DE69313647T2

DE69313647T2 - Synthetische peptide als lungensurfactants mit kovalent gebundenen antioxidantien

Info

Publication number: DE69313647T2
Application number: DE69313647T
Authority: DE
Inventors: J. Vincent The Woodlands Texas 77381-4248 Edwards; Larry R. Wyoming Ohio 45215 Mclean
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 1998-03-12
Anticipated expiration: 2013-07-01
Also published as: DE69313647D1; IL106503A0; US5623052A; CA2137348C; ATE157671T1; KR950702573A; US5886156A; NZ254496A; EP0652894B1; CA2137348A1; EP0652894A1; MX9304621A; ES2107048T3; WO1994003484A1; KR100279059B1; JPH07509713A; AU4659693A; AU664112B2

Description

Fachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Synthese einer Reihe von Polypeptiden aus 3 bis 4 Aminosäuren mit kovalent gebundenen Antioxidantien, die entweder direkt oder über einen Linkerbereich an das Peptid gebunden sind. Diese modifizierten Peptide sind als synthetische Lungensurfactanten, in denen geeignete Antioxidantien strukturell als Teil des Peptids vorkommen, geeignet. Ebenso werden die Herstellung von Gemischen dieser Polypeptide mit Lipiden, das Verfahren zur Herstellung derselben und Arzneimittel, die bei der Behandlung des Atemnotsyndroms bei Säugern wirksam sind, beschrieben.

Hintergrund der Erfindung

Die Lungen befinden sich in einem empfindlichen Gleichgewicht zwischen toxischen Oxidantien und den Schutzwirkungen von Antioxidantienabwehrsystemen. Ein gestörtes Gleichgewicht in diesem System, entweder durch einen Anstieg an Oxidantien oder eine Funktionsstörung der Antioxidantienabwehrsysteme, kann zu pathophysiologischen Vorfällen in der Lunge führen, die Lungenfunküonsstörungen verursachen können. Ein Typ von Lungenfunktions-störung, zu der ein Anstieg an Antioxidantien beitragen kann, ist das Atemnotsyndrom (RDS).
Atemnotsyndrom bei Säuglingen ist der Hauptgrund für den Tod in den ersten 28 Lebenstagen. RDS bei Säuglingen kommt weltweit bei einem von 100 Säuglingen vor und es sterben etwa 10 Prozent. Das Syndrom tritt selten bei ausgetragenen Säuglingen auf und ist im allgemeinen jedoch mit Unreife und niedrigem Geburtsgewicht (unter 2 kg) verbunden. RDS bei Erwachsenen weist ähnliche klinische Charakteristika und eine ähnliche Pathophysiologie wie die kindliche Erkrankung auf und wird im allgemeinen auf einer Intensivstation behandelt. Die Erkrankung bei Erwachsenen hat verschiedene Krankheitsursachen, viele sind eine Folge von Lungenverletzungen, wie diffuse Infektionen, Aspiration des Mageninhalts, Inhalation von Reizmitteln oder Toxinen und Lungenödeme, als Folge solcher Quellen, wie Überdosierung bei der Narkose.
RDS steht in Wechselwirkung mit einem Fehlen oder einer Funktionsstörung des Lungensurfactants, das die Lungenbläschen, wo der Gasaustausch stattfindet, überzieht, und wird mit freien Radikalen von Sauerstoff in der Lunge oder der Lungenhöhle in Zusammenhang gebracht, die als Oxidantien bekannt sind, wie zum Beispiel Superoxidradikale, Hydroxylradikale, Wasserstoffperoxid, das Hydroxylradikale erzeugen kann, und Lipidperoxide, die mit zellulären Verletzungen in Verbindung gebracht werden (Heffner, et al., Am. Rev. Respir. Dis. 104: 531-554 1989); (Halliwell, FASEB J. 1: 358-364 1987).
Synthetische Lungensurfactanten aus größeren Polypeptiden mit Antioxidationseinheiten wurden in der U.S.-Patentanmeldung Seriennr. 07/789,918, eingereicht am 4. November 1991, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, beschrieben. Indes stellt die vorliegende Erfindung ein wirksames synthetisches Lungensurfactantat bereit, das Antioxidationseigenschaften besitzt, aus verkürzten Peptiden mit 3-4 Aminosäuren besteht und die Fähigkeit besitzt, die Oxidation von empfindlichen Verbindungen zur Oxidantien zu hemmen. Die verkürzten Lungensurfactanten stellen wirksamere und kostengünstigere Mittel zur Herstellung von Therapeutika bereit. Die Neuheit der vorliegenden Erfindung liegt in der Möglichkeit, das Peptid auf 3-4 Aminosäuren zu verkleinern, wobei die oberflächenaktiven Eigenschaften beibehalten werden, und das Peptid bereitzustellen, das mit einem kovalent gebundenen Antioxidationsmittel verknüpft ist.
Bei einigen Zubereitungen synthetischer Lungensurfactanten werden als weitere Komponenten zu den oberflächenaktiven Zubereitungen therapeutische Mittel, wie Vitamin E, gegeben (U.S. Patent Nr. 4,765,987; PCF Publication Nr. WO 90/11768; PCT Publication Nr. WO 90/07469). In der vorliegenden Erfindung jedoch stellen die Antioxidantien keine getrennte Komponente dar, sondern sind sogar in ein Polypeptid eingebaut. Ein Vorteil des Einbaus des Antioxidationsmittel in das Polypeptid liegt darin, daß anstelle eines Dreikomponentengemischs (Lipid, Polypeptid und Antioxidationsmittel) ein Zweikomponentengemisch verfügbar ist. Das kann bei der Untersuchung der Wirksamkeit eines vermarktungsfähigen Arzneimittels, wo für jede einzelne Komponente eine Reihe von Dosierungen und Formulierungen untersucht werden muß, von bedeutendem Vorteil sein. Außerdem ist eine Zweikomponentenformulierung leichter herzustellen.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können einzeln in Gemischen mit Lipiden oder in Kombination in Lipidgemischen vorliegen, wobei das Polypeptid einen kleineren Anteil des Surfactantgemisches darstellt. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in hoher Reinheit und auf standardisierte Art und Weise hergestellt werden, da es ein definiertes Gemisch synthetischer Komponenten darstellt. Desweiteren sind die Komponenten nicht auf tierische Quellen zurückzuführen, was die Gefahr einer Kontamination durch Viren und Bakterien möglichst gering hält.
Die Darstellung eines amphipatischen, α-helicalen Peptids aus zehn Aminosäureresten (für die Beschreibung des amphipatischen, α-helicalen Peptids siehe Mclean, L.R. et al. Biochem. 1991, 30, 31) als eine helicale Schraube wird verwendet, um ein Modell für Peptide mit drei und vier Aminosäureresten zu entwickeln. Bei der faßartigen Darstellung der α-Helix lassen die Seitenketten der Aminosäurereste auf eine hydrophobe Seite und eine hydrophile Seite der Helix schließen. Ein Peptid aus vier Aminosäureresten gibt einen Umlauf dieser α-Helix wieder, in der die gewünschte hydrophobe und die hydrophile Seite vorhanden sind. Ein Peptid mit drei Aminosäureresten gibt einen eingeengten Umlauf der α-Helix wieder, in der die hydrophobe und die hydrophile Seite weiterhin vorhanden sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt synthetische Lungensurfactanten, bestehend aus einem Komplex eines Polypeptides und Lipiden, wobei das Polypeptid die folgende Formel 1 hat:
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Y 1
oder ein optisch aktives Isomer oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon; wobei
A&sub1; eine Bindung oder eine negativ geladene Aminosäure, ausgewählt aus Glu oder Asp, darstellt;
A&sub2; eine hydrophobe Aminosäure, ausgewählt aus Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu oder Ile, darstellt;
A&sub3; Aib, Glu, Gin, Leu, Ala, Orn oder eine Bindung darstellt; und
A&sub4; eine positiv geladene Aminosäure, ausgewählt aus Lys, Arg oder His, darstellt;
X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:
wobei B&sub1; B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)- bedeutet; und B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;-Alkenylenrest darstellt; und R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylrest darstellen;
Y einen Carboxylsubstituenten von A&sub4;, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, Arninogruppe, Alkylaminoresten und Alkoxyresten, darstellt; und
wobei, falls A&sub3; eine Bindung bedeutet, A&sub1; und A&sub2; miteinander vertauscht werden können.
Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung synthetische Lungensurfactanten, bestehend aus einem Komplex eines Polypeptides und Lipiden, wobei das Polypeptid die folgende Formel 2 hat:
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;- Y 2
oder ein optisch aktives Isomer oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon; wobei
A&sub1; eine Bindung oder Glu darstellt;
A&sub2; Trp oder Glu, darstellt;
A&sub3; Aib, Glu, Gin, Leu, Ala oder Om darstellt; und
A&sub4; Lys darstellt;
X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:
wobei B&sub1; B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)- bedeutet; und B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;-Alkenylenrest darstellt; und R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylrest darstellen;
Y einen Carboxylsubstituenten von A&sub4;, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Alkylaminoresten und Alkoxyresten, darstellt.
Ferner können die erfindungsgemäßen Peptide mit einem Lipid verbunden sein, das ein oder mehrere Lipide des mit natürlichen Lungensurfactanten verbundenen Typs umfaßt.
Diese Polypeptid-Lipid-Komplexe und deren Arzneimittel sind für die Behandlung des Atemnotsyndroms bei Säugern geeignet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 gibt die Darstellung eines Peptidsurfactants mit zehn Aminosäuren als helicale Schraube wieder, die zur Entwicklung eines Modells für kurze Peptide verwendet wurde. Die Ansicht auf die faßartige Helix erfolgt von oben und die Seitenketten der Aminosäurereste sind in ihrer Stellung relativ zur Helixachse angegeben. Die hydrophobe Seite umfaßt die Aminosäurereste auf der rechten Seite der Zeichnung, nämlich Trp&sup8;, Leu¹, Leu&sup5;, Leu&sup9;, Leu² und Leu&sup6;. Die hydrophile Seite umfaßt die geladenen Aminsäurereste Lys&sup4;, Glu&sup7;, Glu³ und Lys¹&sup0;.
Figur 2 gibt ein Beispiel eines Tetrapeptidantioxidans wieder, das auf der Grundlage eines einzelnen Umlaufs der helicalen Schraubenprojektion des in Figur 1 gezeigten Peptids mit zehn Aminosäureresten entwickelt wurde. Die hydrophobe Seite des Peptids aus Figur 1 wurde durch Trp², Ala³, HBB-Aoc ersetzt, was eine zur Verankerung des Peptids an das Lipid ausreichende, hydrophobe Seite darstellt. Die hydrophile, geladene Seite wurde durch Glu¹ und Lys&sup4; ersetzt.

Kurze Beschreibung der Tabellen

Tabelle 1 gibt die Ergebnisse der Aminosäureanalyse der synthetisierten Peptide wieder.
Tabelle 2 gibt die Ergebnisse der Druck-Volumen-Experimente wieder, das die Wirksamkeit der Verbindungen in dem Modell mit Lungen von ausgewachsen Ratten zeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

In der gesamten Beschreibung werden die folgenden allgemeinen Abkürzungen der natürlich vorkommenden Aminosäuren verwendet:
Ala oder A - Alanin
Val oder V - Valin
Leu oder L - Leucin
Ile oder I - Isoleucin
Phe oder F - Phenylalanin
Trp oder W - Tryptophan
Met oder M - Methionin
Ser oder S - Serin
Tyr oder Y - Tyrosin
Asp oder D - Asparaginsäure
Glu oder E - Glutaminsäure
GlN oder Q - Glutamin
Thr oder T - Threonin
Gly oder G - Glycin
Lys oder K - Lysin
Arg oder R Arginin
Asn oder N - Asparagin
Nle - Norleucin
Orn - Ornithin
hArg - Homoarginin
Nva - Norvalin
Aib - Amino-isobuttersäure
Die natürlichen Aminosäuren enthalten mit Ausnahme von Glycin ein chirales Kohlenstoffatom. Sofern im einzelnen nicht anders angegeben, liegen die optisch aktiven Aminosäuren, auf die hier Bezug genommen wird, in der L-Konfiguration vor. Sobald die erfindungsgemäße Antioxidationseinheit in das Peptid eingeführt wird, können Stereoisomere gebildet werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt sowohl Gemische dieser Stereoisomere als auch die isolierten Stereoisomere. Wie üblich, ist die Struktur der hier ausgeschrieben Peptide so, daß sich das Aminoende an der linken Seite der Kette befindet und das Carboxyende an der rechten Seite der Kette.
Wenn zwei Aminosäuren miteinander kombiniert werden, wobei über eine typische Amidbindung ein Peptid erzeugt wird, wird ein Molekül Wasser freigesetzt und was von jeder Aminosäure verbleibt wird "Aminosäurerest" genannt. Die Amidverknüpfung kann auch stattfinden wenn ein Rest X an eine nachfolgende Aminosäure oder an eine zu der Amidbindung isostere Verbindung gebunden ist. Somit handelt es sich bei einem Aminosäurerest um eine Aminosäure, der an der endständigen Aminogruppe ein Wasserstoffatom und an der endständigen Carboxylgruppe die Hydroxylgruppe fehlt. Unter Verwendung anerkannter Terminologie gibt ein Bindestrich (-) vor (was den Verlust von Wasser anzeigt) einer Dreibuchstabenabkürzung für eine Aminosäure oder für ein Aminosäurederivat die Amidbindung eines Aminosäurerestes an.
Wie hier verwendet, bedeutet "Alkyl" einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest, wie eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isopropyl-, tert-Butyl-, sec-Butyl-, iso-Pentyl-, 1-Methylbutylgruppe und so weiter, in Abhängigkeit von der bestimmten Anzahl an Kohlenstoffatomen. Wie hier verwendet, bedeutet "Acyl" einen Rest, der durch die Entfernung einer Hydroxyl gruppe aus einer organischen Säure gebildet wird; die allgemeine Formel lautet RCO-, wobei R einen aliphatischen, alicyclischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffrest oder ein Wasserstoffatom (Formylgruppe) darstellt. Der Rest R kann substituiert sein. Ein Beispiel für einen Acylrest ist die Succinylgruppe.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "hydrophobe Aminosäure" einen nichtpolaren Aminosäurerest mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoffseitenkette, wie Val, Leu oder Ile; oder einen nicht-polaren Aminosäurerest mit einer aromati schen Gruppe, wie Phe, Tyr, Trp oder His.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "negativ geladene Aminosäure" einen polaren Aminosäurerest mit einer sauren hydrophilen Seitenkette, wie Glu oder Asp.
Wie hier verwendet, bedeutet die Bezeichnung "positiv geladene Aminosäure" einen polaren Aminosäurerest mit einer basischen hydrophilen Seitenkette, wie Lys, Arg oder His.
Peptide, in denen X nicht durch das benannte Antioxidans funktionell abgeändert ist, können nach jedem geeigneten Verfahren, wie das nachstehend beschriebene, sequentielle Festphasenverfahren, hergestellt werden. Bevorzugte Markush-Gruppen sind diejenigen, in denen R&sub1;, R&sub2;, R&sub6; und R&sub7; jeweils eine tert.-Butylgruppe darstellen, und R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; jeweils eine Methylgruppe darstellen. Da ist Db vorzuziehen, und B ist vorzugsweise -C(O)-NH-B-C(O)-, wobei B ein Cg-Alkan darstellt.
X wird hier als "Antioxidationsseinheit" bezeichnet, da man annimmt, daß es sich bei X um denjenigen Teil handelt, der die Antioxidationseigenschaften auf das Pol ypeptid überträgt. Es versteht sich jedoch, daß X mit Verbindungsgliedern zu dem Polypeptid ausgestattet sein kann, so daß, wenn Antioxidationseinheiten, die mit dem Polypeptid verknüpft sind, beschrieben werden, auch die passenden Verbindungsglieder z.B. -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)-, usw. eingeschlossen sind.
Es gibt viele Wege zur Erzeugung von X. Zum Beispiel können Aminosäurederivate durch Acylierungsmittel, die aus Antioxidationsverbindungen hergestellt werden, acyliert werden. Um als Acylierungsmittel fungieren, können die Antioxidationsverbindungen zum Beispiel ein symmetrisches Anhydrid oder einen Aktivester, z.B. N-Hydroxybenzotriazolester (HOBt- Ester) bilden. Das Acylierungsmittel wird dann, damit die Umsetzung stattfinden kann, dem ungeschützten funktionellen Nudeophil ausgesetzt. Dies wird vorzugsweise in der Festphasenpeptidsynthese durchgeführt, solange die Aminosäure, die die Antioxidationseinheit erhalten soll, einen Teil des an das Harz gebundenen Peptids bildet.
Ebenso können die einzelnen Aminosäuren vor dem Einbau in das Peptid modifiziert werden, zum Beispiel durch Veresterung, reduktive Alkylierung usw. Andere Modifikationen von Aminosäuren und Aminsäurederivaten, die funktionelle Gruppen enthalten, sind im Fachgebiet bekannt.
Bevorzugte Beispiele für Antioxidationsverbindungen, von denen gefunden wurde, daß sie für die Umsetzung mit Aminosäuren oder Aminosäurederivaten in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind folgende:
1) HBB = 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzoesäure
2) HBP = 3-(3',5'-Di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)-propionsäure
3) HBC = 3,5-Di-tert-butyl-4-hydroxyzimtsäure
4) HBA = 2-(3',5'-Di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)-essigsaure
5) di-HBA = 2,2-Di-(3',5'-di-t-butyl-4-hydroxyphenyl)-essigsäure
6) Trl = 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure - auch als Trolox bekannt
Vorzugsweise werden HBB, HBP, HBC, HBA, di-HBA und Trl verwendet, wenn es sich bei der funktionellen Gruppe entweder um eine Alkohol- oder eine Aminogruppe handelt. Innerhalb der Gruppe von verbundenen Surfactanten kann eine bevorzugte Gruppe ausgewählt werden, um eine stärker bevorzugte Gruppe, wie HBB und Trl, zu bilden.
Die vorstehenden Antioxidationsverbindungen sind im Handel erhältlich oder die Synthese ist im Fachgebiet bekannt, z.B. wird 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxyphenylessigsäure in Izv. Akad. Nauk SSSR, Ser. Khim., 358 1965 und 3,5-Di-t-butyl-4-hydroxybenzaldehyd in J. Org. Chem., 22, 1333 1957 beschrieben. Im allgemeinen kann jede Antioxidationsverbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die (1) mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verknüpft werden kann, die (2) eine antioxidierende Wirkung zeigt, wenn sie mit dem Polypeptid verknüpft ist und die (3) es dem Polypeptid ermöglicht, wie hier beschrieben zu funktionieren.
Trl-Glu - bedeutet ein Molekül mit einer Peptidbindung, die zwischen Trolox und einem Glutamylrest gebildet wurde; wobei der Troloxrest wie nachstehend gezeigt mit der α-Aminogruppe eines Glutaminsäurerestes verknüpft ist:
Wie für das Trl-Glu-Beispiel gezeigt, kann die Antioxidationseinheit, in diesem Fall stellt X = Db und B = eine Bindung dar, zusammen mit einer Carbonylgruppe (C(O)-) mit dem α-Aminoende des Polypeptids verknüpft werden, wobei Db-C(O)-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Y erzeugt wird.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können nach einer Reihe von Verfahren hergestellt werden, die einem Fachmann bekannt sind, wie die Hüssigphasenchemie. Ein bevorzugtes Verfahren ist das sequentielle Festphasenverfahren, das automatisierte Verfahren, wie den ABI Peptide Synthesizer, verwenden können. In dem Festphasenverfahren treten die folgenden Stufen auf: (1) eine erste Aminosäure mit einer geschützen α-Aminogruppe wird an einen Harzträger gebunden; (2) die Carboxylgruppe einer zweiten Aminosäure mit einer geschützen α- Aminogruppe wird aktiviert; (3) von der ersten Aminosäure wird mit einem Reagenz, das den Verbleib der ersten Aminosäure an dem Harz ermöglicht, die Schutzgruppe entfernt, und (4) es findet eine Kupplung zwischen der α-Aminogruppe der ersten Aminosäure und der aktivierten Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure statt. Diese Stufen werden mit neuen Aminosäureresten wiederholt, was die Bildung des Peptids ermöglicht. Wenn die gewünschte Länge des Peptids gebildet wurde, kann das Peptid mit einer passenden, gekuppelten Antioxidationseinheit modifiziert werden, bevor es von dem Harz abgespalten, die Schutzgruppen entfernt und das Peptid isoliert wird. Alternativ kann das geschützte Peptid selektiv vom Harz entfernt werden, und die Antioxidationseinheit kann vor der Entfernung der Schutzgruppen und der Isolierung angekuppelt werden.
Bei dem verwendeten Harzträger kann es sich um jedes geeignete Harz handeln, das üblicherweise bei der Festphasenhersteliung von Polypeptiden verwendet wird, wie ein Polystyrol, das mit 0,5 bis 3 Prozent Divinylbenzol quervernetzt ist und das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert ist, um Bindungsstellen für die Esterbildung mit der zuerst eingeführten, α-Aminogruppe geschützen Aminosäure bereitzustellen. Andere geeignete Harzträger sind pMHBA (Peptide International, Louisville, Ky), RINK (Calbiochem, Lajolla, Ca) und Sasrin (Biochem, Philadelphia, Pa). Für das Sasrin-Harz ist ein besonderer ABI-Cyclus für das Laden der ersten Aminosaure erforderlich, der in dem Benutzerhandbuch des ABI Peptide Synthesizer beschrieben ist. Die erste Aminosäure mit einer geschützen α-Aminogruppe wird mit dem Harz verknüpft, wie es in dem Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer User's Manual, das hier als Ganzes eingeschlossen wird, beschrieben wird.
Zu bevorzugten Verfahren zur Aktivierung jeder Aminosäure, die zu der gebundenen Peptidkette gegebenen wird, gehört die Bildung eines symmetrischen Anhydrids oder Aktivesters von jeder zugegebenen α-Aminosäure, die passend geschützt ist. Zum Beispiel kann eine an der α-Aminogruppe geschützte Aminosäure mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart von Dichlormethan (DCM) umgesetzt werden, wobei das symmetrische Anhydrid erzeugt wird. Alternativ kann ein HOBt-Aktivester erzeugt werden, indem eine Boc-Aminosäure (tert- Butyloxycarbonyl-aminosäure) und HOBt in DCC gelöst und abgekühlt werden, zusätzliches DCC dazugegeben wird und die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt wird. Diese Lösung wird dann zu der an das Harz gebundenen Aminosäure gegeben. Dieses Aktivierungsverfahren zur Bildung von Acylierungsmitteln kann auch für die Antioxidationsverbindungen verwendet werden.
Falls andere funktionelle Gruppen neben den α-Aminogruppen vorhanden sind, müssen diese Gruppen generell geschützt werden. Im allgemeinen können die α-Aminogruppe und jede funktionelle Gruppe in der Seitenkette durch verschiedene Schutzgruppen geschützt werden, so daß eine Schutzgruppe entfernt werden kann, ohne daß die anderen Schutzgruppen entfernt werden.
Zu den Klassen der α-Aminoschutzgruppen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung möglich sind gehören die (1) Schutzgruppen vom Acyltyp. wie die Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl-), Benzol sulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und γ-Chlorbutyrylgruppe; (2) aromatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie die Benzyloxycarbonyl- und substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, wie die p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-Biphenyl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und Benzhydryloxycarbonyl gruppe; (3) aliphatische Schutzgruppen vom Urethantyp, wie die tert-Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und Allyloxycarbonylgruppe; (4) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethantyp, wie die Cyclopentyloxycarbonyl- oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) gruppe; (6) Schutzgruppen vom Alkyltyp, wie die Triphenylmethyl- (Trityl) und Benzylgruppe; (7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan.
Die Auswahl der Q-Aminoschutzgruppe hängt jedoch von dem verwendeten Harz, der funktionellen Gruppe am Zielort, anderen im Polypeptid vorhandenen funktionellen Gruppen und davon ab, ob das Aminosäurederivat X der Abspaltung vom Harz mit dem Abspaltungsreagenz standhalten kann. Zum Beispiel wird zur Herstellung von HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys- NH&sub2; (SEQ ID NO: 1) ein pMBHA-Harz verwendet, das eine C-terminale Aminogruppe erzeugt, und das Peptid wird unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie auf einem A8I430A Peptide Synthesizer aufgebaut. Die HBB-Einheit kann als ein HOBt-Aktivester eingeführt werden, um HBB am Zielort, der N-α-Aminogruppe von Glutaminsaure, anzubringen. Wasserfreie Huorwasserstoffsäure (HF) kann verwendet werden, um gleichzeitig das Peptid von Harz abzuspalten und die verbliebenen Schutzgruppen zu entfernen.
Die Auswahl der passenden Kombination von Schutzgruppen und Reagenzien zur selektiven Entfernung der Schutzgruppen sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel M. Bodanszky PEPTIDE CHEMISTRY, A PRACTICAL TEXTBOOK, Springer Verlag 1988; J. Stewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co. (1984),
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in einem etwa vierfachen Überschuß in das Festphasenreaktiongefäß eingebracht und die Kupplung wird in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt, wie in einem Medium aus Dimethylformamid: Methylenchlorid(1:1)oder in Dimethylformamid alleine oder in Methylenchlorid alleine. In den Fällen, in den eine unvollständige Kupplung erfolgt, wird das Kupplungsverfahren wiederholt, bevor die α-Aminoschutzgruppe entfernt wird und bevor die Kupplung der nächsten Aminosäure in dem Festphasenreaktiongefäß stattfindet. Der Erfolg der Kupplungsreaktion wird auf jeder Stufe der Synthese durch die Ninhydrinreaktion überwacht, wie von E. Kaiser, et al., Analyt. Biochem. 34, 595(1970) beschrieben.
Nach Erhalt der gewünschten Aminosäuresequenz wird das Peptid vom Harz entfernt unter Verwendung eines beliebigen Reagenzes, das das Polypeptid nicht ungünstig beeinflußt. Zum Beispiel kann wasserfreie HF, die 5% Anisol und 5% Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure enthält, verwendet werden, um das Polypeptid von einem pMBHA-Harz abzuspalten.
Die Polypeptide der Formel 1 können pharmazeutisch verträgliche Salze mit jeder nichttoxischen, organischen oder anorganischen Säure bilden. Beispielhafte anorganische Säuren, die geeignete Salze bilden, sind Chlorwasserstoff-, Bromwassserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure sowie saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogen-orthosphosphat und Kaliumhydrogensulfat. Beispielhafte organische Säuren, die geeignete Salze bilden, sind Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispielhaft für solche Säuren sind zum Beispiel Essig-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Zitmnen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl-, 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Salze der Aminosäureeinheit am Carboxyende können mit jeder geeigneten anorganischen oder organischen Base gebildet werden. Beispielsweise können zu diesen Salzen diejenigen der Alkalimetalle, wie zum Beispiel Natrium und Kalium; diejenigen der Erdalkalimetalle, Calcium und Magnesium; diejenigen der Leichtmetalle der Gruppe IIIa, einschließlich Aluminium; sowie der organischen primären, sekundären und tertiären Amine gehören, wie zum Beispiel der Trialkylamine, einschließlich Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydroabietylamin, N-(Nieder)alkylpiperidin und jedes andere geeignete Amin.
Bei den Phospholipiden der erfindungsgemäßen Protein-Phospholipid-Komplexe kann es sich um irgendein Phospholipid handeln, und diese Bezeichnung umfaßt, wie hier verwendet, die Phosphoglyceride und die Sphingolipide. Phosphoglyceride sind diejenigen Difettsäureester von Glycerin, in denen die verbliebene Hydroxygruppe, eine endständige Hydroxygruppe, der Glycerineinheit einen Ester mit Phosphorsäure bildet. Normalerweise bildet die Phosphorsäureeinheit der Phosphoglyceride einen zweiten Ester mit einem Alkohol wie Ethanolamin, Serin, Cholin oder Glycerin. Sphingolipide sind diejenigen Monofettsäureester von Sphingosin oder Dihydrosphingosin, in denen die Hydroxygruppe in der Position 1 einen Ester mit dem Cholinester von Phosphorsäure bildet. Die bevorzugten Lipide der erfindungsgemäßen Protein- Phospholipid-Komplexe umfassen Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Phosphatidylcholinmoleküle mit Acylketten anderer Längen und Sättigungsgraden (PC), Cardiolipin (CL), Phosphatidylglycerine (PG), Phosphatidylserine (PS), Fettsäuren (FA) und Triacylglycerine (TG). DPPC bildet den größeren Anteil des Lungensurfactantgemisches, während PC, CL, PG, PS, FA und TG zu einem kleineren Anteil vorliegen. Geeignete Festtsäuren für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Phospholipiden sind langkettige Carbonsäuren (im allgemeinen mit acht oder mehr Kohlenstoffatomen), die typischerweise unverzweigt sind. Die Fettsäuren können gesättigt oder ungesättigt sein. Beispielhafte Festtsäuren sind Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Ölsäure.
Arzneimittel des erfindungsgemäßen Polypeptids oder des Protein-Phospholipid- Komplexes können als ein trockenes Gemisch oder in einer wäßrigen Suspension hergestellt werden, die in einigen Fällen kleine Mengen organischer Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethanol oder Trifluorethanol, Detergenzien, wie zum Beispiel Natriumdodecylsulfat oder Natriumdeoxycholat, Salze, wie Calciumchlorid oder Natriumchlorid. Kohlenhydrate, wie Glucose, Dextrose oder Mannit, und Aminosäuren, wie Glycin und Alanin, enthalten können. Wenn die Arzmeimittel in eine flüssige Form gebracht werden, können Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, Regulatoren des osmotischen Drucks, Puffer und Suspensionsmittel der Flüssigkeit zugegeben werden. Falls gewünscht können auch keimtötende Mittel zugegeben werden. Der pH-Wert der wäßrigen Suspension kann zwischen 2 und 10 liegen und kann mit Säuren und Basen, wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure, Natriumphosphat oder Natriumhydroxid eingestellt werden. Das trockene Gemisch kann in einer wäßrigen Lösung, die pharmazeutisch verträgliche Salze, organische Lösungsmittel und Detergenzien enthält, wieder in flüssige Form gebracht werden. Die wäßrige Zubereitung kann dialysiert, flltriert oder chromatographiert werden, um vor der Verwendung däs Suspensionsmedium durch ein pharmazeutisch verträgliches Medium auszutauschen. Die Zubereitung kann als ein trockenes Pulver, eine wäßrige Suspension oder als ein Aerosol direkt in die Lungen des Noffailpatienten verabreicht werden. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in hermetisch verschlossene Behältnisse, wie Phiolen und Ampullen, gefüllt und steril aufbewahrt werden. Die Zusammensetzung kann in einer Phiole oder Ampulle getrennt von einer Phiole oder Ampulle mit dem Suspensionspuffer gelagert werden, und die trockene oder hydratisierte Zusammensetzung kann vor der Verwendung mit dem Suspensionspuffer gemischt werden.
Das Lipid macht 50 bis 99,9% der Lungensurfactantzubereitung aus. Zu geeigneten Lipiden gehören DPPC, PC, CL, PG, PS, FA und TG. DPPC macht die Hauptlipidart aus und liegt in Konzentrationen von 60 bis 100% des Gesamtlipidgewichts vor. Die restlichen Lipide liegen in niedrigeren Konzentrationen vor. PC, CL, PG und PS können bis 30% der Lipide ausmachen, und FA und TG können bis zu 10% des Lipidgewichts umfassen. Die Fettsäureacylketten der Nebenkomponenten des Lipids können gesättigt oder ungesättigt sein und jede Kettenlänge umfassen. Kettenlängen von 12 bis 16 Kohlenstoffatomen und bis zu 2 ungesättigte Bindungen werden bevorzugt. Die bevorzugte Lipidzusammensetzung enthält 85 - 100% DPPC plus 0-15% PG. Reines DPPC wird am meisten bevorzugt.
Die Lipidkomponenten der synthetischen Lungensurfactanten werden gewöhnlich in den Lungensurfactanten von Säugern angetroffen und sind aus normalen industriellen Quellen in hoher Reinheit erhältlich. Die Polypeptidkomponenten werden durch Festphasenpeptidsynthese nach Methoden hergestellt, die einem Fachmann vertraut sind. Es wurde gezeigt, daß Gemische von erfindungsgemäßen Lipiden mit Proteinen, die aus Flüssigkeiten von Lungenspülungen bei Säugern isoliert wurden, bei der Behandlung von RDS bei Neugeborenen wirksam sind. Jedoch wurde erst kürzlich über Gemische dieser Lipide mit synthetischen Peptiden in Lungensurfactantzubereitungen berichtet(Mclean, et al.).
Die Lipide werden nach Methoden, die einem Fachmann vertraut sind, als Liposome suspendiert; d.h. dabei werden Lipide anfänglich in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemischen, wie Gemischen aus Chloroform und Methanol oder Trifluorethanol gemischt. Das organische Lösungsmittel wird durch Verdampfen unter Stickstoff, Argon oder Vakuum entfernt. Eine wäßrige Lösung, die organische und anorganische Säuren, Basen und Salze sowie Saccharide, wie Dextrose, enthalten kann, wird zu dem trockenen Lipidgemisch gegeben, wobei man zu einer Endkonzentration von 0,1 bis 100 mg DPPC pro ml kommt. Es ist im allgemeinen vorzuziehen, jedoch nicht notwendig, das Gemisch auf 35-50ºC zu erwärmen, kräftig zu mischen und bis zu 2 Stunde bei 25-50ºC zu inkubieren. Dann wird das Peptid oder ein Gemisch aus Peptiden in Form eines trockenen Pulvers oder in einer wäßrigen Lösung suspendiert zugegeben, die in einigen Fällen ein geeignetes organisches Lösungsmittel, wie Ethanol oder Trifluorethanol, oder ein Denaturierungsmittel, wie Guanidiniumhydrochlorid oder Harnstoff enthält, was die Löslichkeit des Peptids in der wäßrigen Suspension verbessert. Die Assoziation von Peptid und Lipid kann bei einem betimmten pH-Wert unterstützt werden, so daß der pH-Wert der wäßrigen Lösung von 2 bis 10 variieren kann. Das bevorzugte Verfahren zum Mischen von Peptid und Lipid ist die Zugabe von trockenem Peptid zu Lipid in Wasser bei 45- 50ºC und 30-90minütigem Mischen bei 45-50ºC in einem Ultraschallbad, mit anschließender Gefriertrocknung und Lagerung bei -20ºC.
Die Lipide können gegebenenfalls mit einem geeigneten Detergenz, wie Octylglucosid oder Natriumdeoxycholat, in einem Gewichtsverhältnis von 1 bis 20 Teile Detergenz pro Teil DPPC in Wasser, mit einem wäßrigen Puffer oder einer Salzlösung in Konzentrationen von 1 bis 100 mg DPPC/ml gemischt werden. Dann wird das Peptid als ein trockenes Pulver oder in einer wäßrigen Lösung suspendiert, mit oder ohne ein organisches Lösungsmittel, Denaturierungsmittel oder Detergenz dazugegeben. Das Gemisch wird dann dialysiert, flltriert, zentrifugiert oder chromatographiert, wobei das Detergenz entfernt wird.
Vorzugsweise werden Lipide und Peptide in einem flüchtigen organischen Lösungsmittel mit oder ohne eine kleine Menge Wasser gemischt. Das flüchtige organische Lösungsmittel wird unter einem Stickstoff- oder Argonstrom, in einem Vakuumofen oder über einen Rotationsverdampfer vor oder nach der Zugabe eines wäßrigen Lösungsmittels verdampft.
Das nach einem der vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Gemisch aus Lipid und Peptid wird bis zu 2 Stunden inkubiert, vorzugsweise bei 35-50ºC unter Beschallung. Das Gemisch kann dann dialysiert, filtriert oder chromatographiert werden, wobei das wäßrige Medium durch ein pharmazeutisch verträgliches Medium ersetzt wird, obwohl dies nicht notwendig ist. In einigen Fällen wird die Wirksamkeit durch das Abtrennen von nicht umgesetzten Lipid oder Peptid von assozuertem Lipid und Peptid durch Ultrazentrifugieren, Filtration oder Chromatographie verbessert. Das Gemisch kann dann lyophilisiert oder in Aerosolform gebracht werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Polypeptid-Phospholipid-Komplexe bei der Behandlung des Atemotsyndroms bei Neugeborenen verwendet werden, einem physiologischen Zustand, der eine Folge von der Unfähigkeit der Lungen von Frühgeborenen ist. Lungensurfactanten zu erzeugen, wirken die Komplexe als Antioxidantien und synthetische Lungensurfactanten und ersetzen entweder das natürliche, fehlende Surfactant oder beheben den Mangel an ausreichendem natürlichen Surfactant. Die Behandlung wird fortgesetzt bis die Lungen des Säuglings eine ausreichende Menge an natürlichem Lungensurfactant erzeugen, und so eine weitere Behandlung unnötig machen.
Die Zubereitungen sind vorzugsweise diejenigen, die für endotracheale Verabreichung geeignet sind, das heißt eine flüssige Suspension, ein trockenes Pulver oder ein Aerosol. Für eine flüssige Suspension wird das trockene Gemisch oder das Gemisch in wäßriger Suspension mit geeigneten Mitteln, wie Wasser, Kochsalzlösungen, Dextrose und Glycerin gemischt, wobei ein pharmazeutisch wirksames Arzneimittel hergestellt wird. Bevorzugte flüssige Suspensionen enthalten 0,8 bis 1 Gewichtsprozent Natriumchlorid und ist 1 - 20 mM, vorzugsweise in einem Medium mit Calciumionen. Die Zubereitung wird dann einer Sterilfiltration unterzogen. Im allgemeinen umfaßt die Zubereitung 1 bis 100 mg DPPC pro ml und wird in einer Dosis von 0,2 bis 5 ml/kg verabreicht. Zur Herstellung eines trockenen Gemischs wird die wäßrige Suspension lyophilisiert. Das Aerosol wird aus einem fein verteilten trockenem Pulver, das in einem Treibmittel, wie den Niederalkanen und fluorinierten Alkanen, wie Freon, suspendiert ist, hergestellt. Das Aerosol wird in einem unter Druck gesetzten Behälter gelagert.
Zum Beispiel wird das Surfactant (erfindungsgemäßes Polypeptid und Lipidkomplex) als passende Dosierungsform durch einen Trachealtubus, durch Aerosolverabreichung oder durch Vemebelung der Suspension oder des trockenen Gemischs in das eingeatmete Gas verabreicht. Das Surfactant wird als Einzeldosis oder Mehrfachdosis von 10 bis 200 mg/kg verabreicht. Die bevorzugte Verabreichungsmethode ist eine Suspension aus Peptid und Lipid in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 5-10 mg Surfactant pro ml über einen Trachealtubus, wobei eine Dosis von 50-100 mg/kg erreicht wird.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird zur Behandlung eines Patienten verabreicht. "Patient" bedeutet einen Säuger, zum Beispiel, jedoch nicht darauf begrenzt, einen Menschen.
Die folgenden Beispiele zeigen einige Herstellungsverfahren für das Polypeptid, den Polypeptid/Lipid-Komplex und Ausgangsmaterialien der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung ist weder auf die folgenden Beispiele noch auf diese Herstellungsverfahren beschränkt.
Die in den Beispielen verwendeten und nicht vorstehend definierten Abkürzung lauten wie folgt:
TBDMS Tetrabutyldimethylsilyl--
SEt Ethylthio--
Suc Succinyl--
TFA Trifluoressigsäure
Bzl Benzyl--
Ot-Bu t-Butylether;
die bei der Standard-Boc-Chemie und der Standard-Fmoc-Chemie auftreten: diese Chemie wird bei dem ABI Peptide Synthesizer für die Boc-Durchgänge beziehungsweise die Fmoc-Durchgänge verwendet.

EXPERIMENTELLE CHEMISCHE VERFAHREN

BEISPIEL 1

Peptidsynthese und andere Chemikalien.
Die Peptide wurden in einem 0,5 mmol Maßstab durch Festphasenverfahren auf einem Peptidsynthesizer der Firma Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) Model 430-A synthetisiert. Es wurde das p-Methylbenzoxyhydrylamin (pMBHA)-Harz verwendet, um bei der Spaltung C-terminale Amide zu erhalten. Die Nα-t-Boc (t-Butyloxycarbonyl)-aminosäuren mit Seitenkettenschutz, Cys(ethylthio), Glu(benzyl) und Lys(2-chlorbenzyloxycarbonyl), der Firma Peptides International wurden über ihre zuvor erzeugten symmetrischen Anhydride zweimal gekuppelt. Die Kupplung der Antioxidationsgruppe erfolgte über die Aktivierung der Säure des Antioxidans, wobei das symmetrische Anhydrid erzeugt wurde. Antioxidatien, wie HBB (3,5- Di-tert-butyl-4-hydroxybenzoesäure), wurden an dem Aminoende des Peptids angebracht, indem die HBB-Säure voraktiviert wurde, wobei das entsprechende symmetrische Anhydrid erzeugt wurde. Im allgemeinen wurde das Antioxidans zweimal oder dreimal gekuppelt, um eine vollständige Umsetzung sicherzustellen. Zum Beispiel waren bei HBB drei Kupplungen erforderlich, um einen vollständigen Einbau zu erreichen. Wie auf der Basis von Ninhydrintests bestimmt, wurden zusätzliche Kupplungen durchgeführt. Die Nα-t-Boc-Gruppen wurden mit 50%iger Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid entfernt und dann wurde mit 10%igem Diisopropylethylamin (DEA) in Dimethylformamid neutralisiert. Die Peptide wurden von dem Harz abgespalten, und die Schutzgruppen wurden in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthielt, bei -5ºC in 45 Minuten entfernt. HF wurde unter Vakuum entfernt und das Peptid wurde mit 50%igem wäßrigen Acetonitril vom Harz extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden gefroren, lyophilisiert und durch präparative HPLC mit umgekehrten Phasen auf einer Ramm Dynamax (21,4 × 250 mm)-C&sub1;&sub8;-Säule bei 40 mllmin mit einem Acetonitrilgradienten in 0,1%iger wäßriger TFA (pH 2) unter Überwachung bei 214 nm gereinigt. Das Material beim Hauptpeak wurde gesammelt und lyophilisiert. Die Reinheit 097%) und die Identität des synthetischen Peptids wurden durch ein einzelnes Signal im analytischen Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm (HPLC), durch Kapillarzonenelektrophorese, durch Fastatom-bombardment-Massenspektrometrie (FAB-MS) auf einem VG Analytical ZAB2-SE, das einzelne Molekülionen, die mit den korrekten Sequenzen übereinstimmen, erzeugte, und durch Aminosäureanalyse, die innerhalb eines Bereiches von 10% der vorhergesagten Werte für jeden Aminosäurerest lag, bestätigt. L-α-Dipalmitoylphophatidylcholin (DPPC) 099% rein) wurde von Avanti Polar Lipid (Birmingham, AL) bezogen. Unter Verwendung dieser Verfahren wurden die folgenden Peptide synthetisiert; ihre analytischen Eigenschaften sind in Tabelle 1 zu finden.

1(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 1) (HBB-Aoc = Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoyl-aminooactanoyl-)

Zuerst wurde Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pMBHA hergestellt, indem ein in einen ABI430A Peptide Synthesizer gebrachtes Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pMBHA-Harz verwendet und die Synthese unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie durchgeführt wurde. Zur Synthese des Peptids 1A wurden Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoesäure (HBB) (501 mg), Dimethylformamid (4 ml) und Methylenchlorid (4 ml) kombiniert, dazu wurde eine Dicyclohexylcarbodiimidlösung (8 ml einer 0,5 M Lösung in Methylenchlorid) gegeben und 5 Minuten gerührt, wobei das symmetrische Anhydrid von HBB erzeugt wurde, das dann in 10-fachem Überschuß für jede der beiden Kupplungen an Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pHMBA gekuppelt wurde. Das geschützte Peptid HBB-Aoc-Glu(Obzl)-Trp-Aib-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pMBHA wurde vom Harz abgespalten und die Seitenkettenschutzgruppen wurden entfernt, indem das HBB- Peptidharz in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthielt, bei -5ºC 1 Stunde behandelt wurde. Das Peptid wurde dann mit 50%igem Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure vom Harz extrahiert, gefroren und lyophilisiert. Das Peptid wurde dann durch HPLC mit umgekehrter Phase gereinigt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.

1(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES MIT DEM IN BEISPIEL 1(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTID:

Das Peptid 1(A) wird wie vorstehend beschrieben hergestellt. DPPC (25 mg) in 1 ml Chloroform wird unter einem Stickstoffstrom und unter Vakuum getrocknet, wobei Spuren von organischem Lösungsmittel entfernt werden. Zu dem trockenen Lipid werden 3 ml Wasser gegeben. Die Zubereitung wird 1 Stunde bei 45ºC inkubiert. Dann werden 0,5 mg trockenes Peptid 1(A) zu der wäßrigen Zubereitung gegeben. Die Zubereitung wird in einem Ultraschallbad bei 45ºC 2 Stunden beschallt. Das erhaltene Lipid-Peptid-Gemisch wird lyophilisiert und bei 4ºC bis zu einem Monat gelagert. Vor dem Testen werden 9 ml 0,9%ige NaCl, 20 mM HEPES- Puffer, pH 7,40 dazugegeben. Die Zubereitung wird 1 Stunde unter wiederholtem Rühren bei 45ºC inkubiert.

BEISPIEL 2

2(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPFIDS: HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 2) (HBB-Aoc = Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoyl-aminooctanoyl-)

Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Glu(OBzl)-Lys(N&epsi;-2-Clz)-pHMBA wurde hergestellt, indem ein in einen ABI430A Peptide Synthesizer gebrachtes Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pMBHA-Harz verwendet und die Synthese unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie durchgeführt wurde. Zur Synthese des Peptids 2A wurden Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoesäure (HBB) (501 mg), Dimethylformamid (4 ml) und Methylenchlorid (4 ml) kombiniert, dazu wurde eine Dicyclohexylcarbodiimidlösung (8 ml einer 0,5 M Lösung in Methylenchlorid) gegeben und 5 Minuten gerührt, wobei das symmetrische Anhydrid von HBB erzeugt wurde, das dann in 4-fachem Überschuß für jede der beiden Kupplungen an Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Glu(OBzl)-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pHMBA gekuppelt wurde. Das geschützte Peptid HBB-Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Glu(OBzl)-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pHMBA wurde vom Harz abgespalten und die Seitenkettenschutzgruppen wurden entfernt, indem das HBB-Peptidharz in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthielt, bei -5ºC 1 Stunde behandelt wurde. Das Peptid wurde dann mit 50%igem Acetonitril in 0,1%iger Trifiuoressigsäure vom Harz extrahiert, gefroren und lyophilisiert. Das Peptid wurde dann durch HPLC mit umgekehrter Phase gereinigt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.

2(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES MIT DEM IN BEISPIEL 2(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTID:

Das Peptid 2(A) wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben mit DPPC gemischt.

BEISPIEL 3

3(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (Trl-Aoc- = Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoyl-aminooctanoyl-) (SEQ ID NO: 3)

Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pMBHA wurde hergestellt, indem ein in einen A81430A Peptide Synthesizer gebrachtes Lys(N -2-ClZ)-PMBHA-Harz unter Verwendung von Standard-t-Boc-Chemie verwendet wurde.
Zur Synthese des Peptids 3A wurden 6-Hydroxy-2,5,7,8-Tetramethylchroman-2- carbonsäure (Trolox) (501 mg), Dimethylformamid (4 ml) und Methylenchlorid (2,5 ml) kombiniert, dazu wurde eine Dicyclohexylcarbodiimidlösung (8 ml einer 0,5 M Lösung in Methylenchlorid) gegeben und 5 Minuten gerührt, wobei das symmetrische Anhydrid erzeugt wurde, das dann in 10-fachem Überschuß für jede der beiden Kupplungen an Aoc-Glu(Obzl)- Trp-Aib-Lys(N&epsi;-2-ClZ)-pMBHA gekuppelt wurde.
Zur Abspaltung von Trl-Aoc-Glu(OBzl)-Trp-Aib-Lys)N&epsi;-2-ClZ)-pHMBA vom Harz und Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen wurde das Peptid in wasserfreier HF, die 5% Anisol und 5% Dimethylsulfid enthielt, bei -5ºC 1 Stunde behandelt. Das Trl-Peptid wurde mit 50%igem Acetonitril in 0,1%iger Trifluoressigsäure vom Harz extrahiert, gefroren und lyophilisiert. Das Trl-Peptid wurde durch HPLC mit umgekehrter Phase gereinigt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.

3(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES MIT DEM IN BEISPIEL 3(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTID:

Das Peptid 3(A) wurde im wesentlichen wie in Beispiel IB beschrieben mit DPPC gemischt.

BEISPIEL 4

4(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPTIDS: HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 4) (HBB = Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoyl-)

Das Peptid 4(A) wurde auf eine Art und Weise hergestellt, die im wesentlichen analog zur Herstellung des Peptids 1(A) ist.

4(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES MIT DEM IN BEISPIEL 4(A) BESCHRIEBENEN POLYPEPTID:

Das Peptid 4(A) wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben mit DPPC gemischt.

BEISPIEL 5

5(A). HERSTELLUNG DES POLYPEPFIDS: HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 5) (HBB-Aoc = Nα-Hydroxy-di-t-butyl-benzoyl-aminooactanoyl-)

Das Peptid 5(A) wurde auf eine Art und Weise hergestellt, die im wesentlichen analog zur Herstellung des Peptids 1(A) ist.

5(B). HERSTELLUNG DES DPPC-KOMPLEXES MIT DEM IN BEISPIEL 5(A) BESCHRIEBENEN POLYPEFFID:

Das Peptid 5(A) wurde im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben mit DPPC gemischt. TABELLE 1 ANALYTISCHE EIGENSCHAFTEN DER SYNTHETISIERTEN PEPTIDE FABS-MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE DER PEPTIDE 1-5

HERSTELLUNG DER ANTIOXIDATIONSEINHEITEN

Die folgenden Antioxidationsausgangmaterialien können, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, verwendet werden.

BEISPIEL 6

HERSTELLUNG DER AUSGANGSANTIOXIDATIONSVERBINDUNG:

3-t-Butyl-5-methyl-4-hydroxybenzoesäure

Beschicke ein Reaktionsgefäß mit einer Suspension aus Natriumhydrid (4,74 g, 0,198 mol) in wasserfreiem Ethylenglykoldimethylether (150 ml). Gib tropfenweise eine Lösung aus 2-t-Butyl-6-methylphenol (0,1 mol) in Ethylenglykoldimethylether (150 ml) dazu. Erwärme 1,5 Stunden auf 50-60ºC und leite dann 20 Stunden Kohlendioxid über ein Gaseinleitungsröhrchen unterhalb der Obeffläche des Reaktionsgemisches ein. Kühle auf 5ºC und vernichte vorsichtig den Überschuß an Natriumhydrid mit Methylalkohol (30 mi). Stelle nach Beendigung der Wasserstoffentwicklung den pH-Wert des Reaktionsgemischs mit 1 N Chlorwasserstoffsäure auf 2 ein. Verdünne mit Wasser (1,61) und sammle die Titelverbindung durch Filtration.

BEISPIEL 7

HERSTELLUNG DER AUSGANGSANTIOXIDATIONSVERBINDUNG:

(6-Hydroxy-7-t-butyl-5-ispropyl-8-propylchroman-2-yl)essigsäure

Mische Magnesiumspane (45 mg, 1,85 mmol) und 1-Chlor-2,2-dimethylpropan (74,6 mg, 0,7 mmol) in wasserfreiem Ether (9 ml). Erwärme und rühre kräftig, gib dann tropfenweise 1,2-Dibromethan (156 mg, 0,839 mmol) in wasserfreiem Ether (1,5 ml) dazu. Erwärme 12 Stunden unter Rückfluß, bringe es unter eine Argonatmosphäre und kühle auf 0-5ºC. Gib tropfenweise eine Lösung aus Isobutyrylchlorid (0,533 mmol) in wasserfneiem Diethylether (1,5 ml) dazu. Rühre 1,5 Stunden bei 0-5ºC, gieße es in ein Gemisch aus Eis und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (0,15 ml) und trenne die organische Phase ab. Wasche mit Ethylacetat, 5%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung und Kochsalzlösung Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2,2,6-Trimethyl-4-heptanon erhalten wird.
Löse Vinylmagnesiumchlorid (0,7 mmol) in wasserfreiem Diethylether (1 ml), bringe es unter eine Argonatmosphäre und kühle auf 1-5ºC. Gib tropfenweise eine Lösung aus Butyrylchlorid (0,533 mmol) in wasserfreiem Diethylether (1,5 ml) dazu. Rühre bei 0-5ºC 1,5 Stunden, gieße in ein Gemisch aus Eis und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (0,15 ml) und trenne die organische Phase ab. Wasche mit Wasser, 5%iger wäßriger Natriumcarbonatlösung und Kochsalzlösung. Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei Propylvinylketon erhalten wird.
Löse 2,2,6-Trimethyl-4-heptanon (0,4 mol) in Methanol (10 ml) und gib Kalium-tert.- butanolat (12 g, 0,1 mol) dazu. Gib tropfenweise eine Lösung aus Propylvinylketon (0,2 mol) in Methanol (10 ml) dazu. Rühre 10 Minuten und verteile zwischen Ethylether und Kochsalzlösung. Trenne die organische Phase ab und wasche bis zur Neutralität mit Kochsalzlösung Trockne (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2-Propyl-3-t-butyl- 5-isopropylbenzochinon erhalten wird.
Löse 2-Propyl-3-t-butyl-%isopropylbenzochinon (10 mmol), 1,1,3,3-Tetramethyldisiloxan (1,79 ml, 10 mmol) und bd (0,05 g) in Methylenchlorid (30 ml). Rühre 30 Minuten unter Rückfluß und extrahiere mit 1 N Natriumhydroxidlösung (30 ml). Säure die wäßrige Phase mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure an und extrahiere in Ethylacetat (4 × 10 ml), trockne (Na&sub2;SO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2-Propyl-3-t-butyl-4- hydroxy-5-isopropylphenol erhalten wird.
Löse 2-Propyl-3-t-butyl-4-hydroxy-5-isopropylphenol (2,0 mol) und Trimethylorthoformiat (0,3 1) in Methanol (1,2 1) und entgase. Bringe das Gemisch unter eine Stickstoffatmosphäre, kühle auf 3ºC und gib konzentrierte Schwefelsäure (5 ml) dazu. Gib tropfenweise Methylvinylketon (340 ml, 4,0 mol) dazu und rühre ohne Kühlung 44 Stunden. Gieße in wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung und extrahiere in Ethylether. Trockne (MgSO&sub4;) und verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum, wobei 2-Mehtoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8- propyl-chroman-6-ol erhalten wird.
Löse 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-ol (2 mol) in Pyridin (600 ml) und gib Essigsäureanhydrid (900 ml) dazu. Entgase und rühre 18 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre Gieße in Eis/Wasser und rühre 3 Stunden. Extrahiere in Ethylether, trockne (MgSO&sub4;), verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch Chromatographie, wobei 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-yl- acetat erhalten wird.
Löse 2-Methoxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-6-yl-acetat (2 mol) in Aceton (2,5 l) und gib Wasser (2 l) dazu, gefolgt von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (16,6 ml). Destilliere das Lösungsmittel solange aus dem Gemisch ab bis die Kopftemperatur 90ºC erreicht. Kühle die Suspension, verdünne mit Ethylether und wasche mit wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung. Trockne (MgSO&sub4;), verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch Chromatographie, wobei 2-Hydroxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl- 8-propyl-chroman-6-yl-acetat erhalten wird.
Suspendiere Natriumhydrid (42,7 g einer 56%igen Suspension in Mineralöl, 1,1 mol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (11). Bringe es unter eine Stickstoffatmosphäre und gib tropfenweise Trimethylphosphonoacetat (209,4 g, 1,15 mol) dazu. Rühre 25 Minuten und gib eine Lösung aus 2-Hydroxy-2-methyl-7-t-butyl-5-isopropyl-8-propyl-chroman-6-yl-acetat (0,5 mol) in Tetrahydrofuran (11) dazu. Rühre 18 Stunden bei Raumtemperatur und erwärme dann 4 Stunden unter Rückfluß Kühle, verdampfe das Lösungsmittel unter Vakuum und reinige durch Chromatographie, wobei die Titelverbindung erhalten wird.

BIOLOGISCHES

Verfahren zur Untersuchung der Wirksamkeit von synthetischen Lungensurfactantzubereitungen sind im Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen synthetischen Surfactantzubereitungen aufjede geeignete Art und Weise untersucht werden, wie in dem Lungenmodell von erwachsenen Ratten (Ikegami, et al., (1979) Pediatr. Res. 13, 777-780).
Die charakteristischen Druck-Volumen-Merkmale von Rattenlungen, denen Surfactant entzogen wurde, sind denen der Lungen von Säuglingen mit Hyalinmembranerkrankung ähnlich, und die Wiederherstellung der normalen Druck-Volumen-Beziehung der Lunge steht in einer dosisabhängigen Art und Weise mit der Menge an eingeträufeltem Surfactant in Zusammenhang (Bermel, M.S., et al. Lavaged excised rat lungs as a model of surfactant deficiency, Lung 162: 99-113 (1984)).

BEISPIEL 8

Modell mit isolierten gespülten Rattenlungen

Die experimentellen Verfahren zur Tierpräparation, Aufnahme der Druck-Volumen- Kurve und der Lungenspülung sind an diejenigen angepasst, die von Ikegami et al., Pediatr. Res. 11:178-182 (1977) und Pediatr. Res. 13: 777-780 (1979) sowie Bermel et al. Lung 162: 99-113 (1984) beschrieben wurden. Männliche Sprague Dawley Ratten (200-250 g) werden mit Natriumpentobarbital anästhetisiert und man läßt sie ausbluten. In die Trachea wird eine Kanüle eingeführt und die Thoraxorgane werden im ganzen entfernt. Nach Entfernung des Nebengewebes werden die Lunge und die Trachea ( 2 g) in Kochsalzlösung (0,9%) suspendiert, in eine Vakuumkammer gebracht, nach dem Verfahren von Stengel et al. entgast. Die entgasten Lungen werden in einem ummantelten Behältnis bei 37ºC in Kochsalzlösung suspendiert und die Tracheakanüle wird über ein T-Röhrchen sowohl mit einem Wassermanometer als auch mit einer Glasspritze verbunden. Die Glasspritze wird in eine lnfusionlentnahme-Pumpvorrichtung gebracht. Die Lungen werden rasch, zur Minimierung der Luftretention mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit Luft auf einen Druck von 30 cm H&sub2;O aufgeblasen und 10 Minuten bei diesem Druck gehalten, indem zu den Lungen periodisch Luft gegeben wird. Das Gesamtvolumen von infundierter Luft wird als Gesamtlungenkapazität (TLC) die im allgemeinen 14-15 ml beträgt, aufgezeichnet. Aus den Lungen wird dann in einer Geschwindigkeit von 2,5 ml/min die Luft herausgelassen, bis ein Druck von Null erhalten wird. Während des Herauslassens der Luft wird der Druck des Wassermanometers in Intervallen von 1 cm abgelesen und aufgezeichnet. Diese Daten werden zur Konstruktion einer Druck-Volumen- (P-V)-Kurve oder einer quasistatischen Dehnbarkeitskurve nach Korrektur der P-V-Kurve des Apparates verwendet. Nach Entgasen und Einstellen des Gleichgewichts wird in den Lungen durch wiederholtes Spülen mit 5 ml/g Spülpuffer (0,9%ige NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4) ein Surfactantmangel hervorgerufen. Die Verfahren Entgasen, Einstellen des Gleichgewichts und Spülen werden wiederholt (15-20 mal) bis die Druck-Volumen-Kurve deutlich s-förmig geworden ist und das bei einem Druck von 5 cm H&sub2;O verbleibende Luftvolumen kleiner oder gleich 3 ml ist. An diesem Punkt wird angenommen, daß die Lungen einen Surfactantmangel aufweisen. Zur Untersuchung werden 2 ml 0,9%ige NaCl, 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,4 zu den trockenen Lungensurfactanten (25 mg Phospholipid; 100-125 mg/kg) gegeben, das Gemisch wird mit einem Vortexrührer gerührt, mit Stickstoff gespült und 1 Stunde bei 45ºC inkubiert. Das Gemisch wird dann erneut mit einem Vortexrührer gerührt, und falls es schaumig ist, entgast. 2 ml des Testgemischs werden viermal mittels einer Spritze in die Lungen eingeführt und entfernt. Bei der fünften Einführung des Testgemischs verbleibt es in der Lunge. Dieses Verfahren wird gewählt, um eine gleichmäßige Verteilung des Materials in der Lunge zu unterstützen. Die Lungen werden entgast, man läßt sie bei 37ºC 5 Minuten ins Gleichgewicht kommen und führt eine P-V-Messung durch. Die Lungen werden untersucht, während sie in einer Kochsalzlösung bei 37ºC gehalten werden, im Gegensatz zu Umgebungstemperatur, da die physikalischen Charakteristika der Surfactanten von der Temperatur abhängig sein können. Hundelungensurfactant wird auf eine ähnliche Art und Weise verabreicht, mit der Ausnahme, daß das Surfactant nur 5 Minuten erwärmt wird. Die Daten sind in Form der %TLC aufgeführt. Die Deflationsbereiche der Druck-Volumen (P-V)- Kurven bei Lungen von erwachsenen Ratten werden analysiert, indem die Gesamtlungenkapazitäten (%TLC) bei 5 und 10 cm H&sub2;O-Druck (PC&sub5; und PC&sub1;&sub0;) berechnet werden. Vergleiche werden auf der Grundlage der prozentualen Wiederherstellung = (PC5(ausreichend) - PC5(Test)) × 100 / (PC5(ausreichend) - PC5(unzulänglich)) und durch Einfach-Varianzanalyse unter Verwendung der allgemeinen linearen Modellverfahren mit spezifischen Hervorhebungen der Mittelwerte (SAS Institute Inc., Cary, NC). Spülung und Behandlung mit Testgemischen ruft keine Änderung bei der absoluten TLC von mehr als 6% hervor.

Ergebenisse

Die den Ratten verabreichten Zubereitungen hatten ein durchsichtiges Aussehen. Die Deflationsteile der Druck-Volumen (P-V)-Kurve bei Lungen von erwachsenen Ratten wurde analysiert, indem die prozentualen Gesamtlungenkapazitäten (TLC) bei einem Druck von 5 cm H&sub2;O (PC&sub5;) und die TLC bei 10 cm H&sub2;O (PC 10) berechnet wurde. Die Wiederherstellung auf der Grundlage der PC&sub5;-Werte wurde zum Vergleich der Testgemische verwendet. DPPC allein hatte keine deutliche Wirkung auf die Druck-Volumen (P-V)-Kurven der gespülten Lunge. Die Wirkungen der Peptid-DPPC-Gemische sind in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Wirksamkeit von synthetischen Surfactanten im Modell mit isolierten gespülten Rattenlungen

Claims

1. Polypeptid der Formel:

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;- Y

oder ein optisch aktives Isomer oder pharrnazeutisch verträgliches Salz davon; wobei

A&sub1; eine Bindung oder eine negativ geladene Aminosäure, ausgewählt aus Glu oder Asp, darstellt;

A&sub2; eine hydrophobe Aminosäure, ausgewählt aus Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu oder Ile, darstellt:

A&sub3; Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn oder eine Bindung darstellt; und

A&sub4; eine positiv geladene Aminosäure, ausgewählt aus Lys, Arg oder His, darstellt;

X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:

wobei B&sub1; B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)- bedeutet; und B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;-Alkenylenrest darstellt; und R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylrest darstellen;

Y einen Carboxylsubstituenten von A&sub4;, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Alkylaminoresten und Alkoxyresten, darstellt; und

wobei, falls A&sub3; eine Bindung bedeutet, A&sub1; und A&sub2; miteinander vertauscht werden können.

2. Polypeptid der Formel:

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;- Y

oder ein optisch aktives Isomer oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon; wobei

A&sub2; eine hydrophobe Aminosäure, ausgewählt aus Trp, Tyr, Phe, His, Val, Leu oder Ile, darstellt;

A&sub3; Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Orn oder eine Bindung darstellt; und

X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:

Y einen Carboxylsubstituenten von A&sub4;, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Alkylaminoresten und Alkoxyresten, darstellt.

3. Polypeptide der Formel:

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;- Y

A&sub1; eine Bindung oder Glu darstellt;

A&sub2; Trp oder Glu darstellt;

A&sub3; Aib, Glu, Gln, Leu, Ala oder Orn darstellt; und

A&sub4; Lys darstellt;

X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:

wobei B&sub1; B, -C(O)-, -B-C(O)-, -C(O)-NH-B-C(O)- bedeutet; und B eine Bindung, einen C&sub1;&submin;&sub1;&sub6;-Alkylenrest oder einen C&sub2;&submin;&sub1;&sub6;-Alkenylenrest darstellt; und R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6; und R&sub7; jeweils unabhängig voneinander einen C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylrest darstellen; und

Y einen Carboxylsubstituenten von A&sub4;, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Alkylaminoresten und Alkoxyresten darstellt.

4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, indem A&sub1; ein Glu darstellt.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, in dem A&sub2; ein Trp darstellt.

6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, in dem A&sub3; ein Aib darstellt.

7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, in dem A&sub3; ein Ala darstellt.

8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, in dem A&sub4; ein Lys darstellt.

9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, in dem X den Rest Da darstellt.

10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 17 oder 18, in dem R&sub1; und R&sub2; jeweils eine t- Butylgruppe darstellen.

11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-10, in dem Y eine Aminogruppe darstellt.

12. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, nämlich HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NR&sub2; (SEQ ID NO: 1).

13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, nämlich HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-Lys-NR&sub2; (SEQ ID NO: 2).

14 Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, nämlich Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 3).

15. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, nämlich HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 4).

16. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, nämlich HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 5).

17. Komplex eines Polypeptids der Formel:

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;- Y

oder eines optisch aktiven Isomeren oder pharmazeutisch verträglichen Salzes davon; wobei

A&sub3; Aib, Glu, Gin, Leu, Ala, Orn oder eine Bindung darstellt; und

X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:

wobei, falls A&sub3; eine Bindung bedeutet, A&sub1; und A&sub2; miteinander vertauscht werden können;

und eines Lipids oder Gemisches von Lipiden, ausgewählt aus DPPC, PC, CL, PG, PS, FA und TG.

18. Komplex eines Polypeptids der Formel:

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;- Y

A&sub3; Aib, Glu, Gln, Leu, Ala, Grn oder eine Bindung darstellt; und

X einen Rest der Formel Da oder Db bedeutet:

Y einen Carboxylsubstituenten von A&sub4;, ausgewählt aus einer Hydroxygruppe, Aminogruppe, Alkylaminoresten und Alkoxyresten, darstellt;

19. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei DPPC die Hauptkomponente des Lipids umfaßt.

20. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei das Lipid ein Gemisch aus DPPC und PG ist.

21. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei das Lipid aus etwa 85-100% DPPC und etwa 0-15% PG besteht.

22. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 1) handelt.

23. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 2) handelt.

24. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 3) handelt.

25. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 4) handelt.

26. Komplex nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 5) handelt.

27. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Atemnotsyndroms bei einem Patienten, der dies benötigt.

28. Verwendung eines Komplexes nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Atemnotsyndroms bei einem Patienten, der dies benötigt.

29. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei DPPC die Hauptkomponente des Lipids umfaßt.

30. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei das Lipid ein Gemisch aus DPPC und PG ist.

31. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei das Lipid aus etwa 85-100% DPPC und etwa 0-15% PG besteht.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 1) handelt.

33. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Aoc-Glu-Trp-Glu-LYS-NH2 (SEQ ID NO: 2) handelt.

34. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei es sich bei dem Polypeptid um Trl-Aoc-Glu-Trp-Aib-Lys-NR&sub2; (SEQ ID NO: 3) handelt.

35. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei es sich bei dem Polypeptid um HBB-Glu-Trp-Aib-Lys-NH&sub2; (SEQ ID NO: 4) handelt.

36. Verwendung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, wobei es sich bei dem Pol ypeptid um HBB-Aoc-Glu-Trp-Ala-Lys-NR&sub2; (SEQ ID NO: 5) handelt.

37. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend die Stufen:

(1) Synthetisieren eines geeignet geschützten Polypeptids der Formel A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Y; und dann

(2) Umsetzen eines für eine Acylierung auf geeignete Art und Weise hergestellten alpha- Aminoendes von A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Y durch Umsetzen mit einer aktiven Carbonylgruppe von B&sub1; der Formel X, wobei ein Polypeptid der Form X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Y erzeugt wird.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei es sich bei dem Polypeptid um eines nach einem der Ansprüche 12-16 handelt.