ml). Kühle in einem Eisbad auf 0ºC und gib Dioxan (50 ml) dazu, gib dann langsam unter Rühren eine Lösung aus 9-Fluorenylmethylchlorformiat (13 g, 50,2 mmol) in Dioxan (75 ml) dazu. Rühre 1 Stunde bei 0ºC und 5 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur. Gieße das Reaktionsgemisch in 1,5 l Eiswasser. Extrahiere zur Entfernung von nicht umgesetztem Chlorformiat mit Ether (2 · 400 ml). Schrecke die wäßrige Phase in Eis ab und säure mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 an. Extrahiere in Ethylacetat, wasche mit 0,1 N Chlorwasserstoffsäure und Wasser. Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei Nα-Fmoc-Glu-[HBB-olester] erhalten wird.
Baue die Verbindung unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz und HOBT-Aktivestern auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer in ein Polypeptid ein.

Beispiel 10

HERSTELLUNG DES ANTIOXIDATIONSAMINOSÄUREDERIVATS: Nα-Fmoc-N&epsi;-Boc-Lys[N&epsi;-HBB-CH&sub2;]

Mische Nα-Fmoc-Lys (7,2 mmol) und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzaldehyd (HBB-al) (7,2 mmol) in Acetonitril (30 ml). Gib Natriumcyanoborhydrid (1,37 g, 23,2 mmol) dazu. Gib soviel Essigsäure dazu, wie es zur Beibehaltung eines leicht sauren Mediums nötig ist. Rühre mehrere Stunden, verdünne mit Ethylether (100 ml) und wasche mit 1 N Natriumhydroxidlösung. Trenne die organische Phase ab, trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei Nα-Fmoc-Lys-[N&epsi;-HBB-CH&sub2;] erhalten wird.
Löse Nα-Fmoc-Lys-[N&epsi;-HBB-CH&sub2;] (10 mmol) in 50/50 Dioxan/Wasser (25 ml) und puffere mit 1 N Natriumhydroxidlösung auf pH 10. Gib bei 10ºC tropfenweise eine Etherlösung von t- Butylazidoformiat (1,58 g, 11 mmol) dazu. Laß auf Raumtemperatur erwärmen und puffere zur Beibehaltung von pH 10 gelegentlich. Säure mit Natriumcitrat/Zitronensäure-Puffer auf pH 5 an, extrahiere mit Ether (3 x), trockne (MgSO&sub4;) und laß durch den Rest einen Stickstoffstrom strömen, wobei die Titelverbindung erhalten wird.
Baue die Verbindung unter Verwendung von Standard-Nα-Fmoc-Schutz, HOBT-Aktivestern und eines Rink-Harzes auf einem ABI430A-Peptidsynthesizer in ein Polypeptid ein.
Die folgenden Antioxidationsausgangmaterialien können, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, verwendet werden.

BEISPIEL 11

HERSTELLUNG DER AUSGANGSANTIOXIDATIONSVERBINDUNG: 3-t-Butyl-5-methyl-4-hydroxybenzoesäure

Beschicke ein Reaktionsgefäß mit einer Suspension aus Natriumhydrid (4,74 g, 0,198 mol) in wasserfreiem Ethylenglykoldimethylether (150 ml). Gib tropfenweise eine Lösung aus 2-t- Butyl-6-methylphenol (0,1 mol) in Ethylenglykoldimethylether (150 ml) dazu. Erwärme 1,5 Stunden auf 50-60ºC und leite dann 20 Stunden Kohlendioxid über ein Gaseinleitungsröhrchen unterhalb der Oberfläche des Reaktionsgemisches ein. Kühle auf 5ºC und vernichte vorsichtig den Überschuß an Natriumhydrid mit Methylalkohol (30 ml). Stelle nach Beendigung der Wasserstoffentwicklung den pH-Wert des Reaktionsgemischs mit 1 N Chlorwasserstoffsäure auf 2 ein. Verdünne mit Wasser (1,6 l) und sammle die Titelverbindung durch Filtration.

BEISPIEL 12

HERSTELLUNG DER AUSGANGSANTIOXIDATIONSVERBINDUNG: (6-Hydroxy-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propylchroman-2-yl)essigsäure

Mische Magnesiumspäne (45 mg, 1,85 mmol) und 1-Chlor-2,2-dimethylpropan (74,6 mg, 0,7 mmol) in wasserfreiem Ether (9 ml). Erwärme und rühre kräftig, gib dann tropfenweise 1,2- Dibromethan (156 mg, 0,839 mmol) in wasserfreiem Ether (1,5 ml) dazu. Erwärme 12 Stunden unter Rückfluß, bringe es unter eine Argonatmosphäre und kühle auf 0-5ºC. Gib tropfenweise eine Lösung aus Isobutyrylchlorid (0,533 mmol) in wasserfreiem Diethylether (1,5 ml) dazu. Rühre 1,5 Stunden bei 0-5ºC, gieße es in ein Gemisch aus Eis und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (0,15 ml) und trenne die organische Phase ab. Wasche mit Ethylacetat, 5%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung und Kochsalzlösung. Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2,2,6-Trimethyl-4-heptanon erhalten wird. Löse Vinylmagnesiumchlorid (0,7 mmol) in wasserfreiem Diethylether (1 ml), bringe es unter eine Argonatmosphäre und kühle auf 1-5ºC. Gib tropfenweise eine Lösung aus Butyrylchlorid (0,533 mmol) in wasserfreiem Diethylether (1,5 ml) dazu. Rühre bei 0-5ºC 1,5 Stunden, gieße in ein Gemisch aus Eis und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (0,15 ml) und trenne die organische Phase ab. Wasche mit Wasser, 5%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung und Kochsalzlösung. Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei Propylvinylketon erhalten wird.
Löse 2,2,6-Trimethyl-4-heptanon (0,4 mol) in Methanol (10 ml) und gib Kalium-tert.-butanolat (12 g, 0,1 mol) dazu. Gib tropfenweise eine Lösung aus Propylvinylketon (0,2 mol) in Methanol (10 ml) dazu. Rühre 10 Minuten und verteile zwischen Ethylether und Kochsalzlösung. Trenne die organische Phase ab und wasche bis zur Neutralität mit Kochsalzlösung. Trockne (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2-Propyl-3-t-butyl- 5-isopropylbenzochinon erhalten wird.
Löse 2-Propyl-3-t-butyl-5-isopropylbenzochinon (10 mmol), 1,1,3,3-Tetramethyldisiloxan (1,79 ml, 10 mmol) und Iod (0,05 g) in Methylenchlorid (30 ml). Rühre 30 Minuten unter Rückfluß und extrahiere mit 1 N Natriumhydroxidlösung (30 ml). Säure die wäßrige Phase mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure an und extrahiere in Ethylacetat (4 · 10 ml), trockne (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2-Propyl-3-t-butyl-4- hydroxy-5-isopropylphenol erhalten wird.
Löse 2-Propyl-3-t-butyl-4-hydroxy-5-isopropylphenol (2,0 mol) und Trimethylorthoformiat (0,3 l) in Methanol (1,2 l) und entgase. Bringe das Gemisch unter eine Stickstoff atmosphäre, kühle auf 3ºC und gib konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) dazu. Gib tropfenweise Methylvinylketon (340 ml, 4,0 mol) dazu und rühre ohne Kühlung 44 Stunden. Gieße in wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung und extrahiere in Ethylether. Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8- propyl-chroman-6-ol erhalten wird.
Löse 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-ol (2 mol) in Pyridin (600 ml) und gib Essigsäureanhydrid (900 ml) dazu. Entgase und rühre 18 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre. Gieße in Eis/Wasser und rühre 3 Stunden. Extrahiere in Ethylether, trockne (MgSO&sub4;), verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch Chromatographie, wobei 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-yl-acetat erhalten wird. Löse 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-yl-acetat (2 mol) in Aceton (2,5 l) und gib Wasser (2 l) dazu, gefolgt von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (16,6 ml). Destilliere das Lösungsmittel solange aus dem gerührten Gemisch ab bis die Kopftemperatur 90ºC erreicht. Kühle die Suspension, verdünne mit Ethylether und wasche mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung. Trockne (MgSO&sub4;), verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch Chromatographie, wobei 2-Hydroxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl- 8-propyl-chroman-6-yl-acetat erhalten wird.
Suspendiere Natriumhydrid (47,2 g einer 56%igen Suspension in Mineralöl, 1,1 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (1 l). Bringe es unter eine Stickstoffatmosphäre und gib tropfenweise Trimethylphosphonoacetat (209,4 g, 1,15 mol) dazu. Rühre 25 Minuten und gib eine Lösung aus 2-Hydroxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-yl-acetat (0,5 mol) in Tetrahydrofuran (1 l) dazu. Rühre 18 Stunden bei Raumtemperatur und erwärme dann 4 Stunden unter Rückfluß. Kühle, verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch Chromatographie, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

BIOLOGISCHES

Verfahren zur Untersuchung der Wirksamkeit von synthetischen Surfactantzubereitungen sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen synthetischen Surfactantzubereitungen auf jede geeignete Art und Weise untersucht werden, wie in dem Lungenmodell von erwachsenen Ratten (Ikegami, et al., (1979) Pediatr. Res. 13, 777-780).
Die charakteristischen Druck-Volumen-Merkmale von Rattenlungen, denen Surfactant entzogen wurde, sind denen der Lungen von Säuglingen mit Hyalinmembranerkrankung ähnlich, und die Wiederherstellung der normalen Druck-Volumen-Beziehung der Lunge steht in einem dosisabhängigen Zusammenhang mit der Menge an eingeträufeltem Surfactant (Bermel, M. S., et al. Lavaged excised rat lungs as a model of surfactant deficiency, Lung 162: 99-113 (1984)).

BEISPIEL 13

Modell mit isolierten gespülten Rattenlumen Die experimentellen Verfahren zur Tierpräparation, Aufnahme der Druck-Volumen-Kurve und der Lungenspülung wurden an diejenigen angepasst, die von Ikegami et al., Pediatr. Res. 11: 178-182 (1977) und Pediatr. Res. 13: 777-780 (1979) sowie Bermel et al. Lung 162: 99-113 (1984) beschrieben wurden. Männliche Sprague Dawley Ratten (200-250 g) wurden mit Natriumpentobarbital anästhetisiert und man ließ sie ausbluten. In die Trachea wurde eine Kanüle eingeführt und die Thoraxorgane wurden im ganzen entfernt.
Nach Entfernung des Nebengewebes wurden die Lunge und die Trachea (~2 g) in Kochsalzlösung (0,9%) suspendiert, in eine Vakuumkammer gebracht, nach dem Verfahren von Stengel et al. entgast. Die entgasten Lungen wurden in einem ummantelten Behältnis bei 37ºC in Kochsalzlösung suspendiert und die Tracheakanüle wurde über ein T-Röhrchen sowohl mit einem Wassermanometer als auch mit einer Glasspritze verbunden. Die Glasspritze wurde in eine Infusion/Entnahme-Pumpvorrichtung gebracht. Die Lungen wurden rasch, zur Minimierung der Luftretention mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit Luft auf einen Druck von 30 cm H&sub2;O aufgeblasen und 10 Minuten bei diesem Druck gehalten, indem zu den Lungen periodisch Luft gegeben wurde. Das Gesamtvolumen von infundierter Luft wurde als Gesamtlungenkapazität (TLC), die im allgemeinen 14-15 ml beträgt, aufgezeichnet. Aus den Lungen wurde dann mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min die Luft herausgelassen, bis ein Druck von Null erhalten wurde. Während des Herauslassens der Luft wurde der Druck des Wassermanometers in Intervallen von 1 cm abgelesen und aufgezeichnet. Diese Daten wurden zur Konstruktion einer Druck-Volumen- (P-V)-Kurve oder einer quasi-statischen Dehnbarkeitskurve nach Korrektur der P-V-Kurve des Apparates verwendet. Nach Entgasen und Einstellen des Gleichgewichts wurde in den Lungen durch wiederholtes Spülen mit 5 ml/g Spülpuffer (0,9%ige NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4) ein Surfactantmangel hervorgerufen. Die Verfahren Entgasen, Einstellen des Gleichgewichts und Spülen wurden wiederholt (15-20 mal) bis die Druck-Volumen-Kurve deutlich s-förmig geworden war und das bei einem Druck von 5 cm H&sub2;O verbleibende Luftvolumen kleiner oder gleich 3 ml war. An diesem Punkt wurde angenommen, daß die Lungen einen Surfactantmangel aufweisen. Zur Untersuchung wurden 2 ml 0,9%ige NaCl, 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,4 zu den trockenen Lungensurfactanten (25 mg Phospholipid; 100- 125 mg/kg) gegeben, das Gemisch wurde mit einem Vortexrührer gerührt, mit Stickstoff gespült und 1 Stunde bei 45ºC inkubiert. Das Gemisch wurde dann erneut mit einem Vortexrührer gerührt, und falls es schaumig war, entgast. 2 ml des Testgemischs wurden viermal mittels einer Spritze in die Lungen eingeführt und entfernt. Bei der fünften Einführung des Testgemischs verblieb es in der Lunge. Dieses Verfahren wurde gewählt, um eine gleichmäßige Verteilung des Materials in der Lunge zu unterstützen. Die Lungen wurden entgast, man ließ sie bei 37ºC 5 Minuten ins Gleichgewicht kommen und führte eine P-V-Messung durch. Die Lungen wurden untersucht, während sie in einer Kochsalzlösung bei 37ºC gehalten wurden, im Gegensatz zu Umgebungstemperatur, da die physikalischen Charakteristika der Surfactanten von der Temperatur abhängig sein könnten. Hundelungensurfactant wurde auf eine ähnliche Art und Weise verabreicht, mit der Ausnahme, daß das Surfactant nur 5 Minuten erwärmt wurde. Die Daten sind in Form der %TLC aufgeführt. Die Deflationsbereiche der Druck-Volumen (P-V)- Kurven bei Lungen von erwachsenen Ratten wurden analysiert, indem die Gesamtlungenkapazitäten (%TLC) bei 5 und 10 cm H&sub2;O-Druck (PC&sub5; und PC&sub1;&sub0;) berechnet wurden. Vergleiche wurden auf der Grundlage der prozentualen Wiederherstellung = (PC5(funktionstüchtig) - PC5(Test)) · 100 / (PC5(funktionstüchtig) - PC5(unzulänglich)) und durch Einfach-Varianzanalyse unter Verwendung der allgemeinen linearen Modellverfahren mit spezifischen Hervorhebungen der Mittelwerte (SAS Institute Inc., Cary, NC) durchführt. Es wurde angenommen, daß ein Wahrscheinlichkeitswert < 0,05 auf eine statistische Signifikanz hinweist. Spülung und Behandlung mit Testgemischen rief keine Änderung bei der absoluten TLC von mehr als 6% hervor.
Antioxidationswirkung Die Peptide wurden in Trifluorethanol (TFE) gelöst und mit Sojaphosphatidylcholin (PC) in Chloroform gemischt. Nach dem Trocknen unter einem N&sub2;-Strom wurde das Gemisch erneut in Ethanol suspendiert und in eine Pufferlösung (50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,0) injiziert, wobei eine Endkonzentration von 0,5 mM Phospholipid erhalten wurde. Mit 50 uM Fe²&spplus; plus einem Gemisch aus 50 uM Fe³&spplus; und 250 uM Histidin wurde die Peroxidation in Gang gesetzt. In Intervallen über einen Zeitraum von 15 Minuten wurden bei 37ºC 1 ml Proben aus dem Reaktionsgemisch zur Bestimmung der TBAR (Thiobarbitursäure reaktive Substanzen) entnommen. Es wurden 2 ml eines Gemisches aus 2 Teilen 0,67%iger Thiobarbitursäure/0,05 N NaOH, 1 Teil 10%iger Trichloressigsäure und 0,05 ml 2%igem butylierten Hydroxytoluol zugegeben. Die Umsetzung wurde 30 Minuten bei 100ºC fortgesetzt. Die Röhrchen wurden dann gekühlt, 15 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert und in Acrylküvetten überführt. Der Unterschied bei der Absorption bei 532 nm und 700 nm (zur Korrektur der Lichtstreuung) wurde gemessen und die TBAR wurden in Einheiten von Malondialdehydäquivalenten unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 1,56 · 10&sup5; M&supmin;¹cm&supmin;¹ berechnet.
CD-Spektren Die Zirkulardichroismus (CD)-Spektren von Proben in 1 mm Zirkularküvetten wurden auf einem Jasco J-500A Spectropolarimeter mit einer Spaltbreite von 2 nm bei Raumtemperatur aufgenommen. Das CD-Spektrum von Puffer wurde nach jedem Durchgang von dem CD-Spektrum der Probe abgezogen. Die Durchgangsrate betrug 2 nm/min und die Zeitkonstante war 8 Sekunden. Die Daten wurden bei 0,04 nm Intervallen gesammelt und über ein Intervall von 0,2 nm wurde der Durchschnitt ermittelt.
Messung der Oberflächenspannung Die minimale und maximale Oberflächenspannung eines oszillierenden Bläschens wurde, wie im wesentlichen von Enhorning, J. Appl. Physiol. 43: 198- 203 (1977) beschrieben, von Proben bei 37ºC mit einer Zyklusrate von 20 pro Minuten in einem pulsierenden Bläschensurfactometer (PBS, Electronetics Corp.) gemessen. Die Plastikprobenkammer wurde vor der Verwendung mit einer verdünnten Spülmittellösung gespült, gründlich mit Wasser gewaschen und unter einem N&sub2;-Strom getrocknet.

Ergebnisse

Die Strukturen der Testpeptide sind in Fig. 1 aufgeführt. WMAP10 ist ein wirksames amphiphatisches α-helikales Peptid, das in DPPC als einem Lungensurfactanten getestet wurde. Die Peptidanaloga HBB-Lys-MAP10, HBS-Cys-MAP10 und Trl-Lys-MAP10 enthalten ein hydrophobes Antioxidanz. Die Troloxgruppe wurde in Trl-Lys-MAP10 in Form zweier Isomere an Lys gekuppelt, Trolox(I)-MAP10 und Trolox(II)-MAP10, die zwar getrennt wurden aber deren Stereochemie nicht bestimmt wurde. Die Strukturen der Peptide wurden über CD- Spektroskopie in Wasser und Trifluorethanol, das die Wasserstoffbindung und die Bildung einer α-helikalen Struktur fördert, verglichen. Die CD-Spektren sind in Fig. 2 aufgeführt. Die berechneten Sekundärstrukturen sind in Tabelle I angegeben. Alle Peptide waren in TFE stark α- helikal, jedoch weniger in Wasser. Aus den Daten in Tabelle I wird ein kleiner Unterschied im α- helikalen Anteil der Peptide in TFE deutlich. In Wasser jedoch werden beträchtliche Unterschiede beobachtet. TABELLE I Konformation von Peptiden auf der Grundlage von CD-Spektren
* Die Daten wurden an die Standardspektren von Greenfield & Fasman, Biochemistry 8: 4108-4116 (1969) angepasst. Die Anpassungen betragen alle ±3% (SEM der Anpassung)
Die physikalischen Eigenschaften der Lungensurfactantgemische wurden durch Differentialscanningcalorimetrie (DSC) und in dem pulsierenden Bläschensurfactometer bewertet. Die Enthalpie des Phasenübergangs des DPPC ist in Lungensurfactantgemischen, die Peptide enthalten, die stark mit Lipid wechselwirken (McLean, L. R. et al., Biochemistry 30: 31-37 (1991)), und die im Modell mit gespülten Rattenlungen wirksam sind, deutlich verringert. Für alle synthetischen Lungensurfactantgemische wurde eine signifikante Verringerung bei der minimalen Oberflächenspannung (γmin) in einem pulsierenden Bläschen beobachtet. Probucol erhöhte γmin leicht (Tabelle II).

TABELLE 11

Physikalische Eigenschaften von Lungensurfactantgemischen

Ymin
Gemisch
(mN/m)
DPPC* 38
+ WMAP10 < 2
+ WMAP10 + Probucol 12
+ HBB-LysMAP10 < 2
+ HBS-CysMAP10 2
+ Trolox(I)-MAP10 10
+ Trolox(II)-MAP10 2
* Werte von DPPC wurden bei unbeschallten Liposomen gemessen.
γmin-Wene nach 10minütigem Pulsieren.
Die Wirksamkeit der Peptide als Antioxidantien wurde mit denjenigen verglichen, bei denen Probucol zu Gemischen von WMAP10 in Soja-PC-Gemischen gegeben wurde. BHT wurde als eine Kontrolle getestet. WMAP10 in Soja-PC zeigte in dem untersuchten Bereich keine Wirkung (Fig. 3). Ebenso zeigte ein Analogon, das anstelle des Trp-Restes einen Lys-Rest enthielt, keine Wirkung (Daten sind nicht aufgeführt). Probucol hemmt die Oxidation bei einer Konzentration von 0,6% (bezogen auf das Gewicht) für mindestens 8 Minuten vollständig (Daten sind nicht aufgeführt). Sowohl HBB-Lys- als auch HBS-Cys-Derivate waren in Konzentrationen, die den zur Herstellung der synthetischen Surfactanten verwendeten ähnlich waren, als Antioxidantien wirksam. Die Trolox-Derivate waren in ähnlichen Gemischen ebenso wirksame Antioxidantien (Daten sind nicht aufgeführt).
Die den Ratten verabreichten Zubereitungen hatten ein durchsichtiges Aussehen. Die Deflationsteile der Druck-Volumen (P-V)-Kurve bei Lungen von erwachsenen Ratten wurde analysiert, indem die prozentualen Gesamtlungenkapazitäten (TLC) bei einem Druck von 5 cm H&sub2;O (PC&sub5;) und die TLC bei 10 cm H&sub2;O (PC&sub1;&sub0;) berechnet wurde. Die Wiederherstellung auf der Grundlage der PC&sub5;-Werte wurde zum Vergleich der Testgemische verwendet. DPPC allein hatte keine deutliche Wirkung auf die Druck-Volumen (P-V)-Kurven der gespülten Lunge. Für die synthetischen Surfactanten wurden auf der Grundlage der optimalen Konzentration für WMAP10-Gemische mit DPPC (MAPIO) Peptidkonzentrationen von 2 oder 4 Gewichts-% gewählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt. Die WMAP-Sequenz ist bei der Wiederherstellung der P-V-Kurve der gespülten Rattenlungen hoch wirksam, beinahe bis zur Funktionstüchtigkeit, wenn sie mit DPPC gemischt ist. Die Zugabe von Probucol oder der Ersatz von Peptiden, die die HBB- oder Trolox-Funktionalität enthalten, vermindert die Wirkung der Peptid-DPPC-Gemische nicht. TABELLE III Wirksamkeit von synthetischen Surfactanten im Modell mit isolierten gespülten Rattenlungen
* Wiederherstellungen basieren auf PC5 und werden mit funktionstüchtigen und unzulänglichen Messungen an den gleichen Lungen verglichen, die für das Testmaterial verwendet wurden. Die Werte sind Durchschnitt ± SEM. Die Probucolkonzentration betrug 2 Gewichts-%.

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANTRAGSTELLER: McLcan, Larry R. Payne, Marguerite H.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Synthetische Lungensurfactanten mit antioxidativen Eigenschaften
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 37
(iv) KORRESPONDENZADDRESSE:
(A) ADDRESSAT: Marion Merrell Dow Inc.
(B) STRASSE: 2110 East Galbraith Rd.
(C) STADT: Cincinnati P. O. Box 1563100
(D) BUNDESSTAAT: Ohio
(E) STAAT: USA
(F) ZIP: 45215-6300
(v) COMPUTER LESBARE FORM:
(A) TYP DES MEDIUMS: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM kompatibel
(C) SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0. Version 1.25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US
(B) ANMELDEDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) INFORMATIONEN ZUM PATENTANWALT/AGENTUR
(A) NAME: Moon, Carolyn D.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 33,022
(C) REFERENZ/DOCKET-NUMMER: M01613
(ix) INFORMATIONEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (513) 948-7785
(B) TELEFAX: (513) 948-7961
(C) TELEX: 214320

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C), TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 3

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 4

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 31:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 32:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 33:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 34:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 35:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 36:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:

(2) INFORMATIONEN ZUR SEQ ID NO: 37:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:

Claims

1. Polypeptid der Formel 1:

X-Y-Z-Y'-Q 1

ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder optisch aktives Isomer davon, wobei:

X ein Wasserstoffatom, einen C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylrest, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Acylrest, eine Aminosäure, Dipeptid oder Tripeptid darstellt;

Y und Y' jeweils unabhängig voneinander eine Bindung, -(Ser)n-, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, oder T darstellt,

wobei T:

bedeutet und n' eine ganze Zahl von 1-8 ist; W -NHC(O)-, -NHCH&sub2;-, -C(O)-O-, -OC(O)-, -SC(O)- oder -SS- darstellt; und D:

darstellt, wobei B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;- Alkenylenrest darstellt und B&sub1; B oder

bedeutet, wobei jeder Rest R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest darstellt;

oder X und Y zusammengenommen den Rest Da-C(O)- oder Db-C(O)- wiedergeben;

Q eine Hydroxygruppe, eine Aminogruppe, einen Alkylaminorest, einen Alkoxyrest, -O- Da oder -O-Db darstellt;

Z einen Peptidrest von 8 bis 25 Aminosäureresten darstellt, bestehend aus einem Fragment des Oligomers mit der Sequenz

-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-A&sub7;-A&sub8;-A&sub9;-A&sub1;&sub0;-A&sub1;&sub1;-A1'-A2'-A3'-A4'-A5'- A6'-A7'-A8'-A9'-A10'-A11'-A1"-A2"-A3"-A4"-A5"-A6"-A7"-A8"- A9"-A10"-A11"-A1'''-A2'''-

die mit irgendeiner der mit A&sub1; bis A&sub1;&sub1; bezeichneten Aminosäure beginnen kann,

wobei A&sub1;, A1', A1", A1''', A&sub4;, A4', A4", A&sub8;, A8' und A8" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der hydrophilen Aminosäurereste, bestehend aus -Glu-, -Asp-, -Ala-, -Gln-, -Asn-, -Gly-, -Ser-, -Thr-, -Lys-, -Arg-, -Orn- und -hArg-, ausgewählt sind;

A&sub2;, A2', A2", A2''', A&sub3;, A3', A3", A&sub6;, A6', A6", A&sub7;, A7', A7", A&sub1;&sub0;, A10' und A10" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der lipophilen Aminosäurereste, bestehend aus -Leu-, -Nle-, -Met-, -Ala-, -Val-, -Phe-, -Nva-, -Ile- und -Tyr-, oder dem Aminosäurederivat T ausgewählt sind;

A&sub5;, A5', A5", A&sub1;&sub1;, A11' und A11" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der basischen Aminosäurereste, bestehend aus -Lys-, -Orn-, -Arg- oder -hArg-, ausgewählt sind,

A&sub9;, A9' und A9" jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe der lipophilen, neutralen oder basischen Aminosäurereste, bestehend aus -Leu-, -Nle-, -Met-, -Ala-, -Val-, -Phe-, -Nva-, -Ile-, -Tyr-, -Thr-, -Ser-, -Gln-, -Asn-, -Gly-, -Lys-, -Arg-, -hArb, -Trp-, -Orn-, -Trp(For)-, oder dem Aminosäurederivat T ausgewählt sind;

mit der Maßgabe, daß in der Formei 1 mindestens einmal der Rest T, -O-Da, -O-Db, Da-C(O)-oder Db-C(O)- vorhanden ist.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub2;, A2', A2" oder A2''' einen Leu-Rest darstellt.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub3;, A3' oder A3" einen Leu-Rest darstellt.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub4;, A4' oder A4" einen Glu-Rest darstellt.

5. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub5;, A5' oder A5" einen Lys-Rest darstellt.

6. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub6;, A6' oder A6" einen Leu-Rest darstellt.

7. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub7;, A7' oder A7" einen Leu-Rest darstellt.

8. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub8;, A8' oder A8" einen Glu-Rest darstellt.

9. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub9;, A9' oder A9" den Rest T darstellt.

10. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub1;&sub0;, A10' oder A10" einen Leu-Rest darstellt.

11. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem mindestens einer der Reste A&sub1;&sub1;, A11' oder A11" einen Lys-Rest darstellt.

12. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 - 11, wobei Q eine Aminogruppe darstellt.

13. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei D Da bedeutet.

14. Polypeptid nach Anspruch 13, wobei beide Reste R&sub1; und R&sub2; eine tert-Butylgruppe darstellen.

15. Polypeptid nach Anspruch 1, nämlich Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-[N&epsi;-HBB- Lys]-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 29).

16. Polypeptid nach Anspruch 1, nämlich Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-[S-HBS-Cys]- Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 30).

17. Polypeptid nach Anspruch 1, nämlich Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-[N&epsi;-Trl-Lys]- Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 31).

18. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem in der Formel 1 mindestens einmal der Rest T vorhanden ist, wobei n' den Wert 4 hat, W -NHC(O)- darstellt, D Da darstellt, B&sub1; eine Bindung bedeutet, R&sub1; eine tert-Butylgruppe und R&sub2; eine tert-Butylgruppe darstellen.

19. Polypeptid nach Anspruch 1, in dem in der Formel 1 mindestens einmal der Rest T vorhanden ist, wobei n' den Wert 1 hat, W -SS- darstellt, D Da darstellt, B&sub1; eine Bindung bedeutet, R&sub1; eine tert-Butylgruppe und R&sub2; eine tert-Butylgruppe darstellen.

20. Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuren in der Konfiguration der D-Isomeren vorliegen.

21. Komplex eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1-20 und eines Lipids oder eines Gemisches aus Lipiden, ausgewählt aus DPPC, PC, CL, PG, PS, FA und TG.

22. Komplex nach Anspruch 21, wobei DPPC die Hauptkomponente des Lipids darstellt.

23. Komplex nach Anspruch 21, wobei das Lipid ein Gemisch aus DPPC und PG ist.

24. Komplex nach Anspruch 21, wobei das Lipid aus etwa 85-100% DPPC und etwa 0-15% PG besteht.

25. Komplex nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Polypeptid um Suc-Leu-Leu-Glu-Lys- Leu-Leu-Glu-[N&epsi;-HBB-Lys]-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 32) handelt.

26. Komplex nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Polypeptid um Suc-Leu-Leu-Glu-Lys- Leu-Leu-Glu-[S-HBS-Cys]-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 33) handelt.

27. Komplex nach Anspruch 21, wobei es sich bei dem Polypeptid um Suc-Leu-Leu-Glu-Lys- Leu-Leu-Glu-[N&epsi;-Trl-Lys]-Leu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 34) handelt.

28. Komplex nach Anspruch 21, wobei die Aminosäuren des Polypeptids in der Konfiguration der D-Isomeren vorliegen.

29. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 19 oder Komplex nach einem der Ansprüche 20 bis 28 zur Verwendung als Arzneimittel.

30. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder eines Komplexes nach einem der Ansprüche 21 bis 28 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Atemnotsyndroms.

31. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung eines Arzneimittels mit Eigenschaften als Lungensurfactant und Antioxidans.

32. Arzneimittel, das ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder einen Komplex nach einem der Ansprüche 21 bis 28 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

33. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bei 20, umfassend die Stufen:

a) Verwendung eines Harzes mit einer auf geeignete Weise gebundenen, C-terminal geschützen Aminosäure aus der Gruppe Z"-Y'-Q, wobei das Harz durch Q an das Aminosäurefragment gebunden ist, Y' und Q wie vorstehend beschrieben sind und Z" denjenigen Teil von Z darstellt, der eine Aminosäureverbindung der Formel

enthält, wobei n' wie vorstehend beschrieben ist und W' eine geschützte Modifikation von W darstellt, die die Verknüpfung des Antioxidans erlaubt;

b) Entfernung der Schutzgruppe von W';

c) Kupplung mit einer entsprechenden Antioxidationseinheit der Formel

wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; wie vorstehend beschrieben sind und B' und B1' Modifikationen von B und B 1 darstellen, durch die nach erfolgter Kupplung mit W', die geschützte Aminosäuresequenz 2'-Y'-Q erhalten wird, wobei Y' und Q wie vorstehend beschrieben sind und Z' denjenigen Teil von Z darstellt, der die Aminosäureverbindung der Formel

enthält, wobei n' und D wie vorstehend beschrieben sind und W -NHC(O)-, -NHCH&sub2;-, -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)- oder -SS- darstellt;

d) aufeinanderfolgende Kupplung mit den anderen, an der alpha-Aminogruppe geschützten Aminosäuren, A&sub1;-A&sub1;&sub1;, wobei die beanspruchte geschützte Aminosäuresequenz erhalten wird; und

e) Entfernen der Schutzgruppen und Reinigen des gewünschten Peptids.

34. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bei 20, umfassend die Stufen:

enthält, wobei n' wie vorstehend beschrieben ist und W' eine Modifikation von W darstellt, die die Verknüpfung des Antioxidans erlaubt;

b) aufeinanderfolgende Kupplung mit den anderen, an der alpha-Aminogruppe geschützten Aminosäuren, A&sub1;-A&sub1;&sub1;, wobei die geschützte Aminosäuresequenz X-Y- Z'-Y'-Q erhalten wird, in der X, Y, Y' und Q wie vorstehend definiert sind und Z' die Aminosäureverbindung der Formel

c) Entfernung der Schutzgruppe von W';

d) Kupplung mit einer entsprechenden Antioxidationseinheit der Formel

wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; wie vorstehend beschrieben sind und B' und B1' Modifikationen von B und B&sub1; darstellen, durch die nach erfolgter Kupplung mit W', die geschützte Aminosäuresequenz X-Y-Z-Y'-Q erhalten wird, wobei X, Y, Z, Y' und Q wie vorstehend beschrieben sind; und

e) Entfernen der Schutzgruppen und Reinigen des gewünschten Peptids.

35. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bei 20, umfassend die Stufen:

a) Verwendung eines Harzes mit einer auf geeignete Weise gebundenen, C-terminal geschützen Aminosäure aus der Gruppe Z"-Y'-Q, wobei das Harz durch Q an das Aminosäurefragment gebunden ist, Y' und Q wie vorstehend beschrieben sind und Z" jeder geeignete Aminosäureteil von Z ist;

b) aufeinanderfolgende Kupplung mit den anderen, an der alpha-Aminogruppe geschützten Aminosäuren, A&sub1;-A&sub1;&sub1;, wobei die geschützte Aminosäuresequenz Y-Z'- Y'-Q erhalten wird, in der Y, Y' und Q wie vorstehend definiert sind und Z' einen N-terminal geschützten Peptidrest darstellt, der die gewünschte Anzahl von Aminosäureresten, A&sub1;-A&sub1;&sub1;, enthält;

c) Entfernung der Schutzgruppe von Z';

d) Kupplung mit einer entsprechenden Antioxidationseinheit der Formel

e) Entfernen der Schutzgruppen und Reinigen des gewünschten Peptids.

36. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bei 20, umfassend die Stufen:

b) aufeinanderfolgende Kupplung mit den anderen, an der alpha-Aminogruppe geschützten Aminosäuren, A&sub1;-A&sub1;&sub1;, wobei die geschützte Aminosäuresequenz X-Y- 2'-Y'-Q erhalten wird, in der X, Y, Y' und Q wie vorstehend definiert sind und Z' einen N-terminal geschützten Peptidrest darstellt, der die gewünschte Anzahl von Aminosäureresten, A&sub1;-A&sub1;&sub1;, enthält;

c) Abspaltung von X-Y-Z-Y-Q' von dem Harz;

d) Kupplung mit einer entsprechenden Antioxidationseinheit der Formel

wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; wie vorstehend beschrieben sind und B' und B1' Modifikationen von B und B&sub1; darstellen, durch die nach erfolgter Kupplung mit Q', die geschützte Aminosäuresequenz X-Y-Z-Y'-Q erhalten wird, wobei X, Y, Z, und Y' wie vorstehend beschrieben sind und Q -O-Da oder -O-Db darstellt; und

e) Entfernen der Schutzgruppen und Reinigen des gewünschten Peptids.

37. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptid-Komplexes nach einem der Ansprüche 21 bis 28, umfassend das Mischen des Polypeptids der Formel 1 mit einem Lipid oder einem Gemisch von Lipiden, ausgewählt aus DPPC, PC, CL, PG, PS, FA und TG.